WO2004020656A1

WO2004020656A1 - 癌化細胞コロニーの培養系、検出解析システムおよび検出方法

Info

Publication number: WO2004020656A1
Application number: PCT/JP2003/010865
Authority: WO
Inventors: Norioki Kou; Makoto Fujii
Original assignee: Natural Way Co., Ltd.
Priority date: 2002-08-28
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2004-03-11
Also published as: KR20050062543A; CN1678751A; JPWO2004020656A1; AU2003257569A1

Abstract

細胞癌化を引き起こす環境中の細胞発癌剤、細胞癌化を抑制する薬品や食品を迅速かつ正確に検出することが可能な癌化細胞コロニーの検出解析システムおよびその方法を提供するために、培地と、軟寒天と、発癌誘導物質および／または抗癌剤とから構成される所定の寸法を有する底層１１と、培地と、軟寒天と、細胞とから構成される所定の寸法を有する上層１２とから構成された寒天重層培養法に基づいて調製された培養系１を用いた、光学顕微鏡２１、デジタルカメラ等の電子データ変換手段２２および電子データ変換手段２２により変換されたデータを処理するためのコンピュータシステム２３から構成される癌化細胞コロニーの検出解析システムを本発明は提供する。このコンピュータシステム２３には、電子データをグレー化し、キャリブレーション、減算および単一しきい値による２値化を行い、コロニーの有無、コロニーの数、コロニーの寸法分布等を解析する画像解析ソフトウェアが格納されている。

Description

明細書

癌化細胞コロニーの培養系、検出解析システムおよび検出方法産業上の利用分野

本発明は、癌ィ匕細胞コロニー検出解析システム、癌化細胞コロニー検出方法および、これに用いる癌ィ匕細胞コ口ニーの培養系に関する。より詳しくは軟寒天から構成された軟寒天重層法による培養系と、この培養系を用いた細胞培養及び培養した細胞を半自動ィ匕して癌細胞コロニーを検出するシステムと、その方法とに関する。背景技術

癌は医療技術のめざましい進歩にもかかわらず、日本においては 1 9 8 1年以来、死亡原因のトップである。したがって、社会の関心は癌の予防に移りつつある。そこで、まず発生過程を知った上で癌の予防を立てなければならない。

一般に発癌性物質が体に取り込まれて大半は生体の防御能力で代謝し、体外に排泄される。体に溜まつた一部は三つの段階を経て最終的に癌という病をもたらす。まず、これらの発癌性物質が短期間（例えば数日間）に細胞遺伝子に障害を与え、変位細胞をもたらす。この変位細胞は、数年から数十年の潜伏期を経て前癌状の細胞となる。最後に前癌状細胞が速いスピード（例えば 1年間）で増殖し、癌となる。このような前癌状の細胞になるまでは我々自身は、何も感じず、現代の医療技術での検出も困難であるので、癌と診断されたら、余命が短いと言われるのがそのわけである。

一方、疫学的調査によると、癌の発生の原因の大部分は、私たちの環境、とくに食生活によるものではな V、かという見方が注目されており、長寿 ·健康社会に向けて「食と癌予防」の関連性について、強い関心が寄せられている。

しかしながら、前記したように変位細胞から癌細胞になるためには長い年月がかかるため、癌の予防のためには、この長レ、過程を持続的に阻害しなければならない。現時点では、食による癌の予防の効果検証は難しく、疫学的調査に頼るしかない。したがって、食材による癌予防の有効な検証方法の開発およびその作用機構の究明がこれからますます要求されると考えられる。

食材による癌予防の有効な検証方法の開発おょぴその作用機構の究明の一つのァプローテとして、 Proceedings of the ational Academy of Science of the United States of America. 9 8卷、 1 3号、 7 5 1 0〜 7 5 1 5頁には、発癌剤による正常細胞の癌化および癌細胞の進行を、寒天培地でコロニーを形成させて、このコロニーの数を計測することで検証する記載がある。

