WO2004017996A1 - 関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害剤 - Google Patents

関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害剤 Download PDF

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Noboru Yamaji
Nobuaki Shindou
Yoh Terada
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Yamanouchi Pharmaceutical Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to an articular cartilage extracellular matrix degradation inhibitor useful as a therapeutic agent for joint diseases such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis, and osteoarthritis.
  • DNA in the cell nucleus forms a nucleosome-based chromatin structure.
  • the nucleosome is a structure in which core histones (octamers consisting of two molecules each of histones H2A, H2B, H3, and H4) and DNA are wrapped around, and the positively charged lysine residue at the histone N-terminal is Nucleosome exists in a highly folded state by forming a charge stable state with negatively charged DNA (Wolffe, AR et al Cell 84, 817-819, 1996 ). In order for the transcription reaction of a gene to occur in the nucleus, it is necessary to unravel its structure so that various transcription factors can contact DNA.
  • Histones in gene regions where transcription is suppressed have a low degree of acetylation, and histones in gene regions where transcription is actively occurring are strongly acetylated.
  • Histones in gene regions where transcription is suppressed have a low degree of acetylation, and histones in gene regions where transcription is actively occurring are strongly acetylated.
  • Has previously known Hebbes, TR et al EMBO J. 7, 1395-1402, 1988; Grunstein, M. et al Nature 389, 349-352, 1997.
  • the histone lysine residue in the nucleosome is acetylated, its positive charge is neutralized, and the nucleosome structure relaxes, allowing various transcription factors to contact DNA and facilitate transcription.
  • HAT histone deacetylase
  • HDAC histone deacetylase
  • butyric acid which has various actions such as cell cycle arrest, normalization of transformed cell morphology, and induction of differentiation, has been known to accumulate highly acetylated histones in cells and inhibit HDAC.
  • TSA microbial metabolite Trichostatin A
  • TSA is a potent HDAC inhibitor
  • HDAC inhibitors are also being studied. Trapoxin, a microbial metabolite, was known to inhibit cell growth and normalize the morphology of v-sis transformed cells.
  • CHAP cyclic hydroxamic acid-containing peptide
  • Valproic acid Gott Anlagen, M. EMBO J. 20, 6969-78, 2001
  • NVP-LAQ824 Perez, LB et al Proc. Am.Assoc. It has been reported that compounds such as Cancer Res. Abst # 3671, 2002, WO02 / 22577) and Apicidin (Cancer Res. 60, 6068-6074, 2000) have HDAC inhibitory activity.
  • a compound in which R is an isopropyl group in Formula (II) is Compound A, a compound in which sec-butyl is R in Formula B, a compound B in which R is an isobutyl group, and a compound C in which R is an isobutyl group in Formula (II).
  • the depsipeptide compound represented by (Ila) is abbreviated to reduced compounds A to C, respectively.
  • R means an isopropyl group, a sec-butyl group or an isobutyl group.
  • HDAC inhibitors are expected to be effective as antitumor agents because they exhibit cell cycle arrest, normalization of transformed cell morphology, differentiation induction, apoptosis induction, and angiogenesis inhibitory action (Non-patent Document 1). And 2).
  • treatment and improvement of cell proliferative diseases such as infectious diseases, autoimmune diseases and skin diseases (see Non-patent Document 3), and prevention and treatment of progressive neurodegenerative diseases such as Huntington's disease (See Non-Patent Document 4)
  • various applications have been attempted, such as efficient vector transfer in gene therapy (see Non-Patent Document 5), and enhancement of transgene expression (see Non-Patent Document 6).
  • Patent Document 1 The patent specification of the FK228 reduced form (Patent Document 1) states that the FK228 reduced form is useful for diseases caused by abnormal gene expression due to its HDAC inhibitory activity. Although rheumatoid arthritis and osteoarthritis are mentioned, there is no specific effect described, nor is there any evidence of a therapeutic effect.
  • International Publication WO02 / 055017 pamphlet shows the effect of an HDAC inhibitor on the normal expression of abnormal immune-related genes in T cells collected from patients with systemic lupus erythematosus. Based on this, it is described that it can be used to treat autoimmune diseases including rheumatoid arthritis. However, there is no disclosure of a specific effect on rheumatoid arthritis, and there is no description suggesting that an HDAC inhibitor inhibits degradation and degeneration of extracellular matrix components of articular cartilage.
  • Joint diseases such as osteoarthritis, rheumatoid arthritis (RA), and osteoarthritis (OA) mainly involve damage and degeneration of articular cartilage.
  • OA is the disease with the largest number of patients, but with current treatment methods, the analgesic and anti-inflammatory drug ⁇ hyaluronan is used as a symptomatic treatment to reduce the pain associated with cartilage degeneration and subchondral bone destruction. It is used only for clinical purposes, and it cannot be said that it has achieved a sufficient therapeutic effect.
  • Joint diseases are caused by various causes, such as cartilage surface cracks due to trauma, abnormal autoimmunity, and abnormalities of matrix metallo-orbase, and in the early stage, degradation and degeneration of extracellular matrix in articular cartilage It is commonly observed (see Non-Patent Documents 7 and 8).
  • the extracellular matrix is mainly composed of type II collagen and aggrecan, a cartilage-specific proteodalican, and both disruptions cause destruction of the extracellular matrix, leading to destruction of cartilage tissue.
  • Non-Patent Documents 79 and 10 described above.
  • No therapeutic agent for joint diseases that controls the degradation and degeneration of the extracellular matrix of articular cartilage has been put on the market (see Non-Patent Documents 11 and 12).
