WO2004030691A1

WO2004030691A1 - Ｎｋ４を含有する徐放性製剤

Info

Publication number: WO2004030691A1
Application number: PCT/JP2003/012770
Authority: WO
Inventors: Yasuhiko Tabata
Original assignee: Medgel Corporation
Priority date: 2002-10-04
Filing date: 2003-10-06
Publication date: 2004-04-15
Also published as: AU2003268770A1; JP2004123650A

Abstract

ＮＫ４およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤、ならびにＮＫ４およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤からなる、血管新生を阻害するための組成物が開示される。本発明の組成物は、癌の浸潤および転移を抑制する癌治療薬として、および加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬化症などの、血管新生をともなう疾患の治療および予防薬として有用である。

Description

明細書

NK 4を含有する徐放性製剤技術分野

本発明は、血管新生を阻害し、このことにより、癌、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬化症などの、血管新生をともなう疾患を治療するための徐放製剤、特に癌の浸潤および転移を抑制するための徐放製剤に関する。背景技術

HG F (肝細胞増殖因子）は、細胞の遊走、増殖促進活性および血管新生促進活性を有する増殖因子であり、癌細胞の遊走や浸潤の促進において中心的な役割を果たすことが知られている。 N K 4は H G Fの N末端へァピン構造および 4個のクリングルドメインを有する分子内断片であり、 H G Fアン夕ゴニストとしての活性を有する（Date et al, FEBS Lett 420, 1-6, 1997) 。 NK 4はインビトロおよびィンビポにおいて癌細胞の浸潤を抑制することが示されている（Date, et al., Oncogene 17, 3045-3054, 1998) 。さらに、 NK 4は血管新生の抑制機能も有しており、 HG F、 VE G Fまたは b F G Fなどによる内皮細胞の増殖を阻害することができる (久場ら、分子癌治療第 1巻第 1号、 2 0 0 0年、 p . 4 6 - 5 5 ) 。 NK 4は、これらの 2つの機能の相乗効果により癌の浸潤および血管新生を抑制することができるため、癌の浸潤および転移を抑制する癌治療薬として、および加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬ィ匕症などの、血管新生をともなう疾患の治療および予防への応用が期待されている。

しかしながら、 NK 4は、投与部位から拡散により排泄、酵素分解により失活するため、生体内半減期が短く、水溶液として全身投与あるいは病巣部位へ局所投与した場合、長期間にわたり十分な生理活性効果を得ることができなかった。本発明に関連する先行技術文献情報としては以下のものがある：特開平 8— 3 2 5 1 6 0 ; WO94/27630；久場ら、分子癌治療第 1巻第 1号、 2 0 0 0年、 p . 4 6 - 5 5 ； Date et al, FEBS Lett 420, 1-6, 1997； Date, et al., Oncogene 17, 3045-3054, 1998； Kuba, et al, Cancer Res., 60： 6737-6743, 2000。

本発明は、 NK 4を長期間安定して徐放させ、 NK 4による血管新生の抑制効果を発揮させることにより、腫瘍の浸潤、転移および癌の悪性化を防止し、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬化症などの、血管新生をともなう疾患を治療および予防しうる徐放性製剤を提供することを目的とする。発明の開示 .

本発明者らは、 NK 4タンパク質を含むハイド口ゲルを用いて作製した NK 4 の徐放性製剤が、血管新生モデル動物系において血管新生を有意に抑制しうることを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、 NK 4およびゼラチンからなるハイド口ゲルを含む徐放製剤を提供する。本発明にしたがって、 NK 4 を含浸させたゼラチンハイドロゲルを病巣およびその周辺に局所投与し、あるいは他の部位の投与してそこより NK 4を徐放させることにより、血管新生の有意な抑制効果が得られる。 .

