WO2004015100A1

WO2004015100A1 - 炎症性疾患の判定方法

Info

Publication number: WO2004015100A1
Application number: PCT/JP2003/010131
Authority: WO
Inventors: Toshihiro Tanaka; Yozo Ohnishi; Koichi Ozaki; Aritoshi Iida; Yusuke Nakamura; Masatsugu Hori
Original assignee: Riken
Priority date: 2002-08-08
Filing date: 2003-08-08
Publication date: 2004-02-19
Also published as: EP1536000B1; JPWO2004015100A1; KR20050083625A; US20060147920A1; TWI326710B; AU2003254895A1; TW200406489A; EP1536000A1; EP1536000A4; US7754422B2; JP4688492B2

Abstract

　本発明の目的は、心筋梗塞と関連性のある一塩基多型（ＳＮＰｓ）を同定し、これらのＳＮＰｓを利用して心筋梗塞をはじめとする炎症性疾患を判定するである。本発明によれば、リンホトキシン-α（ＬＴ-α）遺伝子、Ｉ　Kappa　Ｂ−like（ＩＫＢＬ）遺伝子、及びＢＡＴ１遺伝子より成る群から選ばれる少なくとも1つの遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法、該方法に使用されるオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含む炎症性疾患診断用キット、並びにそれらの利用が提供される。さらに本発明によれば、ＬＴ-αを利用した、炎症性疾患の治療方法及び炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。

Description

明細書

炎症性疾患の判定方法技術分野

本発明は L T- _α遺伝子等に存在する遺伝子多型を検出することを含む炎症性疾患の判定方法、該方法に使用されるオリゴヌクレオチド、該オリゴヌクレオチドを含む炎症性疾患診断用キット、並びにそれらの利用に関する。本発明はさらに、 L T- αを利用した、炎症性疾患の治療方法及び炎症性疾患の治療薬のスクリ一二ング方法にも関する。背景技術

ライフスタイルの変化及び新しい薬理学的アプローチにも関わらず、心筋梗塞を含む冠状動脈疾患は多くの国々において主要な死亡原因となっている（Breslow, J. L. , Nature Med. 3, 600—601， 1997 ;Braunwald, E. , N. Engl. J. Med. , 337, 1360-1369, 1997)。従って、それらの発症における遺伝的及ぴ環境的因子を同定することが強く望まれている。

共通の遺伝的変異は、糖尿病や高血圧症などの生活習慣病に罹患する危険性と顕著に関連していることが知られている（Risch, N. , et al. , Science, 273, 1516-1517, 1996; Collins, F. S. , et al. , Science, 278, 1580 - 1581, 1997； Lander, E. S. , et al. , Science, 274, 536-539， 1996)。多遺伝子性疾患の感受性遺伝子を同定するには、「連鎖」を利用する方法と、「関連」を利用する方法がある。連鎖解析では、疾患感受性遺伝子の座位と遺伝マーカー（主としてマイクロサテライト）の座位が連鎖しているかを検出する、すなわち遺伝子座位間の関係を調べるのに対して、関連解析では特定の遺伝マーカー（主として一塩基多型： S N P ) のどの型（アレル：対立遺伝子）が疾患と関連しているかを検出する、つまり対立遺伝子間の関係を調べる。従って、共通の変異をマーカーとして用いる関連解析は疾患関連遺伝子の局在に対する連鎖解析のよりもずつと強力といえる。一塩基多型（SNP s) は、疾患易罹患性や薬剤反応性に関連する遺伝子を探索する際の有用な多型マーカーとなる。 SNP sは、遺伝子産物の質や量に直接影響を与えたり、ある疾患や薬剤による重篤な副作用に対する危険性を増やすことがある。よって、多くの SNP sを探索することにより、疾患関連遺伝子の同定や薬剤による副作用を避ける診断方法の確立に寄与できることを期待される。

ヒト染色体 6 p 21上の約 130 k bの領域には、リンホトキシン一 a (LT — α)、腫瘍壊死因子一a (TNF— a)、 LST 1、 1 C 7、ァログラフト炎症因子 1 (A I F— 1 ： allograft inflammatory - factor - 1)、 I kappa B—like protein ( I KB L)、 V-ATPase G - subunit like protein(ATP 6 G)、 B AT 1、 MI CB及び p 5- 1が存在している。 LT—α (TNF— j3としても知られる）は血管炎症過程の最初の段階に生産されるサイト力インの一つで、 i3 シート構造がサンドイッチ状に重なったホモトリマー構造をとり、インターロイキン一 1及ぴ接着分子のような他のメディエーターを誘導することによってサイトカインカスケードを活性する（Ross, R. , N. Engl. J. Med. , 340, 115-126, 1999)。サイト力インのような炎症メディエーターは、ァテローマ形成ゃァテローマ性損傷に関与し、管腔内血栓を誘導することが知られている（Ross, R. , N. Engl. J. Med. , 340, 115-126, 1999)。 I K B Lは主要組織親和性複合体（NHC) クラス I I領域において 6 p 21. 3に位置している。 I KB Lは B細胞における κ軽鎖遺伝子のインヒビター（ I KB)ファミリータンパク質に類似していると報告されている。 I KBフアミリーのタンパク質は B細胞内における C軽鎖遺伝子ェンハンサ一の核因子を阻害する作用を有する。

遺伝子変異と心筋梗塞との関係については、これまでヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の多型を分析して心筋梗塞の遺伝的要因を判定する方法（特開 2002-136291 号公報）などがある。しかしながら、上記の 6 p 21上の約 1 30 k bの領域に存在する遺伝子変異と心筋梗塞との関連についてはこれまで報告はない。発明の開示

本発明の課題は、心筋梗塞と関連性のある遺伝子多型を同定し、その遺伝子多型を利用して心筋梗塞をはじめとする炎症性疾患を判定する方法、該方法に用いることのできるオリゴヌクレオチド、炎症性疾患診断用キット、並びに炎症性疾患の治療方法などを提供することにある。

本発明者らは上記の課題を解決すべくヒト LT—ひ、 I KBL、及ぴ BAT 1 遺伝子内の S N P sをそれぞれ約 1, 000人の心筋梗塞患者群と対照群についてマルチプレックス P CR—ィンベーダ法によりタイビングし、患者一対照研究 (case-control study)による関連解析を行った結果、これらの SNP sの頻度が統計学的に有意に心筋梗塞患者で多いことを同定した。さらに、ルシフェラーゼアツセィ法、リコンビナントプロテインを用いた実験により、これらの SNP s が該遺伝子の転写活性に影響を与え、その結果遺伝子産物量が変化し、この変ィ匕が心筋梗塞等の疾患を引き起こす可能性を見出した。本発明はかかる知見により完成されたものである。

すなわち、本発明によれば、リンホトキシン- a (LT- ο 遺伝子、 I Kappa B -like (I KBL) 遺伝子、及ぴ B AT 1遺伝子より成る群から選ばれる少なくとも 1つの遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。

すなわち、本発明によれば、リンホトキシン- a (LT-ひ）遺伝子、 I Kappa B -like (I KBL) 遺伝子、及び B AT 1遺伝子より成る群から選ばれる少なくとも 1つの遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。

本発明によればまた、下記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。

(1) 配列番号 1に示す LT-α遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 10番目の塩基における G/Aの多型 ( 2 ) 配列番号 2に示す L T- a遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基における AZGの多型

(3) 配列番号 3に示す LT-α遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 81番目の塩基における CZAの多型

(4) 配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 572番目の塩基における T/Aの多型

(5) 配列番号 5に示す BAT 1遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1228番目の塩基における G Z Cの多型

本発明によればまた、配列番号 3に示す L T - α遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 80番目から 82番目の塩基の少なくとも一つが他の塩基に置換されることによって、コードされるアミノ酸がスレオニンからァスパラギンに変異する遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法が提供される。

本発明によればまた、配列番号 1から 5に示される配列における、前記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも 1つの部位を含む連続する少なくとも 10塩基の配列、又はその相補配列にハイブリダイズすることができ、前記判定方法においてプロ一ブとして用いるオリゴヌクレオチドが提供される。

( 1 ) 配列番号 1に示す L Τ- 遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 10番目の部位

