JPWO2004015423A1 - 蛋白質測定方法、蛋白質測定用指示薬、および蛋白質測定用試験片 - Google Patents

Abstract

本発明は、蛋白質を測定する技術に関する。本発明においては、蛋白質測定用指示薬として、下記化学式（１）で示される化学構造を有するものが使用される。ただし、化学式（１）において、Ｘ１はハロゲン、ニトロ基またはニトロソ基、Ｘ２はハロゲン、Ｘ３はハロゲンまたは水素、Ｘ４は水酸基またはその塩、Ｘ５はカルボキシル基またはその塩である。

Description

本発明は、蛋白質含有試料（たとえば血液や尿などの体液、蛋白質含有飲料、工場廃水）中に存在する蛋白質を測定するための技術に関する。

生体試料中の蛋白質を測定することは、病理学的診断において重要である。たとえば、肝臓機能が低下した場合には、血清アルブミンの量が減少する一方、腎炎、ネフローゼ症候群、結石、腫瘍等の腎・尿路疾患、循環系及び中枢神経系の疾患などの場合には、尿中の蛋白質の量が増加する。したがって、アルブミンなどの蛋白質を測定することは、これらの疾患の診断において重要な指針となり得るのである。
蛋白質測定の分野においては、蛋白質誤差指示薬を用いた簡便な測定方法が知られている。この測定方法では、蛋白質誤差指示薬として、たとえばテトラブロムフェノールブルー（ＴＢＰＢ）が用いられており、一例を挙げれば、ＴＢＰＢを用いた尿試験紙が一次スクリーニング用として広く用いられている。ＴＢＰＢは、蛋白質が存在する場合に、ｐＨ３付近においてフェノール性ヒドロキシル基が解離して黄色から青色に変化するため、蛋白質を検出することができる。
しかしながら、ＴＢＰＢを指示薬として用いた試験紙は、臨床的に必要とされる１０〜２０ｍｇ／ｄＬの低濃度蛋白質に対する検出感度が不充分なため、蛋白質を正確に検出できない場合がある。たとえば、カラーチャートとの比較により行われる目視判定においては、陰性蛋白質と痕跡蛋白質の色が近いために区別が難しく判定が困難である。一方、尿試験紙の測定装置を用いる場合においても、ＴＢＰＢの感度が低いためにしばしば判定を誤る場合がある。
そのため、低濃度な蛋白質をより高感度に定量できる技術、とくにＴＢＰＢ以外の新規な指示薬の開発が望まれていた。

本発明者は、低濃度の蛋白質を高感度で測定するための指示薬をスクリーニングした結果、特定のハロゲン化キサンテン系色素が目的の指示薬として好適であることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明では、下記化学式（１）で示される化学構造を有する蛋白質測定用指示薬、この蛋白質測定用指示薬を使用する蛋白質測定方法および蛋白質測定用試験片が提供される。

ただし、化学式（１）において、Ｘ１はハロゲン、ニトロ基またはニトロソ基、Ｘ２はハロゲン、Ｘ３はハロゲンまたは水素、Ｘ４は水酸基またはその塩、Ｘ５はカルボキシル基またはその塩である。本発明においては、蛋白質測定用指示薬として、化学式（１）において、Ｘ１がヨウ素、臭素、塩素またはニトロ基、Ｘ２がヨウ素または臭素、Ｘ３が塩素、臭素または水素のものを使用するのが好ましく、最も好ましくは、Ｘ１およびＸ２がヨウ素または臭素、Ｘ３が塩素のものが使用される。Ｘ４およびＸ５における塩としては、典型的にはＮａ塩が挙げられる。
本発明の蛋白質測定用指示薬としては、典型的には、下記化学式（１）−１〜（１）−５に示したものが挙げられる。その中でもとくに、下記化学式（１）−１および（１）−２の蛋白質測定用指示薬が好ましい。

