JP2023537178A - ヒトｎｓｃｌｃ細胞株及びその用途 - Google Patents
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Abstract
ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株、本発明のヒトＮＳＣＬＣ細胞株が含まれる試薬とキットを提供する。さらに、薬の有効性を測定し、又は、前記薬の薬理学的データを取得するように、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株を利用して抗ＮＳＣＬＣ薬の有効性を評価する用途、及び動物モデルの製造方法を提供する。【選択図】図３
Description
本発明は、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）細胞株、及び抗ＮＳＣＬＣ薬の有効性を評価することにおけるその用途に関する。本発明は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株が含まれる動物モデル、その製造方法、及び、薬の有効性の試験又は前記薬の薬理学的データの取得における該動物モデルの用途をさらに開示する。本発明は、さらに、本発明のヒトＮＳＣＬＣ細胞株が含まれるキットに関する。本発明は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株を用いて抗ＮＳＣＬＣ薬の有効性を評価する方法をさらに開示する。
肺癌は、世界で最も一般的な悪性腫瘍の１つであり、中国の都市人口における悪性腫瘍の死因の第１位となっている。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）は、扁平上皮癌（ＳＣＣ）、腺癌及び大細胞癌を含む。小細胞癌と比較して、癌細胞は、成長と分裂が遅く、拡散と転移が比較的遅い。非小細胞肺癌は、すべての肺癌患者が罹った癌の約８０％を占める。患者の約７５％が、中期及び後期で発見され、５年生存率は低い。
細胞株は、初代細胞培養の最初の継代後に増殖する細胞集合を指す。また、長期連続で継代できる培養細胞も指す。ところが、生き残り、連続的に継代できる細胞はほとんどなく、即ち、細胞株になれる細胞はほとんどない。
ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）は、ＥＧＦ細胞増殖及びシグナル伝達の受容体である。研究により、ＥＧＦＲが多くの固形腫瘍で高発現又は異常に発現することが示されている。ＥＧＦＲは、腫瘍細胞の増殖、血管新生、腫瘍浸潤、転移及びアポトーシス抑制と関連する。ＥＧＦＲチロシンキナーゼ領域の変異は、主にエクソン１８～２１で発生し、エクソン１９と２１における変異がすべてのＥＧＦＲの変異の９０％を占めている。ＥＧＦＲ変異は、例えば、ＰＣＲ及び直接シーケンシング技術を用いて検出することができる。ＥＧＦＲは、腫瘍細胞の増殖、成長、修復及び生存において重要な役割を果たす。ＥＧＦＲは、非小細胞肺癌、乳癌、グリオーマ、頭頸部癌、子宮頸癌、膀胱癌、胃癌など、多くの上皮性腫瘍において過剰に発現する。そのほか、ＥＧＦＲの異常な発現は、新生血管形成、腫瘍浸潤と転移、化学療法耐性及び予後と密接に関連する。ＥＧＦＲ変異のほぼ８０～９０％は、小さいエクソン１９欠失、又はエクソン２１におけるＬ８５８Ｒ変異であるが、他のＴＫＩ感受性ＥＧＦＲ変異は、エクソン１２、１９、２０、２１で起こる可能性がある。エクソン２０におけるＴ７９０ＭなどのＴＫＩ耐性に関連する変異は、小腫瘍細胞サブクローンにおいても進行することができ、同定が必要である（Ｄａｒｉｏ ｄｅ Ｂｉａｓｅら、「Ｎｅｘｔ－Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ ＥＧＦＲ Ｅｘｏｎｓ １８－２１ Ａｌｌｏｗｓ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｓｍａｌｌ Ｒｏｕｔｉｎｅ Ｓａｍｐｌｅｓ（Ｃｙｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｓｙ）」、２０１３年１２月２３日、第８巻、第１２期．ｅ８３６０７に掲載、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００８３６０７）。ＮＳＣＬＣ細胞におけるＥＧＦＲ変異を検出するための方法は、当該技術分野において周知である（Ｈｕｉｌｉ Ｃｈｕら、「Ｄｉｒｅｃｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｎｏｎ－ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ」、オンラインで２０１３年８月２９日に公開、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３８９２／ｏｒ．２０１３．２７０９、第２３１１～２３１５ページ、及び、Ｃｈｉｎｇ－Ｈｓｉｕｎｇ Ｌｉｎら、「Ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ」、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｓｃｉ．２０１０；１７（１）：３７、オンラインで２０１０年５月１２日に公開、ｄｏｉ：１０．１１８６／１４２３－０１２７－１７－３７，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｂｉｏｍｅｄｓｃｉ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／１７／１／３７参照）。