( 2 ) 配列番号 2に示す L Τ- 遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目部位

(3) 配列番号 3に示す LT-α遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 81番目の部位

(4) 配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 572番目の部位

(5) 配列番号 5に示す BAT 1遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1228番目の部位

本発明によればまた、配列番号 1から 5に示される配列における、前記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも 1つの部位を含む連続する少なくとも 1 0塩基の配列、及び Z又はその相補配列を増幅することができ、前記判定方法においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチドが提供される。

( 1 ) 配列番号 1に示す L T- 遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 1 0番目の部位

( 2 ) 配列番号 2に示す L T- a遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目部位

(3) 配列番号 3に示す LT-_a遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 8 1番目の部位

(4) 配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 5 72番目の部位

(5) 配列番号 5に示す BAT 1遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1 2 28番目の部位

さらに、本発明によれば、上記のオリゴヌクレチドの 1種以上を含む、炎症性疾患診断用キットが提供される。

本発明の別の側面によれば、前記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、 LT—a、 I KB L、又は BAT 1の発現状態の分析方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、前記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含む LT -ひ、 I KB L、又は BAT 1遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、 LT - 、 I KB L、又は BAT 1の転写活性の測定方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、前記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含む LT- 、 I KB L、又は BAT 1遺伝子断片を細胞に導入し、 LT一 a；、 I KB L、又は BAT 1の転写活性を阻害する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、 LT- _α、 I KBL、又は BAT 1の転写活性阻害物質のスクリーニング方法が提供される。

本発明の好ましい態様によれば、前記 LT- a、 I KBL、又は BAT 1遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ュニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する、上記いずれかの方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、前記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含む遺伝子断片と LT一ひ、 I KB L、又は BAT 1の転写制御因子の存在が予想される試料を接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することを含む、 L Τ- _αの転写制御因子のスタリーニング方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、配列番号 2に示す L Τ - α遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基における CZAの多型を含む遺伝子断片を接着分子誘導性細胞に導入し、該細胞の接着分子の誘導化能を評価する方法が提供される。

本発明のさらに別の側面によれば、リンホトキシン- α (LT-α) の発現又は活性を抑制することを含む、炎症性疾患の治療方法が提供される。好ましくは、炎症性疾患は心筋梗塞である。上記方法において好ましくは、リンホトキシン- a (LT-α) に対する抗体を用いる。

本発明のさらに別の側面によれば、リンホトキシン-ひ (LT-α) の発現又は活性を抑制する物質を有効成分として含む、炎症性疾患の治療薬が提供される。好ましくは、リンホトキシン -α (LT-α) の発現又は活性を抑制する物質は、リンホトキシン -αに対する抗体である。

本発明のさらに別の側面によれば、細胞と候補物質とを接触させる工程、細胞内におけるリンホトキシン -_α (LT-α) をコードする遺伝子の発現量を分析する工程、及ぴ候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法が提供される。本発明のさらに別の側面によれば、リンホトキシン- a (LT- c と候補物質とを接触させる工程、リンホトキシン - の活性を測定する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較してリンホトキシン- の活性を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリー二ング方法が提供される。好ましくは、リンホトキシン -aの活性は、接着分子及び Z又はサイト力インを誘導する活性である。好ましくは、接着分子は、 VCAM 一 1、 I CAM— 1又は E—セレクチンであり、サイト力インは TNFである。本発明の一例によれば、リンホトキシン -α (LT-α) の発現量又は活性の低下は、 I KB L遺伝子の発現量又は活性の増加を介したものである。図面の簡単な説明

図 1は、 LT一 a遺伝子座を含む 130 k bのゲノム領域における連鎖不平衡を示す。

上：各遺伝子におけるゲノタイプされた SNP sの数を表す転写マップ。

下：本領域における D' の分布。 D' は LT一 aのイントロン 1内の SNP対他の S N Pで示す。

図 2 (A) は LT一 aのイントロン 1 (252A>G)、図 2 (B) は I KBL のプロモーター領域（― 63T>A) 内の SNPによる転写制御活性をそれぞれ示す。 * 10G— 252Aと 1 OA— 252Gとの間の比較において pく 0. 0 1 ： * *一 6 3 Aァレルと一 6 3 Tァレル間の比較において p < 0 · 0 1 (student t test)。

図 3は、 LT一ひのイントロン 1に対する未知の核因子の結合を示す。矢印は核因子の G—ァレルに対するより強い結合を示すバンドである。

図 4 (A) は、 HCASMCのみを培養した場合（白色バー）、 HCASMCを 26 T-LT-a (灰色バー）又は 26N— LT一 a (黒色バー）（5 n g /m 1 ) を用いて 4時間処理して培養した場合の VCAM— 1の相対的な mRNA発現量をそれぞれ示す。図 4 (B) は、 HCASMCのみを培養した場合（白色バー）、 H CASMCを 26 T—LT— α (灰色バー）又は 26 N— L T— α (黒色パー） (5 n g/m 1 ) を用いて 4時間処理して培養した場合の E—セレクチンの相対的な mR A発現量を示す。結果は平均値土 S.D, (n=3、 *pく 0.01、 **ρ〈0· 05対 26T) を示す。

図 5は、ヒト冠動脈血管内皮細胞（HCAEC) における LT- a (26Asn) (26N) の TNF誘導活性及ぴ S e l e c t i n E誘導活性（相対的な mRNA発現量）について、 LT- a (26Thr) (26T) の場合と比較した結果を示す。結果は平均値土 S. D. ( * p<0.01、 **p<0.05対 26T)を示す。

図 6は、血球系細胞株（HL- 60)における LT- a (26Asn) (26N) の TNF誘導活性及び I CAM If!導活性（相対的な mRNA発現量）について、 LT- a (26Thr) (26T) の場合と比較した結果を示す。結果は平均値土 S.D. (*]3<0.01対26；を示す。発明を実施するための最良の形態

[1] 炎症性疾患の判定方法

本発明の方法は、炎症性疾患と関連性を示す特定遺伝子に存在する遺伝子多型、特には一塩基多型（SNP s) を検出することによって、炎症性疾患の発症の有無、あるいは炎症性疾患の発症の可能性を判定する方法である。

上記の特定遺伝子とは、ヒト染色体 6 p 2 1上の約 1 30 k bの領域に存在するリンホトキシン -a (LT-ct) 遺伝子（配列番号 6) 、 I Kappa B— like ( I K B L) 遺伝子（配列番号 7)、及び BAT 1遺伝子（配列番号 8) より成る群から選ばれる少なくとも 1つの遺伝子であって、遺伝子多型は、これらの遺伝子を含むゲノム DNAのェキソン、イントロン、プロモーター部分に存在する。

本発明において「リンホトキシン-ひ (LT-α) 遺伝子、 I Kappa B— like ( I KB L) 遺伝子、及ぴ BAT 1遺伝子より成る群から選ばれる少なくとも 1 つの遺伝子に存在する遺伝子多型（一塩基多型など）を検出する」とは、（i)当該遺伝子多型（遺伝子側多型と称する）を直接検出すること、及び (ii)前記遺伝子の相補配列側に存在する遺伝子多型（相補側多型と称する）を検出し、その検出結果から遺伝子側多型を推定することの双方を指すものとする。ただし、遺伝子側の塩基と相補配列側の塩基とが完全に相補的な関係にあるとは限らないという理由から、遺伝子側多型を直接検出することがより好ましい。

なお、本発明において検出対象となる相補側多型としては、リンホトキシン- a (LT-α) 遺伝子の相補配列、 I Kappa B—like ( I KB L) 遺伝子の相捕配列、及ぴ BAT 1遺伝子の相補配列から選ばれる少なくとも一つの相補配列に存在する遺伝子多型が挙げられ、より具体的には、下記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型が挙げられる。

をレヽう。

(1) LT-α遺伝子の相捕配列における、配列番号 1に示す LT -ひ遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 1 0番目の塩基に相補的な塩基の c/τの多型

(2) LT- a遺伝子の相補配列における、配列番号 2に示す LT-α遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基に相補的な塩基の TZCの多型

(3) LT-α遺伝子の相補配列における、配列番号 3に示す LT- 遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 8 1番目の塩基に相補的な塩基の G/Tの多型

(4) I KB L遺伝子の相補配列における、配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 5 72番目の塩基に相補的な塩基の A/Tの多型