  • Non-Patent Document 1 Marks, P.A. et al., "Joumal of the National Cancer Institute 2000, Vol. 92, p. 1210-1216
  • Non-Patent Document 2 im M.S. et al., "Nature Medicine J 2001, Vol. 7, p. 437-443
  • Non-Patent Document 4 Steffan, J.S. et al., ⁇ NatureJ 2001, Vol. 413, p.739-743
  • Non-Patent Document 5 Dion, L.D., et al., "Virology”, 1997, Vol.231, ⁇ 201-209
  • Non-Patent Document 7 Ishiguro, N, “Separate Volumes, History of Medicine (Extracellular Matrix)”, Medical and Dental Medicine Publishing Co., Ltd., February 25, 1997, p.81-85
  • Non-Patent Document 8 Ozaki, S, et al., "Bone to Know: New Medical Treatment for Joint Diseases", Shinko Trading
  • Non-Patent Document 9 Lohmander LS. Et al., "Aithritis and Rhettismj 1993, Vol. 36, No. 9, ⁇ ⁇ 1214-22
  • Non-Patent Document 10 Ma ait AM. Et al., “Journal of Biological Chemistry 2002, Vol. 277, No. 25, p. 22201-8
  • Non-Patent Document 11 Close DR et al., Annals of the Rheumatic Diseases], 2001, Vol. 60, No. 3, p.62-67
  • Non-Patent Document 1 2 Arner, EG et al., "Current Opinion in Pharmacology J, 2002, Volume 2, p.322-329
  • Patent Document 1 International Publication WO02 / 06307 Breadlet
  • Patent Document 2 International Publication WO02 / 055017 Pamphlet Disclosure of the Invention
  • the present inventors have conducted intensive studies on the effects of HDAC inhibitory compounds, and found that all HDAC inhibitory compounds having completely different structures have a good effect of inhibiting articular cartilage extracellular matrix degradation.
  • the present invention has been completed.
  • the present invention relates to an articular cartilage extracellular matrix degradation inhibitor comprising an HDAC inhibitory compound as an active ingredient.
  • the present invention relates to a prophylactic or therapeutic agent for osteoarthritis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, etc., which is involved in the degradation and degeneration of articular cartilage extracellular matrix.
  • the present invention also relates to an agent for preventing or treating extracellular matrix degradation of articular cartilage in osteoarthritis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis and the like, which comprises an HDAC inhibitory compound as an active ingredient.
  • the present invention also relates to the use of an HDAC-inhibiting compound for the manufacture of a medicament for inhibiting articular cartilage extracellular matrix degradation.
  • the present invention relates to a method for preventing and treating a disease caused by degradation of articular cartilage extracellular matrix, which method comprises administering to a patient a therapeutically effective amount of an HDAC inhibitory compound.
  • the present invention has the potential that an HDAC inhibitory compound involved in transcriptional regulation may unexpectedly suppress the degradation and degeneration of extracellular matrix, which is a major lesion of osteoarthritis, and play a central role in the treatment of osteoarthritis. It is a discovery and a truly revolutionary invention.
  • the HDAC inhibitory compound used in the medicament of the present invention is a compound that inhibits HDAC and a salt thereof, and specifically, a known HDAC inhibitory compound, FK228 and its reduction , Depsipeptide compounds (compounds A, B and C) and their reduced forms, MS-27-275, Trichos.tatin A, NVP-LAQ824, SAHA, Apicidin, butyric acid and its derivatives (Phenylbutyrate, Pivaloyloxvmetyl butyrate, Valproic acid Etc.), CI-994, Depudecin, Trapoxin and CHAP.
  • HDAC inhibitory compounds are commercially available or can be obtained using methods known in the literature.
  • FK228 and its reduced form debutpeptide compounds (compounds A, B and C) and their reduced forms, MS-27-275, Trichostatin A, NVP-LAQ824, SAHA, Apicidin, Phenylbuty rate and Valproic acid
  • FK228 and its reduced form depsipeptide compounds (compounds ⁇ , ⁇ and C) and their reduced forms, MS-27-275, Trichostatin A, NVP-LAQ824, SAHA and Apicidin .
  • Derivatives of these compounds having the same action are also suitable as the HDAC inhibitor of the present invention.
  • the HDAC inhibitory activity can be easily measured according to a known general method, for example, the method described in Yoshida, M. et al J. Biol. Chem. 265, 17174-17179, 1990. Specifically, for the prepared literature SL mounting method [3 H] ⁇ cetyl histones and using histone de Asechiru enzyme fraction, a test compound containing [3 H] ⁇ cetyl histones and DTT reaction The mixture was added to the solution, pre-incubated at room temperature for 1 hour, mixed with the histone deacetylase fraction, reacted at room temperature for 2 hours, added with 1M hydrochloric acid and ethyl acetate, and then separated by centrifugation. The measurement can be performed by measuring the radioactivity in the layer with a liquid scintillation counter.
  • HDAC inhibitory activity of a representative HDAC inhibitory compound is shown together with the cited reference.
  • Compound A shows the results measured by the above method.
  • Butyrates butyric acid, Phenylbutyrate, etc.
  • raM order Namate. Rev. Drug Discov. 2002 1, 287-299, 2002
  • Tric ostatin A 2.1 nM (IC 50 value; Exp. Cell Res. 241, 126-133, 1998)
  • NVP-LAQ824 0.03 JLM. (IC 5 value; Blood First Edition Paper, prepublished online June 19, 2003)
  • Another preferred HDAC inhibitory compound of the present invention is a compound having an HDAC inhibitory activity (IC 5 o value) of 100 or less, more preferably 10 M or less, and still more preferably 1 / M or less, as measured by the method of Yoshida et al. is there.
  • compositions containing one or more HDAC-inhibiting compounds as active ingredients can be converted into tablets, powders, and fine granules using commonly used pharmaceutical carriers, excipients, and other additives. , Granules, capsules, pills, solutions, injections, suppositories, ointments, patches, etc., and are administered orally or parenterally.
  • the clinical dose of the HDAC inhibitor compound to humans can be appropriately set depending on the type of the HDAC inhibitor compound.
  • about 0.001 to 500 mg, preferably 0.01 to 300 mg per day is appropriate, and it is administered once or in 2 to 4 times.