これらのハロゲン化キサンテン系色素は、当該色素のｐＫａ以下のｐＨにおいては蛋白質が共存しなければ無色〜淡橙色である一方、蛋白質が共存すれば赤〜紫色に変色する。そのため、ＴＢＰＢのように黄色から青色に変色する場合に比べれば、元の色が無色〜淡色であるために色の変化を検知しやすい。したがって、上述のハロゲン化キサンテン系色素を用いれば、目視判定であるが、測定装置を用いた判定であるかを問わず、低濃度蛋白質を適切に検知することができるようになる。
本発明の蛋白質定量用試験片は、上述したハロゲン化キサンテン系色素、緩衝剤、増感剤などを含有する含浸液に吸収性担体を浸み込ませ、これを乾燥させることにより製造することができる。試験片はそのまま使用することができるが、非吸収体に接着させて使用することもできる。
含浸液中のハロゲン化キサンテン系色素の濃度は、特に限定されないが、典型的には０．１〜１０ｍＭ、好ましくは０．５〜２ｍＭとされる。
含浸液のｐＨは、たとえば本願のハロゲン化キサンテン系色素のｐＫａ値よりやや低い値である１．５〜４．５とされ、好ましくは２．０〜３．５とされる。
緩衝剤としては、ｐＨ１．５〜４．５の範囲で良好な緩衝能を有し、ハロゲン化キサンテン系色素と蛋白質との反応を阻害しないものであれば何れでもよい。緩衝剤としては、たとえばグリシン緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、リンゴ酸緩衝液、あるいは酒石酸緩衝液を用いることができる。含浸液中の緩衝剤の濃度は、特に限定されないが、典型的には０．１〜１．５Ｍ、好ましくは０．３〜１Ｍとされる。
増感剤としては、たとえばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリカーボネート、あるいはポリビニルエーテルを使用することができ、好ましくはポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコールが使用される。含浸液中の増感剤の濃度は、特に限定されないが、典型的には０．０５〜５ｗｔ％、好ましくは０．１〜１ｗｔ％とされる。
吸収性担体としては、蛋白質成分を含まない多孔性物質を使用することができ、たとえばシート状または膜状の形態のものが使用される。多孔性物質としては、たとえば紙状物、フォーム（発泡体）、織布状物、不織布状物、および編物状物が挙げられる。吸収性担体を形成するための材料としては、たとえば綿、麻、セルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ロックウール、ガラス繊維、シリカ繊維、カーボン繊維、ボロン繊維、ポリアミド、アラミド、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセテート、レーヨン、ポリエステル、ナイロン、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸エステル、およびポリオレフィンが挙げられる。これら吸収性担体の形状は、特に限定されないが、矩形、長矩形、円形あるいは楕円形が一般的である。
非吸収体としては、たとえばシート状または膜状の形態のものが使用される。非吸収体を形成するための材料としては、たとえばポリエチレンテレフタレート、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、およびポリスチレンが挙げられる。

本実施例では、低濃度蛋白質を検出可能な指示薬のスクリーニングを行った。スクリーニングは、スクリーニング液に０．５ｍＭとなるように対象化合物を添加し、その発色性を目視により観察することにより行った。スクリーニング液としては、０．７Ｍリンゴ酸緩衝液（ｐＨ２．２）に、アルブミン１５ｍｇ／ｄＬ、ポリエチレングリコール０．５ｗｔ％を溶解させたものを使用した。対象化合物としては、市販されている種々の色素を用いた。その結果、下記化学式（２）−１〜（２）−５に示す５つの化合物について良好な発色が見受けられた。これらの化合物の入手先については、表１に示した通りである。

本実施例では、スクリーニングされた指示薬の感度を評価した。感度は、アルブミン濃度が０．３ｍｇ／ｄＬ（陰性）または１５ｍｇ／ｄＬ（陽性）の尿を試験片に含浸させ、それぞれについて反射率を測定することにより行った。試験片は、表２に示した組成の含浸液を濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ社製「３ＭＭＣｈｒ」）に含浸させた後にそれを乾燥させることにより形成した。反射率は、色差計を用いて測定した。各サンプルの測定結果については、表３に示した。表３には、各サンプルの測定波長についても同時に示した。

表３より明らかなように、指示薬として化学式（２）−１に示したフロキシンＢを用いたサンプル１，２や化学式（２）−２に示したローズベンガルを用いたサンプル３，４は、指示薬としてＴＢＰＢを用いたサンプル５，６に比べて、アルブミン濃度が０．３ｍｇ／ｄＬ（陰性）のときの反射率が大きく、アルブミン濃度が１５ｍｇ／ｄＬ（陽性）のときの反射率が小さくなっている。つまり、フロキシンＢやローズベンガルは、これらのｐＨ条件下で無色であるためにＴＢＰＢに比べて非発色時（陰性）の光吸収量が少なく、その反面、発色時（陽性）の光吸収量が大きくなっている。このため、フロキシンＢやローズベンガルは、陰性の尿と陽性の尿の反射率の差分Δが大きく、その差分はＴＢＰＢの２倍程度となっている。したがって、フロキシンＢやローズベンガルは、アルブミンに対する感度が高く、アルブミン濃度が１０〜２０ｍｇ／ｄＬ程度の低濃度であっても、適切にアルブミンを検出できるといえる。
本発明者はさらに、各サンプルについて目視判定が可能であるかを検討した。その結果、フロキシンＢやローズベンガルを用いたサンプル１〜４は、アルブミン濃度が１５ｍｇ／ｄＬのときに無色から赤色に発色し、その発色（陽性）を容易に確認できた。それに対して、ＴＢＰＢを用いたサンプル５，６は、アルブミン濃度が１５ｍｇ／ｄＬのときには、陰性のときの黄色と殆ど差がなく、目視では発色の有無を検出するのが困難であった。このように、指示薬としてフロキシンＢやローズベンガルを用いた場合には、アルブミン濃度が低い場合であっても、目視により容易にアルブミンを検出することができる。
なお、実施例２における実験結果は尿サンプルに関するものであるが、本発明は尿に限らず、蛋白質を含んだ種々の試料、たとえば血液、蛋白質含有飲料、工場廃水における蛋白質を定量する場合にも適用することができる。

