WO2004009639A1 - 単鎖抗体およびその利用 - Google Patents

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WO2004009639A1
WO2004009639A1 PCT/JP2003/009140 JP0309140W WO2004009639A1 WO 2004009639 A1 WO2004009639 A1 WO 2004009639A1 JP 0309140 W JP0309140 W JP 0309140W WO 2004009639 A1 WO2004009639 A1 WO 2004009639A1
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antibody
chain
chain antibody
linker
substance
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PCT/JP2003/009140
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Yaeta Endo
Takayasu Kawasaki
Tatsuya Sawasaki
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Cellfree Sciences Co., Ltd.
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    • C07K16/00Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/12Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
    • C07K16/1203Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
    • C07K16/1228Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C07K16/1235Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia from Salmonella (G)
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    • C07K2317/62Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622Single chain antibody (scFv)
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07KPEPTIDES
    • C07K2318/00Antibody mimetics or scaffolds
    • C07K2318/10Immunoglobulin or domain(s) thereof as scaffolds for inserted non-Ig peptide sequences, e.g. for vaccination purposes

Definitions

  • the present invention relates to a single-chain antibody having a structure in which a heavy chain and a light chain of an antibody are cross-linked via a linker, a labeled single-chain antibody characterized by having a labeling substance in a linker portion of the antibody, and How to use them.
  • Single-chain antibodies are characterized in that non-specific binding to cells can be reduced because they have a small size consisting of only an antigen-binding region as compared to complete IgG.
  • various methods for labeling the antibody have been developed for the purpose of tracking the immune response (Cloutier, SMeta 1., Mo 1. Immunol., 37, 1067—1077 (2 ⁇ 00)).
  • a method for labeling an antibody a method of binding a biotin or the like to the C-terminus or the N-terminus of the antibody using a biotin ligase (Cloutier, SM, eta 1., Mo. 1. Immunol., 37, 1067- 1077 (2000)), but there was a problem in that the label reduces the binding activity of the antibody to the antigen.
  • the present invention relates to an antibody in which a single-chain antibody having a structure in which a heavy chain and a light chain of an antibody are cross-linked via a linker retains an antigen-binding activity, and a labeled single-chain antibody obtained by labeling the antibody;
  • the purpose is to provide a method for utilizing. Also, a method for immobilizing the antibody while maintaining the binding property of the antibody to the antigen, a labeled single-chain antibody for use in the method, and a method for analyzing an antigen-antibody reaction using the labeled single-chain antibody The purpose is to provide.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to solve the above-mentioned problems, and as a result, have linked biotin to a linker part of a single-chain antibody in which the heavy chain and the light chain of the antibody are linked via a linker.
  • the single-chain antibody was brought into contact with a substrate coated with butavidin on the surface, and the antibody was bound to the substrate.
  • the antigen was brought into contact with the solid-phased single-chain antibody produced in this manner, it was found that the binding property of the antibody to the antigen was extremely high.
  • the present invention has been accomplished based on these findings.
  • a single-chain antibody characterized in that it has a structure in which the heavy and light chains of the antibody are crosslinked via a linker, or a labeled monomer characterized in that a labeled substance is carried on a portion of the linker of the single-chain antibody.
  • the labeling substance is present in the presence of a specific enzyme.
  • a labeled single-chain antibody having a structure in which a heavy chain and a light chain, which are variable regions of an antibody, are cross-linked via a linker, and a labeling substance is carried on a part of the linker, the labeling substance is specified.
  • a labeled single-chain antibody which is a substance capable of binding to a polypeptide of a linker part of the antibody in the presence of the enzyme.
  • a labeled single-chain antibody having a structure in which a heavy chain and a light chain of an antibody are cross-linked via a linker, and a linker partially carrying a labeling substance
  • the labeling substance is a part of the linker part of the antibody.
  • the labeling substance is A labeled single-chain antibody that is incorporated as part of the linker portion of the antibody.
  • a labeling substance having a structure in which the heavy and light chains of an antibody are cross-linked via a linker, and which can bind to the linker part and the polypeptide of the antibody linker part in the presence of a specific enzyme.
  • the antibody has a structure in which the heavy and light chains, which are variable regions of the antibody, are cross-linked via a linker, and binds to the linker at the linker and to the polypeptide at the antibody linker in the presence of a specific enzyme.
  • a DNA characterized in that DNAs encoding a heavy chain and a light chain of an antibody capable of binding to a specific antigen are linked via a DNA encoding a linker.
  • DNA in which a heavy chain and a light chain of an antibody capable of binding to a specific antigen are linked via a DNA encoding a linker, the heavy chain and the light chain of the antibody have variable regions.
  • DNA characterized by the following.
  • DNAs encoding the heavy and light chains of an antibody capable of binding to a specific antigen are linked via a DNA encoding a linker
  • the DNA encoding the linker is identified after translation.
  • a DNA comprising a base sequence capable of binding a labeling substance in the presence of an enzyme.
  • a DNA encoding a heavy chain and a light chain, which are the variable regions of an antibody capable of binding to a specific antigen, is linked to a DNA encoding a linker by a DNA encoding the linker.
  • a DNA, wherein the DNA encoding the linker comprises a base sequence capable of binding a labeling substance in the presence of a specific enzyme after translation.
  • a DNA encoding a heavy chain and a light chain of an antibody capable of binding to a specific antigen is a DNA encoding a linker containing a base sequence capable of binding a labeling substance in the presence of a specific enzyme after translation.
  • the DNA encoding the heavy and light chains which are the variable regions of an antibody that binds to a specific antigen, contains a base sequence capable of binding a labeling substance in the presence of a specific enzyme after translation.
  • a DNA which is linked via a DNA encoding a linker, wherein a base sequence capable of binding the labeling substance encodes an amino acid sequence recognized by biotin ligase.
  • a labeled single-chain antibody characterized in that the DNA described in any of 10 to 15 above is transcribed and translated using a protein synthesis system in the presence of a labeling substance and a specific enzyme. Production method. 17. A method for producing a single-chain antibody or a labeled single-chain antibody, comprising transcribing and translating the DNA according to any one of 10 or 11 above using a protein synthesis system.
  • the protein synthesis system is a cell-free protein translation system derived from wheat germ, and the concentration of the reducing agent in the translation reaction solution is such that the disulfide bond of the produced single-chain antibody is maintained and that the cell-free system is used. 16.
  • An immobilization method characterized by contacting the antibody described in any one of the following with a substrate divided into a plurality of regions having a substance that specifically binds to an antibody labeling substance on the surface.
  • a method for producing a single-chain antibody characterized by contacting the antibody described in any one of the following with a substrate divided into a plurality of regions having a substance that specifically binds to an antibody labeling substance on the surface.
  • a labeled single-chain antibody having a structure in which a heavy chain and a light chain of an antibody are cross-linked via a linker, and a labeled substance is partially carried on the linker.
  • a labeled single-chain antibody having a structure in which a heavy chain and a light chain of an antibody are cross-linked via a linker, and a linker partially carries a labeling substance
  • the heavy chain and the light chain of the antibody may have a variable region.
  • a labeled single-chain antibody having a structure in which a heavy chain and a light chain of an antibody are crosslinked via a linker, and the linker partially carries a labeling substance
  • the labeling substance is present in the presence of a specific enzyme.
  • a labeled single-chain antibody which is a substance capable of binding to a polypeptide of a linker part of the antibody below.
  • a labeled single-chain antibody having a structure in which a heavy chain and a light chain, which are variable regions of an antibody, are cross-linked via a linker, and a labeling substance is carried on a part of the linker, the labeling substance is specified.
  • a labeled single-chain antibody which is a substance capable of binding to a polypeptide of a linker part of the antibody in the presence of the above enzyme.
  • the labeling substance is a part of the linker part of the antibody.
  • a labeled single-chain antibody having a structure in which a heavy chain and a light chain, which are variable regions of an antibody, are cross-linked via a linker, and a portion of the linker carries a labeling substance, wherein the labeling substance is an antibody
  • the labeled single-chain antibody is incorporated as a part of a linker part.
  • a labeling substance that has a structure in which the heavy and light chains of the antibody are cross-linked via a linker, and is capable of binding to a portion of the linker, which is capable of binding to the polypeptide of the linker portion of the antibody in the presence of a specific enzyme.
  • the antibody has a structure in which the heavy and light chains, which are variable regions of the antibody, are crosslinked via a linker, and binds to the linker part to the polypeptide of the antibody linker part in the presence of a specific enzyme.
  • An immobilized single-chain antibody prepared by the production method described in 21 to 23 above.
  • a method for analyzing an antigen-antibody reaction comprising the following steps. (1) a step of preparing a labeled single-chain antibody under conditions in which the disulfide bond of the single-chain antibody is retained, comprising the following elements (1) and (2):
  • the DNA encoding the heavy and light chains of an antibody capable of binding to a specific antigen is a DNA encoding a linker containing a base sequence capable of binding a labeling substance in the presence of a specific enzyme after translation. Producing a labeled single-chain antibody by transcribing and translating the DNA linked via the above using a wheat cell-free protein synthesis system in the presence of a specific enzyme;
  • the DNA encoding the heavy and light chains which are the variable regions of the antibody capable of binding to a specific antigen, encodes a linker containing a base sequence capable of binding a labeling substance in the presence of a specific enzyme after translation.
  • Producing a labeled single-chain antibody by transcribing and translating the DNA linked via the DNA using a wheat cell-free protein synthesis system in the presence of a specific enzyme;
  • (I) a step of immobilizing a substance (adaptor substance) that specifically binds to the labeling substance of the labeled single-chain antibody on a substrate partitioned into a plurality of regions;
  • a reagent kit for measuring an antigen-antibody reaction comprising a reagent used in the analysis method described in 25 or 26 above.
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of the translation type I of the single-chain antibody of the present invention.
  • FIG. 2 is an electrophoretic photograph showing the degree of binding of biotin to a single-chain antibody by biotin ligase.
  • FIG. 3 is a diagram showing the degree of specific binding of the labeled single-chain antibody of the present invention to an antigen.
  • FIG. 4 is a view showing an association dissociation curve between the labeled single-chain antibody of the present invention and an antigen.
  • FIG. 5 is a diagram showing the degree of binding between a single-chain antibody in which a portion of the linker is conjugated with biotin and an antigen, and an antigen.
  • FIG. 6 is a diagram showing the degree of binding of a single-chain antibody having a polyhistidine peptide as a linker part to a nickel column.
  • the single-chain antibody used in the present invention is one in which the heavy and light chains of the antibody are bound via a linker, and the antibody has an activity of binding to an antigen having a specific binding affinity. If it is, any thing may be used.
  • an antibody whose heavy chain is located at the N-terminus of a single-chain antibody molecule is used.
  • the antibody is preferably a monoclonal antibody having an activity of recognizing and binding to a specific antigen.
  • the heavy and light chains of the antibody need not include the full length, but may be any site sufficient to recognize the antigen and have specific affinity. Specifically, a variable region is preferably used.
  • the linker is not particularly limited as long as it is long enough to allow the heavy and light chains of the antibody to crosslink via the linker and has a structure for having a labeling substance.
  • a polypeptide consisting of 10 to 30 amino acids is preferably used.
  • the specific structure can be appropriately selected according to the labeling substance described later.
  • the labeling substance may be used for labeling the single-chain antibody of the present invention (hereinafter, this may be referred to as a “signal substance”) and for the purpose of immobilizing the single-chain antibody of the present invention on a solid phase. (Hereinafter, this may be referred to as “solid-phased substance”) is preferred.
  • the signal substance may be a fluorescent dye capable of binding to an amino acid, such as a fluorescein series, a rhodamine series, an eosin series, an NBD series, or a photosensitizer such as methylene blue or rose bengal, or Substances that give specific signals in nuclear magnetic resonance spectrum (NMR), such as amino acids containing fluorine and phosphorus atoms.
  • NMR nuclear magnetic resonance spectrum
  • the immobilized substance may be any substance that binds to a specific substance bound on the surface of the solid phase (hereinafter, this may be referred to as “adapter substance”).
  • adapter substance examples include, for example, a biotin-binding protein such as piotinnoavidin and streptavidin, a manoletose ⁇ maltose-binding protein, a guanine nucleotide ZG protein, a polyhistidine peptide nickel or cobalt.
  • glutathione S transferer Receptor proteins such as ose / daltathione, DNA-binding protein DNA, antibody / antigen molecule ( ⁇ -top), calmodulin / calmodulin-binding peptide, ATP-binding protein ZATP, or estradiol receptor protein Estradiol, etc. Is mentioned. Any of these may be a solid-phased substance or an adapter substance. Among these, preferably, the immobilized substance is biotin and the adapter substance is streptavidin, or the immobilized substance is polyhistidine peptide and the adapter substance is nickel.
  • the labeling substance a substance capable of binding to the polypeptide of the linker part of the antibody in the presence of a specific enzyme in the method of binding to the linker part can also be used.
  • a substance includes, for example, biotin.
  • biotin ligase is mentioned as a specific enzyme, and a linker having an amino acid sequence recognized by biotin ligase is used.
  • the labeling substance may be a substance incorporated as a part of a linker part of the antibody, and specific examples thereof include a polyhistidine peptide. In this case, a linker containing a polyhistidine peptide is used as the linker.
  • the binding or incorporation of the labeling substance into the linker portion can be carried out by a method known per se, depending on the properties of the signal substance or the solid-phased substance and the adapter substance used.
  • the single-chain antibody and the labeled single-chain antibody of the present invention are produced, for example, by the following method. First, (i) a monoclonal antibody that recognizes a target protein or a part thereof as an antigen is produced, and (ii) a DNA encoding the monoclonal antibody is obtained. Furthermore, the sequences encoding the heavy and light chains are specified, and the sequences are ligated across a base sequence encoding a linker (hereinafter, this DNA fragment may be referred to as a “single-chain antibody unit”). (iii) The protein encoded by the produced single-chain antibody unit is synthesized by an appropriate method that maintains its structure correctly. During or after synthesis When a labeling substance is bound to a part of the linker, it is bound. These detailed methods will be described below.
  • the antigen of the single-chain antibody of the present invention is not particularly limited, and any antigen having immunogenicity may be used. Specifically, for example, salmonella sugar chains and the like can be mentioned.
  • As a method for preparing a monoclonal antibody that specifically recognizes these antigens commonly used known methods can be used, and polypeptides used as antigens have high antigenicity according to known methods.
  • a suitable sequence can be selected and used as the antigenic determinant.
  • commercially available software such as Epitop Adviser (manufactured by Fujitsu Kyushu System Engineering Co., Ltd.) can be used.
  • polypeptide used as the above antigen it is preferable to use a synthetic peptide synthesized according to a known method.
  • the polypeptide serving as an antigen may be prepared in an appropriate solution or the like according to a known method and immunized to a mammal, for example, a heron or a mouse.
  • the antigen peptide it is preferable to use the antigen peptide as a conjugate with an appropriate carrier protein or to carry out immunization by adding an adjuvant or the like.
  • the route of administration of the antigen upon immunization is not particularly limited, and any route such as subcutaneous, intraperitoneal, intravenous, or intramuscular route may be used. Specifically, for example, a method of inoculating a BALB / c mouse several times every several days to several weeks with an antigen polypeptide is used.
  • the antigen intake is preferably from 0.3 to 0.5 mgZl times when the antigen is a polypeptide, but is appropriately adjusted depending on the type of the polypeptide and the animal species to be immunized.
  • test blood is collected as appropriate, and an increase in antibody titer is confirmed by enzyme-linked immunosorbent assay (hereinafter sometimes referred to as “ELISA”) or Western blotting.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • Blood is collected from animals with sufficiently raised antibody titers.
  • a polyclonal antibody can be obtained by subjecting this to an appropriate treatment used for the preparation of the antibody.
  • Ingredient Specifically, for example, a method of obtaining a purified antibody obtained by purifying an antibody component from serum according to a known method, and the like can be mentioned.
  • a hybridoma obtained by fusing spleen cells and myeloma cells of the animal according to a known method is used (Mi1stein, eta 1., Nature, 256, 495 (1975)) to obtain a monochrome.
  • a local antibody can also be produced.
  • the monoclonal antibody can be obtained, for example, by the following method.
  • antibody-producing cells are obtained from an animal whose antibody titer has been raised by immunization with the above-mentioned antigen.
  • the antibody-producing cells are plasma cells and lymphocytes which are precursor cells thereof, which may be obtained from any of the individuals, but is preferably obtained from spleen, lymph nodes, peripheral blood and the like.
  • the myeloma to be fused with these cells is generally a cell line obtained from a mouse, for example, P3-X63-Ag8, an 8-azaguanine-resistant mouse (derived from BALBZc) myeloma cell line.
  • P 3—NS 1 no 1 Ag 4.1 (RIKEN cell bank: RCB 0095) and the like are preferably used.
  • antibody-producing cells and myeloma cells are mixed at an appropriate ratio, and the cells are mixed in an appropriate cell fusion medium, such as RPMI 1640, Iskov's modified Dulbecco's medium (IMDM), or Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM).
  • IMDM Iskov's modified Dulbecco's medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • PEG polyethylene glycol
  • Hybridoma is normal medium (HAT medium) in 5% C0 2 containing an appropriate amount of hypoxanthine aminopterin 'thymidine (HAT) solution by utilizing the myeloma cell line is a 8-Azaguayun resistant strain used, It can be selected by culturing at 37 ° C for an appropriate time. This selection method can be appropriately selected and used depending on the myeloma cell line to be used.
  • the antibody titer of the antibody produced by the selected hybridoma is analyzed by the method described above, the hybridoma producing the antibody with a high antibody titer is separated by limiting dilution, etc., and the separated fused cells are cultured in an appropriate medium.
  • a monoclonal antibody can be obtained by purifying the resulting culture supernatant by an appropriate method such as ammonium sulfate fractionation and affinity chromatography.
  • an appropriate method such as ammonium sulfate fractionation and affinity chromatography.
  • a commercially available monoclonal antibody purification kit can also be used.
  • by growing the antibody-producing hybridoma obtained above in the abdominal cavity of an animal of the same strain as the immunized animal or a nude mouse ascites containing a large amount of the monoclonal antibody of the present invention can be obtained. You can also.
  • variable region of the H chain and L chain of the monoclonal antibody is preferably composed of a framework region (FR) and a hypervariable region (CDR).
  • the DNA encoding the variable regions of the H and L chains thus obtained is, for example, a single-chain antibody recognizing the O-antigen of Salmonella, An and, NN, eta 1., J. B Chem., 266, 21874-21879 (1991).