  • intraarticularly, intramuscularly, subcutaneously or intravenously about 0.0001 to 100 mg, preferably 0.001 to 10 mg per administration is appropriate.
  • the administration frequency and dosage are appropriately determined in consideration of the symptoms, age, sex, etc., depending on the individual case.
  • the one or more active compounds comprise at least one inert diluent, such as lactose, mannitol, glucose, hydroxypropyl cellulose, microcrystalline cellulose, starch, polybutylpyrrolidone. , Aluminum metasilicate It is mixed with magnesium phosphate.
  • the composition may contain, in a conventional manner, additives other than inert diluents, for example, lubricating agents such as magnesium stearate, disintegrating agents such as calcium cellulose glycolate, and stabilizers and solubilizing agents. May be contained. If necessary, tablets or pills may be coated with a sugar coating such as sucrose, gelatin, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose phthalate or a film of a gastric or enteric compound.
  • Liquid compositions for oral administration include pharmaceutically acceptable emulsions, solutions, suspensions, syrups, elixirs and the like, and commonly used inert diluents such as purified Contains water and ethyl alcohol.
  • This composition may contain, in addition to the inert diluent, auxiliary agents such as a solubilizing agent, a wetting agent, and a suspending agent, a sweetening agent, a flavoring agent, a flavoring agent, and a preservative.
  • Injections for parenteral administration include sterile aqueous or non-aqueous solutions, suspensions, and emulsions.
  • Diluents for aqueous solutions and suspensions include, for example, distilled water for injections and saline.
  • examples of diluents for water-insoluble solutions and suspensions include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, alcohols such as ethyl alcohol, and polysorbate 80 (trade name).
  • Such compositions may further comprise additives such as tonicity agents, preservatives, wetting agents, emulsifiers, dispersants, stabilizers (eg, lactose), solubilizing agents.
  • solubilization treatment known methods applicable to pharmaceutical preparations, for example, a method of adding a surfactant, and formation of a solid dispersion of a drug and a solubilizer, for example, a polymer (a water-soluble polymer or an enteric polymer) Method.
  • Example 1 (1) Proteodalican (PG) destruction inhibitory activity in primary cultured heron cartilage cells (retinoic acid stimulation)
  • Egret Japanese white species, female, 1.0-: 1.5 kg was killed under over anesthesia, the knee joint was excised, and the cartilage layer on the joint surface was peeled off with a scalpel and shredded.
  • trypsin-EDTA trypsin-EDTA
  • the cells were seeded on a 96-well plate (manufactured by Asahi Techno Glass Co.) coated with type I collagen at 200 ⁇ / well. Three days later, the medium was replaced with 200/1 DMEM / 10% FBS medium containing 50 / g ml ascorbic acid (hereinafter referred to as ascorbic acid medium), and the culture was further repeated twice for two days. Thereafter, ⁇ Sa formic knee articular cartilage primary culture cells at a final concentration of 10 H Ci / ml of Na 2 35 S0 4 containing Asukorupin acid medium 200
  • the cells were washed three times with 2001 ascorbic acid medium and cultured for 1 day in 20011 ascorbic acid medium.
  • the cells were stimulated with a 1 M final concentration of all-trans retinoic acid (manufactured by Sigma), and 48 hours later, the culture supernatant was collected in 20 I portions, and the radioactivity was measured using TopCount (Packard's restriction).
  • the test compound was added at the same time as the start of stimulation, and its PG degradation inhibitory activity was calculated as a percentage with the retinoic acid-free group being 100 % and the retinoic acid-added group being 0%.
  • Example 2 PG destruction inhibitory activity in primary culture cells of egret cartilage (IL-1 stimulation)
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, primary cultured egret cartilage cells were prepared. Stimulate with human IL-li3 (R & D System) at a final concentration of lOng / ml, collect the culture supernatant 20 hours after 48 hours, and measure the radioactivity using Topcount (Packard) did. The test compound was added at the same time as the start of stimulation, and the PG degradation inhibitory activity was calculated as a percentage with the IL-1 non-addition group being 100% and the IL-1 addition group being 0%.
  • human IL-li3 R & D System
  • Topcount Topcount
  • test methods of Examples 1 and 2 described above have been widely used as a simple evaluation method for evaluating the effect of a test compound on articular cartilage, particularly the effect on degradation and degeneration of extracellular matrix, and have been widely used for screening of therapeutic agents for joint diseases. This is the method used (Spirito S. et al, Agents Actions; 39, C160-2, 1993).
  • a matrix meta-oral protease inhibitor that has the effect of inhibiting PG degradation by retinoic acid or IL-1 in vitro (Lawrence J. et al, Arch Biochem Biophys. 344 (2), 404-12, 1997) has been confirmed to suppress the degradation and degeneration of extracellular matrix well in osteoarthritis model mice (Aim Rheum Dis.
  • the HDAC inhibitory compound which is an active ingredient of the present invention, which has been confirmed to have excellent effects in this evaluation system, is useful as a drug for suppressing the degradation and degeneration of the extracellular matrix of articular cartilage.
  • the HDAC-inhibiting compound which is an active ingredient of the present invention, is suitable for articular chondrocyte cells with respect to both IL-1 and retinoic acid, which are typical stimulators that cause the degradation and degeneration of the cartilage extracellular matrix. It has the action of inhibiting the degradation and denaturation of the extracellular matrix, and is useful as a drug that inhibits the degradation and denaturation of the extracellular matrix of chondrocytes regardless of the type of stimulant.
  • the HDAC inhibitory compound which is an active ingredient of the medicament of the present invention, favorably inhibits the degradation of the extracellular matrix of articular cartilage. Degradation of bone extracellular matrix. Useful as a preventive or therapeutic agent for osteoarthritis, rheumatoid arthritis, osteoarthritis, etc. involving degeneration.

