DE60113645T2

DE60113645T2 - Verwendung von Histonedeacetylasehemmern zur Behandlung von Papillomaviren assoziierte Krankheiten

Info

Publication number: DE60113645T2
Application number: DE60113645T
Authority: DE
Inventors: Patrick Finzer; Harald Zur Hausen; Frank RÖSL
Original assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Current assignee: Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date: 2001-04-10
Filing date: 2001-04-10
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2021-04-11
Also published as: ATE305297T1; EP1249246A1; EP1249246B1; WO2002083173A1; DE60113645D1; US20040132817A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Histon-Deacetylase-Inhibitoren zur Behandlung einer Krankheit, wobei die Krankheit Zervixkrebs, zervikales intraepitheliales Neoplasma, Warze, Larynxpapillom oder Condyloma acuminatum in Verbindung mit einer humanen Papillomavirus-HPV-Infektion ist. Besonders nützliche Inhibitoren sind Natriumbutyrat, Phenylbutyrat und Trichostatin A.
Das Uteruszervixkarzinom (Zervixkrebs, CC) ist weltweit der zweithäufigste Krebs bei Frauen und in Entwicklungsländern der häufigste. CC entwickelt sich durch präkanzeröse Zwischenstufen mit zunehmender Schwere, die als zervikale intraepitheliale Neoplasien (CIN) der Stufen 1–3 bekannt sind, wobei letztere über einen Zeitraum von 1 – 2 Jahrzehnten in etwa 50 % der Fälle zur Entwicklung von invasivem Krebs führen. Über 11 % der globalen Krebsfälle bei Frauen resultiert aus humanen Papillomavirus(HPV)-Infektionen. Eine Infektion mit HPV Typ 16 und 18 wird mit der Entwicklung von CIN und CC in Verbindung gebracht, wobei der HPV-Genotyp 16 die am meisten verbreitete Virusart zur Infektion der Zervix ist. Die E6- und E7-Proteine, die durch diese HPV-Arten kodiert werden, sollen an der Pathogenese von CC durch Induktion einer abnormalen Zellproliferation beteiligt sein. Die Expression von E6 und E7 wird kontinuierlich in Gewebe- und Tumorzellen von mit HPV verbundenen CC ermittelt. Außerdem reichen die E6- und E7-Gene der HPV-Arten 16 und 18 für eine Transformation von epithelialen Zellen in einer Kultur aus.
Es gibt immer mehr Beweise, dass die viralen E6- und E7-Onkogene, die durch die HPV-Arten 16 und 18 kodiert werden, wirksame Ziele für eine Tumorabstoßung durch den Wirt sein können und dass eine Therapie auf einer Inaktivierung dieser Proteine oder einer Hemmung der Expression der entsprechenden Gene beruhen könnte. Unglücklicherweise haben die unterschiedlichen Strategien, die bisher zur Therapie verwendet wurden, nur zu entmutigenden Ergebnissen geführt. Theoretisch könnte eine Behandlung durch Verfahren wie beispielsweise die Unterdrückung der Expression von viralen Onkogenen unter Verwendung von Antisense-Ansätzen oder die Beeinträchtigung von bestimmten Proteinwechselwirkungen zwischen Zellproteinen und viralen Onkogenen mittels Aptameren erzielt werden. Allerdings ist es gegenwärtig unklar, ob diese Strategien jemals funktionieren werden, da zum Beispiel im Hinblick auf die Antisense-Ansätze völlig offen ist, ob in vivo eine Wirkung durch Onkogenunterdrückung erreicht werden kann und im Hinblick auf die Verwendung von Aptameren ist bis jetzt vollkommen unklar, ob sie in der Lage sind, in eine Onkogen-positive Zelle zu einzudringen. Außerdem sind beide Ansätze zeitaufwendig und kostenintensiv und daher wahrscheinlich generell für eine Therapie nicht geeignet.
Es ist deshalb eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Mittel zur Verfügung zu stellen, die die Behandlung von Erkrankungen in Verbindung mit einer HPV-Infektion ermöglichen, wobei die Krankheit Zervixkrebs, zervikales intraepitheliales Neoplasma, Warze, Larynxpapillom oder Condyloma acuminatum ist.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird dies durch die in den Ansprüchen definierten Gegenstände erzielt. Es wurde während der zur vorliegenden Erfindung führenden Versuche festgestellt, dass die Anwendung von Histon-Deacetylase-Inhibitoren zur funktionellen Inaktivierung der viralen Onkogene von humanen Papillomaviren (HPV) durch Reaktivierung von Abwehrmechanismen der Wirtszelle führt, was eine Wachstumshemmung und Apoptoseeinleitung der behandelten Zellen zur Folge hat. In den Versuchen konnte gezeigt werden, dass die Histon-Deacetylase-Inhibitoren Natriumbutyrat und Trichostatin-A humane Papillomavirus(HPV)-positive Zellen beim G1/S-Übergang des Zellzyklus hemmen, der gleichlaufend zu einer Hochregulation der zyklinabhängigen Kinase-Inhibitoren (CKI) p21^CIP1 und p27^KIP1 ist. Während diese CKI normalerweise ihre cdk2-hemmende Funktion in Gegenwart des viralen Onkoproteins E7 nicht ausüben können, haben gleichzeitige Immunpräzipitationsversuche gezeigt, dass durch Bindung von p21^CIP1 und p27^KIP1 an den Zyklin-cdk2-Komplex eine E7-Bindung verhindert wird. Obwohl eine HPV-Expression für notwendig gehalten wird, um einen proliferativen Phänotyp von Zervixkrebszellen aufrechtzuerhalten, wird ein Ausschluss von E7 und eine vollständige Unterdrückung der cdk2-Aktivität sogar in Gegenwart einer anhaltenden viralen Transkription erzielt. Ein Anstieg von p27^KIP1 korreliert mit der Runterregulation von p45^SKP2, einer Komponente der Ubiquitin-Proteinligase SCF^SKP2, die die Halbwertszeit von regulatorischen Proteinen während des Zellzyklus steuert. Neben zusätzlichen modulatonischen Wirkungen auf die Zyklinexpression (Zyklin D1- und Zyklin A-Unterdrückung, Zyklin E-Induktion), löste eine Hemmung der Histondeacetylierung auch einen Rb-Abbau aus, während die E2F-Niveaus unbeeinflusst blieben. Das Vorhandensein von freiem intrazellulärem E2F und die gleichzeitige Induktion von p21 und p27 während der G1-Hemmung führen offenbar zu einer „zwiespältigen Wachstumssituation", die schließlich die Zellen zur Apoptose bringt. Als Folgerung daraus kann der Befund, dass die Hemmung einer Histondeacetylierung das Transformationspotential von „risikoreichen" HPV-Onkoproteinen durch Induktion einer Blockierung des G1/S-Übergangs und anschließende Apoptose umgehen kann, wichtige Auswirkungen auf die Behandlung einer HPV-vermittelten Krankheit, wie Zervixkrebs, haben. Da die in den nachfolgenden Beispielen verwendeten HDAC-Inhibitoren für normale Zellen nicht toxisch sind, ist offensichtlich, dass diese Inhibitoren zur Behandlung von Krankheiten, die mit einer HPV-Infektion in Verbindung stehen, nützlich sind.
Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Histon-Deacetylase-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer mit einer HPV-Infektion in Verbindung stehenden Erkrankung, wobei die Krankheit Zervixkrebs, zervikales intraepitheliales Neoplasma, Warze, Larynxpapillon oder Condyloma acuminatum ist.
Der Begriff „Histon-Deacetylase-Inhibitor", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Verbindung, die in der Lage ist, die Aktivität von Histondeacetylase zu hemmen. Der Fachmann kann geeignete Verbindungen auf der Grundlage der bekannten Strukturen (und Aminosäuresequenzen) von Histondeacetylasen auswählen, zum Beispiel Histondeacetylasen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 7A, Isoform a, 7B, Isoform b und 8; siehe NCBI-Datenbanken AAH00301, XP004370, AAH00614, NP006028, NP005465, NP006035, AAF63491, NP056216, NP057680 und NP060956. Beispiele für solche Verbindungen sind Antikörper, vorzugsweise monoklonale Antikörper, die spezifisch mit Histondeacetylase reagieren. In jüngerer Zeit hat die WO 98/25146 weitere Verfahren zum Screenen von Komplexbibliotheken auf Verbindungen mit der gewünschten Eigenschaft beschrieben, insbesondere die Fähigkeit ein Polypeptid zu agonisieren, zu binden oder zu antagonisieren. Die Komplexe in solchen Bibliotheken umfassen eine zu prüfende Verbindung, eine Markierstelle, die mindestens einen Schritt in der Synthese der Verbindung erfasst, und eine Anbindung, die durch ein Reportermolekül zu einer Modifikation in der Lage ist. Die Modifikation der Anbindung wird dazu verwendet zu kennzeichnen, dass ein Komplex eine Verbindung mit der gewünschten Eigenschaft enthält. Die Markierstelle kann dekodiert werden, um mindestens einen Schritt in der Synthese einer solchen Verbindung zu zeigen. Weitere Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die mit Histon-Deacetylase-Inhibitoren in Wechselwirkung stehen, sind zum Beispiel das in vitro-Screening mit dem Phagendisplaysystem sowie die Filterbindungsassays oder „Echtzeit"-Messung der Wechselwirkung. All diese Verfahren können zu Identifizierung von Histon-Deacetylase-Inhibitoren verwendet werden.
Verschiedene Quellen für die grundlegende Struktur eines solchen Inhibitors können verwendet werden und umfassen zum Beispiel mimetische Analoge der Histondeacetylase. Mimetische Analoge oder biologisch aktive Fragmente davon können zum Beispiel durch Substitution der Aminosäuren, die für die biologische Aktivität mit z.B. Stereoisomeren, d.h. D-Aminosäuren, als wichtig angesehen werden, erzeugt werden; siehe z.B. Tsukida, J. Med. Chem. 40 (1997), 3534–3541. Weiterhin können in dem Fall, in dem Fragmente für den Aufbau von biologisch aktiven Analogen verwendet werden, promimetische Komponenten in ein Peptid aufgenommen werden, um zumindest einige der Konformationseigenschaften wiederherzustellen, die nach dem Entfernen eines Teils des ursprünglichen Polypeptids verloren gegangen sein können; siehe z.B. Nachman, Regul. Pept. 57 (1995), 359–370. Außerdem kann die Histondeacetylase dazu verwendet werden, synthetische chemische Peptidmimetika zu identifizieren, die als Ligand, Substrat oder Bindungspartner der Histondeacetylase so wirksam wie das natürliche Polypeptid binden oder fungieren können; siehe z.B. Engleman, J. Clin. Invest. 99 (1997), 2284–2292. Zum Beispiel können Faltungssimulationen und Wiederaufbauten mittels des Computers von strukturellen Motiven der Histondeacetylase unter Verwendung von geeigneten Computerprogrammen durchgeführt werden (Olszewski, Proteins 25 (1996), 286–299; Hoffman, Comput. Appl. Biosci. 11 (1995), 675–679). Ein Computermodell einer Proteinfaltung kann zur Konformations- und Energieanalyse von detaillierten Peptid- und Proteinmodellen verwendet werden (Monge, J. Mol. Biol. 247 (1995), 9956–1012; Renouf, Adv. Exp. Med. Biol. 376 (1995), 37–45). Insbesondere können die geeigneten Programme zur Identifikation von sich gegenseitig beeinflussenden Stellen der Histondeacetylase und seinem Ligand oder anderen sich gegenseitig beeinflussenden Proteinen durch Computersuchen nach komplementären Peptidsequenzen verwendet werden (Fassina, Immunomethods 5 (1994), 114–120). Weitere geeignete Computersysteme für den Aufbau von Proteinen und Peptiden sind im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Berry, Biochem. Soc. Trans. 22 (1994), 1033–1036; Wodak, Ann. N. Y. Acad. Sci. 501 (1987), 1–13; Pabo, Biochemistry 25 (1986), 5987–5991. Die aus der oben beschriebenen Computeranalyse erhaltenen Ergebnisse können zum Beispiel zur Herstellung von Peptidmimetika einer Histondeacetylase verwendet werden. Solche Pseudopeptidanaloge der natürlichen Aminosäuresequenz des Proteins können sehr wirksam das Ausgangsprotein imitieren (Benkirane, J. Biol. Chem. 271 (1996), 33218–33224). Zum Beispiel führt die Aufnahme von leicht verfügbaren achiralen ω-Aminosäureresten in eine Histondeacetylase zur Substitution von Amidbindungen durch Polymethyleneinheiten einer aliphatischen Kette, wodurch eine günstige Strategie zur Konstruktion eines Peptidmimetikums zur Verfügung gestellt wird (Banerjee, Biopolymers 39 (1996), 769–777). Geeignete Peptidmimetika von Histondeacetylasen können auch durch die Synthese von peptidmimetischen kombinatorischen Bibliotheken durch aufeinander folgende Amidalkylierung und Testen der sich ergebenden Verbindungen, z.B. auf ihre Bindungs- und immunologischen Eigenschaften hin, identifiziert werden. Verfahren zur Erzeugung und Verwendung von peptidomimetischen kombinatorischen Bibliotheken werden im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel in Ostresh, Methods in Enzymology 267 (1996), 220–234 und Dorner, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709–715. Weiterhin kann eine dreidimensionale und/oder kristallographische Struktur einer Histondeacetylase zum Aufbau von peptidmimetischen Inhibitoren verwendet werden (Rose, Biochemistry 35 (1996), 12933–12944; Rutenber, Bioorg. Med. Chem. 4 (1996) 1545–1558).
