KR100844061B1 - 히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제 및 이를 이용한 골다공증의 치료 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 골모 세포의 성장을 유도하는 히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제 및 이를 이용한 골모 세포의 성장 유도방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게 히스톤 탈아세틸라제 (histone deacetylase; HDAC)의 유전자 발현 및 효소 활성을 조절하는 저해제 및 이를 이용하여 골 생성 (osteogenesis) 과정을 증진시키는 골모 세포의 성장 유도방법은 골모 세포와 관련된 골다공증 등을 효과적으로 치료하고 예방하는 데 널리 이용될 수 있다.

히스톤 탈아세틸라제, 골모 세포, HDAC 에 대한 저해제, 골다공증 치료제

Description

히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제 및 이를 이용한 골다공증의 치료 방법{Histone deacetylase inhibitor and method for treating osteoporosis using the same}

도 1 은 골모 세포의 분화 과정에서 히스톤 탈아세틸라제 (HDACs) 유전자의 발현 양상 및 전체 HDAC 효소 활성을 분석하여 나타낸 것이다. 이 때 GM 은 배양 배지이고 DM 은 분화 배지이다.

A. 전체 RNA 를 각 HDAC 이소형의 cDNA 프로브를 사용하여 노던 블럿한 결과; B. 전체 단백질을 각 HDAC 이소형에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블럿한 결과; C. 상대적인 HDAC 효소 활성

도 2 는 본 발명의 HDAC 에 대한 저해제를 처리하여 골모 세포의 분화에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

A: 각 세포를 ALP 염색하여 무기질화를 관찰한 사진; B: 상대적인 ALP 효소 활성을 비교한 결과

도 3 은 본 발명의 HDAC 에 대한 저해제를 처리하여 유도된 골 생성 유전자 들의 발현을 비교한 것이다.

도 4 는 골 생성 유전자 Cbfa 1 및 오스티오칼신의 프로모터 부위에서 과아세틸화 된 히스톤 H3 및 H4 를 면역 침전과 중합효소 연쇄반응으로 나타낸 것이다.

A. 히스톤 H3 에 대한 항체를 사용한 결과; B. 히스톤 H4 에 대한 항체를 사용한 결과

도 5 는 본 발명의 간섭 리보 뉴클레오타이드 산을 이용하여 골 생성 과정 중 HDAC 유전자의 발현 억제에 미치는 효과를 나타낸 것이다.

A. 감염된 세포를 웨스턴 블럿으로 분석한 결과; B: 분화된 세포의 상대적인 HDAC 효소 활성; C: 세포를 ALP 염색하여 무기질화를 관찰한 사진; D: 감염된 세포를 노던 블럿으로 분석한 결과

도 6 은 본 발명의 HDAC 에 대한 저해제 (NaBT)가 골 생성 과정 중 세포 주기 정지에 미치는 효과를 웨스턴 블럿으로 나타낸 것이다.

A: 세포 분화에 따른 유전자 발현 양상; B: 상기 저해제를 처리하여 세포 주기 조절 단백질에 대한 항체로 관찰한 유전자 발현 양상

도 7 은 본 발명의 HDAC 에 대한 저해제가 골모 세포의 분화에 미치는 과정을 모식화하여 나타낸 것이다.

본 발명은 골모 세포의 성장을 유도하는 히스톤 탈아세틸라제 (histone deacetylase; 이하 "HDAC"라고 약칭함)에 대한 저해제 및 이를 이용하여 골 생성 과정을 증진시키는 골모 세포의 성장 유도방법에 관한 것이다.

골다공증은 노화 과정과 동반하여 점차 뼈가 손실되어 나가는 가장 보편적인 골 대사성 질환으로 상당히 위험하다. 실제로 골 감소증 (osteopenias)이라고 알려진 뼈 이상 질환으로 매년 40,000 ~ 50,000 명이 사망하고 있으며 이 수치는 유방암 및 자궁암을 합한 사망률과 같다. 더우기 이러한 골 질환은 뼈가 부러지기 전까지는 증상이 없다는 점에서 더욱 문제가 된다.

골다공증은 남성보다 여성에게 더 커다란 영향을 미치고 발병율이 갱년기 이후에 급격히 증가하는 경향이 있다. 여성에게 있어서 골다공증은 천천히 진행되기는 하지만 기존의 에스트로겐 대체 요법으로도 잘 개선되지는 않고 이에 대한 적절한 대안의 치료법도 아직까지 부족한 상황이다.

본 발명자들은 염색질의 재구성이 세포의 유전자 발현에 있어서 중요한 역할을 하고, 골모 세포의 분화와도 관련이 있는 것을 확인하였다 (이 등, 2004). 이 과정에서 골 생성 유전자의 프로모터 부위에 생기는 히스톤 탈아세틸라제 (HDACs)에 의한 히스톤 탈아세틸화 및 히스톤 아세틸트랜스퍼라제에 의한 히스톤 아세틸화가 중요한 역할을 맡는 것을 밝혔다.