Abstract

ヒストン脱アセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する本発明の関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害剤は、関節軟骨細胞外マトリクス分解・変性の関与する疾患や病態、殊に骨関節炎、関節リウマチ、変形性関節症等の予防並びに治療に有用である。

Description

明 細 書
関節軟骨細胞外マ卜リクス分解阻害剤
技術分野
本発明は、 骨関節炎、 関節リウマチ、変形性関節症などの関節疾患の治療剤として有 用な関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害剤に関する。 背景技術
細胞の核内の DNAはヌクレオソ一ムを基本としたクロマチン構造を形成している。 ヌクレオソ一ムはコアヒストン (ヒストン H2A, H2B, H3, H4それぞれ 2分子ずつから 成る 8量体） と DNAとが巻き付いた構造体で、 ヒストン N末端に存在する正電荷を帯 びたリジン残基は負電荷を帯びた DNAと電荷的に安定な状態を形成することでヌクレ ォソ一ムは高次に折り畳まれた状態で存在している （Wolffe,A.R et al Cell 84， 817-819, 1996)。 核内で遺伝子の転写反応が起こるためにはその構造を解けた状態にして、 様々 な転写因子が DNAに接触できるようにすることが必要である。転写が抑制されている 遺伝子領域のヒストンはァセチル化の程度は少なく、活発に転写が起こつている遺伝子 領域のヒストンは強くァセチル化されているといったように、ヒストンのァセチル化と.. 転写活性化の関連性が以前より知られていた （Hebbes,T.R. et al EMBO J. 7, 1395-1402, 1988、 Grunstein,M. et al Nature 389, 349-352, 1997)。 ヌクレオソ一ム中のヒストンのリジ ン残基がァセチル化されるとその正電荷は中和され、ヌクレオゾーム構造が弛緩するこ とで様々な転写因子が DNAに接触できるようになり、 転写が起こりやすくなると考え られている （Hong,L.et al J.Biol.Chem. 268, 305-314, 1993)。 ラーゼ (Histone Acetyltransferase); HAT) とヒストン脱ァセチル化酵素 （ヒストンデァセ チラ一ゼ (ffistone Deacetylase); HDAC) とのバランスによって制御されていることが知 られており、 近年、 いくつかの ΗΛΓ並びに HDACが同定されその転写調節における 重要性が報告されている (Ogryzko,V.V. et al Cell 87, 953-959, 1996、 Brown,C.E. et al Trends Biochem.Sci. 25(1), 15-19, 2000、 Grozinger,C.M. et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96, 4868-4873, 1999)。
一方で、 細胞周期停止、 形質転換細胞の形態正常化、 分化誘導など多彩な作用を有す る酪酸は、 細胞内に高ァセチル化ヒストンを蓄積させ、 HDAC 阻害作用を有すること が以前より知られていた (Counsens,L.S.et al J.Biol. Chem. 254， 1716-1723, 1979)。 また、 微生物代謝産物の Trichostatin A (TSA)は細胞周期の停止、分化誘導を示すことが知られ ていたが（Yoshida，M. et al Cancer Res 47, 3688-3691, 1987、 Yoshida,M. et al Exp.Cell Res 177, 122-131, 1988)、 細胞内に高ァセチル化ヒストンを蓄積させ、 部分精製した HDAC を用いた検討から TSAが強力な HDAC阻害剤であることが明らかとなつた（Yoshida,M. et al J.Biol.Chem. 265, 17174-17179, 1990)。
他の HDAC阻害剤についても研究が進んでいる。 微生物代謝産物である Trapoxinは 細胞増殖を抑制し、 v-sis 形質転換細胞の形態を正常化する作用が知られていたが
(ltazaki,H. et al J.antibiotics 43(12), 1524-1534,1990)、後に HDAC阻害剤であることが明 らかとなつた （Kijima,M. et al J.Biol.Chem. 268, 22429-22435, 1993)。 その阻害形式は不 可逆的であることから、この Trapoxinを分子プローブとしてこれに結合するヒト HDAC のクローニングも報告されている （Taunton,J. et al Science 272 408-411, 1996)。 その他、. Depudecin (Kwon,H.J. et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95, 3356-3361, 1998)、 Phenylbutyrate
(Warrell,R.PJr. et al J.Natl.Cancer Inst. 90(21), 1621-1625, 1998)、 Pivaloyloxymet yl butyrate (Aviram, A. et al IntJ.Cancer 56, 906-909, 1994)、 MS-27-275 (Saito，A. et al Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96， 4592-4597, 1999)、 CI-994 (Howard, C.T et al Proc. Am. Assoc. Cancer Res. abst #2886, 2002)、 SAHA (Richon,V.M. et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 95, 3003-3007, 1998 ) 、 CHAP (cyclic hydroxamic acid-containing peptide) ( Furumai,R. et al Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 98, 87-92, 2001)、 Valproic acid (Gottlicher, M. EMBO J. 20, 6969-78, 2001)、 NVP-LAQ824 (Perez, L.B. et al Proc.Am.Assoc.Cancer Res. abst #3671, 2002、 WO02/22577公報）、 Apicidin (Cancer Res. 60, 6068-6074, 2000) などの化合物が HDAC 阻害作用を有することが報告されている。 また、 最近になって、 いくつかのデブシぺプチド誘導体が良好な HDAC阻害作用を 有することが報告されている。 例えば、 FK228 (Nakajima,H.et al Exp.Cell Res. 241, 126-133,1998) 及び下式 (I) で示されるデプシペプチド化合物 (国際公開 WO02/06307