(5) BAT 1遺伝子の相補配列における、配列番号 5に示す B AT 1遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1 228番目の塩基に相補的な塩基め CZGの多型本明細書において、遺伝子（例えば LT— CK遺伝子）における X番目の塩基をその位置を示す数字 Xと、塩基を表す記号との組み合わせで示す場合がある。例えば、「1 0G」とは、 1 0番目の位置にある Gを示し、「1 0 A」とは、 1 0 番目の位置にある Aを示し、「1 OG/AJ とは、 1 0番目の位置にある G又は Aを示す。

本明細書において配列番号 2に示す LT-α遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基は、 LT-α遺伝子のェキソン 1の 1番目から数えて 25 2番目の塩基に相当する。また、配列番号 3に示す LT-_a遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 8 1番目の塩基は、 LT-α遺伝子のェキソン 1の 1番目の塩基から数えて 7

23番目の塩基に相当する。

従って、本明細書において配列番号 2に示す L T- a遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基における G/A多型は、 LT- o;イントロン 1 252G /Aと、また配列番号 3に示す L Τ_ α遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 81番目の塩基における C/Aの多型は、 LT- αェキソン 3 723 CZAと表現する場合がある。

本明細書において配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 572番目の塩基は、 634番目の塩基を 1番とした場合に下流方向に向かつて 63番目（—63番目）の塩基に相当する。また、配列番号 5に示す BAT 1 遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1228番目の塩基は、 1250番目の塩基を 1番とした場合に下流方向に向かって 23番目（一 23番目）に相当する。従って、本明細書において配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 572番目の塩基における T/Aの多型は、 I KB Lプロモーター —63T/Aと、また配列番号 5に示す BAT 1遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1228番目の塩基における G/Cの多型は、 BAT 1プロモーター - 2

3 G/Cと表現する場合がある。

例えば、後記表 1に示すように、配列番号 1に示す LT- α遺伝子のェキソン 1 の塩基配列の 10番目の塩基が Gである場合（LT— αェキソン 1 10G) 、配列番号 2に示す L Τ - α遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基が Αである場合（LT一 αイントロン 1 252 Α) 、配列番号 3に示す L Τ- α遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 81番目の塩基が Cである場合（LT—o;ェキソン 3 723 C) 、配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 572番目の塩基が Aである場合（ 1 KB Lプロモーター一 63 A) 、配列番号 5に示す BAT 1遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1228番目の塩基が Gである場合（BAT 1プロモーター一 23G) は、炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能性が高いと判定できる。

これに対し、配列番号 1に示す LT- a遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 1 0番目の塩基が Aである場合（丁ー0；ェキソン1 1 0A) 、配列番号 2に示す L Ύ-α遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基が Gである場合（ L Τ一ひイントロン 1 2 5 2 G)、配列番号 3に示す LT-α遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 8 1番目の塩基が Aである場合（LT一 αェキソン 3 723 Α) 、配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 5 72番目の塩基が Tである場合（ 1 KB Lプロモーター一6 3T) 、配列番号 5に示す BAT 1 遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1 228番目の塩基が Cである場合 (BAT 1プロモーター一 23 C) は、炎症性疾患が発症していない、あるいは発症の可能性が低いと判定できる。

また、配列番号 1に示す LT- α遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 10番目の塩基と配列番号 2に示す LT -ひ遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基（ェキソン 1の 1番目の塩基から数えて 2 52番の塩基）の組み合わせの違い (10 G— 2 5 2 Αヘテロ接合、 1 OA— 2 52Gヘテロ接合、 1 0A— 2 5 2 Aホモ接合）によって LT -ひ発現量が異なる。従って、配列番号 1に示す LT- ひ遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 1 0番目の塩基と配列番号 2に示す LT- α 遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基の組み合わせが、 1 0 G— 2 52 Αヘテロ接合、 1 OA— 2 52Gヘテロ接合、 1 0 A— 25 2 Aホモ接合であるかを検出することによつても、炎症性疾患の判定ができる。

例えば後記実施例に示すように、 1 0A— 25 2 Gである場合は炎症のシグナルである LT—αの発現量が有意に多く、炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能性が高いと判定できる。

また、配列番号 3に示す L T- α遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 8 1番目の塩基における C/Aの多型は、ェキソン 3中の 26番目のコドンが変化（ACCから AAC) することによってスレオニンからァスパラギンへのアミノ酸変異をもたらす。例えば後記実施例に示すように、 2 6番目のコドンがァスパラギンをコードする場合（26N) は、スレオニンをコードする場合（26T) より有意に LT- α:の発現量が多く、またヒト冠状動脈平滑筋細胞（HCASMC) において細胞接着因子である血管細胞接着分子一 1 (VCAM— 1) や Ε—セレクチンを誘導することから炎症性疾患が発症している、あるいは発症の可能性が高いと判定できる。

本明細書において、疾患の「判定」とは疾患発症の有無の判断、疾患発症の可能性の判断（罹患危険性の予想）、疾患の遺伝的要因の解明などをいう。

また、疾患の「判定」は、上記の一塩基多型の検出法による結果と、所望により他の多型分析（ V N T Rや R F L Ρ )及び又は他の検査結果と合わせて行うこともできる。

また、本明細書において、「炎症性疾患」とは、炎症性病態との相関が知られている細胞接着因子やサイトカインの誘導が認められる疾患であれば特に限定はされないが、例えば慢性関節リウマチ、全身性エリマト一デス、炎症性腸炎、種々のアレルギー反応、細菌性ショック、心筋梗塞や脳卒中などの動脈硬化性疾患などが挙げられ、特には心筋梗塞が挙げられる。

(検出対象）

遺伝子多型の検出の対象は、ゲノム DNAが好ましいが、場合によっては（つまり多型部位及ぴその隣接領域の配列がゲノムと同一または完全相補的になっている場合） cDNA、又は mRNAを使用することもできる。また、上記対象を採取する試料としては、任意の生物学的試料、例えば血液、骨髄液、精液、腹腔液、尿等の体液；肝臓等の糸且織細胞；毛髪等の体毛等が挙げられる。ゲノム DN A等は、これらの試料より常法に従い抽出、精製し、調製することができる。 (増幅)

遺伝子多型を検出するにあたっては、まず遺伝子多型を含む部分を増幅する。増幅は、例えば PCR法によって行われるが、他の公知の増幅方法、例えば NA SB A法、 LCR法、 SDA法、 LAMP法等で行ってもよレヽ。

プライマーの選択は、例えば、配列番号 1から 5に示される配列における、前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも 1 0塩基以上、好ましくは 1 0〜 1 0 0塩基、より好ましくは 1 0〜 5 0塩基の配列、及ぴ Z又はその相補配列を増幅するように行う。

プライマーは、前記の一塩基多型部位を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において 1又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。

増幅のために用いるプライマーは、試料が一の対立遺伝子型の場合にのみ増幅されるようにフォヮ一ドプライマ一又はリバースプライマーの一方が一塩基多型部位にハイブリダィズするように選択してもよい。プライマーは必要に応じて蛍光物質や放射性物質等により標識することができる。

(遺伝子多型の検出）

遺伝子多型の検出は、一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダィゼーシヨンにより行うことができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。プローブは、前記の一塩基多型部位を含み、被検試料とハイブリダィズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異性を与えるものである限り何等限定はない。プローブとしては、例えば配列番号 1から 5に示す配列における、前記の一塩基多型部位を含む連続する少なくとも 1 0塩基以上、好ましくは 1 0〜1 0 0塩基の配列、より好ましくは 1 0〜 5 0塩基の配列、又はそれらの相補配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、一塩基多型部位がプローブのほぼ中心部に存在するようにオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該ォリゴヌクレオチドは、プローブとして機能し得る限り、即ち、目的の対立遺伝子型の配列とハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、その配列において 1又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。また、プローブには、 R C A (rolling circle ampl if i cat i on)法による増幅に用いられる一本鎖プローブ（パドロックプローブ）のように、ゲノム D N Aとァニールし、環状になることによって上記のブロープの条件を満たすプローブが含まれる。

