JPS6328890B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は止血剤及びその製造方法に関し、より
詳細に述べると、化学的に修飾されたコラーゲン
ポリマー（コラーゲン分子の集合体）からなる止
血剤及びその製造方法に関するものである。 血液中の血小板の役割は止血機構の初期に於て
非常に重要である。血管壁の細胞層が剥れたり、
血管が破れたりして、血管の結合組織が露出する
と、先づ血液中の血小板が結合組織に粘着して凝
集体を形成し、出血を止める作用をすると同時
に、血液凝固を促進する因子を放出して血液凝固
を促進させる。 コラーゲンは結合組織の主要タンパク質であ
り、血小板がコラーゲン繊維と反応して粘着を起
し、更に凝集体を作ることはよく知られている。
言い換えると、コラーゲンは血栓形成を誘起させ
る重要な物質の１つである。 最近止血剤としてのミクロクリスタリンコラー
ゲン（MCC）について報告がなされている。例
えば、MCCの止血効果を、従来止血剤として使
用されているゼラチンスポンジやオキシセルロー
ズ製品などと比較した報告がなされている。 本発明は、MCCよりも更に優れた止血効果を
有するコラーゲン止血剤に関するものである。 我々は最近次のことを発見した。即ち、(1)単分
子のコラーゲンは血小板凝集反応を起さないが、
コラーゲン分子が規則的に配列し、700Åの周期
構造をもつようなコラーゲンポリマーの場合は血
小板凝集反応を起す。(2)血小板凝集反応を起させ
るに必要な上記コラーゲンポリマーの最小の大き
さは、長さ7000〜10000Å、太さ（直径）20〜40
Åであり、670〜700Åの周期構造が必要である。
(3)メチル化、エチル化、もしくはメチル化（又は
エチル化）及びグアニジール化コラーゲンの表面
に全血を接触させた場合、血小板及びフイブリン
繊維の粘着が大きく促進される。 この知見を更に詳細に説明する。コラーゲンが
血小板を凝集させて血液凝固に導く反応において
は、コラーゲンの正電荷が大きな役割をしてい
る。コラーゲン中には1000残基のアミノ酸当り80
個のCOOH（負電荷）、90個の正電荷（リジン35
個、ヒスチジン５個、アルギニン50個）がある。
このうち、80個のCOOH基（負電荷）をエステ
ル化でマスクすると正の実効電荷は90になり、止
血作用が向上する。又、正電荷中、アルギニンが
特に重要でグアニジール化して35個のリジンをア
ルギニン残基に変化させることにより、更に止血
作用が向上する。またコラーゲンが血小板と反応
する際、単分子コラーゲン（長さ3000Å、直径15
Å）では反応しない。コラーゲン分子が規則性の
ある配列をとり（４次構造を作り）、その大きさ
が長さで7000Å以上、太さで20Å以上になつた時
に始めて反応する。この場合、コラーゲン分子が
寄り集つても、規則性がなくかつ無定形の集合形
態では反応しない。従つて670Åの周期構造をも
つ天然型繊維のような規則性ある配列が必要とな
る。 このような発見は次の様な結論を導く。即ち、
効果的なコラーゲン止血剤は、エステル化又はグ
アニジール化、もしくはエステル化及びグアニジ
ール化されたものであり、しかもコラーゲン分子
の周期構造が670〜700Åであるような天然型コラ
ーゲン繊維の４次構造をもつ必要がある。ここ
で、メチル化、グアニジール化は“化学修飾”と
称され、コラーゲン分子の立体構造を破壊するこ
となく、コラーゲン分子を構成するポリペプチド
鎖の側鎖の官能基を化学反応で変化させることで
ある。また、４次構造とは、コラーゲン分子が集
合してコラーゲンポリマーや繊維を作る時、ポリ
マーや繊維内でのコラーゲン分子の配列の仕方に
関する構造を意味する。 我々は、例えば、メチル化、又は好ましくはメ
チル化及びグアニジール化されることにより無修
飾のものより正電荷が比較的大きく、かつまた規
則配列されたコラーゲン分子からなるコラーゲン
ポリマーを用いて、粉末状、ゲル状もしくはスポ
ンジ状の止血剤を作成し、市販されている止血剤