し力し、先行技術には、寒天培地の濃度および厚さに問題点があり、安定な細胞のコロニー数が得られない。また、培養期間は長く、 2 0〜3 0日間を要する。さらに、先行技術では、コ口ニーの検出を顕微鏡下での肉眼観察にて行うため、コロニーの計数はできるものの、コロニーの大きさおょぴ分布の解析を行うことはできなかった。また、この計数には時間おょぴ体力を著しく要し、また、計数の結果に実験者の個人差が出やすく、精度に問題があり、この検証方法の課題となっている。また、この検証方法を用いて計数するためには、実験者の熟練を要するという課題もあった。

したがって、本発明は、細胞癌化を引き起こす環境中の細胞発癌剤、細胞癌化を抑制する薬品や、食品などを迅速カゝっ正確に検出することが可能な癌ィヒ細胞コロニーの検出解析システムおよびその方法を提供することを課題とする。発明の開示

本発明者は、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、癌化細胞の培養条件を規匕し、この規格に沿って培養された癌ィ匕細胞をデジタルデータとしてコンピュータなどの演算手段に取り込み、取り込んだデジタルデータを特殊処理することによつて、上記課題を解決できることを見出して本発明を創作するに至った。

第 1の発明は、培地と、 0 . 5 %〜0 . 6 %の濃度を有する軟寒天と、発癌誘導物質およぴ抗癌剤から成る群から選択される少なくとも 1種の物質とから構成される厚さ 2 . 4 mmを有する底層と、培地と、 0 . 3 %〜0 . 4 %の濃度を有する天と、細胞とから構成される厚さ 1 . 6 mmを有する上層とから構成され、寒天重層培養法に基づいて調製されたことを特徴とする癌化細胞コ口ユーの培養系である。第 1の発明にかかる癌化細胞コロニーの培養系において、底層と上層とが各々所定の構成を有することが重要である。すなわち、培養系を一定条件にすることにより、再現性のある検出および解析結果が得られる。

さらに、第 1の発明において、培養系の上層に含まれる細胞が、マウス新生児皮膚細胞 J B 6株であることが好ましレ、。

J B 6細胞は、マウスの新生児皮膚の初代培養細胞から樹立された細胞株である。この細胞は非腫瘍性で、発癌プロモーター（T P A、 TNF—アルファ、 E G F) のみの処理によって軟寒天コロニー形成能を持っている。また、この細胞は T P Aの一段の処理によって、コロニー能を獲得し、プロモートされて前癌状の状態にあるので、発癌プロモーションの検出系、またその作用機構の解析に優れた材料であると考えられている。さらに、本発明の検出系で癌抑制活性を示した多くの化合物は種々の動物実験レベルで、同様な発癌抑制効果が実証されている。したがって、この検出系は発癌プロモーション抑制効果を迅速に検出する手法として現在注目されている系である。

第 2の発明は、培地と、軟寒天と、発癌誘導物質および抗癌剤から成る群から選択される少なくとも 1種の物質とから構成される所定の寸法を有する底層と、培地と、軟寒天と、細胞とから構成された所定の寸法を有する上層とから構成され、寒天重層培養法に基づいて調製された培養系を用いた癌化細胞コロニーの検出解析システムにであって、この培養系により培養された癌化コロニーを観察するための光学顕微鏡と、この光学顕微鏡に映し出されたコロニーの映像を電子データに変換するための電子データ変換手段と、この電子データ変換手段により変換された電子データを処理するためのコンピュータシステムとから構成され、このコンピュータシステムは、この電子データをグレー化し、キャリブレーション、減算及ぴ単一しきい値により 2値化を行い、コロニーの有無、コロニーの数、コロニーの寸法分布から成る群から選択された少なくとも 1つを解析する画像解析ソフトウェアが格納されていることを特徴としている。

このように構成することによって、細胞癌化を引き起こす環境中の細胞発癌剤また、細胞癌ィ匕を抑制する薬品や食品を迅速かつ正確に検出することが可能となる。第 2の発明において、このコンピュータシステムは、既知の発癌誘導物質から得られた標準データによる解析結果を有しており、前記既知の発癌誘導物質の解析結果と、発癌誘導物質および抗がん剤から成る群から選択される少なくとも 1 種類の物質とを比較することが好まし!/、。

