KR20050062543A

KR20050062543A - 암세포 콜로니의 배양계, 검출해석 시스템 및 검출방법

Info

Publication number: KR20050062543A
Application number: KR1020057003478A
Authority: KR
Inventors: 노리오키 고우; 마코토 후지이
Original assignee: 내추럴 웨이 가부시키가이샤; 노리오키 고우; 마코토 후지이
Priority date: 2002-08-28
Filing date: 2003-08-27
Publication date: 2005-06-23
Also published as: CN1678751A; JPWO2004020656A1; WO2004020656A1; AU2003257569A1

Abstract

세포암화를 일으키는 환경 중의 세포발암제, 세포암화를 억제하는 약품이나 식품을 신속 정확하게 검출할 수 있는 암세포 콜로니의 검출해석 시스템 및 그 방법을 제공하기 위해 배지와 연한천과 발암유도 물질 및/또는 항암제로 구성되는 소정 칫수를 갖는 저층(11)과, 배지와 연한천과 세포로 구성되는 소정 칫수를 갖는 상층(12)로 구성된 한천 중층 배양법에 기초하여 제작된 배양계(1)를 이용한 광학현미경(21), 디지털 카메라 등의 전자 데이터 변환수단(22) 및 전자 데이터 변환수단(22)에 의해 변환된 데이터를 처리하기 위한 컴퓨터 시스템(23)으로 구성되는 암세포 콜로니의 검출해석 시스템을 본 발명은 제공한다. 이 컴퓨터 시스템(23)에는 전자 데이터를 그레이화하고 캘리브레이션, 감산 및 단일 문턱값에 의한 2값화를 실행하여 콜로니의 유무, 콜로니 수, 콜로니의 크기 변화 등을 해석하는 화상해석 소프트웨어가 설치되어 있다.

Description

암세포 콜로니의 배양계, 검출해석 시스템 및 검출방법{Culture system, detection and analysis system and detection method for cancer cell colonies}

본 발명은 암세포 콜로니 검출해석 시스템, 암세포 콜로니 검출방법 및 이에 이용하는 암세포 콜로니의 배양계에 관한 것이다. 보다 상세하게는 연한천(軟寒天)으로 구성된 연한천 중층법(重層法)에 의한 배양계와, 이 배양계를 이용한 세포배양 및 배양한 세포를 반자동화하여 암세포 콜로니를 검출하는 시스템과 그 방법에 관한 것이다.

암은 의료기술의 눈부신 진보에도 불구하고 일본에서 1981년 이래 사망원인 중 1위를 차지하고 있다. 따라서 사회의 관심은 암의 예방으로 바뀌고 있다. 그래서 우선 발생과정을 안 후에 암의 예방을 해야만 한다.

일반적으로 발암성 물질이 몸에 들어오면 대부분은 생체의 방어능력으로 대사되어 체외로 배출된다. 몸에 쌓인 일부는 3가지 단계를 거쳐 최종적으로 암이라는 병을 유발한다. 우선 이들 발암성 물질이 단기간(예컨대 수일간)에 세포 유전자에 장해를 주어 변위세포를 초래한다. 이 변위세포는 수년 내지 십수년의 잠복기를 거쳐 전(前)암 형태의 세포가 된다. 이와 같은 전암 형태의 세포가 될 때까지는 우리 자신은 아무것도 느끼지 못하며 현대 의료기술로도 검출하기 어렵기 때문에 암으로 진단될 때에는 이미 여생이 얼마 남지 않게 되는 것이다.

한편 역학적 조사에 따르면 암 발생의 원인 대부분은 우리들 환경, 특히 식생활에 의한 것이라는 견해가 주목받고 있으며 장수·건강사회를 위한 「음식과 암예방」의 연관성에 대해 강한 관심이 모아지고 있다.