と効果を比較した結果、この新しいコラーゲン止
血剤の方がより効果的であることが分つた。 上に述べたコラーゲンポリマーのサイズは、血
小板凝集反応を起すのに必要な最小サイズであ
り、勿論、ポリマーのサイズの上限は制限はな
い。しかしあまりに大きいと表面積が減少して効
果が低下するので、上限サイズは、赤血球の大き
さに対応して、長さ10μ迄、直径1μ迄であるのが
好ましい。また、ゲル状の止血剤の場合、ポリマ
ーサイズは粉末状止血剤の場合より小さい方が好
ましい。 コラーゲン分子の重合度は、透析液のPHをコン
トロールすることにより調節出来る。即ち、より
高いPHの場合、重合度は大きくなる。ゲル状止血
剤を作成する場合は、透析液のPHはやや酸性側で
ある。 コラーゲンポリマーの正の実効電荷の増加は、
アルコールもしくは他のエステル形成試剤の作用
でカルボキシル基をエステル化することによりな
される。又、更にアミノ基をグアニジール化する
ことにより、より塩基性になる。 本発明において使用されたコラーゲンは、例え
ば仔牛からの酵素溶解コラーゲン（アテロコラー
ゲン）である。仔牛以外に、ステア、カウ、ブル
などの牛皮や豚皮もコラーゲン原料として使用で
きる。コラーゲナーゼ以外のタンパク質分解酵
素、例えばペプシン、プロナーゼなどはコラーゲ
ン分子のテロペプタイドを消化分解し、不溶性コ
ラーゲンからテロペプタイドのない可溶性の分子
状コラーゲン（テロペプタイドプアーコラーゲ
ン）を生成する。このテロペプタイドプアーコラ
ーゲンは止血剤の原料に最適である。なぜなら
ば、このコラーゲンの抗原性は非常に弱く、医学
材料として抗原性などの問題を起さないからであ
る。最近、規則的に分子が配列したコラーゲンポ
リマーがテロペプタイドプアーコラーゲンから得
られた。例えば、0.02MのNa₂HPO₄に透析する
と、670Åの周期構造をもつた天然型繊維コラー
ゲンが得られる。又、テロペプタイドプアーコラ
ーゲン溶液のPHを７〜８に調節しても得られる。 粉末状の止血剤は天然型繊維コラーゲンから作
られる。又、止血小板を凝集せしめるに充分な大
きさのコラーゲンポリマーは、テロペプタイドプ
アーコラーゲン溶液をPH4.8〜5.2の緩衝液に透析
することにより得られる。ゲル状の止血剤はこの
コラーゲンポリマーから作られる。ゲル状及び粉
末状コラーゲンの４次構造の安定化は、紫外線照
射又はガンマ線照射、或いはアルデヒド処理（ホ
ルムアルデヒド、グルタールアルデヒドなどによ
る処理）により達成される。更に、メチル化、又
はメチル化及びグアニジール化処理が行なわれ
る。化学修飾された天然繊維型コラーゲンは乾燥
され、ウイリーミルで粉末化される。化学修飾さ
れたコラーゲンポリマーはPH4.8〜5.2の水中に分
散され、ゲル状の止血剤が作られる。 次に本発明を実施例に付き更に詳細に説明す
る。 実施例 １ 新鮮な約５Kgの仔牛を脱毛、シエービングして
汚れを除いた後、真皮層のみを肉挽機で粉砕し
た。この皮を、１ｇのペプシンを含むPH2.5（HCl
酸性）の１の水に分散させ、20℃で５日間、
時々撹拌しながら溶解させた。粘稠な溶解コラー
ゲンをフランネルで過し、NaOHでPH10に調
節し、４℃で24時間放置してペプシンを不活性化
した。PHを７に調節後、コラーゲンの沈澱物を遠
心で集め、水で３回洗滌した。酵素溶解コラーゲ
ン（テロペプタイドプアーコラーゲン）を凍結乾
燥して保存した。 100ｇの乾燥コラーゲンをPH2.0（HCl酸性）の
５の水に溶解させ、25の0.02MのNa₂HPO₄
に透析し、白色の天然型コラーゲン繊維（670Å
周期）を作成した。遠心回収後、水で２回洗つ
た。コラーゲン繊維を、0.1％のグルタールアル
デヒドを含むPH7.2の燐酸緩衝液（10の水に
10.35ｇのKH₂PO₄及び64.75ｇのNa₂HPO₄・
7H₂Oを溶かしたもの）２で30分間処理し、３
回水洗後、凍結乾燥した。この乾燥コラーゲン
を、0.1NのHClを含む無水メタノール２に浸
漬し、７日間室温でメチル化した。メチル化後、