Bevorzugte Histon-Deacetylase-Inhibitoren sind Natriumbutyrat, Phenylbutyrat bzw. Trichostatin A. Besonders bevorzugt sind Derivate dieser Inhibitoren, die eine erhöhte pharmakologische Halbwertszeit zeigen (Brettman und Chaturvedi, J. Cli. Pharmacol. 36 (1996) 617–622).
Die vorliegende Erfindung betrifft besonders, aber nicht ausschließlich, die Verwendung eines Histon-Deacetylase-Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Krankheit, die mit einer Infektion mit einem HPV der HPV-16- und HPV-18-Genotypen in Verbindung steht, wobei die Krankheit Zervixkrebs, zervikales intraepitheliales Neoplasma, Warze, Larynxpapillom oder Condyloma acuminatum ist. Es wird aber davon ausgegangen, dass die Erfindung sich auf Varianten von solchen HPV-Genotypen und andere HPV-Genotypen, z.B. HPV1 oder HPV11, erstreckt, die ein onkogenes oder andere pathologische Potential haben.
Zur Verabreichung werden diese Histon-Deacetylase-Inhibitoren vorzugsweise mit geeigneten pharmazeutischen Trägern kombiniert. Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, wie beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, verschiedene Arten von Netzmitteln, sterile Lösungen usw. Solche Träger können durch herkömmliche Verfahren formuliert werden und können der Testperson in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung der geeigneten Zusammensetzungen kann auf unterschiedliche Weise bewirkt werden, z.B. durch intravenöse, intraperitoneale, subkutane, intramuskuläre, topische oder intradermale Verabreichung. Der Verabreichungsweg hängt natürlich von der Art der Erkrankung und der Art der in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthaltenden Verbindung ab. Die Dosierungspläne werden durch den behandelnden Arzt und andere klinische Faktoren bestimmt. Wie in der Medizin bekannt ist, hängen die Dosierungen für einen Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe, Körperoberfläche, dem Alter und Geschlecht des Patienten, der speziellen, zu verabreichenden Verbindung, der Zeit und dem Verabreichungsweg, der Art der Erkrankung, dem allgemeinen Gesundheitszustand und anderen gleichzeitig zu verabreichenden Medikamenten.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1: Natriumbutyrat (NaB) hemmt den G1/S-Phasenübergang in HeLa-Zellen, ohne die virale Onkogenexpression zu beeinflussen.
(A) Oberer Teil: repräsentatives durchflusszytometrisches Profil von HeLa-Zellen nach der Behandlung mit 6 mM Natriumbutyrat (NaBG) über einen Zeitraum von 16 Stunden. „Contr.": unbehandelte Kontrolle. Die unterschiedlichen Phasen des Zellzyklus werden angegeben (G1, S, G2). Unterer Teil: Quantifizierung der Zahl von Zellen während des Zellzyklus (Mittel von drei unabhängigen Experimenten).
(B) Northern Blot Analyse. 5 μg RNA wurde in 1 % Agarosegel aufgetrennt. Der Filter wurde fortlaufend mit einer HVP18- und GAPDH-Sonde hybridisiert. Die Positionen der 28S- und 18S-ribosomalen RNA sind angegeben.
(C) Western Blot Analyse. 75 μg Gesamtzellprotein wurde auf einem 12 % SDS-Page-Gel aufgegeben. Nach einem Elektrotransfer wurden die Filter fortlaufend mit HPV18 E7 und monoklonalem Aktin-Antikörper inkubiert. (–): unbehandelte Zellen; (+):16 Stunden lang mit 6 mM Natriumbutyrat behandelt.
2: Wirkungen von Natriumbutvrat auf die Expression von G1-Zyklinen und zyklinabhängigen Kinasen (cdks).
(A und B) Exponentiell wachsende HeLa-Zellen wurden mit Natriumbutyrat (NaB), wie in der 1 angegeben, behandelt. 50 μg Protein wurde auf 12 % SDS-Page-Minigelen aufgetrennt. Nach einem Elektrotransfer wur den die Filter mit Antikörpern gegen Zyklin D1, Zyklin E, Zyklin A oder cdk2-, cdk4- oder cdk6-spezifischen Antikörpern inkubiert. Eine gleiche Proteinbeladung wurde durch erneute Inkubation der Filter mit einem monoklonalen Aktin-Antikörper bestätigt.
(C) Northern Blot Analyse. 5 μg RNA wurde in einem 1 % Agarosegel aufgetrennt. Die Filter wurden mit cDNA hybridisiert, die Zyklin D1, Zyklin E, Zyklin A und GAPDH kodiert. Die Positionen der 28S- und 18S-ribosomalen RNA sind angegeben. (-): unbehandelte Zellen; (+):16 Stunden lang mit 6 mM Natriumbutyrat behandelt.
3. Regulation von Zyklin abhängigen Kinase-Inhibitoren und Unterdrückung von p45^SKP2 durch Natriumbutyrat.
(A) Western Blot Analyse. 50 μg zelluläres Protein wurde auf SDS-PAGE-Minigelen aufgegeben. Nach einem Elektrotransfer wurden die Filter mit p21^CIP1, p27^KIP1, p16^INK4 und p45^SKP2 inkubiert. Eine gleiche Proteinbeladung wurde durch einen monoklonalen Aktin-Antikörper bestätigt.
(B) Northern Blot Analyse. 5 μg RNA wurde in einem 1 % Agarosegel aufgetrennt. Die Filter wurden mit cDNA, die p21^CIP1, p27^KIP1 und GAPDH kodiert, hybridisiert. Die Positionen der 28S- und 18S-ribosomalen RNA sind angegeben. (–): unbehandelte Zellen; (+)16 Stunden lang mit 6 mM Natriumbutyrat behandelt.
