WO2004015423A1 - 蛋白質測定方法、蛋白質測定用指示薬、および蛋白質測定用試験片 - Google Patents

蛋白質測定方法、蛋白質測定用指示薬、および蛋白質測定用試験片 Download PDF

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    • G01N33/6827—Total protein determination, e.g. albumin in urine
    • G01N33/6839—Total protein determination, e.g. albumin in urine involving dyes, e.g. Coomassie blue, bromcresol green

Definitions

  • the present invention relates to a technique for measuring a protein present in a protein content (for example, a body fluid such as blood or urine, a protein-containing beverage, or a factory wastewater).
  • a protein content for example, a body fluid such as blood or urine, a protein-containing beverage, or a factory wastewater.
  • Measuring protein in the production rights is important in pathological diagnosis.
  • a decrease in me ability may mean a decrease in the amount of serum albumin and a decrease in the amount of serum albumin, nephritis, nephrotic syndrome, stones, tumors and other renal ailments, circulatory and central nervous system diseases, etc. Increases the amount of protein in urine. Therefore, measuring proteins such as albumin can be an important ⁇ 1 + in the diagnosis of these diseases.
  • TBPB tetrabromophenol blue
  • urine test paper is widely used for primary screening.
  • TBPB is the protein exists, for changing from yellow to blue and dissociated phenolic hydroxyl groups in the vicinity of P H3, it is possible to detect the protein.
  • test papers using TBPB as an indicator have insufficient detection sensitivity for low-concentration proteins of clinically required 10-20 mg / dL, and thus cannot accurately detect proteins.
  • the colors of the negative protein and the trace protein are close to each other, so it is difficult to distinguish them and the judgment is difficult.
  • using a urine test paper measuring device: ⁇ too, often makes erroneous judgments due to the low sensitivity of TBPB.
  • the present inventors have screened an indicator for measuring a protein at a low concentration with high sensitivity, and as a result, have found that a specific halogenated xanthene dye is suitable as a target indicator. Reached.
  • a protein measurement indicator having a chemical formula represented by the following chemical formula (1) there are provided a protein measurement indicator having a chemical formula represented by the following chemical formula (1), a protein measurement method using the protein measurement indicator, and a protein measurement test strip.
  • XI is a halogen, a nitro group or a nitroso group
  • X2 is a nitrogen
  • X3 is a halogen or hydrogen
  • X4 is a hydroxyl group or a salt thereof
  • X5 is a carboxy group or a salt thereof.
  • XI is iodine, bromine, chlorine or nitro group
  • X2 is iodine or bromine
  • X3 is chlorine, bromine or hydrogen.
  • XI and iodine or bromine are used
  • X3 is chlorine.
  • Examples of the salt in X4 and X15 typically include «Na salt.
  • the indicator for protein measurement of the present invention typically includes those represented by the following chemical formulas (1 to 1 (1) -5). In particular, the following chemical formulas (1) -1 and (1) The indicator for protein measurement of -2 is preferable.
  • halogenated xanthene dye while the pKa following P H of the dye is colorless to pale orange unless coexist ⁇ white matter changes color to red to purple when coexisting protein. Therefore, compared to the case where the color changes from yellow to blue like TBPB, the color change is easier to detect because the original color is colorless to light. Therefore, the use of the above-described halogenated oxanthen-based dye makes it possible to appropriately detect the high-level protein irrespective of whether it is a visual judgment or a judgment using a measuring device. .
  • the test piece for protein quantification of the present invention can be produced by impregnating an absorbent carrier into an impregnating liquid containing the above-mentioned halogenated xanthene dye, buffer, sensitizer, and the like, and drying it. it can.
  • the test piece can be used as it is, but it can also be used by attaching it to a non-absorbent material.
  • the concentration of the halogenated xanthene dye in the impregnating liquid is not particularly limited, but is typically 0.1 to 10 mM, preferably 0.5 to 2 mM.
  • the pH of the impregnating solution is slightly lower than the pKa value of the halogenated xanthene dye of the present invention, for example. Re, the value is 1.5 to 4.5, preferably 2.0 to 3.5.