  • the DNA encoding the linker is sandwiched between the DNAs encoding the variable regions of the H chain and the L chain thus obtained, and both DNA fragments are joined by an appropriate method to prepare a single-chain antibody unit.
  • the single-chain antibody unit does not need to be obtained alone as a DNA fragment, but may be constructed simultaneously with insertion into an expression vector or the like described later.
  • the DNA encoding the linker may be any DNA as long as it encodes the linker described in (1). Specifically, for example, a linker containing an amino acid sequence recognized by biotin ligase (Peter J. Schatz (1993) Biotechnology, 11 (1138-1143)) is used. The DNA shown in SEQ ID NO: 1 is preferred. Examples of the labeling substance incorporated as a part of the linker include those containing a base sequence encoding a polyhistidine peptide.
  • the DNA encoding the linker can be prepared using a commonly used method, but is preferably prepared by chemical synthesis.
  • the thus obtained single-chain antibody unit is ligated under the control of an appropriate promoter, and introduced into a host, or transcribed by an appropriate method, and thereafter, using a cell-free protein translation system.
  • a single-chain antibody can be produced by expressing under conditions that maintain the disulfide bond of the produced single-chain antibody.
  • an antibody having low binding to an antigen can be obtained as an antibody having even higher binding by using a known evolutionary engineering technique.
  • An appropriate promoter can be appropriately selected depending on the host used or the RNA synthase used for transcription. Specifically, when SP 6 RNA synthase is used for transcription, it is preferable to use the SP 6 promoter. In a cell-free protein translation system, it is preferable to insert a nucleotide sequence that enhances translation activity between the promoter and the single-chain antibody unit. Specifically, in eukaryotes, the 5 'cap structure (S hatkin, Ce11, 9, 645- (1976)) and the Kozak sequence (Kizak, Nu cleic Acid. Res., 12, 857— (1 984)). In prokaryotes, Shine-Dalgarno sequences are known.
  • the 5′-untranslated leader sequence of the RNA virus also has a translation promoting activity (Japanese Patent No. 2841433).
  • a method has been developed (JP-A-10-146197).
  • a sequence obtained by a method of selecting a translation enhancer sequence for a random sequence by using its influence on polysome formation as an index is also included (Japanese Patent Application No. 2001-396941).
  • the DNA thus produced may be referred to as a translation type III.
  • Specific examples of the translation type I include those having the structure shown in FIG. 1, for example, those that recognize the o-antigen of Salmonella.
  • a cell-free protein synthesis system derived from wheat germ which is usually used for protein synthesis and which can maintain the disulfide bond of the single-chain antibody, is used. This is because antibodies produced by other cell-free protein synthesis systems do not have sufficient three-dimensional structure to recognize the antigen, and therefore show only low K d values (ALEXANDER ZDANOV., Et al., Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 91, pp. 6423-6427 (1994), C. Roger Mackenzie., Et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY., Vol. 271, pp., 1527-1533 (1998) )).
  • Specific examples of the wheat germ-derived cell extract used in the present invention include commercially available PROTEIOS TM (manufactured by TOYOBO).
  • the reaction solution in which the intramolecular disulfide bond is retained and the protein is synthesized is a reaction solution for performing the above-mentioned wheat germ-derived cell-free translation system (hereinafter, referred to as a “weakly reduced translation reaction solution”).
  • a reaction solution for performing the above-mentioned wheat germ-derived cell-free translation system (hereinafter, referred to as a “weakly reduced translation reaction solution”).
  • DTT dithiothreitol
  • the final concentration of ethanol is 0.1 to 0.2 mM
  • the concentration of daltathione oxidized daltathione is in the range of 30 to 50 ⁇ / 1 to 5 ⁇ .
  • the concentration of the reducing agent in such a translation reaction solution is not limited to the above, and can be appropriately changed depending on the protein to be synthesized.
  • the method for selecting the optimum concentration range of the reducing agent is not particularly limited, and examples thereof include a method of judging based on the effect of an enzyme that catalyzes a disulfide bond exchange reaction. Specifically, a translation reaction solution with various concentrations of reducing agents is prepared, and an enzyme that catalyzes a disulfide bond exchange reaction is added to these solutions to synthesize a protein having a disulfide bond in the molecule. I do. In addition, a similar translation reaction solution was used as a control experiment.
  • the solubilized component of the protein synthesized here is separated by a method such as centrifugation.
  • the reaction solution in which the solubilized component accounts for 50% or more of the total (solubilization rate of 50%) and the amount of the solubilized component increased by the addition of an enzyme that catalyzes a disulfide bond exchange reaction is the molecular weight of the protein. It can be judged that it is suitable as a reaction solution for synthesizing while maintaining the internal disulfide bond. Further, from the concentration range of the reducing agent selected by the effect of the enzyme that catalyzes the disulfide bond exchange reaction, the concentration of the reducing agent having the largest amount of synthesized protein is selected as a more preferable concentration range. can do.
  • a cell extract for synthesizing a cell-free protein derived from wheat germ without a reducing agent is prepared, and the components necessary for a wheat germ-derived cell-free protein translation system are prepared.
  • a method of adding a reducing agent to the above concentration range a method of removing the reducing agent from the cell extract for cell-free protein synthesis derived from wheat germ to the above concentration range, and the like are used. . Since the cell extract for cell-free protein synthesis from wheat germ requires high reducing conditions for extraction, it is more convenient to remove the reducing agent from this solution after extraction.
  • Examples of the method for removing the reducing agent from the cell extract include a method using a carrier for gel filtration. Specifically, for example, there is a method in which a Sephadex G-25 column is equilibrated in advance with a suitable buffer solution containing no reducing agent, and then a cell extract is passed through the column.
  • an appropriate buffer may be added to the preparation for use.
  • the total concentration of the deliquescent substance is 6 OmM or less.
  • the cell extract may be freeze-dried after adding the above-mentioned translation type III.
  • the deliquescent substance (deliquescent substance) in the above lyophilized preparation does not decrease the storage stability in the lyophilized state, and the content is 1 part by weight of the protein contained in the lyophilized preparation. Therefore, it is preferably 0.01 part by weight or less, particularly preferably 0.005 part by weight or less.
  • the protein weight here is the absorbance (260, 280, 320 nm).
  • the cell extract in which the reducing agent concentration has been adjusted as described above may be hereinafter referred to as a weakly reduced translation reaction solution.
  • a translation reaction is performed by further adding an enzyme that catalyzes a disulfide bond exchange reaction to the weakly reduced translation reaction solution, a protein having a retained intramolecular disulfide bond can be synthesized with high efficiency.
  • the enzyme that catalyzes a disulfide bond exchange reaction include protein disulfide isomerase.
  • the amount of these enzymes to be added to the wheat germ-derived cell-free translation system can be appropriately selected depending on the type of the enzyme.
  • a protein disulfide isomerase is added to a translation reaction solution, which is a cell extract for cell-free protein synthesis extracted from wheat germ and contains 20 to 70, preferably 30 to 50 DTT as a reducing agent.
  • the final concentration should be in the range of 0.01 to 10 and preferably 0.5 ⁇ .
  • the addition is preferably performed before the start of the cell-free translation reaction because of the efficiency of the formation of disulfide bonds.
  • examples of the cell-free protein translation system derived from plant seeds other than wheat include those of grasses such as wheat, rice, and corn.
  • a wheat germ extract it is particularly preferable to use a wheat germ extract, and the method for producing a single-chain antibody will be described in detail by taking the case of using this cell extract as an example.
  • a method for selecting wheat germ for example, Johnston n. FB eta 1., Nature, 179, 160—161 (1957) can be used, and a method for preparing a cell extract from germ
  • the method described in Erickson. AHeta 1., Meth. In Enzymo 1., 96, 38-50 (1996) can be used.
  • a wheat germ extract can be obtained by collecting and purifying a wheat germ extract by gel filtration or the like. Gel filtration can be performed using a gel filtration device such as a Sephadex G-25 column. The composition and concentration of each component in the gel filtration solution are known per se, What is used in the method for producing a wheat germ extract for cell-free protein synthesis may be employed.
  • a solution containing no reducing agent specifically, for example, a solution containing HEPE S_KOH, acetic acid lime, magnesium acetate, or L-type amino acid
  • a wheat germ extract containing about 30 ⁇ of DTT can be finally obtained.
  • the step of removing the reducing agent is preferably performed immediately before use in the translation reaction.
  • Germ extract after gel filtration may contain microorganisms, especially spores such as filamentous fungi, and it is preferable to eliminate these microorganisms. It is important to prevent microbial growth, especially during long-term (1 day or more) cell-free protein synthesis reactions.
  • the means for eliminating microorganisms is not particularly limited, but it is preferable to use a filtration sterilization filter.
  • the pore size of the filter is not particularly limited as long as it can remove microorganisms that may be contaminated, but is usually 0.1 to 1 micrometer, preferably 0.2 to 0.5 micrometer. is there.
  • the spore size of a small class of Bacillus subtilis is 0.5 ⁇ ⁇ ⁇ , so it is best to use a 0.20 ⁇ m filter (for example, Minisart TM manufactured by Sartorius). It is also effective for removal.
  • a filter having a large pore size it is preferable to first filter using a filter having a large pore size, and then use a filter having a pore size capable of removing microorganisms that may be contaminated.
  • the cell extract thus obtained acts on substances such as tritin, thionine, ribonuclease, such as mRNA, tRNA, translation protein factor, ribosome, etc., which inhibit the protein synthesis function contained or retained by the raw material cells themselves.
  • the endosperm containing the substance that suppresses its function is almost completely removed and purified.
  • the term “endosperm almost completely removed and purified” refers to a wheat germ extract from which endosperm has been removed to the extent that ribosomes have not been substantially deadenylated.
  • the degree to which no deadenination is performed means that the rate of deadenination of the ribosome is less than 7%, preferably 1% or less.
  • the cell extract from which such endosperm components have been removed contains a low-molecular-weight protein synthesis inhibitor (hereinafter sometimes referred to as a “low-molecular-weight synthesis inhibitor”)
  • a low-molecular-weight synthesis inhibitor a low-molecular-weight protein synthesis inhibitor
  • cell extraction It is preferable to fractionate and exclude these low-molecular-weight synthesis inhibitors from the components of the solution due to differences in molecular weight.
  • the molecular weight of the substance to be excluded need only be smaller than the factors required for protein synthesis contained in the cell extract. Specific examples include those having a molecular weight of 50,000 to 14,000 or less, preferably 14,000 or less.
  • a method for excluding the low-molecular-weight synthesis inhibitor from the cell extract a commonly used method known per se is used. Specifically, a method using dialysis through a dialysis membrane, a gel filtration method, or an ultrafiltration method is used. Examples include a filtration method. Among them, the method by dialysis (dialysis method) is preferable in terms of easy supply of the substance to the dialysis solution. Hereinafter, the case where the dialysis method is used will be described in detail.
  • Dialysis membranes used for dialysis include those having an excluded molecular weight of 50,000 to 12,000, specifically, regenerated cellulose membrane (Viskase S) having an excluded molecular weight of 12,000 to 14,000. ales, manufactured by Chicago, Inc.) and Spectra / Pore 6 (excluded molecular weight: 50,000) (manufactured by Spectrum Laboratories Inc., CA, USA).
  • An appropriate amount of the above-mentioned cell extract is put into such a dialysis membrane, and dialysis is performed using a conventional method.
  • the dialysis time is preferably about 30 minutes to 24 hours.
  • the protein synthesis activity of the finally obtained cell extract (hereinafter, this may be referred to as “post-treatment cell extract”) is increased.
  • Cell extract stability As a specific method for the conversion, a method in which the above-mentioned low-molecular inhibitor is eliminated in a solution containing at least a high-energy phosphate compound such as ATP or GTP is exemplified. ATP is preferably used as the high energy phosphate compound.
  • the reaction is performed in a solution containing ATP and GTP, more preferably ATP, GTP, and 20 kinds of amino acids.
  • stabilizing components When eliminating small molecule inhibitors in a solution containing these components (hereinafter sometimes referred to as “stabilizing components”), add the stabilizing components to the cell extract in advance, and incubate This may be subjected to a step of eliminating the low molecular inhibitor.
  • the stabilizing component can be added not only to the cell extract but also to the outer dialysis solution to perform dialysis to eliminate the low-molecular-weight inhibitor. It is more preferable to add a stabilizing component to the external dialysis solution, because a new stabilizing component is always supplied even if the stabilizing component is decomposed during dialysis.
  • the amount of the stabilizing component to be added and the stabilization treatment time can be appropriately selected depending on the type of the cell extract and the preparation method.
  • the liquid is separated into a solubilized component and an insoluble component by a method such as centrifugation, and a solution having a small amount of insoluble components is selected.
  • a method is also preferable in which cell-free protein synthesis is performed using the obtained cell extract after the treatment, and a protein having high protein synthesis activity is selected.
  • an appropriate stabilizing component is also added to the external dialysis solution, and dialysis is performed using these components for an appropriate time.
  • the stabilization conditions of the cell extract selected in this way specifically, when the above-prepared wheat germ extract is subjected to the elimination step of the low-molecular inhibitor by the dialysis method, 100 ⁇ to 0.5 mM of ATP and 25 ⁇ of GTP in wheat germ extract and external dialysis solution; lmM, 20 L-type amino acids at 25 M to 5 mM, respectively, for 30 minutes Dialysis for 1 hour or more.
  • the temperature for dialysis may be any temperature as long as protein synthesis activity is not lost and dialysis can be performed.
  • the minimum temperature is the temperature at which the solution does not freeze, usually -10 ° C, preferably _5 ° C, and the maximum temperature is the temperature that does not adversely affect the solution used for dialysis. 40 ° C, preferably 38 ° C.
  • the method of adding the stabilizing component to the cell extract is not particularly limited, and it is added before the step of eliminating the small molecule inhibitor, and after incubating for an appropriate time for stabilization, the small molecule inhibitor is added.
  • An exclusion step may be performed, or a cell extract solution to which a stabilizing component has been added, and / or a buffer solution for the exclusion step to which a stabilizing component has been added.
  • An exclusion step may be performed.
  • the above-mentioned cell extract for cell-free protein synthesis is prepared in the concentration range of the reducing agent in the above-mentioned range, and the energy source required for cell-free protein synthesis is amino acid, translation type, or t-type.
  • RNA or the like, or an enzyme that catalyzes a disulfide bond exchange reaction can be added as necessary, and then added to a selected system or apparatus selected per se to perform protein synthesis.
  • the Knott's method Pratt, J. M. eta 1., Transcription and Transcription, Hames, 179-209, BD & Higgins, S.
  • a synthesis reaction solution for example, 10 to 50 mM HEPE S-KOH (pH 7.8), 55 to: I 2 OmM potassium acetate,:! ⁇ 5 mM magnesium acetate, 0.;! ⁇ 0.6 mM sunoremidine, 0.025-1 mM L-amino acid each, 20-70 ⁇ , 0 preferably 30-50 DTT,:!
  • preincubation is performed at 10 to 40 ° C for 5 to 10 minutes, and the incubation is also performed at 10 to 40 ° C, preferably 18 to 30 ° (:, more preferably
  • the reaction time is about 10 minutes to 7 hours in the power batch method, which is the time until the reaction is stopped (P ratt, J. M. eta 1., T ranscriptionand T rans lation, Hames, 179-209, BD & Higgins, SJ, eds, IRLP ress, Ox ford (1 984)).
  • the synthesis reaction solution is used as the inner solution of the dialysis, and the protein is synthesized using a device that is separated from the outer solution by the dialysis membrane capable of mass transfer (Kikawa et al. 21 See Japan Society for Molecular Biology, WI D 6.
  • the synthesis reaction solution is placed in an appropriate container, and the dialysis external solution described in the above dialysis method is overlaid so as not to disturb the interface.
  • Perform protein synthesis (Sawasaki, T., eta 1., FEB SLet., 514, 102-105 (2002), Patent Publication No. WO 02/24939 Al)
  • the synthesis reaction is performed using the synthesis reaction solution, and when the synthesis reaction is stopped, the RNA, amino acids, energy source, etc. are supplied to the synthesis and the synthesis is performed.
  • Protein synthesis is performed by discharging substances and decomposition products. Specifically, for example, after pre-incubating the above-mentioned synthesis reaction solution from which translation type II has been removed for an appropriate period of time as necessary, add translation type III and place it in an appropriate container to carry out the reaction. Examples of the container include a microplate and the like. Under this reaction, for example, in the case of a reaction solution containing a wheat germ extract at a volume of 48% by volume, the synthesis reaction is completely stopped in 1 hour.
  • a labeling substance When a labeling substance is bound after protein synthesis, it may be bound to a linker of a single-chain antibody in the translation reaction solution after the translation reaction by a method suitable for each labeling substance. After purifying the single-chain antibody by the following method, it may be bound by a method suitable for each labeling substance.
  • the thus obtained single chain antibody or labeled single chain antibody of the present invention can be confirmed by a method known per se. Specifically, for example, measurement of amino acid incorporation into proteins, separation by SDS-polyacrylamide electrophoresis, staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB), and autoradiography (Endo, Y. eta 1., J. Biotec h., 25, 22 1-230 (1 992); Proc. Natl. Ac ad. Sci. USA., 97, 559-564 (2 000)) it can.
  • CBB Coomassie Brilliant Blue
  • the reaction solution thus obtained contains the target single-chain antibody or labeled single-chain antibody at a high concentration
  • the reaction solution is used for dialysis, ion-exchange chromatography, affinity chromatography, gel filtration, etc.
  • the target single-chain antibody or labeled single-chain antibody can be easily obtained from the reaction solution by a separation and purification method known per se.
  • the labeled single-chain antibody of the present invention can be used in an analysis method of an antigen-antibody reaction by analyzing the binding property to an antigen.
  • the analysis method of the antigen-antibody reaction is as follows (I) To (VI).
  • DNA encoding the heavy and light chains of an antibody that has the ability to bind to a specific antigen can be transferred via a DNA encoding a linker containing a base sequence capable of binding a labeling substance in the presence of a specific enzyme after translation.
  • Producing a labeled single-chain antibody by translating and translating the DNA linked by using a wheat cell-free protein synthesis system in the presence of a specific enzyme,
  • a linker encoding a DNA encoding a heavy chain and a light chain, which are variable regions of an antibody capable of binding to a specific antigen, containing a base sequence capable of binding a labeling substance in the presence of a specific enzyme after translation. Producing a labeled single-chain antibody by transcribing the DNA linked via the DNA encoding the above using a wheat cell-free protein synthesis system in the presence of a specific enzyme;
  • (I) a step of immobilizing a substance (adaptor substance) that specifically binds to the labeling substance of the labeled single-chain antibody on a substrate partitioned into a plurality of regions;
  • the labeled single-chain antibody prepared in (I) above (1) or (2) is partitioned into multiple regions having on its surface a substance (adapter substance) that specifically binds to the labeled single-chain antibody described in (II).