그러나 상기와 같이 변위세포에서 암세포로 되려면 긴 시간이 걸리기 때문에 암예방을 위해서는 이 긴 과정을 지속적으로 저해해야만 한다. 현시점에서는 음식에 의한 암예방의 효과는 검증할 수 없으며 역학적 조사에 의존할 수 밖에 없다. 따라서 음식재료에 의한 암예방의 효과적인 검증방법의 개발 및 그 작용기구의 규명이 앞으로 더욱 요구될 것으로 생각된다.

음식재료에 의한 암예방의 유효한 검증방법의 개발 및 그 작용기구의 규명 중 한가지 접근으로서 Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 98권, 13호, p.7510∼7515에는 발암제에 의한 정상세포의 암화 및 암세포의 진행을, 한천배지에서 콜로니를 형성시켜 이 콜로니의 수를 계측함으로써 검증하는 기재가 있다.

그러나 선행기술에는 한천배지의 농도 및 두께에 문제점이 있어 안정적인 세포의 콜로니 수를 얻을 수 없다. 또 배양기간은 길어서 20∼30일을 필요로 한다. 또 선행기술에서는 콜로니의 검출을 현미경 하에서의 육안관찰로 실행하기 때문에 콜로니의 계수는 가능하지만 콜로니의 크기 및 분포의 해석은 불가능했다. 또 이 계수에는 엄청난 시간 및 체력을 필요로 하며 또 계수 결과에 실험자의 개인차가 나기 쉬워 정밀도에 문제가 있기 때문에 이 검증방법의 과제로 남아 있다. 또 이 검증방법을 이용하여 계수하기 위해서는 실험자의 숙련을 필요로 하는 문제도 있다.

따라서 본 발명은 세포암화를 일으키는 환경 속의 세포발암제, 세포암화를 억제하는 약품이나 식품 등을 신속 정확하게 검출할 수 있는 암세포 콜로니의 검출해석 시스템 및 그 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 본 실시예의 암세포 콜로니 검출해석 시스템의 개략을 도시한 모식도이다.

도 2는 본 실시예의 암세포 콜로니 검출해석 시스템을 이용하여 배양계의 저층에 마즙 농축액을 첨가한 경우를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.

도 3은 본 실시예의 암세포 콜로니 검출해석 시스템을 이용하여 배양계의 저층에 블루베리 안토시아닌을 첨가한 경우를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.

도 4는 본 실시예의 암세포 콜로니 검출해석 시스템을 이용하여 배양계의 저층에 한방약의 대황 유래의 레인을 첨가한 경우를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.

도 5는 본 실시예의 암세포 콜로니 검출해석 시스템을 이용하여 배양계의 저층에 안토시아니딘에 속하는 페오니딘, 멀비딘, 펠라르고니딘, 시아니딘, 델피니딘을 각각 첨가한 경우를 측정한 결과를 도시한 그래프이다.

본 발명자는 상기 과제를 감안하여 예의 검토한 결과, 암세포의 배양조건을 규격화하고 이 규격에 따라 배양된 암세포를 디지털 데이터로서 컴퓨터 등의 연산수단에 입력하고 입력한 디지털 데이터를 특수처리함으로써 상기 과제를 해결할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 창작하기에 이르렀다.

제1 발명은 배지와 0.5%∼0.6%의 농도를 갖는 연한천과 발암 유도물질 및 항암제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질로 구성되는 두께 2.4mm를 갖는 저층과, 배지와 0.3%∼0.4%의 농도를 갖는 연한천과 세포로 이루어진 두께 1.6mm를 갖는 상층으로 구성되며 한천 중층 배양법에 기초하여 제작된 것을 특징으로 하는 암세포 콜로니의 배양계이다.

제1 발명에 관한 암세포 콜로니의 배양계에서, 저층과 상층이 각각 소정의 구성을 갖는 것이 중요하다. 즉 배양계를 일정 조건으로 함으로써 재현성이 있는 검출 및 해석결과를 얻을 수 있다.

또 제1 발명에서 배양계의 상층에 포함되는 세포가 마우스 신생아피부세포 JB6 세포주인 것이 바람직하다.