4: Natriumbutyrat unterdrückt die cdk2-Aktivität durch verstärkte Wechselwirkung mit p21 und p27 bei Gleichzeitigem Verlust der E7-Bindung
(A) Autoradiographie: Cdk2-Komplexe wurden aus NeLa-Zellen immunpräzipitiert und auf ihre Wirkung mittels Histon H1 als Substrat untersucht. („P1": Präimmunserum).
(B-E) Western Blot Analyse des cdk2-Komplexes. Cdk2-Präzipitate wurden in einem 12 % SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und mit p21^CIP1 (B), p27^KIP1 (C) und HPV18 E7-spezifisichen Antikörpern immungeblottet.
(D) Eine gleiche Beladung wurde durch Inkubation mit cdk2-Antikörpern bestätigt.
(E) P1: Präimmunserum. Contr.: unbehandelte Zellen; NaB: 16 Stunden lang mit 6 mM Natriumbutyrat behandelt.
5: Natriumbutyrat vermittelt einen pRb-Abbau ohne das E2F-1-Niveau zu beeinflussen: Induktion von Apoptose in HeLa-Zellen.
(A) Northern Blot Analyse. Derselbe Filter wurde aufeinander folgend mit pRB- und GAPDH-spezifischer cDNA hybridisiert. Die Positionen der 28S- und 18S-ribosomalen RNA in dem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel sind angegeben.
(B und C) Western Blot Analyse. 50 μg Protein wurde in 8 % (für pRb) und 12 % SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt. Nach einem Elektrotransfer wurden die Filter mit pRb, E2F-1- (B) und (C) p53-spezifischen Antikörpern inkubiert. Eine gleiche Proteinbeladung wurde mit einem monoklonalen Aktin-Antikörper bestätigt.
(D) Quantifizierung von Apoptose mittels eines im Handel erhältlichen „Cell Death Detection ELISA"-Kits. Der Anreicherungsfaktor, der für unbehandelte Kontrollzellen willkürlich auf 1 gesetzt wurde, reflektiert direkt den Umfang der Apoptose in HeLa-Zellen nach einer Behandlung mit Natriumbutyrat über einen Zeitraum von 16 Stunden.
6: pRB-Abbau durch Natriumbutyrat in HPV16-immortalisierten Keratinozyten hängt von E7 ab
Western Blot Analyse von Zellextrakten, die von E6-, E7- und E6/E7-immortalisierten Zellen erhalten wurden, die in 8 % (pRb) und 12 SDS-PAGE- Gelen aufgetrennt wurden. Nach einem Elektrotransfer wurden die Filter mit pRb, E2F-1, Zyklin E und Aktin-Antikörpern inkubiert. (–): unbehandelte Zellen; (+):16 Stunden lang mit 6 mM Natriumbutyrat behandelt. Aufgrund der quantitativen Unterschiede der pRb- und Zyklin-E-Niveaus in E7- und E6/E7-positiven Zellen wurden die Filter unterschiedlich lang exponiert.
7: Wirkungen von Trichostatin A auf die Expression von Zyklinen und Zyklin abhängigen Kinase-Inhibitoren und pRb-Abbau
Die vorliegende Erfindung wird durch die Beispiele erläutert.
Beispiel 1
Allgemeine Verfahren
(A) Zelllinien
HPV18-positive Zervixkrebszellen (HeLa) wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum (Gibco BRL, Rockville, USA), 1 % Penicillin und Streptomycin (Sigma, Deisenhofen, Deutschland), erhalten. Primäre humane Keratinozyten, die mittels E6-, E7- und E6/E7-offene Leserahmen mit amphotropischen Retroviren immortalisiert waren, wurden im „Keratinocyte Medium Kit" (Sigma) kultiviert.
(B) Reagenzien
Das Natriumsalz von n-Buttersäure (Sigma) wurde frisch aufgelöst und mit Kulturmedium verdünnt. Trichostatin A (Sigma) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO) (Merck, Darmstadt, Deutschland) hergestellt.
(C) Zellzyklusanalyse
Die Zellen wurden durch Trypsinierung geerntet, zweimal mit phosphatgepufterter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und über Nacht mit 70 % Ethanol fixiert. Die Zellen wurden erneut in PBS mit 40 μg/ml DNase-freie RNase A und 50 μg/ml Propidiumiodid suspendiert, und die Zellzyklusverteilung wurde in einem fluoreszenzaktivierten Zellsortierer (FACSort) von Becton Dickinson, San Jose, USA gemessen. Der DNA-Gehalt wurde mittels der „Cell Quest"-Software (Becton Dickinson, San Jose, USA) quantifiziert.
(D) RNA-Extraktion und Northern Blot Analyse
Die gesamte zelluläre RNA wurde gemäß dem Guanidinium-Thiocyanat-Verfahren (Chomczynski und Sacchi, Anal. Biochem. 162 (1987), 156–159) extrahiert. Ungefähr 5 μg RNA wurde auf 1 % Agarosegelen in Gegenwart von Ethidiumbromid unter nicht denaturierenden Bedingungen aufgetrennt und auf GeneScreen Plus-Membranen übertragen (DuPont, Bad Homburg, Deutschland). Die Filter wurden unter stringenten Bedingungen mit bestimmten Sonden hybridisiert, die mit ³²p-dCTP durch willkürliches Priming markiert wurden (Feinberg und Vogelstein, Anal. Biochem. 137 (1984, 266–267).
(E) DNA-Hybridisierungssonden
Die cDNA von p21 (el-Deiry u.a., Cell 75 (1993), 817–825), p27 (Polyak u.a., Cell 78 (1994), 59–66), Zyklin D1 (Baldin u.a., Genes Dev. 7 (1993), 812–821), Zyklin A (Pines und Hunter, Nature 346 (1990), 760–763) und Zyklin E (Hinds u.a., Cell 70 (1992), 993–1006) wurden verwendet. Der cDNA-Strang von pRB (Nukleotid 370–928) wurde von M. Tommasino (DKFZ Heidelberg) erhalten. Die GAPDH-Sonde (Ercolani u.a., J. Biol. Chem. 263 (1988, 15335–15341) wurde von A. Alonso (DKFZ, Heidelberg) erhalten. Das vollständige HPV18-Genom wurde in pBR322 (Boshart u.a., EMBO J. 3 (1984), 1151–1157) kloniert.
