WO2007018182A1 - 癌様変異株 - Google Patents

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cells
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normal gastric
cell line
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Hirofumi Matsui
Yumiko Nakamura
Osamu Shimokawa
Yasushi Matsuzaki
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University Of Tsukuba
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity

Definitions

  • the present invention relates to a cancer-like mutant derived from normal gastric mucosa cells useful for screening an anticancer agent against gastric cancer.
  • one method for evaluating the anticancer activity of a test substance is to bring the test substance into contact with cancer cells in a petri dish, thereby killing the cancer cells or suppressing their growth.
  • a method has been implemented to check whether or not.
  • the anticancer effect of a test substance against gastric cancer is evaluated using human gastric cancer cell lines in which gastric cancer cells such as MKN-1, MKN-45, MKN-74, and St-4 are also established. I'll be.
  • an object of the present invention is to provide a cancer-like mutant derived from normal gastric mucosa cells that is useful for screening an anticancer agent against gastric cancer.
  • RGM-1 cell line isolated from the normal gastric mucosa of a rat.
  • the well-known RGM-1 cell line deposited with cell number RCB0876 is called N-methi, a carcinogen.
  • RGM-1 cells have been found to be transformed into cancer-like cells when cultured in the presence of ru-N-toro-N--trosoguanidine (MNNG: N-Methy N and nitro-N-nitrosoguanidine) And cancer-like cells (RGK-1 cell line) obtained in this way, screening for anticancer drugs with excellent sensitivity to cancer cells and determination of the ability of carcinogens can be performed easily and quickly.
  • a methodology that can be established is established.
  • the cancer-like mutant of the present invention based on the above findings is obtained by transforming normal gastric mucosa cells as described in claim 1.
  • the cancer-like mutant according to claim 2 is the cancer-like mutant according to claim 1, wherein the normal gastric mucosa cells are those of a non-human animal.
  • the cancerous mutant according to claim 3 is the cancerous mutant according to claim 2, wherein the non-human animal is a rat.
  • the cancerous mutant according to claim 4 is the cancerous mutant according to claim 1, wherein the normal gastric mucosal cells are normal gastric mucosal epithelial cells.
  • the cancerous mutant according to claim 5 is the cancerous mutant according to claim 4, wherein normal gastric mucosal epithelial cells are deposited in the independent administrative agency, RIKEN Cell Bank as cell number RCB0876. The RGM-1 cell line.
  • the cancerous mutant according to claim 6 is the cancerous mutant according to claim 1, wherein the cancerous mutant is registered with the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number F ERM BP-10619. Deposited! The RGK-1 cell line.
  • the RGK-1 cell line of the present invention has been deposited at the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FERM BP-10619 as described in claim 7.
  • the method for producing the like mutant is by culturing and transforming normal gastric mucosal cells in the presence of a carcinogenic substance.
  • the screening method for an anticancer agent of the present invention is carried out using the action against the cancer-like mutant according to claim 1 as an index, as described in claim 9.
  • the screening kit for an anticancer agent of the present invention comprises at least the cancer-like mutant according to claim 1 as described in claim 10.
  • the carcinogenicity evaluation method of the present invention is carried out as described in claim 11 using as an index whether or not a test substance is transformed into cancerous cells by acting on normal gastric mucosal cells.
  • the carcinogenicity evaluation kit of the present invention comprises at least normal gastric mucosa cells as described in claim 12.
  • FIG. 1 Micrograph of RGM-1 cell line
  • the cancerous mutant of the present invention is obtained by transforming normal gastric mucosal cells.
  • the cancerous variant of the present invention can be prepared, for example, by culturing normal gastric mucosal cells in the presence of a carcinogenic substance and transforming them.
  • the normal gastric mucosal cells serving as starting cells are exemplified by normal gastric mucosal epithelial cells of non-human animals such as rats and mice.
  • the RGM-1 cell line can be obtained from the above cell bank with the consent of one of the inventors of the present invention, Hiroshi Matsui (if necessary, In Vitro Cell. Dev. Biol.-Animal 32: 259 -261, May 1 996).
  • a carcinogen for example, MNNG can be used.
  • a carcinogenic substance is added to a culture solution usually used for culturing normal gastric mucosal cells so that its content is about 0.1% to 10%, and then normal Gastric mucosa cells can be seeded at a rate of 10 3 cells / mL to 10 7 cells / mL, and subculture can be performed for 10 days to 3 months under normal culture conditions.
  • the normal culture conditions for normal gastric mucosa cells are, for example, 36 ° C to 38 ° C, 4% to 6% CO.
  • the cancer-like mutant obtained by transforming the RGM-1 cell line is the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology Patent Biological Deposit Center (zip code 305-8566).
  • the RGK-1 cell line (taxonomic position: animal cell) is deposited as deposit number FERM BP-10619 at Tsukuba Sakai Higashi 1-chome 1-chome 1-center 6 in Ibaraki, Japan (deposited) Day: 2 April 5th, 005).
  • the ability of normal gastric mucosal cells to be transformed into a cancer-like mutant can be determined, for example, based on one or more methods selected from the following methods! In order to improve the accuracy of judgment, it is desirable to use multiple methods.
  • Transformation to a cancer-like mutant reduces the dependence on growth factors.
  • the growth rate is increased by transformation into a cancer-like mutant.
  • Motility is reduced by transformation into a cancer-like mutant.
  • the cells By transforming into a cancer-like mutant, the cells grow in a spherical shape and form colonies even when mixed with soft agar agarose gel and seeded.
  • Expression of the differentiation function is changed by transformation into a cancer-like mutant.
  • a test substance is brought into contact with the cancer-like mutant of the present invention in a petri dish, and whether the test substance kills cells or suppresses proliferation, That is, the method used for examining whether or not it has an anticancer activity is exemplified, but the method is not limited thereto. If the cancer-like mutant of the present invention is put into a predetermined tube and stored frozen, for example, screening of anticancer agents can be carried out easily.
  • the cancerous mutant of the present invention and normal gastric mucosal cells derived therefrom are brought into contact with the test substance at the same concentration, and the effect on each is evaluated, whereby the anticancer action of the test substance is specific to cancer cells. Therefore, it is possible to accurately evaluate whether it is a cancer cell, that is, sensitivity to cancer cells.
  • normal gastric mucosa cells can be transformed into a cancer-like mutant using a carcinogenic substance.
  • the carcinogenicity of a test substance can be evaluated using as an index whether or not it is transformed into a mutant strain.
  • Example 1 Preparation of RGK-1 cell line from RGM-1 cell line
  • Figure 1 shows the RGM-1 cell line.
  • FIG. 2 shows a micrograph (magnification: 20 times) of the RGK-1 cell line.
  • Example 2 Characteristics of RGK-1 cell line
  • RGK-1 cell line In a 12-well petri dish, place the RGK-1 cell line in the culture medium (same as above) at a rate of 10 5 cells / mL.
  • the culture conditions were the same as above; the same applies hereinafter
  • cell growth was observed on the filter surface on the third day from the start of the culture, and on the seventh day. Became confluent on the filter surface. Similar results were obtained using the MKN-45 cell line known as the human gastric cancer cell line. Therefore, it could be determined that the RGK-1 cell line was transformed into cancerous cells.
  • Example 3 Effect of anticancer agent on RGK-1 cell line
  • the RGK-1 cell line When the RGK-1 cell line was seeded and cultured at a rate of 10 5 cells / mL in a culture solution containing 0.1M mitomycin in a 12-well petri dish, its growth was suppressed. Therefore, the anticancer activity of the anticancer agent could be evaluated using the RGK-1 cell line, indicating that the RGK-1 cell line can be used for screening of anticancer agents.
  • the present invention relates to a normal gastric mucosal cell-derived cell useful for screening for anticancer agents against gastric cancer.
  • the present invention has industrial applicability in that cancer-like mutant strains can be provided.