JB6세포는 마우스의 신생아피부의 초대 배양 세포로부터 수립된 세포주이다. 이 세포는 비종양성으로서 발암 프로모터(TPA, TNF-알파, EGF) 처리만으로도 연한천 콜로니 형성능력을 갖고 있다. 또 이 세포는 TPA의 일단(一段)의 처리에 의해 콜로니 능력을 획득하고 프로모팅되어 전암 형태의 상태가 되기 때문에 발암 촉진의 검출계 또 그 작용기구의 해석에 우수한 재료라고 생각되고 있다. 또 본 발명의 검출계에서 암억제 활성을 나타낸 많은 화합물은 각종 동물실험 레벨에서 동일한 발암억제 효과가 실제 입증되어 있다. 따라서 이 검출계는 발암 촉진 억제 효과를 신속하게 검출하는 수법으로서 현재 주목받고 있는 시스템이다.

제2 발명은 배지와 연한천과 발암 유도물질 및 항암제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질로 구성되는 소정 칫수를 갖는 저층과, 배지와 연한천과 세포로 구성된 소정 칫수를 갖는 상층으로 구성되며, 한천 중층 배양법에 기초하여 제작된 배양계를 이용한 암세포 콜로니의 검출해석 시스템으로서, 이 배양계에 의해 배양된 암화 콜로니를 관찰하기 위한 광학 현미경과, 이 광학 현미경에 비춰진 콜로니의 영상을 전자 데이터로 변환하기 위한 전자 데이터 변환수단과, 이 전자 데이터 변환수단에 의해 변환된 전자 데이터를 처리하기 위한 컴퓨터 시스템으로 구성되며 이 컴퓨터 시스템은 이 전자 데이터를 그레이(grey)화하여 캘리브레이션, 감산 및 단일 문턱값에 의해 2값화를 실행하고, 콜로니 유무, 콜로니 수, 콜로니 크기 분포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 해석하는 화상해석 소프트웨어가 설치되어 있는 것을 특징으로 한다.

이와 같이 구성함으로써 세포암화를 일으키는 환경 내의 세포발암제 그리고 세포암화를 억제하는 약품이나 식품을 신속 정확하게 검출할 수 있게 된다.

제2 발명에서 이 컴퓨터 시스템은 이미 알려져 있는 발암 유도물질에서 얻어진 표준 데이터에 의한 해석결과를 가지고 있으며 상기 이미 알려져 있는 발암 유도물질의 해석결과와, 발암 유도물질 및 항암제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질을 비교하는 것이 바람직하다.

이와 같이 이미 알려져 있는 성분을 표준물질로 하여 아직 알려져 있지 않은 성분의 암화거동을 쉽게 조사할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어「암화거동」이란, 물질이 암 억제작용 또는 유도작용 중 어느 하나를 갖고 있는 것을 의미한다.

또 제2 발명에서 상기 이미 알려져 있는 발암 유도물질이 TPA, TNF-알파, 활성산소종으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

이들 물질의 발암 유도거동은 널리 알려진 바와 같이 표준물질로서 이들 물질과 비교함으로써 아직 알려져 있지 않은 물질의 암유도 또는 암억제 거동을 용이하게 파악할 수 있다.

제3 발명은 본 발명의 검출해석 시스템을 이용하는 암세포의 콜로니 검출해석 방법으로서 (A) 발암작용 또는 항암작용을 갖는 물질을 선택하여 상기 배양계를 조정하는 단계, (B) 상기 배양계에서 암세포를 소정 조건으로 소정 시간 배양하는 단계, (C) 상기 배양한 암세포를 현미경 및 전자 데이터 변환수단을 통해 전자화상 데이터로서 컴퓨터 시스템으로 송출하는 단계, (D) 상기 송출한 전자화상 데이터를 그레이화하고 캘리브레이션, 감산 및 단일 문턱값에 의한 2값화를 실행하여 콜로니 유무, 콜로니 수, 콜로니의 크기 분포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 해석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 것이다.