  • Any buffer may be used as long as it has a good buffering ability in the range of ⁇ 1.5 to 4.5 and does not inhibit the reaction between the halogenated xanthene dye and the protein.
  • concentration of the buffer in the impregnation liquid is not particularly limited, but is typically 0.1 to 1.5 ⁇ , preferably 0.3 to 1 ⁇ .
  • polyethylene glycol, polypropylene glycol, polycarbonate, some resins, and polybutyl ether can be used, and polyethylene glycol or polypropylene dalicol is preferably used.
  • concentration is not particularly limited, but is typically 0.05 to 5 wt%, preferably 0.1 to 1 wt%.
  • a porous substance containing no protein component can be used.
  • a sheet-like or film-like one is used.
  • the porous substance include a paper-like material, a foam (foam), a woven fabric, a non-porous material, and a waste material.
  • Materials for forming the excipient carrier include, for example, cotton, hemp, cellulose, nitrosenololose, cenorellose acetate, rock oonole, glass fiber, silica fiber, carbon fiber, boron fiber, polyamide, aramide. , Polyvinyl alcohol, polyvinyl acetate, rayon, polyester, nylon, polyacrylic acid, polyacrylate, and polyolefin.
  • the shape of these absorbent carriers is not particularly limited, but is generally rectangular, oblong, circular or elliptical. ⁇ ,
  • non-absorbent for example, a sheet-shaped or film-shaped one is used.
  • Materials for forming the non-absorbent include, for example, polyethylene terephthalate, polyester, polypropylene, polyethylene, polyvinyl chloride, polyvinylidene chloride, and polystyrene.
  • screening of an indicator capable of detecting a low concentration of protein was performed. Screening was carried out by adding the target compound to the screen Jung solution so as to be 0.5, and visually observing the color development.
  • As the screening liquid a solution prepared by dissolving 15 mg / dL of albumin and 0.5 wt% of polyethylene glycol in 0.7 M malate buffer ( ⁇ 2.2) was used.
  • As the target compound various commercially available dyes were used. As a result, favorable color development was observed for the five compounds shown in the following chemical formulas (2) -1 to (2 to 5. The sources of these compounds are as shown in Table 1.
  • the sensitivity of the screened indicator was evaluated. Sensitivity is determined by impregnating urine with an albumin concentration of 0.3 mg / dL (negative) or 15 mg / dL ( P ⁇ raw) into the test specimens, respectively! / By measuring the reflectance.
  • the test pieces were formed by impregnating a filter paper (Whatman Ne ⁇ 3 ⁇ 4 "3 Band Chr") with an impregnating solution having the composition shown in Table 2 and then drying it. The reflectance was measured using a color difference meter. Table 3 shows the measurement results for each sample. Table 3 also shows the measurement wavelength of each sample.
  • phloxin B and rose bengal have a large difference in reflectance between negative urine and positive I "raw urine, and the difference is about twice that of TBPB.
  • the sensitivity to albumin is high, and it can be said that albumin can be detected properly even if the albumin concentration is as low as 10 to 20 mg / dLm.
  • the present inventor further studied a method for visually determining each sample.
  • Samples 1 to 4 using Phloxin B and Rose Benganore developed colorless to red when the albumin concentration was mg / dL, and the color (positive) was easily ⁇ .
  • samples 5 and 6 using TBPB when the albumin concentration was 15 mg / dL, there was almost no difference from the yellow color when the albumin concentration was negative, and it was difficult to visually detect the presence or absence of coloration.
  • phloxin B or rose bengal is used as an indicator, albumin can be easily detected visually even when the albumin concentration is low.
  • Example 2 Although the experimental results in Example 2 relate to urine samples, Can be applied not only to urine but also to various kinds of protein-containing samples such as blood, protein-containing beverages, and quantification of protein in factory wastewater.