(F) SDS-PAGE und Western Blots
Zellextrakte wurden in 8–12 % SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt und wie von Finzer u.a. (Oncogene 19 (2000), 3235–3244) beschrieben elektrotansferiert. Die folgenden Antikörper wurden verwendet. Zyklin E (HE 12), Zyklin D1 (HD 11), cdk2 (M2), cdk4 (C-22), cdk6 (C-21 ), p27^KIP1 (C-19), p45^SKP2 (N-19), HPV18-E7 (N-19) und E2F-1 (KH95) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, USA), p21^CIP1 (C24420; Transduction Laboratories, Lexington, USA), pRB (NCL-RB; Novocastra, UK) und p16^INK4 (15126E, Pharmingen, San Diego, USA). Zyklin A wurde freundlicherweise von M. Pagano (Pagano u.a., EMBO J. 11 (1992), 961–971) zur Verfügung gestellt. Gleiche Proteinübertragung und Beladung wurden routinemäßig durch Inkubation der Filter mit einem monoklonalen Aktin-Antikörper (ICN Biomedicals, Ohio, USA) geprüft.
(G) Extraktherstellung, Immunpräzipitation und Histonkinaseassay
Für die Zellfraktionierung wurden Zellmonoschichten zweimal mit PBS gewaschen und mittels Trypsinierung geerntet. Die Zellextraktherstellung und cdk2-Aktivitätsassays erfolgten genau wie von Blomberg und Hoffmann (Mol. Cell. Biol. 19 (1999), 6183–6194) beschrieben. Darüber hinaus wurde cdk2 immunpräzipitiert und durch Immunblotting analysiert. Kügelchen, die für den cdk2-Kinaseassay verwendet wurden, wurden dreimal mit Lysepuffer gewaschen (Blomberg und Hoffmann, 1999), mit Laemmli-Probenpuffer inkubiert und 5 min gekocht. Der Überstand wurde mittels SDS-PAGE-Gelen analysiert. Immunblotting wurde mit den folgenden Antikörpern durchgeführt: p21^CIP1 (C24420) und p27^KIP1 (K25020; Transduction Laboratories) oder HPV18-E7 (N-19; Santa Cruz, Inc.). Cdk2-spezifische Antikörper oder Präimmunserum wurde freundlicherweise von I. Hoffmann (DKFZ, Heidelberg) zur Verfügung gestellt.
(H) Quantifizierung der Apoptose
Die Apoptoserate wurde mit dem Cell Death Detection Kit (ELISA^PLUS, Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland) nach den Anweisungen des Herstellers bestimmt.
Beispiel 2
Histon-Deacetylase(HDAC)-Inhibitoren induzieren eine G1/S-Phasenhemmung in HPV18-positiven Zervixkrebszellen trotz laufender E6/E7-Synthese
Die Modulation der Histonacetylierung ist ein integraler Bestandteil eines Regulationsmechanismus, der an der nukleosomalen Organisation von bulk-Zell-DNA beteiligt ist. Die Posttranslationsneutralisation der positiven Ladung von Lysinresten in der N-terminalen Domäne von Core-Histonen erleichtert die Histon-DNA-Wechselwirkungen, die wiederum den Zugang von Transkriptionsfaktoren mit ihren verwandten regulatorischen Elementen auf dem DNA-Niveau vereinfacht. Änderungen der Chromatin-Architektur wird durch ein Wechselspiel zwischen Histonacetylasen (HAT) und -deacetylasen (HDAC) vermittelt, die entweder durch Aktivierung oder Unterdrückung der Genexpression gegeneinander arbeiten. In den letzten Jahren ist eine wesentliche Zahl von HATS in Hefe und Tetrahymena beschrieben worden. Bei höheren Eukaryonten besitzen bestimmte Adaptermoleküle, wie beispielsweise p300/CBP oder p/CAF (als p300/CPB-verwandter Faktor bezeichnet), eine intrinsische HAT-Aktivität. Ihre Verbindung zu CREB, c-jun, c-fos oder nicht ligandierten nukleären Rezeptoren sieht eine funktionelle Verknüpfung zwischen Transkriptions-Koaktivatoren und Histonacetylatoren während der Einleitung einer Genexpression vor. Umgekehrt ist die Histondeacetylase Typ 1 (HDAC1) eine inhärente Komponente eines allgemeinen Korepressorkomplexes, der mit YY-1, Mad/Max sowie dem Retinoblastomprotein pRb in Wechselwirkung steht, was regelmäßig zur Hemmung einer Genexpression führt, obwohl Ausnahmen bestehen (Workman und Kingston, Annu. Rev. Biochem. 67 (1998), 545–579; Wade u.a., Trends Biochem. Sci. 22 (1997), 128–132). Da sowohl HAT als auch HDAC selbst keine sequenzspezifischen DNA-Bindungsaffinitäten aufweisen, stellt die physikalische Wechselwirkung mit Transkriptionsaktivatoren oder -repressoren eine zuverlässige Erläuterung zur Verfügung, durch die Enzyme, die während des nukleosomalen Umbaus normalerweise ganz global wirken, für örtlich definierte Transkriptionseinheiten bestimmt werden können.
Es können nicht nur Zelltranskriptionsfaktoren auf HAT- und HDAC-Moleküle abzielen, sondern auch virale Onkoproteine, wie beispielsweise E6 und E7 der „risikoreichen" humanen Papillomaviren (HPV), den etiologischen Mitteln des Zervixkrebses. Wie kürzlich gezeigt, ist HPV16 E6 in der Lage, die kostimulatorische Funktion von CBP und p300 aufzuheben, was zu einer verminderten Fä higkeit dieser Faktoren, die p53-, NF-KB- und c-jun-reagierenden Promotorelemente zu transaktivieren, führt. Während E6 die CBP/p300-Anbindungsfunktion an andere Transkriptionsfaktoren und möglicherweise die intrinsische HAT-Aktivität stört, kann das E7-Onkoprotein indirekt über das Brückenprotein Mi2ß an den Histondeacetylasekomplex binden. Diese Eigenschaft ermöglicht wahrscheinlich, dass E7 die zellulären Gene inaktiviert, die mit dem Auswuchs von prämalignen Zellen während der Entwicklung von Zervixkrebs nicht vereinbar sind. Zum Beispiel wird das Interferon regulatorische Faktor-1(IRF-1)-Gen, dessen Expression für den Interferon-Signalweg und die immunologische Überwachung von hartnäckigen HPV-Infektionen wichtig ist, über eine E7-vermittelte Rekrutierung von HDAC für den jeweiligen Promotor außer Gefecht gesetzt. Je nach dem Wechselspiel zwischen unterschiedlichen Transkriptionsfaktoren kann E7 auch in entgegengesetzter Richtung wirken. Zum Beispiel erleichtert E7 die repressive Wirkung von pRb und HDAC1 auf den Zyklin-E-Promotor, wodurch eine unvorhergesehene Zellzyklusprogression gefördert wird.