本発明は、エクソン１９、２０及び２１において、１つ又は１つ以上のＥＧＦＲ変異を有する新規なＮＳＣＬＣ腫瘍細胞株を開示し、それは、細胞癌、腫瘍転移のメカニズムを研究し、及びＮＳＣＣＬＣの薬の有効性を評価することに対して重要な意義を持っている。癌研究のための異なる腫瘍細胞株の確立は、新薬の研究開発に有用なデータを提供することができる。ＥＧＦＲ変異を有する腫瘍細胞株は、インビトロとエクスビボの両方で抗ＮＳＣＬＣ薬を評価するための有用なツールである。例えば、腫瘍細胞株を皮下に移植して、薬の有効性評価のための動物モデルを形成することができ、該モデルは、患者の体内環境をシミュレートして、患者の反応を反映することにより、より効果的になる。従って、本関連技術分野では、増殖過程中に安定した遺伝的特徴を維持し、且つ動物モデルにおいて腫瘍に成長する、エクソン１９、２０及び２１に１つ又は１つ以上のＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ細胞株と、参照として用いることができる同じ起源の野生型ＮＳＣＬＣ細胞株とが必要である。本発明のヒトＮＳＣＬＣ細胞株、前記細胞株を含む試薬、キット、又は動物モデルが、薬物の研究開発に有用であることを証明する。
本発明は、ヒトＮＳＣＬＣ（ｈＮＳＣＬＣ）細胞株、即ち、ＬＤ１－００２５－２００６３６、ＬＤ１－００２５－２００６９４、ＬＤ１－０００６－２１５６７６、及びＬＤ１－００２５－２００７１７を提供する。
具体的に言えば、ヒトＮＳＣＬＣ（ｈＮＳＣＬＣ）細胞株ＬＤ１－００２５－２００６３６は、ＥＧＦＲ ＷＴ ＮＳＣＬＣの患者から直接確立され、ＬＤ１－００２５－２００６９４は、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ ＮＳＣＬＣの患者から直接確立され、ＬＤ１－０００６－２１５６７６は、ＥＧＦＲ二重変異（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ）の患者から直接確立され、ＬＤ１－００２５－２００７１７は、ＥＧＦＲ三重変異（１９ｄｅｌ／Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ）の患者から直接確立される。
本発明のヒトＮＳＣＬＣ細胞株は、インビトロで増殖し、且つ動物モデルにおいて腫瘍に成長し、同時にその遺伝的特徴を維持することができる。
本発明は、ＬＤ１－００２５－２００６３６、ＬＤ１－００２５－２００６９４、ＬＤ１－０００６－２１５６７６、及びＬＤ１－００２５－２００７１７の子孫細胞株をさらに含む。
実施形態において、本発明は、連続継代を通して患者のＮＳＣＬＣサンプルから本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を生成する方法に関する。実施形態において、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株は、１０世代以上、特に２０世代以上、より特に３０世代以上、より特に５０世代以上、さらに、特に７０世代以上、さらに、特に１００世代を超える。好ましくは、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株は、１０世代、３０世代、３５世代、４０世代、４５世代、５０世代、５５世代、６０世代、６５世代、７０世代、７５世代、８０世代、８５世代、９０世代、９５世代、１００世代に受け継がれている。
本発明は、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む組織又は臓器サンプルにも関する。特に、前記組織又は臓器サンプルは、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を移植又は注入した動物モデルに由来する。実施形態において、前記組織又は臓器は、動物モデルの肺に由来し、好ましくは、免疫障害マウスの肺に由来する。実施形態において、前記組織又は臓器サンプルは、本発明の転移性ｈＮＳＣＬＣ細胞株を含み、特に、前記組織又は臓器サンプルは、哺乳動物の脳又は骨における本発明の転移性ｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む。
一態様において、本発明は、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む試薬に関する。前記試薬は、抗ｈＮＳＣＬＣ薬の評価に用いることができる。
他の一態様において、本発明は、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株、又は本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む組織若しくは臓器サンプルを含むキットに関する。実施形態において、前記キットは、薬理学的データ又は他の関連データを取得するために、抗ＮＳＣＬＣ薬の有効性の評価、又は、薬の研究開発を行うことに用いることができる。
他の一つの態様において、本発明は、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む動物モデルを開示する。実施形態において、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を動物の体内に皮下移植又は注入することにより動物モデルを取得する。実施形態において、前記動物モデルは、免疫障害を有する哺乳動物であり、好ましくは免疫障害マウスである。
本発明は、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む試薬又はキットを用いて薬の有効性を評価する方法をさらに開示する。実施形態において、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む試薬、又は本発明のキットは、薬の研究開発のデータを取得することに用いられる。実施形態において、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む試薬、又は本発明のキットから得られるデータは、薬の有効性を評価するためのコンピュータモデルを確立することに用いられ、特に、コンピュータソフトウェアを介して前記データを処理して、抗ＮＳＣＬＣ薬の有効性を評価するためのコンピュータモデルを確立することに用いられる。