이와 같이 구성함으로써 세포암화를 일으키는 환경 속의 세포발암제, 또는 세포암화를 억제하는 약품이나 식품 등을 신속 정확하게 검출할 수 있게 된다.

제3 발명의 단계(A)에서 발암작용 또는 항암작용을 갖는 물질이 식품 또는 식품유래 물질인 것이 바람직하다.

식품의 항암작용 및 발암성은 현재 가장 주목받고 있다. 본 발명은 이와 같은 식품이나 식품유래 물질에 대한 암화거동을 검정할 수 있다.

또 제3 발명의 단계(B)에서, 배양계의 배양조건이 약 37℃, 5% 탄산가스 중에서 15∼30일인 것이 바람직하다.

이와 같이 배양조건을 표준화함으로써 동일 조건에서 고정밀도로 재현성이 좋은 검정이 가능해진다.

또 제3 발명의 단계(D)에서 이 컴퓨터 시스템에서 실행되는 화상해석 소프트웨어를 이용하여 해석하고 한천겔의 투명도를 균일화하여 현미경 산란광을 처리하여, 콜로니의 형상, 크기 및 수의 계측, 크기 분포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 해석하는 것이 바람직하며 또 화상차분 처리함으로써 먼지와 콜로니의 형상을 판별하고, 장직경/단직경의 값 1.6 이하를 암세포 콜로니로 판별하는 것이 바람직하다.

이와 같은 화상해석 소프트웨어를 이용함으로써 고정밀도와 우수한 재현성으로 검정을 실행할 수 있다. 또 화상해석 소프트를 이용함으로써 숙련된 스킬이 없이도 검정을 실행할 수 있게 된다.

이하 본 발명의 실시형태를 설명하기로 한다.

우선 본 발명에 관한 암세포 콜로니 검출해석 시스템의 개략을 도 1에 도시한다. 이 도 1을 참조하면 본 발명에 관한 암세포 콜로니 검출해석 시스템은 소정 한천 중층 배양법에 기초한 배양계(1)와, 상기 배양계에 의해 배양한 암세포를 검출해석하기 위한 검출계(2)로 주로 구성된다.

(배양계)

본 발명에서 사용되는 배양계(1)는, 배지와 연한천과 발암유도 물질 및 항암제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질로 구성된 소정 칫수를 갖는 저층(11)과, 배지와 연한천과 세포로 구성된 소정 칫수를 갖는 상층(12)으로 구성된 한천형 중층 배양법에 기초하여 제작된 배양계(1)이다.

저층(11)에 이용되는 배지는 종래 공지의 것에서 적절히 선택하여 사용할 수 있으며 예컨대 EMEM(Eagle's minimum essential medium) 플러스 5%의 소(牛)태아 혈청을 이용할 수 있다. 또 저층(11)에서의 연한천 배지에 대해서도 종래 공지의 것을 사용할 수 있는데 재현성 관점에서 동일 제조사의 것을 사용하는 것이 특히 바람직하다. 본 발명에서 저층(11)을 형성하는 연한천은, 예컨대 농도 0.5∼0.6%, 바람직하게는 0.5%의 일정량으로 규정한다. 또 두께에 대해서도 일정 두께, 예컨대 2.4mm로 규정한다. 이와 같이 하여 구성된 저층(11)에 소정량의 발암 유도제 또는 항암제를 첨가하여 본 발명의 배양계(1)에서의 저층(11)을 조정한다.

또 상층(12) 및 저층(11)의 한천겔의 농도와 두께는 현미경 촬영을 위해 어느 정도 투명도를 갖는 한천겔일 필요가 있으며, 그 때문에 한천겔의 농도와 두께를 검토하여 세포배양에 영향이 없고 또 현미경 촬영도 가능한 한천겔의 농도와 두께를 선택하는 것이다.