이에 본 발명자들은 골모 세포의 성장을 유도하는 의약품을 개발하기 위하여 계속 노력한 결과, 히스톤 탈아세틸라제의 작용을 억제하면 골모 세포의 유전자 발현 및 분화가 촉진되는 것을 발견하고 간섭 리보 뉴클레오타이드 산을 사용하여 HDAC 유전자의 발현을 억제하고, 더 나아가 소듐 부틸레이트, 트리코스타틴 A 등을 사용하여 HDAC 효소의 작용을 억제한 결과, 골 생성 유전자의 발현이 증가하고 세포 주기의 정지가 조절되어 골 생성 과정이 가속화되며, 상기 HDAC 에 대한 저해제가 골수 간엽 줄기세포에서도 골 생성을 유도하여 골다공증의 치료에 효과적으로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 성공적으로 완성하였다.

본 발명은 골다공증 등을 치료하는 데 사용될 수 있는 골모 세포 성장 유도제 및 골모 세포 성장 유도방법을 제공하는 데 그 목적이 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 골모 세포의 성장을 유도하는 히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제로서 히스톤 탈아세틸라제의 유전자 발현을 조절하는 간섭 리보 뉴클레오타이드 산 (small interfering RNAs; 이하 "siRNAs"라고 약칭함)를 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 서열번호 1 및 서열번호 2 의 염기 서열을 포함하는 간섭 리보 뉴클레오타이드 산을 제공한다.

또한, 본 발명은 히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제로서 효소 작용을 조절하는 소듐 부틸레이트 (sodium butylate; 이하 "NaBT"라고 약칭함), 페닐부티레이트(phenyl butyrate), 수베로일아닐라이드(suberoylanilide hydroxamic acid), 뎁시펩타이드(depsipeptide), 벤자미드(benzamides) 및 트리코스타틴 A (trichostatin A; 이하 "TSA"라고 약칭함), 트라폭신 B(TPX), 클라미도신(chlamydocin)을 제공한다.

또한, 본 발명은 히스톤 탈아세틸라제 (HDAC)에 대한 저해제를 탐색하는 것을 특징으로 하는 골모 세포의 성장을 유도제 탐색방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제를 사용하여 골모 세포와 관련된 골다공증 등을 치료하는 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 골모 세포의 성장을 유도하여 골다공증 치료제 등에 사용될 수 있는 히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제를 제공한다.

먼저 히스톤 변형 (histone modification)은 많은 진핵 세포의 전사 조절에 관여하는 과정으로, 주로 히스톤의 코아 단백질이 아미노 말단에서 아세틸화 및 탈아세틸화 되는 것이 알려져 있다. 이 과정에는 2가지 효소, 즉 히스톤 아세틸트랜 스퍼라제 (HATs) 및 히스톤 탈아세틸라제 (HDACs)가 작용하는 데, 이 중 히스톤 탈아세틸라제는 주요한 2가지, 제 I 군 및 제 II 군으로 나누어지고, 전자에는 HDAC 1, HDAC 2, HDAC 3 및 HDAC 8 이 속하며 보편적으로 발현되고, 후자에는 HDAC 4, HDAC 5, HDAC 6 및 HDAC 7 이 속하고 심장, 뇌 및 골격 근육에서 주로 발현된다 (드 루이터 등, 2003).

특히 히스톤 탈아세틸라제 HDAC 1 및 HDAC 2 는 염기 서열 상에서 높은 상동성 (약 82%)을 나타내고 상호 단백질 복합체를 형성하여 히스톤을 탈아세틸화 하고 이로써 전사 기작에 관여한다. 또한 HDAC 1 은 몇 가지 전사 인자의 전사 활성에 직접적으로 영향을 미치고 세포 분화 과정과도 밀접하게 관련되어 있다.

이외에도 히스톤 탈아세틸라제 HDAC 3 는 오스티오칼신 (osteocalcin) 프로모터에 작용하는 Cbfa 1 인자의 작용을 억제한다고 최근 보고되었다 (슈뢰더 등, 2004). 또한 RNA 간섭에 의한 HDAC 3 의 억제가 오스티오칼신, 오스티오폰틴 (osteopontin)및 골 시알로프로테인 (bone sialoprotein)를 포함하는 Cbfa 1 전사인자가 겨낭하는 유전자의 발현을 가속화한다고 알려졌다 (슈뢰더 등, 2004). 이와 같이 히스톤 탈아세틸라제는 골 생성에 관여하는 다양한 과정을 조절하는 중요한 작용을 한다.