このように既知の成分を標準物質として、未知成分の癌化挙動を調べることが容易となる。なお、本発明において使用される用語「癌化挙動」とは、物質が癌抑制作用または誘導作用のいずれかを有していることを意味している。

さらに、第 2の発明において、前記既知の発癌誘導物質が T P A、 TNF—ァルファ、活性酸素種から成る群から選択されることが好ましレ、。

これらの物質の発癌誘導挙動は、公知となつており、標準物質としてこれらの物質と比較することにより、未知の物質の癌誘導または癌抑制挙動を容易に把握することができる。

第 3の発明は、本発明の検出解析システムを用いる癌化細胞のコロユーの検出解析方法であって、（A) 発癌作用または抗癌作用を有する物質を選択して前記培養系を調整する段階、（B) 前記培養系において癌ィ匕細胞を所定条件で所定時間培養する段階、（C) 前記培養した癌ィ匕細胞を、顕微鏡および電子データ変換手段を介して電子画像データとしてコンピュータシステムに送出する段階、

(D) 前記送出した電子画像データをグレー化し、キャリブレーション、減算おょぴ単一しきい値による 2値化を行い、コロニーの有無、コロニーの数、コ口- —の寸法分布から成る群から選択された少なくとも 1つを解析する段階を含むことを特徴とするものである。

このように構成することによって、細胞癌ィ匕を引き起こす環境中の細胞発癌剤、または細胞癌ィ匕を抑制する薬品や食品等を迅速かつ正確に検出することが可能となる。

第 3の発明の段階（A) において、発癌作用または抗癌作用を有する物質が、食品または食品由来物質であることが好ましい。

食品の抗癌作用および発癌性は、現在最も注目されるものである。本発明は、このような食品や食品由来物質についての癌化挙動を検定することが可能である。また第 3の発明の段階（B) において、培養系の培養条件が約 3 7 °C、 5 %炭酸ガス中で 1 5〜 3 0日であることが好ましい。

このように培養条件を標準化することによって、同一条件で精度よく、力つ再現性のよレ、検定が可能となる。

さらに、第 3の発明の段階（D) において、このコンピュータシステムで実行される画像解析ソフトを用レヽて解析を行レヽ、寒天ゲルの透明度を均一化し、顕微鏡散乱光を処理し、コロニーの形状、寸法、および数の計測、大きさの分布からなる群から選択されたすくなくとも 1つを解析することが好ましく、そして、画像差分処理することにより、ゴミとコロニーの形状を判別し、長径/短径の値が 1 . 6以下を癌化細胞コ口-一と判別することが好ましレ、。

このような画像解析ソフトを用いることにより、精度よく力つ再現性よく検定を行うことができる。また、画像解析ソフトを用いることで、熟練したスキルを要することなく検定を行うことが可能となる。図面の簡単な説明

図 1は、本実施例の癌ィ匕細胞コ口ニー検出解析システムの概略を示す模式図である。

図 2は、本実施例の癌ィ匕細胞コロニー検出解析システムを用いて、培養系の底層にィモジュース濃縮液を添加した場合を測定した結果を示すダラフである。図 3は、本実施例の癌化細胞コロニー検出解析システムを用いて、培養系の底層にブルーべリーアントシァニンを添加した場合を測定した結果を示すグラフである。

図 4は、本実施例の癌ィ匕細胞コ口ニー検出解析システムを用いて、 '培養系の底層に漢方薬の大黄由来のレインを添加した場合を測定した結果を示すグラフである。

図 5は、本実施例の癌ィ匕細胞コロニー検出解析システムを用いて、培養系の底層にアントシァニジンに含まれるぺォニディン、マルビジン、ペラルゴ二ジン、シャニジン、デルピニジンをそれぞれ添加した場合を測定した結果を示すダラフである。