Figure imgf000004_0001
ド化合物を FK288還元体、 一般式 （II) において Rがイソプロピル基であるものを化 合物 A、 sec-ブチル基であるものを化合物 B、 イソブチル基であるものを化合物 C、 ま た一般式（Ila)で示されるデプシペプチド化合物を化合物 A〜Cの還元体とそれぞれ略 記する。
Figure imgf000004_0002
(I) (II) (Ha)
(式中 Rは、 イソプロピル基、 sec-ブチル基又はイソブチル基を意味する。）
HDAC 阻害剤は、 細胞周期停止、 形質転換細胞の形態正常化、 分化誘導、 アポトー シス誘導、血管新生阻害作用などを示すことから、抗腫瘍剤としての効果が期待されて いる （非特許文献 1及び 2参照）。 またその他にも、 例えば感染症、 自己免疫疾患、 皮 膚病 （非特許文献 3参照） などの細胞増殖性疾患の治療 ·改善薬、 またハンチントン病 などの進行性神経変性疾患の予防 ·治療薬 （非特許文献 4参照）、 さらに遺伝子治療に おけるベクター導入の効率化 （非特許文献 5参照）、 導入遺伝子の発現宂進 （非特許文 献 6参照） など様々な応用も試みられている。
しかしながら、 現在まで、 HDAC と関節軟骨細胞外マトリクスの関連を示す具体的 報告は無く、 HDAC 阻害剤が関節軟骨細胞外マトリクス成分の分解 ·変性を阻害し、 関節軟骨細胞外マトリクス成分の分解 ·変性を伴う関節疾患の予防 ·治療に有用である ことを示唆する報告も何等なされていない。
なお、前記 FK228還元体の特許明細書（特許文献 1 )には、 FK228還元体はその HDAC 阻害活性により異常な遺伝子発現によって引き起こされる疾患に有用として、多数の疾 患が羅列されている中にリウマチ性関節炎や変形性関節症が挙げられているが、具体的 な効果の記載は無く、 治療効果を示す根拠も示されていない。 また、 国際公開 WO02/055017号パンフレツト（特許文献 2 )には、 HDAC阻害剤が全身性エリトマト一 デス患者から採取した T細胞において異常な免疫関連遺伝子の発現を正常な状態にす る効果が示されたことに基づき、関節リウマチを含む自己免疫疾患の治療に使用できる との記載がある。 しかしながら、 関節リウマチに対する具体的な効果の開示は無く、 HDAC阻害剤が関節軟骨細胞外マトリクス成分の分解 ·変性を阻害することを示唆す る記載も無い。
骨関節炎、 関節リウマチ （RA)、 変形性関節症 （OA) などの関節疾患は、 関節軟骨 の損傷 ·変性を主病変とする疾患である。関節疾患の中で最も患者数の多い疾患は O A であるが、現行の治療法においては鎮痛消炎剤ゃヒアル口ン酸製剤が軟骨変性 ·軟骨下 骨破壊に伴う痛みを軽減する目的で対症療法的に用いられているに過ぎず、十分な治療 効果を上げているとは言えない状況にある。
関節疾患は、外傷による軟骨表面の亀裂、 自己免疫の異常或いはマトリクスメタロブ 口テアーゼの異常等、様々の原因により生じ、その初期の段階においては関節軟骨にお ける細胞外マトリクスの分解 ·変性が共通して観察される（非特許文献 7及び 8参照）。 細胞外マトリクスは主に II型コラーゲンと軟骨特異的プロテオダリカンであるァグリ カンから構成されており、 どちらの破綻も細胞外マトリクスの破壊を引き起こし、軟骨 組織の破壊につながる。 さらにこの軟骨組織の破壊が、 RAにおいては軟骨下骨組織の 露出、 破壊、 変性を引き起こし、 関節機能の障害を招く一方、 OAにおいては軟骨下骨 の増殖による骨棘形成や骨硬化を引き起こし、関節の変形を招く （前記非特許文献 8参 照)。 そのため、 古くからこれらの関節疾患に共通する細胞外マトリクスの分解 ·変性 W 200
を制御することが関節疾患の治療に繋がると考えられており、 その分解を担うプロテ ァ一ゼ （コラゲナーゼ、 ァグリカナーゼ） の同定、 そして、 それらの阻害剤の探索、 医 薬品としての開発の試みが精力的に行われてきている （前記非特許文献 7 9及び 1 0 参照）。 しかしながら、 現在に至るまで、 関節軟骨細胞外マトリクスの分解 ·変性を制 御する関節疾患治療薬は上市されていない （非特許文献 1 1及び 1 2参照）。
今なお、関節軟骨細胞外マトリクスの分解を良好に阻害する医薬の創製が切望されて いる。
【非特許文献 1】 Marks,P.A.ら、 「Joumal of the National Cancer Institute 2000年、 第 92 巻、 p.1210-1216
【非特許文献 2】 im M.S.ら、 「Nature MedicineJ 2001年、 第 7巻、 p.437-443
特 B午文犬 3 J Darkin-Rattray,S J. 1 Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America] , 1996年、 第 93巻、 p.13143- 13147
【非特許文献 4】 Steffan,J.S.ら、 「NatureJ 2001年、 第 413巻、 p.739-743
【非特許文献 5】 Dion, L.D.ら、 「Virology」、 1997年、 第 231卷、 ρ·201-209
L 特午文南犬 6】 Chen,W.Y.ら、 I Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of AmericaJ , 1997年、 第 94巻、 p.5798-5803
【非特許文献 7】 Ishiguro, N、 「別冊 ·医学のあゆみ （細胞外マトリックス)」、 医歯薬 出版株式会社、 1997年 2月 25日、 p.81-85