コラーゲンを真空中で乾燥し、100メツシユの網
をもつたウイリーミルで粉砕した。 このようにして作られた粉末状コラーゲン止血
剤は、これ迄市販されている止血剤より止血効果
が優れ、犬を用いての実験でも異物反応や炎症反
応など全く問題なかつた。 実施例 ２ 実施例１により天然型コラーゲン繊維（670Å
周期）を作つた。透析膜から取り出した後、コラ
ーゲン繊維をワーリングブレンダーにかけ、ミル
ク状の乳化液を作つた。この乳化液を10の石英
フラスコに入れ、窒素存在下で紫外線照射する。
紫外線照射は2537Åの紫外線を出す15ワツトの殺
菌燈で２時間行なつた。紫外線照射コラーゲンは
遠心で集め、水で３回洗つた後、凍結乾燥した。
照射コラーゲンのメチル化は実施例１の方法で行
つた。乾燥したメチル化コラーゲンを100メツシ
ユの網をもつたウイリーミルで粉砕した。 この粉末状メチル化コラーゲン止血剤は従来の
市販止血剤より止血効果が優れており、犬の実験
でも異物反応や炎症反応は認められなかつた。 実施例 ３ 天然型コラーゲン繊維を実施例１の方法で作
り、次の方法でグアニジール化した。100ｇの乾
燥コラーゲンを１の水に分散させ、NaOHで
PH9.5に調節した。１−グアニール−３，５−ジ
メチルピラゾールニトレート80ｇを１の水に溶
かし、PH9.5に調節した。この試薬液とコラーゲ
ン分散液とを混合し、４℃で７日間、時々撹拌し
ながらグアニジール化した。コラーゲン繊維の４
次構造はこの反応中全く安定であつた。コラーゲ
ン繊維を遠心で集め、水で３回洗つた。グアニジ
ール化コラーゲンを、0.1％のグルタールアルデ
ヒドを含むPH7.2の燐酸緩衝液で30分処理し、２
回水洗後、凍結乾燥した。乾燥後、実施例１の方
法で粉砕した。 この方法で作つた粉末状のグアニジール化コラ
ーゲン止血剤は従来の市販止血剤より止血効果が
優れ、犬の実験でも異物反応や炎症反応は認めら
れなかつた。 実施例 ４ 紫外線照射メチル化コラーゲンを実施例２の方
法で作成した。このコラーゲン100ｇを実施例３
の方法でグアニジール化した後、水で３回洗い、
真空乾燥した。乾燥コラーゲンを100メツシユの
網の付いたウイリーミルで粉砕した。 この粉末状のメチル化及びグアニジール化コラ
ーゲン止血剤は従来の市販止血剤より止血効果が
優れ、犬の実験でも異物反応、炎症反応ともに認
められなかつた。 実施例 ５ 実施例１の方法で酵素溶解コラーゲン（アテロ
コラーゲン）を作つた。このコラーゲン100ｇを
PH２（HCl酸性）の水２に溶解させ、0.0002M
の酢酸緩衝液（PH5.0）に４℃で透析した。緩衝
液は３回取換えた。この透析でコラーゲンは重合
し、血小板を凝集させ得る周期構造をもつたコラ
ーゲンポリマーになつた。しかし沈澱は起さなか
つた。透析平衡の後、コラーゲンを透析膜より取
り出し、実施例２の方法で紫外線照射して架橋を
導入し、コラーゲンポリマーのもつ周期性構造を
安定化した。更にPHを７〜８に調節し、コラーゲ
ンを沈澱せしめ、水洗を２回行つた後、凍結乾燥
した。凍結乾燥コラーゲンを実施例１の方法でメ
チル化した。メチル化コラーゲンを真空乾燥した
後、５の水に分散させた。メチル化コラーゲン
はHClを含有しているので、この分散液は酸性を
示して容易に分散するが、周期性構造（４次構
造）は保持されていた。このゲル状分散液のPHを
５に調節した。 このメチル化コラーゲンゲルの止血剤は優れた
止血効果を示し、犬の実験でも異物反応、炎症反
応ともに認められなかつた。 実施例 ６ 実施例５の方法により周期性構造をもつたメチ
ル化コラーゲンポリマーを作り、凍結乾燥した。
このコラーゲン100ｇを１の水に分散し、PHを
9.5にNaOHで調節した。実施例３の方法により
グアニジール化を行つた。反応後、コラーゲンを
遠心で集めて水で３回洗い、５の水に分散さ
せ、HClでPH５に調節してゲル状にする。このゲ
ル状のメチル化及びグアニジール化コラーゲンは
周期性構造を保持したコラーゲンポリマーであ
り、血小板凝集反応を誘起するのに都合のよいコ
