DE60032795T2

DE60032795T2 - Nordihydroguaiaretinsäurederivate zur behandlung von tumoren

Info

Publication number: DE60032795T2
Application number: DE60032795T
Authority: DE
Inventors: Ru Chih C Huang; Jonathan Heller; Jih Ru Hwu; Ke Yung King; Gholam Hosein Nankang Hakimelahi
Original assignee: Johns Hopkins University
Current assignee: Johns Hopkins University
Priority date: 1999-10-15
Filing date: 2000-10-16
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2020-10-17
Also published as: US6214874B1; JP2003511477A; AU1207501A; US6417234B1; HK1050860A1; JP4062664B2; US6958411B2; WO2001028494A2; DE60032795D1; WO2001028494A3; CA2387873C; SG144712A1; CA2387873A1; EP1231914B1; ATE350030T1; CN1309381C; EP1231914A4; US20050267208A1; US20030065016A1; AU783015C

Description

Die hierin beschriebene und beanspruchte Erfindung wurde teilweise mit Unterstützung der National Institutes of Health gemacht. Die Regierung der USA hat bestimmte Rechte an der Erfindung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung von Nordihydroguaiaretinsäure-Derivaten (NDGA), insbesondere Derivaten, die Substituenten von natürlich vorkommenden Aminosäuren enthalten, zur Behandlung von Tumoren und Virusinfektionen.
2. Hintergrundinformationen
Karzinogenese ist ein mehrstufiger Vorgang, der durch eine Reihe von genetischen und epigenetischen Faktoren beeinflusst wird und sich typischerweise durch das Ausbrechen von unkontrolliertem Zellwachstum mit Ursprung in unterschiedlichen Geweben manifestiert. Ein allgemeines Ziel der Antikrebsforschung liegt in der Entwicklung einer klinischen Behandlung, die äußerst effektiv bei der Einschränkung von Tumorwachstum ist, für den Wirt nichttoxisch ist und für die meisten Patienten leistbar ist. Arzneimittel, die sich auf die Hemmung von Targets konzentrieren, die nur in sich teilenden Zellen vorhanden sind, sollten wirksame Chemotherapeutika ohne das Risiko von wesentlichen Nebenwirkungen sein.
Zellen passieren auf ihrem Weg durch den Zellzyklus viele Kontrollpunkte. Bestimmte Kriterien müssen erfüllt sein, damit sie jeden dieser Kontrollpunkte passieren können. Beim G2/M-Übergang ist der wesentlichste Regulator die Cyclin-abhängige Kinase CDC2. Diese Kinase bindet eng an das Regulatorprotein Cyclin B, und dieser Komplex, der auch als Reifungspromotionsfaktor (MPF) bezeichnet wird, ist verantwortlich für die Stimulierung einer Unzahl an Vorgängen, die zum Eintritt der Zelle in die frühe Prophase führen (1). Es ist nicht überraschend, dass der Verlust oder die Deaktivierung einer Komponente des MPF die Weiterentwicklung der Zelle aus G2 heraus blockiert.
Die Expression und Aktivität des MPF wird in unterschiedlichen Graden geregelt. Cyclin-B-Protein-Werte steigen während der G1- und S-Phase des Zellzyklus langsam an, erreichen während des Übergangs von der G2- in die M-Phase ihren Höhepunkt und fallen während der Mitose scharf ab (2). Das CDC2-Protein, andererseits, ist immer während des Zellzyklus vorhanden, obwohl seine Werte in den letzten Stadien der G2-Phase leicht ansteigen (3). Die Aktivität des Proteins hängt von der Assoziation mit dem geeigneten Cyclin sowie von der Dephosphorylierung seiner Hemmstellen durch die Phosphatase CDC25C ab (4,5). Es wurde gezeigt, dass ein Versagen dieser Dephosphorylierung einen G2-Arrest als Reaktion auf DNA-Schädigung durch Strahlung und chemische Einwirkung initiiert. Neuere Beweise lassen außerdem vermuten, dass jedes verbleibende aktive CDC2 nach einer DNA-Schädigung außerhalb des Kerns transportiert werden kann.
Von einer Reihe von natürlich vorkommenden Derivaten des Pflanzenlignans Nordihydroguaiaretinsäure (NDGA) wurde nachgewiesen, dass sie die Virusreplikation durch Hemmung der Virustranskription hemmen. Diese frühere Arbeit hat gezeigt, dass NDGA-Derivate, die ursprünglich aus Larrea Tridentata isoliert und danach chemisch synthetisiert wurden, die Produktion von HIV- (7,8), HSV- (9) und HPV-Transkripten (10) durch Deaktivierung ihrer Sp1-abhängigen Promotoren hemmen kann. Unerwarteterweise scheint eines dieser Derivate, Tetra-O-methyl-NDGA, auch einen Zellzyklus-Arrest in Säugetier-Zelllinien zu induzieren. Die hierin im Folgenden dargelegten Beweise zeigen, dass M₄N in der Lage ist, ohne nachgewiesene Toxizität einen G2-Arrest in Säugetierzellen zu induzieren, und unterstützten die Ansicht, dass dieser Arrest auf die Hemmung der Cyclin-abhängigen Kinase CDC2 zurückzuführen ist.
Eine Infektion mit Humanpapillomaviren (HPV) verursacht in vielen Arten von Schuppenepithelzellen ein unreguliertes Zellwachstum, was in Beschwerden von benignen Papillomen (Warzen) bis zu Zervix-, Penis- und Mundkrebs resultiert. Die starke Assoziation dieser Krebsarten mit HPV und die weite Verbreitung von Infektionen zeigen, wie wichtig die Entwicklung einer Anti-HPV-Therapie ist.
Die meisten, wenn nicht alle, Viren, einschließlich der replikativen aktiven Mutanten, sind vom Wirt abhängig. Sie erfordern die Beteiligung von bestimmten zellulären Faktoren zur Unterstützung des Viruswachstums. Zelluläre Wirtsfaktoren sind, anders als Virusproteine, keinem Mutationsdruck ausgesetzt und im Allgemeinen strukturell unveränderlich. Somit ist die Wahrscheinlichkeit groß, dass Verbindungen, welche die Nutzung dieser zellulären Faktoren in unterschiedlichen Stadien des Viruslebenszyklus blockieren, gute Kandidaten für mutationsunempfindliche antivirale Arzneimittel sind. Ein Überblick über mehrere Studien zur Verwendung von zellulären Faktoren als alternative Targets zur Hemmung von HIV-1 steht zur Verfügung (11).
Die Anmelder haben schon früher berichtet, dass 3'-0-methylierte NDGA (d.h. Mal. 4), die aus dem Kreosotbusch (Larrea tridentata) isoliert wird, basale HIV-Transkription, Tat-regulierte Transaktivierung und HIV-Replikation in einer menschlichen Zellkultur spezifisch blockieren kann (12, 13, 14). Mal.4 übt seine Wirkung aus, indem es die Bindung des-Transkriptionsfaktors Sp1 an den Promotor der HIV-Provirusmatrize stört. Das Ziel von Mal.4 wird an die Nucleotide –87 bis –40, die Sp1-Bindungsstellen der langen terminalen Wiederholung (LTR) des HIV, kartiert. Die nichtmodifizierte NDGA hemmt HIV-Transkription in vitro nicht und hat keinerlei Auswirkungen auf die Sp1-Bindung (12).
Die Isolation und Reinigung von Pflanzenlignanen ist jedoch arbeitsaufwändig und kostenintensiv. Im Hinblick auf eine mögliche klinische Anwendung von Pflanzenlignanen bei der Kontrolle des Sp1-regulierten Virus- und Tumorwachstums in Menschen wurden neun unterschiedliche methylierte NDGA-Aktivitäten unter Einsatz von unmethylierter NDGA als Ausgangssubstrat in großen Mengen und mit geringen Kosten chemisch synthetisiert (15). Bei Arzneimittelkonzentrationen unter 30 μM zeigte sich Tetra-O-methyl-NDGA am wirksamsten bei der Kontrolle der HIV-Replikation durch Hemmung von Sp1-regulierter Provirustranskription und -transaktivierung (15). Diese Studie wurde seither auf die Kontrolle des Wachstums des Herpes-simplex-Virus (HSV-1 und HSV-2) ausgeweitet (16). Das unmittelbare frühe (IE) ICP4-Gen von Herpes simplex ist wesentlich für die HSV-Replikation (17). Seine Promotorregion besitzt acht Sp1-Consensus-Bindungsstellen (18), wovon fünf für die ICP4-Genepxression erforderlich sind. Somit stellt das ICP4-Gen einen guten Kandidaten für solche Tests dar. Die Anmelder haben herausgefunden, dass sowohl 3-0-Methyl-NDGA (Mal.4) als auch Tetra-O-methyl-NDGA (M₄N) wirksame Transkriptionshinhibitoren für HSV-ICP4-Genexpression in Verozellen sind, indem sie die Sp1-Proteinbindung an den ICP4-Promotor blockieren, wie durch die Gel-Retentionsanalyse gezeigt wurde (16).
Als die Anti-HSV-Aktivitäten von M₄N und Mal.4 getestet und mit der von Acycloguanosin (Acyclovir, ACV) in infizierten Verozellen verglichen wurden, fanden die Anmelder heraus, dass die IC₅₀ für M₄N bei 10 Passagen von HSV-1 und 4 Passagen von HSV-2 zwischen 11,7 μM und 4 μM variiert, ohne dass eine offensichtliche steigende Tendenz in der Notwendigkeit einer höheren Arzneimittelkonzentration zu beobachten wäre. Die IC₅₀ für ACV stieg jedoch von 7 µm bei der ersten Viruspassage auf 444 µM bei der zehnten Passage von HSV-1 und auf > 88 µM bei der vierten Passage von HSV-2, was den raschen Aufbau von Arzneimittelresistenz gegen ACV in Verozellen aufzeigt.
Folglich fiel, während der Selektionsindex, S.I. (TC₅₀/IC₅₀), für M₄N relativ stabil blieb, der S.I. für ACV nach den Viruspassagen in Verozellen um das 60fache ab. Somit ist M₄N ein mutationsunempfindliches Arzneimittel (16). Es kann ACV-resistentes HSV wirksam hemmen (16).
Aufgrund der Tatsache, dass Sp1 ein wichtiger zellulärer Transkriptionsfaktor ist (19), sollte die Aufmerksamkeit auf die mögliche Hemmwirkung dieser Klasse von Verbindungen auf die Expression von Sp1-regulierten zellulären Genen gerichtet werden. Mal.4 kann Sp1 nicht mehr verdrängen, sobald es stabil an seine Bindungsstellen gebunden ist (12). Es schien daher wahrscheinlich, dass NDGA-Derivate eine stärkere Wirkung auf Sp1-regulierte Gene in proliferierenden Zellen haben würde als auf die Sp1-regulierten Haushaltsgene in stationären Zellen. In ersterem Fall ist das Arzneimittel in der Lage, während einer DNA-Synthese mit einem Sp1-Protein um die Sp1-Stellen in Genpromotoren zu konkurrieren, während sich das Arzneimittel in letzterem Fall gegebenenfalls kaum auf das transkribierende Chromatin von Haushaltsgenen auswirkt, bei denen das Sp1-Protein schon stabil an die Promotoren gebunden ist. Das wurde tatsächlich nachgewiesen. Wie nachstehend aufgezeigt wird, fanden die Anmelder unter Einsatz von Gen-Array-Studien mit 9600 exprimierten Genen heraus, dass die Produkte der meisten Sp1-regulierten Gene auf ähnlichen Werten bleiben und durch die Behandlung von Zervixkrebszellen C3 in einer Kultur mit einem Arzneimittel nicht beeinflusst wurden (5). Trotzdem schränkt der relativ niedrige Selektionsindex von M₄N seine Anwendung auf die niedrigste wirksame Konzentration ein, wenn das Arzneimittel systemisch eingesetzt werden muss. Andererseits induziert das Humanpapillomvirus solide Zervix- und Oraltumoren anfänglich durch die Sp1-regulierte Expression von HPV-E₆/E₇-Genen (20). Die Anmelder argumentierten, dass, wenn ein Arzneimittel in situ abgegeben werden kann und nur im Tumorbereich gehalten werden kann, die Arzneimittel mit hoher Konzentration eingesetzt werden können, um den Tumor bei nur geringer Schädigung des Patienten wirksam zu zerstören.
Verfahren zur Behandlung von Tumoren mit Zusammensetzungen von Catechinbutanen sind in der US 5.008.294 beschrieben.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Demgemäß besteht ein Ziel der Erfindung in der Bereitstellung von Verbindungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei der Behandlung von krebsartigen und nichtkrebsartigen Tumoren in Tieren, vor allem Säugetieren, und insbesondere in Menschen. Gemäß einem Aspekt der Erfindung werden neue Nordihydroguaiaretinsäure-Derivate bereitgestellt, die Tumorwachstum hemmen.
Somit stellt die Erfindung in einem Aspekt eine Verbindung der Formel
bereit, worin R₁, R₂, R₃ und R₄ identisch sind und für ein N,N-Dimethyl-substituiertes Derivat eines Aminosäurerests stehen. Vorzugsweise ist die Aminosäure Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, 5-Hydroxylysin, 4-Hydroxyprolin, Thyroxin, 4-Methylhistidin, ε-N-Methyllysin, ε-N,N,N-Trimethyllysin, Aminoadipinsäure, γ-Carboxyglutaminsäure, Phosphoserin, Phosphothreonin, Phosphotyrosin, N-Methylarginin oder N-Acetyllysin. R₁, R₂, R₃ und R₄ stehen vorzugsweise jeweils für -O(C=O)CH₂N(CH₃)₂
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Synthese einer Verbindung gemäß der Erfindung bereit, umfassend die folgenden Schritte:

(a) Kombinieren von NDGA und einem N,N-Dimethyl-substituierten Derivat einer Aminosäure; und
(b) Zusetzen von HCl;

In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine Verbindung gemäß der Erfindung und zumindest einen pharmazeutisch annehmbaren Exzipienten oder Träger umfasst. Vorzugsweise ist der Exzipient oder Träger physiologische Kochsalzlösung oder PBS.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung oder pharmazeutische Zusammensetzung gemäß der Erfindung zur Verwendung bei der therapeutischen Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung einer Verbindung oder pharmazeutischen Zusammensetzung gemäß der Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors oder zur Hemmung von Virenreplikation und -wachstum bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung die Verwendung eines Nordihydroguaiaretinsäure-Derivats der Formel
bereit, worin R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander für -OH, -OCH₃, -O(C=O)CH₃ oder einen Aminosäurerest oder ein N,N-Dimethyl-substituiertes Derivat davon stehen, jedoch nicht gleichzeitig alle -OH sind, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors bereit. Aminosäuresubstituenten umfassen unter anderem Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, 5-Hydroxylysin, 4-Hydroxyprolin, Thyroxin, 4-Methylhistidin, ε-N-Methyllysin, ε-N,N,N-Trimethyllysin, Aminoadipinsäure, γ-Carboxyglutaminsäure, Phosphoserin, Phosphothreonin, Phosphotyrosin, N-Methylarginin und N-Acetyllysin.
Besonders bevorzugt sind die Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung M₄N und G₄N, die in 1 dargestellt sind.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung einer Behandlung von krebsartigen und nichtkrebsartigen Tumoren durch die Verwendung dieser neuen Derivate und durch ähnliche Derivate, die zwar auf dem Gebiet der Erfindung bekannt waren, bisher aber nicht für die Behandlung von Tumoren eingesetzt wurden. Diese Behandlung sollte vor allem gegen rasch proliferierende Zelltypen wirksam sein, die Cyclin-abhängige Kinase CDC2 enthalten. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung der Hemmung von CDC2 in einem eukaryotischen Zellzyklus, insbesondere in einer Tierzelle, noch bevorzugter in einer Säugetierzelle und insbesondere einer menschlichen Zelle.
Zu behandelnde Tumoren umfassen jeden beliebigen Tumor, der gegenüber den oben genannten Verbindungen, die gemäß der Erfindung eingesetzt werden, empfindlich ist. Insbesondere umfasst dies sich rasch teilende krebsartige und benigne Tumoren, die gegenüber der Hemmung des Zyklus der Cyclin-abhängigen Kinase CDC2 empfindlich sind.
Die Bezeichnung „krebsartiger Tumor" ist so zu verstehen, dass er jegliche maligne Tumoren umfasst, die eine Metastase durchlaufen haben oder auch nicht. Die Bezeichnung „nichtkrebsartiger Tumor" ist so zu verstehen, dass er jeglichen benignen Tumor umfasst. Diese Bezeichnungen werden so verwendet, wie sie herkömmlicherweise von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung verstanden werden.
Beispiele für benigne und maligne Tumoren, die durch die Zusammensetzungen der Erfindung behandelt werden können, finden sich in Tabelle 1-1 in Cancer Biology (Raymond W. Ruddon, Cancer Biology, 3. Aufl., Oxford Univ. Press (1995), durch Verweis hierin aufgenommen). Zu behandelnde Tumoren umfassen jene, die bekannterweise viralen Ursprungs sind, sowie solche, die nicht viralen Ursprungs sind. Es ist zu erwarten, dass die Zusammensetzungen der Erfindung besonders nützlich für die Behandlung von soliden Tumoren sind.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung der Hemmung des Zyklus der Cyclin-abhängigen Kinase CDC2. Dies ist für die Hemmung von Zellproliferation, insbesondere bei sich rasch teilenden Zelltypen, zweckdienlich.
Die hierin beschriebenen Verbindungen und Zusammensetzungen können bei der Behandlung von HPV-induzierten Tumoren eingesetzt werden. HPV-induzierte Tumoren umfassen insbesondere, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Zervix-, Oral-, Penis- sowie Kopf- und Halstumoren, die mit einer HPV-Infektion assoziiert sind. Das Verfahren umfasst die lokale Anwendung von Nordihydroguaiaretinsäure-Derivaten, insbesondere Tetra-O-methylnordihydroguaiaretinsäure (M₄N) und N,N-Dimethyltetraglycinyl-NDGA (G₄N), auf krebsartige und nichtkrebsartige HPV-induzierte Tumoren.
Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht in der Bereitstellung der Hemmung von Virusreplikation und -wachstum durch Verabreichung der Verbindungen der Formel I, die Aminosäuresubstituenten enthalten. Somit stellt die Erfindung in einem Aspekt die Verwendung eines Nordihydroguaiaretinsäure-Derivats der Formel I bereit, worin R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander -OH, -OCH₃, -O(C=O)CH₃ oder einen Aminosäurerest oder ein N,N-Dimethyl-substituiertes Derivat davon darstellen, jedoch nicht gleichzeitig alle -OH sind, bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Virenreplikation und -wachstum bereit. Bevorzugt für diese Verwendung sind Verbindungen, worin die Aminosäuresubstituenten R₁, R₂, R₃ und R₄ identisch sind.
Es ist vorhergesehen, dass M₄N, G₄N und andere Derivate durch lokale Injektion in die Tumoren verabreicht werden, im Allgemeinen zusammen mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln, Exzipienten und Trägern. In bevorzugten Ausführungsformen wird M₄N in Form einer DMSO-Lösung und G₄N in einer PBS-Lösung in Tumoren injiziert. Die Verwendung von G₄N ergänzt den Einsatz von M₄N, insbesondere in größeren Tumoren (> 2 cm³), und zwar aufgrund seiner Wasserlöslichkeit, die es ihm erlaubt, sich über einen größeren Bereich des Tumors auszubreiten. Andere wasserlösliche und wasserunlösliche Nordihydroguaiaretinsäure-Derivate können auf ähnliche Weise gemäß der Erfindung eingesetzt werden. Diese können auch in auf Lipiden basierenden Formulierungen zur systemischen Verabreichung eingesetzt werden, wie sie auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind und verwendet werden.
Mit pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmitteln, Exzipienten und Trägern sind solche Verbindungen gemeint, die, wie Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung bekannt ist, mit M₄N, G₄N und anderen ähnlichen Derivaten kompatibel und zur lokalen Verabreichung an einen Menschen oder ein anderes Säugetier gemäß der Erfindung geeignet sind. Obwohl die nachstehenden Beispiele die Verabreichung mittels lokaler Injektion beschreiben, können auch andere Mittel zur lokalen Verabreichung, wie z.B. topische Anwendung oder gerichtete Zufuhr zur Tumorstelle, eingesetzt werden.
Die Menge der Verbindung, die verabreicht wird, um die gewünschte Behandlungswirkung zu erreichen, kann von Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung leicht bestimmt werden. Die Dosierungsmenge, Verabreichungsfrequenz und Behandlungsdauer hängen von den Umständen, vor allem von der Größe und der Art des Tumors, ab. Dosierungen von 10 mg bis 20 mg von entweder M₄N alleine oder mit ähnlichen Mengen G₄N pro Gramm Tumorgewicht in Abständen von einem Tag bis zu einer Woche oder weniger häufig sind zum Zwecke der Veranschaulichung zu nennen. Es ist zu erwarten, dass die Verabreichung von 50 µl bis 100 µl M₄N, in DMSO in einer Konzentration von 200 mg/ml gelöst, entweder alleine oder in Kombination mit G₄N, in vielen Fällen bei Tumoren mit 1–1,5 cm³ wirksam ist.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Struktur von M₄N und G₄N.
2A. HPV-16-LCR, welche die Region eines E₆/E₇-Promotors (pPV16P97) und die Bindungsstelle für ein Sp1-Protein zeigt.
2B. Die Wirkung von M₄N auf die E₆/E₇-Promotor-Aktivität in C-33A-Zellen (Hemmung von E₆/E₇-Promotor-getriebener Luciferase-Gen-Transkription durch unterschiedliche M₄N-Konzentrationen).
3A–3C. Hemmung von viralen E₆- und E₇-RNA-Transkripten durch 40 µM M₄N. Gesamt-RNA, die aus mit entweder 40 µM M₄N oder DMSO alleine in einem Wachstumsmedium 71 Stunden lang behandelten C3-Zellen isoliert worden war, wurde einer relativen RTPCR unterzogen. Die RTPCR-Proben wurden nach einer Steigerung der Amplifikationszyklen entfernt und auf einem Agarosegel aufgelöst. Die Gelaufnahmen (3A und 3B) zeigen diese Zyklen, die Gegenwart (+) oder Abwesenheit (–) von M₄N im Wachstumsmedium und zwei Verdauungen eines pGMT-Vektors, die als Größenmarker eingesetzt wurden. Die Amplifikationskarte (2C) zeigt die beiden Amplifikationsprodukte mit der erwarteten Größe, die aus einer alternativen Spleißung des frühen viralen RNA-Transkripts resultieren.
4A. Hemmung von C3-Zellwachstum durch M₄N.
4B. Hemmung von C3-Zellwachstum nach der Entfernung von M₄N.
5A–5B. Wirkung von M₄N auf Genexpression in C3-Zellen, untersucht durch die Gentestanalyse. 5A. In C3-Zellen nach > 2 Stunden DMSA-Behandlung (C3 DMSO) exprimiertes Gen. 5B. In C3-Zellen nach > 2 Stunden M₄N-Behandlung unter Verwendung von DMSO als Lösungsmittel (C3 M₄N) exprimiertes Gen.
6A–6B. Visuelle Beobachtungen an tumortragenden Mäusen nach. M₄N-Behandlung. 6A. Mäuse mit nur einem Tumor wurden mit einer In-situ-Injektion von DMSO (Nr. 3) oder M₄N (Nr. 7) behandelt. Eine In-situ-Injektion von M₄N wurde auch an einem der beiden in Maus Nr. 9 gezüchteten Tumoren vorgenommen. 6B. M₄N-behandelter Tumor (weiße Narbe) mit unbehandeltem Tumor von der gleichen Maus, Nr. 9, wie in Tabelle 2 beschrieben.
7. Histopathologische Wirkung von M₄N und M₄N/G₄N auf das Tumorwachstum in Mäusen. Die erste Spalte der Tafel zeigt die große Größe von Tumoren von Maus Nr. 4, 10, 12 nach einer DMSO-Behandlung (CON) im Vergleich zu den relativ kleinen arzneimittelbehandelten (M₄N oder M₄N/G₄N) Läsionen von Maus Nr. 12, 10, 27 und 20 (M₄N). Die nachfolgenden Fotografien sind Beispiele für diese Tumoren, die an Mäusen bei 100facher Vergrößerung untersucht wurden (A, B, C, DMSO-behandelt, D unbehandelt, E, F, G, H, M₄N- oder M₄N/G₄N-behandelt) (Tabelle 1 und Tabelle 2).