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Description

明 細 書 蛋白質測定方法、 蛋白質測定用指示薬、 および蛋白質測定用試験片 技術分野
本発明は、蛋白質含 料 (たとえば血液や尿などの体液、蛋白質含有飲料、 ェ 場廃水)中に存在する蛋白質を測定するための技術に関する。 背景技術
生 ί權料中の蛋白質を測定することは、 病理学的診断において重要である。 た とえば、 me能が低下した には、 血清アルブミンの量が減少する一方、 腎 炎、 ネフローゼ症候群、 結石、 腫瘍等の腎 '尿路疾患、 循環系及び中枢神経系の 疾患などの場合には、 尿中の蛋白質の量が増加する。 したがって、 アルブミンな どの蛋白質を測定することは、 これらの疾患の診断において重要な^ 1+となり得 るのである。
蛋白質測定の分野においては、 蛋白質誤差指示薬を用いた簡便な測定方法が知 られている。 この測定方法では、 蛋白質誤差指示薬として、 たとえばテトラブロ ムフエノールブルー (TBPB)が用いられており、 一例を挙げれば、 TBPBを用レ、た尿 試験紙が一次スクリーニング用として広く用いられている。 TBPBは、 蛋白質が存 在する に、 PH3付近においてフエノール性ヒドロキシル基が解離して黄色から 青色に変化するため、 蛋白質を検出することができる。
しかしながら、 TBPBを指示薬として用いた試験紙は、 臨床的に必要とされる 10 〜20mg/dLの低濃度蛋白質に対する検出感度が不充分なため、蛋白質を正確に検出 できない ¾ ^がある。 たとえば、 カラーチャートとの比較により行われる目視判 定においては、 陰性蛋白質と痕跡蛋白質の色が近いために区別が難しく判定が困 難である。 一方、 尿試験紙の測定装置を用いる：^においても、 TBPBの感度が低 いためにしばしば判定を誤る がある。
そのため、 低濃度な蛋白質をより高感度に定量できる技術、 とくに TBPB以外の 新規な指示薬の開発が望まれてレヽた。 発明の開示
本発明者は、 低濃度の蛋白質を高感度で測定するための指示薬をスクリーニン グした結果、 特定のハロゲンィ匕キサンテン系色素が目的の指示薬として好適であ ることを見出し、 本発明を するに至った。
すなわち、 本発明では、 下記化学式 (1)で示される化 冓造を有する蛋白質測定 用指示薬、 この蛋白質測定用指示薬を使用する蛋白質測定方法および蛋白質測定 用試験片が される。
Figure imgf000004_0001
ただし、 ィヒ学式 (1)において、 XIはハロゲン、 ニトロ基またはニトロソ基、 X2は ノヽロゲン、 X3はハロゲンまたは水素、 X4は水酸基またはその塩、 X5はカルボキシ ル基またはその塩である。 本発明においては、 蛋白質測定用指示薬として、 化学 式 (1)において、 XIがヨウ素、臭素、塩素またはニトロ基、 X2がョゥ素または臭素、 X3が塩素、 臭素または水素のものを使用するのが好ましく、 最も好ましくは、 XI およひ がヨウ素または臭素、 X3が塩素のものが使用される。 X4およひ 15におけ る塩としては、 典型的に «Na塩が挙げられる。
本発明の蛋白質測定用指示薬としては、 典型的には、 下記化学式 (1卜 1〜(1)-5に 示したものが挙げられる。 その中でもとくに、 下記化学式 (1)- 1および (1)-2の蛋白 質測定用指示薬が好ましい。
Figure imgf000005_0001
Figure imgf000006_0001
Figure imgf000006_0002