ラーゲン粒子であつた。 この方法で作られたメチル化及びグアニジール
化コラーゲンゲルは止血効果が優れており、犬の
実験で異物反応及び炎症反応が認められなかつ
た。 実施例 ７ 実施例５の方法により真空乾燥したメチル化コ
ラーゲンを作つた。このコラーゲン100ｇを１
の水に分散させた後、PHを5.0に調節した。この
分散コラーゲンは、血小板凝集を誘起するに必要
な周期性構造を有し、充分な大きさのコラーゲン
ポリマーであつた。このコラーゲン分散液を深さ
５mmのアクリル樹脂板の平らな容器内に入れ、凍
結乾燥してスポンジを作つた。 このスポンジ状のメチル化コラーゲンは優れた
止血効果を示し、犬の実験でも異物反応や炎症反
応は認められなかつた。 以上述べた各実施例による止血剤の効果を調べ
るために、実験動物として犬を用いて実験を行な
い、比較のために化学処理をしない無修飾コラー
ゲンと市販の酸化セルローズ止血剤を試験した。 実験方法 実験箇所として犬の頚動脈を用いた。頚動脈血
管を露出させ、無菌ガーゼの上に充分なサンプル
（約１cmの厚さ）をのせ、サンプルが血管に密着
するように軽く押えた。この時、血流を阻害する
ような過大な圧力をかけないように注意し、どの
実験も同じ圧力になるよう調節した。17号ゲージ
の套管針を用い、外部から血管に注意深く穴をあ
けた。穴をあけた後、もう一度外部から血管を軽
く押え、血管穴とサンプルが密着するようにし
た。穴をあけてから３分後に静かにサンプルを剥
がし、止血したかどうかを観察した。止血しない
場合は更に３分間サンプルを密着させた（２回
目）。２回目でも止血しない場合は更に３分間３
回目の密着を行つた。３回目でも止血しなかつた
場合は実験を中止し、血管穴を縫合した。

【表】

【表】 考 察 実験結果の上記表に示された様に、本出願の実
施例の方法で製造されたコラーゲン止血剤の成績
は、合計成功率で80％以上、場合により殆んど
100％近くの止血成功率を示した。しかもいずれ
の場合も第１回もしくは第２回目に於て大部分の
止血成功数をかぞえた。第３回に成功する数は少
なくなつている。これは血液との接触時間が短か
くてもよい止血作用を示したことになる。 これらに反し、本出願の各実施例で製造した化
学修飾コラーゲン止血剤と同様の物理的状態をも
つ、即ち粉末状もしくはゲル状の無修飾コラーゲ
ンでは、合計成功率が60％台に低下している。
又、１回目、２回目の止血成功数よりも、３回目
の成功数が多い。この傾向は血液との接触時間が
長くならないと止血効果があがらないことを示し
ている。市販酸化セルローズも同様で止血効果は
余りよくなかつた。 これらの結果は、本出願の方法で製造された化
学修飾コラーゲン止血剤は良い止血作用をもつて
いることを示している。 以上実施例に付き述べたが、上に述べたメチル
化の場合は通常メタノールが使用されるが、他の
水溶性アルコール、例えばエタノールプロパノー
ルなども使用出来る。 上述の各実施例で得られたコラーゲン止血剤が
規則性のあるコラーゲン分子の配列構造（４次構
造）をもつていること、及びこれらのコラーゲン
ポリマーの大きさが或る大きさ以上であること
は、血小板凝集反応を誘起せしめるためには重要
なことである。例えばモノマーコラーゲンもしく
はダイマーコラーゲンでは、血小板凝集反応は起
きない。血小板凝集反応を起させるためには、コ
ラーゲンポリマーの大きさは、長さが7000〜
10000Å以上、直径が20〜40Å以上であることが
必要である。モノマーコラーゲンは長さ2800Å、
直径15Åであるので、血小板凝集反応を誘起せし
めるのに必要なコラーゲンポリマーは、長さでモ
ノマーコラーゲンの３倍、直径で２倍程度であ
る。更に、このコラーゲンポリマー中では、天然
型コラーゲン繊維構造（670〜700Å周期）のよう
な規則性ある周期構造が保持されていなければな
らない。この様な４次構造は化学修飾されても保
持されていなければならない。更に、化学修飾、
即ちエステル化、又はエステル化及びグアニジー
ル化により、これらコラーゲンポリマーの正の実