本発明に用いるハイブリダィゼーション条件は、対立遺伝子型を区別するのに十分な条件である。例えば、試料が一の対立遺伝子型の場合にはハイブリダィズするが、他の対立遺伝子型の場合にはハイブリダィズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。ここで、「ストリンジェントな条件」としては、例えば、例えば、モレキュラークローユング ·ァ ·ラボラトリーマニュアル第 2 版 (Sambrook et al. , 1989)に記載の条件等が挙げられる。具体的には、例えば、 6 XS SC (1 X S SCの糸且成： 0. 15M Na C l、 0. 015 Mタエン酸ナトリウム、 p H 7. 0)、 0. 5 % S D S、 5 Xデンハート及ぴ 10 Omg/m 1 二シン精子 DN Aを含む溶液中プローブとともに 65°Cでー晚保温するといぅ条件等が挙げられる。

プローブは、一端を基板に固定して DNAチップとして用いることもできる。この場合、 DN Aチップには、一の対立遺伝子型に対応するプローブのみが固定されていても、両方の対立遺伝子型に対応するプローブが固定されていてもよい。遺伝子多型の検出は、制限酵素断片長多型分析法（RF LP ： Restriction fragment length polymorphism) により行うこともできる。この方法では、一塩基多型部位がいずれの遺伝子型をとるかによって制限酵素により切断されるか否かが異なってくる制限酵素で試料核酸を消化し、消化物の断片の大きさを調べることにより、該制限酵素で試料核酸が切断されたか否かを調べ、それによつて試料の多型を分析する。

遺伝子多型の検出は、増幅産物を直接配列決定することによつて行つてもよい (ダイレクトシークェンシング法) 。配列決定は、例えばジデォキシ法、 Maxam- Gilbert法等の公知の方法により行うことができる。

遺伝子多型の検出は、インベーダーアツセィにより行ってもよい。この方法では、 SNPがあるかどうかテストする DNAターゲットフラグメントに対して相捕的配列を持つインベーダーオリゴと 5，のフラップ構造を持ち、 SNP を検出するための相捕的オリゴ（シグナルプローブ）を使用する。まずターゲット DNAに対してインベーダーオリゴとシグナルプローブをハイブリダィズさせる。この時、ィンベーダーオリゴとプローブは 1塩基がォーパーラップする構造（invasive structure)を持つ。この部分に Cleavase (Archaeoglobus fulgidus力ら分離されたフラップ ·ェンドヌクレアーゼ）が作用し、 SNP部位のシグナルプローブの塩基とターゲットの塩基が相補的（SNP なし）の場合にはシグナルプローブの 5 ，フリップが切断される。切断された 5 ' フリップは FRET Probe (Fluorescence resonance energy transfer probe)にノヽィプリダイスする。 FRET フローブ上に f 蛍光色素とクェンチヤ一（Quencher)が近接しており、蛍光が抑制されるが、 5 ，フリップ DNAが結合することにより Cleavaseによって蛍光色素の部分が切断され、蛍光シグナルが検出できる。

遺伝子多型の検出はまた、変性勾配ゲル電気泳動法（D G G E ： denaturing gradient gel electrophoresis)、一本鎖コンフオメーション多型解析（S S C P ： single strand conformation polymorphism) 、对 L遺 is子特異白勺 Pし R (allele— specific PCR) 、 A S O 、allele - specif ic oligonucleotide) によるハイフリタィーゼーション法、ミスマッチ部位の化学的切断 ( C CM： chemical cleavage of mismatches; 、 H E T (heteroduplex method)法、 P E X (primer extension;法、 R C A (rolling circle amplification)法等を用いることができる。

[ 2 ] 炎症性疾患診断用キット

前記のプライマー又はプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、これを含む炎症疾患診断用キットとして提供できる、キットは、上記遺伝子多型の分析法に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識、緩衝液等を含んでいてもよい。

[ 3 ] L T一 α、 I K B L、又は B A T 1の発現状態の分析方法

本発明によればまた、前記の（1 ) から（5 ) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出することによって、 L T - 、 I K B L、又は B A T 1の発現状態を分析することができる。

例えば、配列番号 1に示す LT- a遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 1 0番目の塩基が Aで、配列番号 2に示す LT- a遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基（ェキソン 1の 1番目の塩基から数えて 2 5 2番の塩基）が Gである場合（1 OA— 2 52Gハプロタイプ）は、 LT- aの発現量が多いと判断できる。これに対し、配列番号 1に示す L T_ a遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 1 0番目の塩基が Gで、配列番号 2に示す LT-_a遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90 番目の塩基（ェキソン 1の 1番目の塩基から数えて 2 5 2番の塩基）が Aである場合（1 0G— 25 2 Aハプロタイプ）、配列番号 1に示す LT- a遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 1 0番目の塩基が Aで、配列番号 2に示す L Ύ-α遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基（ェキソン 1の 1番目の塩基から数えて 2 52番の塩基）が Αである場合（1 OA— 2 5 2 Aハプロタイプ）は、 LT - aの発現量が少ないと判断できる。

[4] LT一 a；、 I KB L、又は BAT 1の転写活性の測定方法

本発明によればまた、前記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含む LT- _a、 I KB L、又は BAT 1遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することによって LT- a、 I KBL、又は BAT 1の転写活性を測定することができる。

本発明の好ましい態様によれば、前記 LT- a、 I KB L、又は BAT 1遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ュニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。例えば、一塩基多型がプロモーター部位に存在する場合は、その一塩基多型を含む遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を培養し、レポーター活性を測定すれば、一塩基多型による転写効率に違いを測定することができる。

ここでリポータ一遗伝子としては、ルシフェラーゼ、クロラムフエ二コール、ァセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼなどの遺伝子が用いられる。

[5] LT-α, I KB L、又は BAT 1の転写活性阻害物質のスクリーニング方法

本発明においては、前記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含む LT- α、 I KB L、又は BAT 1遺伝子断片を細胞に導入し、 LT—a、 I KB L、又は BAT 1の転写活性を阻害する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することによって LT- a、 I KB L、又は BAT 1転写活性阻害物質をスクリ一ユングすることできる。

本発明の好ましい態様によれば、前記 LT- a、 I KB L、又は BAT 1遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ュニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リポーター活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する。例えば、 LT一 _αの発現量が有意に高いことが認められる一塩基多型（例えば上記 1 OA— 25 2 Gハプロタイプ）を有する遺伝子の下流にレポーター遺伝子を挿入した系を導入した細胞を候補物質の存在下又は非存在下の両方の場合について培養し、候補物質の存在下で培養を行った場合にレポーター活性が下がれば、その候補物質は LT一転写活性阻害物質として選択することができる。

ここでリポーター遺伝子としては、上記に挙げた遺伝子が用いられる。

候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリ一、ファージディスプレーライブラリ一、コンビナトリアルライブラリーでもよレ、。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリ一が好ましい。化合物ライブラリ一の構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリ一を使用することもできる。

上記のスクリ一二ング法により得られる LT- α、 I KB L、又は BAT 1の転写活性阻害物質もまた本発明の範囲内である。このような LT-_a、 I KB L、又は BAT 1の転写活性阻害物質は、心筋梗塞治療剤、抗炎症剤、免疫抑制剤などの各種薬剤の侯捕物質として有用である。

[6] LT-o;転写制御因子のスクリーニング方法

本発明においてはまた、前記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含む遺伝子断片と LT一ひ、 I KBL、又は BAT 1 の転写制御因子の存在が予想される試料を接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することによって、 LT- _α、 I KB L、又は BAT 1の転写制御因子をスクリーニングすることができる。前記の一塩基多型を含む遺伝子断片と L Τ-α, I KBL、又は BAT 1の転写制御因子の存在が予想される物質との結合の検出は、ゲルシフト法（電気泳動移動度シフト解析： electrophoretic mobility shift assay, EMSA)、 DNase I フットプリント法等によつて行うことがきるが、ゲルシフト法が好ましい。ゲルシフト法では、タンパク質（転写制御因子）が結合すると、分子サイズが大きくなり電気泳動における DNAの移動度が低下するので、 ³²Pで標識した遺伝子断片と転写制御因子を混ぜ、ゲル電気泳動にかける。オートラジオグラフィ一で DNAの位置を見ると、因子の結合した DNAはゆつくり動くので、通常のバンドよりも遅れて移動するバンドとして検出される。