生体材料の寄託情報
本発明は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－００２５－２００６３６を提供し、受託番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２００５であり、２０２０年６月３日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）（所在地：中国、武漢、武漢大学、４３００７２）に寄託された。
本発明は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－００２５－２００６３６を提供し、受託番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２００５であり、２０２０年６月３日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）（所在地：中国、武漢、武漢大学、４３００７２）に寄託された。
本発明は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－００２５－２００６９４を提供し、受託番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２０１０２であり、２０２０年６月３日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）（所在地：中国、武漢、武漢大学、４３００７２）に寄託された。
本発明は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－０００６－２１５６７６を提供し、受託番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２０１０４であり、２０２０年６月３日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）（所在地：中国、武漢、武漢大学、４３００７２）に寄託された。
本発明は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－００２５－２００７１７を提供し、受託番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２０１０３であり、２０２０年６月３日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）（所在地：中国、武漢、武漢大学、４３００７２）に寄託された。
特に定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての専門用語、記号、及びその他の技術と科学用語は、保護を必要とする主題が属する分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有することを意図している。場合によって、明確に及び／又は参照しやすいように、本明細書は、普遍的に理解された意味を有する用語を定義する。且つ、本明細書に含まれるそのような定義は、必ずしも当該技術分野で一般的に理解されるものとの実質的な相違を表すものとして解釈されるものではない。
本明細書において、「１つ」、「１種」及び「前記」という単数形は、文脈によって特に明確に示されない限り、複数形も含むものである。また、本明細書において「及び／又は」という用語は、１つ又は１つ以上の関連リスト項目の可能なすべての組み合わせを意味し、カバーすることを理解すべきである。さらに、「含む」、「包含する」、及び／又は「含有する」という用語は、本明細書において使用される場合、前記特徴、整数、ステップ、操作、構成要素、成分及び／又はユニットの存在を指定するが、１つ又は複数の他の特徴、整数、ステップ、操作、構成要素、成分、及び／又はそれらのグループが存在するか、又は追加されたかは除外されない。
本発明は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－００２５－２００６３６を提供し、受託番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２００５であり、２０２０年６月３日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）（所在地：中国、武漢、武漢大学、４３００７２）に寄託された。
実施形態において、本発明はヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－００２５－２００６９４を提供し、受託番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２０１０２であり、２０２０年６月３日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）（所在地：中国、武漢、武漢大学、４３００７２）に寄託された。細胞株ＬＤ１－００２５－２００６９４は、Ｌ８５８Ｒをコードするエクソン２１におけるＥＧＦＲ変異を含む。