別の観点においては、本発明は、 NK 4およびゼラチンハイド口ゲルを含む徐放製剤からなる、血管新生を抑制するための組成物を提供する。本発明の組成物は、癌の浸潤および転移を抑制する癌治療薬として、および加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬化症などの、血管新生をともなう疾患の治療および予防薬として有用である。さらに別の観点においては、本発明は、 NK 4およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤を用いて血管新生を阻害する方法を提供する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の NK 4含浸ゼラチンハイドロゲルのインビポにおける NK 4 の残存性を示すグラフである。

図 2は、ゼラチンハイドロゲルのインビポにおける分解性を示すグラフである。発明の詳細な説明

本発明においてゼラチンハイドロゲルを作製するために使用されるゼラチンは、牛、豚、魚類などを始めとする各種の動物種の皮膚、骨、腱などの身体のあらゆる部位から採取できるコラーゲン、あるいはコラーゲン製品から、アルカリ加水分解、酸加水分解、および酵素分解等の種々の処理によって変性させて得ることができる。遺伝子組換え型コラーゲンの変性体ゼラチンを用いてもよい。ゼラチンの性質は、用いる材料および処理方法により様々であるが、そのいずれの性質をもつゼラチンも本発明において NK 4の徐放のためのハイド口ゲル材料として利用することができる。

本発明において NK 4含有ゼラチンハイド口ゲルを作製するためには、力ルポキシル基の導入により改変されているゼラチンを用いることが好ましい。力ルポキシル基導入ゼラチンは、 DM S 0等の適当な溶媒中で上述の各種ゼラチンをァシル化剤と反応させることにより製造することができる。ァシル化剤としては、無水コハク酸、無水マレイン酸、無水ダルタル酸、無水フタル酸等を用いることができる。あるいは、力ルポキシル基に加えて、力ルポキシル基、アミノ基、水酸基、チオール基などの反応性官能基を分子内に有する化合物をゼラチン分子の力ルポキシル基、アミノ基、水酸基などと化学結合することによつても、ゼラチンのカルボキシル基導入反応が可能である。これらの官能基間の化学反応は既知の方法を用いて行うことができる。ゼラチンの力ルポキシル基導入率を確認するためには、当該技術分野において知られる種々の方法を用いることができ、例えば、 T N B S法により求めたァミノ基の減少率から算出することができる。カルポキシル基導入ゼラチンを用いることにより、クーロン力、疎水性相互作用、あるいは水素結合によなどの分子間相互作用力を介して、 NK 4がゼラチンハイド口ゲル中により安定に固定化され、ハイドロゲルが分解してゼラチン分子が水可溶化してハイド口ゲルから遊離しない限り、ゼラチンハイド口ゲルのマトリクス中から NK 4が脱離することを防止することができる。好ましくは、ゼラチンの力ルポキシル基導入率は 1 0 %以上、より好ましくは 1 5 %以上、さらに好ましくは 2 0 %以上である。力ルポキシル基導入率の上限としては特に制限はないが、用いられるゼラチン材料の性質や化学反応の種類によって、反応の平衡や立体障害のために 1 0 0 %の導入率を得ることができない場合もある。

本発明で使用されるゼラチンハイドロゲルは、上記ゼラチンを用いて種々の化学的架橋剤とゼラチン分子間に化学架橋を形成させることにより得られる。化学的架橋剤としては、例えばダルタルアルデヒド、例えば E D C等の水溶性カルボジイミド、例えばプロピレンオキサイド、ジエポキシ化合物、水酸基、カルポキシル基、アミノ基、チオール基、イミダゾール基などの間に化学結合を作る縮合剤を用いることができる。好ましいものは、ダルタルアルデヒドである。また、ゼラチンは、熱処理又は紫外線照射によっても化学架橋することもできる。また、これらの架橋処理を組み合わせて用いることもできる。さらに、塩架橋、静電的相互作用、水素結合、疎水性相互作用などを利用した物理架橋によりハイドロゲルを作製することも可能である。

ゼラチンの架橋度は、所望の含水率、すなわちハイド口ゲルの生体吸収性のレベルに応じて適宜選択することができる。ゼラチンハイドロゲルを調製する際のゼラチンと架橋剤の濃度の好ましい範囲は、ゼラチン濃度 1〜2 0 wZw%、架橋剤濃度 0 . 0 l〜l w/w%である。架橋反応条件は特に制限はないが、例えば、 0〜4 0 °C、 1〜4 8時間で行うことができる。一般に、ゼラチンおよび架橋剤の濃度、架橋時間が増大するとともにハイド口ゲルの架橋度は増加し、生体吸収性は低くなる。

ゼラチンハイド口ゲルの形状は、特に制限はないが、例えば、円柱状、角柱状、シート状、ディスク状、球状、粒子状などがある。円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のものは、通常埋込片として用いられることが多く、あるいは細かく碎いて粒子状にして用いることも可能である。また、球状、粒子状、ペースト状のものは注射投与も可能である。