  • (V) a step of adding a required amount of the test substance to each substrate according to the above (m) or (IV), and analyzing the binding between the labeled single-chain antibody and the test substance;
  • the condition under which the disulfide bond of the single-chain antibody is maintained in the above-described antigen-antibody analysis method may be such that the disulfide bond of the manufactured labeled single-chain antibody is maintained in the step of producing the labeled single-chain antibody.
  • the method can be performed by adjusting the concentration of a reducing agent in a translation reaction solution, which is the method described in (iiii) Production of single-chain antibody.
  • the method for removing the adapter substance and the labeled single-chain antibody is to remove the substrate from the substrate by washing the substrate several times using a washing buffer used by those skilled in the art.
  • the method of removing non-specific adsorption of the adapter substance fixed to the base is such that the base is filled with a booking solution or the like usually used by those skilled in the art. Thereafter, washing can be performed several times with a buffer solution.
  • the method includes a method of pre-coating an array solid support using pepsin serum albumin (BSA), reduced low-fat milk, salmon sperm DNA, porcine heparin, etc. (Au sube 1, .eta 1. , Short Protocol, Molecular Biology, 3rd edition (1 995)).
  • BSA pepsin serum albumin
  • As a base used for the above-described antigen-antibody analysis method a method suitable for an antigen-antibody reaction analysis method or apparatus can be used.
  • an enzyme-linked immunosorbent assay Enzyme Linked Immu nosorbent Assay (ELISA): Crow thjer, JR, Methodsin Molecular Biology, 42, (1995)
  • ELISA Enzyme Linked Immu nosorbent Assay
  • a plastic microtiter plate usually used by the ELISA method is preferred.
  • surface plasmon resonance Cu llen, DC eta 1., 1.i ⁇ sciences, 3 (4), 2 1 1—225 (1 987—88)
  • gold A metal thin film composed of silver, platinum, etc. is preferred.
  • a transparent body such as glass is preferable, and quartz is more preferable.
  • a glass one is used.
  • a ditrosenololose membrane, a nylon membrane, or a plastic microtiter plate which is usually used for immobilizing a protein or the like can also be used.
  • complex carbohydrates eg, agarose and sepharose
  • acrylic resins eg, polyacrylamide and latex beads
  • magnetic beads silicon wafers, and the like can also be used as a base.
  • the binding of the adapter substance to such a substrate can be performed by a commonly used method known per se. Specifically, diazo method, peptide method (acid amide derivative, carboxychloride resin, maleic anhydride derivative, inocyanate derivative, cyanogen bromide-activated polysaccharide, cellulose carbonate derivative, etc. Examples include an alkyl method, a method using a cross-linking reagent, a method using the Ugi reaction, etc. In addition, when a substrate such as glass is used, a method of physically adsorbing is also used. (Promoga) can be used.
  • the labeled single-chain antibody thus obtained can be tested with one or more known antigens.
  • an antibody having binding specificity to the antigen can be identified.
  • This antigen may be a protein, an organic compound, a carbohydrate, a nucleic acid, or the like. These may be isolated, recombinant or naturally occurring.
  • the amount of antigen used is about 1 ⁇ 1 0 0 ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 1 is preferably in the range.
  • the time required for the antigen-antibody reaction is usually in the range of 5 minutes to 24 hours, and is preferably 0.5 to 2 hours.
  • a step of washing the solid phase bound to the antibody with a biochemically used buffer containing a surfactant or the like can be added.
  • the composition of the buffer and the number of washings are appropriately selected depending on the strength of the antigen-antibody reaction.
  • the binding between the solid-phased single-chain antibody and the antigen is analyzed, and the labeled substance is a signal substance.
  • the antigen-antibody reaction can be analyzed by analyzing the binding property to the antigen in a solution.
  • a method for quantitatively or qualitatively determining the interaction between the labeled single-chain antibody and the test substance can be performed by a commonly used method known per se. Specific examples include the ELISA method, surface plasmon resonance method, evanescent field molecular imaging method, fluorescence imaging analysis method, and a method using a radioisotope label.
  • test substance such as an antigen may be any substance that may contain an antigen.
  • Specific examples include body fluids such as blood, bacterial cell wall extracts, and protein mixtures.
  • Lipopolysaccharide is present on the cell surface of Salmonella bacteria, and anti-Salmonella antibodies bind to the most extracellular O-antigen of this lipopolysaccharide (An and, NN, eta 1., ⁇ ro tein). Engi rt., 3, 54 1—546 (1 990). It has been reported that Escherichia coli overexpressed a single-chain antibody in which the VL and VH chains, which are antigen recognition sites that specifically bind to the O-antigen, were connected by a specific linker (An and, NN, eta 1., J. Biol. Chem., 26, 2 1 8 74—2 1 8 7 9 (1 9 9 1)).
  • the DNA encoding the anti-Salmonella single-chain antibody is a plasmid containing DNA encoding a single-chain antibody to wild-type Salmonella O-antigen (An and, NN, eta 1., J-Biol. Chem.
  • DNA was prepared in which a DNA sequence (SEQ ID NO: 1) encoding a recognition sequence of biotin ligase was inserted into a portion of the linker.
  • PCR was carried out using the plasmid scfV—pEU prepared above as a type II with a primer consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 or 7 using a LATaq (TAKARA) kit.
  • PCR reaction solution was prepared as 5 ⁇ l 10 XLA buffer, 5 ⁇ l 25 mM magnesium chloride, 8 ⁇ l 2.5 mM dNTP, ⁇ ⁇ 20 ⁇ primer, O.
  • Chihuoku wheat seeds (undisinfected) from Hokkaido were added to a mill (Rorit Speedmillpulverisette 14 type, manufactured by Fritsch) at a rate of 100 g per minute, and the seeds were gently ground at 8,000 rpm.
  • the crude germ fraction was obtained by removing impurities such as seed coat.
  • This color sorter is a means for irradiating the crude germ fraction with light, a means for detecting reflected light and / or a transmitted light from the crude germ fraction, a means for comparing the detected value with a reference value, and a means for deviating from the reference value Alternatively, it is a device having means for selecting and eliminating those within the reference value.
  • the crude embryo fraction was supplied to a 1 000 to 5000 grains cm 2 on beige belt color sorter, it was detected by irradiating light reflected light by a fluorescent lamp to the crude embryo fraction on the belt .
  • the conveying speed of the belt was set to 5 OmZ.
  • a monochrome CCD line sensor (2048 pixels) was used as the light receiving sensor.
  • a standard value was set between the luminance of the embryo and the luminance of the seed coat in order to eliminate components (eg, seed coat) that are darker in color than the embryo, and those that deviated from the standard value were removed by suction.
  • a reference value was set between the luminance of the embryo and the luminance of the endosperm, and those that deviated from the reference value were removed by suction. Suction was performed using 30 suction nozzles (one suction nozzle per 1 cm length) arranged at a position of about 1 cm above the conveyor belt.
  • the embryos were selected until the purity of the embryos (weight ratio of embryos contained in 1 g of any sample) became 98% or more.
  • the obtained wheat germ fraction was suspended in distilled water at 4 ° C, and washed using an ultrasonic washing machine until the washing solution did not become cloudy.
  • 0.5 volume of Nonidet (Nocalide: manufactured by Nakarai Techtonix) P40. / 0 were suspended in the solution, and washed until the washings became clear by using an ultrasonic cleaning machine to obtain a wheat germ, the following operation was performed at 4 ° C.
  • the filter was passed through a new filter (New Stella Disk 25: Kurashiki Spinning Co., Ltd.) to sterilize by filtration and remove fine dust mixed in.
  • a new filter New Stella Disk 25: Kurashiki Spinning Co., Ltd.
  • this filtrate was previously prepared as a solution (40 mM HE PES-KOH (pH 7.8), lO OmM potassium acetate, 5 mM magnesium acetate, and 0.3 mM each of 20 L-type amino acid mixtures (protein synthesis).
  • gel filtration was performed on a Sephadex G-25 column that had been equilibrated in (2) without adding an amino acid or with a labeled amino acid.
  • the translated type I DNA obtained in (1) above was transcribed using SP6 RNA polymerase (manufactured by TOY-BO).
  • SP6 RNA polymerase manufactured by TOY-BO.
  • As the reaction solution 8 OmM HE PES-KOH (pH 7.6), 16 mM magnesium acetate, 2 mM spermidine, lOmM DTT, NTP s 2.5 mM each, 0.8 ⁇ / ⁇ 1 RNaseinhibitor , 50 ⁇ g / ml plasmid, and 1.2 U / ⁇ l SP6 RNA po 1 yMerase / ddw 400 ⁇ l were used.
  • the translation reaction solution was 1.2 mM ATP, 0.25 mM GTP, 15 mM creatine phosphate, 0.4 mM spermidine, 29 mM HE PES-KOH (pH 7.6), 95 mM potassium acetate, 2 mM 7 mM magnesium phosphate, 0.23 mM L-type amino acid, 0.58 ⁇ l RNa strighibitor (produced by Romega), 4 nCi / ⁇ 11 4C—Leu, 7.5 ⁇ g mRNA, 0 5 MPDI, 19.5 ⁇ Piotin (Nakarai), 19.5 ⁇ g / ⁇ 1 Biotin Ligation (a Vidity), and 12 n1 Wheat Germ Extract
  • the reaction was performed at 26 ° C for 3 hours by a batch method. As a control, a translation reaction without addition of biotin was also performed.
  • Aminated magnetic beads (NH2-Mag: manufactured by Polyscience) 0.1 ml was washed three times with 0.4 ml of the same buffer, equilibrated, and the above-mentioned aldehyde-linked salmonella sugar chain was removed. The mixture was added to the solution and reacted at room temperature for 6 hours. The magnetic beads were washed three times with 0.4 ml of the same buffer. The immobilization rate of the sugar chains on the magnetic beads was determined by quantifying the sugar chains remaining in the supernatant by the phenol / sulfuric acid method. Here, the binding ratio of the sugar chain to the magnetic beads was 40% (0.13 mo 1 Salmonella sugar chain Z 100 ⁇ l magnet beads). (2) Binding of biotinylated anti-Salmonella single chain antibody to Salmonella sugar chain
  • the first wash elutes single-chain antibodies that did not bind to the antigen, and the later elution elutes single-chain antibodies that bound to the antigen.
  • the amount of protein in each fraction (5 ⁇ l) was determined by 14 C count.
  • Figure 3 shows the results.
  • the binding results obtained when the mutant G102D was similarly biotinylated for the purpose of confirming that the biotinylated single-chain antibody retains the antigen specificity are also shown.
  • the active fraction in the case of the wild type (Wildtype)
  • biotinylated single-chain antibody prepared in Example 1 was purified using the immobilized Salmonella sugar chain antigen (S a1 -Mag) by the method of (2) above.
  • a purified biotinylated single chain antibody of 8.4 pmo 1/50 ⁇ l calculated from the 14 C dpm value was obtained. This 50 minutes was added to the above cuvette and immobilized on streptavidin (immobilized amount: 43 3.6 arcsec., 11.5 ng, 0.4 pmol).
  • the reaction was 30 mu 1 prepared in the above (1) 1 OmM PB ST ( pH8. 0), the excess Piochin was gel filtered through G_ 25 spincol umn been turned into ⁇ after flat at 0. 6 mM C a C 1 2 .
  • Immobilized Salmonella sugar produced in the protein solution 40 1 advance 0. 6mM C a C 1 2 a wheat germ extract 25 1 had been washed with mu 1 0 mu 1 of Example 2 (1) It was added to a 96-we11 microplate together with the chain antigen (Sal-Mag).
  • PCR was performed using the scf V—p EU described in Example 1 (1) as a type I and a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 8 or 9 using a LA taq (TAKARA) kit.
  • PCR reaction solution 5 1 10 X LA buf fer, 5 ⁇ l 25 mM magnesium chloride, 8 ⁇ l 2.5 mM dNTP, each 1 ⁇ l 20 ⁇ primer, 0.1 ⁇ g ⁇ type plasmid / ⁇ 50 ⁇ l, 94 ° C for 1 minute X
  • the reaction was carried out for 1 cycle at 94 ° C for 45 seconds, 55 ° C for 1 minute, 72 ° C for 1 minute and 30 seconds X 30 cycles, and at 72 ° C for 5 minutes.
  • the amplified DNA fragment is blunt-ended with KOD T4polymerase (NEB), ligated with Polynucleotidekinase (NEB), and ligated with Ligationhigh (Toyobo). Se Lf Ligation was performed to produce a circular plasmid ( Figure 1: hereinafter, this may be referred to as "scFV-pHIS-pEU").
  • This plasmid was used as type I, transcribed according to the method described in Example 1 (3), and mRNA was purified.
  • the translation reaction was performed by replacing DTT in the translation reaction solution with 200 ⁇ ⁇ ⁇ mercaptoethanol. Was. After 3 hours from the translation reaction, the reaction solution was centrifuged at 15,000 rpm for 10 minutes to separate the solubilized components, and excess mercaptoethanol was added to 5 OmM phosphate buffer (pH 7.0). Was removed by a G-25 spin column equilibrated with 500 mM NaCl, 5% Glycerol (Bindingbuffer).
  • the horizontal axis of the graph indicates the fraction number
  • w1 to w4 indicate the 14C dpm values in the fraction eluted by the washing buffer
  • el to e5 indicate the 14C dpm values in the fraction eluted by the elutionbuffer.
  • ET indicates the sum of the 14 C dpm values in el to e5.
  • Fraction numbers el to e5 indicate the presence of a single chain antibody containing a polyhistidine peptide that specifically binds nickel. As is clear from the figure, it was found that a single-chain antibody of about 50% of the total synthesis amount can be purified by the nickel column. It was also confirmed by the method described in Example 2 that the purified single-chain antibody retained the antigen-binding activity. This result indicates that a single-chain antibody incorporating a polyhistidine peptide into a linker can be immobilized on a nickel solid phase while retaining its activity.
  • a single-chain antibody or a labeled single-chain antibody having specific binding activity to an antigen According to the single-chain antibody, the antibody can be bound to a solid phase via a labeling substance, and an antibody chip or the like can be prepared.