実施形態において、本発明は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－０００６－２１５６７６を提供し、受託番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２０１０４であり、２０２０年６月３日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）（所在地：中国、武漢、武漢大学、４３００７２）に寄託された。細胞株ＬＤ１－０００６－２１５６７６は、Ｔ７９０Ｍ及びＬ８５８Ｒをコードするエクソン２０及び２１におけるＥＧＦＲ変異を含む。
実施形態において、本発明は、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－００２５－２００７１７を提供し、受託番号はＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２０１０３であり、２０２０年６月３日に中国典型培養物保蔵センター（ＣＣＴＣＣ）（所在地：中国、武漢、武漢大学、４３００７２）に寄託された。細胞株ＬＤ１－００２５－２００７１７は、Ｔ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓをコードするエクソン２０におけるＥＧＦＲ変異、並びにエクソン１９欠失７４６＿７５０ｄｅｌを含む。
具体的に言えば、ヒトＮＳＣＬＣ（ｈＮＳＣＬＣ）細胞株ＬＤ１－００２５－２００６３６は、ＥＧＦＲ ＷＴ ＮＳＣＬＣ患者から直接確立され、ＬＤ１－００２５－２００６９４は、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ ＮＳＣＬＣの患者から直接確立され、ＬＤ１－０００６－２１５６７６は、ＥＧＦＲ二重変異（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ）の患者から直接確立され、ＬＤ１－００２５－２００７１７は、ＥＧＦＲ三重変異（１９ｄｅｌ／Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ）の患者から直接確立される。
そのため、実施形態において、本発明は、ＥＧＦＲ ＷＴ ＮＳＣＬＣ患者、ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ ＮＳＣＬＣ患者、ＥＧＦＲ二重変異（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ）患者及びＥＧＦＲ三重変異（１９ｄｅｌ／Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ）患者を含むＮＳＣＬＣ患者から生成されるＰＤＸ（患者由来異種移植片）モデルを提供する。ＰＤＸモデルは、遺伝子発現プロファイルや薬物反応などの、原発性患者の腫瘍の特徴を保持するため、体内でのヒト癌の最も信頼性の高いモデルである。
表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）チロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）を用いて活性化ＥＧＦＲ変異を有する非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者の治療は、ＮＳＣＬＣ標的療法の画期的な成果を表す。ところが、獲得耐性の出現が避けられないため、臨床において患者の長期的な利益を制限する。Ｔ７９０変異の上に二次治療としての第３世代ＥＧＦＲ－ＴＫＩであるオシメルチニブ（ｏｓｉｍｅｒｔｉｎｉｂ）によるって引き起こされるＥＧＦＲ Ｃ７９７Ｓ変異の出現は、特に課題であり、最終的には治療の失敗につながる。１９ｄｅｌ、Ｔ７９０Ｍ及びＣ７９７ＳにおけるＥＧＦＲ三重変異を有する天然細胞株又は患者由来異種移植片（ＰＤＸ）が存在していないことは、オシメルチニブの獲得耐性の生物学の理解、及びＣ７９７Ｓ変異による獲得耐性を克服する効果的な戦略の開発を著しく遅らせている。
そのため、本発明者は、１９ｄｅｌ及びＴ７９０ＭのＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ患者からＰＤＸの確立に成功した。該患者は、Ｃ７９７Ｓの出現のためにオシメルチニブに対して薬剤耐性を有していた。さらに、発明者は、このようなＥＧＦＲ三重変異のＰＤＸから細胞株を生成した。したがって、該ＰＤＸ及びそれに対応する細胞株は、ＥＧＦＲ Ｃ７９７Ｓ変異に起因するオシメルチニブの獲得耐性を理解し、克服するための貴重な研究モデルを提供する。
Ｃ７９７Ｓ変異を有する細胞株及び患者由来ＰＤＸの可用性は、Ｃ７９７Ｓ変異の獲得によって引き起こされるオシメルチニブ耐性を克服するための効果的な薬物又は手段を開発する上で極めて重要である。しかし、残念ながら、１９ｄｅｌ、Ｔ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓ三重変異ＥＧＦＲを発現する工学的ＥＧＦＲ変異細胞株を除き、これらの患者由来の細胞株及びＰＤＸは、我々の研究業界には存在しない。生体内モデルでは、細胞由来異種移植片（ＣＤＸ）は、工学的ＥＧＦＲ変異細胞株によって確立することができるが、しかしながら、ＣＤＸモデルは、腫瘍内不均一性の低下と臨床的に有効な治療法の予測の記録が乏しいことによって制限される（Ｗｈｉｔｔｌｅら、２０１５及びその中の参照文献）。加えて、工学的三重変異のＥＧＦＲ変異細胞株は、Ｃ７９７Ｓを含む多くの要因によって薬剤耐性が引き起こされる可能性があるため、オシメルチニブ耐性の複雑な自然メカニズムを完全にシミュレートすることはできない。
実施形態において、本発明は、本発明のｈＳＣＬＣ細胞株に由来する子孫細胞株に関する。