[ 7 ] 炎症性疾患の治療方法及び炎症性疾患の治療薬

本発明においては、以下の実施例 5で示す通り、 LT—_aタンパク質の動脈壁隆起性病変部での発現状態を調べた結果、心筋梗塞患者由来の動脈壁隆起性病変部内血管平滑筋細胞およびマクロファージにおいて L T一 αタンパク質が強く染色されており、病変の発生、進展に関連している可能性が示唆された。従って、 L Τ一 _αタンパク質の発現や活性を抑制すれば病変の改善、再発又は予防が期待できる。

さらに、心筋梗塞感受性遺伝子産物である L Τ一 ο;の 26Asn変異体は、野生型 (26Thr)に比べて血管平滑筋細胞からの接着分子（VCAM- 1， E-selectin) の誘導能が強いことが知られている (Ozaki k. et al. Nature Genetics 32, 650-654， 2002)。本発明では、以下の実施例 6で示す通り、ヒト冠動脈血管内皮細胞（HCAEC) および血球系細胞株（HL- 60)における L T—α変異体（26Asn) のサイトカイン誘導活性及び接着分子誘導活性について、 26Thr の活性と比較した。その結果、図 5及ぴ 6に示したように、 L T—α (Asn26) は L T— a (Thr26) に比べて血管内皮細胞からの Tumor necrosis factor- a (TNF)、 selectin - E mRNAを 2倍高く、 HL-60細胞からは TNF, ICAM-1 (intracellular cell adhesion molecule- 1) mRNA を 3倍高く誘導した。これらの結果は、 L T一ひ ( 2 6Asn) が心筋梗塞等の炎症性疾患の発症、進展に関与していることを示していると共に、 1^丁_ 0；の活性を抑制することによる心筋梗塞等の炎症性疾患の治療が期待できる。また、 L T一 αの活性を抑制するための手段としては、例えば、リンホトキシン - a ( L T- a ) に対する抗体を用いることができる。

また、リンホトキシン - a ( L T- α ) の発現又は活性を抑制する物質を有効成分として含む、炎症性疾患の治療薬も本発明の範囲内に含まれる。ここで用いるリンホトキシン-ひ ( L T- α ) の発現又は活性を抑制する物質としては、リンホトキシン _ _αに対する抗体が挙げられる。また、リンホトキシン- αに対する抗体としては、ヒト抗体又はヒト化抗体を使用することもできる。

リンホトキシン - に対する抗体は、定法により作製することができる。例えば、リンホトキシンに対するポリクローナル抗体は、リンホトキシン - _αを抗原として哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ゥサギ、ャギ、ヒッジ、ゥシ等）を当業者に公知の方法で免疫感作し、該哺乳動物から血液を採取し、採取した血液から抗体を分離 ·精製することにより得ることができる。抗原を投与する際には、適当なアジュパントを使用することもできる。血液からの抗体の分離 ·精製は、例えば遠心分離、硫酸ァンモニゥムまたはポリエチレングリコールを用いた沈澱、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ァフィ二テイクロマトグラフィ一等のクロマトグラフィー等の通常の方法によって行うことがでさる。リンホトキシン- αに対するモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを用いて作製することができる。リンホトキシン -aに対するモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、抗体産生細胞（免疫動物から採取した脾細胞、リンパ節細胞、 Βリンパ球等）とミエローマ細胞（例えば、マウスでは、 P 3X63Ag 8、 P 3U 1株、 S p 2/0株など）とをポリエチレングリコール又はセンダイウィルスなどの融合促進剤を用いて細胞融合させることにより作製することができる。細胞融合後のハイプリドーマの選抜にはヒポキサンチン 'アミノプテリン 'チミジン（HAT) 培地を常法に従って使用することができる。得られたハイブリド一マから目的とするモノクローナル抗体を製造するには、通常の細胞培養法や腹水形成法により該ハイプリドーマを培養し、培養上清あるいは腹水から該モノクローナル抗体を精製すればよい。

[8] 炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法

上記の通り、本発明では、炎症性疾患では、リンホトキシン -aの発現又は活性の亢進が関与していることが示されたことにより、リンホトキシン- αの発現又は活性を低下させる物質は、炎症性疾患の治療薬として有用であることが判明した。本発明によればさらに、リンホトキシンの発現又は活性を^ ί氐下させる物質をスクリーニングする方法が提供される。上記スクリーニングの一例としては、細胞と候補物質とを接触させる工程、細胞内におけるリンホトキシン -a (LT-a) をコードする遺伝子の発現量を分析する工程、及ぴ候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程により行うことができる。また、上記スクリーエングの別の例としては、リンホトキシン -ひ（LT-ひ）と候補物質とを接触させる工程、リンホトキシン- _αの活性を測定する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較してリンホトキシン- _aの活性を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程により行うことができる。ここで言うリンホトキシン- aの活性とは、例えば、接着分子及び/又はサイト力インを誘導する活性であり、接着分子の具体例としては、 VCAM—1、 I CAM— 1又は E—セレクチンであり、サイトカインの具体例としては TNFである。

候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、例えば、本明細書中上記 [5] に記載した各種のライプラリー等を使用することができる。

以下の実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は実施例によつて限定されるものではない。実施例

実施例 1 (関連性研究）

(1) 方法

①被験者

一般に、心筋梗塞の診断には、次に挙げる 3つの基準のうち 2つを必要とする： (1) 胸の圧迫、痛み、又は締め付けが 30分以上継続する臨床歴、（2) 少なくとも一の標準又は二の胸部誘導において 0. lmVより大きい ST—セグメント上昇、（3)通常の実験値の 2倍よりも大きい血清クレアチンキナーゼ濃度における上昇。これらの基準によって心筋梗塞と診断された患者 1， 133名を被験者とした。心筋梗塞患者の被験者の年齢範囲は 28〜 85才で、平均年齢は 62. 5才であった。一方、幾つかの医療機関を通じて志願した健常者 1,006名を対照とした。対照の被験者の年齢範囲は 5才から 88才で、平均年齢は 38. 5才であつた。なお、すべての被験者は日本人であった。

② SNP発見及びゲノタイビング

全ゲノム関連性研究のために、ウェブサイト（http：〃 snp.ims.u-tokyo.ac.jp) 上で利用できる SNPデータベースを用いた。 SNP sのスクリーニングは既報 (Iida, A.， et al. , J. Hum. Genet. , 46, 668-683, 2001) に従って行った。 LT 一 α、 TNF— α、 L ST 1、 1 C 7、ァログラフト炎症因子- 1 (allograft inf丄 ammatoi - factor-l (AIF - 1) )、 I kappa B— like protein ( I KB L)、 V - ATPase G- subunit like protein(ATP 6 G)、 BAT 1、 MI CB及ぴ p 5— 1を含む約 1 30 k bの 6 p 2 1上の関連領域（図 1、上パネル）をスクリー二ングした。スクリ一二ングに先立って、 GeneBankデータベースからの配列 Y14768、 ΑΡ000506及ぴ AC004184をアセンブリングすることによって約 1 30 k bの参照配列を作成した。 PCRプライマーデザイン、 PCR実験、 DNA抽出、 DNA 配列及ぴ SNP発見のためのプロトコルは Iida， A. , et al. , J. Hum. Genet. , 46, 668-683, 2001 に記載に従った。 1 30 k b領域における S NP sはィンベーダ一アツセィ又は P C R産物のダイレクトシークェンスによって capillary sequencer (ABI3700, Applied Biosystems)を用レヽて既報（Ohnishi, Y.， et al. , J. Hum. Genet.， 46, 471-477, 2001； lida, A. , et al. , J. Hum. Genet. , 46, 668-683, 2001) に従って行った。

本実施例で使用したプライマー及ぴプローブを以下に記載する。

(1) LT-a (ィンベーダ一法によりタイピング)

PCRプライマー

フォワードプライマー： ACTCAGCCAAGGGTGCAGAG (配列番号 9 )

リバースプライマー： CTTCCTCAGGGATTGAGACCTC (配列番号 1 0 )

プローブ（括弧内は S P)

Exon 1 10G>A

TCCAAAGCACGA

TGGGCCCGGACGCTCAGGTCCCTTTATAGAGGAAGCGGCAGTGGCAGCGTGG (配列番号 1 1及び 1 2)