発明を実施するための最良の形態以下、本発明の実施の形態を説明する。

まず、本発明に係る癌化細胞コロニー検出解析システムの概略を図 1に示す。この図 1を参照して、本発明に係る癌化細胞コロニー検出解析システムは、所定の寒天重層培養法に基づく培養系 1と、前記培養系により培養した癌化細胞を検出解析するための検出系 2とから主として構成される。本発明において使用される培養系 1は、培地と、軟寒天と、発癌誘導物質および抗癌剤から成る群から選択される少なくとも 1種の物質とから構成された所定の寸法を有する底層 1 1と、培地と、軟寒天と、細胞とから構成された所定の寸法を有する上層 1 2とから構成された寒天状重層培養法に基づいて調製された培養系 1である。

底層 1 1に用いられる培地は、従来公知のものがから適宜選択されて使用することができ、例えば EMEM (Eagle' s minimum essential medium) プラス 5 % の牛胎児血清を用いることができる。また、底層 1 1における軟寒天培地についても、従来公知のものを使用することができるが、再現性の観点から、同一メー力のものを使用することが特に好ましい。本発明において、底層 1 1を形成する軟寒天は、例えば濃度 0 . 5〜0 . 6 %、好ましくは 0 . 5パーセントの一定量に規定する。また、厚みについても一定の厚み例えば 2 . 4 mmに規定する。このようにして構成された底層 1 1に、所定量の発癌誘導剤または抗癌剤を添加して本発明の培養系 1における底層 1 1を調整する。

なお、上層 1 2および底層 1 1の寒天ゲルの濃度と厚みは、顕微鏡撮影のため、ある程度の透明度を有する寒天ゲルである必要であり、そのために寒天ゲルの濃度と厚みを検討し、細胞培養に影響が無く、さらに顕微鏡撮影もできる寒天ゲルの濃度と厚みを選択するものである。

この際に使用される発癌誘導剤として、発癌性が充分確立されている既知の発癌誘導剤、例えば T P A、 T N F—アルファ、活性酸素種、発癌性が未知の発癌性の物質を添加する。後述する通り、既知の発癌性誘導剤を添加して所定条件で調製した本発明の培養系 1を用いて培養を行い検出解析したデータを、標準データとして用いて、この標準データと、検出解析すべき未知成分を同量添加して比較することにより未知成分の発癌性を解析することが可能となる。

また、同様にして、抗癌剤、例えば種々の医薬用抗癌剤や食品などを底層 1 1 に添加することも可能である。さらに、例えば発癌誘導剤と抗癌剤の両方を底層

1 1に添付してその抗癌剤の抗癌作用を解析することも可能である。

本発明の培養系 1における上層 1 2は、所定の寸法およぴ所定濃度の軟寒天およぴ癌細胞を成長させるための細胞から構成される。

上層 1 2に使用される軟寒天は、例えば濃度 0 . 3〜0 . 4 %および厚み:！. 6 mmなどの所定条件に設定することが必要である。

本発明に使用する細胞は、特に制限されるものではないが、 J B 6細胞が好ましい。

J B 6細胞は、マウス新生児皮膚の初代培養細胞から樹立された公知の細胞株である。（N. H. Colburn et al. , Nature, 281, 589 (1979) ) 。この細胞は非腫瘍性で、発癌プロモーター（T P 'A、 T N F—アルファ、 E G F ) のみの処理によつて、軟寒天コロニー構成能を有している。また、この細胞は T P Aの一段の処理によって、コロニー能を獲得し、プロモートされて前癌状な状態にあるので、発癌プロモーションの検出用、またはその作用機構の解析用に優れた材料だと考えられている (Z. Dong et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 609 (1994)； Z. Dong et al. , Mol Carcinog. , 19, 204 (1997) ;J. J. Li et al. , Cancer Res. , 57, 3569 (1997)； C. Huang et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 156 (1998)；および： Γ. Y. Chung et al .， Cancer Res.，59, 4610 (1999)を参照のこと）。また、後述する本発明と同様の検出系で癌抑制活性を示した多くの化合物は種々の動物実験レベルで、同様な発癌抑制効果が実証されている（M. R. Young et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 9827 (1999)；およひ Ύ. Zhao et al. , Cancer Res. , 61, 6082 (2001)を参照のこと）。したがって、この J B 6細胞を用いた検出方法は、発癌プロモーション抑制効果を迅速に検出する方法として現在注目されている系である。本発明ではこのような細胞を用いることで、多大な時間および労力を要することなしに、実験者による測^ IS差を最小ィ匕して使用することが可能である。