実施形態において、本発明は、連続継代を通して患者のＮＳＣＬＣサンプルから本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を生成する方法に関する。実施形態において、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株は、１０世代以上、特に２０世代以上、より特に３０世代以上、より特に５０世代以上、さらに、特に７０世代以上、さらに、特に１００世代を超える。好ましくは、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株は、１０世代、３０世代、３５世代、４０世代、４５世代、５０世代、５５世代、６０世代、６５世代、７０世代、７５世代、８０世代、８５世代、９０世代、９５世代、１００世代に受け継がれている。実施形態において、本発明のｈＮＳＣＬＣは、以下のステップを含む方法によって取得される。（ａ）免疫障害を有する動物に患者から得られる腫瘍組織を移植するか、又は免疫障害を有する動物に患者から得られる腫瘍細胞を注入する。（ｂ）腫瘍細胞を収集するように、免疫障害を有する動物から腫瘍細胞を含む組織又は臓器を解剖する。（ｃ）非腫瘍組織及び壊死腫瘍組織を取り除き、腫瘍を１～２ｍｍ３の断片に切断し、その後、消化バッファーで沈殿を懸濁し、３７℃でインキュベートする。（ｄ）単一細胞を７０ｕＭフィルターで収集し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離する。（ｅ）細胞を懸濁し、１０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ溶液で遠心分離し、中層から細胞を収集する。（ｆ）コンディショナルリプログラミング細胞培養キット（上海リディから入手可能）を使用して細胞を培養する。（ｇ）細胞を１０～１００世代にわたって継代させる。（ｈ）安定した細胞株を取得する。実施形態において、患者のサンプルは、ｉｎ－ｓｉｔｕでのＮＳＣＬＣ組織、又は転移性ＮＳＣＬＣ組織に由来する。
本発明は、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む組織又は臓器サンプルにさらに関する。特に、前記組織又は臓器サンプルは、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む哺乳動物に由来する。実施形態において、前記組織又は臓器は、免疫障害を有する哺乳動物の肺に由来し、好ましくは、免疫障害マウスの肺に由来する。実施形態において、前記組織又は臓器サンプルは、本発明の転移性ｈＮＳＣＬＣ細胞株を含み、ここで、前記組織又は臓器サンプルは、動物の脳又は骨に由来する。
他の一つの態様において、本発明は、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株、又は本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む組織若しくは臓器サンプルを含む試薬に関する。実施形態において、前記試薬は、薬理学的データ又は他の関連データを取得するために、抗ＮＳＣＬＣ薬の評価、又は、薬の研究開発を行うことに用いることができる。
他の一つの態様において、本発明は、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株、又は本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む組織若しくは臓器サンプルを含むキットに関する。実施形態において、前記キットは、薬理学的データ又は他の関連データを取得するために、抗ＮＳＣＬＣ薬の評価、又は、薬の研究開発を行うことに用いることができる。実施形態において、前記キットは、本発明のヒトＮＳＣＬＣ細胞株の存在を検出するための試薬又はツールをさらに含む。
他の一つの態様において、本発明は、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む動物モデルを開示する。実施形態において、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を、動物の体内に皮下移植又は注入することにより動物モデルを取得する。実施形態において、前記動物は、免疫障害を有する哺乳動物である。実施形態において、前記免疫障害を有する哺乳動物はマウスある。
本発明は、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む試薬、キット又は動物モデルを用いて薬の有効性を評価する方法をさらに開示する。実施形態において、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む試薬、キット又は動物モデルは、薬の研究開発のためのデータを取得することに用いられる。実施形態において、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む試薬、キット又は動物モデルから取得したデータは、薬のスクリーニングのためのコンピュータモデルを確立することに用いられ、特に、コンピュータソフトウェアを介して前記データを処理して、抗ＮＳＣＬＣ薬の有効性のコンピュータモデルを取得することに用いられる。
評価される抗ＮＳＣＬＣ薬は、任意の適切な経路、経口又は非経口によって投与することができる。例えば、候補薬は、経口投与又は筋肉内注射（例えば、筋肉内、皮下又は静脈内注入）、局所投与、吸入、皮膚貼付剤等の経皮的送達、インプラント、坐剤等によって本発明の動物モデルに投与される。当業者は、必要に応じて適切な投与経路を選択する。
本発明で評価される抗ＮＳＣＬＣ薬は、既知の抗腫瘍薬若しくはその組み合わせ、新規な抗腫瘍薬若しくはその組み合わせ、又は既知の抗腫瘍薬の新規な組み合わせであってもよい。本発明の方法において、スクリーニングされる薬は、固体、半固体、又は液体の形態で使用することができる。
本発明の動物モデルは、経口投与又は筋肉内注射（例えば、筋肉内、皮下又は静脈内注入）、局所投与、吸入、皮膚貼付剤等の経皮的送達、インプラント、坐剤等によって、抗ＮＳＣＬＣ薬を投与される。当業者は、必要に応じて適切な投与経路を選択する。