円柱状、角柱状、シート状、ディスク状のゼラチンハイド口ゲルは、ゼラチン水溶液に架橋剤水溶液を添加するか、あるいは、架橋剤水溶液にゼラチンを添カロし、所望の形状の铸型に流し込んで、架橋反応させることにより調製することができる。また、成形したゼラチンゲルにそのまま、あるいは乾燥後に架橋剤水溶液を添加してもよい。架橋反応を停止させるには、エタノールァミン、グリシン等のアミノ基を有する低分子物質に接触させるか、あるいは、 p H 2 . 5以下の水溶液を添加する。反応に用いられた架橋剤および低分子物質を完全に除去する目的で、得られたゼラチンハイド口ゲルは、蒸留水、エタノール、 2 _プロパノ —ル、アセトン等により洗浄し、製剤調製に供される。

球状、粒子状のゼラチンハイド口ゲルは、例えば、三口丸底フラスコに固定した攪拌用モーター（例えば、新東科学社製、スリーワンモーター、 EYELA miniD. C. スターラー等）とテフロン（登録商標）用プロペラを取り付け、フラスコと一緒に固定した装置にゼラチン溶液を入れ、ここにオリープ油等の油を加えて 2 0 0〜6 0 0 r pm程度の速度で攪拌し、 WZO型ェマルジヨンとし、これに架橋剤水溶液を添加する力、ゼラチン水溶液を予めオリーブ油中にて前乳化 (例えば、ポルテックスミキサー Advantec TME-21、ホモジナイザー、 polytron PT1035等を用いて）しておいたものをォリーブ油中に滴下し、微粒子化した WZ〇型ェマルジョンを調製し、これに架橋剤水溶液を添加して架橋反応させ、遠心分離によりゼラチンハイド口ゲルを回収した後、アセトン、酢酸ェチル等で洗浄し、さらに 2—プロパノール、エタノール等に浸漬して架橋反応を停止させることにより、調製することができる。得られたゼラチンハイド口ゲル粒子は、 2—プロパノール、 Tw e e n 8 0を含む蒸留水、蒸留水等で順次洗浄し、製剤調製に供される。ゼラチンハイド口ゲル粒子が凝集する場合には、例えば、界面活性剤などの添加あるいは超音波処理（冷却下、 1分以内程度が好ましレ等を行ってもよい。

得られるゼラチンハイド口ゲル粒子の平均粒径は、上述の粒子作製時におけるゼラチン濃度、ゼラチン水溶液とオリ一ブ油との体積比、および撹拌スピードなどにより変化する。一般には粒径は 1〜1 0 0 0 mであり、目的に応じて適宜必要なサイズの粒子をふるい分けて使用すればよい。さらに、前乳化することによって、粒子サイズが 2 0 以下の微粒子状のゼラチンハイドロゲルを得ることができる。

球状、粒子状のゼラチンハイドロゲルを調製する別法として以下の方法も挙げられる。上記の方法と同様の装置にオリープ油を入れ、 2 0 0〜6 0 0 r pm程度の速度で攪拌し、ここにゼラチン水溶液を滴下して WZO型ェマルジョンを調製し、これを冷却後、アセトン、酢酸ェチル等を加えて攪拌し、遠心分離により未架橋ゼラチン粒子を回収する。回収したゼラチン粒子を、さらにアセトン、酢酸ェチル等、次いで 2—プロパノール、エタノール等で洗浄後、乾燥させる。この乾燥ゼラチン粒子を 0. l%Twe en 80を含む架橋剤水溶液に懸濁させ、緩やかに攪拌しながら架橋反応させ、使用した架橋剤に応じて 0. l%Twe e n 80を含む 10 OmM グリシン水溶液又は 0. 1 % T w e e n 80を含む 0. 004N HC 1等にて洗浄し、架橋反応を停止することによりゼラチンハイド口ゲル粒子を調製することができる。本法で得られるゼラチンハイドロゲル粒子の平均粒径は上記の方法の場合と同様である。