  • Such a single-chain antibody is synthesized by a cell-free protein translation system in which a disulfide bond in the molecule is maintained, and thus has a higher antigenicity than that synthesized in a living cell such as Escherichia coli. Which have high specific binding to

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Abstract

本発明は、抗原との特異的結合活性を保持したままの単鎖抗体及び該単鎖抗体に標識化物質を結合した標識化単鎖抗体を提供する。詳しくは、本発明の標識化単鎖抗体は、単鎖抗体のリンカー部分に標識化物質を結合することにより製造することができる。コムギ胚芽由来無細胞タンパク質合成系を用いて該抗体を製造し、分子内のジスルフィド結合が保持される低還元状態で行う。また、該抗体を標識化物質を介して固相に結合させることにより固相化単鎖抗体の製造及び該固相化単鎖抗体を用いた抗原抗体反応の解析方法を行う。

Description

明細書
単鎖抗体およびその利用 本出願は、 参照により ここに援用されるところの、 日本特許出願番号
5 2002-210067からの優先権を請求する。 技術分野
本発明は抗体の重鎖および軽鎖がリンカーを介して架橋する構造を有する単 .鎖抗体、 及び該抗体のリンカ一部分に標識化物質を有することを特徴とする標識0 化単鎖抗体、 並びにそれらの利用方法等に関する。 背景技術
単鎖抗体は、 完全 I g Gに比較して抗原結合領域のみからなる小さなサイズで あるため、 細胞に対する非特異的結合が軽減できる点が特徴である。 単鎖抗体を5 抗原抗体反応の解析に用いる場合、 免疫反応を追跡する目的で抗体に種々の標識 をする方法が開発されいる (C l o u t i e r, S. M. e t a 1. , Mo 1. I mmu n o l ., 37, 1067— 1077 ( 2◦ 00 ) )。 抗体を標識する方 法としては、 抗体の C末または N末にピオチン等をピオチンリガーゼにより結合 する方法 (C l o u t i e r, S. M., e t a 1. , M o 1. I mmu n o l ., 37, 1067- 1 077 ( 2000) ) などが提案されているが、 該標識によ り、 抗体の抗原との結合活性を低下させる点などが問題であった。
また近年、 細胞表面に存在する特異抗原を迅速にかつ多量に検出することなど を目的として、 このような抗体をチップやビーズなどに固相化する技術の開発も 目覚ましレヽ (M i t c h e 1 1, P., Na t u r e B i o t e c h n o l o g y , 20, 225 - 229 (2002))。 具体的には、 マイクロスポッティン グ法、 マイクロプリンティング法、 化学修飾法等が用いられているが、 これらは いずれも抗体の抗原への結合活性の低下、 高密度化の困難性などの点で問題があ つた。
一方、 タンパク質の固相化基盤に共有結合するストレブトアビジン Zピオチン などの特異的結合性を有する物質をリンカーとして結合させる方法も提案され ている。 しカゝし、 該方法においても抗体をその抗原との結合性を保持させて固相 ィヒした例はない。 発明の開示
本発明は、 抗体の重鎖および軽鎖がリンカーを介して架橋する構造の単鎖抗体 が抗原との結合活性を保持した抗体であり、 さらに該抗体を標識化した標識化単 鎖抗体並びにそれらを利用する方法を提供することを目的とする。 また、 抗体の 抗原との結合性を保持したまま該抗体を固相化する方法、 および該方法に用いる ための標識化単鎖抗体並びに該標識化単鎖抗体を用いた抗原抗体反応の解析方法 を提供することを目的とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた結果、 抗体の重鎖 と軽鎖がリンカーを介して結合している単鎖抗体のリンカ一部分にピオチンを 結合させ、 ス トレブトアビジンを表面にコートした基盤に該単鎖抗体を接触させ、 該抗体を基盤に結合した。 このようにして製造した固相化単鎖抗体に抗原を接触 させたところ、 該抗体の抗原との結合性が非常に高く保持されていることを見出 した。 本発明はこられの知見に基づいて成し遂げられたものである。
すなわち、 本発明は、
1 . 抗体の重鎖および軽鎖がリンカーを介して架橋する構造を有することを特徴 とする単鎖抗体又は該単鎖抗体のリンカ一部分に標識化物質を担持することを 特徴とする標識化単鎖抗体。
2 . 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有する単鎖抗体又 は該単鎖抗体のリンカ一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該抗体の重鎖および軽鎖が可変領域であることを特徴とする単鎖抗体又は標識 化単鎖抗体。 3 . 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質が、 特定 の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリべプチドに結合し得る物質である ことを特徴とする標識化単鎖抗体。
4 . 抗体の可変領域である重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有 し、 かつリンカ一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識 化物質が、 特定の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリべプチドに結合し得 る物質であることを特徴とする標識化単鎖抗体。
5 . 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質が、 抗体 のリンカ一部分の一部として組み込まれていることを特徴とする標識化単鎖抗 体。
6 . 抗体の可変領域である重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有 し、 力つリンカ一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識 化物質が、 抗体のリンカ一部分の一部として組み込まれていることを特徴とする 標識化単鎖抗体。
7 . 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に、 特定の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリべプチドに結合し得 る標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質がピオチンであ り、 該酵素がピオチンリガーゼであることを特徴とする標識化単鎖抗体。
8 . 抗体の可変領域である重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有 し、 かつリンカ一部分に、 特定の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリぺプ チドに結合し得る標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質 がピオチンであり、 該酵素がビォチンリガーゼであることを特徴とする標識化単 鎖抗体。
9 . 天然型の抗体と同等の K d値を有し、 コムギ胚芽を使った無細胞タンパク質 翻訳系によって製造された前項 1〜 8の何れか一に記載の単鎖抗体又は標識化 単鎖抗体。
10. 特定抗原への結合性を有する抗体の重鎖および軽鎖をコードする DNAが、 リンカ一をコードする DN Aを介して連結されていることを特徴とする DNA。
11. 特定抗原への結合性を有する抗体の重鎖および軽鎖をコードする DNAが、 リンカ一をコードする DNAを介して連結されている DNAにおいて、 該抗体の 重鎖および軽鎖が可変領域であることを特徴とする D N A。
12. 特定抗原への結合性を有する抗体の重鎖および軽鎖をコードする DNAが、 リンカーをコードする DNAを介して連結されている DNAにおいて、 該リンカ 一をコードする DNAが、 翻訳後に特定の酵素の存在下で標識化物質を結合し得 る塩基配列を含むことを特徴とする DNA。
13. 特定抗原への結合性を有する抗体の可変領域である重鎖および軽鎖をコ一 ドする DNAが、 リンカ一をコードする DN Aを介して連結されている DN Aに おいて、 該リンカ一をコードする DN Aが、 翻訳後に特定の酵素の存在下で標識 化物質を結合し得る塩基配列を含むことを特徴とする D N A。
14. 特定抗原への結合性を有する抗体の重鎖および軽鎖をコードする DNAが、 翻訳後に特定の酵素の存在下で標識化物質を結合し得る塩基配列を含むリンカ 一をコードする DNAを介して連結されている DNAにおいて、 該標識物質を結 合し得る塩基配列が、 ピオチンリガーゼにより認識されるアミノ酸配列をコード することを特徴とする DNA。
1 5. 特定抗原への結合性を有する抗体の可変領域である重鎖および軽鎖をコー ドする D N Aが、 翻訳後に特定の酵素の存在下で標識化物質を結合し得る塩基配 列を含むリンカーをコードする DNAを介して連結されている DNAにおいて、 該標識物質を結合し得る塩基配列が、 ピオチンリガーゼにより認識されるァミノ 酸配列をコードすることを特徴とする DNA。
1 6. 前項 10〜1 5のいずれかに記載の DN Aを、 標識化物質および特定の酵 素の存在下でタンパク質合成系を用いて転写翻訳することを特徴とする標識化 単鎖抗体の製造方法。 1 7 . 前項 1 0又は 1 1のいずれかに記載の D N Aをタンパク質合成系を用いて 転写翻訳することを特徵とする単鎖抗体又は標識化単鎖抗体の製造方法。
1 8 . タンパク質合成系が、 コムギ胚芽由来の無細胞タンパク質翻訳系であって、 その翻訳反応液中の還元剤の濃度が、 製造する単鎖抗体のジスルフィ ド結合が保 持され、 かつ無細胞タンパク質合成が可能な濃度であることを特徴とする前項 1 6または 1 7に記載の単鎖抗体又は標識化単鎖抗体の製造方法。
1 9 . さらにジスルフィ ド結合交換反応を触媒する酵素の存在下で行うことを特 徴とする前項 1 8に記載の単鎖抗体又は標識化単鎖抗体の製造方法。
2 0 . コムギ胚芽由来の無細胞タンパク質翻訳系を使い前項 1 9に記載の単鎖抗 体又は標識化単鎖抗体の製造方法によって製造された天然型の抗体と同等の K d値を有する単鎖抗体又は標識化単鎖抗体。
2 1 . 抗体の標識化物質と特異的に結合する物質を表面に有する複数の領域に区 画された基盤に、 以下のいずれか 1に記載の抗体を接触させることを特徴とする 固相化単鎖抗体の製造方法。
1 ) 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に標識化物質を担持することを特徴とする標識化単鎖抗体。
2 ) 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該抗体の重鎖および軽 鎖が可変領域であることを特徴とする標識化単鎖抗体。
3 ) 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質が、 特定 の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリぺプチドに結合し得る物質である ことを特徴とする標識化単鎖抗体。
4 ) 抗体の可変領域である重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有 し、 かつリンカ一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識 化物質が、 特定の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリペプチドに結合し得 る物質であることを特徴とする標識化単鎖抗体。 5 ) 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質が、 抗体 のリンカ一部分の一部として組み込まれていることを特徴とする標識化単鎖抗 体。
6 ) 抗体の可変領域である重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有 し、 かつリンカ一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識 化物質が、 抗体のリンカ一部分の一部として組み込まれていることを特徴とする 標識化単鎖抗体。
7 ) 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に、 特定の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリペプチドに結合し得 る標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質がビォチンであ り、 該酵素がピオチンリガーゼであることを特徴とする標識化単鎖抗体。
8 ) 抗体の可変領域である重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有 し、 かつリンカ一部分に、 特定の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリぺプ チドに結合し得る標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質 がビォチンであり、 該酵素がビォチンリガーゼであることを特徴とする標識化単 鎖抗体。
2 2 . 前項 2 1に記載の固相化単鎖抗体の製造方法において、 複数の領域に区画 された基盤上で 2種以上の異なる固相化単鎖抗体を固相化することを特徴とす る固相化単鎖抗体の製造方法。
2 3 . 標識化物質がピオチンであり、 該標識化物質と特異的に結合する物質がス トレブトアビジンであることを特徴とする前項 2 1または 2 2に記載の製造方 法。
2 4 . 前項 2 1〜2 3に記載の製造方法により調製される固相化単鎖抗体。 2 5 . 前項 2 4に記載の固相化単鎖抗体に被検物質を接触させ、 該固相化単鎖抗 体との結合性を解析することを特徴とする抗原抗体反応の解析方法。
2 6 . 以下の工程を含む、 抗原抗体反応の解析方法。 ( 1 ) 以下の要素の①又は②を含む、 単鎖抗体のジスルフイ ド結合が保持される 条件下において、 標識化単鎖抗体を調製する工程、
① 特定抗原への結合性を有する抗体の重鎖および軽鎖をコ一ドする DNAが 、 翻訳後に特定の酵素の存在下で標識化物質を結合し得る塩基配列を含むリ ンカーをコードする DNAを介して連結されている DNAを、 特定の酵素の 存在下でコムギ無細胞系タンパク質合成系を用いて転写翻訳し、 標識化単鎖 抗体を製造する工程、
②特定抗原への結合性を有する抗体の可変領域である重鎖および軽鎖をコード する DNAが、 翻訳後に特定の酵素の存在下で標識化物質を結合し得る塩基 配列を含むリンカーをコードする DNAを介して連結されている DNAを、 特定の酵素の存在下でコムギ無細胞系タンパク質合成系を用いて転写翻訳し 、 標識化単鎖抗体を製造する工程、
(2) 以下の要素を含む、 標識化単鎖抗体の標識化物質が固相化物質である場合 における標識化単鎖抗体の標識化物質と特異的に結合する物質 (アダプター物質 ) を調製する工程、
①複数の領域に区画された基盤に標識化単鎖抗体の標識化物質と特異的に結 合する物質 (アダプター物質) を固定する工程、
②前記①の基盤に固定されなかった標識化単鎖抗体の標識化物質と特異的に結 合する物質 (アダプター物質) を除去する工程、
③前記①又は②の工程の前後において、 適宜基盤における非特異的吸着を除去 する工程、
(3) 以下の要素を含む、 標識化単鎖抗体の標識化物質が固相化物質である場合 における固相化標識化単鎖抗体を調製する工程、
①前記 (1) ①又は②で調製した標識化単鎖抗体の標識化物質を (2) の標識 化単鎖抗体の標識化物質と特異的に結合する物質 (アダプター物質) を表面に 有する複数の領域に区画された基盤に必要量を添加、 接触させる工程、
②前記①の基盤上の標識化単鎖抗体と特異的に結合する物質 (アダプター物質 ) に固定されなかった標識化単鎖抗体を除去する工程、
③前期②の工程に続いて、 適宜基盤における非特異的吸着を除去する工程、
( 4 ) 以下の要素を含む、 標識化物質がシグナル物質である場合における標識化 単鎖抗体を調製する工程、
①適宜、 複数の領域に区画された基盤における非特異的吸着を除去する工程、 ②前記 (1 ) ①又は②で調製した標識化単鎖抗体の標識化物質を基盤に必要量 を添加させる工程、
( 5 ) 被検物質を前記 (3 ) 又は (4 ) に記載の各基盤に必要量添加し、 標識化 単鎖抗体と該被検物質との結合性を解析する工程、
( 6 ) ( 5 ) の結合性結果をもとに、 標識化単鎖抗体と被検物質との相互作用を 質的又は量的に判定する工程。
2 7 . 前項 2 5又は 2 6に記載の解析方法に使用される試薬を含む抗原抗体反応 の測定用試薬キット。
を提供するものである。 図面の簡単な説明 '
図 1は、 本発明の単鎖抗体の翻訳铸型の構造を示す図である。
図 2は、 ピオチンリガーゼによる単鎖抗体へのピオチンの結合度を示す電気泳 動写真である。
図 3は、 本発明の標識化単鎖抗体の抗原への特異的結合度を示す図である。 図 4は、 本発明の標識化単鎖抗体と抗原との会合解離曲線を示す図である。 図 5は、 リンカ一部分以外にピオチンを結合させた単鎖抗体と抗原との結合度 を示す図である。
図 6は、 ポリヒスチジンべプチドをリンカ一部分に有する単鎖抗体のニッケル カラムへの結合度を示す図である。 発明を実施するための最良の形態 ( 1 ) 単鎖抗体及び標識化単鎖抗体
本発明に用いられる単鎖抗体は、 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して結 合しており、 かつ該抗体が特異的な結合親和性を有する抗原と結合する活性を有 するものであれば如何なるものであってもよい。 好ましくは、 抗体の重鎖が単鎖 抗体分子の N末端に位置するものが用いられる。 抗体は、 特定の抗原を認識して 結合する活性を有するモノクローナル抗体が好ましい。 また、 抗体の重鎖および 軽鎖は、 その全長を含む必要はなく、 抗原を認識して特異的な親和結合性を有す るに充分な部位であればよい。 具体的には可変領域が好ましく用いられる。
リンカ一は、 抗体の重鎖および軽鎖が該リンカーを介して架橋するに十分な長 さであり、 さらに標識化物質を有するための構造を有するものであれば特に制限 はない。 一般的には 1 0〜3 0アミノ酸からなるポリぺプチドが好ましく用いら れる。 具体的な構造については、 後述する標識化物質に応じて適宜選択すること ができる。