実施形態において、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株の細胞増殖は、ＣＴＧ（ＣＥＬＬ ＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ）を通してテストされる。ＣＴＧテスト用キットは市販されたものである。実施形態において、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株のゲノム解析は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングを通してテストされ、これは当業者に既知の方法である。
本発明は、エクソン１９－２１におけるＥＦＧＲ変異を含むｈＮＳＣＬＣ細胞の薬物有効性データベースを作るための薬物有効性データの取得における、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株を含む試薬、キット又は動物モデルの方法又は用途をさらに提供する。実施形態において、薬物有効性データベースは、１つ又は１つ以上の候補薬の細胞増殖阻害率を含む。実施形態において、本発明は、以下のステップを実現するためのコンピュータ読み取り可能な媒体を提供する。
（ｉ）下記の式によって本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株が１つ又は１つ以上の候補薬と接触した後の増殖阻害率を算出する。
阻害率（％）＝（（Ｖコントロール群－Ｖ媒体群）－（Ｖ薬剤治療群－Ｖ媒体群））／（Ｖコントロール群－Ｖ媒体群）×１００％
阻害率（％）＝（（Ｖコントロール群－Ｖ媒体群）－（Ｖ薬剤治療群－Ｖ媒体群））／（Ｖコントロール群－Ｖ媒体群）×１００％
（ｉｉ）ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）による阻害曲線を作成し、対応するＩＣ５０を計算する。
（ｉｉｉ）前記１つ又は１つ以上の候補薬剤の名前、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株の増殖阻害率、阻害曲線及び対応するＩＣ５０を含むデータベースにアクセス可能なコンピュータを任意に確立する。
実施例１．ＰＤＸモデルの構築
ＬＤ１－００２５－２００６３６ＰＤＸモデルは、ＥＧＦＲ ＷＴ ＮＳＣＬＣ患者から確立した。ＬＤ１－００２５－２００６９４ＰＤＸモデルは、ＥＧＦＲＬ ８５８Ｒ ＮＳＣＬＣ患者から確立した。ＬＤ１－０００６－２１５６７６ＰＤＸモデルは、ＥＧＦＲ二重変異（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ）患者の胸水サンプルから確立した。
ＬＤ１－００２５－２００６３６ＰＤＸモデルは、ＥＧＦＲ ＷＴ ＮＳＣＬＣ患者から確立した。ＬＤ１－００２５－２００６９４ＰＤＸモデルは、ＥＧＦＲＬ ８５８Ｒ ＮＳＣＬＣ患者から確立した。ＬＤ１－０００６－２１５６７６ＰＤＸモデルは、ＥＧＦＲ二重変異（Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ）患者の胸水サンプルから確立した。
ＬＤ１－００２５－２００７１７ＰＤＸモデルは、ＮＳＣＬＣと診断され、オシメルチニブ（ＡＺＤ９２９１）に耐性を有する患者から得られた生検サンプルから確立した。患者はＥＧＦＲ三重変異体（１９ｄｅｌ／Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓ）である。該患者の治療履歴の詳細は以下の通りである。
ＥＧＦＲ変異は１９ｄｅｌから１９ｄｅｌ／Ｔ７９０Ｍに徐々に進行し、その後１９ｄｅｌ／Ｔ７９０Ｍ／Ｃ７９７Ｓに進行した。他の人工モデルでは、この治療履歴の影響を模倣することはできなかった。天然由来のＰＤＸ及び細胞株は、オシメルチニブに対する獲得耐性に対抗するための効果的な薬又は手段を開発するための貴重な研究ツール又はモデルとなる。
表１：細胞株ＰＤＸモデルのＷＥＳ（全エクソングループシーケンシング）の結果は以下の通りである。すべての変異は、対応するＰＤＸモデルに保存される。
実施例２．細胞株の確立
ＰＤＸ腫瘍を採取し、ＨＢＳＳに浸漬した。ＨＢＳＳで腫瘍組織を洗浄して、バイオセーフティキャビネットで非腫瘍組織と壊死腫瘍組織を取り除いた。腫瘍を１～２ｍｍ３の断片に切断し、沈殿を消化バッファーで懸濁し、３７℃で２～４時間インキュベートした。単一細胞を７０ｕＭフィルターで回収し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞を懸濁し、１０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ溶液で遠心分離し、中層から細胞を収集した。コンディショナルリプログラミング細胞培養キットを用いて、細胞を懸濁し、培養した。安定した細胞株が得られるまで、１０世代以上の細胞を連続継代させた。
ＰＤＸ腫瘍を採取し、ＨＢＳＳに浸漬した。ＨＢＳＳで腫瘍組織を洗浄して、バイオセーフティキャビネットで非腫瘍組織と壊死腫瘍組織を取り除いた。腫瘍を１～２ｍｍ３の断片に切断し、沈殿を消化バッファーで懸濁し、３７℃で２～４時間インキュベートした。単一細胞を７０ｕＭフィルターで回収し、１０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。細胞を懸濁し、１０ｍｌのＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ溶液で遠心分離し、中層から細胞を収集した。コンディショナルリプログラミング細胞培養キットを用いて、細胞を懸濁し、培養した。安定した細胞株が得られるまで、１０世代以上の細胞を連続継代させた。
実施例３．細胞増殖とゲノム解析