本発明において、このように構成された軟寒天をシャーレ上で所定温度、例えば 4 2 °Cで溶解して培養系 1を形成する。このようにして調製された培養系 1は、所定条件で培養ざれる。この培養系 1 の培養条件を規定することにより、短時間で癌細胞の組織培養を安定して行うことが可能となり、再現性のある検出解析結果が得られる。

例えば、本発明では培養条件として、約 3 7 °Cの温度にて、 5 %炭酸ガス中 1 5〜 3 0日、好ましくは 1 5日間ィンキュベータ中で培養することにより再現性のある検出解析を行うことが可能である。

(検出系）

本発明の癌ィ匕細胞コロニー検出解析システムにおける検出系 2は、顕微鏡 2 1、この顕微鏡 2 1に接続された電子データ変換手段であるデジタルカメラ 2 2およぴコンピュータシステム 2 3から主に構成される。

本発明において使用される顕微鏡 2 1は、従来公知の倍率を有する光学顕微鏡であって、デジタルカメラ 2 2などの電子データ変換手段と接続可能なものであれば特に制限されるものではない。

デジタルカメラ 2 2は、顕微鏡 2 1で拡大したアナ口グ画像を、電子データであるデジタル画像データ、例えば J P E G、 T I F F , P C X, G I Fフォーマットなどのデジタル画像データに変換する電子データ変換手段である。デジタルカメラ 2 2によって、デジタル画像データは、デジタルカメラ 2 2に内蔵された記憶媒体に保存され、この記録媒体を介してコンピュータシステム 2 3に取り込むことが可能であるが、例えば U S B (Universal Serial Bus) などのインターフェイスを介して直接コンピュータシステム 2 3に送出することがさらに望ましレ、。

本発明の検出系 2に使用されるコンピュータシステム 2 3は、ストレージ、ストレージに保持されたプログラムを実行するための演算処理装置 (Central Processing Unit) 、 R AM (Random Access Memory) 、テングノレカメラ 2 2で撮影されたデジタノレ画像データを取り込むためのインターフェイス、例えば U S Bインターフェイスや、メモリーカードリーダ一などのデジタル力メラ 2 2に内蔵された記録媒体の取り込み手段などから主に構成されている。このコンビユータシステム 2 3のストレージには、オペレーティングシステム、画像解析ソフトウェアなどのプログラムと、デジタル画像データなどが保持されている。本発明において、デジタルカメラ 2 2から取り込まれる培養結果であるデジタル画像データは、画像解析ソフトウェアにより解析される。この画像解析ソフトウェアは、例えば、デジタル画像データをグレー化し、キャリブレーション、減算および単一しきい値による 2値化を行い、コロエーの有無、コロニーの数および/またはコロエーの寸法分布を解析することが可能である。この際に、顕微鏡撮影の目的で、寒天ゲルの透明度を均一ィ匕し、顕微鏡散乱光を処理するのが好ましく、さらに、当該技術分野に公知の方法による画像差分処理することで、ゴミと癌化細胞コロエーの形状を判別させることが望ましい。この際、細胞癌化コ口ユーは、一般的に円状であるので、癌化細胞コロニーの判定条件を長径/短径の値が 1 . 6以下とすると、長細のゴミなどを除去して解析することができる。なお、顕微鏡撮影では、必然的に中心部の光量が多く、その周辺につれて暗い視野となってしまう。そのため、光量の分布の影響を補正するため、画像差分処理を行う。その方法としては、細胞を入れていない寒天ゲルのシャーレを撮影し、このデジタノレ画像データをコントロール画像とする。検出解析対象のサンプル画像からこのコント口ール画像を除くと明るさが均一化されたサンプル画像が得られる。