Ein anderes Kennzeichen einer HPV-induzierten Transformation ist die posttranslationale Wechselwirkung von E6 und E7 mit Zellproteinen, die in die Zellzykluskontrolle eingreifen: E6 bindet an p53 und fördert dessen Abbau über den Ubiquitin/Proteosom-Weg. E7 komplexiert mit dem Retinoblastomaprotein pRb, p107, p130, Zyklin A, Zyklin E sowie den zyklinabhängigen Kinase-Inhibitoren p21^CIP1 und p27^KIP1.
Um die molekularen Wirkungen der Histondeacetylasehemmung im Zusammenhang mit der HPV16/18-induzierten Karzinogenese zu erhellen, wurden in den Versuchen der vorliegenden Erfindung die HPV18-positive Zervixkrebszelllinie HeLa sowie die primären humanen Vorhautkeratinozyten verwendet, die getrennt mit amphotropischen Retroviren, die die offenen Leserahmen von HPV16 E6, E7 oder E6/E7 trugen, immortalisiert. Um die spezifische Auswirkung der Histondeacetylasehemmung auf die Zellproliferation zu bewerten, wurde eine durchflusszytometrische Analyse des Zell-DNA-Gehalts durchgeführt (1). Die Behandlung mit 6 mM Natriumbutyrat über 16 Stunden führte zu einem signifikanten Anstieg der G1-Fraktion (von 56,8 % auf 75,7 %), während die Zahl der Zellen in der S-Phase vermindert wurde (von 24,9 % auf 8,5 %). Wie zuvor ge zeigt, scheint die kontinuierliche Expression der viralen Onkogene notwendig zu sein, um den proliferativen Phänotyp von Zervixkrebszellen zu erhalten. Auf die Frage, ob HDAC-Inhibitoren auch Auswirkungen auf die Transkriptionsaktivität von endogenen HPV18-Genomen in HeLa-Zellen haben, wurden Northern Blot Analysen durchgeführt. Obwohl Zeitverlaufsversuche reproduzierbar eine anfängliche Herunterregulation der viralen E6/E7-Epxression kurz nach der Natriumbutyratzugabe zeigten, war der Effekt nur vorübergehend. Allerdings konnte unter Bedingungen, unter denen das Wachstum von Zellen gehemmt wurde (1A), noch eine anhaltende HPV18-Transkription (1B) und E7-Onkogenexpression ausgemacht werden (1C). Ähnliche Ergebnisse wurden mit Trichostatin A erhalten, was zeigt, das HDAC-Inhibitoren im Allgemeinen in der Lage sind, die Proliferation von Zervixkrebszellen durch Umgehung und/oder Neutralisierung der viralen Onkoproteinfunktion zu hemmen.
BEISPIEL 3
HDAC-Inhibitoren modulieren Zykline aber nicht die cdk-Expression
Weil der genaue, der wachstumshemmenden Wirkung auf Zervixkrebszellen zugrunde liegende Mechanismus noch nicht ermittelt wurde, wurden die Gleichgewichtsniveaus von regulatorischen Proteinen, die an der Zellzykluskontrolle beteiligt sind, geprüft. Wie in der 2 gezeigt ist, reguliert Natriumbutyrat selektiv Zyklin D1 und Zyklin A herunter, während die Menge an Zyklin E stark erhöht wurde (2A). Die Inkubation desselben Filters mit einem monoklonalen Aktin-Antikörper bestätigte die gleiche Beladung und Proteinübertragung. Die quantitativen Unterschiede der Zyklinexpression nach der Natriumbutyratanwendung resultierten wahrscheinlich nicht aus geänderten Abbauraten, da es eine gute Übereinstimmung zwischen den Niveaus an Protein und den entsprechenden mRNA gab (2C). Die Kontrollhybridisierung des identischen Blots mit Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH) bestätigte wieder die Selektivität dieser Wirkung. Im Gegensatz dazu zeigte weder die zyklinabhängige Kinase 2 (cdk2) noch cdk4 oder cdk6 einen signifikanten Einfluss auf ihre Expressionsraten (2B), was klar die Möglichkeit ausschließt, dass die wachstums hemmende Wirkung einer bloßen Verringerung der intrazellulären Mengen an bestimmten cdk zugeschrieben werden könnte.
Beispiel 4
Natriumbutyrat induziert den zyklinabhängigen Kinase-Inhibitor p21^CIP1 auf dem Transkriptionsniveau, während p27^KIP1 posttranslational durch gleichzeitige Suppression von p45^SKP2, einer Komponente der Ubiquitin-Protein-Ligase SCF^SKP2, hochreguliert wird.
In einer nächsten Versuchsreihe wurden die Niveaus an zyklinabhängigen Kinase-Inhibitoren (CKI) untersucht, die nach verschiedenen antiproliferativen Signalen bekannte Mediatoren der Zellzyklushemmung sind. Eine Western Blot Analyse von Zellextrakten (3A) veranschaulicht, dass die Cip/Kip-Familienmitglieder p21^CIP1 und p27^KIP1, die normal die Zyklin A/cdk2- und Zyklin E/cdk2-Funktion blockieren, nach der Natriumbutyratbehandlung signifikant induziert wurden. Im Gegensatz dazu wurde nach dem Prüfen derselben Extrakte für den Zyklin D1-cdk4/6-Inhibitor p16^INK4 keine Reduzierung festgestellt. Überraschenderweise wurde bei Überwachung der Gleichgewichtsniveaus an entsprechenden mRNA nur p21^CIP1 erhöht, während die p27^KIP1-Expression unter denselben Versuchsbedingungen sogar gesenkt wurde. Um diese offensichtliche Diskrepanz zu verstehen, wurde das Augenmerk auf die Expression von p45^SKP2 gelegt, einem regulatorischen Schlüsselprotein, das, wie kürzlich gezeigt wurde, die intrazelluläre Halbwertszeit von p27^KIP1 steuert. p45^SKP2, das, wie festgestellt wurde, in vielen transformierten Zellen hochreguliert wurde, wurde nach Zugabe von Natriumbutyrat stark unterdrückt (3A). Da dieselben Ergebnisse mit Trichostatin A erhalten wurden, legen diese Daten stark nahe, dass mindestens eine zellwachstumshemmende Hauptfunktion der Histon-Deacetylase-Inhibitoren über die Störung des SCF (SKP-1-CDC3-F-box)-Ubiquitin-Proteinligasekomplexes der posttranslationalen Stabilisierung des cdk2-Inhibitors p27^KIP2 zugeschrieben werden kann.