8. HSV-1-Replikation in Abwesenheit von Arzneimitteln (HSV-C, HSV-SC) in Gegenwart von unwirksamen Arzneimitteln (ABDS₁ [„HSV-ABDS₁"], ABDS₁ [„HSV-ABDS₂"]) und in Gegenwart von wirksamen Arzneimitteln (M₄N [„HSV-4N") und ACV [„HSV-ACV"]).
9. M₄N verursacht einen Wachstumsarrest in Säugetierzellen. (a-d) C3-, CEM-T4-, C33a- und TC-1-Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen M₄N behandelt. Die Anzahl an Zellen, die zu Beginn des Experiments vorhanden ist, ist als Tag 0 angegeben. Nach drei Tagen wurde die Anzahl an lebensfähigen Zellen gezählt und über die M₄N-Konzentration geplottet. (e) C3-Zellen wurden in T-25-Kolben mit 5 × 10³ Zellen pro Kolben geteilt und mit entweder M₄N in 1 % DMSO in einem Medium oder 1 % DMSO in einem Medium alleine versetzt (erste Medienänderung). Nach drei Tagen wurde zu einer Hälfte der M₄N-behandelten Zellen ein frisches Medium zugegeben, das nur 1 % DMSO (M-D) enthielt, während zum Rest der Zellen ein frisches Medium mit den gleichen Bedingungen zugegeben wurde (zweite Medienänderung). Die Zellen wurden täglich gezählt und über die Behandlungsdauer geplottet.
10. Mit M₄N behandelte Zellen arretieren in G2/M. C3-Zellen (a), C33a-Zellen (b), CEM-T4-Zellen (c) und TC1-Zellen (d) wurden drei Tage lang in einem Medium gezüchtet, das entweder 1 % DMSO oder 1 % DMSO mit M₄N (M₄N) enthielt. Die Zellen wurden trypsiniert, mit Ethanol fixiert, mit Propidiumiodid gefärbt und danach durch Durchflusszytometrie analysiert. Die Daten sind als Anzahl an Zellen (3–5 × 10⁴ Gesamtzellen) versus Propidiumiodid-Färbungsintensität angegeben. Die dargestellten Phasen des Zellzyklus sind markiert und entsprechen dem relativen zellulären DNA-Komplement, bestimmt durch die Färbungsintensität.
11. Mit 40 µM M₄N behandelte C3-Zellen weisen G2-Zellstrukturen auf. C3-Zellen wurden drei Tage lang auf Deckgläsern in einem Medium gezüchtet, das entweder 1 % DMSO (Kontrolle) oder 1 % DMSO mit 40 µM M₄N (M₄N) enthielt. Die Proben wurden mit Ethanol fixiert und mit Antikörpern gegen α- (grün) und γ-(oran ge) Tubulin (a) oder mit der DAPI-DNA-Färbung (b) inkubiert. Die Zellen wurden durch Fluoreszenzmikroskopie untersucht.
12. CDC2 und virale Onkogene werden durch M₄N reduziert. C3-Zellen wurden unterschiedlich lange (Zeiten sind in Stunden angegeben) in einem Medium gezüchtet, das entweder 1 % DMSO (D) oder 1 % DMSO mit 40 µM M₄N (M) enthielt. Nach der angegebenen Zeit wurde Gesamtprotein oder Gesamt-RNA aus den Zellen isoliert. Western-Blots (a – obere zwei Tafeln) wurden unter Einsatz von Antikörpern gegen CDC2 oder Cyclin B mit dem gleichen Nitrocellulosefilter durchgeführt. Kinase-Tests (a – untere zwei Tafeln) wurden durchgeführt, und zwar nach einer Immunfällung mit Antikörpern gegen Cyclin B, durch Inkubation mit γ-³²P-ATR und Histon H1. Die Coomassie-Färbung des PAGE-Gels ist als Kontrolle für die Beladung enthalten. Kinase-Tests für 24 und 72 Stunden dauernde Arzneimittelbehandlungen wurden separat durchgeführt.
Northern-Blots (b) wurden auf Gesamt-RNA-Extrakten durchgeführt. Filter wurden über Nacht mit zufallsgeprimter ³²P-markierter DNA für CDC2 oder GAPDH inkubiert, gewaschen und drei Tage lang einem Film ausgesetzt. Der gleiche Filter wurde verwendet, um CDC2- und GAPDH-RNA zu testen.
Eine rtPCR-Analyse (c) wurde auf Gesamt-RNA-Extrakten mit Primern durchgeführt, die an Regionen innerhalb entweder HPV-16-E7 oder GAPDH hybridisieren. Beide Primerpaare wurden in den gleichen Reaktionen eingesetzt, und die Produkte wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert.
13. Gel-Retentionanalysen (EMSA) der G₄N-Wechselwirkung mit den HIV-Sp1-Bindungsstellen (–87 bis –49). (A) G₄N-Hemmung von Sp1-167D-Bindung an ³²P-markierte HIV-Sp1-DNA-Matrize. Spur 1, Matrize alleine; Spur 2, Matrize plus 0,1 µg Sp1-167D; Spuren 3–9, mit steigenden Konzentrationen G₄N inkubierte Matrize (0,25 bis 1,75 mM vor dem Zusatz von 0,1 µg Sp1-167D. (B) G₄N-Verdrängung von an eine HIV-Matrize gebundenem Sp1-167D. Spur 1, Matrize alleine; Spur 2, Matrize plus 0,1 µg Sp1-167D plus 100fachem Überschuss an unmarkierter Matrize; Spur 3, Matrize plus 0,1 µg Sp1-167D; Spuren 4–10, mit steigenden Konzentrationen G₄N provozierter Sp1/DNA-Komplex (0,25 bis 1,75 mM); Spur 11, in einem 1,75 mM G₄N enthaltendem Reaktionspuffer inkubierte Matrize. (C) Sp1-167D-Verdrängung von an eine Matrize gebundenem G₄N. Spur 1, Matrize alleine; Spuren 2–4, Matrize plus steigende Mengen Sp1-167D (0,075, 0,150, 0,300 µg); Spuren 5–8, in einem 1,2 mM G₄N enthaltendem Reaktionspuffer inkubierte Matrize, gefolgt von einer Provokation mit steigenden Mengen Sp1-167D (0,075, 0,150, 0,300 µg), Spur 8 ohne Sp1-167D. (D) Diagramm der Verringerung von Sp1-167D/DNA-Komplex-Bandenintensitäten als Reaktion auf steigende Konzentrationen von G₄N in (A) -•- und (B) -•-. Die verwendeten Gele waren 5 % nichtdenaturierendes Polyacrylamid, wobei jede Spur 5 µl der einzelnen Reaktionsvolumina erhielt, wie im experimentellen Teil und in [1] beschrieben ist.
14. Hemmung von HIV-Tat-regulierter Transaktivierung in Cos-Zellen durch G₄N.
15. SIV-Produktion mit der Gegenwart von G₄N. 10⁷ 174 × Zellen wurden mit einer 24-h-Erntestammlösung von SIV-mac-239 (4 ng p27) zwei Stunden lang bei 37 °C vermischt. Die Zellen wurden resuspendiert, und 1 × 10⁵ Zellen in 100 µl Medium wurden zu den einzelnen Wells von drei 96-Well-Platten zugesetzt. Verschiedene Konzentrationen von G₄N aus einer frisch hergestellten Stammlösung wurden vorbereitet und zu jedem der sechs vorbereiteten Wells zugesetzt. Kulturüberstände wurden nach vier und acht Tagen für eine Virusproduktionsanalyse entnommen. Die Virusproduktion wurde durch einen modifizierten p27-Capsid-Protein-Antigen-Einfang-ELISA untersucht, wie im experimentellen Teil beschrieben ist.
16. Hemmung von HIV-p24-Antigenproduktion in H9-Zellen durch G₄N. Die prozentuelle Hemmung wurde berechnet, indem p24-Werte von einem Mittel aus zwei Duplikatkulturen von G₄N-behandelten und nichtbehandelten H9-Zellen 9 Tage nach der Virusinfektion mit einem AZT-resistenten HIV-Stamm, HIV-1 RTMF, verglichen wurden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Versuchsverfahren:
NDGA-Derivate wurden chemisch synthetisiert (15). Die Zelllinie C3 ist eine transformierte Zelllinie aus HPV16E + L plus aktiviertem Ras mit C57-BL/6kh-Ursprung, bereitgestellt von W. Martin Kast vom Loyola University Medical Center, Chicago, Illinois, USA. Sie wurde wie von Greenstone et al. (21) und Feltkamp et al. (22, 23) beschrieben gehalten und kultiviert.
Synthese von G₄N:
Standardverfahren für die Herstellung von meso-1,4-Bis[3,4-(dimethylaminoacetoxy)phenyl]-(2R,3S)-dimethylbutanhydrochloridsalz-N,N-dimethyltetraglycinyl-NDGA, G₄N. Zu einer Dichlormethanlösung (250 ml), die NDGA (12,8 g, 42,3 mmol, 1,0 Äqu.) und N,N-Dimethylglycin (26,2 g, 254 mmol, 6,0 Äqu.) enthielt, wurden DDC (52,4 g, 254 mmol, 6,0 Äqu.) und DMAP (2,32 g, 18,9 mmol, 1,0 Äqu.) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurden 24 h lang unter Stickstoff bei Raumtemperatur gerührt. Nachdem das Reaktionsgemisch abfiltriert worden war, wurde die Lösung unter reduziertem Druck eingeengt. Aceton (250 ml) wurde anschließend zum Reaktionskolben zugesetzt, und durch die Lösung wurde überschüssiges HCl(g) durchperlen gelassen. Der wasserlösliche Niederschlag wurde in H₂O gelöst und erneut zweimal bei Raumtemperatur aus Aceton ausgefällt, um (1) (29,2 g, 36,8 mmol) als weißen Feststoff in einer Ausbeute von 87 % zu erhalten. Protonen-NMR-Spektren wurden auf einem Spektrometer Unity-400 von Varian (400 MHz) unter Einsatz eines D₂O-Lösungsmittels und TSP als internem Standard erhalten. Kohlenstoff-13-NMR-Spektren wurden auf einem Spektrometer Unity-400 von Varian (400 MHz) unter Verwendung von D₂O als Lösungsmittel erhalten. Chemische Kohlenstoff-13-Verschiebungen sind bezogen auf das TSP-Singulett (δ 0,0 ppm) bezogen.
Die Synthese ist in Schema 1 dargestellt. Schema 1
Allgemeines Verfahren. Alle Reaktionen wurden, sofern nicht anders angegeben, in ofengetrockneten Glasgeräten (120 °C) unter Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Aceton, Dichlormethan, 1,4-Dioxan, Ethylacetat, Hexane und Tetrahydrofuran wurden von Mallinckrodt Chemical Co. bezogen. Aceton wurden mit 4A-Molekularsieben getrocknet und destilliert. Dichlormethan, Ethylacetat und Hexane wurden getrocknet und aus CaH₂ destilliert. 1,4-Dioxan und Tetrahydrofuran wurden durch Destillation aus Natrium und Benzophenon unter Stickstoffatmosphäre getrocknet. Nordihydroguaiaretinsäure wurde von Fluka Chemical Co. bezogen. N,N'-Dicyclohexylcarbodümid (DCC), 4-Dimethylaminopyridin (DMAP), Morpholin, Triethylamin und Kaliumcarbonat wurden von Merck Inc. bezogen. 1-Brom-3-Chlorpropan, N,N-Dimethylglycin und Methyldichlorphosphat wurden von Aldrich Chemical Co. bezogen.
Eine analytische Dünnschichtchromatographie (DC) auf vorbeschichteten Platten (Silicagel 60 F-254) von Merck Inc. wurde durchgeführt. Gaschromatographische Analysen wurden auf einem Instrument der Hewlett-Packard-5890-Serie II durchgeführt, das mit einer 25 m langen Methylsilicongummi-Kapillarsäule (0,32 mm ID) ausgestattet war. Stickstoffgas wurde als Trägergas eingesetzt, und die Durchflussgeschwindigkeit wurde konstant bei 14,0 ml/min gehalten. Die Retentionszeit t_R wurde unter folgenden Bedingungen gemessen: Injektortemperatur 260 °C, isotherme Säulentemperatur 280 °C. Gaschromatographische und niedrigauflösende massenspektroskopische Analysen wurden auf einem Instrument der Hewlett-Packard-5890-Serie II durchgeführt, das mit einem massenselektiven Hewlett-Packard-5791A-Detektor und einer HP-1-Kapillarsäule ausgestattet war. Trennungen wurden durch Mitteldruck-Flüssigkeitschromatographie (MPLC) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 120 ml/h unter Einsatz einer intelligenten HPLC-Pumpe Jasco Modell 880-PU durchgeführt. Das MPLC-Packungsmaterial, Reversed Phase Silica Gel C18 (Teilchengröße 0,035–0,070 mm), wurde von Knauer Co. bezogen. Eine Reinigung durch Schwerkraftsäulenchromatographie wurde unter Einsatz von Merck Reagents Silica Gel 60 (Teilchengröße 0,063–0,200 mm, 70–230 Mesh ASTM) durchgeführt.