これらのハロゲン化キサンテン系色素は、当該色素の pKa以下の PHにおいては蛋 白質が共存しなければ無色〜淡橙色である一方、 蛋白質が共存すれば赤〜紫色に 変色する。 そのため、 TBPBのように黄色から青色に変色する場合に比べれば、 元 の色が無色〜淡色であるために色の変ィ匕を検知しやすい。 したがって、 上述のハ ロゲンィ匕キサンテン系色素を用いれば、 目視判定であるカゝ、 測定装置を用いた判 定であるかを問わず、 ί«度蛋白質を適切に検知することができるようになる。 本発明の蛋白質定量用試験片は、 上述したハロゲンィ匕キサンテン系色素、 緩衝 剤、 増感剤などを含有する含浸液に吸収性担体を浸み込ませ、 これを乾燥させる ことにより製造することができる。 試験片はそのまま使用することができるが、 非吸収体に接着させて使用することもできる。
含浸液中のハロゲンィ匕キサンテン系色素の濃度は、 特に限定されないが、 典型 的には 0. l〜10mM、 好ましくは 0. 5〜2mMとされる。
含浸液の pHは、たとえば本願のハロゲンィ匕キサンテン系色素の pKa値よりやや低 レ、値である 1· 5〜4· 5とされ、 好ましくは 2. 0〜3. 5とされる。
緩衝剤としては、 ρΗ1. 5〜4· 5の範囲で良好な緩衝能を有し、 ハロゲンィ匕キサン テン系色素と蛋白質との反応を阻害しないものであれば何れでもよレヽ。 緩種刺と しては、 たとえばグリシン緩衝液、 クェン酸緩衝液、 コハク酸緩衝液、 リンゴ酸 緩衝液、 あるいは酒石^!爰衝液を用いることができる。 含浸液中の緩衝剤の濃度 は、 特に限定されないが、 典型的には 0. 1〜1. 5Μ、 好ましくは 0. 3〜1Μとされる。
としては、 たとえばポリエチレングリコーノレ、 ポリプロピレングリコー ル、 ポリカーボネート、 あるレ、はポリビュルエーテルを使用することができ、 好 ましくはポリエチレングリコールまたはポリプロピレンダリコールが使用される 含浸液中の増感剤の濃度は、特に限定されないが、典型的には 0. 05〜5wt%、好ま しくは 0. l〜lwt%とさ;^る。
吸収性担体としては、蛋白質成分を含まない多孔性物質を使用することができ、 たとえばシート状または膜状の形態のものが使用される。 多孔性物質としては、 たとえば紙状物、 フォーム (発泡体)、 織布状物、 不»状物、 およ Ό ΐ物状物が 挙げられる。 Ρ及収性担体を形成するための材料としては、 たとえば綿、 麻、 セル ロース、 ニトロセノレロース、セノレロースアセテート、 ロックウーノレ、ガラス糸 維、 シリカ練維、 カーボン繊維、 ボロン繊隹、 ポリアミド、 ァラミド、 ポリビニノレア ルコール、 ボリビュルァセテ一ト、 レーヨン、 ポリエステル、 ナイロン、 ポリア クリル酸、 ポリアクリル酸エステル、 およびポリオレフインが挙げられる。 これ ら吸収性担体の形状は、 特に限定されないが、 矩形、 長矩形、 円形あるいは楕円 形が一般的である。 ―,
非吸収体としては、 たとえばシート状または膜状の形態のものが使用される。 非吸収体を形成するための材料としては、たとえばポリエチレンテレフタレート、 ポリエステル、 ポリプロピレン、 ポリエチレン、 ポリ塩化ビュル、 ポリ塩化ビニ リデン、 およびポリスチレンが挙げられる。 実施例
[実施例 1 ]
本実施例では、 低濃度蛋白質を検出可能な指示薬のスクリーニングを行った, スクリ—ユングは、 スクリ一ユング液に 0. 5 となるように対象化合物を添加し、 その発色性を目視により観察することにより行った。スクリ一ユング液としては、 0. 7Mリンゴ酸緩衝液 (ρΗ2· 2)に、 アルブミン 15mg/dL、 ポリエチレングリコール 0. 5wt%を溶解させたものを使用した。対象化合物としては、市販されている種々 の色素を用いた。 その結果、 下記化学式 (2)- 1〜(2ト5に示す 5つの化合物について 良好な発色が見受けられた。 これらの化合物の入手先については、 表 1に示した 通りである。
Figure imgf000008_0001
Figure imgf000009_0001
Figure imgf000009_0002
Figure imgf000009_0003
 表 1
Figure imgf000010_0001
[実施例 2 ]