Beispiel 5
Die Cdk2-Aktivität wird vollständig nach der Butyratbehandlung unterdrückt: Ausschluss von E7 aus dem Komplex
Cdk2-Inhibitoren, wie beispielsweise p21^CIP1 und p27^KIP1 spielen eine wichtige Rolle bei der Immortalisierung und Zelltransformation durch potentielle DNA-Tumorviren, weil ihre Funktion neutralisiert oder nach der Bindung von viralen Onkoproteinen, wie beispielsweise E7, umgangen werden kann. Um zu analysieren, ob die cdk2-Aktivität nach der Zugabe von Natriumbutyrat moduliert wurde, wurden Zyklin-cdk2-Komplexe zuerst mittels bestimmter, gegen cdk2 gerichteter Antikörper immunpräzipitiert und anschließend in vitro mittels Histon H1 als Substrat untersucht (4A). Im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle war die cdk2-Kinaseaktivität 16 Stunden nach der Natriumbutyratzugabe vollständig abgebaut. Die Zeitverlaufsexperimente, die parallel durchgeführt wurden, zeigten, dass cdk2 nach 9 Stunden noch aktiv war, aber 3 Stunden später abrupt abfiel. Um zu testen, ob p21^CIP1 und p27^KIP1 tatsächlich an den cdk2-Komplex binden oder nicht, wurde das Zusammensetzungsmuster der cdk2-Immunpräzipitate mittels Western Blot Analyse untersucht. Wie in der 4B und C gezeigt, war die cdk2-Aktivität unter Bedingungen, unter denen beide CKI mit dem cdk2-Komplex verbunden wurden, außer Kraft gesetzt. Im Gegensatz dazu verschwand E7, das in unbehandelten Kontrollzellen sofort detektierbar war, völlig in den behandelten Zellen, obwohl die gesamte intrazelluläre Nettomenge des viralen Onkoproteins sich nicht änderte (4D), siehe auch 1C zum Vergleich). Die erneute Inkubation derselben Immunblots mit einem cdk2-Antikörper bestätigte, dass gleiche Mengen ausgefällt wurden (4E). Zusammen genommen zeigen diese Daten, dass der Übergang von einem proliferativen zu einem ruhigen Phänotyp offensichtlich mindestens zwei Schritte erfordert: die funktionelle Aufhebung der cdk2-Aktivität durch p21^CIP1 und p27^KIP1 sowie die gleichzeitige Verhinderung der E7-Bindung.
Beispiel 6
Unterschiedliche pRb-Inaktivierung in Gegenwart der einzelnen Onkoproteine: die Rolle von Histon-Deacetylase-Inhibitoren bei der Apoptoseinduktion.
Das am besten untersuchte G1-spezifische Zyklin/cdk-Substrat ist das Retinoblastomaprotein, pRb, das HDAC1 rekrutieren kann, um die regulatorischen Zellzyklusproteine, wie beispielsweise Zyklin E, zu unterdrücken. Da Zyklin E signifikant durch Natriumbutyrat hochreguliert wurde, war es zwingend notwendig, das Schicksal von pRb in den Versuchszellsystemen zu untersuchen. Die 5B veranschaulicht, dass pRB nach 16 Stunden vollständig abgebaut wurde, aber die Histondeacetylasehemmung offensichtlich keine Auswirkungen auf die Genexpression und Translation des Transkriptionsfaktors E2F-1 hat. Stattdessen konnte das Fehlen von pRb klar einem posttranslationalen Ereignis zugeschrieben werden, weil das Gleichgewichtsniveau der entsprechenden mRNA aufrechterhalten wurde (5A). Das Fehlen einer modulatorischen Wirkung auf p53 (5C), dessen Halbwertszeit durch E6 gesteuert wird, bestätigte die frühere Erkenntnis, dass die virale Onkoproteinexpression in Gegenwart von Natriumbutyrat aufrechterhalten wird (siehe 1C).
Der starke Abbau des anti-apoptotischen Proteins pRb ohne eine Reduzierung des Transkriptionsfaktors E2F-1 bedingt wahrscheinlich das abschließende Auftreten der deutlichen apoptotischen Zahlen, wie beispielsweise Membranausstülpungen („membrane blebbing"), Ablösen von der Oberfläche und Karyorrhexis nach langer HDAC-Hemmung. Der Beginn der Apoptose kann bereits nach 16 Stunden mittels eines empfindlichen EILSA-Assays, der die Freisetzung von mit Histon verbundenen DNA-Fragmenten im Zytoplasma nach nukleärem Abbau misst, festgestellt werden. Wie in der 5D gezeigt, induzieren sowohl Natriumbutyrat (und viel stärker Trichostatin A) den programmierten Zelltod in einem signifikanten Umfang.
Während E2F-1 auch nicht signifikant HPV16-immortalisierte humane Keratinozyten änderte, scheint ein pRb-Abbau streng von der Gegenwart von E7 abzuhängen. Wie in der 6 gezeigt, verschwand pRb vollständig ausschließlich in E7-exprimierenden Zellen, während es nur in Zellen hypophosphoryliert wird, die E6 als virales Onkogen enthalten. E6/E7-immortalisierte Keratinozyten zeigten wiederum einen pRb-Abbau, was deutlich veranschaulicht, dass das Schicksal von pRb durch E7 dominant bestimmt wird. An eine biologische Verfügbarkeit von pRb kann sich ein Überwachen des Expressionsniveaus von Zyklin E anschließen, dessen Transkription negativ durch pRb reguliert wird. Der Grund für eine Zyklin-E-Expression in unbehandelten E7-positiven Zellen stimmt mit der Fähigkeit von E7 überein, die pRb-unterdrückende Wirkung auf den verwandten Promotor durch Zerstören des pRb-HDACI-Komplexes zu überwinden.