本発明のゼラチンハイドロゲルは適宜、適当な大きさ及び形に切断後凍結乾燥し滅菌して使用することができる。凍結乾燥は、例えば、ゼラチンハイド口ゲルを蒸留水に入れ、液体窒素中で 30分以上、又は— 8 で 1時間以上凍結させた後に、凍結乾燥機で 1〜3日間乾燥させることにより行うことができる。

本発明において徐放性製剤を製造するために使用される NK4は、 HGFの分子内断片であり、その構造は Dateら（上掲）に記載されている。 NK4は、医薬として使用できる程度に精製されたものであれば、種々の方法で調製されたものを用いることができる。例えば、遺伝子工学的手法により NK 4をコードする遺伝子を適切なベクタ一に組み込み、これを適当な宿主細胞に導入して形質転換し、この形質転換体の培養上清から目的とする組換え NK 4を得ることができる。上記の宿主細胞は特に限定されず、従来から遺伝子工学的手法で用いられている各種の宿主細胞、例えば大腸菌、酵母、昆虫、かいこ、または動物細胞などを用いることができる。 NK 4タンパク質は、 HGFアン夕ゴニストとしての活性を有する限り、そのアミノ酸配列中の 1若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失及び Z又は付加されていてもよく、また同様に糖鎖が置換、欠失及び Z又は付加されていてもよい。

本発明の NK4徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤は、上記の膨潤および乾燥力ルポキシル基導入ゼラチンハイド口ゲルに NK 4の水溶液を含浸させることにより得ることができる。 NK4は、力ルポキシル基を導入したゼラチンハイドロゲルと主として静電的相互作用を介した複合体を形成するが、 NK 4—ゼラチンハイド口ゲル複合体には、静電的相互作用だけでなく、疎水結合、水素結合等の他の相互作用も寄与していると考えられる。

本発明の NK 4含有徐放性ゼラチンハイド口ゲル製剤は、例えば、上記の凍結乾燥した力ルポキシル基導入ゼラチンハイドロゲルに NK 4溶液を滴下するか、あるいはゼラチンを NK 4溶液中に浸漬させ、ハイドロゲル内に NK 4を含浸させることにより得ることができる。この含浸操作は、通常、 4— 3 7 Tで 1 5分間一 1時間、好ましくは 4— 2 5 °Cで 1 5— 3 0分間で終了し、その間にハイド口ゲルは NK 4溶液で膨潤し、 NK 4がゼラチン分子と相互作用することによつて複合体を形成し、 NK 4がゼラチンハイドロゲル内に物理的相互作用によって固定される。 NK 4とゼラチンとの間の複合体の形成には、両者の間の静電的相互作用だけでなく、疎水結合、水素結合等の他の相互作用も大きく寄与していると考えられる。

ゼラチンに対する NK 4の重量比は約 5倍量以下であることが好ましい。さらに好ましくは、ゼラチンに対して NK 4は約 5〜約 1 Z 1 0 ⁴倍量の重量比である。

本発明の NK 4徐放性ゼラチンハイド口ゲル製剤は、 NK 4の徐放性効果と安定化効果を持っため、 NK 4の機能を少量で長時間にわたって発揮し得る。そのため、 HG Fアン夕ゴニストとしての機能および血管新生抑制機能が病巣部位において効果的に発揮され、癌の浸潤および転移を抑制する癌治療薬として、および加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症および未熟児網膜症等の眼科疾患、血管腫、慢性関節リウマチ、乾癬、浮腫性硬化症などの、血管新生をともなう疾患の治療および予防薬として、有効に作用することができる。

この徐放のメカニズムは、 NK 4が、カルボキシル基を導入したハイド口ゲル内のゼラチンに物理的に固定ィヒされていることに基づく。この状態では、因子は、ハイドロゲルから放出されない。生体内でハイドロゲルが分解されるにつれて、ゼラチン分子が水可溶性となり、それに伴って、固定化されている NK 4が放出されるようになる。すなわち、ハイド口ゲルの分解性によって、 NK 4の徐放性を制御することができる。ハイド口ゲルの分解性は、ハイド口ゲル作製時における架橋程度を調節することにより調節することができる。また、 NK 4がゼラチンと相互作用することによって、これらの生体内での安定性、例えば酵素分解に対する抵抗性などが向上する。