このように構成することによって、培養系 1で所定条件により培養された細胞の検出および解析を効率よくカっ再現性よく行うことができる。

次に、本発明の癌ィ匕細胞コロニー検出解析システムを用いた場合と従来のシステムを用いた場合の検出解析の相違を列挙する。

従来のシステムと本発明に係るシステムの相違サンプノレ調製、細胞培養

I

細胞癌化誘導（ 3 7 °C、 5 % C O ₂、 1 4日間）

1 1

癌化細胞コ口ユー検出解析システム従来の計測法

コロニー顕微鏡撮影装置顕微鏡下での肉眼的な計数

4 Ϊ

結果

(数、形状、大きさ、分布) (コロニー数のみ）評価結果：精度向上、時間短縮計測者の個人差

解析項目の増加軌跡項目の制限大量解析の容易さ大 * ^折の困難さ研究環境の改善体力仕事

実施例

次に、本発明に係る癌ィ匕細胞コロニー検出解析システムを用いて、抗癌作用を有する食品由来物質を、培養系 1の底層 1 1に添付して培養し、癌化細胞コロェ一を検出解析した結果を以下の実施例に示す。

(実施例 1 )

実施例 1では、底層 1 1の寒天にィモジュース濃縮液と T P Aとを添加して培養系 1を調製した。この培養系 1を所定条件で培養し、本発明に係る癌化細胞コロニー検出解析システムを用いて検出解析した結果を図 2に示す。図 2に示したグラフは、縦軸に癌化抑制率を、横軸にィモジュースの濃度をとつて、ィモジュ一スの各濃度における、癌化抑制率をプロットしたものである。

図 2に示したグラフによると、ィモジュースの濃度の増加とともに癌化抑制率が向上することがわかる。 (実施例 2 )

実施例 2では、底層 1 1の寒天にブルーべリ一に含まれるブルーべリーアントシァニンを添加して培養系 1を調製した。この培養系 1を所定条件で培養し、本発明に係る癌化細胞コ口ニー検出解析システムを用いて検出解析した結果を図 3 に示す。図 3に示したグラフは、図 2に示したグラフと同様に、縦軸に癌化抑制率を、横軸にブルーべリーアントシァニンの濃度をとつて、ブルーべリーアントシァニンの各濃度における、癌化抑制率をプロットしたものである。

このグラフによると、ブルーべリーアントシァニンの濃度の増加とともに癌ィ匕抑制率が向上することがわかる。

(実施例 3 )

実施例 3では、底層 ·1 1の寒天に漢方薬の大黄由来のレインを添加して培養系 1を調製した。この培養系 1を所定条件で培養し、本発明に係る癌ィ匕細胞コ口- 一検出解析システムを用いて検出解析した結果を図 4に示す。図 4に示したグラフは、図 2に示したグラフと同様に、縦軸に癌化抑制率を、横軸にレインの濃度をとつて、レインの各濃度における、癌化抑制率をプロットしたものである。このグラフによると、大黄由来のレインの濃度の増カ卩とともに癌化抑制率が向上することがわかる。

(実施例 4 )

実施例 4では、底層 1 1の寒天にアントシァニジンに含まれるぺォ-ディン、マルビジン、ペラルゴ二ジン、シャニジン、デルピニジンをそれぞれ添加して、それぞれ培養系 1を調製した。それぞれの培養系 1を所定条件で培養し、本発明に係る癌ィ匕細胞コロニー検出解析システムを用いて検出解析した結果を図 5に示す。図 5に示したグラフは、図 2に示したグラフと同様に、縦軸に癌化抑制率を、横軸にアントシァニジン由来の各成分の濃度をとつて、各成分の各濃度における、癌化抑制率をプロットしたものである。

このグラフによると、全体として各成分の濃度の増加とともに癌化抑制率が向上することがわかる。中でも特にデルピ-ジンの細胞癌化抑制効果が高いことがわかる。

以上、実施例 1ないし実施例 4に示す通り、本発明の培養系およびシステムを用いることで、癌細胞の抑制率を定量的に測定できることがわかる。産業上の利用可能性

本発明によると、細胞癌ィ匕を引き起こす環境中の細胞発癌剤、細胞癌ィヒを抑制する薬品や食品を、迅速力正確に検出することができ、長寿 ·健康社会に向けて、食材による癌の予防の有効な検証手段を提供することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 培地と、 0 . 5 %〜0 . 6 %の濃度を有する軟寒天と、発癌誘導物質およぴ抗癌剤から成る群から選択される少なくとも 1種の物質とから構成される 2. 4 mmの厚さを有する底層と、