Intron 1 90A〉G

AAACAGAGAATGTGTGACAGAGACAATGAGACTGACAGATGGAGAGTCAGAG (配列番号 1 3及ぴ 1 4)

Exon 3 81C>A CTGCTGCTCACCTCATTGGTAAACATCCACCTGACCTCCCAGACATGTCCCC (配列番号 1 5及ぴ 1 6)

(2) I KB L (シークェンス法によりタイピング）

PCRプライマー

フォワードプライマー： TTTMGGCTCAGGAGCCCAG (配列番号 1 7 )

リバースプライマー： TCCCTGTTGTTGTCCCACTG (配列番号 1 8)

シーケンスプライマー： ATATCATGTACCCGGCAGAC (配列番号 1 9)

(3) BAT 1 (インベーダー法によりタイピング）

PCRプライマー

フォワードプライマー： TGGTCTCACATCACTGTTACGC (配列番号 20)

リバースプライマー： TCTTCCCGCTCGGATTCAG (配列番号 2 1)

プローブ：

AAGCTTACCT

CTTCCGGTTGCAGGCTTCCCTCTACTCCAGCCTCCCGCCTTCTTGGCTGCAA (配列番号 22及ぴ 2 3)

③統計学的分析

関連性研究のための統計学的分析、ハプロタイプ頻度及ぴ Hardy- Weinberg平衡、及ぴ LD係数（D， ) の計算は既報（Yamada, R.， et al. , Am. J. Hum. Genet, 68, 674-485, 2001) に従って行った。

(2) 実験結果

関連性研究の第 1のステップとして、ハイスループットマルチプレックス PC R—インベーダーアツセィ法（Ohnishi, Y.， et al. , J. Hum. Genet. , 46, 471-477, 2001) を用いて 94名の心筋梗塞患者をゲノタイピングし、その結果を健常人集団に見出されるァレル頻度と比較した。約 75， 000の遺伝子をベースとした S N P sのスクリーエングの結果、染色体 6 p 2 1上の LT—o;遺伝子内にあるひとつの SNP (イントロン 1 ； 25 2A>G) の心筋梗塞に対する弱い関連性を同定することができた（％²=9.4、 p=0.0022；マイナーアレルに対するホモ接合体対その他）。続いて全部で 1, 133名の心筋梗塞患者と 1,006の対照者をゲノタイピングした結果、 ²値が 18.0 (p=0.000022；マイナーアレルに対するホモ接合体対その他）及ぴォッズ比が 1.69 (95%コンフイデンスインターパル (C I ) ； 1.32-2.15、表 1)となり、その関連性はずつと顕著になった。これらのデータは、心筋梗塞感受性遺伝子がこの領域内に存在することを示した。

LDマッピングのための高密度 SNPマップを 16名の心筋梗塞患者と 16名の対照者からの DN Aのダイレクトシークェンシングによって構築した。 TNF— 、 LT— ]3、 I kappaB- like protein( I KB L)、及ぴ B AT 1 (図 1、上パネル）に関連する分子をコードするいくつかの他の分子を含んでいる約 130キロベースの 6 p 21上の関連領域をスクリーニングした。該領域に全部で 187個の SNP sを同定し、そして 94名の心筋梗塞患者と一般的な集団からの 94名の対照を 120個のそれらのマーカーに対してゲノタイビングし、エレクトロフエログラム上でヌクレオチドシグナルのピークレベルを比較することによって大まかに推定された約 10%以上のアレル頻度に基づいて選択した。最終的に、疾患関連性遺伝子と決定するに十分に高いアレル頻度を有する 26 SNP sが（>25%、マイナーアレル）、 p 5— 1及ぴ A I F_ 1の近くに D， drop off を伴う強い LDの広がりのある一つのブロックを示した（図 1、下パネル)。よって心筋梗塞感受性遺伝子がこれらの 2つの遺伝子座の間に位置すると結論し、試料サイズを拡大することによってこれらの 26個の SNP sをタイピングした。それらのほとんどは心筋梗塞表現型との顕著な関連性は示さなかった力 S、これらの 26個の S N P sのうちの 4個は心筋梗塞患者と対照との間でマイナーァレルに対するホモ接合性の頻度を比較したとき、心筋梗塞との強い関連性を表した（表 1)。これらの SNP sは LT— α のェキソン 1内の 10 G> Α及ぴェキソン 3内の 723 C>A (T h r 26 A s n)、 I KB Lのプロモーター領域内の一 63 T>A、及ぴ BAT 1 のプロモーター領域内の一 23 G>Cであった。 4つの全てはほとんど完全に互いに連鎖しており、その領域内の特定のハプロタイプはそれぞれの S NP単独よりも心筋梗塞との関連性に対してより高い統計学的有意差を示した。各 SNPに対するゲノタイプの分布に関する Hardy - Weinberg平衡は、患者群と対照群両方に対する； c ²試験によって評価し、顕著な偏差を示さなかった（p >0. 01)。これらの S N P遺伝子座はほとんど同じ程度の心筋梗塞との関連性を有しているので、 LT— α、 I KB L及び BAT 1のすべてが心筋梗塞感受性に影響を及ぼす候補と考えることができた。

h

GG 16 36.7% ¾ 378(37.6%)

GA 504(44.5%) 512(50.9%) AA vs . GG+GA 1,78

AA 213(18.8%) 116(11.5%) 21.6 [0.0000033] (1.39-2.27)

LT- intronl 252A>G

AA 413(36.5%) 371(36.9%)

AG 511(45.1%) 516(51.3%) GG vs . AA+AG 1.69

GG 209(18.4%) 119(11.8%) 18.0 [0.000022] (1.32-2,15)

LT- a exon3 723C>A,T26N

CC 414(36.5%) 374(37.2%)

CA 506(44,7%) 516(51.3%) AA VS. CC+CA 1.78

ΛΑ 213(18.8%) 116(11.5%) 21.6 [0.0000033] (1.39-2.27)

JKBL promoter -63T>A

TT 406(35.8%) 374(37.2%)

TA 521(46.0%) 509(50.6%) AA. VS . TT+TA 1.6

AA 206(18.2%) 123(12.2%) 14.5 【0·000129] (1.25-2.03)

BAT1 promoter -23G>C

6G 411(36.3%) 374(37.2%)

GC 517<45,6¾》 510(50.7%) CC vs . GG+GC 1.6

CC 205(18.1¾) 122(12.1%) 14.7 [0·000129】 (1.26-2.04)

実施例 2 (LT— αのイントロン 1内の SNPによってもたらされる転写活性の増加）

(1) 実験方法

LT— αの - 307から 268まで、 I KB Lの - 635から 15まで、及ぴ BAT 1の -1231から 30までに対応する DNA断片を、ゲノム DNAを鐃型として用いて P CRによって増幅し、 pGL3 - basic vector (Promega)に 5， - 3 ' 方向にクロー二ングした。 Jurkut細胞（RIKEN Cell Bankから入手； RCB0806) は 10%ゥシ胎児血清を添加した PRMI1640培地内で成長させた。 LT- 遺伝子における 2つの S NP s、ェキソン 1内の 1 0 G>A及ぴィントロン 1内の 2 52 A >Gがその発現レベルに影響を与えるかどうかを決定するために、両方の SNP s (それぞれ

1 0G— 25 2A, 1 OA— 2 5 2G及ぴ 1 OA— 2 5 2 Aハプロタイプ）を含むゲノム断片をルシフェラーゼ遺伝子転写ュニットの上流に含む 3種のプラスミドを構築した。

上記 Jurkut細胞 (2 X10⁶)に、 10ugの上記プラスミド構築物と 2.5ugの pRL-TK ベクター（トランスフエクシヨン効率のための内部制御）を LipoTAXI トランスフェクション試薬（Stratagene)を用いてトランスフエクトした。 6時間後、細胞を PMA (20ng/ml) 及ぴイソノミシン（luM) (Sigma)で刺激した。 24時間後、細胞を集め、ゾレシフェフー活±を Dual - Luciferase Reporter Assay System (Promega) を用いて測定した。