【非特許文献 8】 Ozaki, S ら、 「知っておきたい骨 '関節疾患の新たな診療」、 真興交易
(株) 医書出版部、 2001年 11月 20日、 p.46-95
【非特許文献 9】 Lohmander LS.ら、 「Aithritis and Rhe tismj 1993年、 第 36卷、 第 9号、 ρ·1214-22
【非特許文献 1 0】 Ma ait AM.ら、 「 Journal of Biological Chemistry 2002年、 第 277 巻、 第 25号、 p.22201-8
【非特許文献 1 1】 Close D.R.ら、 Annals of the Rheumatic Diseases] , 2001年、 第 60 卷、 第 3号、 p.62-67 【非特許文献 1 2】 Arner, E.G.ら、 「Current Opinion in Pharmacology J、 2002年、第 2巻、 p.322-329
【特許文献 1〕 国際公開 WO02/06307号パンフレツト
【特許文献 2】 国際公開 WO02/055017号パンフレット 発明の開示
本発明者等は、 HDAC阻害化合物の作用につき鋭意検討する中で、 多くの構造の全 く異なる HDAC阻害化合物が、 いずれも良好な関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害作 用を有することを知見し、 本発明を完成した。
即ち、 本発明は、 HDAC 阻害化合物を有効成分として含有する関節軟骨細胞外マト リクス分解阻害剤に関する。殊に、 関節軟骨細胞外マトリクスの分解 ·変性の関与する 骨関節炎、 関節リウマチ、 変形性関節症等の予防又は治療剤に関する。
また、 本発明は、 HDAC阻害化合物を有効成分として含有する骨関節炎、 関節リウ マチ又は変形性関節炎等における関節軟骨細胞外マトリクス分解の予防又は治療剤に 関する。
また、 本発明は、 関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害用医薬の製造の為の HDAC阻 害化合物の使用に関する。
更に、本発明は、関節軟骨細胞外マトリクス分解に起因する疾患の予防及び治療方法 であって、 治療有効量の HDAC阻害化合物を患者に投与することからなる予防及び治 療方法に関する。
本発明は転写調節に関与する HDAC阻害化合物が、 意外にも骨関節炎の主病変であ る関節細胞外マトリクス分解 ·変性そのものを抑制し、骨関節炎治療の中心的役割を担 え得る可能性を見出したものであり、 まさに画期的な発明であるといえる。
以下、 本発明につき詳述する。
本発明医薬に用いられる HDAC阻害化合物としては、 HDACを阻害する化合物並び にその塩であり、 具体的には、 公知の HDAC阻害化合物である、 FK228及びその還元 体、 デプシペプチド化合物 （化合物 A，B及び C) 及びそれらの還元体、 MS- 27-275、 Trichos.tatin A、 NVP-LAQ824, SAHA、 Apicidin、 酪酸及びその誘導体 （Phenylbutyrate、 Pivaloyloxvmet yl butyrate, Valproic acid等)、 CI-994、 Depudecin、 Trapoxin並びに CHAP などが挙げられる。 これらの HDAC阻害化合物は、 市販されているか、 文献既知の方 法を用いて入手することができる。 好ましくは、 FK228 及びその還元体、 デブシぺプ チド化合物 （化合物 A，B及び C) 及びそれらの還元体、 MS- 27-275、 Trichostatin A、 NVP-LAQ824, SAHA、 Apicidin, Phenylbuty rate及び Valproic acidであり、 より好まし くは、 FK228及びその還元体、 デプシペプチド化合物 （化合物 Α,Β及び C) 及びそれ らの還元体、 MS-27-275、 Trichostatin A、 NVP-LAQ824, SAHA及び Apicidinである。 また、 同様の作用を持つこれらの化合物の誘導体も本発明の HDAC阻害化合物として 好適である。
HDAC阻害活性は、 公知の一般的方法、 例えば、 Yoshida, M. et al J.Biol.Chem. 265, 17174-17179, 1990に記載の方法に従って容易に測定できる。 具体的には、 当該文献記 載の方法で調製された [3H]ァセチルヒストン及びヒストン脱ァセチル化酵素画分を使 用し、被験化合物を [3H]ァセチルヒストンと DTTを含む反応溶液中に加え、室温にて 1 時間プレインキュベ一ション後、 ヒストン脱ァセチル化酵素画分を混合し室温にて 2 時間反応させ、 1M塩酸及び酢酸ェチルを添加後、遠心分離により分離した酢酸ェチル 層中の放射活性を液体シンチレーシヨンカウンターで測定することにより行うことが できる。
代表的な HDAC阻害化合物の、 HDAC阻害活性を引用文献名と共に示す。 なお、 化 合物 Aについては上記方法にて測定した結果を示す。
• FK228： 1.1 nM (IC5。値； Exp.Cell Res. 241, 126-133,1998)
•化合物 A： 30 nMにおいて約 85%阻害
• MS-27-275： 2 M (IC50値； Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96， 4592-4597, 1999) '酪酸 （Na塩） ： 280 M (IC5Q値； Exp.Cell Res. 241, 126-133,1998)
• Butyrates (酪酸， Phenylbutyrate, etc.)： raMオーダー （Nat. Rev. Drug Discov. 2002 1, 287-299, 2002)
- Valproic acid： mMオーダ一 （Nat. Rev. Drug Discov. 2002 1, 287-299, 2002)
• Tric ostatin A： 2.1 nM (IC50値； Exp.Cell Res. 241, 126-133, 1998)
• NVP-LAQ824： 0.03 J L M . (IC5。値； Blood First Edition Paper, prepublished online June 19, 2003)
• SAHA： 10-20 nM (IC5。値； Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 3003-3007, 1998)