標識化物質としては、 本発明の単鎖抗体を標識する目的で用いられるもの (以 下、 これを 「シグナル物質」 と称することがある) と、 本発明の単鎖抗体を固相 化する目的で用いられるもの (以下、 これを 「固相化物質」 と称することがある) が好ましい。 具体的には、 シグナル物質としては、 アミノ酸に結合し得る蛍光色 素、 例えばフルォレセイン系列、 ローダミン系列、 ェォシン系列、 N B D系列な どや、 光増感剤、 例えば、 メチレンブルーやローズベンガルなどや、 あるいは、 核磁気共鳴スぺク トル (NMR ) において特異的シグナルを与える物質、 例えば フッ素やリン原子を含むアミノ酸などが挙げられる。また、固相化物質としては、 固相表面上に結合させた特定の物質 (以下、 これを 「アダプター物質」 と称する ことがある) と結合する物質であれば如何なるものであってもよい。 固相化物質 とアダプタ一物質の組み合わせとしては、 例えば、 ピオチンノアビジンおよびス トレプトアビジンなどのピオチン結合タンパク質、 マノレトース ^マルトース結合 タンパク質、 グァニンヌクレオチド ZGタンパク質、 ポリヒスチジンペプチド ニッケルあるいはコバルト等の金属イオン、 グルタチオン一 S— トランスフェラ ーゼ /ダルタチオン、 D N A結合タンパク質 D N A、 抗体/抗原分子 (ヱピト ―プ)、 カルモジュリン/カルモジュリン結合ペプチド、 A T P結合タンパク質 ZA T P、 あるいはエストラジオ一ル受容体タンパク質 エストラジオール等の 各種受容体タンパク質 そのリガンド等が挙げられる。 これらは、 いずれが固相 化物質でもアダプター物質でもよい。 これらの中で、 固相化物質がピオチンでァ ダプター物質がストレプトアビジン、 または固相化物質がポリヒスチジンべプチ ドでアダプター物質がニッケル等が好ましく用いられる。
標識化物質は、 そのリンカ一部分への結合方法において特定の酵素の存在下で 抗体のリンカ一部分のポリべプチドに結合し得る物質を用いることもできる。 こ のような物質としては、 例えば、 ピオチン等が挙げられる。 標識物質としてピオ チンを用いる場合、 特定の酵素としてピオチンリガーゼが挙げられ、 リンカ一は ピオチンリガーゼにより認識されるアミノ酸配列を有するもの等が挙げられる。 また、 標識化物質は、 抗体のリンカ一部分の一部として組み込まれている物質 であってもよく、 その具体例としては、 ポリヒスチジンペプチドが挙げられる。 この場合には、 リンカ一にはポリヒスチジンペプチドを含むものが用いられる。 標識化物質のリンカ一部分への結合、 または組み込みは、 用いるシグナル物質 あるいは固相化物質とアダプター物質との性質に応じて、 それ自体既知の方法に より行うことができる。 ( 2 ) 単鎖抗体及び標識化単鎖抗体の製造方法
本発明の単鎖抗体及び標識化単鎖抗体は、 例えば以下の方法により製造される。 まず ( i ) 目的のタンパク質またはその一部を抗原として認識するモノクローナ ル抗体を製造し、 ( i i )該モノクローナル抗体をコ一ドする D N Aを取得する。 さらにその重鎖および軽鎖をコードする配列を特定し、 リンカーをコードする塩 基配列を挟んで連結する (以下、 この D N A断片を 「単鎖抗体ユニット」 と称す ることがある)。 ( i i i ) 製造した単鎖抗体ユニッ トがコードするタンパク質を その構造が正しく保持される適当な方法で合成する。合成の際、あるいは合成後、 標識化物質をリンカ一部分に結合する場合には、 これを結合させる。 これらの詳 細な方法について以下に説明する。
( i ) モノクローナル抗体の製造
本発明の単鎖抗体の抗原は特に制限はなく、 免疫原性を有するものであれば如 何なるものであってもよい。 具体的には、 例えば、 サルモネラ糖鎖等が挙げられ る。 これらの抗原を特異的に認識するモノクローナル抗体の調製方法としては、 通常用いられる公知の方法を用いることができ、 抗原として用いられるポリぺプ チドについても、 公知の方法に従って抗原性が高くェピトープ (抗原決定基) と して適した配列を選択して用いることができる。 ェピトープの選択方法としては、 例えば E p i t o p e Ad v i s e r (富士通九州システムエンジニアリング 社製) 等の市販のソフトウェアを用いることができる。
上記の抗原として用いるポリペプチドは、 公知の方法に従って合成した合成ぺ プチドを用いることが好ましい。 抗原となるポリペプチドは、 公知の方法に従つ て適当な溶液等に調製して、 哺乳動物、 例えばゥサギやマウス等に免疫を行えば よいが、 安定的な免疫を行ったり抗体価を高めるために抗原ペプチドを適当なキ ャリアタンパク質とのコンジユゲートにして用いたり、 アジュバント等を加えて 免疫を行うのが好ましい。
免疫に際しての抗原の投与経路は特に限定されず、 例えば皮下、 腹腔内、 静脈 内、 あるいは筋肉内等のいずれの経路を用いてもよい。 具体的には、 例えば BA LB/cマウスに抗原ポリペプチドを数日〜数週間おきに数回接種する方法等 が用いられる。 また、 抗原の摂取量としては、 抗原がポリペプチドの場合 0. 3 〜0. 5mgZl回が好ましいが、 ポリペプチドの種類、 また免疫する動物種に よっては適宜調節される。
免疫後、 適宜試験的に採血を行って固相酵素免疫検定法 (以下、 これを 「EL I SA法」 と称することがある) やウェスタンブロッテイング等の方法で抗体価 の上昇を確認し、 十分に抗体価の上昇した動物から採血を行う。 これに抗体の調 製に用いられる適当な処理を行えばポリクローナル抗体を得ることができる。 具 体的には、 例えば、 公知の方法に従い血清から抗体成分を精製した精製抗体を取 得する方法等が挙げられる。 また、 該動物の脾臓細胞とミエローマ細胞とを用い て公知の方法に従って融合させたハイブリ ドーマを用いる (M i 1 s t e i n, e t a 1. , Na t u r e, 256, 495 (1 9 75)) ことによりモノクロ ーナル抗体を製造することもできる。 モノクローナル抗体は、 例えば以下の方法 により取得することができる。
まず、 上記した抗原の免疫により抗体価の高まった動物から抗体産生細胞を取 得する。 抗体産生細胞は、 形質細胞、 及びその前駆細胞であるリンパ球であり、 これは個体の何れから取得してもよいが、 好ましくは脾臓、 リンパ節、 末梢血等 から取得する。 これらの細胞と融合させるミエローマとしては、 一般的にはマウ スから得られた株化細胞、 例えば 8—ァザグァニン耐性マウス (BALBZc由 来等) ミエローマ細胞株である P 3 X 63— A g 8. 653 (ATCC : CRL - 1 580), P 3— N S 1ノ 1 A g 4. 1 (理研セルバンク : R C B 0095 ) 等が好ましく用いられる。 細胞の融合は、 抗体産生細胞とミエローマ細胞を適当 な割合で混合し、 適当な細胞融合培地、 例えば RPMI 1 640やイスコフ改変 ダルベッコ培地 ( IMDM)、 あるいはダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) 等に、 50%ポリエチレングリコール (PEG) を溶解したもの等を用いること により行うことができる。 また電気融合法(U. Z i mm e rma n n. e t a 1., Na t u r w i s s e n s c h a f t e n, 68, 577 (198 1)) に よっても行うことができる。
ハイブリ ドーマは、 用いたミエローマ細胞株が 8—ァザグァユン耐性株である ことを利用して適量のヒポキサンチン ·アミノプテリン 'チミジン (HAT) 液 を含む正常培地 (HAT培地) 中で 5%C02、 37°Cで適当時間培養すること により選択することができる。 この選択方法は用いるミエローマ細胞株によって 適宜選択して用いることができる。 選択されたハイプリ ドーマが産生する抗体の 抗体価を上記した方法により解析し、 抗体価の高い抗体を産生するハイプリ ドー マを限界希釈法等により分離し、 分離した融合細胞を適当な培地で培養して得ら れる培養上清から硫安分画、 ァフィ二テイクロマトググラフィ一等の適当な方法 により精製してモノクローナル抗体を得ることができる。 また精製には市販のモ ノクローナル抗体精製キッ トを用いることもできる。 さらには、 免疫した動物と 同系統の動物、 またはヌードマウス等の腹腔内で上記で得られた抗体産生ハイブ リ ドーマを増殖させることにより、 本発明のモノクローナル抗体を大量に含む腹 水を得ることもできる。
( i i ) モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする DN Aの取得および 単鎖抗体ュニットの作製
上記 ( i) で取得したモノクローナル抗体の重鎖 (H鎖) および軽鎖 (L鎖) をコードする DNAを取得する方法として、 具体的には、 該モノクローナル抗体 を産生するハイプリ ドーマより得られる免疫グロブリンの H鎖、 及び L鎖の一部、 好ましくは可変領域 ( V領域) が有するァミノ酸配列の一部のァミノ酸配列を解 析し、 そのアミノ酸配列を基にこれをコードする遺伝子をクローニングする方法 等が挙げられる。 ここで、モノクローナル抗体の H鎖および L鎖の可変領域とは、 フレームワーク領域 (FR) と超可変領域 (CDR) よりなるものが好ましレ、。 かく して得られる H鎖および L鎖の可変領域をコードする DNAとしては、 例 えば、 サルモネラ菌の O—抗原を認識する単鎖抗体のものとして、 An a n d, N. N. , e t a 1. , J . B i o l . C h e m. , 266, 21 874— 21 879 (1 99 1 ) に記載の配列からなる DNA等が挙げられる。
かく して得られる H鎖および L鎖の可変領域をコードする DNAの間にリン カーをコードする DNAを挟んで両 DNA断片を適当な方法で結合し、 単鎖抗体 ユニットを作製する。 ここで、 単鎖抗体ユニットは、 単独で DNA断片として取 得する必要はなく、 後述する発現用ベクター等への挿入と同時に構築してもよレ、。 リンカ一をコードする DNAとしては、 (1) に記載したリンカ一をコードする DN Aであれば何れのものでもよい。 具体的に、 例えば、 ピオチンリガ一ゼによ り認識されるアミノ酸配列 (P e t e r J. S c h a t z (1 993) B i o t e c hn o l o g y, 1 1 (1 1 38— 1 143) を含むリンカーをコ一ド する DNAが好ましく、 配列番号 1に示すもの等が挙げられる。 また、 標識化物 質がリンカ一部分の一部として組み込まれている例としては、 ポリヒスチジンべ プチドをコ一ドする塩基配列を含むもの等が挙げられる。
リンカーをコードする DNAは通常用いられる方法を用いて作製することが できるが、 化学合成によって作製することが好ましい。
( i i i ) 単鎖抗体の製造
かく して得られる単鎖抗体ュニットは、 これを適当なプロモーターの制御下に なるように連結し、 宿主に導入するか、 あるいは適当な方法で転写した後に無細 胞タンパク質翻訳系を用いて、 製造する単鎖抗体のジスルフィ ド結合が保持され る条件で発現させることにより単鎖抗体を製造することができる。 ここで、 抗原 との結合性の低い抗体は、 それ自体既知の進化工学的手法を用いることによりさ らに結合性の高い抗体として取得することもできる。
適当なプロモーターとは、 用いる宿主、 または転写に用いる RNA合成酵素に より適宜選択することができる。 具体的には、 転写に S P 6 RN A合成酵素を 用いる場合には、 S P 6プロモーターを用いることが好ましい。 また、 無細胞タ ンパク質翻訳系では、 プロモーターと単鎖抗体ユニットとの間に、 翻訳活性を増 強する塩基配列を挿入することが好ましい。 翻訳活性を増強させる塩基配列とし て具体的には、 真核生物においては、 5' キャップ構造 (S h a t k i n, C e 1 1 , 9, 645 - (1 976))、 コザック配列 (K i z a k, Nu c l e i c Ac i d. Re s ., 1 2, 857— (1 984)) 等があり、 また原核生物にお いてはシャインダルガーノ配列等が知られている。 更には RN Aウィルスの 5 ' 一非翻訳リーダー配列にも翻訳促進活性があることが見出されており (特許第 2 8 14433号公報)、 これらの配列を用いてタンパク質合成を効率よく行う方 法が開発されている (特開平 1 0— 146 1 97号公報)。 また、 ランダム配列 についてそのポリソーム形成への影響を指標として翻訳ェンハンス配列を選択 する方法によって得られた配列も挙げられる (特願 2001—396941明細 書)。 かくして製造される DNAを以下、 翻訳铸型と称することがある。 翻訳铸型の具体例としては、 サルモネラ菌の o—抗原を認識するのものとして、 例えば図 1に示す構造を有するものが挙げられる。
翻訳鎵型を導入する宿主としては、 通常タンパク質の合成に用いられるもので あって、 単鎖抗体が有するジスルフィ ド結合が保持され得るコムギ胚芽由来の無 細胞タンパク質合成系を用いる。 これは、 他の無細胞タンパク質合成系で製造し た抗体では、 抗原を認識するための立体構造を十分に保持できないために、 低い K d値しか示していない (ALEXANDER ZDANOV.,et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol 91, pp.6423-6427(1994)、 C.Roger Mackenzie. ,et al., THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY., Vol 271, pp, 1527-1533(1998))。 本発明に用い られるコムギ胚芽由来細胞抽出液として具体的には、 市販のものであるである P R O T E I O S™ ( T O Y O B O社製) 等が挙げられる。
また、 分子内ジスルフィ ド結合を保持され、 かつタンパク質が合成される反応 液は、 上記のコムギ胚芽由来無細胞翻訳系を行う反応液 (以下、 これを 「弱還元 型翻訳反応液」 と称することがある) のタンパク質合成に必要な成分のうち、 還 元剤の濃度を調製することにより作製することができる。 具体的な還元剤とその 濃度としては、 ジチォスレイ トール (以下これを 「D T T」 と称することがある) を最終濃度 2 0〜7 0 μ Μ、 好ましくは 3 0〜5 0 μ Μ、 2 —メルカプトエタノ ールを最終濃度 0 . 1〜0 . 2 mM、 ダルタチオン 酸化型ダルタチオンの濃度 が 3 0〜5 0 μ Μ/ 1〜5 μ Μの範囲等が挙げられる。
このような翻訳反応液中の還元剤濃度は、 上記したものに限定されるものでは なく、 合成しょうとするタンパク質により適宜変更することができる。 還元剤の 至適濃度範囲の選択法としては、 特に制限はないが、 例えば、 ジスルフィ ド結合 交換反応を触媒する酵素の効果によって判断する方法を挙げることができる。 具 体的には、 還元剤の濃度を様々にふった翻訳反応液を調製し、 これらにジスルフ ィ ド結合交換反応を触媒する酵素を添加して分子内にジスルフィ ド結合を有す るタンパク質合成を行う。 また、 対照実験として同様の翻訳反応液に
ド結合交換反応を触媒する酵素を添加しないで同様のタンパク質合成を行う こで合成されるタンパク質の可溶化成分を、 例えば遠心分離等の方法により分離 する。 この可溶化成分が全体の 5 0 % (可溶化率 5 0 %) 以上であり、 またその 可溶化成分がジスルフィ ド結合交換反応を触媒する酵素の添加により増加した 反応液が、 該タンパク質の分子内ジスルフィ ド結合を保持したまま合成する反応 液として適していると判断することができる。 さらには、 上記のジスルフイ ド結 合交換反応を触媒する酵素の効果によって選択された還元剤の濃度範囲のうち、 合成されるタンパク質量の最も多い還元剤の濃度をさらに好ましい濃度範囲と して選択することができる。
このような還元剤濃度を有する反応液の調整方法としては、 還元剤を含まない コムギ胚芽由来無細胞タンパク質合成用細胞抽出液を調製し、 これにコムギ胚芽 由来無細胞タンパク質翻訳系に必要な成分とともに、 上記の濃度範囲となるよう に還元剤を添加する方法や、 コムギ胚芽由来無細胞タンパク質合成用細胞抽出液 から上記の濃度範囲となるように還元剤を除去する方法等が用レ、られる。 コムギ 胚芽由来無細胞タンパク質合成用細胞抽出液はこれを抽出する際に高度の還元 条件を必要とするため、 抽出後にこの溶液か 還元剤を取り除く方法がより簡便 である。 細胞抽出液から還元剤を取り除く方法としては、 ゲルろ過用担体を用い る方法等が挙げられる。 具体的には、 例えば、 セフアデックス G— 2 5カラムを 予め還元剤を含まない適当な緩衝液で平衡化してから、 これに細胞抽出液を通す 方法等が挙げられる。
さらにこの細胞抽出液を凍結乾燥することにより凍結乾燥製剤とした後に、 こ れに適当な緩衝液を添加して用いることもできる。 凍結乾燥する場合、 潮解性の ' 物質の総濃度が 6 O mM以下にして行うことが好ましい。 また、 該細胞抽出液に 上記の翻訳铸型を添加してから凍結乾燥することもできる。
また、 上記凍結乾燥製剤における、 潮解性を示す物質 (潮解性物質) は、 凍結 乾燥状態での保存安定性を低下させない含有量は、 当該凍結乾燥製剤中に含有さ れるタンパク質 1重量部に対して、 0.01重量部以下が好ましく、 特に 0.005重量 部以下が好ましい。 なお、 ここでいうタンパク質重量は、 吸光度 (260, 280, 320 nm) を測定することにより算出されるものである。
以上のように還元剤濃度を調整された細胞抽出液を以下弱還元型翻訳反応液 ということがある。
また、 弱還元型翻訳反応液にさらにジスルフィ ド結合交換反応を触媒する酵素 を添加して翻訳反応を行えば、 分子内のジスルフィ ド結合が保持されたタンパク 質を高効率で合成することができる。 ジスルフィ ド結合交換反応を触媒する酵素 としては、 例えばタンパク質ジスルフィ ドイソメラーゼ等が挙げられる。 これら の酵素のコムギ胚芽由来無細胞翻訳系への添加量は、 酵素の種類によつて適宜選 択することができる。 具体的には、 コムギ胚芽から抽出した無細胞タンパク質合 成用細胞抽出液であって、 還元剤として DTTを 20〜70、 好ましくは 30〜 50 含有する翻訳反応液にタンパク質ジスルフィ ドイソメラーゼを添加す る場合、 最終濃度で 0. 0 1〜 1 0 の範囲、 好ましくは 0. 5 μΜとなるよ うに添加する。 また、 添加の時期はジスルフィ ド結合が形成される効率から無細 胞翻訳反応開始前に添加しておくことが好ましい。
また、 コムギ以外の植物種子由来の無細胞タンパク質翻訳系としては、 ォォム ギ、 イネ、 コーン等のイネ科植物のものも挙げられる。 しかし、 このような無細 胞タンパク質翻訳系うち、 特にコムギ胚芽抽出液を用いることが好ましく、 この 細胞抽出液を用いる場合を例として、 単鎖抗体の製造方法を詳細に説明する。 コムギ胚芽の選別法としては、例えば J o h n s t o n. F. B. e t a 1. , Na t u r e, 1 79, 1 60— 1 6 1 (1 957) を用いることができ、 また 胚芽からの細胞抽出液の作製方法としては、 E r i c k s o n. A. H. e t a 1., Me t h. I n E n z y m o 1. , 96, 38— 50 ( 1 996) 等に記 載の方法を用いることができる。