Claims (19)

1. 蛋白質測定用指示薬を用いて蛋白質を測定する方法であって、
   蛋白質測定用指示薬として、下記化学式（１）で示される化学構造を有するものを使用する、蛋白質測定方法。
   

   

   化学式（１）において、Ｘ１はハロゲン、ニトロ基またはニトロソ基、Ｘ２はハロゲン、Ｘ３はハロゲンまたは水素、Ｘ４は水酸基またはその塩、Ｘ５はカルボキシル基またはその塩である。
2. 上記化学式（１）において、Ｘ１はヨウ素、臭素、塩素またはニトロ基、Ｘ２はヨウ素または臭素、Ｘ３は塩素、臭素または水素である、請求項１に記載の蛋白質測定方法。
3. 上記化学式（１）において、Ｘ１およびＸ２はヨウ素または臭素、Ｘ３は塩素である、請求項２に記載の蛋白質測定方法。
4. 上記蛋白質指示薬として、下記化学式（１）−１〜（１）−５からなる群より選択される少なくとも１種を使用する、請求項３に記載の蛋白質測定方法。
   

   

   
5. 上記蛋白質指示薬は、当該蛋白質指示薬のｐＫａ以下のｐＨにおいては、蛋白質が共存しない場合に無色〜淡橙色を呈する一方、蛋白質が共存する場合に赤〜紫色を呈するものである、請求項１に記載の蛋白質測定方法。
6. 上記蛋白質は、アルブミンである、請求項１に記載の蛋白質測定方法。
7. アルブミン濃度が１０〜２０ｍｇ／ｄＬの範囲にあるアルブミン含有試料において、アルブミン濃度を測定する、請求項６に記載の蛋白質測定方法。
8. 蛋白質を測定するための指示薬であって、下記化学式（２）で示される化学構造を有する、蛋白質測定用指示薬。
   

   

   化学式（２）において、Ｘ１はハロゲン、ニトロ基またはニトロソ基、Ｘ２はハロゲン、Ｘ３はハロゲンまたは水素、Ｘ４は水酸基またはその塩、Ｘ５はカルボキシル基またはその塩である。
9. 上記化学式（２）において、Ｘ１はヨウ素、臭素、塩素またはニトロ基、Ｘ２はヨウ素または臭素、Ｘ３は塩素、臭素または水素である、請求項８に記載の蛋白質測定用指示薬。
10. 上記化学式（２）において、Ｘ１およびＸ２はヨウ素または臭素、Ｘ３は塩素である、請求項９に記載の蛋白質測定用指示薬。
11. 下記化学式（２）−１〜（２）−５のいずれかによって表される化学構造を有するものである、請求項８に記載の蛋白質測定用指示薬。
    

    

    

    
12. ｐＫａ以下のｐＨにおいては、蛋白質が共存する場合に無色〜淡橙色を呈する一方、蛋白質が共存する場合に赤〜紫色を呈するものである、請求項８に記載の蛋白質測定用指示薬。
13. 蛋白質を定量または半定量するために使用される試験片であって、蛋白質定量指示薬として、下記化学式（３）で示される化学構造を有するものを使用する、蛋白質測定用試験片。
    

    

    化学式（３）において、Ｘ１はハロゲン、ニトロ基またはニトロソ基、Ｘ２はハロゲン、Ｘ３はハロゲンまたは水素、Ｘ４は水酸基またはその塩、Ｘ５はカルボキシル基またはその塩である。
14. 上記化学式（３）において、Ｘ１はヨウ素、臭素、塩素またはニトロ基、Ｘ２はヨウ素または臭素、Ｘ３は塩素、臭素または水素である、請求項１３に記載の蛋白質測定用試験片。
15. 上記化学式（３）において、Ｘ１およひＸ２はヨウ素または臭素、Ｘ３は塩素である、請求項１３に記載の蛋白質測定用試験片。
16. 上記蛋白質指示薬として、下記化学式（３）−１〜（３）−５からなる群より選択される少なくとも１種を使用する、請求項１３に記載の蛋白質測定用試験片。
    

    

    
17. 上記蛋白質指示薬は、当該蛋白質指示薬のｐＫａ以下のｐＨにおいては、蛋白質が共存する場合に無色〜淡橙色を呈する一方、蛋白質が共存しない場合に赤〜紫色を呈するものである、請求項１３に記載の蛋白質測定用試験片。
18. 蛋白質に対する発色感度を高めるための増感剤をさらに含んでいる、請求項１３に記載の蛋白質測定用試験片。
19. 上記増感剤として、ポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコールのうちの少なくとも一方を含んでいる、請求項１８に記載の蛋白質測定用試験片。