効電荷を増加させることが、止血剤としての効果
を上げることに不可欠である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 比較的大きい正電荷を有するコラーゲンポリ
   マーを主成分とし、このコラーゲンポリマーがコ
   ラーゲン分子の規則的配列構造を有しかつ7000Å
   以上の長さ、20Å以上の直径を有していることを
   特徴とする止血剤。 ２ コラーゲンポリマーが7000Å〜10μの長さ、
   20Å〜1μの直径を有している、特許請求の範囲
   の前記第１項に記載の止血剤。 ３ 化学修飾によつて、コラーゲン分子に正電荷
   が付与されている、特許請求の範囲の前記第１項
   又は第２項に記載の止血剤。 ４ エステル化とグアニジール化との少なくとも
   一方によつてコラーゲン分子が化学修飾されてい
   る、特許請求の範囲の前記第３項に記載の止血
   剤。 ５ コラーゲンポリマーが安定化されておりかつ
   通常670〜700Åの配列周期の天然繊維型構造を有
   している、特許請求の範囲の前記第１項〜第４項
   のいずれか１項に記載の止血剤。 ６ コラーゲンポリマーが紫外線照射又はガンマ
   線照射によつて安定化されている、特許請求の範
   囲の前記第５項に記載の止血剤。 ７ コラーゲンポリマーがアルデヒドによつて安
   定化されている、特許請求の範囲の前記第５項に
   記載の止血剤。 ８ 粉末状である、特許請求の範囲の前記第５項
   〜第７項のいずれか１項に記載の止血剤。 ９ ゲル状である、特許請求の範囲の前記第５項
   〜第７項のいずれか１項に記載の止血剤。 １０ スポンジ状である、特許請求の範囲の前記
   第５項〜第７項のいずれか１項に記載の止血剤。 １１ コラーゲンを分解して可溶化する工程と、
   この可溶化コラーゲンを透析又はPH調節によつて
   所定サイズ及び周期構造の規則的配列構造体にす
   る工程と、この構造体を化学的に修飾する工程と
   を夫々具備することを特徴とする、コラーゲンポ
   リマーを主成分とする止血剤の製造方法。 １２ タンパク質分解酵素によつてコラーゲン分
   子を消化分解し、この酵素溶解コラーゲンをPH
   4.8〜5.2の緩衝液に透析することによつて所定サ
   イズのコラーゲンポリマーを生成させ、このコラ
   ーゲンポリマーを水溶性脂肪族アルコールとの反
   応でエステル化する、特許請求の範囲の前記１１
   項に記載の方法。 １３ タンパク質分解酵素によつてコラーゲン分
   子を消化分解し、この酵素溶解コラーゲンを
   Na₂HPO₄溶液への透析又はPH７〜８への調節に
   よつて所定の配列周期の天然繊維型構造体にし、
   この構造体をエステル化及び／又はグアニジール
   化する、特許請求の範囲の前記第１１項又は第１
   ２項に記載の方法。 １４ エステル化を水溶性脂肪族アルコールによ
   つて行ない、しかる後にグアニジール化を行な
   う、特許請求の範囲の前記第１３項に記載の方
   法。 １５ コラーゲンポリマーを紫外線照射又はガン
   マ線照射によつて安定化する、特許請求の範囲の
   前記第１１項〜第１４項のいずれか１項に記載の
   方法。 １６ コラーゲンポリマーをアルデヒド溶液での
   処理によつて安定化する、特許請求の範囲の前記
   第１１項〜第１４項のいずれか１項に記載の方
   法。 １７ コラーゲンポリマーを乾燥後に粉砕して粉
   末状にする、特許請求の範囲の前記第１１項〜第
   １６項のいずれか１項に記載の方法。 １８ コラーゲンポリマーを乾燥し、しかる後に
   PH調節下に水中に分散させてゲル状にする、特許
   請求の範囲の前記第１１項〜第１６項のいずれか
   １項に記載の方法。 １９ コラーゲンポリマーを乾燥し、しかる後に
   水中に分散させ、この分散液を凍結乾燥してスポ
   ンジ状にする、特許請求の範囲の前記第１１項〜
   第１６項のいずれか１項に記載の方法。