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Abstract

　本発明の課題は、胃癌に対する抗癌剤のスクリーニングに有用な正常胃粘膜細胞由来の癌様変異株を提供することである。その解決手段としての本発明の癌様変異株は、正常胃粘膜細胞を形質転換してなる。本発明の癌様変異株は、例えば、正常胃粘膜細胞を発癌性物質の存在下で培養して形質転換させることで作製することができる。

Description

明 細 書
癌様変異株
技術分野
[0001] 本発明は、胃癌に対する抗癌剤のスクリーニングに有用な正常胃粘膜細胞由来の 癌様変異株に関する。
背景技術
[0002] 癌治療においては、種々の抗癌剤が化学療法に用いられている力 効力や副作用 などの点で改善の余地があるものも多ぐより優れた抗癌剤の研究開発が精力的に 行われていることは周知の通りである。
[0003] 抗癌剤の研究開発において、被験物質の抗癌作用を評価する方法の 1つとして、 被験物質をシャーレ内で癌細胞と接触させることで、癌細胞を死滅させたりその増殖 を抑制したりするかどうかを調べる方法が実施されている。例えば、被験物質の胃癌 に対する抗癌作用の評価は、 MKN-1, MKN-45, MKN-74, St-4などの胃由来の癌 細胞カも榭立されたヒト胃癌細胞株を用いて行われて 、る。
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0004] し力しながら、上記のような胃由来の癌細胞力 榭立された胃癌細胞株を用いた方 法では、当該癌細胞に対して直接的に比較対照とすることができる正常細胞が存在 しないため、被験物質の胃癌に対する抗癌作用が、癌細胞に特異的なものなのかど う力 即ち、癌細胞に対する感受性を必ずしも正確に評価するといつたことができな かった。
そこで本発明は、胃癌に対する抗癌剤のスクリーニングに有用な正常胃粘膜細胞 由来の癌様変異株を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0005] 本発明者らは、上記の点に鑑みて鋭意研究を重ねた結果、ラットの正常胃粘膜か ら分離された上皮細胞株である、独立行政法人理ィ匕学研究所細胞バンクに細胞番 号 RCB0876として寄託されて!、る公知の RGM-1細胞株を、発癌性物質である N-メチ ル— Nし-トロ— N—-トロソグァ-ジン（MNNG： N— Methy Nし nitro— N— nitrosoguanidine )の存在下で培養すると、癌様細胞に形質転換されることを見出し、 RGM-1細胞株と こうして得られた癌様細胞 (RGK-1細胞株）を用いることで、癌細胞に対する感受性 に優れた抗癌剤のスクリーニングや、発癌性物質力否かの判定などを簡易かつ迅速 に行うことができる方法論を確立した。
上記の知見に基づいてなされた本発明の癌様変異株は、請求項 1記載の通り、正 常胃粘膜細胞を形質転換させてなる。
また、請求項 2記載の癌様変異株は、請求項 1記載の癌様変異株において、正常 胃粘膜細胞が非ヒト動物のものである。
また、請求項 3記載の癌様変異株は、請求項 2記載の癌様変異株において、非ヒト 動物がラットである。
また、請求項 4記載の癌様変異株は、請求項 1記載の癌様変異株において、正常 胃粘膜細胞が正常胃粘膜上皮細胞である。
また、請求項 5記載の癌様変異株は、請求項 4記載の癌様変異株において、正常 胃粘膜上皮細胞が独立行政法人理ィ匕学研究所細胞バンクに細胞番号 RCB0876とし て寄託されて 、る RGM-1細胞株である。
また、請求項 6記載の癌様変異株は、請求項 1記載の癌様変異株において、癌様 変異株が独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 F ERM BP-10619として寄託されて!、る RGK-1細胞株である。
また、本発明の RGK-1細胞株は、請求項 7記載の通り、独立行政法人産業技術総 合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP-10619として寄託されている また、本発明の癌様変異株の作製方法は、請求項 8記載の通り、正常胃粘膜細胞 を発癌性物質の存在下で培養して形質転換させることによる。
また、本発明の抗癌剤のスクリーニング方法は、請求項 9記載の通り、請求項 1記載 の癌様変異株に対する作用を指標にして行う。