Infrarotspektren (IR) wurden auf einem FT-IR-Spektrometer der Bomem Michelson Serie gemessen. Die angegebenen Wellenzahlen beziehen sich auf die Polystysrol- Absorption bei 1601 cm^-1. Absorptionsintensitäten sind mithilfe der folgenden Abkürzungen angegeben: s, stark, m, mittel, w, schwach. Protonen-NMR-Spektren wurden auf einem Spektrometer Unity-400 von Varian (400 MHz) unter Einsatz von D₂O als Lösungsmittel und 3-(Trimethylsilyl)propionsäurenatriumsalz als internem Standard erhalten. Kohlenstoff-13-NMR-Spektren wurden auf einem Spektrometer Unity-400 von Varian (100 MHz) unter Einsatz von D₂O als Lösungsmittel erhalten. Chemische Kohlenstoff-13-Verschiebungen sind auf das Zentrum des Singuletts des Natriumsalzes von 3-(Trimethylsilyl)propionsäure (δ 0,0 ppm) bezogen. Multiplizitäten sind mithilfe der folgenden Abkürzungen angegeben: s, Singulett, d, Duplett, t, Triplett, q, Quartett, m, Multiplett, J, Kupplungskonstante (Hertz). Hochauflösende Massenspektren wurden mithilfe eines Massenspektrometers JEOL JMS-HX110 erhalten.
meso-1,4-Bis[3,4-(dimethylaminoacetoxy)phenyl]-(2R,3S)-dimethylbutanhydrochloridsalz (2). Zu einer Lösung von NDGA (1, 12,81 g, 42,37 mmol, 1,0 Äquiv.) und N,N-Dimethylglycin (26,21 g, 254,2 mmol, 6,0 Äquiv.) in Dichlormethan (250 ml) wurden DCC (52,45 g, 254,2 mmol, 6,0 Äquiv.) und DMAP (5,176 g, 42,37 mmol, 1,0 Äquiv.) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurden 24 h lang bei Raumtemperatur unter Stickstoff gerührt. Nachdem Dicyclohexylharnstoff aus dem Reaktionsgemisch abfiltriert worden war, wurde die resultierende Lösung unter reduziertem Druck eingeengt. Aceton (250 ml) wurde dann zum Rückstand zugesetzt, und durch die resultierende Lösung wurde überschüssiges HCl(g) durchperlen gelassen. Der Niederschlag wurde in Wasser gelöst und erneut zweimal unter Einsatz von Aceton bei Raumtemperatur ausgefällt, um 2 (28,97 g, 36,86 mmol) als weißen Feststoff in einer Ausbeute von 87 % zu erhalten: ¹H-NMR (D₂O, 400 MHz) δ 0,78 (d, J = 6,0 Hz, 6 H, 2 × CH₃), 1,73 (m, 2H, 2 × CH), 2,38 (dd, J = 13,2, 9,6 Hz, 2H, 2 × ArCH), 2,78 (dd, J = 13,2, 4,4 Hz, 2H, 2 × ArCH), 3,03 (s, 24H, 8 × CH₃N), 4,53 (s, 8H, 4 × CH2N), 7,22 (m, 4H, 4 × ArH), 7,29 (d, J = 8,4 Hz, 2H, 2 × ArH); ¹³C-NMR (D₂O, 100 MHz) δ 18,11, 40,82, 41,73, 46,75, 59,59, 125,79, 126,58, 131,63, 140,66, 142,47, 146,11, 167,84; IR (KBr) 3461 (br), 2963 (m), 1777 (s, C=O), 1620 (m), 1478 (m), 1377 (m), 1210 (m), 1106 (m), 961 (w), 852 (w) cm^-1; MS (FAB) von (2–4 HCl) m/z (relative Intensität) 643 (M+, 30), 600 (20), 558 (43), 515 (20), 473 (42), 430 (13), 388 (26), 185 (18), 93 (38), 58 (100), 44 (22); HRMS (FAB) von (2–4 HCl) ber. für C₃₄H₅₀N₄O₈ 642,3628, gef. 642,3614; Anal. ber. für C₃₄H₅₄N₄O₈Cl₄: C, 51,78; H, 6,90; N, 7,10; O, 16,23, Gef.: C, 51,70; H, 6,85; N, 7,05; O, 16,21.
Es versteht sich, dass durch jede geeignete Substitution von anderen N,N-Dimethylsubstituierten Aminosäuren weitere Aminosäure-substituierte Verbindungen der Erfindung synthetisiert werden können.
Beispiel 1
Wirkung von M₄N und verschiedenen anderen NDGA-Derivaten auf SP1-regulierte HPV-E₆/E₇-Promotoraktivität.
Die Wirkung von M₄N und verschiedenen anderen NDGA-Derivaten auf SP1-regulierte HPV-E₆/E₇-Promotoraktivität wurde unter Einsatz von Luciferase als Reporter untersucht. Der Test hängt von der DNA-Transfektion der HPV16-LCR (P₉₇-Promotor), die an das Luciferase-Reportergen fusioniert ist, in C33A-Zellen durch Calciumphosphatverfahren ab. C33A ist eine Zervixtumor-Zelllinie (ATCC-Zugangsnr. HTB-31), die keine integrierte HPV-DNA aufweist, aber Transkriptionsfaktoren besitzt, die für eine störungsunempfindliche Expression des frühen HPV-Genpromotors erforderlich ist. Einen Tag nach der DNA-Transfektion wurden verschiedene Arzneimittelkonzentrationen, die mithilfe von Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst worden waren, zu den Zellen zugesetzt. Dreißig Stunden nach der Arzneimittelbehandlung (sodass der Test innerhalb der herkömmlichen achtundvierzig Stunden für Experimente mit vorübergehender Transfektion abgeschlossen werden kann) wurden die Zellen lysiert, und die spezifische Luciferaseaktivität wurde bestimmt (Luciferase Assay Systems, Promega, US-Patent Nr. 5.283.179). Als die M₄N-Arzneimittelkonzentration erhöht wurde, nahm die spezifische Luciferaseaktivität ab.
Die (in 2 dargestellten) Ergebnisse zeigen, dass M₄N Sp1-regulierte Transkriptionsinitiation am HPV-E₆/E₇-Promotor im Luciferase-Test deutlich verringerte.
Beispiel 2
Hemmung von E₆/E₇-mRNA-Synthese nach einer M₄N-Behandlung.
Die Hemmung einer E₆/E₇-mRNA-Synthese nach einer M₄N-Behandlung wurde durch RT-PCR in der Zervix-Zelllinie C₃ gemessen. Eine relative RT-PCR wurde mit Mengen an zellulärer Gesamt-RNA durchgeführt, die gegenüber den gezählten Zellzahlen standardisiert wurden. Das RT-PCR-Produkt wurde auf einem 2 % Agarosegel analysiert. Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt. Die RT-PCR-Ergebnisse zeigten, dass amplifizierte cDNAs mit der erwarteten Größe für E7 (321 bp) und E6 (204 bp) in den DMSO-behandelten Zellen schon im 22. Amplifikationszyklus detektiert werden können. Die gleichen Produkte waren in den arzneimittelbehandelten RNA-Extrakten nach 30 Amplifikationszyklen kaum nachweisbar. Keine amplifizierten Produkte wurden für die PCR-Kontrolle ohne Matrize oder in der Gesamt-RNA-Extrakten der HPV16-negativen C33a-Zelllinie nachgewiesen.
Beispiel 3
Hemmung von Zervix-C3-Zellwachstum durch M₄N-Behandlung.
HPV-16-transformierte unsterbliche Mausepithelzellen (C3-Zellen) wurden mit einer Dichte von 10⁵ Zellen pro Phiole ausplattiert. Nach 24 Stunden wurde zur Hälfte der Phiolen ein Wachstumsmedium zugesetzt, das 40 µM in 1 % DMSO gelöstes M₄N enthielt, während zur anderen Hälfte ein Wachstumsmedium zugesetzt wurde, das nur 1 % DMSO enthielt. Die Ergebnisse sind in 4A dargestellt. Innerhalb von 24 Stunden wurde ein Unterschied in der Zellmorphologie zwischen arzneimittelbehandelten und Kontroll-C3-Zellen beobachtet. Das Wachstum und die Teilung der arzneimittelbehandelten Zellen wurde im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle deutlich verringert, während der Anteil von lebensfähigen Zellen im Vergleich zur Gesamtzellzahl konstant blieb, sowohl bei den arzneimittelbehandelten als auch bei den DMSO-Kontrollzellen. Dies weist darauf hin, dass M₄N die Zellteilung drastisch reduziert.
Die Wirkung auf das C3-Wachstum nach der Entfernung von M₄N aus dem Medium wurde ebenfalls untersucht. C3-Zellen wurden mit einer Dichte von 10⁴ Zellen pro Phiole ausplattiert. Zum Zeitpunkt 0 wurde zu 2/3 der Phiolen ein Wachstumsmedium zugesetzt, das mit 40 µM M₄N in 1 % DMSO ergänzt war. Zu den restlichen Phiolen wurde ein Wachstumsmedium zugesetzt, das nur 1 % DMSO enthielt. Nach 73 Stunden wurde die Hälfte der Phiolen, bei denen M₄N zum Wachstumsmedium zugesetzt worden war, gewaschen, und ein Medium, das nur 1 % DMSO enthielt, wurde zugesetzt. Die anderen 2/3 der Zellphiolen wurden gewaschen, und das Medium wurde durch das gleiche Medium wie vorher ersetzt. Die Ergebnisse, die in 4B dargestellt sind, zeigen, dass die Geschwindigkeit des Zellwachstums in der M₄N-behandelten Probe nach dem Wechsel zum arzneimittelfreien Medium nicht nennenswert gesteigert wurde, was zeigt, dass M₄N die Zellteilung weiterhin signifikant reduziert, auch nachdem es aus der extrazellulären Umgebung entfernt wurde.
Beispiel 4
Analyse der zellulären Genexpression in C3-Zellen vor und nach 72 h Arzneimittelbehandlung.
Die Genexpression wurde anhand von Test aus 9600 Genen untersucht (5). Jeweils fünf Mikrogramm Poly-A⁺-RNA von 72 h lang M₄N-behandelten (40 µm) (C₃ M₄N) und nichtbehandelten (C₃ DMSO) wurden in einem Anordnungspaar von 9600 menschlichen Genen für eine Hybridisierungsstudie gemäß dem in Genomics 51, 313–324 (1998), beschriebenen Verfahren eingesetzt. Das Hybridisierungsbild wurde mithilfe einer Farbvideokamera mit einer 55-mm-AF-Mikro-Niko-Linse von Nikon eingefangen und mithilfe eines Macintosh-LC630-Computers digitalisiert. Solch eine Detektion mittels Enzymsubstratreaktion von farbbildenden Enzymen in entweder einem Einfarben- oder einem Zweifarbenmodus ist reproduzierbar und äußerst empfindlich (es können < 5 Kopien eines Transkripts pro Zelle mit RNAs von 10⁷ Zellen detektiert werden).
Die Computerausdrucke, die unterschiedlich exprimierte Gene (C₃ M₄N/C₃ CMSO > 10 und C₃ DMSO/C₃M₄N > 10) zeigen, wurden in eine Untersuchungsliste eingetragen. Bilddateien im TIFF-Format und Dateien im MS-Excel-Format werden auf einer ZIP-Diskette gespeichert. Gennamen und Klon-ID-Nummern sind verfügbar, um Bild-Klone für eine spätere Northern-Blot-Bestätigung zu erhalten.
Von einer Gruppe von Genen, die 72 h nach einer M₄N-Behandlung entweder hochreguliert oder herabreguliert sind, hängen die folgenden spezifisch mit der Zellteilung und der Apoptose zusammen. Verschiedene andere mit dem Zellzyklus zusammenhängende Gene sind als Reaktion auf M₄N ebenfalls stark hochreguliert. Zusätzlich zur Cyclin-abhängigen Kinase CDC2 (Beispiel 11) beispielsweise:

Steigerung

Inhibitor von Cyclin-abhängiger Kinase (100×)

Apoptose-(APO-1-)Antigen (100×)

Todesdomäne Drei DR₃ (100×)

Ras-bezogenes Protein RAP-1 (60×)

Human-MAP-Kinase (40×
Die folgenden mit dem Zellzyklus zusammenhängenden Gene sind als Reaktion auf M₄N stark herabreguliert:
Zu früheren Zeitpunkten, wie z.B. eine Stunde nach der Arzneimittelbehandlung, waren die E₆/E₇-Werte ähnlich wie die der Kontrollzellen, während nach 4,5 h E₆/E₇ durch RT-PCR nicht länger nachweisbar waren (39). Genexpressionen mit 9600- Gen-Tests können mit RNA wiederholt werden, die aus diesen kurz behandelten Zellen (1 Stunde und 5 Stunden) isoliert wurden, um die anfänglichen zellulären Wirkungen des Arzneimittels noch genauer zu bestimmen.
Beispiel 5
Targeting von C3-Tumorwachstum in Mäusen durch lokale Injektion von M₄N.
Sechsunddreißig C57bl-16-NCR-Mäusen wurden zwischen den Schultern 5 ×10⁵ C3-Zellen in den Rücken injiziert. Vierundzwanzig der Mäuse entwickelten innerhalb von 20 Tagen Tumoren. Eine tägliche Injektion (50μl–100 µl M₄N oder M₄N/G₄N) (200 mg/ml M₄N in DMSO, 200 mg/ml G₄N in PBS) zeigte eine deutliche Auswirkung auf das Tumorwachstum in den Tieren, wie in Tabelle 1 und 2 sowie in 6 und 7 zu sehen ist. Tabelle 1. M₄N- und G₄N-Wirkung auf das Wachstum von einzelnen in Mäusen entwickelten Tumoren

* DMSO = Vehikel für das Arzneimittel
** Am Tag 15 entnommen
*** Läsionen enthielten hauptsächlich Nekrosezellen, wie sie auch in Läsionen von Maus 6, 7, 11, 14, 15, 17, 19, 21, 28, 29 zu finden waren (6, 7). In Maus Nr. 11 und Nr. 22 waren nach den Arzneimittelbehandlungen keine Läsionen mehr vorhanden. In den Kontrollmäusen Nr. 1, 2, 3, 4 gefundene Tumoren enthielten wachsende Zellen (2).

Versuchsverfahren:
36 C57bl-16NCR-Mäusen wurden 5 × 10⁵ C3-Zellen/Maus injiziert. Die Injektionen umfassen 100 µl, die zwischen den Schultern subkutan in den Rücken injiziert wurden. Die Zellen wurden in salzarmen HBSS suspendiert, und die Gleichförmigkeit der Suspension wurde durch vorsichtiges Verwirbeln aufrechterhalten.
24 Mäuse entwickelten Tumoren. Die Größe der Läsionen wurde mithilfe einer Schublehre gemessen. Diese Mäuse wurden rasiert, gewogen, und dann wurde die Behandlung begonnen (Tag 1). Vier Mäuse wurden als Kontrolle abgesondert. Die Kontrollmäuse erhielten 50 µl DMSO, das täglich intratumoral injiziert wurde. Versuchsmäuse (10) erhielten 50 µl M₄N, das in DMSO gelöst war (200 mg/ml). Zusätzliche 10 Mäuse erhielten 8 Tage lang M₄N-Behandlungen, gefolgt von täglichen G₄N-Behandlungen (50 µl, 200 mg/ml in PBS) 8 Tage lang. Injektionen wurden in unterschiedlichen Regionen eines Tumors vorgenommen. Vor einer Injektion wurden die Mäuse mit Ether oder Metaphan anästhesiert. Tabelle 2. M₄N- und G₄N-Wirkung auf das Wachstum von behandelten Läsionen in Mäusen mit mehreren Tumoren

* Arzneimittel in DMSO wurde direkt in die Tumorregionen injiziert
** von benachbarten Tumoren ohne Arzneimittel