본 발명에서는 히스톤 탈아세틸라제가 골 생성 과정에서 발현이 억제되는 것을 확인한다. 도 1 에서 보는 바와 같이, HDAC 1 및 HDAC 2 에 대한 mRNA 및 단백질은 몇 가지 분화된 골모 세포에서 급격히 감소되고, 전체 HDAC 효소 활성도 분화 된 세포에서 급격히 감소된다.

본 발명은 히스톤 탈아세틸라제에 대한 제해제로 사용될 수 있는 간섭 리보 뉴클레오타이드 산 (siRNAs)을 제공하고, 바람직하게는 서열번호 1 및 서열번호 2 의 염기서열을 포함하는 간섭 리보 뉴클레오타이드 산을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서 상기 siRNA 가 인지하는 특이 유전자는 HDAC 1 유전자의 전사 개시 부위로부터 하류 1102 ~ 1121 번 염기 서열에 해당하는 서열번호 1 의 19개 뉴클레오타이드로 정한 다음, 상기와 동일한 19개 뉴클레오타이드 서열에 더하여 이와 반대 방향으로 상보적인 서열에 서열번호 2 의 9개 뉴클레오타이드로 이루어진 비상보 공간이 포함하도록 본 발명의 siRNA 를 제작한다 (서열목록 참조).

도 5 에서 보는 바와 같이, 히스톤 탈아세틸라제는 siRNAs 를 사용하여 발현을 억제하면 전체 효소 활성이 50% 이상 감소되고 결과적으로 골 생성 과정을 유도하게 된다. 따라서 골모 세포의 유전자 발현은 HDAC 가 억제되면 증가되고, HDAC 은 골모 생성 유전자의 프로모터 부위에 탈아세틸화를 조절하여 골모 세포의 분화를 조절하는 데 중요한 역할을 하게 된다.

본 발명은 상기 siRNA 서열을 포함하는 재조합 레트로바이러스 벡터를 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 상기 HDAC 에 대한 저해제로 사용되는 siRNA 서열을 제한효소 Bgl II 및 Hind III 로 잘라 기존의 발현 벡터 pSUPER-retro 의 동일한 제한효소 부위에 삽입한 다음 재조합 레트로바이러스 벡터는 칼슘 포스페이트 방법 등을 따라 세포 내로 형질전환 시킨다 (서 등, 2004). 다시 상기 레트로바이러스 입자를 포함하는 세포 상층액을 수집하고 이를 사용하여 다시 실험용 세포를 형질전환 시킨다. 상기 과정에서 레트로바이러스가 감염된 세포는 퓨로마이신 등을 사용하여 선별한다.

또한, 본 발명은 히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제로 사용될 수 있는 화합물을 제공하고, 바람직하게는 소듐 부틸레이트 (sodium butylate; 이하 "NaBT"라고 약칭함), 페닐부티레이트(phenyl butyrate), 수베로일아닐라이드(suberoylanilide hydroxamic acid), 뎁시펩타이드(depsipeptide), 벤자미드(benzamides) 및 트리코스타틴 A (trichostatin A; 이하 "TSA"라고 약칭함), 트라폭신 B(TPX), 클라미도신(chlamydocin) 등에서 선택될 수 있다. 이외에도 본 발명에는 히스톤 탈아세틸라제의 효소 활성을 조절하는 저해 물질은 모두 포함될 수 있다.

본 발명은 골 생성 과정 동안 히스톤 탈아세틸라제의 효소 활성을 억제하는 소듐 부틸레이트 및/또는 트리코스타틴 A 를 처리한 결과, 효소 활성 억제에 의해 골모 세포의 성장 및 분화 과정이 촉진되는 것을 확인한다.

참고로, 부틸레이트는 HDAC 에 작용하는 짧은 사슬을 가진 지방산이고, 이미 많은 종양 세포주에서 세포 주기 G1기 정지 및 분화 등에 강력한 효과를 미치는 것으로 보고되어 있다 (바나드 및 워윅, 1993; 그래함 및 부익, 1988; 레더 및 레더, 1975; 사이토 등, 1991).

도 2 및 도 3 에서 보는 바와 같이, HDAC 에 대한 저해제인 소듐 부틸레이트 등은 골모 세포의 분화를 증가시키고, 실험 결과 상 히스톤 탈아세틸라제에 제한적으로 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 따라서 본 발명의 HDAC 에 대한 저해제는 골 생성 과정을 증진시킬 뿐만 아니라 골 생성 유전자의 발현을 증가시킨다.

또한, 본 발명에서는 상기 소듐 부틸레이트가 골모 세포의 분화를 유도하는 과정이 세포 주기와도 관련이 있는 것을 확인한다.