Beispiel 7
Wirkungen von Trichostatin A auf die Expression von Zyklinen und zyklinabhängigen Kinase-Inhibitoren und den pRb-Abbau
Die Wirkungen von Trichostatin A sind in der 7(a) – (i) gezeigt
7(a) Trichostatin A reguliert Zyklin A herunter und Zyklin E hoch.
Exponentiell wachsende HeLa-Zellen wurden mit Trichostatin A behandelt, wie in der 1 angegeben. 50 μg Protein wurde auf 12 % SDS-PAGE-Minigels aufgetrennt. Nach einem Elektrotransfer wurden die Filter mit Antikörpern gegen Zyklin E und Zyklin A inkubiert. Eine gleiche Proteinbeladung wurde durch erneute Inkubation der Filter mit einem monoklonalen Aktin-Antikörper bestätigt. (Contr.): unbehandelte Zellen; (DMSO): DMSO-Kontrolle; (TSA): 16 Stunden lang mit 330 nM Trichostatin A behandelt.
7(b) Trichostatin A induziert Zyklin abhängige Kinase-Inhibitoren p21^CIP1, reguliert p27^KIP1 hoch und unterdrückt p45^SKP2.
Western Blot Analyse. 50 μg Zellprotein wurde auf SDS-PAGE-Minigels aufgetragen. Nach einem Elektrotransfer wurden die Filter mit p21^CIP1, p27^KIP1, p16^INK4 und p45^SKP2 inkubiert. Eine gleiche Proteinbeladung wurde durch einen monoklonalen Aktin-Antikörper bestätigt. (Contr.): unbehandelte Zellen; (DMSO): DMSO-Kontrolle; (TSA): 16 Stunden lang mit 330 nM Trichostatin A behandelt.
7(c) (d) Trichostatin A unterdrückt die cdk2-Aktivität durch verstärkte Wechselwirkung mit p21^CIP1 und p27^KIP1 und gleichzeitigen Verlust der E7-Bindung.
(c) Autoradiographie: Cdk2-Komplexe wurden von HeLa-Zellen immunpräzipitiert und auf ihre Aktivität mit Histon H1 als Substrat untersucht. („PI": Präimmunserum).
(d) Western Blot Analyse des cdk2-Komplexes. Cdk2-Präzipitate wurden in einem 12 % SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und mit für p21^CIP1, p27^KIP1 und HPV18-E7 spezifischen Antikörpern immungeblottet. Eine gleiche Beladung wurde durch Inkubation mit cd2-Antikörpern verifiziert. PI: Präimmunserum. (Contr.): unbehandelte Zellen; (DMSO): DMSO-Kontrolle; (TSA): 16 Stunden lang mit 330 nM Trichostatin A behandelt.
7(e) Zeitverlauf der cdk2-Unterdrückung nach einer Behandlung mit Natriumbutyrat.
Autoradiographie: cdk2-Komplexe wurden aus HeLa-Zellen immunpräzipitiert und auf ihre Aktivität wie in (c) untersucht. Die Zellen wurden 3, 6, 9, 12 und 16 Stunden lang mit 6 mM Natriumbutyrat (NaB) behandelt. (Contr.): nach 3, 6, 9, 12 und 16 Stunden geerntete, unbehandelte Zellen.
7(f) (g) (h) Trichostatin A vermittelt einen pRb-Abbau ohne das NE2F-1-Niveau zu beeinflussen: Induktion der Apoptose in HeLa-Zellen.
(f und g) Western Blot Analyse: 50 μg Protein wurde in 8 % (für pRb) und 12 % SDS-PAGE-Gelen aufgetrennt. Nach einem Elektrotransfer wurden die Filter mit für pRb, E2F-1 (f) und (g) p53 spezifischen Antikörpern inkubiert. Eine gleiche Proteinbeladung wurde mit einem monoklonalen Aktin-Antikörper bestätigt.
(h) Quantifizierung der Apoptose mittels eines im Handel erhältlichen „Cell Death Detection ELISA" Kits. Der Anreicherungsfaktor für unbehandelte Kontrollzellen, der willkürlich auf 1 gesetzt wurde, reflektiert direkt das Apoptoseausmaß in HeLa-Zellen nach einer Behandlung mit Trichostatin A über 16 Stunden. (Contr.): unbehandelte Zellen; (DMSO): DMSO-Kontrolle; (TSA): 16 Stunden lang mit 330 nM Trichostatin A behandelt.
7(i) Feststellen von HPV16 E6 und E7 mRNA durch RT-PCR in den immortalisierten Keratinozyten.
Die Expression von E6 und D7 wurde nach der Elektrophorese der reversen Transkriptase(RT)-PCR-Produkte auf 2 % Agarosegelen festgestellt. Erwartete E6-, E6*- oder E7-Fragmente sind angegeben. Als Kontrolle wurde GAPDH-mRNA mittels RT-PCR ermittelt (460 bp). Die RT-Reaktion wurde mit dem Superscript TMII (Gibco) unter Beachtung der Instruktionen des Herstellers mittels 1,5 μg Gesamt-RNA durchgeführt. Für die E6-Detektion wurden die folgenden Primer verwendet: oberer Primer 5' ACT GCA ATG TTT CAG GAC CC 3', unterer Primer 5' TCA GGA CAC AGT GGC TTT TG 3', für die E7-Detektion; oberer Primer 5' CCC AGC TGT AAT CAT GCA TG 3', unterer Primer 5' TGC CCA TTA ACA GGT CTT CC 3'. Für die GAPDH-Detektion wurden die folgenden Vorwärts- (TGG ATA TTG TTG CCA TCA ATG ACC) und Rückwärts- (GAT GGC ATG GAC TGT GGT CAT G) Primer verwendet. Die Bedingungen für alle Primersätze waren wie folgt: anfängliche Denaturierungszeit von 3 min. bei 94°C und dann 30 s bei 94°C, 1 min bei 60°C, 10 min bei 72°C (35 Zyklen) und 10 min bei 72°C. (1): E6- und (2) E6*-Fragmente; (#): E7-Fragment; (+): 16 Stunden lang mit 6 mM Natriumbutyrat behandelt; (–) unbehandelte Zellen.

Claims

Verwendung eines Histon-Deacetylase Inhibitors zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Krankheit, die mit einer humanen Papillomavirusinfektion assoziiert ist, wobei die Krankheit Zervixkrebs, zervikales intraepitheliales Neoplasma, Warze, Larynxpapillom oder Condyloma acuminatum ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei der Histon-Deacetylase Inhibitor Natriumbutyrat, Phenylbutyrat oder Trichostatin A ist.