ＣＴＧによって、細胞増殖をテストした。ゲノム解析は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによってテストした。
ＣＴＧによって、細胞増殖をテストした。ゲノム解析は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングによってテストした。
ＬＤ１－００２５－２００６３６：細胞は４．０倍の増殖を示し、良好な細胞生存率を有していた。（図１Ａ）
ＬＤ１－０００６－２１５６７６：細胞は３．３倍の増殖を示し、良好な細胞生存率を有していた。（図１Ｂ）
ＬＤ１－００２５－２００７１７：細胞は３．７倍の増殖を示し、良好な細胞生存率を有していた。（図１Ｃ）
本発明の細胞株のゲノム解析結果を図２に示す。
本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株におけるＥＧＦＲ変異は、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングにより確認された。９～５０世代に受け継がれた後、本発明のｈＮＳＣＬＣ細胞株における変異をＳａｎｇｅｒシーケンシングにより再度検出し、関連する細胞株に残存するすべての変異を同定した。
実施例４
本研究は、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）ＤＮＡ分析法を用いて、上記の新たに確立された細胞株の真正性を調査するために実施した。プロトコルは、下記のとおりである。
本研究は、ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）ＤＮＡ分析法を用いて、上記の新たに確立された細胞株の真正性を調査するために実施した。プロトコルは、下記のとおりである。
１．細胞沈殿及びＰＤＸ組織からゲノムＤＮＡを抽出した。
２．ＧｅｎｅＰｒｉｎｔ １０ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ポジティブ及びネガティブコントロールと共にサンプルを増幅した。
３．ＡＢＩ３７３０ｘｌＧｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて、増幅産物を処理した。
４．ＧｅｎｅＭａｐｐｅｒ４．０ソフトウェアを用いてデータを分析した後、細胞を細胞に対応するＰＤＸ組織と比較した。
ＳＴＲ分析に用いた細胞株の詳細情報及び結果を下記表２～３に示す。
表２：ＳＴＲ分析に用いた細胞株の詳細情報
表３：初代細胞株とＰＤＸとの一致率のプロファイル
この実施例は、新たに確立された細胞株の真正性を証明するものである。
実施例５．薬の有効性の研究
本開示の細胞株（即ち、ＬＤ１－００２５－２００６３６、ＬＤ１－００２５－２００６９４、ＬＤ１－０００６－２１５６７６、及びＬＤ１－００２５－２００７１７）を、９６ウェルの丸底超低付着板に、２×１０４の細胞／ウェルで播種した。細胞株に薬を添加し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で６日間培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを用いてＡＴＰ量を測定した。薬の濃度に対応する阻害率を計算した。阻害率の計算式は下記の通りである。
本開示の細胞株（即ち、ＬＤ１－００２５－２００６３６、ＬＤ１－００２５－２００６９４、ＬＤ１－０００６－２１５６７６、及びＬＤ１－００２５－２００７１７）を、９６ウェルの丸底超低付着板に、２×１０４の細胞／ウェルで播種した。細胞株に薬を添加し、細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で６日間培養した。ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏを用いてＡＴＰ量を測定した。薬の濃度に対応する阻害率を計算した。阻害率の計算式は下記の通りである。
阻害率（％）＝（（Ｖコントロール群－Ｖ媒体群）－（Ｖ薬剤治療群－Ｖ媒体群））／（Ｖコントロール群－Ｖ媒体群）×１００％
ＸＬｆｉｔ（ＩＤＢＳ）によって阻害曲線を作成し、ＩＣ５０を計算した。
ＮＳＣＬＣ細胞株に対するＡＺＤ９２９１のインビトロ有効性試験
本開示のＮＳＣＬＣ細胞株（即ち、ＬＤ１－００２５－２００６３６、ＬＤ１－００２５－２００６９４、ＬＤ１－０００６－２１５６７６、及びＬＤ１－００２５－２００７１７）に対するＡＺＤ９２９１のインビトロ有効性試験を実施した。結果は、図３における、ＡのＬＤ１－００２５－２００６３６（ＥＧＦＲ ＷＴ）細胞株の阻害曲線、ＢのＬＤ１－００２５－２００６９４（ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ）細胞株の阻害曲線、ＣのＬＤ１－０００６－２１５６７６（ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ）細胞株の阻害曲線、ＤのＬＤ１－００２５－２００７１７（ＥＧＦＲ １９ｄｅｌ，Ｔ７９０Ｍ＆Ｃ７９７Ｓ変異体）細胞株の阻害曲線に示される。
本開示のＮＳＣＬＣ細胞株（即ち、ＬＤ１－００２５－２００６３６、ＬＤ１－００２５－２００６９４、ＬＤ１－０００６－２１５６７６、及びＬＤ１－００２５－２００７１７）に対するＡＺＤ９２９１のインビトロ有効性試験を実施した。結果は、図３における、ＡのＬＤ１－００２５－２００６３６（ＥＧＦＲ ＷＴ）細胞株の阻害曲線、ＢのＬＤ１－００２５－２００６９４（ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ）細胞株の阻害曲線、ＣのＬＤ１－０００６－２１５６７６（ＥＧＦＲ Ｌ８５８Ｒ／Ｔ７９０Ｍ）細胞株の阻害曲線、ＤのＬＤ１－００２５－２００７１７（ＥＧＦＲ １９ｄｅｌ，Ｔ７９０Ｍ＆Ｃ７９７Ｓ変異体）細胞株の阻害曲線に示される。