이 때 사용되는 발암 유도제로서 발암성이 충분히 확립되어 있는 이미 알려져 있는 발암 유도제, 예컨대 TPA, TNF-알파, 활성산소종, 발암성이 아직 알려져 있지 않은 발암성 물질을 첨가한다. 후술하는 바와 같이 이미 알려져 있는 발암성 유도제를 첨가하여 소정 조건으로 제작한 본 발명의 배양계(1)를 이용하여 배양하여 검출해석한 데이터를 표준 데이터로서 이용하고, 이 표준 데이터와 검출해석해야 할 아직 알려져 있지 않은 성분을 동일량 첨가하여 비교함으로써 아직 알려져 있지 않은 성분의 발암성을 해석할 수 있게 된다.

또 마찬가지로 항암제, 예컨대 각종 의약용 항암제나 식품 등을 저층(11)에 첨가하는 것도 가능하다. 또 예컨대 발암 유도제와 항암제를 저층(11)에 첨가하여 그 항암제의 항암작용을 해석할 수도 있다.

본 발명의 배양계(1)에서의 상층(12)은 소정 칫수 및 소정 농도의 연한천 및 암세포를 성장시키기 위한 세포로 구성된다.

상층(12)에 사용되는 연한천은 예컨대 농도 0.3∼0.4% 및 두께 1.6mm 등의 소정 조건으로 설정할 필요가 있다.

본 발명에 사용하는 세포는 특별히 제한되어 있지 않으나 JB6세포가 바람직하다.

JB6세포는 마우스 신생아 피부의 초대 배양세포에서 수립된 공지의 세포주이다.(N.H. Colburn et al.,Nature,281,589(1979)). 이 세포는 비종양성으로서 발암프로모터(TPA, TNF-알파, EGF) 처리만으로 연한천 콜로니 구성능력을 갖고 있다. 또 이 세포는 TPA의 일단 처리에 의해 콜로니 능력을 획득하고 프로모팅되어 전암 상태가 되기 때문에 발암 프로모션의 검출용, 또는 그 작용기구의 해석용으로 우수한 재료라고 생각되고 있다(Z.dong et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91,609(1994); Z.dong et al.,Mol Carcinog.,19,204(1997);J.J.Li et al.,Cancer Res.,57,3569(1997);C.Huang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,95,156(1998); 및 J.Y.Chung et al.,Cancer Res.,59,4610(1999)을 참조할 것). 또 후술하는 본 발명과 동일한 검출계에서 암억제 활성을 나타낸 많은 화합물은 각종 동물실험 레벨에서 동일한 발암억제 효과가 실증되어 있다(M.R.Young et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,96,9827(1999); 및 Y.Zhao et al.,Cancer Res.,61,6082(2001)를 참조할 것). 따라서 이 JB6세포를 이용한 검출방법은 발암 촉진 억제 효과를 신속하게 검출하는 방법으로서 현재 주목받고 있는 계이다. 본 발명에서는 이와 같은 세포를 이용함으로써 많은 시간과 노력 없이도 실험자에 의한 측정오차를 최소화하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 이와 같이 구성된 연한천을 샤알레 위에서 소정 온도, 예컨대 42℃에서 용해하여 배양계(1)를 형성한다.

이와 같이 하여 제작된 배양계(1)는 소정 조건에서 배양된다. 이 배양계(1)의 배양조건을 규정함으로써 단시간에 암세포의 조직배양을 안정적으로 실행할 수 있어 재현성 있는 검출해석 효과를 얻을 수 있다.

예컨대 본 발명에서는 배양조건으로서 약 37℃의 온도에서 5% 탄산가스 중 15∼30일, 바람직하게는 15일간 인큐베이터 속에서 배양함으로써 재현성 있는 검출해석을 실행할 수 있다.

(검출계)

본 발명의 암세포 콜로니 검출해석 시스템에서의 검출계(2)는 현미경(21), 이 현미경(21)에 접속된 전자 데이터 변환수단인 디지털 카메라(22) 및 컴퓨터 시스템(23)으로 주로 구성된다.