本発明のゼラチンハイドロゲルの架橋度を評価する指標として含水率がある。これは膨潤ハイドロゲルの重量に対するハイドロゲル中の水の重量パーセントである。含水率が大きければハイド口ゲルの架橋度は低くなり、分解されやすくなる。つまり、この含水率の値が NK 4の徐放（徐々に放出）を左右する。ハイド口ゲルの生体内での酵素分解性は、この含水率によって変化する。体内の場所、動物の種類によって多少の差はあるが、分解期間が 5日間から 3か月間で分解するハイドロゲルの含水率は 9 9一 8 5 w t %である。ハイドロゲルの分解期間は NK 4の徐放期間と一致するため、この場合の徐放期間も 5日から 3か月の間で変化する。好ましい徐放性効果を示す含水率としては約 8 0〜 9 9 wZw%であり、さらに好ましいものとしては、約 9 5〜9 8 wZw%のものが挙げられる。本発明の NK 4徐放性ゼラチンハイドロゲル製剤あるいはその複合体は、それぞれの用途に応じて適宜剤型を工夫することができる。例えば、シート状、ステイツク状、粒子状、ロッド状、ペースト状の剤型にして投与することができる。投与方法としては、皮内投与、皮下投与、筋肉内投与、体腔内投与、結合組織内投与、骨内膜投与などが挙げられる。特に好ましくは、癌病巣内に直接投与する。本発明製剤中の NK 4の用量は、疾患の重篤度、患者の年齢、体重等により適宜調製することができるが、通常成人患者当たり約 0 . 0 1〜約 5 0 0 gの範囲、好ましくは、約 0. 1〜約 2 0 0 zz g'の範囲から投与量が選択され、これを病巣またはその周辺部位に留置または注入することができる。また 1回の投与で効果が不十分であった場合は、該投与を複数回行うことも可能である。

本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また、本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願 2 0 0 2 - 2 9 2 8 2 5号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。実施例

以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。実施例 1. 力ルポキシル基導入ゼラチンの作製

ジメチルスルホキシド（DMSO) は脱水したものを用いた。牛骨由来酸性ゼラチン（等電点 5. 0、新田ゼラチンから供与） 2. 0 gを DMSO 14gに 37でにて溶解し、ゼラチンの 12. 5wt%溶液を得た。これに種々の量の無水コハク酸を溶解した DMSO 9 gを加え、 37 °Cにて 2時間撹拌した。得られた DMSO反応液を 1Lのアセトンに滴下し、ゼラチンを沈澱させた。沈澱物を 1 Lのアセトンで 3回洗浄し、真空下で乾燥させた。

ゼラチンの力ルポキシル基導入率は、 TNB S法により求めたァミノ基の減少率から算出した。ゼラチンを蒸留水.中に 37°Cにて溶解し、 0. 125mg/m 1の溶液を調製した。この溶液 0. 5mlに、 4%炭酸水素ナトリウム水溶夜 1 1111ぉょび0. 1 %トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS) ナトリウム塩水溶液 lmlを加え、 37 °Cで 2時間反応させた。反応後、 415 nmの吸光度を測定した。ァラニンの段階希釈溶液を用いて作成した検量線に基づき、カルポキシル基の導入率を求めた。このようにして、カルボキシル基導入率の異なる数種のゼラチンハイド口ゲルを得た。実施例 2. ゼラチンハイド口ゲルの作製

実施例 1で調製した力ルポキシル基導入ゼラチンおよび牛骨由来酸性ゼラチン (等電点 5. 0、新田ゼラチンから供与）をそれぞれ蒸留水に 37 °Cにて溶解し、 5wt %ゼラチン溶液（pH6. 0) を調製した。この溶液 40mlに、 25% ダルタルアルデヒド水溶液 200 1を加え、よく撹拌した。直ちに、 8X8 cm²バランスディッシュに流延し、 4°Cにて 24時間ゲル化させた。得られたハイド口ゲルを 1 X 1 cm²に切り取り、成形した。これを 0. 1Mグリシン水溶液で処理して未反応のアルデヒド基をブロックし、蒸留水で洗浄後、凍結乾燥した。得られた凍結乾燥ゼラチンハイド口ゲルは EOGガス滅菌をした後に用いた。実施例 3. NK4の¹²⁵ I—標識