₄

Weibliche C57BL-16NCR-Mäuse vom NCl wurden in diesem Versuch verwendet. N,N-Dimethyltetraglycinyl-NDGA (G₄N) wurde jeden Tag frisch in Konzentrationen von 75 mg/ml in PBS hergestellt. Injektionen von 0,05 ml für Gruppe 1, 0,1 ml für Gruppe 2 und 4 und 0,2 ml für Gruppe 3 pro Behandlung wurden über einen Zeitraum von 6 Tagen vorgenommen. Die Versuche dauerten sieben Tage. Das Körpergewicht wurde vor und nach sechs Injektionstagne bestimmt. Während des Versuchszeitraums traten keine signifikanten Gewichtsänderungen auf.
Alle behandelten Mäuse, Kontroll- (Mäuse Nr. 1–4) und Versuchsmäuse (Mäuse Nr. 6, 7, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16, 17 M₄N, Nr. 18–22, 24, 26–29 M₄N/G₄N), wiesen Schwellungen auf. Die Größe der Läsionen wurde mithilfe einer Schublehre bestimmt. Einige Mäuse wiesen aufgrund der Injektion leichte Blutungen auf. Das Behandlungsschema und die Ergebnisse waren wie folgt:
Tag 10: Die Mäuse wurden erneut gewogen. Alle Mäuse wiesen eine Zunahme von bis zu 2 Gramm auf.
Tag 12: Keine Behandlungen.
Tag 13: Alle Mäuse wiesen Hauterhöhungen auf, aber unterschiedlich stark. Die Haut einer M₄N-behandelten Maus (Nr. 7) sprang auf und der „ausgetrocknete Tumor" fiel heraus.
Tag 14: Das Injektionsvolumen wurde auf 100 µl erhöht.
Tag 15: Eine M₄N-behandelte Maus (Nr. 17) starb aufgrund einer überdosierten Anästhesie/der Handhabung. Die Haut an der Läsionsstelle von Nr. 17 war aufgeris sen, und der „ausgetrocknete Tumor" war zu sehen. Diese wurde seziert, und die Läsion wurde exzisiert und gewogen.
Tag 16: Vier weitere M₄N-behandelte Mäuse (Nr. 6, 14, 15, 16), drei M₄N/G₄N-behandelte Mäuse (Nr. 19, 21, 28) und eine Kontrollmaus (Nr. 2) wurden getötet, seziert und gewogen. Die restlichen Kontrollmäuse (Nr. 1, 3, 4) wurden nichtinvasiv untersucht und wiesen Tumoren auf.
Tag 21: Die Tumorgrößen der Kontrollmäuse wurden mithilfe einer Schublehre gemessen. Beobachtung: Die Haut an den Läsionsstellen der Mäuse Nr. 10 und Nr. 12 (M₄N-behandlete Regionen) war aufgerissen, und der „ausgetrocknete Tumor" war zu sehen.
Tag 24: Die Haut von Maus Nr. 7 hatte sich vollkommen erholt. Das Experiment wurde an diesem Tag beendet. Alle restlichen Mäuse, M₄N-behandelt (Nr. 7, 9, 10, 11, 12) und M₄N/G₄N-behandlet (Nr. 18, 20, 24, 26, 29) wurden getötet, seziert, untersucht und gewogen.
Die Auswirkungen von M₄N und M₄N/G₄N auf das C3-Tumorwachstum in Mäusen sind in Tabelle 1 und 2 sowie in 5 und 6 zusammengefasst. Tabelle 1 zeigt die Arzneimittelwirkung auf das C3-Zellwachstum in Mäusen mit einem einzelnen Tumor. Das mittlere Gewicht von vier exzisierten Tumoren der Kontrollgruppe betrug 1,48 g, während das Gewicht der Läsionen von M₄N-behandelten und M₄N/G₄N-behandelten Mäusen 0,142 bzw. 0,51 g betrug. Arzneimittelbehandelte Läsionen bestanden hauptsächlich aus ausgetrockneten Nekrosezellen (6). Tumoren von der Kontrollgruppe sahen homogen aus und enthielten aktiv wachsende Zellen. Tabelle 2 zeigt die Arzneimittelwirkung auf das C3-Tumorwachstum in Mäusen mit mehreren Tumoren. In dieser Untersuchung wurde ein Arzneimittel in einen der Tumoren injiziert. Das mittlere Gewicht der unbehandelten Tumoren war 1,77 g, während das der M₄N-behandleten Läsionen 0,15 g betrug. Ähnliche Ergebnisse wurden nach einer M₄N/G₄N-Injektion erhalten – das mittlere Gewicht von unbehandelten Tumoren betrug 1,27 g, während das der arzneimittelbehandelten Läsionen nur 0,103 g betrug.
Die Körpergewichtsänderungen aller Mäuse während des gesamten Versuchszeitraums erschienen nicht signifikant (Tabelle 1 und 2).
Beispiel 6
Arzneimittelbehandelte (M₄N) und mit einem DMSO-Vehikel behandelte oder unbehandelte Tumoren (CON) von zwei Gruppen von Mäusen wurden für eine histopathologische Untersuchung vorbereitet. Die exzisierten Tumoren wurden sofort fixiert und dann in 4 % Formaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelagert. Das fixierte Gewebe wurde anschließend durch eine abgestufte Reihe von Alkoholen und Xylol dehydratisiert und in Paraffin eingebettet. Die Paraffingewebeblöcke wurden dünn geschnitten und für eine mikroskopische Analyse mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Histopathologische Untersuchungen zeigten, dass die Kontrolltumoren durch die DMSO-Behandlung nicht beeinflusst wurden und weiter wuchsen. Sie weisen das hohe Kern/Zytoplasma-Verhältnis, pleomorphe Kernänderungen, hohe Mitosezahlen, spindelartige Sarkomformen und eine Infiltration in das umliegende Gewebe auf, wie dies für Krebszellen charakteristisch ist.
Im Gegensatz dazu hörten jene Tumoren, die eine M₄N-Behandlung erfuhren, bald nach Beginn der Behandlung zu wachsen auf. Sie wiesen eine signifikante Nekrose auf und waren nicht länger lebensfähig. Bei einer stärkeren Vergrößerung ist eine kleine Menge Arzneimittelniederschlag erkennbar, und fokale Bereiche weisen eine chronische Entzündung und Fibrose auf. Diese Heilwirkung führt zur Abstoßung dieser abgestorbenen Tumorzellen in diesem Bereich. Bei einer M₄N/G₄N-Behandlung werden die gleichen Ergebnisse erhalten wie bei einer Behandlung mit M₄N alleine. Da G₄N jedoch wasserlöslich ist, kann es sich in einen größeren Bereich des Tumors ausbreiten als M₄N. Es ist zu erwarten, dass G₄N, wenn es synergistisch mit M₄N eingesetzt wird, bei der Behandlung von größeren Tumoren (d.h. größer als 2 cm³) wirksamer ist.
Beispiel 7
Wirkung von M₄N auf HSV-1-Hautinfektionen bei Meerschweinchen.
Das Arzneimittel M₄N wurde auch in Bezug auf die Hemmung von HSV-1-Replikation bei Hautinfektionen in Meerschweinchen getestet. Meerschweinchenhaut wurde mit Nadeln durchstocken, und HSV-1-Suppression wurde topisch angewandt, um die einzelnen punktierten Bereiche zu infizieren. Nach der Infektion wurde 6 Tage lang M₄N täglich auf den punktierten Infektionsbereich aufgetragen.
Sechs Bereiche nackter Haut auf dem Rücken eines Meerschweinchens wurden steril mit einer 5=DIN-Nadel durchstochen. Zwei Bereiche wurden mit HSV-1 (HSV-C, Kulturüberstand oder isoliertes HSV in Kochsalzlösung, HSV-SC) infiziert. Die anderen vier Bereiche wurden mit HSV-SC infiziert. Fünfzehn Minuten nach der Infektion wurden 30 µl Testverbindungen (ABDS₁, ABDS₂, ACV und M₄N (4N) in 60 mg/ml DMSO) auf die einzelnen punktierten Infektionsbereiche aufgetragen, und zwar fünfmal pro Tag 6 Tage lang. ABDS₁ und ABDS₂ wurden als negative Kontrollen inkludiert. Das Foto in 8 wurde am Tag 6 gemacht und zeigt das Ausmaß der HSV-1-Replikation in Abwesenheit von Arzneimitteln (HSV-C, HSV-SC), in Gegenwart von unwirksamen Arzneimitteln (HSV-ABDS₁, HSV-ABDS₂) und in Gegenwart von wirksamen Arzneimitteln (HSV-M₄N und HSV-ACV). Es ist zu sehen, dass sich in den mit HSV-C, HSV-SC, HSV-ABDS₁, HSV-ABD₂ behandelten Bereichen sechs große konfluierende Blasen bildeten, während in infizierten Bereichen nach M₄N-(4N) und ACV-Behandlungen keine Blasen erkennbar waren.
Eindeutige Ergebnisse, dass M₄N HSV-Replikation blockieren kann, wurden in diesem Modellsystem erhalten, wie durch das Verschwinden der Hautläsionen und das Fehlen einer Ausbreitung des Virus 4 Tage nach der Arzneimittelbehandlung gezeigt wurde. Anfängliche Tierstudien zeigten außerdem, dass M₄N in Konzentrationen von bis zu 300 mg/kg, wenn es intraperitoneal verabreicht wird, und bis zu 375 mg/kg, wenn es entweder subkutan oder durch IV verabreicht wird, für Mäuse nichttoxisch ist (Tabelle 3) (6).
Beispiel 8
M₄N für eine klinische Behandlung unter Verwendung einer In-situ-Injektion.
Die Verabreichung von M₄N direkt in Tumoren als Arzneimittel-Zufuhrweg bringt mehrere deutliche Nachteile mit sich. 1) M₄N ist eine hydrophobe Verbindung und in DMSO äußerst gut löslich (200 mg/ml). Deshalb ist nur ein geringes Volumen der Arzneimittellösung für eine Injektion erforderlich, um eine wirksame Dosierung des Arzneimittels zu erreichen. In der in Beispiel 5 beschriebenen Studie an Mäusen reicht eine tägliche Injektion von 50 µl bis 100 µl über mehrere Tage aus, um das Tumorwachstum in den Mäusen vollständig zu stoppen. Es gab eine Reihe von vorangegangenen Studien über die Verwendung von größeren Dosen (30 ml IV pro Behandlung) DMSO zu Behandlung von Erkrankungen (24). Die Ergebnisse waren nicht überzeugend (25). Da jedoch in der Vergangenheit große Mengen DMSO an Millionen Menschen weltweit getestet wurden, scheint es, dass DMSO ein sicheres Vehikel zur Arzneimittelzufuhr sein sollte, wenn nur ein geringes Volumen davon eingesetzt wird (26). 2) Durch eine In-situ-Injektion bleibt der Großteil des Arzneimittels unlöslich und in den Tumorbereichen konzentriert und tritt nicht in das Kreislaufssystem ein, wodurch eine Toxizität für den gesamten Körper vermieden wird. Außerdem ist, da genug Arzneimittel im Tumor verbleibt, um sein Wachstum zu unterdrücken, eine kontinuierliche Injektion des Arzneimittels nach relativ wenigen Behandlungen unnötig. In der in Beispiel 5 beschriebenen Studie an Mäusen starben die Tumorzellen auch nach Einstellung der M₄N-Injektionen noch weiter ab. Wenn also ein Arzneimittel direkt gerichtet ist, wird die Tumorgröße der bestimmende Faktor für die erforderliche Arzneimittelmenge, die verabreicht werden muss. Der Unterschied zwischen dem Gesamtkörpergewicht eines Menschen und einer Maus wird irrelevant. In den Maus-Tumorstudien waren 20 mg/Tag über 10 Tage mehr als genug, um Tumoren zu eliminieren. Es sollte keinen Grund für die Verwendung einer höheren Dosis als diese bei der Behandlung eines menschlichen Tumors mit vergleichbarer Größe (1–1,5 cm³) geben. Dies sollte das Risiko in Versuchen an Menschen deutlich reduzieren.
Beispiel 9
Eine M₄N-Behandlung von Zellen blockiert die zelluläre Proliferation.
Vorangegangene Forschungsarbeiten der Anmelder an M₄N haben gezeigt, dass es virale Transkription durch Deaktivierung von Sp1-abhängigen Promotoren hemmen könnte. Viele Säugetier-Zellzyklusgene enthalten auch wesentliche Sp1-Promotoren, und M₄N kann folglich ihre Transkription hemmen. Diese Hypothese wurde geprüft, indem die antiproliferative Wirkung von M₄N auf eine Reihe von unterschiedlichen Zelllinien untersucht wurde. Es wurde schon früher gezeigt, dass geringe Konzentrationen (100 µM) der Ausgangsverbindung, NDGA, Apoptose in Säugetierzellen induzieren (27). Diese Wirkung kann jedoch umgangen werden, indem einer der Catechinsauerstoffe blockiert wird oder eine hydrophile Gruppe zu NDGA hinzugefügt wird (28). Steigende Menge des NDGA-Derivats M₄N wurden an Kulturen der HPV-16/ras-transformierten C3-Zelllinie getestet (19), um die optimale Konzentration zu bestimmen, die zur Hemmung der Proliferation erforderlich ist (9a). Die Zellen reagieren gut auf M₄N und stoppen ihre Teilung nach 72 Stunden über einen Konzentrationsbereich von 40 bis 60 µM. Nach drei Tagen mit diesen Konzentrationen war die Anzahl an Zellen gleich wie bei der Zählung zu Beginn der Beispiele (Tag 0, 9). Eine bescheidenere Reduktion des Zellwachstums wurde bei geringeren Konzentrationen des Arzneimittels beobachtet, und bei Konzentrationen über 60 µM trat ein gewisser Grad an Zelltod auf.
Die antiproliferative Wirkung von M₄N auf die C3-Zelllinie ist nicht nur auf die Fähigkeit des Arzneimittels zurückzuführen, den Sp1-abhängigen HPV-16-E6/E7-Onkogenpromotor zu deaktivieren, da eine ähnliche Wachstumshemmung in der HPV-16-transformierten TC-1-Zelllinie beobachtet wurde, deren E6/E7-Onkogene unter Kontrolle eines Nicht-Sp1-abhängigen retroviralen Promotors stehen (30) (9d). Außerdem wurde das Wachstum der C33a-Zelllinie (8c), einer HPV-negativen menschlichen Zervixkrebs-Zelllinie, und der CEM-T4-Linie (9b), einer menschlichen Leukämie-Zelllinie (31), durch Behandlung mit M₄N blockiert. In den vier Zelllinien, die mit dem Arzneimittel behandelt wurden, waren fast alle (> 95 %) der arre tierten Zellen lebensfähig, bis die M₄N-Konzentration einen „Schwellenwert" (60 µM bei C3-Zellen, 40 µM bei TC-1-Zellen usw.) überschritt. Über diesen Konzentrationen nahm der Prozentsatz an lebensfähigen Zellen rasch ab. Interessanterweise behielten arretierte Zellen auch nach längerer Einwirkung des Arzneimittels eine Lebensfähigkeit von > 95 % bei. Die C3-Zellen wiesen nach acht Tagen Behandlung mit 40 µM M₄N keine Zunahme des Zelltods auf (9e).