本発明で好適に利用される調製方法により、 コムギ胚芽抽出液を回収し、 ゲル ろ過等により精製することによりコムギ胚芽抽出液を得ることができる。 ゲルろ 過としては、 例えばセフアデックス G— 25カラム等のゲルろ過装置を用いて行 うことができる。 ゲルろ過溶液中の各成分の組成 ·濃度はそれ自体既知であり、 無細胞タンパク合成用のコムギ胚芽抽出液の製造法に用いられるものを採用す ればよい。 ここで、 セフアデックス G— 25カラムを平衡化するための溶液とし て、 還元剤を含まないもの、 具体的には、 例えば、 HEPE S_KOH、 酢酸力 リゥム、酢酸マグネシウム、又は L型アミノ酸を含むものを用いることによれば、 抽出液中に含まれていた還元剤のうちの約 97%が吸収される。 具体的には、 コ ムギ胚芽から還元剤として DTTを 1 mM含む抽出液を用いて抽出を行った場 合、 最終的に約 30 μΜの DTTを含むコムギ胚芽抽出液を取得することができ る。 ただし、 還元剤濃度を低下させたコムギ胚芽抽出液は凍結保存によりその活 性が著しく低下するため、 還元剤の除去工程は翻訳反応に用いる直前に行うこと が好ましい。
ゲルろ過後の胚芽抽出液には、 微生物、 特に糸状菌 (力ビ) などの胞子が混入 していることがあり、これら微生物を排除しておくことが好ましレ、。特に長期(1 日以上) の無細胞タンパク質合成反応中に微生物の繁殖が見られることがあるの で、 これを阻止することは重要である。微生物の排除手段は特に限定されないが、 ろ過滅菌フィルターを用いるのが好ましい。 フィルターのポアサイズとしては、 混入の可能性のある微生物が除去可能なものであれば特に制限はないが、 通常 0. 1〜 1マイクロメーター、 好ましくは 0. 2〜0. 5マイクロメーターが適当で ある。 ちなみに、 小さな部類の枯草菌の胞子のサイズは 0. 5 μ ηιΧ ΐ μηであ ることから、 0. 20マイクロメーターのフィルター (例えば S a r t o r i u s社製の M i n i s a r t TM等) を用いるのが胞子の除去にも有効である。 ろ 過に際して、 まずポアサイズの大きめのフィルターでろ過し、 次に混入の可能性 のある微生物が除去可能であるポアサイズのフィルターを用いてろ過するのが 好ましい。
このようにして得られた細胞抽出液は、 原料細胞自身が含有する又は保持する タンパク質合成機能を抑制する物質 (トリチン、 チォニン、 リボヌクレアーゼ等 の、 mRNA、 t RNA、 翻訳タンパク質因子やリボソーム等に作用してその機 能を抑制する物質) を含む胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されている。 ここで、 胚乳がほぼ完全に取り除かれ純化されているとは、 リボソームが実質的に脱アデ ニン化されなレ、程度まで胚乳部分を取り除いたコムギ胚芽抽出液のことであり、 また、 リボソームが実質的に脱アデニン化されない程度とは、 リボソームの脱ァ デニン化率が 7%未満、 好ましくは 1 %以下になっていることをいう。
また、 このような胚乳成分を取り除いた細胞抽出液は、 低分子のタンパク質合 成阻害物質 (以下、 これを 「低分子合成阻害物質」 と称することがある) を含有 しているため、 細胞抽出液の構成成分から、 これら低分子合成阻害物質を分子量 の違いにより分画排除することが好ましい。 排除されるべき物質 (低分子阻害物 質) の分子量は、 細胞抽出液中に含まれるタンパク質合成に必要な因子よりも小 さいものであればよい。 具体的には、 分子量 50, 000〜14, 000以下、 好ましくは 14, 000以下のものが挙げられる。
低分子合成阻害物質の細胞抽出液からの排除方法としては、 それ自体既知の通 常用いられる方法が用いられるが、 具体的には透析膜を介した透析による方法、 ゲルろ過法、あるいは限外ろ過法等が挙げられる。 このうち、透析による方法(透 析法) 力 透析内液に対しての物質の供給のし易さ等の点において好ましい。 以 下、 透析法を用いる場合を例に詳細に説明する。
透析に用いる透析膜としては、 50, 000〜1 2, 000の排除分子量を有 するものが挙げられる、 具体的には排除分子量 1 2, 000〜14, 000の再 生セルロース膜 (V i s k a s e S a l e s, Ch i c a g o社製) や、 排除 分子量 50, 000のスぺク トラ/ポア 6 (S PECTRUM LABOTRA TOR I ES I NC., C A, USA製) 等が好ましく用いられる。 このよう な透析膜中に適当な量の上記細胞抽出液を入れ常法を用いて透析を行う。 透析を 行う時間は、 30分〜 24時間程度が好ましい。
低分子合成阻害物質の排除を行う際、 細胞抽出液に不溶性成分が生成される場 合には、 これを阻害する (以下、 これを 「細胞抽出液の安定化」 と称することが ある) ことにより、 最終的に得られる細胞抽出液 (以下、 これを 「処理後細胞抽 出液」 と称することがある) のタンパク質合成活性が高まる。 細胞抽出液の安定 化の具体的な方法としては、 上記した低分子阻害物質の排除を行う際に、 少なく とも高エネルギーリン酸化合物、 例えば A T Pまたは G T P等を含む溶液中で行 う方法が挙げられる。 高エネルギーリン酸化合物としては、 A T Pが好ましく用 レヽられる。 また、 好ましくは、 A T Pと G T P、 さらに好ましくは A T P、 G T P、 及び 2 0種類のアミノ酸を含む溶液中で行う。
これらの成分 (以下、 これを 「安定化成分」 と称することがある) を含む溶液 中で低分子阻害物質の排除を行う場合は、 細胞抽出液に予め安定化成分を添加し、 インキュベートした後、 これを低分子阻害物質の排除工程に供してもよい。 低分 子合成阻害物質の排除に透析法を用いる場合は、 細胞抽出液だけでなく透析外液 にも安定化成分を添加して透析を行い低分子阻害物質の排除を行うこともでき る。 透析外液にも安定化成分を添加しておけば、 透析中に安定化成分が分解され ても常に新しい安定化成分が供給されるのでより好ましい。 このことは、 ゲルろ 過法や限外ろ過法を用レ、る場合にも適用でき、 それぞれの担体を安定化成分を含 むろ過用緩衝液により平衡化した後に、 安定化成分を含む細胞抽出液を供し、 さ らに上記緩衝液を添加しながらろ過を行うことにより同様の効果を得ることが できる。
安定化成分の添加量、 及び安定化処理時間としては、 細胞抽出液の種類や調製 方法により適宜選択することができる。 これらの選択の方法としては、 試験的に 量及び種類をふった安定化成分を細胞抽出液に添加し、 適当な時間の後に低分子 阻害物質の排除工程を行い、 取得された処理後細胞抽出液を遠心分離等の方法で 可溶化成分と不溶化成分に分離し、 そのうちの不溶性成分が少ないものを選択す る方法が挙げられる。 さらには、 取得された処理後細胞抽出液を用いて無細胞タ ンパク質合成を行い、 タンパク質合成活性の高いものを選択する方法も好ましい。 また、 上記の選択方法において、 細胞抽出液と透析法を用いる場合、 適当な安定 化成分を透析外液にも添加し、 これらを用いて透析を適当時間行った後、 得られ た細胞抽出液中の不溶性成分量や、 得られた細胞抽出液のタンパク質合成活性等 により選択する方法も挙げられる。 このようにして選択された細胞抽出液の安定化条件の例として、 具体的には、 上記調製したコムギ胚芽抽出液で、 透析法により低分子阻害物質の排除工程を行 う場合においては、 そのコムギ胚芽抽出液、 及び透析外液中に, ATPを 1 00 μΜ〜0. 5mM、 GTPを 25 μΜ〜; lmM、 20種類の L型アミノ酸をそれ ぞれ 25 M〜 5 mM添加して 30分〜 1時間以上の透析を行う方法等が挙げ られる。 透析を行う場合の温度は、 タンパク質合成活性が失われず、 かつ透析が 可能な温度であれば如何なるものであってもよい。 具体的には、 最低温度として は、 溶液が凍結しない温度で、 通常— 10°C、 好ましくは _ 5°C、 最高温度とし ては透析に用いられる溶液に悪影響を与えない温度の限界である 40°C、 好まし くは 38°Cである。
細胞抽出液への安定化成分の添加方法は、 特に制限はなく、 低分子阻害物質の 排除工程の前に添加しこれを適当時間インキュベートして安定化を行った後、 低 分子合成阻害物質の排除工程を行つてもよいし、 安定化成分を添加した細胞抽出 液、 及び または安定化成分を添加した該排除工程に用レ、るための緩衝液を用レ、 て低分子合成阻害物質の排除工程を行ってもよい。
上記した無細胞タンパク質合成用細胞抽出液は、 これを上記に記載した範囲の 還元剤の濃度範囲に調製し、 無細胞タンパク質合成に必要なエネルギー源ゃァミ ノ酸、 翻訳铸型、 あるいは t RNA等、 またジスルフイ ド結合交換反応を触媒す る酵素を必要に応じて添加してそれぞれ選択されたそれ自体既知のシステム、 ま たは装置に投入し、 タンパク質合成を行うことができる。 タンパク質合成のため のシステムまたは装置としては、ノくツチ法(P r a t t , J . M . e t a 1., T r a n s c r i p t i o n a n d T r a n l a t i o n, Hame s , 1 79 - 209, B. D. &H i g g i n s, S. J . , e d s, I R L P r e s s , Ox f o r d ( 1984))、 アミノ酸、 エネルギー源等を連続的に反応系 に供給する連続式無細胞タンパク質合成システム (S p i r i n, A. S. e t a 1. , S c i e n c e, 242, 1 1 62— 1 1 64 (1 988))、 透析法 (木 川等、 第 2 1回日本分子生物学会、 W I D 6)、 あるいは重層法 (S a w a s a k i, T. , e t a 1. , FEB S L e t., 514, 1 02— 105 (20
02)) 等が挙げられる。
さらには、 合成反応系に、 铸型の RNA、 アミノ酸、 エネルギー源等を必要時 に供給し、 合成物や分解物を必要時に排出する方法 (特開 2000— 33367 3号公報:以下これを 「不連続ゲルろ過法」 と称することがある) 等を用いるこ とができる。
このうち、 アミノ酸やエネルギー源の連続、 または不連続供給系を使用するこ とにより、 反応を長時間維持させることができ、 更なる効率化が可能となるが、 弱還元型翻訳反応液を用いてタンパク質合成を行う場合は、 バッチ法を用いる方 がタンパク質合成効率が高い傾向にあるため好ましい。 また、 上記に記載の方法 によりコムギ胚芽抽出液を調製した場合には t RNAを充分に含んでいるため 通常これを添加する必要が無い。
ノ ッチ法によりタンパク質合成を行う場合には、 例えば翻訳铸型を除いた合成 反応液を必要に応じて適当時間プレインキュベートした後に翻訳铸型を添加し てインキュベートすること等により行うことができる。 合成反応液としては、 翻 訳反応液として、 例えば、 1 0〜50 mM HEPE S—KOH (pH 7. 8)、 55〜 : I 2 OmM酢酸カリウム、 :!〜 5 mM酢酸マグネシウム、 0. ;!〜 0. 6 mMスぺノレミジン、 各 0. 025〜 1 mM L—アミノ酸、 20〜70 μΜ、 0 ましくは 30〜50 の DTT、 :!〜 1. 5 mM ATP、 0. 2〜0. 5m M GTP、 1 0〜 2 OmMクレアチンリン酸、 0. 5〜 1. OUZ/ 1 RN a s e i n h i b i t o r , 0. 0 1〜 : 1 0 μΜタンパク質ジスルフィ ドィソ メラーゼ、 及び 24〜75%コムギ胚芽抽出液を含むもの等が用いられる。
このような翻訳反応液を用いた場合プレインキュベートは 1 0〜40°Cで 5 〜1 0分間、 インキュべ一トは同じく 10〜40°C、 好ましくは 1 8〜30° (:、 さらに好ましくは 20〜26°Cで行う。 反応時間は、 反応が停止するまでの時間 である力 バッチ法では通常 1 0分〜 7時間程度である。(P r a t t, J. M . e t a 1. , T r a n s c r i p t i o n a n d T r a ns l a t i o n, Hame s, 1 79— 209, B. D. &H i g g i n s , S. J., e d s, I R L P r e s s, Ox f o r d (1 984) 参照)。
透析法によりタンパク質合成を行う場合には、 合成反応液を透析内液とし、 透 析外液と物質移動が可能な透析膜によって隔離される装置を用いて、 タンパク質 合成を行う (木川等、 第 2 1回日本分子生物学会、 WI D 6参照)。
重層法を用いてタンパク質合成を行う場合には、 合成反応液を適当な容器に入 れ、 該溶液上に、 上記透析法に記載した透析外液を界面を乱さないように重層す ることによりタンパク質合成を行う (S a wa s a k i , T., e t a 1. , F EB S L e t., 5 14, 102— 105 (2002)、 特許公開番号 WO 02/24939 Al参照)
不連続ゲルろ過法を用いてタンパク質合成を行う場合には、 合成反応液により 合成反応を行い、 合成反応が停止した時点で、 鋒型の RNA、 アミノ酸、 ェネル ギ一源等を供給し、 合成物や分解物を排出することによりタンパク質合成を行う。 具体的には例えば、 翻訳铸型を除いた上記合成反応液を必要に応じて適当時間プ レインキュベートした後、 翻訳铸型を添加して、 適当な容器に入れ反応を行う。 容器としては、 例えばマイクロプレート等が挙げられる。 この反応下では、 例え ば容量の 48 %容のコムギ胚芽抽出液を含む反応液の場合には反応 1時間で合 成反応は完全に停止する。 このことは、 アミノ酸のタンパク質への取りこみ測定 やショ糖密度勾配遠心法によるポリ リボソーム解析 (P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA., 97, 559— 564 (2000)) により確認するこ とができる。 合成反応の停止した上記反応溶液を、 予め上記透析法に記載の透析 外液と同様の組成の供給液により平衡化したゲルろ過カラムを通す。 このろ過溶 液を再度適当な反応温度に保温することにより、 合成反応が再開し、 タンパク質 合成は数時間に渡って進行する。 以下、 この反応とゲルろ過操作を繰り返す。 反 応温度、 及び時間は用いるタンパク質合成系において適宜選択されるが、 コムギ 胚芽抽出液を用いた系においては 26°Cで約 1時間ごとにゲルろ過を繰り返す のが好ましい。 このような無細胞タンパク質翻訳において、 本発明の単鎖抗体に標識化物質を 特定の酵素の存在下で結合させる場合には、 標識化物質と、 それをリンカ一部分 のポリべプチドに結合し得る酵素の存在下で上記した翻訳反応を行う。 具体的に は、 標識化物質としてビォチンをリンカ一に結合させる場合、 リンカ一に予め挿 入したビォチンリガーゼに認識されるアミノ酸を認識してピオチンを結合させ る酵素であるピオチンリガーゼ (Av i d i t y, LLC社製等) 等の存在下で 翻訳反応を行う。 ピオチンおよびピオチンリガ一ゼの添加量は、 市販製品 (酵素) に添付されている説明書に記載の量が好ましい。
また、標識化物質をタンパク質合成の後に結合する場合には、翻訳反応終了後、 翻訳反応液中の単鎖抗体のリンカ一部分に、 それぞれの標識化物質に適した方法 により結合してもよいし、 下記の方法で単鎖抗体を精製した後に、 それぞれの標 識化物質に適した方法により結合してもよい。
かく して得られた本発明の単鎖抗体又は標識化単鎖抗体は、 それ自体既知の方 法により確認することができる。 具体的には例えば、 アミノ酸のタンパク質への 取りこみ測定や、 S D S—ポリアク リルアミ ド電気泳動による分離とクマシーブ リ リアン卜ブルー(CBB)による染色、ォートラジオグラフィー法(En d o, Y. e t a 1. , J . B i o t e c h., 25, 22 1— 230 (1 992) ; P r o c. Na t l . Ac a d. S c i . USA., 97, 559— 564 (2 000)) 等を用いることができる。
また、 かく して得られる反応液には、 目的の単鎖抗体又は標識化単鎖抗体が高 濃度に含まれているので、 透析、 イオン交換クロマトグラフィー、 ァフィ二ティ クロマトグラフィー、 ゲルろ過等のそれ自体既知の分離、 精製法により、 該反応 液から目的の単鎖抗体又は標識化単鎖抗体を容易に取得することができる。 (3) 標識化単鎖抗体の利用
本発明の標識化単鎖抗体は、 抗原との結合性を解析することにより抗原抗体反 応の解析方法に用いることができる。 抗原抗体反応の解析方法は、 以下の ( I ) 〜(VI)工程を含むことによって行える。
( I ) 以下の要素の①又は②を含む、 単鎖抗体のジスルフィ ド結合が保持される 条件下において、 標識化単鎖抗体を調製する工程、
① 特定抗原への結合性を有する抗体の重鎖および軽鎖をコードする D N Aが 、 翻訳後に特定の酵素の存在下で標識化物質を結合し得る塩基配列を含むリ ンカーをコードする D N Aを介して連結されている D N Aを、 特定の酵素の 存在下でコムギ無細胞系タンパク質合成系を用いて転写翻訳し、 標識化単鎖 抗体を製造する工程、
② 特定抗原への結合性を有する抗体の可変領域である重鎖および軽鎖をコー ドする D N Aが、翻訳後に特定の酵素の存在下で標識化物質を結合し得る塩 基配列を含むリンカ一をコードする D N Aを介して連結されている D N A を、特定の酵素の存在下でコムギ無細胞系タンパク質合成系を用いて転写翻 訳し、 標識化単鎖抗体を製造する工程、
( Π ) 以下の要素を含む、 標識化単鎖抗体の標識化物質が固相化物質である場合 の、 標識化単鎖抗体の標識化物質と特異的に結合する物質 (アダプター物質) を調製する工程、
①複数の領域に区画された基盤に標識化単鎖抗体の標識化物質と特異的に結 合する物質 (アダプター物質) を固定する工程、
② 前記①の基盤に固定されなかった標識化単鎖抗体の標識化物質と特異的に 結合する物質 (アダプター物質) を除去する工程、
③前記①又は②の工程の前後において、 適宜基盤における非特異的吸着を除去 する工程、
(ΠΙ) 以下の要素を含む、 標識化物質が固相化物質である場合の固相化単鎖抗体 を調製する工程、
①前記 ( I ) ①又は②で調製した標識化単鎖抗体を (Π ) に記載の標識化単鎖 抗体と特異的に結合する物質 (アダプター物質) を表面に有する複数の領域に 区画された基盤に必要量を添加、 接触させる工程、 ②前記①の基盤上の標識化単鎖抗体と特異的に結合する物質 (アダプター物質 ) に固定されなかった標識化単鎖抗体を除去する工程、
③ 前期②の工程に続いて、 適宜基盤における非特異的吸着を除去する工程、
(IV) 以下の要素を含む、 標識化物質がシグナル物質である場合の標識化単鎖抗 体を調製する工程、
①適宜、 複数の領域に区画された基盤おける非特異的吸着を除去する工程、