참고로, 부틸레이트는 p21 단백질을 증가시키고 트리코스타틴 A 도 마찬가지로 p21 및 p27 을 증가시킨다고 보고된 바 있다. 또한 소듐 부틸에이트는 골 생성 과정의 아주 초기 단계에서 p27 단백질의 발현을 증가시키고 이로 인해 세포 주기에 변화를 가져온다고 보고되어 있다. 소듐 부틸에이트는 Rb 단백질의 발현도 점차 증가시킬 수 있고, 이는 아마도 세포 주기를 멈추게 하여 Cbfa 1 전사인자의 작용을 촉진하는 것으로 보인다.

본 발명의 히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제는 효소 활성을 억제하여 염색질 구조 상에 변화를 유발하고 골모 세포의 유전자 발현을 증가시킬 뿐만 아니라 세포 주기 정지를 조절하여 골 생성을 유도하고, 이 모든 과정은 골모 세포의 분화에 중요한 역할을 한다. 도 7 에서 보는 바와 같이, 히스톤 탈아세틸라제 에 대한 저해제는 골 생성 유전자의 프로모터 부위를 아세틸화 하여 염색질이 재구성되게 한다.

또한, 본 발명은 히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제를 사용하여 골다공증을 포함하여 골모 세포와 관련이 있는 골 질환 등을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제는 골수 간엽 줄기세포 등에서 골 생성을 유도하여 골다공증 등을 효과적으로 치료할 수 있다.

본 발명의 저해제는 해당 용도에 따라 허용 가능한 담체와 함께 독립적으로 또는 약품 첨가제로 사용되거나, 사람에게 투여하기 적합한 기타 모든 형태로 사용될 수 있다. 본 발명의 저해제에 함유될 수 있는 담체로는 증량제, 고섬유 첨가제, 캡슐화제, 지질 등이 포함될 수 있으며, 이러한 담체들의 예는 당업계에 충분히 공지되어 있다.

본 발명의 저해제는 골다공증의 진행 정도, 나이, 성별, 신체 상태, 투여 기간, 투여 방법, 환자의 체중, 식사, 배출 속도 등에 따라 용량을 달리하여 투여될 수 있다.

이하, 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다

<실시예 1> siRNAs 의 제작

본 발명은 HDAC 에 대한 저해제로 사용되는 siRNA 를 제작하기 위하여, 포유 동물 레트로바이러스 발현 벡터 pSUPER-retro (올리고엔진사 제품)을 사용하였다. 상기 siRNA 가 인지하는 특이 유전자는 HDAC 1 유전자의 전사 개시 부위로부터 하류 1102 ~ 1121 번 염기 서열에 해당하는 서열번호 1 의 19개 뉴클레오타이드로 정한 다음, 상기와 동일한 19개 뉴클레오타이드 서열에 더하여 이와 반대 방향으로 상보적인 서열에 서열번호 2 의 9개 뉴클레오타이드로 이루어진 비상보 공간이 포함하도록 본 발명의 siRNA 를 제작하였다 (서열목록 참조).

상기 유전자 서열은 제한효소 Bgl II 및 Hind III 로 자르고 기존의 발현 벡터 pSUPER-retro 의 동일한 제한효소 부위에 삽입하여 본 발명의 재조합 레트로바이러스 벡터를 제작하였다.

다시 상기 재조합 레트로바이러스 벡터는 칼슘 포스페이트 방법을 따라 Ampho 세포 내로 형질전환 시키고 (서 등, 2004) 48 시간 동안 배양하였다. 그 다음 레트로바이러스 입자를 포함하는 세포 상층액을 수집하고 이를 사용하여 ROS17/2.8 세포를 형질전환 하였다. 상기 과정에서 레트로바이러스가 감염된 세포는 2 μg/mL 퓨로마이신을 사용하여 선별해 내었다 (시그마 알드리치사 제품).

<실시예 2> 분화된 골모 세포에서 HDAC 1 및 HDAC 2 유전자의 발현 감소

(1) 골모 세포의 배양 및 분화

일차 골수 세포는 4 ~ 6 주 된 C57BL/6J 생쥐의 두정부로부터 분리하고 20% 말 혈청 및 100 nM 하이드로코티존을 포함하는 α-MEM 배지에 배양하였다. 상기 일차 골수 세포를 분화시키기 위하여 다시 10% 우태아 혈청 (FBS), 50 μg/mL 아스코빅산, 10 mM β-글리세로포스페이트 및 100 nM 데사메타존을 포함하는 α-MEM 배지에 번갈아 배양하였다.

또한 생쥐 C3H10T1/2 간엽 줄기세포, MC3T3-E1 두정부 세포 및 토끼 ROS17/2.8 골종양 세포는 항생제와 10% 우태아 혈청을 첨가한 DMEM 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium)에 배양하였다 (Ducy 등, 1997). 상기 세포를 분화시키기 위하여 다시 10% 우태아 혈청, 50 μg/ml 아스코빅산, 10 mM β-글리세로포스페이트 및 10 nM 데사메타존을 포함하는 DMEM 배지를 사용하여 배양하였다.