本実施例では、 スクリーニングされた指示薬の感度を評価した。感度は、 アル プミン濃度が 0. 3mg/dL (陰性)または 15mg/dL (P~生)の尿を試験片に含浸させ、それ ぞれにつ！/ヽて反射率を測定することにより行つた。 試験片は、 表 2に示した組成 の含浸液を濾紙 (Whatmanネ ±¾「3匪 Chr」）に含浸させた後にそれを乾燥させること により形成した。 反射率は、 色差計を用いて測定した。 各サンプルの測定結果に ついては、 表 3に示した。 表 3には、 各サンプルの測定波長についても同時に示 した。
表 2
Figure imgf000010_0002
： ΤΒΡΒ=Ϊトラプ Πムフエノ-ルプル- 表 3
Figure imgf000011_0001
表 3より明らかなように、 指示薬として化学式 (2) - 1に示したフロキシン Bを用 いたサンプル 1, 2やィ匕学式 (2)_2に示したローズべンガノレを用いたサンプル 3， 4は、 指示薬として TBPBを用いたサンプル 5, 6に比べて、 アルブミン濃度が 0. 3mg/dL (陰 性)のときの反射率が大きく、 アルブミン濃度が 15mg/dL (陽 ft)のときの反射率が 小さくなつている。 つまり、 フロキシン Bやローズべンガルは、 これらの pH条件 下で無色であるために TBPBに比べて非発色時 (陰性)の光吸収量が少なく、 その反 面、 発色時 (陽 14)の光吸収量が大きくなつている。 このため、 フロキシン Bや口 ーズベンガノレは、陰性の尿と陽 I"生の尿の反射率の Δが大きく、その差分は TBPB の 2倍程度となっている。 したがって、 フロキシン Bやローズベンガルは、 アルブ ミンに対する感度が高く、アルブミン濃度が 10〜20mg/dLm の低濃度であっても. 適切にアルブミンを検出できるといえる。
本発明者はさらに、 各サンプルにつレ、て目視判定が可能であるカゝを検討した。 その結果、 フロキシン Bやローズべンガノレを用いたサンプル 1〜4は、 アルブミン 濃度が mg/dLのときに無色から赤色に発色し、その発色 (陽性)を容易に β、でき た。 それに対して、 TBPBを用いたサンプル 5, 6は、 アルブミン濃度が 15mg/dLのと きには、 陰性のときの黄色と殆ど差がなく、 目視では発色の有無を検出するのが 困難であった。 このように、 指示薬としてフロキシン Bやローズベンガルを用い た場合には、 アルブミン濃度が低い場合であっても、 目視により容易にアルブミ ンを検出することができる。
なお、 実施例 2における実験結果は尿サンプルに関するものであるが、 本発明 は尿に限らず、 蛋白質を含んだ種々の試料、 たとえば血液、 蛋白質含有飲料、 ェ 場廃水における蛋白質を定量する ^にも適用することができる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 蛋白質測定用指示薬を用いて蛋白質を測定する方法であって、
蛋白質測定用指示薬として、 下記ィ匕学式 (1)で示される化 冓造を有するもの を使用する、 蛋白質測定方法。
Figure imgf000013_0001
化学式 (1)において、 XIはハロゲン、二ト口基または二ト口ソ基、 X2はハロゲン、 X3はハロゲンまたは水素、 X4は水酸基またはその塩、 X5はカルボキシル基または その塩である。
2 . 上記化学式 (1)において、 XIはヨウ素、 臭素、 塩素またはニトロ基、 X2はヨウ 素または臭素、 X3は塩素、 臭素または水素である、 請求項 1に記載の蛋白質測定 方法。
3 . 上記化学式 (1)において、 ） (1およひ はヨウ素または臭素、 X3は塩素である、 請求項 2に記載の蛋白質測定方法。
4 . 上記蛋白質指示薬として、 下記化学式 (1)-1〜は) - 5からなる群より選択される 少なくとも 1種を使用する、 請求項 3に記載の蛋白質測定方法。
Figure imgf000014_0001
12
Figure imgf000015_0001