②前記 ( I ) ①又は②で調製した標識化単鎖抗体の標識化物質を基盤に必要量 を添加させる工程、
(V) 被検物質を前記 (m) 又は (IV) に記載の各基盤に必要量添加し、 標識化 単鎖抗体と該被検物質との結合性を解析する工程、
(VI) (V) の結合性結果をもとに、 標識単鎖抗体と被検物質との相互作用を質 的又は量的に判定する工程。
上記抗原抗体解析方法における、 単鎖抗体のジスルフィ ド結合が保持される条 件とは、 標識化単鎖抗体を製造する工程において、 製造される標識化単鎖抗体の ジスルフィ ド結合が保持され得る条件であれば特に限定されない。 具体的には ( i i i ) 単鎖抗体の製造に記載の方法である、 翻訳反応液中の還元剤濃度を調 整することにより行える。 また、 アダプター物質及び標識化単鎖抗体を除去する 方法とは、 通常当業者が用いる洗浄用緩衝液を用いて基盤を数回洗浄することに より、 基盤上から除去することである。 また、 基盤に固定されたアダプター物質 における非特異的吸着を除去する方法とは、 通常当業者が用いるブッキング液等 を基盤に満たし。 その後、 数回緩衝液で洗浄することにより行える。
単鎖抗体を固相化した場合には、 非特異的吸着を減少させるために、 当該分野 において周知の方法を用いることができる。具体的には、ゥシ血清アルブミン(B SA)、 還元低脂肪乳、 サケ精子 DNA、 ブタへパリンなどを用いてアレイ固体 支持体をプレコーティングする方法を含む (Au s u b e 1 , . e t a 1. , S h o r t P r o t o c o l s i n Mo l e c u l a r B i o l o g y , 3 r d. e d i t i o n (1 995))。 上記抗原抗体解析方法に用いる基盤としては、 抗原抗体反応の解析方法あるい は装置に適したものを用いることができる。具体的には、固相酵素免疫検定法(E n z y m e L i n k e d I mmu n o s o r b e n t A s s a y (EL I SA) : C r ow t h j e r, J. R., Me t h o d s i n Mo l e c u l e r B i o l o g y, 42, (1995)) をにより解析する場合、 通常 E L I S A法により用いられるプラスチック製のマイクロタイタ一プレートが好まし レ、。 表面プラズモン共鳴法 (Cu l l e n, D. C. e t a 1. , Β i ο s c i e n c e s, 3 (4), 2 1 1— 225 (1 987— 88)) を用いる場合には、 ガラス等の透明基盤上に金、銀、 白金等の金属薄膜が構成されたものが好ましレ、。 また、 エバネッセント場分子イメージング法 (F u n a t s u, T., e t a 1. , Na t u r e, 374, 555— 5 59 (1 995)) を用いる場合には、 ガラス等の透明体が好ましく、 さらに好ましくは石英ガラス製のものが用いられ る。 蛍光イメージングアナライズ法を用いる場合には、 通常タンパク質等を固定 化するのに用いられる二トロセノレロースメンブレンやナイロンメンブレン、 ある いはプラスチック製のマイクロタイタープレート等も用いることができる。 また、 複合糖質 (例えば、 ァガロースとセファロース)、 アクリル樹脂 (例えば、 ポリ アクリルアミ ドとラテックスビーズ)、 マグネットビーズ、 シリコンゥェハー等 も基盤として用いることができる。
このような基盤へのアダプター物質の結合は、 それ自体既知の通常使用される 方法を用いることができる。 具体的には、 ジァゾ法、 ペプチド法 (酸アミ ド誘導 体、カルボキシクロライ ド樹脂、無水マレイン酸誘導体、ィノシアナ一ト誘導体、 臭化シアン活性化多糖体、 セルロースカルボナート誘導体等を用いる方法、 アル キル法、 架橋試薬を用いる方法、 Ug i反応による方法等が挙げられる。 また、 ガラス等の基盤を用いる場合には、 物理的に吸着させる方法も用いられる。 さら には、 ストレプトアビジン—マグネット (P r om e g a社製) のように市販の ものを用いることもできる。
かく して得られた標識化単鎖抗体を、 1つまたはそれ以上の既知抗原等の被検 物質を含む溶液と接触させ、 抗原抗体反応を解析することにより、 該抗原に対す る結合特異性を有する抗体を同定することができる。 この抗原はタンパク質であ つてもよいし、また有機化合物、炭水化物、核酸などであってもよレ、。 これらは、 単離されたものでもよいし、 また、 組換えまたは天然に存在するものであっても よレ、。 使用される抗原の量は、 約 1〜1 0 0 η § Ζ μ 1の範囲が好ましい。 抗原 抗体反応に要する時間は、 通常 5分間〜 2 4時間の範囲であり、 一般には 0 . 5 〜 2時間が好ましい。
抗原抗体反応の後、 固相化単鎖抗体の場合は、 該抗体を結合した固相を界面活 性剤等を含む生化学的に用いられる緩衝液により洗浄する工程も付加すること ができる。 緩衝液の組成および洗浄の回数等は抗原抗体反応の強さ等により適宜 選択される。
また、 上記抗原抗体反応の解析方法は、 標識化物質が固相化物質である場合に は、 固相化単鎖抗体と抗原との結合性を解析し、 標識化物質がシグナル物質であ る場合は、 抗原との結合性を溶液中で解析することにより抗原抗体反応を解析す ることができる。
標識化単鎖抗体と被検物質との相互作用を量的又は質的に判定する方法は、 そ れ自体既知の通常用いられる方法により行うことができる。 具体的には、 E L I S A法、 表面プラズモン共鳴法、 エバネッセント場分子イメージング法、 蛍光ィ メージングアナライズ法、 あるいは放射性同位体ラベルを用いた方法等も挙げら れる。
抗原等の被検物質とは、抗原を含む可能性があればよい。具体的には、例えば、 血液等の体液、 細菌の細胞壁抽出物、 タンパク質混合物等が挙げられる。
本発明の標識化単鎖抗体を用いた抗原抗体反応の解析方法及び該解析方法に 試薬を含む抗原抗体反応の測定用試薬キットによれば、 例えば、 ヒ トの自己抗体 の有無や、 がん細胞特異抗原等を解析、 診断するツールとなることができる。 実施例 以下、 実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、 本発明の範囲はこれらの実 施例により限定されるものではない。 実施例 1 ピオチン化抗サルモネラ単鎖抗体の製造
(1) サルモネラ単鎖抗体、 およびリンカ一をコードする DNAの作製 本発明の単鎖抗体として、 抗サルモネラ単鎖抗体を選択し、 以下の実験を行つ た。 該抗体は既に X線立体構造が解析され、 糖鎖に対する分子認識が詳細に調べ られている (C y g l e r, M., e t a 1 . , S c i e n c e , 2 5 3, 44 2— 44 5 ( 1 9 9 1) ; B u n d l e, D. R. e t a 1 , B i o c h e m i s t r y, 3 3, 5 1 7 2— 5 1 8 2 ( 1 9 94))。 サルモネラ細菌の細胞表 層には、 リポ多糖が存在し、 抗サルモネラ抗体は、 このリポ多糖の最も細胞外に 位置する O—抗原に結合する (An a n d, N. N., e t a 1 . , Ρ r ο t e i n E n g i rt. , 3, 54 1— 546 (1 9 9 0))。 この O—抗原に対して 特異的に結合する抗原認識部位である V L鎖と V H鎖を特定のリンカ一でつな げた単鎖抗体を大腸菌で大量発現させた報告がある (An a n d, N. N., e t a 1. , J . B i o l . C h em., 2 6 6, 2 1 8 74— 2 1 8 7 9 (1 9 9 1))。 単鎖抗体を活性な状態で合成するためには、 VL鎖と VH鎖に 1個ずつ 存在するジスルフィ ド結合の形成が不可欠である(Z d a n o V, A. L. Y. , e t a 1. , P r o c . Na t l . A c a d. S c i . USA. , 9 1 , 6 4 2 3 - 6 4 2 7 ( 1 9 94)) ため、 該単鎖抗体を本発明の方法の対象とした。 抗サルモネラ単鎖抗体をコードする DNAは、 野生型のサルモネラ O—抗原に 対する単鎖抗体をコードする DNAを含むプラスミ ド (An a n d, N. N. , e t a 1. , J - B i o l . C h em., 2 6 6, 2 1 8 74— 2 1 8 7 9 ( 1 9 9 1 )) を錶型として、 配列番号 2及び 3に記載の塩基配列からなるプライマ —を用いてポリメラーゼチェインリアクション (P CR) を行った。 取得された 0 八断片を 0£1^丁一 e a s yベクター (P r ome g a社製) に挿入した 後、 B g 1 I I及び N o t Iで制限酵素処理した。 得られた DN A断片を予め同 じ制限酵素で処理した p EUベクターに挿入した。 このプラスミ ドをテンプレー トとして配列番号 4及び 5に記載の塩基配列からなるプライマーを用いて PC Rを行い、 ストップコドンを導入した。 ここで作製したプラスミ ドを s c f V — p EUと称する。
次にリンカ一部分にピオチンリガーゼの認識配列をコードする DNA配列 (配 列番号 1) を挿入した DNAを作製した。 まず、 上記で作製したプラスミ ド s c f V — p EUを铸型として、 配列番号 6及び 7に記載の塩基配列からなるプライ マーにより LA T a q (TAKARA社製) キットを用いて P C Rを行った。 PCR反応液は、 5 μ 1 10 X L A b u f f e r, 5 μ 1 25 mM塩化マ グネシゥム、 8 μ 1 2. 5 mM dNTP、 各 Ι μ ΐ 20 μΜプライマー、 O. l n g鎵型プラスミ ド/ 50 1に調製し、 94°C1分 X 1サイクル、 94 °C 45秒ノ 55°C 1分/ 72 °C 1分 30秒 X 30サイクル、 72 °C 5分の反応を行 つた。 増幅された DNA断片は、 常法に従い、 KOD T4 p o l yme r a s e (NEB社製) により末端の平滑化を行ったのち、 P o l y n u c l e o t i d e k i n a s e (NE B社製) によるリン酸化後、 L i g a、t i o n H i g h (東洋紡社製) により S e l f L i g a t i o nを行い、 環状のプラスミ ド (図 1 :以下、 これを 「s c F v— b i o t i n— p EU」 と称することがあ る) を作製した。 (2) 弱還元型無細胞タンパク質合成用細胞抽出液の調製
北海道産チホクコムギ種子 (未消毒) を 1分間に 100 gの割合でミル (F r i t s c h社製: R o t o r S p e e d m i l l p u l v e r i s e t t e 14型) に添加し、 回転数 8, 000 r p mで種子を温和に粉砕した。 篩いで 発芽能を有する胚芽を含む画分 (メッシュサイズ 0. 7〜1. 00mm) を回収 した後、 四塩化炭素とシクロへキサンの混合液 (容量比 =四塩化炭素: シクロへ キサン =2. 4 : 1) を用いた浮選によって、 発芽能を有する胚芽を含む浮上画 分を回収し、 室温乾燥によって有機溶媒を除去した後、 室温送風によって混在す る種皮等の不純物を除去して粗胚芽画分を得た。
次に、 ベルト式色彩選別機 B LM- 300K (製造元:株式会社安西製作所、 発売元:株式会社安西総業) を用いて、 次の通り、 色彩の違いを利用して粗胚芽 画分から胚芽を選別した。 この色彩選別機は、 粗胚芽画分に光を照射する手段、 粗胚芽画分からの反射光及び 又は透過光を検出する手段、 検出値と基準値とを 比較する手段、 基準値より外れたもの又は基準値内のものを選別排除する手段を 有する装置である。
色彩選別機のベージュ色のベルト上に粗胚芽画分を 1 000乃至 5000粒 cm2となるように供給し、 ベルト上の粗胚芽画分に蛍光灯で光を照射して反 射光を検出した。ベルトの搬送速度は、 5 OmZ分とした。受光センサーとして、 モノクロの C CDラインセンサー (2048画素) を用いた。
まず、 胚芽より色の黒い成分 (種皮等) を排除するために、 胚芽の輝度と種皮 の輝度の間に基準値を設定し、 基準値から外れるものを吸引により取り除いた。 次いで、胚乳を選別するために、胚芽の輝度と胚乳の輝度の間に基準値を設定し、 基準値から外れるものを吸引により取り除いた。 吸引は、 搬送ベルト上方約 1 c m位置に設置した吸引ノズル 30個 (長さ 1 cm当たり吸引ノズル 1個並べたも の) を用いて行った。
この方法を繰り返すことにより胚芽の純度 (任意のサンプル 1 g当たりに含ま れる胚芽の重量割合) が 98%以上になるまで胚芽を選別した。
得られたコムギ胚芽画分を 4°Cの蒸留水に懸濁し、 超音波洗浄機を用いて洗浄 液が白濁しなくなるまで洗浄した。 次いで、 ノニデット (No n i d e t :ナカ ライ ·テク トニクス社製) P 40の 0. 5容量。 /0溶液に懸濁し、 超音波洗浄機を 用いて洗浄液が白濁しなくなるまで洗浄してコムギ胚芽を得、 以下の操作を 4 °C で行った。
洗浄した胚芽湿重量に対して 2倍容量の抽出溶媒 (8 OmM HEPE S— K OH (p H 7. 8)、 20 OmM酢酸カリウム、 1 0 mM酢酸マグネシウム、 8 mMジチオスレィ トール、 (各 0. 6 mMの 20種類の L型アミノ酸を添加して おいてもよい)) を加え、 ヮ一リングブレンダーを用い、 5, 0 00〜 20, 0 00 r pmで 3 0秒間ずつ 3回の胚芽の限定破砕を行った。 このホモジネートか ら、 高速遠心機を用いた 3 0, 00 0 X g、 3 0分間の遠心により得られる遠心 上清を再度同様な条件で遠心し、 上清を取得した。 本試料は、 一 8 0°C以下の長 期保存で活性の低下は見られなかった。 取得した上清をポアサイズが 0.
のフィルター (ニューステラディスク 2 5 :倉敷紡績社製) を通し、 ろ過滅菌と 混入微細塵芥の除去を行った。
次に、 このろ液をあらかじめ溶液 (4 0mM HE P E S— KOH ( p H 7. 8)、 l O OmM酢酸カリウム、 5mM酢酸マグネシウム、 各 0. 3 mMの 20 種類 L型アミノ酸混液 (タンパク質の合成目的に応じて、 アミノ酸を添加しなく てもよいし、 標識アミノ酸であってもよレ、)) で平衡化しておいたセフアデック ス G— 2 5カラムでゲルろ過を行った。得られたろ液を、再度 3 0, 0 00 X g、 3 0分間の遠心し、 回収した上清の濃度を、 A 2 6 0 nmが 90〜1 50 (A 2 6 0ノ A 2 80 = 1. 4〜1. 6) に調整した後、 下記の透析処理やタンパク質 合成反応に用いるまで、 _ 80°C以下で保存した。
(3) 弱還元型翻訳反応液を用いたタンパク質合成 (翻訳時にピオチンおよびビ ォチンリガーゼを添加した場合)
上記 (1) で取得された翻訳铸型 DNAについて、 S P 6 RNA p o l y m e r a s e (TO Y〇 BO社製) を用いて転写を行った。 反応液としては、 8 OmM HE P E S -KOH (p H 7. 6)、 1 6 mM酢酸マグネシウム、 2 m Mスペルミジン、 l OmM DTT、 NTP s各 2. 5 mM、 0. 8Ό/μ 1 RN a s e i n h i b i t o r、 50 μ g /m 1プラスミ ド、 及び 1. 2 U / μ 1 S P 6 RNA p o 1 yMe r a s e/d d w 40 0 μ 1を用レヽ た。 3 7°Cで 2時間インキュベートした後、 フエノールノクロロフオルム抽出、 N I CK c o l umn (Ame r s h a m P h a r ma c i a社製) による 精製を行い、 エタノール沈殿後、 沈殿を精製水 3 5 1に溶解した。 取得された mRN Aを用いて、 翻訳反応を行った。 翻訳反応液は、 1. 2mM ATP、 0. 25 mM GTP、 1 5 mMクレアチンリン酸、 0. 4mMスペル ミジン、 29 mM HE P E S -KOH (p H 7. 6)、 95 mM酢酸力リウム、 2. 7 mM齚酸マグネシウム、 0. 23mM L型アミノ酸、 0. 58υΖμ 1 RNa s e i n h i b i t o r (P r ome g a社製)、 4 n C i / μ 1 1 4C— L e u、 7. 5 μ g mRNA、 0. 5 M PD I、 1 9. 5 μΜピオ チン (ナカライ)、 1 9. 5 μ g/ μ 1 ビォチンライゲース (a V i d i t y社 製)、 および 1 2 n 1 コムギ胚芽抽出液で、 反応は 26 °Cで 3時間バッチ法によ り行った。 コントロールとして、 ビォチンを添加しない翻訳反応も行った。
翻訳反応 3時間後の反応液を 1 5, 000 r p m、 10分間の遠心分離によつ て可溶化成分を分離し、 残存する未反応のピオチンを 5 OmM T r i s (p H 8. 0) で平衡化した G_25スピンカラムにより除去した。 スピンカラムの溶 出液、 20 μ 1を同量の 5 OmM T r i s (p H 8. 0) 緩衝液で希釈後、 ス トレプトァビジンマグネットビーズ (P r o m e g a社製) 5 μ 1を添加し、 室 温で穏やかに混合した。 磁場によりマグネッ トビーズを回収した後、 上清画分を 取得し、 SDS— PAGEにより分離した後、 オートラジオグラフィにより抗サ ルモネラ単鎖抗体の量を測定した。 この結果を図 2の c o - t r a n s 1. b i o t i n y 1 a t i o nに示す。 図からも明らかなように、 ピオチン及びビォチ ンリガーゼの存在下で翻訳を行ったもの (図中: + b i ο· t i n) は、 ス トレプ トァビジンとの結合によってマグネットビーズについて回収されたものが多く、 逆にピオチンを添加しないで行ったもの (一 b i o t i n) は、 マグネットビー ズに結合した抗体がほとんどないことが示された。 このことから、 上記した方法 により抗サルモネラ単鎖抗体にピオチンが結合していることが明らかとなった。 (4) 弱還元型翻訳反応液を用いたタンパク質合成 (翻訳反応後にビォチンおよ びピオチンリガーゼを添加した場合)
上記(1)〜(3) に記載した抗サルモネラ単鎖抗体の製造方法と同様にして、 ピオチン及びピオチンリガーゼを翻訳反応開始から 3時間後に添加した結果を 図 2の p o s t— t r a n s l . b i o t i n y l a t i o nに示す。 図力 ら明 らかなように、 ピオチンを添加したもの (+ ) もしないもの (一) も、 マグネッ トビ一ズについて除去されたビォチン化抗体量はほとんど無いことがわかつた。 このことから、 ピオチンリガーゼおよびビォチンの添加は、 翻訳反応中に行うこ とが好ましいことがわかった。 実施例 2 ピオチン化単鎖抗体の固相化及び抗原抗体反応の解析
(1) アルデヒ ド化サルモネラ O—抗原の調製
リポポリサッカライ ド ( S I GM A社製) 20mg (2. 8 μ m o 1 ) を 0.