(2) 웨스턴 블럿

웨스턴 블럿에 사용되는 항체, 즉 HDAC 1 (H-51), HDAC 2 (H-54), HDAC 3 (n-19), HDAC 4 (H-92), HDAC 5 (H-74), HDAC 7 (H-273), p300 (n-15), p21, p27 및 Rb 단백질에 대한 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지사로부터 구입하여 사용하였다. 전체 단백질 추출물은 NETN 완충용액 [20 mM 트리스-HCl (pH 7.9), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40]을 사용하여 배양된 세포로부터 분리하였다. 상기 단백질은 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동을 수행하여 분리하고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PVDF) 멤브레인으로 이동시킨 다음 스킴 밀크로 블록킹하고 다시 일 차 항체를 사용하여 분석하였다. 다음 호스래디쉬 퍼옥시다제와 결합시킨 이차 항체 (시그마 알드리치사 제품) 및 화학 발광을 사용하여 웨스턴 블럿의 결과를 시각적으로 확인하였다.

(3) 노던 블럿

전체 RNA 는 제조사의 프로토콜에 따라 트리졸 (라이프 테크놀로지사 제품)을 사용하여 분리하였다. 노던 블럿은 기존의 방법과 동일하게 수행하였다 (서 등, 2004). cDNA 프로브는 DNA 폴리머라제 I 의 크레노 효소 (프로메가사 제품) 및 [α-³²p]dCTP (에머샴-파마시아사 제품)을 사용한 랜덤 프라이밍 키트로 라벨 표지하였다. 이 때 프로브로는 Cbfa 1, 오스테릭스, 오스티오칼신, 오스티오폰틴 및 ALP 유전자에 대한 cDNA 가 사용되었다. RNA 양을 균질하게 맞추기 위하여 모든 실험에서 먼저 36B4 에 대한 cDNA 프로브로 하이브리디제이션을 수행하였다.

(4) 본 발명은 분화된 골모 세포에서 HDAC 1 및 HDAC 2 유전자의 발현이 감소되는 것을 다음과 같이 확인하였다.

먼저 골 생성 과정에서 HDACs 유전자의 발현 변화는 분화되지 않은 또는 분화된 골모 세포를 사용하여 HDACs 유전자의 mRNA 및 단백질 발현 양상으로 확인하였다. 이 때 골모 세포로는 생쥐 간엽 줄기세포 C3H10T1/2, MC3T3-E1 세포 및 ROS17/2.8 세포를 사용하였다. 상기 골모 세포에서 분화가 진행되면서, HDAC 1 및 HDAC 2 의 mRNA 수준이 현저히 감소하였고 동시에 단백질 수준도 낮아졌다 (도 1 참조).

그러나 다른 HDACs 유전자, 예로 HDAC 3 및 제 II 군 HDACs 유전자 (HDAC5, HDAC6) 등의 mRNA 수준은 골모 세포의 분화가 진행되면서 약간 증가하였다 (도 1A 참조). 또한 mRNA 수준과는 상관없이, HDAC3, HDAC4, HDAC5 및 HDAC 7 단백질은 분화된 골모 세포에서 약간 감소하거나 변화하지 않았다 (도 1B 참조). 그 결과, HDAC 1 및 HDAC 2 를 포함한 많은 HDAC 단백질이 골모 세포 분화 과정에서 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 3> 골 생성 과정에서 전체 HDAC 효소 활성의 감소

(1) 탈아세틸라제 분석

히스톤 탈아세틸라제는 전체 단백질 추출물은 NETN 완충용액 [20 mM 트리스-HCl (pH 7.9), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 0.5% NP-40]을 사용하여 배양된 세포로부터 분리한 다음, HDAC 분석 키트 (업스테이트 바이오테크놀로지사 제품)를 사용하여 활성을 측정되었다.

구체적으로, 상기 전체 세포 추출액 (30 ~ 40 μg)은 30℃ 에서 30 ~ 40분 동안 HDAC 분석용 형광 기질과 함께 반응시키고 상기 형광 기질이 탈아세틸화 되게 유도하였다. 다음 활성인자가 포함된 용액을 첨가하여 탈아세틸화 된 기질로부터 형광 발광인자 (fluorophore)가 떨어져 나오게 하고 다시 반응 플레이트를 상온에 10 ~ 15 분 동안 방치하였다. 상기 반응 플레이트의 결과는 형광 측정기 (여기 = 350 ~ 380 nm; 발광 = 440 ~ 460 nm)를 사용하여 60분 이내에 읽어 내었다.