5 . 上記蛋白質指示薬は、 当該蛋白質指示薬の pKa以下の pHにおいては、蛋白質が 共存しなレ、¾ ^に無色〜淡橙色を呈する一方、 蛋白質が共存する # ^に赤〜紫色 を呈するものである、 請求項 1に記載の蛋白質測定方法。
6 . 上記蛋白質は、 アルブミンである、 請求項 1に記載の蛋白質測定方法-
7 . アルブミン濃度が 10〜20mg/dLの範囲にあるアルブミン含有試料において、ァ ルプミン濃度を測定する、 請求項 6に記載の蛋白質測定方法。
8 . 蛋白質を測定するための指示薬であって、 下記化学式 (2)で示される化對冓造 を有する、 蛋白質測定用指示薬。
Figure imgf000016_0001
化学式 (2)において、 XIはハロゲン、二トロ基または二ト口ソ基、 X2はハロゲン、 X3はハロゲンまたは水素、 X4は水酸基またはその塩、 X5はカルボキシル基または その塩である。
9. 上記ィヒ学式 (2)において、 XIはヨウ素、 臭素、 塩素またはニトロ基、 X2はヨウ 素または臭素、 X3は塩素、 臭素または水素である、 請求項 8に記載の蛋白質測定 用指示薬。
10. 上記ィヒ学式 (2)において、 XIおよひ 12はヨウ素または臭素、 X3は塩素である、 請求項 9に記載の蛋白質測定用指示薬。
11. 下記化学式 (2)- 1〜(2)- 5のいずれかによつて表される化對冓造を有するもので ある、 請求項 8に記載の蛋白質測定用指示薬。
Figure imgf000016_0002
ex
Figure imgf000017_0001
888600/£00idf/X3d εひ o/rooz OA (2ト 5
Figure imgf000018_0001
12. pKa以下の pHにおいては、 蛋白質が共存する に無色〜淡橙色を呈する一 方、 蛋白質が共存する に赤〜紫色を呈するものである、 請求項 8に記載の蛋 白質測定用指示薬。
13. 蛋白質を定量または半定量するために使用される試験片であって、 蛋白質定 量指示薬として、 下記化学式 (3)で示される化 冓造を有するものを使用する、 蛋 白質測定用試験片。
Figure imgf000018_0002
化学式 (3)において、 XIはハロゲン、ニトロ基または二ト口ソ基、 X2はハロゲン、 X3はハロゲンまたは水素、 X4は水酸基またはその塩、 X5はカルボキシル基または その塩である。
14. 上記化学式 (3)において、 XIはヨウ素、 臭素、 塩素またはニトロ基、 X2はヨウ 素または臭素、 X3は塩素、 臭素または水素である、 請求項 13に記載の蛋白質測定 用試験片。
15. 上記化学式 (3)において、 XIおよひ 12はヨウ素または臭素、 X3は塩素である、 請求項 13に記載の蛋白質測定用試験片。
16. 上記蛋白質指示薬として、 下記化学式 (3)-；！〜 (3)- 5からなる群より選択される 少なくとも 1種を使用する、 請求項 13に記載の蛋白質測定用試験片。
Figure imgf000019_0001
Figure imgf000020_0001
Figure imgf000020_0002
Figure imgf000020_0003
17. 上記蛋白質指示薬は、 当該蛋白質指示薬の pKa以下の pHにおいては、蛋白質が 共存する に無色〜淡橙色を呈する一方、 蛋白質が共存しなレヽ場合に赤〜紫色 を呈するものである、 請求項 13に記載の蛋白質測定用試験片。
18. 蛋白質に対する発色感度を高めるための增赚 []をさらに含んでいる、 請求項 13に記載の蛋白質測定用試験片。
19. 上記増] S^ljとして、 ポリェチレングリコールおょぴポリプロピレングリコー ルのうちの少なくとも一方を含んでいる、請求項 18に記載の蛋白質測定用試験片。
PCT/JP2003/009888 2002-08-09 2003-08-04 蛋白質測定方法、蛋白質測定用指示薬、および蛋白質測定用試験片 Ceased WO2004015423A1 (ja)

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