본 발명에서 사용되는 현미경(21)은 종래 공지의 배율을 갖는 광학 현미경으로서, 디지털 카메라(22) 등의 전자 데이터 변환수단과 접속 가능한 것이라면 특별히 제한되지 않는다.

디지털 카메라(22)는 현미경(21)으로 확대한 아날로그 화상을 전자 데이터인 디지털 화상데이터, 예컨대 JPEG, TIFF, PCX, GIF 포맷 등의 디지털 화상데이터로 변환하는 전자 데이터 변환수단이다. 디지털 카메라(22)에 의해 디지털 화상데이터는 디지털 카메라(22)에 내장된 기억매체에 보존되며 이 보존매체를 통해 컴퓨터 시스템(23)에 입력할 수 있는데 예컨대 USB(Universal Serial Bus) 등의 인터페이스를 통해 직접 컴퓨터 시스템(23)으로 송출하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 검출계(2)에 사용되는 컴퓨터 시스템(23)은 스토리지, 스토리지에 보존된 프로그램을 실행하기 위한 연산처리장치(Central Processing Unit), RAM(Random Access Memory), 디지털 카메라(22)로 촬영된 디지털 화상데이터를 입력하기 위한 인터페이스, 예컨대 USB 인터페이스나 메모리 카드 리더 등 디지털 카메라(22)에 내장된 기록매체의 입력수단으로 주로 구성되어 있다. 이 컴퓨터 시스템(23)의 스토리지에는 오퍼레이팅 시스템, 화상해석 소프트웨어 등의 프로그램과 디지털 화상데이터 등이 보존되어 있다.

본 발명에서 디지털 카메라(22)에서 입력되는 배양결과인 디지털 화상데이터는 화상해석 소프트웨어에 의해 해석된다. 이 화상해석 소프트웨어는 예컨대 디지털 화상데이터를 그레이화하고 캘리브레이션, 감산 및 단일 문턱값에 의한 2값화를 실행하여 콜로니 유무, 콜로니 수 및/또는 콜로니의 크기 분포를 해석할 수 있다. 이 때 현미경 촬영의 목적으로 한천겔의 투명도를 균일화하여 현미경 산란광을 처리하는 것이 바람직하며 또 해당 기술분야의 공지의 방법에 의해 화상 차분처리함으로써 먼지와 암세포 콜로니의 형상을 판별시키는 것이 바람직하다. 이 때 세포암화 콜로니는 일반적으로 원형이므로 암세포 콜로니의 판정조건을 장직경/단직경의 값 1.6 이하로 하면 길고 가는 먼지 등을 제거하여 해석할 수 있다.

또 현미경 촬영은 필연적으로 중심부의 광량이 많고 그 주변으로 갈수록 시야가 어두워진다. 그 때문에 광량 분포의 영향을 보정하기 위해 화상 차분처리를 한다. 그 방법으로는 세포를 넣지 않은 한천겔의 샤알레를 촬영하고 이 디지털 화상데이터를 컨트롤 화상으로 한다. 검출해석 대상인 샘플 화상에서 이 컨트롤 화상을 삭제하면 밝기가 균일화된 샘플 화상을 얻을 수 있다.

이와 같이 구성함으로써 배양계(1)에서 소정 조건에 의해 배양된 세포의 검출 및 해석을 효율적으로 재현성 좋게 실행할 수 있다.

다음에 본 발명의 암세포 콜로니 검출해석 시스템을 이용한 경우와 종래의 시스템을 이용한 경우의 검출해석의 상이점을 열거하기로 한다.

이하 본 발명에 관한 암세포 콜로니 검출해석 시스템을 이용하여 항암작용을 갖는 식품유래 물질을 배양액(1)의 저층(11)에 첨부하여 배양하고 암세포 콜로니를 검출해석한 결과를 이하의 실시예에 나타낸다.