(2) 본 발명은 골 생성 과정에서의 HDAC 효소 활성을 조사하기 위하여, 분화되지 않은 또는 분화된 골모 세포로부터 얻은 전 세포 추출물을 사용하여 전체 HDAC 효소 활성을 확인하였다. 도 1C 에서 보는 바와 같이, C3H10T1/2 세포 및 ROS17/2.8 세포와 같은 분화된 골모 세포에서 HDAC 효소 활성은 상당히 (약 40 ~ 50%) 감소하였다. 그 결과, 전체 HDAC 효소 활성은 골모 세포의 분화 과정 동안 HDACs 유전자의 발현 억제로 인해 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 4> HDAC 에 대한 저해제의 골 생성 유도 효과

(1) 알칼라인 포스파타제 (ALP) 염색 및 분석

골모 세포의 분화 정도를 조사하기 위하여, 배양된 세포를 BCIP / NBT 발색 기질을 사용하여 염색하고 무기질화를 측정하였다 (프로메가사 제품).

알칼라인 포스파타제는 p-니트로페닐 포스페이트 (시그마 104 기질)를 기질로 사용하여 활성을 측정하였다. 배양된 세포는 TBS 완충용액 (20 mM 트리즈마 염기, 150 mM NaCl, pH 7.5)을 사용하여 세척하고 3.7% 포름알데히드가 포함된 90% 에탄올을 사용하여 상온에서 30분 동안 고정시켰다. 고정된 세포에는 알칼라인 포스파타제의 기질 1 ml (1 mg/mL)을 1 mM MgCl₂ 을 포함하는 50 mM 소듐 바이카보네이트 완충용액 (pH 9.6)을 사용하여 37℃ 에서 반응시켰다. 20분이 경과한 다음 3 N NaOH 0.5 ml 을 사용하여 반응을 정지시키고, 반응물의 양을 405 nm 에서 측정하였다. 효소 활성은 405 nm/분 X 10⁶개 세포에서 흡광도로 표시되었다 (마르티네즈 등, 1996; 로드리게스 등, 2002).

(2) 본 발명은 HDAC 활성 억제 및 골모 세포 분화의 관련성을 조사하기 위하여, HDAC 에 대한 저해제가 골 생성에 미치는 효과를 확인하였다. 이 때 HDAC 에 대한 저해제로는 소듐 부틸레이트 (NaBT) 및 트리코스타틴 A (TSA) 등을 사용하였고, 형태학적 변화 및 알칼라인 포스파타제 (ALP) 염색 결과를 관찰하여 골모 세포의 분화 정도를 측정하였다.

상기에서 NaBT 를 처리하면, 일차 골수 세포 C3H10T1/2 세포 및 MC3T3-E1 세포에서 골모 세포의 분화가 분명히 증진되었다 (도 2A 참조). 그러나 NaBT 용량을 높이면 부작용이 생기어 세포 생존, 특히 일차 골수 세포에 영향을 주었다.

또 다른 HDAC 에 대한 저해제인 TSA 는 NaBT 보다 더 특이적이고 활성화된 물질로 마찬가지로 C3H10T1/2 세포에서 골모 세포의 분화를 촉진하였다 (도 3D 참조). 그러나 TSA 는 오래 처리하면 세포 독성을 나타낼 수 있으므로, 본 발명에서는 주로 NaBT 를 처리하여 실험 결과를 조사하였다. 또한, NaBT 를 처리하지 않은 상태에서도 ALP 활성을 측정하였다.

그 결과 도 2B 에서 보는 바와 같이, NaBT 를 처리하면 ALP 효소 활성도 역시 증가되었다. 따라서 HDAC 에 대한 저해제는 HDAC 효소 활성을 감소시키어 골모 세포의 분화를 증진하는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 5> HDAC 에 대한 저해제의 골 생성 유전자의 발현 증진 효과

본 발명은 HDAC 에 대한 저해제가 골 생성 유전자의 발현에 미치는 효과를 조사하기 위하여, 먼저 다양한 골 생성 단계에서 NaBT 를 처리하거나 처리하지 않은 상태의 골모 세포로부터 전체 RNA 를 분리한 다음 다양한 골 생성 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 분석하였다. 그 결과 NaBT 를 처리하면 Cbfa1, 오스테릭스, 오스티오칼신, 오스티오폰틴 및 ALP 유전자에 대한 mRNA 가 매우 증가하는 것을 관찰할 수 있었다 (도 5 참조). 흥미롭게도, 골 생성에 관여하는 주요 전사인자인 Cbfa1 및 오스테릭스의 mRNA 발현이 NaBT 에 의해 현저히 증가되었다. 따라서 NaBT 에 의해 히스톤의 탈아세틸화가 억제되면 골 생성 유전자의 발현이 증가되어 골모 세포의 분화가 촉진되는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 6> 골 생성 유전자의 프로모터 부위에서의 히스톤 H3 및 H4 과아세틸화