培地と、 0. 3 %~ 0. 4 %の濃度を有する車嫁天と、細胞とから構成される 1 . 6 mmの厚さを有する上層とから構成され、寒天重層培養法に基づいて調製されたことを特徴とする癌化細胞コロエーの培養系。

2. 前記上層に含まれる細胞は、マウス新生児皮膚細胞 J B 6株であることを樹敫とする請求の範囲第 1項に記載の癌化細胞コロニーの培養系。

3. 培地と、軟寒天と、発癌誘導物質および抗癌剤から成る群から選択される少なくとも 1種の物質とから構成される所定の寸法を有する底層と、

培地と、軟寒天と、細胞とから構成された所定の寸法を有する上層とから構成され、寒天重層培養法に基づいて調製された培養系を用いた癌ィ匕細胞コロニーの検出解析システムであって、

前記培養系により培養された癌化コ口ニーを観察するための光学顕微鏡と、前記光学顕微鏡に映し出されたコロニーの映像を電子データに変換するための電子データ変換手段と、

前記電子データを処理するためのコンピュータシステムとから構成され、前記コンピュータシステムは、前記電子データをグレー化し、キヤリプレーシヨン、減算及び単一しきい値により 2値化を行い、コロニーの有無、コロニーの数、コロニーの寸法分布から成る群から選択された少なくとも 1つを解析する画像解析ソフトウェアが格納されていることを特徴とする癌化細胞コ口ニーの検出解析システム。

4. 前記コンピュータシステムは、既知の発癌誘導物質の解析結果と発癌誘導物質および抗癌剤から成る群から選択される少なくとも 1種の物質の解析結果とを比較することを特徴とする請求の範囲第 3項に記載の癌ィ匕細胞コロニーの検出解析システム。 -

5. 前記既知の発癌誘導物質は、 T P A、 T F A—ァ 7レファ、活性酸素種からなる群から選択されることを特徴とする請求の範囲第 4項に記載の癌化細胞コロニーの検出解析システム。

6 . 請求の範囲第 4項ないし第 6項のいずれか 1項に記載の検出解析システムを用いる癌化細胞コロニーの検出解析方法であって、

(A) 発癌作用または抗癌作用を有する物質を選択して前記培養系を調製する段階、

( B ) 前記培養系におレ、て癌化細胞を所定条件で所定時間培養する段階、

(C) 前記培養した癌化細胞を、顕微鏡おょぴ電子データ変換手段を介して電子画像データとしてコンピュータシステムに送出する段階、

(D) 前記送出した電子画像データをグレー化し、キャリブレーション、減算および単一しきい値による 2値ィ匕を行い、コロニーの有無、コロニーの数、コロニーの寸法から成る群から選択された少なくとも 1つを解析する段階を含むことを特徴とする癌化細胞コ口ニーの検出解析方法。

7. 前記段階（A) において、前記発癌作用または抗癌作用を有する物質は、食品または食品由来物質であることを特徴とする請求の範囲第 6項に記載の癌ィ匕細胞コ口ニーの検出解析方法。

8. 前記段階（B) において、前記培養系の培養条件は、約 3 7°C、 5 %炭酸ガス中で 1 5〜 3 0日であることを特徴とする請求の範囲第 6項に記載の癌化細胞コ口ユーの検出解析方法。

9. 前記段階（D) において、前記解析は、前記コンピュータシステムで実行される画像解析ソフトウェアにより行われ、寒天ゲルの透明度を均一化し、顕微鏡散乱光を処理し、コロニーの形状、寸法および数の計測、大きさの分布からなる群から選択された少なくとも 1つを解析することを特徴とする請求の範囲第 6項に記載の癌化細胞コ口ニーの検出解析方法。

1 0. 前記段階（D) において、前記解析は、画像差分処理することにより、ゴミと癌化細胞コ口ニーの形状を判別し、長径/短径の値が 1 . 6以下を癌化細胞コロニーと判別することを特徴とする請求の範囲第 9項に記載の癌化細胞コ口ニーの検出解析方法。