(실시예 1)

실시예 1에서는 저층(11)의 한천에 마즙 농축액과 TPA를 첨가하여 배양계(1)를 제작했다. 이 배양계(1)를 소정 조건으로 배양하고 본 발명에 관한 암세포 콜로니 검출해석 시스템을 이용하여 검출해석한 결과를 도 2에 도시한다. 도 2에 도시한 그래프는 종축에 암화 억제율을, 횡축에 마즙의 농도를 취하여 마즙의 각 농도에서의 암화 억제율을 플롯팅한 것이다.

도 2에 도시한 그래프에 따르면 마즙의 농도 증가와 함께 암화 억제율이 향상된다는 것을 알 수 있다.

(실시예 2)

실시예 2에서는 저층(11)의 한천에 블루베리에 포함되는 블루베리 안토시아닌을 첨가하여 배양계(1)를 제작했다. 이 배양계(1)를 소정 조건으로 배양하고 본 발명에 관한 암세포 콜로니 검출해석 시스템을 이용하여 검출해석한 결과를 도 3에 도시한다. 도 3에 도시한 그래프는 도 2에 도시한 그래프와 마찬가지로 종축에 암화 억제율을, 종축에 블루베리 안토시아닌의 농도를 취하여 블루베리 안토시아닌의 각 농도에서의 암화 억제율을 플롯팅한 것이다.

이 그래프에 따르면 블루베리 안토시아닌의 농도 증가와 함께 암화 억제율이 향상된다는 것을 알 수 있다.

(실시예 3)

실시예 3에서는 저층(11)의 한천에 한방약의 대황 유래의 레인을 첨가하여 배양계(1)를 조제했다. 이 배양계(1)를 소정 조건에서 배양하고 본 발명에 관한 암세포 콜로니 검출해석 시스템을 이용하여 검출해석한 결과를 도 4에 도시한다. 도 4에 도시한 그래프는 도 2에 도시한 그래프와 마찬가지로 종축에 암화 억제율을, 횡축에 레인의 농도를 취하여 레인의 각 농도에서의 암화 억제율을 플롯팅한 것이다.

이 그래프에 따르면 대황 유래의 레인 농도의 증가와 함께 암화 억제율이 향상된다는 것을 알 수 있다.

(실시예 4)

실시예 4에서는 저층(11)의 한천에 안토시아니딘에 포함되는 페오니딘, 멀비딘, 펠라르고니딘, 시아니딘, 델피니딘을 각각 첨가하여 각각 배양계(1)를 제작했다. 각각의 배양계(1)를 소정 조건에서 배양하고 본 발명에 관한 암세포 콜로니 검출해석 시스템을 이용하여 검출해석한 결과를 도 5에 도시한다. 도 5에 도시한 그래프는 도 2에 도시한 그래프와 마찬가지로 종축에 암화 억제율을, 횡축에 안토시아니딘 유래의 각 성분의 농도를 취해 각 성분의 각 농도에서의 암화 억제율을 플롯팅한 것이다.

이 그래프에 따르면 전체적으로 각 성분의 농도 증가와 함께 암화 억제율이 향상된다는 것을 알 수 있다. 그 중에서도 특히 델피니딘의 세포암화 억제효과가 높다는 것을 알 수 있다.

이상 실시예 1 내지 실시예 4에 도시한 대로 본 발명의 배양계 및 시스템을 이용함으로써 암세포의 억제율을 정량적으로 측정할 수 있다는 것을 알 수 있다.

본 발명에 따르면, 세포암화를 일으키는 환경 속의 세포발암제, 세포암화를 억제하는 약품이나 식품을 신속 정확하게 검출할 수 있어 장수·건강사회를 위해, 음식재료에 의한 암예방의 유효한 검증수단을 제공할 수 있다.