25 M水酸化ナトリゥム水溶液 20 μ 1に溶角?し、 56 °Cにて 1時間攪拌した。 蒸留水に対して透析後、 メタ過葉酸ナトリウム 2◦ Omg (0. 8mmo 1 ) を 添加し、 遮光下にて 5分間攪拌した。 エチレングリコール 1 m 1をさらに添加し て 1時間攪拌した後、 これを蒸留水に対して透析を行い、 凍結乾燥によりアルデ ヒ ド型サルモネラ糖鎖の粉末を得た。 これを 0. 2m 1の 2 OmMホウ酸ナトリ ゥム緩衝液 pH 9. 0に溶解した (l OmgZm l ) に溶解した。 アミノ化マグ ネッ トビーズ (NH 2— M a g : P o l y s c i e n c e社製) 0. 1 m 1を 0. 4m lの同緩衝液により 3回洗浄、 平衡化した後、 上記アルデヒ ド型サルモ ネラ糖鎖の溶液に添加し、 6時間室温にて反応を行った。 マグネットビーズを同 緩衝液 0. 4 m 1で 3回洗浄した。 糖鎖のマグネットビーズ上への固定化率は、 上清に残存した糖鎖をフヱノール /硫酸法で定量することにより求めた。 ここで、 該糖鎖のマグネットビーズへの結合率は 40% (0. 1 3 mo 1サルモネラ糖 鎖 Z 1 00 μ 1マグネットビーズ) であった。 (2) ピオチン化抗サルモネラ単鎖抗体とサルモネラ糖鎖との結合
実施例 1に記載の方法によりピオチン化単鎖抗体を合成した後 (t o t a l
38 1 )、 1 OmM PB ST ( p H 8. 0)、 0. 6 mM Ca C l 2で平 衡化した G— 25 s p i n c o 1 u m nにより過剰のピオチンをゲルろ過 した。 そのタンパク質溶液 40 μ 1を予め 0. 6mM C a C l 2を含むコムギ 胚芽抽出液 25 μ 1で洗浄しておいた 1 0 μ 1の上記 ( 1 ) で作製した固相化サ ルモネラ抗原 (S a l -Ma g) と共に 96 w e 1 1マイクロプレート上に添加 した。 1 5分間穏やかに混合した後、 40 μ 1の 0. 1 5M Na C l Zl Om M PB ST (pH8. 0) で 4回洗浄し、 最後に同量の 0. 1M g 1 y c i n e -HC 1 (p H2. 4 ) で 4回溶出を行った。 初めの洗浄により抗原と結合 しなかった単鎖抗体が溶出し、 後の溶出により抗原と結合した単鎖抗体が溶出さ れる。 各フラクション (5 μ 1 ) 中のタンパク質量は、 14 C カウントにより 求めた。 この結果を図 3示す。 ここには、 ピオチン化単鎖抗体が抗原特異性を保 持していることを確認する目的で、 変異体 G 1 02 Dを同様にピオチン化した場 合の結合結果も示した。 図から明らかなように、 野生型 (Wi l d t y p e) の場合、 p H酸性溶液で溶出される活性画分 (n o. 6) は、 全抗体量の 5割近 く存在するのに対し、 変異型 G 102Dの場合、 活性画分は全く存在せず、 ほと んどが n o. 1の素通り画分に出ている。 この結果は、 ピオチン化単鎖抗体が、 本来の抗原結合活性を保持していることを示すものであり、 c o— t r a n s 1 a t i o n a 1なピオチン化は、 抗原結合活性を全く損なうことなく進行するこ とが支持された。 (3) 生体分子間相互作用解析装置 ( I a s y s) による解離平衡定数の測定 まず、 ストレプトアビジン (0. l mgZm l :ナカライ社製) をピオチンキ ュベッ ト (A f f i n i t y S e n s o r s社製) に固定化した (固定化量: 674 a r c s e c.、 27. 2 n g、 0. 97 pMo l )。 次に、 実施例 1で 調製したピオチン化単鎖抗体を、 上記 (2) の方法により固相化サルモネラ糖鎖 抗原 (S a 1—Ma g) を用いて精製した。 14 C d pm値から換算して 8. 4 p m o 1 /50 μ 1の精製ピオチン化単鎖抗体が得られた。 この 50 1分を、 上記キュベッ トに添加し、 ストレプトアビジン上に固定化した (固定化量: 43 3. 6 a r c s e c . , 1 1. 5 n g , 0. 4 p m o l )。 ここへ、 様々な 濃度のサルモネラ糖鎖 (2. 4、 4. 8、 9. 7、 1 2. 9 ,、 1 9. 4 μΜ) を添加することにより、会合および解離曲線を測定した。 この結果を図 4に示し、 さらに該曲線から求めた解離平衡定数を表 1に示す。 また、 表 1には、 同様の方 法で大腸菌生細胞を使用して合成した単鎖抗体による値 (Ma c K e n Z i e , C. R. e t a 1 . , J . B i o l . C h e m. , 2 7 1 , 1 5 2 7— 1 5 3 3 ( 1 9 9 6)) も比較のため記載した。 図 4の r e s p o n s e曲線から明らか なように、 ピオチン化単鎖抗体は、 ストレプトアビジン上へ固定化でき、 なおか つ抗原を結合しうる機能を保持していることが示された。 表 1に示すように、 こ の曲線をもとに解離平衡定数 K dを算出した結果、 1 X 1 0— 7〜1 0— 8M のォ ーダ一であることが判明した。 この結果から、 実施例 1で調製し、 ピオチンとス トレプトアビジンの結合により固相化した単鎖抗体は、 完全抗サルモネラ抗体 I g Gと同等の K d値を有することが明らかとなった。
Figure imgf000037_0001
抗体 (M) (Sリ (M 'S 1) s 無細胞系 5.1 x10— / 0.8X 10—2 4.4x104 in vivo系 6.5χ1(Γ6 3.1 xlO-1 .8x104
IgG 1.4X10—7 1.2x10一2 8.7x10 4
比較例 1 ピオチンの結合位置による固相化効率の検討
単鎖抗体への化学結合によるピオチンの付加
本方法は、 続生化学実験講座、 免疫生化学研究法 (日本生化学会、 東京化学同 人 (1 986)) の抗体標識法に記載の方法を用いた。
36 差換え用紙(¾1 ) 実施例 1に記載の方法で、 翻訳反応時にピオチンリガーゼ及びピオチンを添加 しないで合成した反応液を、 1 5, 000 r pm、 10分間の遠心を行い、 上清 を取得した。 上清の可溶画分 25 1を同量の 1 Μ炭酸水素ナトリゥム溶液で希 釈した後、 G— 25セフアデックスカラムにより緩衝液を交換し、 1 μ 1の ΝΗ S— b i o t i n (N— h y d r o x y s u c c i m i d e— b i o t i n、 5 Omg/m 1 DM SO) を添加した。 これを 4 °Cでー晚反応させた後、 以下に 示すように抗原との結合性を解析した。
抗原との結合活性の解析
上記 (1) で調製した反応液 30 μ 1を 1 OmM PB ST (pH8. 0)、 0. 6 mM C a C 1 2で平後 ϊ化した G_ 25 s p i n c o l umnにより 過剰のピオチンをゲルろ過した。 そのタンパク質溶液 40 1を予め 0. 6mM C a C 12を含むコムギ胚芽抽出液 25 μ 1で洗浄しておいた 1 0 μ 1の上記 実施例 2 (1) で作製した固相化サルモネラ糖鎖抗原 (S a 1— Ma g) と共に 96 we 1 1マイクロプレート上に添加した。 1 5分間穏やかに混合した後、 4 Ο μ ΐの 0. 1 5M Na C l /10 mM PB ST (p H 8. 0) で 4回洗浄 し、 最後に同量の 0. 1M g l y c i n e _HC 1 (p H 2. 4) で 4回溶出 を行った。 この結果を図 5に示す。 活性の保持した抗体であれば、 後半の酸性緩 衝液により溶出されるはずである力 図から明らかなように、 フラクション番号 1 0〜1 3にはタンパク質の存在はみられず、 1番目の素通り画分に大半が存在 した。 このことは、 上記の化学的方法で製造したピオチン化単鎖抗体は抗原結合 活性を失っていることを示している。 実施例 3 ポリヒスチジンペプチドを挿入した単鎖抗体の製造および固相化 (1) ポリヒスチジンペプチドをリンカ一部分に含む単鎖抗体の製造
実施例 1 (1) に記載の s c f V— p EUを錶型として、 配列番号 8および 9 に記載の塩基配列からなるプライマーにより LA t a q (TAKARA社製) キットを用いて PCRを行った。 PCR反応液は、 5 1 10 X LA b u f f e r、 5 μ 1 25 mM塩化マグネシウム、 8 μ 1 2. 5 mM dNTP、 各 1 μ 1 20 μΜプライマー、 0. 1 η g铸型プラスミ ド/ ^ 50 μ 1に調製し、 94°C1分 X 1サイクル、 94°C45秒 55°C1分ノ 72 °C 1分 30秒 X 30 サイクル、 72°C5分の反応を行った。 増幅された DNA断片は、 常法に従い、 KOD T 4 p o l yme r a s e (N E B社製) により末端の平滑化を行つ たのち、 P o l y n u c l e o t i d e k i n a s e (NEB社製) によるリ ン酸化後、 L i g a t i o n h i g h (東洋紡社製) により S e 1 f L i g a t i o nを行い、 環状のプラスミ ド (図 1 :以下、 これを 「 s c F V- p H I S— p EU」 と称することがある) を作製した。
このプラスミ ドを鎵型として、 実施例 1 (3) に記載の方法により転写し、 m RNAを精製した後に、 翻訳反応液中の DTTを 200 μΜのメルカプトエタノ ールに換えて翻訳反応を行った。 翻訳反応 3時間後の反応液を 1 5, 000 r ρ m、 1 0分間の遠心分離によって可溶化成分を分離し、 過剰量のメルカプトエタ ノールを 5 OmMリン酸緩衝液 (pH 7. 0)、 500 mM Na C l、 5% G l y c e r o l (B i n d i n g b u f f e r) で平衡化した G— 25スピン カラムにより除去した。
スピンカラムの溶出液、 20 μ 1を同量の B i n d i n g b u f f e rで希 釈後、 予め b i n d i n g b u f f e 1 50 1で 6回洗浄したニッケル力 ラム (Me t a l a f f i n i t y r e s i n : TALON社製) 200 μ 1 ( 50% r e s i η )に 80 1添加し、室温で 1時間ィンキュベートした。 このカラムを 1 50 1の 5 OmMリン酸緩種 ί液 (ρ Η 7. 0)、 50 OmM
Na C l、 5% G l y c e r o l、 6 mM I mm ι d a z o 1 e (wa s h i n g b u f f e r) で 4回洗浄し (図中 w l〜w4)、 さらに 1 50 μ 1 の 50 mMリン酸緩衝液 ( p H 7. 0 )、 500 mM N a C 1、 1 50 mM I mm i d a z o 1 e (e l u t i o n b u f f e r) で 5回溶出 (図中 e 1〜 e 5) を行った。 各フラクションに含まれる単鎖抗体の量は、 14 C d pm値 により測定した。 この結果を図 6に示す。 図中、 Cは、 カラムにかける前のタン パク質含有液の全量中の 14 C d pm値を示す。 グラフの横軸は、 フラクショ ン番号を示し、 w 1〜w4は、 wa s h i n g b u f f e rにより溶出された フラクション中の、 また e l〜e 5は e l u t i o n b u f f e rにより溶出 されたフラクション中の 14 C d pm値を示す。 ETは e l〜e 5中の 14 C d pm値の合計を示す。
フラクション番号 e l〜e 5は、 ニッケルと特異的に結合するポリヒスチジン ペプチドを含む単鎖抗体の存在を示している。 図から明らかなように、 全合成量 の約 50 %近くの単鎖抗体は、 二ッケルカラムにより精製できることがわかった。 精製した単鎖抗体は、 抗原結合活性を保持していることも実施例 2に記載の方法 により確認できた。 この結果は、 ポリ ヒスチジンペプチドをリンカ一部分に組み 込んだ単鎖抗体は、 ニッケル固相上に活性を保持した状態で固定化しうることを
'る。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 単鎖抗体又は標識化単鎖抗体であって、 抗原との特異的結 合活性を保持したものが提供される。 該単鎖抗体によれば、 標識化物質を介して 固相に結合させることも可能であり、 抗体チップ等を作製することができる。 こ のような単鎖抗体は、 分子内のジスルフィ ド結合が保持されるような無細胞タン パク質翻訳系により合成することにより、 大腸菌のような生細胞内で合成された ものに比べて抗原との特異的結合性が高いものが提供される。

Claims

請求の範囲
1 . 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有することを特徴 とする単鎖抗体又は該単鎖抗体のリンカ一部分に標識化物質を担持することを 特徴とする標識化単鎖抗体。
2 . 抗体の重鎖および軽鎖がリンカーを介して架橋する構造を有する単鎖抗体又 は該単鎖抗体のリンカ一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該抗体の重鎖および軽鎖が可変領域であることを特徴とする単鎖抗体又は標識 化単鎖抗体。
3 . 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ
—部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質が、 特定 の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリべプチドに結合し得る物質である ことを特徴とする標識化単鎖抗体。
4 . 抗体の可変領域である重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有 し、 かつリンカ一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識 化物質が、 特定の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリべプチドに結合し得 る物質であることを特徴とする標識化単鎖抗体。
5 . 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質が、 抗体 のリンカ一部分の一部として組み込まれていることを特徴とする標識化単鎖抗 体。
6 . 抗体の可変領域である重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有 し、 かつリンカ一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識 化物質が、 抗体のリンカ一部分の一部として組み込まれていることを特徴とする 標識化単鎖抗体。
7 . 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に、 特定の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリペプチドに結合し得 る標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質がピオチンであ り、 該酵素がピオチンリガーゼであることを特徴とする標識化単鎖抗体。
8. 抗体の可変領域である重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有 し、 かつリンカ一部分に、 特定の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリぺプ チドに結合し得る標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質 がピオチンであり、 該酵素がピオチンリガーゼであることを特徴とする標識化単 鎖抗体。
9. 天然型の抗体と同等の Kd値を有し、 コムギ胚芽を使った無細胞タンパク質 翻訳系によって製造された請求項 1〜8の何れか一に記載の単鎖抗体又は標識 化単鎖抗体。
10. 特定抗原への結合性を有する抗体の重鎖および軽鎖をコードする DNAが、 リンカ一をコードする DN Aを介して連結されていることを特徴とする DNA。
1 1. 特定抗原への結合性を有する抗体の重鎖および軽鎖をコードする DNAが、 リンカ一をコ一ドする DN Aを介して連結されている DN Aにおいて、 該抗体の 重鎖および軽鎖が可変領域であることを特徴とする DNA。
12. 特定抗原への結合性を有する抗体の重鎖および軽鎖をコードする DNAが、 リンカーをコードする DNAを介して連結されている DNAにおいて、 該リンカ 一をコードする DNAが、 翻訳後に特定の酵素の存在下で標識化物質を結合し得 る塩基配列を含むことを特徴とする DNA。
1 3. 特定抗原への結合性を有する抗体の可変領域である重鎖および軽鎖をコー ドする DNAが、 リンカーをコードする DNAを介して連結されている DNAに おいて、 該リンカ一をコードする DNAが、 翻訳後に特定の酵素の存在下で標識 化物質を結合し得る塩基配列を含むことを特徴とする DNA。
14. 特定抗原への結合性を有する抗体の重鎖および軽鎖をコードする DNAが、 翻訳後に特定の酵素の存在下で標識化物質を結合し得る塩基配列を含むリンカ —をコ一ドする DNAを介して連結されている DNAにおいて、 該標識物質を結 合し得る塩基配列が、 ピオチンリガーゼにより認識されるアミノ酸配列をコード することを特徴とする DNA。
1 5. 特定抗原への結合性を有する抗体の可変領域である重鎖および軽鎖をコー ドする D N Aが、 翻訳後に特定の酵素の存在下で標識化物質を結合し得る塩基配 列を含むリンカーをコードする DNAを介して連結されている DNAにおいて、
5 該標識物質を結合し得る塩基配列が、 ピオチンリガーゼにより認識されるァミノ 酸配列をコードすることを特徴とする DNA。
16. 請求項 10〜1 5のいずれかに記載の DN Aを、 標識化物質および特定の 酵素の存在下でタンパク質合成系を用いて転写翻訳することを特徴とする標識 化単鎖抗体の製造方法。
10 1 7. 請求項 1 0又は 1 1に記載の DNAをタンパク質合成系を用いて転写翻訳 することを特徴とする単鎖抗体又は標識化単鎖抗体の製造方法。
1 8. タンパク質合成系が、 コムギ胚芽由来の無細胞タンパク質翻訳系であって、 .その翻訳反応液中の還元剤の濃度が、 製造する単鎖抗体のジスルフィ ド結合が保 持され、 かつ無細胞タンパク質合成が可能な濃度であることを特徴とする請求項
15 1 6または 1 7に記載の単鎖抗体又は標識化単鎖抗体の製造方法。
1 9. さらにジスルフィ ド結合交換反応を触媒する酵素の存在下で行うことを特 徴とする請求項 1 8に記載の単鎖抗体又は標識化単鎖抗体の製造方法。
20. コムギ胚芽由来の無細胞タンパク質翻訳系を使い請求項 1 9に記載の単鎖 抗体又は標識化単鎖抗体の製造方法によつて製造された天然型の抗体と同等の 0 Kd値を有する単鎖抗体又は標識化単鎖抗体。
21. 抗体の標識化物質と特異的に結合する物質を表面に有する複数の領域に区 画された基盤に、 以下のいずれか 1に記載の抗体を接触させることを特徴とする 固相化単鎖抗体の製造方法。
1) 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 5 一部分に標識化物質を担持することを特徴とする標識化単鎖抗体。
2) 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該抗体の重鎖および軽 鎖が可変領域であることを特徴とする標識化単鎖抗体。'
3 ) 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質が、 特定 の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリべプチドに結合し得る物質である ことを特徴とする標識化単鎖抗体。
4 ) 抗体の可変領域である重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有 し、 かつリンカ一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識 化物質が、 特定の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリべプチドに結合し得 る物質であることを特徴とする標識化単鎖抗体。
5 ) 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質が、 抗体 のリンカ一部分の一部として組み込まれていることを特徴とする標識化単鎖抗 体。
6 ) 抗体の可変領域である重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有 し、 かつリンカ一部分に標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識 化物質が、 抗体のリンカ一部分の一部として組み込まれていることを特徴とする 標識化単鎖抗体。
7 ) 抗体の重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有し、 かつリンカ 一部分に、 特定の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリべプチドに結合し得 る標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質がピオチンであ り、 該酵素がピオチンリガーゼであることを特徴とする標識化単鎖抗体。
8 ) 抗体の可変領域である重鎖および軽鎖がリンカ一を介して架橋する構造を有 し、 かつリンカ一部分に、 特定の酵素の存在下で抗体のリンカ一部分のポリぺプ チドに結合し得る標識化物質を担持する標識化単鎖抗体において、 該標識化物質 がピオチンであり、 該酵素がピオチンリガーゼであることを特徴とする標識化単 鎖抗体。
2 2 . 請求項 2 1に記載の固相化単鎖抗体の製造方法において、 複数の領域に区 画された基盤上で 2種以上の異なる固相化単鎖抗体を固相化することを特徴と する固相化単鎖抗体の製造方法。
2 3 . 標識化物質がピオチンであり、 該標識化物質と特異的に結合する物質がス トレプトアビジンであることを特徴とする請求項 2 1または 2 2に記載の製造 方法。
2 4 . 請求項 2 1〜2 3に記載の製造方法により調製される固相化単鎖抗体。
2 5 . 請求項 2 4に記載の固相化単鎖抗体に被検物質を接触させ、 該固相化単鎖 抗体との結合性を解析することを特徴とする抗原抗体反応の解析方法。
2 6 . 以下の工程を含む、 抗原抗体反応の解析方法。
( 1 ) 以下の要素の①又は②を含む、 単鎖抗体のジスルフイ ド結合が保持される 条件下において、 標識化単鎖抗体を調製する工程、
① 特定抗原への結合性を有する抗体の重鎖および軽鎖をコードする D N Aが、 翻訳後に特定の酵素の存在下で標識化物質を結合し得る塩基配列を含むリ ンカーをコードする D N Aを介して連結されている D N Aを、特定の酵素の 存在下でコムギ無細胞系タンパク質合成系を用いて転写翻訳し、標識化単鎖 抗体を製造する工程、
② 特定抗原への結合性を有する抗体の可変領域である重鎖および軽鎖をコー ドする D N Aが、翻訳後に特定の酵素の存在下で標識化物質を結合し得る塩 基配列を含むリンカーをコードする D N Aを介して連結されている D N A を、特定の酵素の存在下でコムギ無細胞系タンパク質合成系を用いて転写翻 訳し、 標識化単鎖抗体を製造する工程、
( 2 ) 以下の要素を含む、 標識化単鎖抗体の標識化物質が固相化物質である場合 における標識化単鎖抗体の標識化物質と特異的に結合する物質 (アダプター物質 ) を調製する工程、
①複数の領域に区画された基盤に標識化単鎖抗体の標識化物質と特異的に結合 する物質 (アダプター物質) を固定する工程、
②前記①の基盤に固定されなかった標識化単鎖抗体の標識化物質と特異的に結 合する物質 (アダプター物質) を除去する工程、
③前記①又は②の工程の前後において、 適宜基盤における非特異的吸着を除去 する工程、
(3) 以下の要素を含む、 標識化単鎖抗体の標識化物質が固相化物質である場合 における固相化標識化単鎖抗体を調製する工程、
①前記 (1) ①又は②で調製した標識化単鎖抗体の標識化物質を (2) の標識 化単鎖抗体の標識化物質と特異的に結合する物質 (アダプター物質) を表面に 有する複数の領域に区画された基盤に必要量を添加、 接触させる工程、
②前記①の基盤上の標識化単鎖抗体と特異的に結合する物質 (アダプタ一物質 ) に固定されなかった標識化単鎖抗体を除去する工程、
③前期②の工程に続いて、 適宜基盤における非特異的吸着を除去する工程、
(4) 以下の要素を含む、 標識化物質がシグナル物質である場合における標識化 単鎖抗体を調製する工程、
①適宜、 複数の領域に区画された基盤における非特異的吸着を除去する工程、 ②前記 (1) ①又は②で調製した標識化単鎖抗体の標識化物質を基盤に必要量 を添加させる工程、
(5) 被検物質を前記 (3) 又は (4) に記載の各基盤に必要量添加し、 標識化 単鎖抗体と該被検物質との結合性を解析する工程、
(6) (5) の結合性結果をもとに、 標識化単鎖抗体と被検物質との相互作用を 質的又は量的に判定する工程。
27. ¾求項 25又は 26に記載の解析方法に使用される試薬を含む抗原抗体反 応の測定用試薬キット。
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