(1) 염색질 면역침전 (Chromatin immunoprecipitation; ChIP) 분석

염색질 면역침전 분석은 기존의 방법과 동일하게 수행하였다 (서 등, 2003). 구체적으로, 분화되지 않은 골모 세포와 분화된 골모 세포는 각각 1% 포름알데히드를 사용하여 37℃에서 10분 동안 교차 연결반응 (cross-link)시키고 NP-40 를 포함하는 완충용액 200 μg (5 mM PIPES, pH 8.0, 85 mM KCl, 0.5% NP-40)을 사용하여 재현탁 하였다. 핵 (crude nuclei)은 그대로 침전시키고 용출 완충용액 200 μl (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM 트리스-HCl, pH 8.1)으로 막을 녹인 다음 산물을 파쇄하여 면역 침전 완충용액 (16.7 mM 트리스-HCl, pH 8.1, 167 mM NaCl, 1.2 mM EDTA, 0.01% SDS, 1.1% 트리톤 X-100)으로 10배 희석하였다. 여기에 다시 프로테인 A-세파로스 CL-4B (에머샴-바이오사이언스사 제품) 및 항-ADD1 항체를 4℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이를 연속하여 세척한 다음, DNA 를 포함하는 면역 복합체를 용출시키고 침전된 DNA 는 중합효소 연쇄반응 (PCR)으로 증폭시켰다.

중합효소 연쇄반응을 수행한 실험 조건은 다음과 같다:

각 프라이머 0.25 μM, 각 dNTP 0.1 mM, 1X PCR 완충용액, 1 유닛 Ex Taq 폴리머라제 (타가라사 제품), 0.06 mCi/ml [α-³²P]dCTP 를 전체 반응액 부피 20 μl 에 맞추어 첨가하였다. 상기 반응 산물은 6% 폴리아크릴아미드, 1X 트리스-보레이트, EDTA 젤 상에 전개하였으며, 이 때 탐침으로 서열번호 3, 서열번호 4, 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8 의 프라이머를 사용하였다 (서열목록 참조).

(2) 본 발명은 전체 HDAC 효소 활성이 분화된 골모 세포에서 감소되기 때문에, 골모 세포의 마커 유전자 프로모터 부위에서 히스톤의 과아세틸화 정도를 염색질 면역침전 분석법으로 조사하였다.

본 발명은 히스톤 H3 및 H4 가 골모 세포의 분화 과정 중 골 생성 유전자의 프로모터 부위에서 아세틸화가 증가되고, 히스톤 H3 K9 의 아세틸화는 Cbfa1 유전자 및 오스티오칼신 유전자의 프로모터 부위에서 증가되는 것을 관찰하였다 (도 4A 참조). 마찬가지로, 히스톤 H4 의 아세틸화는 Cbfa1, 오스테릭스 및 오스티오칼신 유전자의 프로모터 부위에서도 증가되었다 (도 4B 참조).

따라서, 히스톤 H3 및 H4 의 과아세틸화가 골 생성 유전자의 프로모터 부위에서 유도되고, 이것이 골모 세포의 분화 과정 중 HDAC 효소 활성과 밀접한 관련이 있는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 7> HDAC 1 유전자 억제의 골모 세포 분화에 미치는 효과

본 발명은 골 생성 과정 중 HDAC 1 유전자의 발현이 현저히 감소하고 전체 HDAC 효소의 활성도 감소하며 (도 1 참조), HDAC 발현 억제가 골모 세포의 분화를 가속화 하는 것을 관찰하였다 (도 2 및 도 3 참조). 따라서 HDAC 1 유전자의 특이 발현 억제는 골모 세포의 분화 능력을 변화시키는 것을 확인할 수 있었다.

본 발명은 상기 과정을 입증하기 위하여, 서열번호 1의 siRNA 를 이용하여 HDAC 1 유전자의 발현을 억제하는 것이 골모 세포의 분화에 미치는 효과를 조사하였다. HDAC 1 특이 서열번호 1의 siRNA 를 도입하면 ROS17/2.8 세포에서 단백질의 발현이 80% 까지 감소하였다. 이 때 HDAC 1 유전자와 가장 높은 상동성을 나타내는 HDAC 2 유전자를 포함하여 다른 HDACs 유전자의 발현에는 영향을 주지 않았다. HDAC 1 에 대한 서열번호 1의 siRNA 를 사용하여, 골모 세포 분화 과정 중 전체 HDAC 효소 활성은 대략 50% 가 감소된 반면 (도 5B 참조), 전체 HAT 효소 활성은 변화되지 않았다.