また、本発明の抗癌剤のスクリーニングキットは、請求項 10記載の通り、請求項 1記 載の癌様変異株を少なくとも含んでなる。 また、本発明の発癌性の評価方法は、請求項 11記載の通り、被験物質を正常胃粘 膜細胞に作用させることで癌様細胞に形質転換されるか否かを指標にして行う。 また、本発明の発癌性の評価キットは、請求項 12記載の通り、正常胃粘膜細胞を少 なくとも含んでなる。
発明の効果
[0007] 本発明によれば、胃癌に対する抗癌剤のスクリーニングに有用な正常胃粘膜細胞 由来の癌様変異株を提供することができる。
図面の簡単な説明
[0008] [図 1]RGM-1細胞株の顕微鏡写真
[図 2]RGK-1細胞株の顕微鏡写真
発明を実施するための最良の形態
[0009] 本発明の癌様変異株は、正常胃粘膜細胞を形質転換してなる。本発明の癌様変 異株は、例えば、正常胃粘膜細胞を発癌性物質の存在下で培養して形質転換させ ることで作製することができる。ここで、出発細胞となる正常胃粘膜細胞としては、ラッ トゃマウスなどの非ヒト動物の正常胃粘膜上皮細胞が例示される。具体的には、ラット の正常胃粘膜から分離された上皮細胞株である、独立行政法人理ィ匕学研究所細胞 バンクに細胞番号 RCB0876として寄託されている RGM-1細胞株が挙げられる。 RGM -1細胞株は、本発明の発明者の 1人である松井裕史の承諾の下に上記の細胞バン クから入手できる（必要であれば In Vitro Cell. Dev. Biol.- Animal 32:259-261, May 1 996を参照のこと)。発癌性物質としては、例えば、 MNNGなどを用いることができる。 癌様変異株の作製は、例えば、正常胃粘膜細胞の培養のために通常用いられる培 養液に、発癌性物質をその含量が 0.1%〜10%程度になるように添加し、ここに正常胃 粘膜細胞を 103個/ mL〜107個/ mLの割合で播いて通常の培養条件のもとに継代培 養を 10日〜 3ヶ月行えばよい。正常胃粘膜細胞の培養のために通常用いられる培養 液としては、例えば、（DMEM:HamF12=l:l+5%〜20%FBS)などが挙げられる。また、 正常胃粘膜細胞の通常の培養条件としては、例えば、 36°C〜38°C、 4%〜6%COとい
2 つた条件が挙げられる。 RGM-1細胞株を形質転換して得られる癌様変異株としては 、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター (郵便番号 305-8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1中央第 6)に受託番号 FERM BP-10619として 寄託されて 、る RGK-1細胞株 (分類学上の位置：動物細胞）が例示される（寄託日： 2 005年 4月 5日）。
正常胃粘膜細胞が癌様変異株に形質転換された力どうかは、例えば、以下に示す 方法から選ばれる 1つまたは複数の方法に基づ!、て判定すればよ!、。判定の正確性 を高めるためには複数の方法に基づくことが望ましい。
(1)増殖因子依存性の低下
癌様変異株に形質転換されることで増殖因子に対する依存性が低下する。
(2)増殖速度の向上
癌様変異株に形質転換されることで増殖速度が速くなる。
(3)形態変化
癌様変異株に形質転換されることで形や大きさが不揃いになる。
(4)接触阻止の喪失とパイルアップ
癌様変異株に形質転換されることでシャーレ一杯にまで増殖しても増殖が止らず、 細胞の上に細胞が盛り上がるようにして増殖する。
(5)フォーカス形成
癌様変異株に形質転換されることで細胞がパイルアップしたコロニー（フォーカス） を形成する。
(6)クリスクロス
癌様変異株に形質転換されることで細胞同士がクロスして増殖する。
(7)運動性
癌様変異株に形質転換されることで運動性が低下する。
(8)足場依存性の喪失
癌様変異株に形質転換されることで軟寒天ゃァガロースゲルに混ぜて播き込んで も細胞が球状のまま増殖してコロニーを形成する。
(9)分化機能の変化
癌様変異株に形質転換されることで分化機能の発現が変化する。
(10)造腫瘍性の獲得 癌様変異株に形質転換されることでラットやマウスに移植すると腫瘍を形成する。