NK4溶液にクロラミン T (0. 2mg/^/m 1 , 0. 5M リン酸バッファー + 0. 5M 1^ 3<31溶液、 117. 5) 溶液 100 1と Na¹²⁵ I溶液（1· 48MBq) を加え、撹拌した。 2分間反応後、ピロ亜硫酸ナトリウム水溶液 (4. Omg/ml) を 100 ^ 1加え、反応を停止させた。反応溶液を陰ィォン交換樹脂カラムにより未反応の Na¹²⁵ Iを除き、 ¹²⁵ Iによりラベルされた NK4 (¹²⁵1— NK4) 溶液を得た。

実施例 2で調製した各凍結乾燥ゼラチンハイドロゲルに¹²⁵ I一 NK4溶液 2 0 1を滴下し、 4°Cにて 12時間静置することにより、溶液をハイドロゲルに含ませた。これにより¹²⁵ I一 NK 4含浸ゼラチンハイドロゲルを得た。実施例 4. インビポ徐放試験

ddYマウス（雌、 6週齢）をネンブタール（1 x lZl g体重）にて麻酔し、背部皮下に実施例 3で調製した¹²⁵ I—NK4含浸ゼラチンハイドロゲルを埋入した。 1， 3, 7および 14日後にマウスを犠牲死させ、残存ハイド口ゲル、背部皮膚およびゲル周辺組織の残存放射活性を測定することにより、残存している NK 4量を求めた。結果を図 1に示す。力ルポキシル基導入率が 19. 8%、 2 8. 3%または 56. 9%のゼラチンハイド口ゲルを用いた場合には、カルボキシル基導入率が 0 %および 6. 7 %のゼラチンハイドロゲルを用いた場合と比較して、 NK 4の放出が有意に抑制されていることがわかる。図 2は、ハイドロゲルのインビポでの分解を示す。力ルポキシル基の導入率に関係なく、いずれのハイド口ゲルもインビポでの分解の時間変化はほぼ同様であることがわかる。このハイド口ゲルの残存量の時間変化は、力ルポキシル基導入率が 19. 8%以上のハイドロゲルに関しては、 NK4の残存の時間変化パターンとよく相関していた。このことは、本発明の NK 4含有ハイド口ゲル徐放製剤においては、 NK4がハイド口ゲルの生体内分解とともに徐放されていることを示している。これに対して、カルボキシル基導入率の低いハイド口ゲルでは、ハイド口ゲルの残存に比べて、 NK4の残存量が低く、 NK4が単純拡散によりハイド口ゲルから放出されていると考えられ、徐放パターンのコントロールができない。

NK4の生理活性は、角膜マイクロポケット法を用いて、 bFGFによる血管新生を阻害する作用により評価した。 EVA (エチレンビニルアセテート）の塩化メチレン溶液（5wt%) 10 1をガラスシャーレに滴下し、風乾して、 E VAフィルムを作製した。これに bFGF溶液を 1. O I (300 ng) 滴下し、 25T:で 1時間静置することにより bFGF溶液を含浸させた。滅菌した凍結乾燥ゼラチンハイドロゲル（1 X 1 X0. 2111111³に?^1 4溶液を1. 0 n 1

(100 Ong) を滴下し、 4でで 12時間静置することにより NK 4を含浸させた。

日本白色家鬼を麻酔下にて角膜にその圧さの半分の深さに切開を加えた。その傷から角膜実質を剥離し、幅 2mm、長さ 5mmのポケットを作製した。この中に NK 4含浸ゼラチンハイド口ゲル（力ルポキシル基導入率 28. 3%) と bF GF含浸 EVAフィルムを揷入した。対照には、 PBS含浸ゼラチンハイドロゲルと bFGF含浸 EVAフィルムを挿入した。

術後 7日において、角膜組織における血管新生を顕微鏡下にて観察評価した。対照である PBS含浸ゼラチン群では、 bFGFによる血管新生が見られ、赤くなっていることが観察された。一方、本発明にしたがう NK 4含浸ゼラチン群では、血管新生が見られなかった。このことから、 NK4含浸ゼラチンハイドロゲルが b F G Fによる血管新生を有意に阻害したことが確認された。

Claims

請求の範囲

1. NK 4およびゼラチンハイド口ゲルを含む徐放製剤。

2. NK4およびゼラチンハイド口ゲルを含む徐放製剤からなる、血管新生を阻害するための組成物。

3. NK4およびゼラチンハイドロゲルを含む徐放製剤を用いて血管新生を阻害する方法。