Beispiel 10
Mit M₄N behandelte Zellen arretieren in der G2-Phase.
Sobald belegt war, dass die mit M₄N behandelten Zellen ihre Proliferation stoppen, aber trotzdem lebensfähig bleiben, wurden eine Analyse des zellulären DNA-Gehalts und eine Fluoreszenzuntersuchung der Zellstrukturen verwendet, um den Punkt im Zellzyklus zu bestimmen, an dem die Zellen arretieren. Zellen, die 72 Stunden lang M₄N ausgesetzt worden waren, weisen einen zunehmenden G2/M-DNA-Gehalt im Vergleich zu den Kontrollen auf (10a–d). Die extremsten Reaktionen wurden in der C3- und CEMT4-Zelllinie beobachtet, worin > 90 % der Zellen einen G2/M-DNA-Gehalt aufweisen.
Um zwischen einer Arretierung in G2 oder einer Mitoseblockierung zu unterscheiden, wurden Antikörper gegen α-Tubulin (grün) und γ-Tubulin (rot) verwendet, um den Zustand der Centrosome in der C3-Zelllinie nach 72 Stunden M₄N-Behandlung zu bestimmen. Wie in 11a gezeigt ist, sind die Centrosome von M₄N-behandelten Zellen dupliziert, befinden sich aber immer noch nebeneinander im Kern der Zelle. Da Centrosome sich während der frühen Prophase trennen, kann daraus geschlossen werden, dass diese Zellen noch keine Mitose begonnen haben. Im Gegensatz dazu weist die γ-Tubulin-Färbung der Kontrollzellen das diffuse Muster auf, das für die G1- oder S-Phase charakteristisch ist (32). Ein Mangel an Chromatin-Kondensation in den M₄N-behandelten Zellen wurde auch bei DAPI-Färbung beobachtet (12b), ein weiterer Beweis dafür, dass die Zellen nicht aus der G2-Phase ausgetreten sind (33).
Beispiel 11
Die Produktion von CDC2 wird durch 40 µM M₄N gehemmt.
Da der Austritt von Zellen aus G2 von der Produktion des MPF abhängt, wurde der Status seiner Proteinkomponenten in mit 40 µM behandelten C3-Zellen untersucht. Asynchrone Zellen wurden 24 oder 72 Stunden lang in einem Medium gezüchtet, das entweder M₄N in 1 % DMSO oder 1 % DMSO alleine enthielt. Die Zellen wurden geerntet, und gleiche Mengen zelluläres Gesamtprotein wurden durch Western-Blotting analysiert. Eine deutliche Reduktion der Menge an CDC2 wurde nach 72 Stunden Behandlung mit M₄N beobachtet (12a). Die Cyclin-B-Werte, die durch Strippen und Rehybridisierung derselben Membran erhalten wurden, blieben unverändert. Diese Ergebnisse zeigen, dass unter diesen Bedingungen der Arrest wahrscheinlich keine Reaktion auf p53 ist, da gezeigt wurde, dass eine Überexpression von p53 zu einer Reduktion von Cyclin B führt (34, 35). In Übereinstimmung mit der Western-Analyse wurde die CDC2-Kinaseaktivität durch 72 Stunden M₄N-Behandlung eliminiert (12a). Diese Experimente stützen die Ansicht, dass das Arzneimittel durch Hemmung der Produktion des CDC2-Proteins wirkt, was zu einem Verlust der Aktivität des MPF führt.
Vorangegangene Studien der Erfinder, welche die Fähigkeit von M₄N aufgezeigt haben, Sp1-abhängige Virustranskription zu blockieren, lassen auf eine Reduktion von CDC2-mRNA-Werten als möglichen Mechanismus zur Reduktion des CDC2-Proteins schließen. Dies stimmt mit der Erkenntnis überein, dass das Cyclin-B-Protein, dessen Gen kein Sp1 zur Expression erfordert, in normalen Mengen produziert wird, während das CDC2-Protein, dessen Gen zwei wesentliche Sp1-Stellen in seinem Promotor aufweist, in seiner Menge wesentlich reduziert wird. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurde eine Northern-Blot-Analyse an RNA durchgeführt, die aus C3-Zellen entnommen wurde, die 5 bis 72 Stunden lang mit M₄N behandelt worden waren. Wie in 12b zu sehen ist, wird die Menge an CDC2-mRNA erst nach 24 Stunden Behandlung mit M₄N reduziert und nach 72 Stunden fast eliminiert. Die Produktion des nicht-Sp1-regulierten Haushaltsgens GAPDH wurde als RNA-Beladekontrolle verwendet, und seine Werte wurden durch 40 µM M₄N nicht beeinflusst.
Die Verwendung der C3-Zelllinie ermöglicht den Erfindern eine zusätzliche Kontrolle der Analyse des Mechanismus von M₄N-vermitteltem Zellzyklusarrest, da die Wahrscheinlichkeit groß ist, dass auch andere Sp1-abhängige Genpromotoren durch M₄N-Behandlung gehemmt werden. Diese Möglichkeit wurde in C3-Zellen durch eine Analyse der Wirkung von M₄N auf die Transkription aus dem Sp1-abhängigen HPV-16-E6/E7-Promotor untersucht. Eine rtPCR-Analyse von RNA, die aus 5 bis 72 Stunden lang mit 40 µM M₄N behandelten C3-Zellen isoliert wurde, zeigt eine klare Reduktion der Werte des E7-Transkripts (12c). Wiederum wurde GAPDH als interne Kontrolle in diesem Experiment verwendet, und seine Werte blieben von der Arzneimittelbehandlung unbeeinflusst. Diese Ergebnisse sind ein weiterer Beweis dafür, dass M₄N die Transkripte von Sp1-regulierten Promotoren reduziert.
Beispiel 12
Hemmung von Sp1-Bindungsaktivität durch G₄N in einer Gel-Retentionsanalyse.
Proteine der Sp1-Familie induzieren bei der Bindung eine Krümmung zur großen Furche von DNA (36). Die Zinkfingerdomäne des Sp1-Proteins ist verantwortlich für die Bindung der GC-Box-Sequenz 5'-GGGGCGGGG-3'. Durch eine Computeranalyse wurde bestimmt, dass G₄N, das Aminoesterderivat von NDGA, einen stabilen Komplex mit einer solchen Sequenz in der großen Furche bilden könnte. Um zu bestimmen, ob G₄N als Sp1-Blocker sowie als Sp1-Verdränger dienen kann, führten die Erfinder Sp1/Enhancer-Wechselwirkungsuntersuchungen in Gegenwart oder Abwesenheit von G₄N durch die Gel-Retentionsanalyse durch, wobei nur die DNA-Bindungsdomäne von Sp1 für den Test eingesetzt wurde. In den Blockierungsversuchen wurden zuerst unterschiedliche Konzentrationen von G₄N 30 min lang bei 25 °C mit ³²P-markierter DNA im Bindungspuffer inkubiert. Eine DNA-Bindedomäne eines rekombinanten Sp1-Proteins (Sp1-167D) wurde dann zugesetzt und weitere 30 min lang in Gegenwart eines großen Überschusses BSA-Protein inkubiert. In der Verdrängungsstudie wurde das rekombinante S-P1-167D zuerst an DNA binden gelassen, dann wurde G₄N im zweiten Inkubationsschritt zugesetzt. Die G₄N- und Sp1-167D-Konzentrationen und die Inkubations- und Gelelektrophoresebedingungen waren in beiden Studien identisch (experimenteller Abschnitt). Wie in 13 zu sehen, war G₄N in beiden Fällen in der Lage, DNA davon abzuhalten, mit einem Sp1-167D-Protein wechselzuwirken. Wenn nur die DNA-Bindedomäne von Sp1 alleine getestet wurde, schien G₄N wirksamer bei der Verdrängung des gebundenen Sp1 als bei der Blockierung von Sp1-Bindung an den Enhancer zu sein, wie durch die Gel-Retentionsanalyse gezeigt wurde (13, A, B, D). Die Erfinder untersuchten außerdem, ob das gebundene G₄N durch Sp1-167D ersetzt werden kann. In dieser Studie wurde die Hemmung von Sp1-167D-Bindung durch G₄N zuerst durch die Gel-Retentionsanalyse bestimmt (13C, Spuren 2 und 5). Als die G₄N-gebundene Matrize mit zusätzlichem Sp1-167D provoziert wurde, konnte eine dosenabhängige Steigerung der Bandenintensitäten des Sp1-167D/DNA-Komplexes beobachtet werden (6C, Spuren 6, 7), was auf eine Verdrängung von G₄N durch Sp1-167D aus der Matrize hinweist.
Beispiel 13
Hemmung von Sp1-regulierter Tat-Transaktivierung von HIV-Promotoraktivität durch G4N.
Wie schon berichtet können methylierte NDGA-Derivate Sp1-Bindung an die Enhancerstellen verschiedener viraler Promotoren blockieren, einschließlich HIV, ICP4 von HSV, E6/E7-Gen von HPV (37, 38, 39). Die Erfinder testeten außerdem die G₄N-Wirkung auf die Tat-Transakivierung von HIV-Promotoraktivität in Cos-Zellen durch den SEAP-Test, wie er schon beschrieben wurde. Grundniveaus der HIV-LTR-getriebenen SEAP-Expression waren bisher kaum in Cos-Zellen nachweisbar. Es gab eine 60-mal stärkere Steigerung der SEAP-Expression, wenn Cos-Zellen mit dem CMV-Promotor-getriebenen Tat-Gen cotransfiziert wurden (37). Es wurde schon früher nachgewiesen, dass die Tat-getriebene Transaktivierung der HIV-LTR-Promotoraktivität Sp1-reguliert ist (37, 40). In Gegenwart von G₄N konnten die Erfinder eine Hemmung von HIV-Transaktivierung auf dosisabhängige Weise beobachten (14). Ein mittlerer IC₅₀-Wert von 36 µM G₄N war vergleichbar mit dem von 3-0-Methyl-NDGA, Mal.4 (IC₅₀ 25 µM), und etwas höher als der von Tetramethyl-NDGA, M4N (IC₅₀ 11 µM). Die Unterschiede sind vielleicht auf die chemische Natur der Testverbindungen zurückzuführen, welche die Arzneimittelaufnahme der Zellen beeinflussen.
Beispiel 14
Hemmung von SIV-1- und HIV-1-Produktion in Zellkulturen durch G4N.
HIV-1 und SIV sind Retroviren, die in das Wirtsgenom integriert werden müssen, um ihre Replikation abzuschließen. Beide hängen in Bezug auf ihre provirale Transkription von Wirtstranskriptionsfaktoren ab. Sp1 spielt eine zentrale Rolle bei solch einer Expression in diesen beiden Viren, die einen fast identischen Transkriptionsregulationsmodus aufweisen. Im Hinblick auf eine spätere Verwendung von SIV-infizierten Rhesusaffen als Tiermodell zum Testen der antiviralen Wirkung von G₄N untersuchten die Erfinder die G₄N-Wirkung in Bezug auf die Hemmung von SIV in 174 × CEM-Zellen und verglichen sie mit der von HIV in H9-Zellen. Zelluläre Toxizitäten von G₄N in diesen beiden Zelllinien wurden ebenfalls untersucht. Für eine SIV-Inhibitiionsstudie wurden 10⁷ 174 × CEM-Zellen 2 Stunden lang bei 37 °C mit einer Hochtiter-Stammlösung von SIVmac 239 vermischt und dann zweimal mit einem kalten PBS-Puffer gewaschen, um nichtabsorbiertes Virus zu entfernen. Eine Zellsuspension wurde in die einzelnen Wells von drei 96-Well-Platten aliquotiert. Unterschiedliche Konzentrationen der G₄N-Lösungen wurden aus einer frisch zubereiteten Stammlösung hergestellt und jeweils separat in sechs Wells in einer Säule einer 96-Well-Platte aliquotiert. Kulturüberstände wurden alle vier Tage nach der Infektion (P.I.) entnommen, und frisches Medium mit geeigneten Konzentrationen des Arzneimittels wurden nach der Überstandsentnahme zu den Kulturen zugesetzt. Die Virusproduk tion wurde wie dargestellt durch eine modifizierte p27-Kern-Antigen-Einfang-ELISA getestet (15). Bei der Verwendung von G₄N in Konzentrationen über 5 µM konnte keine SIV-Produktion nachgewiesen werden. Bei G₄N-Konzentrationen unter 2,5 µM wurde im Vergleich zur Virusproduktion in Abwesenheit des Arzneimittels SIV-Produktion in Kulturüberständen vom 4. und 8. Tag nach der Infektion nachgewiesen (15). G₄N (250 µM oder weniger) wies keine toxische Wirkung auf nichtinfizierte 174 × CEM-Zellen auf, wie durch den MTT-Test bestimmt wurde (41). Ein ähnliches Experiment wurde auch zur Untersuchung der Hemmung von HIV-1 durch G₄N in H9-Zellen durchgeführt. Die H9-Zellen wurden bei 1 × 10⁵/ml subkultiviert und mit einem AZT-resistenten Stamm von HIV-1 (HIV-1 RTMF) infiziert. G₄N wurde zwei Stunden nach der Infektion in unterschiedlichen Konzentrationen zugesetzt. Alle vier Tage wurde das Medium gegen frisches ausgetauscht. Das Zellwachstum in Gegenwart von G₄N wurde während des Versuchszeitraums von 9 Tagen genau überwacht. Die Virusproduktion wurde durch eine p24-Kern-Antigen-Einfang-ELISA bestimmt. Wie dargestellt (16) hemmte eine G₄N-Konzentration von 80 µM die HIV-Replikation in H9-Zellen vollständig. Eine IC₅₀ von 12 µM G₄N für die Hemmung von HIV-1-RTMF wurde bestimmt. Wiederum gab es innerhalb des Testbereichs (und unter 250 µM) keine nachweisbare Toxizität für nichtinfizierte H9-Zellen.
Die hierin zitierten Literaturstellen sind der Einfachheit halber nachstehend zusammengefasst.