また、 I KB L及ぴ BAT 1遺伝子のプロモーター領域における SNP sの転写効率に与える影響を同様にして調べた。

(2) 実験結果

図 2 Aに示すように、 1 OA— 2 52 Gハプロタイプを含むクローンは他の 2 つのハプロタイプを含むクローンよりも 1.5倍の転写活性を示し、ェキソンにおける一つの置換ではなく、イントロン 1における置換が LT— α遺伝子の転写に影響を与えることを示した。すなわち、心筋梗塞に強い関連性を示す LT一ひ遺伝子におけるこれら 2つの SNP sはその発現レベルに影響を与えることがわかつた。

一方、同じく心筋梗塞と顕著な関連性を示す I KB L (- 6 3 T>A) のプロモーター領域における SNPは転写活性の適度な減少が認められた（図 2 B)。 I KB Lは IkBファミリーのメンバーで、 NF kappa B (NF- κ B) /rel potein のような転写因子に対する阻害分子である（Albertella, M. R.， et al. , Hum. Mol. Genet. , 3, 793-799， 1994)。 LT— ct プロモーター領域における DN A配列は NF— κΒ, SP-1及ぴ AP- 1/c- fos/junを含む数種の核因子に対する結合モチーフを含むという事実から判断すると（Messer, G. et al. , J. Exp. Med. , 173, 209-219, 1991)、 I K B Lはこれらの核因子の阻害を通じて L T— o;の転写を制御すると考えられる。実施例 3 (LT— αのイントロン 1に対する未知の核因子の結合）

(1) 実験方法

Jurkat細胞からの核抽出物が 2 5 2 A又は 2 5 2 Gアレルを含むゲノム配列に対応するオリゴヌクレオチドに結合できるかどうかを調べた。 Andrews, N. C. et al. , Nucleic, Acid Res. , 11, 2499, 1991に記載したように、 Jurkat細胞から調製した核抽出物をジォキシゲニン（DIG)- 11- ddUTPにて標識した 33bpのオリゴヌクレオチドと DIG- gel shift kit(Roche)を用いてインキュベートした。競合研究のために、未標識のォリゴヌクレオチド（100倍過剰）を DIG -標識ォリゴヌクレオチドの添加前に核抽出物と前培養した。タンパク質 ZD NA複合体を 0.5XTris/ホゥ酸/ EDTA (TBE)緩衝液中、未変性 7 %ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルをニトロセルロース膜に移し、シグナルの検出を化学発光検出システム（Roche)を用いて製造者の指示に従って行った。

(2) 実験結果

図 3に示すように、 Gアレルに対応するオリゴヌクレオチドを用いたとき現れるバンドは Aァレルに対応するバンドよりも強く、これは Jurkat細胞に存在する幾つかの核因子が Aアレルに対するよりも Gアレルに対してより強固に結合したことを示す。実験は 3回行い同様な結果を得た。この結果はこの領域に結合することによって LT— の転写を制御する一つ又はそれ以上の核抽出物における未同定の分子が心筋梗塞に関連しているかもしれないことを示す。実施例 4 (LT— αタンパク質内の T 26 Ν変異による接着分子の誘導）

(1) 実験方法

LT一 α産物は、その炎症プロセスへの寄与のように、血管内皮細胞、血管平滑筋細胞、及び種々の白血球から接着分子及びサイトカインを誘導することができる（（Ross, R.， N. Engl. J. Med. , 340, 115—126， 1999； Ware, C. F.， et al.， Curr. Top. Microbiol. Immunol. , 198， 175-218， 1995)。これらの生物学的活性が遺伝子産物におけるアミノ酸置換によって影響されるかどうかを調べた。コドン 26における SNPはスレオニンからァスパラギンへのアミノ酸変化をもたらす。従って、各アレル（26 N— LT一 αは 26 T— LT— α) について接着分子及ぴサイトカインの発現を誘導する能力を培養したヒト冠状動脈血管内皮細胞（Η CAEC) 及ぴヒト冠状動脈平滑筋細胞（HCASMC) を用いて次のようにして調べた。

まず、精製した大腸菌由来組み換え体 26Ν— LT—α及ぴ 26 T-LT- a を pET43 system (Novagen)を用いて調製した。 H C A E C及び H C A S M C (BioWhittaker, Inc. )を 5ng/mlの L T— o;タンパク質（26N— LT一又は 26T— LT一 α)で 4時間処理した。全 RNAをトリゾール（Ufe Technologies) を用いて単離した。 cDNAを 2 gの全 R Aから dT15プライミングによって調製し、 Superscript 逆転写酵素（Life Technologies)を用いて合成した。 mR A を QuantiTect SYBR Green PCR kit (QIAGEN)及び ABI Prism 7700 sequence detector (Applied Biocystems)を用いて定量した。各試験は 3回繰りかえし、各試料は三重に試験した。

(2) 実験結果

変異タンパクである 26N—LT— は 26T— LT— よりも HCASMC において血管細胞接着分子一 1 (VCAM— 1) 及び E—セレクチン mRNAについて 2倍高い転写活性レベルを示した（図 4 )。実施例 5 ( L T- ο;タンパク質の動脈壁隆起性病変部での発現状態）

(1) 実験方法

動脈壁隆起性病変部位のパラフィン包埋切片をシランコーティングスライド上に貼り付け、キシレンを用いて脱パラフィン操作を行った。その後、マイクロウェーブにより抗原性を賦活し、内因性ペルォキシダーゼ活性を阻害するために 3%過酸ィヒ水素水/エタノールで 15分処理し、非特異的反応を抑えるために 5%スキムミルク液でブロッキング反応を行った。 5 g/ml の抗 LT- α抗体（R & D 社）を用いて、 40°C、ー晚反応し、洗浄後、 2次抗体（rabbit ENVISION Polymer Reagent; DAKO社）を加え、室温で 1時間反応した。ペルォキシダーゼ基質を用いて発色後、顕微鏡下で LT-αタンパク質のシグナルを観察した。ネガティブコントロールとして、非免疫正常ヒッジ IgG (DAKO社）を用いて同様に染色した。

(2) 実験結果

上記の免疫染色の結果、心筋梗塞患者由来、動脈壁隆起性病変部内血管平滑筋細胞おょぴマクロファージにおいて LT-αタンパク質が強く染色されることが確認された。この結果より、 LT -ひタンパク質が病変の発生、進展に関連している可能性が示唆された。実施例 6 (LT-o;変異体（Asn26) による血管内皮細胞、血球系細胞株からのサイト力イン、接着分子の誘導）

(1) 実験方法

冠動脈血管内皮細胞（Bio Whittaker 社）は血管内皮細胞専用培地（Bio Whittaker社）、 HL- 60 (RIKEN cell BANK) は RPMI-1640培地（SIGMA社）で培養した。 LT-ひタンパク質の作製、サイト力イン、接着分子 mRNAの誘導の評価は既幸艮 (Ozaki k. et al. Nature Genetics 32, 650-654， 2002) に従って行つた。

( 2 ) 実験結果

ヒト冠動脈血管内皮細胞（HCAEC) および血球系細胞株（HL-60) での L T- α (26Asn) のサイトカイン、接着分子誘導活性について、 L T- o; (26Thr) の場合と比較した。結果を図 5及ぴ図 6に示す。図 5及ぴ図 6に示した通り、 L T- ο; (Asn26) は L T— a (Thr26) に比べて血管内皮細胞からの Tumor necrosis factor- a (TNF)、 selectin- E mRNAを 2倍高く、 HL- 60細胞からは TNF、 ICAM - 1 Untracellular cell adhesion molecule - 1) mRNA を 3倍咼く誘尋した。これらの結果から、 L T- a (26Asn) が心筋梗塞等の炎症性疾患の発症、進展に関与していることを示された。産業上の利用の可能性

本発明の方法によれば、心筋梗塞を初めとする炎症性疾患の発症の有無の判断、疾患発症の可能性の判断を正確にかつ迅速に行うことができる。

Claims

請求の範囲

1. リンホ小キシン - a (LT-a) 遺伝子、 I Kappa B— like ( I KB L) 遺伝子、及び BAT 1遺伝子より成る群から選ばれる少なくとも 1つの遺伝子に存在する少なくとも一種の遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。

2. リンホトキシン -α (LT-α) 遺伝子、 I Kappa B— like ( I KB L) 遺伝子、及ぴ B A T 1遺伝子より成る群から選ばれる少なくとも 1つの遺伝子に存在する少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。