[0011] 本発明の癌様変異株の利用方法としては、被験物質をシャーレ内で本発明の癌様 変異株と接触させ、被験物質が細胞を死滅させたり増殖を抑制したりするかどうか、 即ち、抗癌作用を有するかどうかを調べるために利用する方法が例示されるが、これ に限定されるものではない。本発明の癌様変異株を所定のチューブに入れて凍結保 存するなどしてキットィ匕しておけば、抗癌剤のスクリーニングを簡便に行うことができる 。また、本発明の癌様変異株とその由来となった正常胃粘膜細胞に同一濃度の被験 物質を接触させ、それぞれに対する作用を評価することで、被験物質の抗癌作用が 癌細胞に特異的なものなのかどうか、即ち、癌細胞に対する感受性を正確に評価す ることがでさる。
[0012] また、本発明により、発癌性物質を用いて正常胃粘膜細胞を癌様変異株に形質転 換できることが明らかになつたので、この現象を利用すれば、正常胃粘膜細胞が癌様 変異株に形質転換されるか否かを指標にして被験物質の発癌性の評価を行うことが できる。正常胃粘膜細胞が癌様変異株に形質転換される過程を追跡することで、正 常胃粘膜細胞の癌化についての経時的な遺伝子レベルの解析を行うこともできる。 正常胃粘膜細胞を所定のチューブに入れて凍結保存するなどしてキットィ匕しておけ ば、このような評価や解析を簡便に行うことができる。
実施例
[0013] 以下、本発明を実施例によって詳細に説明する力 本発明は以下の記載によって 何ら限定して解釈されるものではな 、。
[0014] 実施例 1： RGM-1細胞株から RGK-1細胞株の作製
培養液（DMEM:HamF12=l:l+10%FBS)に、発癌性物質として MNNGをその含量力 ¾ %になるように添加し、ここに RGM-1細胞株を 105個/ mLの割合で播いて約 30日間継 代培養することで作製した (培養条件： 37°C、 5%CO )。図 1に RGM-1細胞株の顕微
2
鏡写真 (倍率： 20倍)を、図 2に RGK-1細胞株の顕微鏡写真 (倍率： 20倍)を示す。
[0015] 実施例 2 : RGK- 1細胞株の特性
(1)接触阻止の喪失とパイルアップ (膜の流動性）
12穴シャーレ中で、 RGK-1細胞株を培養液（同上：以下同じ）に 105個/ mLの割合で 播き、孔径が 1 μ mのフィルタを上部に被せて培養したところ (培養条件は上記の通り ：以下同じ）、培養開始から 3日目にフィルタ表面において細胞の増殖が認められ、 7 日目にはフィルタ表面における増殖がコンフルェントな状態になった。ヒト胃癌細胞 株として知られている MKN-45細胞株を用いて同様の実験を行っても結果は同じで あった。従って、 RGK-1細胞株は癌様細胞に形質転換されていると判定できた。
[0016] (2)軟寒天コロニー形成
上層が 1%ゼラチン含有培養液で下層が 2%ゼラチン含有培養液で構成される寒天 培地上に、 RGK-1細胞株を 105個/ mLの割合で播いて培養したところ、細胞は球状の まま増殖し続け、培養開始から 7日目にコロニーの形成が認められた。 MKN-45細胞 株を用いて同様の実験を行っても結果は同じであった。従って、 RGK-1細胞株は癌 様細胞に形質転換されて!/ヽると判定できた。
[0017] (3)造腫瘍性の獲得
4週令で購入後 2週間予備飼育したヌードマウス (BALB/cA- nu,雄， 日本チヤール スリバー社より購入)の右大腿皮下に、 RGK- 1細胞株が 105個/ mL濃度の生理食塩水 懸濁液 0.2mLを接種しところ (n=7)、約 2週間ですベてのマウスに腫瘍が形成された。 MKN-45細胞株を用いて同様の実験を行っても結果は同じであった。従って、 RGK- 1細胞株は癌様細胞に形質転換されていると判定できた。
[0018] 実施例 3： RGK-1細胞株に対する抗癌剤の作用
12穴シャーレ中で、 RGK-1細胞株を 0.1Mマイトマイシン含有培養液に 105個/ mLの 割合で播いて培養したところ、その増殖が抑制された。従って、 RGK-1細胞株を用い て抗癌剤の抗癌作用を評価できたことから、 RGK-1細胞株は抗癌剤のスクリーニング に利用できることがわかった。
[0019] 実施例 4: RGM-1細胞株に対する発癌性物質の作用
MNNGとともに発癌'性物質として知られて!/ヽるメチノレニトロソゥレア (MNU： N— methyl -N-nitrosourea)の発癌作用を RGM-1細胞株が癌様変異株に形質転換されることで 確認することができた。
産業上の利用可能性
[0020] 本発明は、胃癌に対する抗癌剤のスクリーニングに有用な正常胃粘膜細胞由来の 癌様変異株を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