Claims

배지와 0.5%∼0.6%의 농도를 갖는 연한천과 발암 유도물질 및 항암제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질로 구성되는 두께 2.4mm를 갖는 저층과,

배지와 0.3%∼0.4%의 농도를 갖는 연한천과 세포로 이루어진 두께 1.6mm를 갖는 상층으로 구성되며 한천 중층 배양법에 기초하여 조제된 것을 특징으로 하는 암세포 콜로니의 배양계.
제1항에 있어서, 상기 상층에 포함되는 세포는 마우스 신생아피부세포 JB6주인 것을 특징으로 하는 암세포 콜로니의 배양계.
배지와 연한천과 발암 유도물질 및 항암제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종의 물질로 구성되는 소정 칫수를 갖는 저층과,

배지와 연한천과 세포로 구성된 소정 칫수를 갖는 상층으로 구성되며, 한천 중층 배양법에 기초하여 제작된 배양계를 이용한 암세포 콜로니의 검출해석 시스템으로서,

상기 배양계에 의해 배양된 암화 콜로니를 관찰하기 위한 광학 현미경과,

상기 광학 현미경에 비춰진 콜로니의 영상을 전자 데이터로 변환하기 위한 전자 데이터 변환수단과,

상기 전자 데이터를 처리하기 위한 컴퓨터 시스템으로 구성되며,

상기 컴퓨터 시스템은 상기 전자 데이터를 그레이화하여 캘리브레이션, 감산 및 단일 문턱값에 의해 2값화를 실행하고, 콜로니 유무, 콜로니 수, 콜로니 크기 분포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 해석하는 화상해석 소프트웨어가 설치되어 있는 것을 특징으로 하는 암세포 콜로니의 검출해석 시스템.
제3항에 있어서, 상기 컴퓨터 시스템은, 이미 알려져 있는 발암 유도물질의 해석결과와, 발암 유도물질 및 항암제로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 1종류의 물질의 해석결과를 비교하는 것을 특징으로 하는 암세포 콜로니의 검출해석 시스템.
제4항에 있어서, 상기 이미 알려져 있는 발암 유도물질이 TPA, TNF-알파, 활성산소종으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암세포 콜로니의 검출해석 시스템.
제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 검출해석 시스템을 이용하는 암세포의 콜로니 검출해석 방법으로서,

(A) 발암작용 또는 항암작용을 갖는 물질을 선택하여 상기 배양계를 제작하는 단계,

(B) 상기 배양계에서 암세포를 소정 조건으로 소정 시간 배양하는 단계,

(C) 상기 배양한 암세포를 현미경 및 전자 데이터 변환수단을 통해 전자화상 데이터로서 컴퓨터 시스템으로 송출하는 단계, (D) 상기 송출한 전자화상 데이터를 그레이화하고 캘리브레이션, 감산 및 단일 문턱값에 의한 2값화를 실행하여 콜로니 유무, 콜로니 수, 콜로니의 크기 분포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 해석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 암세포 콜로니의 검출해석 방법.
제6항에 있어서, 상기 단계(A)에서 발암작용 또는 항암작용을 갖는 물질이 식품 또는 식품유래 물질인 것을 특징으로 하는 암세포 콜로니의 검출해석 방법.
제6항에 있어서, 상기 단계(B)에서, 배양계의 배양조건이 약 37℃, 5% 탄산가스 중에서 15∼30일인 것을 특징으로 하는 암세포 콜로니의 검출해석 방법.
제6항에 있어서, 상기 단계(D)에서 상기 해석은, 상기 컴퓨터 시스템에서 실행되는 화상해석 소프트웨어를 이용하여 실행되며 한천겔의 투명도를 균일화하여 현미경 산란광을 처리하고 콜로니의 형상, 크기 및 수의 계측, 크기 분포로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나를 해석하는 것을 특징으로 하는 암세포 콜로니의 검출해석 방법.
제9항에 있어서, 상기 단계(D)에서 상기 해석은, 화상차분 처리함으로써 먼지와 콜로니의 형상을 판별하고, 장직경/단직경의 값 1.6 이하를 암세포 콜로니로 판별하는 것을 특징으로 하는 암세포 콜로니의 검출해석 방법.