3. 下記の（1 ) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。

(1) 配列番号 1に示す LT-o;遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 1 0番目の塩基における GZAの多型

( 2 ) 配列番号 2に示す L T- a遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 9 0番目の塩基における AZGの多型

(3) 配列番号 3に示す LT- a遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 8 1番目の塩基における C/Aの多型

(4) 配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 5 7 2番目の塩基における TZAの多型

(5) 配列番号 5に示す BAT 1遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1 2 2 8番目の塩基における GZCの多型

4. 配列番号 1に示す LT-α遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 1 0番目の塩基と配列番号 2に示す L T - _α遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 9 0番目の塩基の組み合わせが、 G - Αへテ口接合体であるカ A - Gへテ口接合体であるか、 A— Aホモ接合体であるかを検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。

5. 配列番号 3に示す L T- a遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 8 0番目から 82番目の塩基の少なくとも一つが他の塩基に置換されることによって、コードされるアミノ酸がスレオニンからァスパラギンに変異する遺伝子多型を検出することを含む、炎症性疾患の判定方法。

6. 炎症性疾患が心筋梗塞である、請求項 1カゝら 5のいずれかに記載の方法。

7. 配列番号 1から 5に示される配列における、下記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも 1つの部位を含む連続する少なくとも 10塩基の配列、又はその相補配列にハイブリダィズすることができ、請求項 1から 6のいずれかに記載の方法においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチド。

( 1 ) 配列番号 1に示す L T- _α遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 10番目の部位

( 2 ) 配列番号 2に示す L Τ-α遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目部位

(3) 配列番号 3に示す LT_ a遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 81番目の部位

8. 配列番号 1から 5に示される配列における、下記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも 1つの部位を含む連続する少なくとも 10塩基の配列、及ぴ Z又はその相補配列を増幅することができ、請求項 1から 6のいずれかに記載の方法においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチド。

(1) 配列番号 1に示す LT- α遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 10番目の部位

(2) 配列番号 2に示す LT-_a遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 90番目部位

(3) 配列番号 3に示す LT-CK遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 81番目の部位

(4) 配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 5 7 2番目の部位

(5) 配列番号 5に示す BAT 1遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1 228番目の部位

9. プライマーがフォヮ一ドプライマ一及び/又はリバースプライマーである請求項 8に記載のォリゴヌクレオチド。

10. 請求項 7から 9のいずれかに記載のオリゴヌクレチドの 1種以上を含む、炎症性疾患診断用キット。

1 1. 炎症性疾患が心筋梗塞である請求項 1 0に記載のキット。

1 2. 下記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を検出することを含む、 LT_o;、 I KB L、又は BAT 1の発現状態の分析方法。

(1) 配列番号 1に示す LT-α遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 1 0番目の塩基における GZAの多型

( 2 ) 配列番号 2に示す L T- a遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基における AZGの多型

(3) 配列番号 3に示す LT-α遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 8 1番目の塩基における CZ Aの多型

(4) 配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 5 7 2番目の塩基における T/Aの多型

(5) 配列番号 5に示す BAT 1遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1 2 28番目の塩基における GZCの多型

1 3. 下記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含む LT- _a、 I KBL、又は BAT 1遺伝子断片を細胞に導入し、該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、 LT- a、 I KB L、又は BAT 1の転写活性の測定方法。 (1) 配列番号 1に示す LT-α遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 10番目の塩基における GZ Aの多型

( 2 ) 配列番号 2に示す L T- _α遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基における AZGの多型

(3) 配列番号 3に示す LT - 遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 81番目の塩基における C/Aの多型

(4) 配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 572番目の塩基における ΤΖ Aの多型

(5) 配列番号 5に示す BAT 1遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1228番目の塩基における GZCの多型

14. 下記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含む LT- α、 I KB L、又は BAT 1遺伝子断片を細胞に導入し、 L T一 α、 I KB L、又は BAT 1の転写活性を阻害する候補物質の存在下で該細胞を培養し、該遺伝子の発現を分析することを含む、 LT-ひ、 I KBL、又は B AT 1の転写活性阻害物質のスクリ一-ング方法。

( 1 ) 配列番号 1に示す L Τ- _α遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 10番目の塩基における GZAの多型

( 2 ) 配列番号 2に示す L Τ- α遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 90番目の塩基における AZGの多型

( 3 ) 配列番号 3に示す L Τ -ひ遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 81番目の塩基における CZAの多型

(4) 配列番号 4に示す I KB L遺伝子のプロモーターの塩基配列の 572番目の塩基における TZAの多型

15. 請求項 14に記載のスクリーニング方法により得られる LT-a、 I K BL、又は BAT 1の転写活性阻害物質。

1 6. 前記 LT—CK、 I KB L、又は BAT 1遺伝子断片の下流にリポータ一遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、該細胞を培養し、リボータ一活性を測定することによって該遺伝子の発現を分析する、請求項 1 3又は 1 4 に記載の方法。

1 7. 前記リポーター遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子である請求項 16に記載の方法。

1 8. 下記の（1) から（5) よりなる群から選ばれる少なくとも一種の一塩基多型を含む遺伝子断片と LT— _A、 I KB L、又は BAT 1の転写制御因子の存在が予想される試料を接触させ、上記断片と転写制御因子との結合を検出することを含む、 LT- α、 I KB L、又は BAT 1の転写制御因子のスクリーニング方法。

(1 ) 配列番号 1に示す LT-α遺伝子のェキソン 1の塩基配列の 1 0番目の塩基における GZAの多型

( 2 ) 配列番号 2に示す L T- α遺伝子のィントロン 1の塩基配列の 9 0番目の塩基における AZGの多型

( 3 ) 配列番号 3に示す L Τ- α遺伝子のェキソン 3の塩基配列の 8 1番目の塩基における CZAの多型

(5) 配列番号 5に示す BAT 1遺伝子のプロモーターの塩基配列の 1 228番目の塩基における GZCの多型

1 9. 検出がゲルシフトアツセィにより行われる請求項 1 8に記載の方法。

2 0. 配列番号 2に示す LT-α遺伝子のイントロン 1の塩基配列の 9 0番目の塩基における C/Aの多型を含む遺伝子断片を接着分子誘導性細胞に導入し、該細胞の接着分子の誘導化能を評価する方法。

2 1. 前記細胞がヒト冠状動脈平滑筋細胞（HCASMC) である請求項 2 0に記載の方法。

22. 前記接着分子が血管細胞接着分子一 1 (VCAM—1) 又は E—セレクチンである請求項 20に記載の方法。

23. リンホトキシン -α (LT-α)の発現又は活性を抑制することを含む、炎症性疾患の治療方法。

24. 炎症性疾患が心筋梗塞である、請求項 23に記載の方法。

25. リンホトキシン -a (LT-a) に対する抗体を用いる、請求項 23又は 24に記載の方法。

26. リンホトキシン (LT-α) の発現又は活性を抑制する物質を有効成分として含む、炎症性疾患の治療薬。

27. リンホトキシン -a (LT-a) の発現又は活性を抑制する物質が、リンホトキシン- aに対する抗体である、請求項 26に記載の治療薬。

28. 細胞と候補物質とを接触させる工程、細胞内におけるリンホトキシン- a (LT-a) をコードする遺伝子の発現量を分析する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較して当該遺伝子の発現量を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリ一二ング方法。

29. リンホトキシン -a (LT-a) と候補物質とを接触させる工程、リンホトキシン - aの活性を測定する工程、及び候補物質の非存在下の条件と比較してリンホトキシン -aの活性を低下させる候補物質を炎症性疾患の治療薬として選択する工程を含む、炎症性疾患の治療薬のスクリーニング方法。

30. リンホトキシン- _aの活性が、接着分子及び Z又はサイトカインを誘導する活性である、請求項 29に記載の方法。

3 1. 接着分子が、 VCAM- 1、 I CAM— 1又は E—セレクチンであり、サイトカインが TNFである、請求項 30に記載の方法。

32. リンホトキシン- _a (LT-a) の発現量又は活性の低下が、 I KBL 遺伝子の発現量又は活性の増加を介したものである、請求項 28又は 29に記載の方法。