Claims

請求の範囲
[I] 正常胃粘膜細胞を形質転換させてなる癌様変異株。
[2] 正常胃粘膜細胞が非ヒト動物のものである請求項 1記載の癌様変異株。
[3] 非ヒト動物がラットである請求項 2記載の癌様変異株。
[4] 正常胃粘膜細胞が正常胃粘膜上皮細胞である請求項 1記載の癌様変異株。
[5] 正常胃粘膜上皮細胞が独立行政法人理ィ匕学研究所細胞バンクに細胞番号 RCB0
876として寄託されている RGM-1細胞株である請求項 4記載の癌様変異株。
[6] 癌様変異株が独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託 番号 FERM BP-10619として寄託されて!、る RGK-1細胞株である請求項 1記載の癌様 変異株。
[7] 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号 FERM BP
-10619として寄託されて!、る RGK-1細胞株。
[8] 正常胃粘膜細胞を発癌性物質の存在下で培養して形質転換させることによる癌様 変異株の作製方法。
[9] 請求項 1記載の癌様変異株に対する作用を指標にして行う抗癌剤のスクリーニング 方法。
[10] 請求項 1記載の癌様変異株を少なくとも含んでなる抗癌剤のスクリーニングキット。
[II] 被験物質を正常胃粘膜細胞に作用させることで癌様細胞に形質転換されるか否か を指標にして行う発癌性の評価方法。
[12] 正常胃粘膜細胞を少なくとも含んでなる発癌性の評価キット。
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