• Apicidin： 5 nM (IC5。値； Cancer Res. 60, 6068-6074, 2000 )
本発明の別の好ましい HDAC阻害化合物は、 上記 Yoshida等の方法により測定した HDAC阻害活性 （IC5o値） が 100 以下、 より好ましくは 10 M以下、 更に好ま しくは 1 / M以下の化合物である。
以下に本発明の関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害剤の製剤化法及び投与方法を詳 述する。 '
HDAC阻害化合物の 1種又は 2種以上を有効成分として含有する医薬組成物は、通常 用いられている製剤用の担体ゃ賦形剤、 その他の添加剤を用いて、 錠剤、 散剤、 細粒剤 、 顆粒剤、 カプセル剤、 丸剤、 液剤、 注射剤、 坐剤、 軟膏、 貼付剤等に調製され、 経口 的又は非経口的に投与される。
HDAC阻害化合物のヒトに対する臨床投与量は、 HDAC阻害化合物の種類に応じて適 宜設定することができる。 通常経口投与の場合、 1日当たり約 0.001から 500mg、好まし くは 0.01〜300mgが適当であり、 これを 1回であるいは 2乃至 4回に分けて投与する。関節 内、 筋肉内、 皮下若しくは静脈内等に非経口投与される場合は、 1回当たり約 0.0001から lOOmgが,好ましくは 0.001〜10mgが適当である。 投与頻度、 投与量は症状、 年令、 性別 等を考慮して個々の場合に応じて適宜決定される。
本発明による経口投与のための固体組成物としては、錠剤、散剤、顆粒剤等が用いら れる。 このような固体組成物においては、一つ又はそれ以上の活性化合物が、 少なくと も一つの不活性な希釈剤、 例えば乳糖、 マンニトール、 ブドウ糖、 ヒドロキシプロピル セルロース、 微結晶セルロース、 デンプン、 ポリビュルピロリドン、 メタケイ酸アルミ ン酸マグネシウムと混合される。組成物は、常法に従って、不活性な希釈剤以外の添加 剤、例えばステアリン酸マグネシゥムのような滑沢剤や繊維素グリコ一ル酸カルシゥム のような崩壊剤、更に安定化剤や溶解補助剤を含有していてもよい。錠剤又は丸剤は必 要によりショ糖、ゼラチン、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ヒドロキシプロピルメチ ルセルロースフタレートなどの糖衣または胃溶性あるいは腸溶性化合物のフィルムで 被膜してもよい。
経口投与のための液体組成物は、薬剤的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロッ プ剤、 エリキシル剤等を含み、 一般的に用いられる不活性な希釈剤、 例えば精製水、 ェ チルアルコールを含む。 この組成物は不活性な希釈剤以外に溶解補助剤、 湿潤剤、懸濁 剤のような補助剤、 甘味剤、 風味剤、 芳香剤、 防腐剤を含有していてもよい。
非経口投与のための注射剤としては、無菌の水性又は非水性の溶液剤、懸濁剤、乳濁 剤を包含する。水性の溶液剤、 懸濁剤の希釈剤としては、 例えば注射剤用蒸留水及び生 理食塩水が含まれる。非水溶性の溶液剤、懸濁剤の希釈剤としては、 例えばプロピレン グリコール、 ポリエチレングリコール、 ォリーブ油のような植物油、 エチルアルコール のようなアルコール類、ポリソルベート 8 0 (商品名）等がある。このような組成物は、 さらに等張化剤、 防腐剤、 湿潤剤、 乳化剤、 分散剤、 安定化剤 （例えば、 ラクトース）、 溶解補助剤のような添加剤を含んでもよい。これらは例えばバクテリア保留フィルター を通す濾過、殺菌剤の配合又【ま照射によって無菌化される。 これらは又無菌の固体組成 物を製造し、 使用前に無菌水又は無菌の注射用溶媒に溶解して使用することもできる。 本発明医薬に用いられる化合物の溶解性が低い場合には、可溶化処理を施してもよい。 可溶化処理としては、医薬製剤に適用できる公知の方法、例えば界面活性剤を添加する 方法、薬物と可溶化剤例えば高分子（水溶性高分子や腸溶性高分子） との固体分散体を 形成する方法が挙げられる。 発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例にて本発明の有効成分である HDAC阻害化合物の関節軟骨細胞外マト リクス分解阻害作用を詳細に説明するが、 本発明はこれらに限定されるものではない。 実施例 1 ：ゥサギ軟骨初代培養細胞におけるプロテオダリカン（PG)破壊阻害活性（レ チノイン酸刺激）
(試験方法） .
ゥサギ （日本白色種、 ォス、 1.0〜： 1.5kg) を過剰麻酔下で致死させた後、 膝関節を摘出 し、 関節表面の軟骨層をメスにて剥離、 細断した。 さらに、 トリプシン- EDTA
(0.25%-lmM； GIBCO-BRL社製） にて 37°C、 1時間処理の後、 1500rpm、 5分で遠心 分離し沈殿した細胞をダルベッコ改¾イーグル培地 （DMEM、 GIBCO-BRL社製） で洗 浄した。 続いてコラゲナ一ゼ A (0.15%；ベーリンガ一 ·マンハイム社製） /DMEMに て 37°C、 3〜： 12時間処理した後、 ナイロンメッシュフィルター （100 m、 Falcon社製） 通過画分を 1500rpm、 5分の遠心分離にかけ、 軟骨細胞を沈殿させた。 DMEM/10%FBS 培地で十分に洗浄した後、 DMEM/10%FBS培地に 2 X 105cells/mlになるように懸濁し、
I型コラーゲンをコートした 96穴プレート （旭テクノグラス社製） に 200 < ^/穴で蒔い た。 3日後に培地を 50 / g mlァスコルビン酸含有 DMEM/10%FBS培地 （以下、 ァスコ ルビン酸培地） 200 1に交換し、 さらに 2日間培養を 2回繰り返した。 その後、 ゥサ ギ膝関節軟骨初代培養細胞を終濃度 10 H Ci/mlの Na2 35S04含有ァスコルピン酸培地 200
/ Iにて 3日間培養、 標識した後、 200 1のァスコルビン酸培地で 3回洗浄し、 200 11 のァスコルビン酸培地で 1日間培養した。 終濃度 1 Mの all-transレチノイン酸 （シグ マ社製）で刺激し、 48時間後の培養上清を 20 Iずつ回収し、 トップカウント （Packard 社掣） を用い、 放射活性を計測した。被験化合物は刺激開始と同時添加し、 レチノイン 酸非添加群を 100%、レチノイン酸添加群を 0%とした百分率でその PG分解阻害活性を 算出した。
(被験化合物）