表４：４つのｈＮＳＣＬＣ細胞株におけるＡＺＤ９２９１のＩＣ５０。各用量の平均阻害を示す（３連（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ））。誤差線（Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ）、ＳＥＭ。
ＰＤＸモデル内では、腫瘍細胞は、患者の原発腫瘍部位に見られる酸素、栄養及びホルモンのレベルを模倣する生理学的に関連する腫瘍微小環境で増殖する。また、移植された腫瘍組織は、患者の体内で見られる遺伝的及びエピジェネティックな異常を維持する。この研究では、ＰＤＸモデルが、抗癌剤（即ちＡＺＤ９２９１）に対して腫瘍サンプルを提供した実際の患者に見られるものと類似する反応を示すことを発見した。したがって、この実施例は、ＰＤＸモデルがＮＳＣＬＣ薬の治療応答のテストに有利であることを証明した。
実施例６．ＣＤＸ（細胞株由来の異種移植片）動物モデルの構築
ＮＣＧマウスは三重免疫不全であり、機能性／成熟Ｔ、Ｂ及びＮＫ細胞を欠いており、マクロファージ及び樹状細胞の機能が低下している。これらの動物モデルは、異種移植細胞、組織及びヒト免疫系成分を定着させることができる。ＮＣＧマウスモデルの特性は、腫瘍学研究に理想的である。
ＮＣＧマウスは三重免疫不全であり、機能性／成熟Ｔ、Ｂ及びＮＫ細胞を欠いており、マクロファージ及び樹状細胞の機能が低下している。これらの動物モデルは、異種移植細胞、組織及びヒト免疫系成分を定着させることができる。ＮＣＧマウスモデルの特性は、腫瘍学研究に理想的である。
本開示のＮＳＣＬＣ細胞株（即ち、ＬＤ１－００２５－２００６３６、又はＬＤ１－００２５－２００７１７）の細胞を、トリプシンによって単一細胞に消化させた。細胞を計数し、５×１０６個の細胞を遠心管に移した。細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離し、上清を除去した。１００ｕＬのＰＢＳで沈殿を懸濁し、すぐに試験管を氷の上に置いた。細胞懸濁液を１００ｕＬのマトリゲルと氷の上で混合し、ＮＣＧマウスに対して混合物で皮下接種した。細胞移植後、動物の罹患率と腫瘍の進展状況を毎日検査した。本発明のＮＳＣＬＣ細胞株（即ち、ＬＤ１－００２５－２００６３６及びＬＤ１－００２５－２００７１７）のＣＤＸモデルがうまく確立されたことが観察された。
本開示におけるＣＤＸ及びＰＤＸモデルの作製は、本開示の細胞株が臨床前の薬の開発のための有望なツールとして使用できることを示唆している。
なお、本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示的な目的のみを目的としており、それによる様々な修正又は変更を当業者に提示し、且つ本出願の精神及び範囲、並びに添付の特許請求の範囲に含まれることを理解すべきである。
Claims (13)
- 受託番号がＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２０１０３である、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－００２５－２００７１７。
- Ｔ７９０Ｍ及びＣ７９７Ｓをコードするエクソン２０におけるＥＧＦＲ変異、並びに、エクソン１９欠失７４６＿７５０ｄｅｌを含む、請求項１に記載の細胞株。
- 受託番号がＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２００５である、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－００２５－２００６３６。
- 受託番号がＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２０１０２である、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－００２５－２００６９４。
- Ｌ８５８Ｒをコードするエクソン２１におけるＥＧＦＲ変異を含む、請求項４に記載の細胞株。
- 受託番号がＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｃ２０２０１０４である、ヒトＮＳＣＬＣ細胞株ＬＤ１－０００６－２１５６７６。
- Ｔ７９０Ｍ及びＬ８５８Ｒをコードするエクソン２０及び２１におけるＥＧＦＲ変異を含む、請求項６に記載の細胞株。
- 請求項１から７のいずれか一項に記載のヒトＮＳＣＬＣ細胞株由来の子孫細胞株。
- 請求項１から７のいずれか一項に記載のヒトＮＳＣＬＣ細胞株、又は請求項８に記載の子孫細胞株を含む、試薬。
- 請求項１から７のいずれか一項に記載のヒトＮＳＣＬＣ細胞株、請求項８に記載の子孫細胞株、又は請求項９に記載の試薬を含む、キット。
- 請求項１から７のいずれか一項に記載の細胞株、請求項８に記載の子孫細胞株、請求項９に記載の試薬、又は請求項１０に記載のキットを、抗ＮＳＣＬＣ薬の有効性を評価するために、免疫障害を有する哺乳動物にＮＳＣＬＣを生成することに用いられる使用方法であって、好ましくは、前記免疫障害を有する哺乳動物は、免疫障害マウスである、使用方法。
- 請求項１から７のいずれか一項に記載のヒトＮＳＣＬＣ細胞株、請求項８に記載の子孫細胞株、又は請求項９に記載の試薬を、動物の体内に注入又は移植することを含み、好ましくは、前記動物は免疫障害を有する哺乳動物であり、さらに好ましくは、免疫障害を有するマウスである、動物モデルの製造方法。
- 一種又は複数種の候補薬を、請求項１から７のいずれか一項に記載のヒトＮＳＣＬＣ細胞株、請求項８に記載の子孫細胞株、請求項９に記載の試薬、又は請求項１０に記載のキットに接触させるステップ（ｉ）と、
細胞増殖の阻害を測定するステップ（ｉｉ）と、を含む、抗ＮＳＣＬＣ薬の有効性を評価する方法。
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