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Claims

Verbindung der Formel:
worin R₁, R₂, R₃ und R₄ identisch sind und für ein N,N-Dimethyl-substituiertes Derivat eines Aminosäurerests stehen.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei die Aminosäure Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, 5-Hydroxylysin, 4-Hydroxyprolin, Thyroxin, 4-Methylhistidin, ε-N-Methyllysin, ε-N,N,N-Trimethyllysin, Aminoadipinsäure, γ-Carboxyglutaminsäure, Phosphoserin, Phosphothreonin, Phosphotyrosin, N-Methylarginin oder N-Acetyllysin ist.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, worin R₁, R₂, R₃ und R₄ jeweils für -O(C=O)CH₂N(CH₃)₂ stehen.
Verfahren zur Synthese einer Verbindung nach Anspruch 1, umfassend die folgenden Schritte: (a) Kombinieren von NDGA und einem N,N-Dimethyl-substituierten Derivat einer Aminosäure; und (b) Zusetzen von HCl; wobei diese Schritte unter Bedingungen durchgeführt werden, die die Bildung eines Hydrochloridsalzes ermöglichen.
Verfahren nach Anspruch 4, worin Schritt (a) in Gegenwart einer Dichlormethanlösung durchgeführt wird und weiters den Zusatz von DCC und DMAP zur Lösung umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die eine Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 und zumindest einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger oder Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin der Arzneimittelträger oder Träger physiologische Kochsalzlösung oder PBS ist.
Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 6 oder Anspruch 7 zur Verwendung bei der therapeutischen Behandlung eines menschlichen oder tierischen Körpers.
Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einer pharmazeutischen Verbindung nach Anspruch 6 oder 7 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors oder zur Hemmung von Virenreplikation und -wachstum.
Verwendung eines Nordihydroguaiaretinsäure-Derivats der Formel:
worin R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander für ein N,N-Dimethyl-substituiertes Derivat eines Aminosäurerests stehen, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei die Aminosäure Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, 5-Hydroxylysin, 4-Hydroxyprolin, Thyroxin, 4-Methylhistidin, ε-N-Methyllysin, ε-N,N,N-Trimethyllysin, Aminoadipinsäure, γ-Carboxyglutaminsäure, Phosphoserin, Phosphothreonin, Phosphotyrosin, N-Methylarginin oder N-Acetyllysin ist.
Verbindung oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder Verwendung nach Anspruch 10, worin der Tumor HPV-induziert ist.
Verbindung oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder Verwendung nach Anspruch 12, worin der Tumor aus der aus einem Zervixtumor, Oraltumor, Penistumor sowie Kopf- und Halstumor bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verbindung oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder Verwendung nach Anspruch 10, worin der Tumor aus malignen und benignen Tumoren ausgewählt ist.
Verbindung, pharmazeutische Zusammensetzung oder Verwendung nach Anspruch 14, worin der maligne Tumor aus der aus Plattenepithelkarzinom, Adenokarzinom und Medulloblastom bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verbindung oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder Verwendung nach Anspruch 10, worin der Tumor in einem Säugetier vorliegt.
Verbindung, pharmazeutische Zusammensetzung oder Verwendung nach Anspruch 16, worin das Säugetier ein Mensch ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 17, worin das Medikament zumindest einen pharmazeutisch annehmbaren Arzneimittelträger oder Träger umfasst.
Verwendung nach Anspruch 18, worin der Arzneimittelträger oder Träger aus der aus DMSO, PBS, einer Formulierung auf Lipidbasis und physiologischer Kochsalzlösung bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
Verwendung eines Nordihydroguaiaretinsäure-Derivats der Formel:
worin R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander für -OH, -OCH₃, -O(C=O)CH₃ oder einen Aminosäurerest oder ein N,N-Dimethyl-substituiertes Derivat davon stehen, jedoch nicht gleichzeitig alle -OH sind, bei der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Virenreplikation und -wachstum.
Verwendung nach Anspruch 20, wobei die Aminosäure Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat, Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Prolin, Serin, Threonin, Tryptophan, Tyrosin, Valin, 5-Hydrozylysin, 4-Hydroxyprolin, Thyroxin, 4-Methylhistidin, ε-N-Methyllysin, ε-N,N,N-Trimethyllysin, Aminoadipinsäure, γ-Carboxyglutaminsäure, Phosphoserin, Phosphothreonin, Phosphotyrosin, N-Methylarginin oder N-Acetyllysin ist.
Verwendung nach Anspruch 20 oder Anspruch 21, worin die Aminosäure ein N,N-Dimethyl-substituiertes Derivat davon ist.
Verbindung oder pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8 oder Verwendung nach Anspruch 20, worin das Virus ein AZT-resistentes Virus ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 23, worin R₁, R₂, R₃ und R₄ identisch sind und entweder -OCH₃ oder -O(C=O)CH₂N⁺H(CH₃)₂Cl^- sind.