Figure imgf000012_0001
化合物 A 酪酸
Figure imgf000012_0002
(結果） 結果を下表 1に示す。各 HDAC阻害化合物は、構造に関係なく、その HDAC 阻害を示す濃度域において、 濃度依存的に PG分解を阻害することが判明した。 表 1
Figure imgf000013_0001
実施例 2 ：ゥサギ軟骨初代培養細胞における PG破壊阻害活性 （IL-1刺激）
(試験方法）
実施例 1と同様にしてゥサギ軟骨初代培養細胞を調製した。 終濃度 lOng/ml のヒト IL-l i3 (R&D System社製） で刺激し、 48時間後の培養上清を 20 ^ 1ずつ回収し、 トツ プカウント （Packard社製） を用い、 放射活性を計測した。 被験化合物は刺激開始と同 時添加し、 IL-1非添加群を 100%、 IL-1添加群を 0%とした百分率でその PG分解阻害活 性を算出した。
(結果） 結果を下表 2に示す。 被験化合物である各種 HDAC 阻害化合物は、 その HDAC阻害を示す濃度域において、 PG分解を阻害することが判明した。
表 2
Figure imgf000014_0001
上記実施例 1並びに 2の試験方法は、関節軟骨に対する被験化合物の作用、特に細胞 外マトリクスの分解 '変性に対する作用を評価する簡便な評価法として、従来より関節 疾患治療剤のスクリ一エングに広く用いられている方法である （Spirito S.et al, Agents Actions;39, C160-2, 1993)。 実際、 in vitroにおいて、 レチノィン酸または IL-1等による PG分解を抑制する作用があるマトリクスメタ口プロテァーゼ阻害剤 （Lawrence J. et al, Arch Biochem Biophys. 344(2), 404-12, 1997)は、骨関節炎モデルマウスにおいても細胞外 マトリクスの分解 ·変性を良好に抑制することが確認されている（Aim Rheum Dis. 54(8), 662-9, 1995、 J Exp Med. 182(2), 449-57， 1995、 Adv Dent Res. 12(2), 82-5, 1998及び Inflamm Res. 49(4), 144-6, 2000)。よって、本評価系で優れた効果が確認された本発明の有効成分 である HDAC阻害化合物は、 関節軟骨細胞外マトリクスの分解 ·変性を抑制する薬剤 として有用である。 特に、 本発明の有効成分である HDAC阻害化合物は、 軟骨細胞外 マトリクスの分解 ·変性を惹起する代表的な刺激物質である IL-1或いはレチノイン酸 のいずれに対しても良好に関節軟骨細胞細胞外マトリクスの分解 ·変性を抑制する作用 を有し、刺激物質の種類にかかわらず軟骨細胞細胞外マトリクスの分解 ·変性を抑制す る薬剤として有用である。 産業上の利用可能性
本発明医薬の有効成分である HDAC阻害化合物は、 前記実施例に示したように、 関 節軟骨細胞外マトリクスの分解を良好に阻害することから、本発明医薬は、特に関節軟 骨細胞外マトリクスの分解.変性の関与する骨関節炎、 関節リウマチ、 変形性関節症等 の予防又は治療剤として有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . ヒストン脱ァセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する関節軟骨細胞外 マトリクス分解阻害剤。
2 . 前記ヒストン脱ァセチル化酵素阻害化合物が、 FK228、 下式 （I) で示されるデブ シペプチド化合物、下記一般式（I I)で示されるデプシペプチド化合物、下記一般式（I la) で示されるデプシペプチド化合物、 MS-27-275、 Trichostatin A NVP-LAQ824, SAHA、 Apicidin、 Phenylbutyrate、 Valproic acid、 Pivaloyloxymethyl butvrate、 CI-994、 Depudecin> Trapoxin CHAP及び酪酸から選択される請求の範囲 1記載の剤。
Figure imgf000016_0001
(0 (H) (Ila)
(式中 Rは、 イソプロピル基、 sec-ブチル基又はイソブチル基を意味する。）
3 . 前記ヒストン脱ァセチル化酵素阻害化合物が、 FK228,請求の範囲 2記載の式（I) で示されるデプシペプチド化合物、請求の範囲 2記載の一般式（I I)で示されるデプシ ぺプチド化合物、請求の範囲 2記載の一般式（I l a)で示されるデブシぺプチド化合物、 MS-27-275、 Trichostatin A、 NVP-LAQ824、 SAHA、 Apicidin、 Phenylbutyrate及び Valproic acidから選択される請求の範囲 1記載の剤。
4 . 前記ヒストン脱ァセチル化酵素阻害化合物が、 「吉田ら、 Journal of Biological Chemistry^ 1990年、 第 265卷、 ρ17174-17Γ79」 記載の方法により測定したヒストン脱 ァセチル化酵素阻害活性 （IC50値） が 100 以下の濃度の化合物である請求の範囲 1記載の剤。
5 . 骨関節炎の予防又は治療剤である請求の範囲 1記載の剤。
6 . 関節リゥマチの予防又は治療剤である請求の範囲 1記載の剤。
7 . 変形性関節症の予防又は治療剤である請求の範囲 1記載の剤。
8 . ヒストン脱ァセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する骨関節炎におけ る関節軟骨細胞外マトリクス分解の予防又は治療剤。
9 . ヒストン脱ァセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する関節リウマチに おける関節軟骨細胞外マトリクス分解の予防又は治療剤。
1 0 . ヒストン脱ァセチル化酵素阻害化合物を有効成分として含有する変形性関節炎 における関節軟骨細胞外マトリクス分解の予防又は治療剤。
1 1 . 関節軟骨細胞外マトリクス分解阻害用医薬の製造の為のヒストン脱ァセチル化 酵素阻害化合物の使用。
1 2 . 関節軟骨細胞外マトリクス分解に起因する疾患の予防及び治療方法であって、 治療有効量のヒストン脱ァセチル化酵素阻害化合物を患者に投与することからなる予 防及び治療方法。
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