또한 본 발명은 HDAC 1 에 대한 서열번호 1의 siRNA 를 사용하여 세포의 형태학적 변화를 조사하기 위하여, 기준 (mock) 또는 HDAC 1 siRNA 레트로바이러스로 형질전환 된 세포를 ALP 로 염색하였다. 도 5C 에서 보는 바와 같이, HDAC 1 발현 억제 (knockdown) 세포는 기준 형질전환 된 세포와 비교하여 현저히 증가된 ALP 양성을 보여주었다. 또한 HDAC 1 발현 억제 세포를 사용하여 노던 블럿을 수행한 결과, 골 생성 마커 유전자의 mRNA 수준이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 특히 Cbfa 1, 오스테릭스 및 ALP 의 mRNA 발현이 현저히 증진되었는 데, 이것은 이들 유전자의 활성화가 골모 세포의 분화 과정 중 HDAC 1 감소로 인해 유발된다는 점을 시사하는 것이다. 따라서 HDAC 1 의 히스톤 디아세틸라제의 활성은 골 생성 분화에 있어 중요한 목표물 (target)이 될 수 있음을 확인하였다.

<실시예 8> HDAC 에 대한 저해제의 세포 주기 조절 유전자에 미치는 효과

본 발명은 골모 세포 분화의 초기 과정 및 세포 주기 조절의 관련성을 파악하기 위하여, 골 생성 과정 중 p21, p27 및 망막아세포종 (Rb) 단백질 수준을 ROS17/2.8 세포에서 조사하였다.

참고로, 세포 분화의 초기 단계에서 증식하는 전구 세포는 세포 주기를 정지시켜야 한다. 여기서 작용하는 사이클린 의존성 카이네이즈 저해제 (CKLs), p21 및 p27 은 골모 세포의 성장 및 분화를 조절하고, Rb 단백질은 전사 활성인자 (transcription coactivator)로서 Cbfa1 과 반응한다고 보고된 바 있었다 (드리시 등, 1999; 토마스 등, 2001). 골 생성 분화 과정의 초기 단계에서 p21 단백질 수준은 분화 유도 후 24시간 경과 시 최고점에 도달하는 한편, 세포 주기 상 G1/S 전이 과정을 조절하는 p27 및 Rb 단백질 수준은 골 생성 분화의 이후 단계 (24 ~ 48 시간 사이)에서 최고점에 도달하였다 (도 6A 참조).

본 발명은 이미 암 세포에 있어서 강력한 증식 억제 특성을 나타내는 것으로 알려져 있는 HDAC 에 대한 저해제로서 NaBT 를 사용하여 세포 주기 정지에 미치는 효과를 조사하였다 (드 루이터 등, 2003; 크레이머 등, 2001) (도 6B 참조). p27 단백질 수준은 NaBT 를 사용하여 10시간 동안 빠르게 증가하였고, Rb 단백질 수준은 NaBT 처리에 의하여 대략 2배 이상 증가하였다. 따라서, 본 발명의 NaBT 는 p27 및 Rb 단백질과 같은 세포 주기 정지 유전자의 발현을 자극하여 세포 주기 정지를 가속화하는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 9> 동물 모델에서의 HDAC 에 대한 저해제의 효과

본 발명의 HDAC 에 대한 저해제를 기준 생쥐 및 골다공증을 나타내는 실험 생쥐에 피하 등에 투여하여 골모 세포의 성장 및 분화 등에 미치는 효과 그리고 골다공증의 예방 및 치료 효과를 조사하였다. 그 결과 본 발명의 siRNAs 및 NaBT 등은 실험 생쥐에 독성을 나타내지 않으면서도, 골모 세포의 성장 및 분화를 증진시키고 골다공증의 증상 등을 두드러지게 개선하는 것을 확인할 수 있었다.

상기에서 설명하고 입증한 바와 같이, 본 발명의 골모 세포의 성장을 유도하는 히스톤 탈아세틸라제에 대한 저해제는 골모 세포의 성장과 분화에 작용하여 골수 간엽 줄기세포를 포함하여 골모 세포의 성장을 유도하여 골 생성 과정을 효과적으로 증진시키므로, 이와 관련된 골다공증 등을 효과적으로 치료하고 예방하는 데 널리 이용될 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (6)

1. 히스톤 탈아세틸라제(HDAC)의 발현을 억제하는 서열번호 1의 간섭 리보 뉴클레오타이드 산(small interfering RNAs; siRNAs)을 포함하는 것을 특징으로 하는 골모 세포 생장 유도용 조성물.
2. 제 1항에 있어서,

   상기 골모 세포 생장 유도가 골다공증 치료에 유용한 것을 특징으로 하는 골다공증 치료용 골모 세포 생장 유도용 조성물.
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