WO2004007548A1 - Utilisation de proteases aspartiques dans le domaine cosmetique et therapeutique - Google Patents

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WO2004007548A1
WO2004007548A1 PCT/FR2003/002151 FR0302151W WO2004007548A1 WO 2004007548 A1 WO2004007548 A1 WO 2004007548A1 FR 0302151 W FR0302151 W FR 0302151W WO 2004007548 A1 WO2004007548 A1 WO 2004007548A1
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seq
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saspase
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Dominique Bernard
Bruno Mehul
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L'oreal
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    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6478—Aspartic endopeptidases (3.4.23)

Definitions

  • the main object of the present invention is the use, in the cosmetic and therapeutic fields, of a new protease with aspartic acid called SASPase, truncated or derived forms of said protein or of a mixture of polypeptides resulting from its proteolysis in particular for treating disorders linked to a dysfunction of proliferation and / or cell differentiation.
  • SASPase a new protease with aspartic acid
  • the subject of the invention is also sequences of deoxyribonucleic acid encoding said SASPase aspartic acid protease and its so-called activated forms, the corresponding polypeptide sequences and the uses of said deoxyribonucleic sequences.
  • Proteases are hydrolytic enzymes capable of cutting peptide bonds. A number of them are now known to play an essential role in terms of the balance and physiology of the epidemic.
  • the epidemic is conventionally divided into a basal layer of keratinocytes constituting the germinal layer of the epidemic, a so-called spiny layer consisting of several layers of polyhedral cells arranged on the germinal layers, one to three so-called granular layers consisting of flattened cells containing distinct cytoplasmic inclusions, keratohyaline grains and finally, a set of upper layers called corneal layers (or stratum corneum), consisting of keratinocytes at the terminal stage of their differentiation called corneocytes.
  • corneal layers or stratum corneum
  • Corneocytes are anucleated cells mainly made up of a fibrous material containing cytokeratins, surrounded by a comedic envelope. There is constantly production of new keratinocytes to compensate for the continuous loss of epidermal cells in the stratum corneum according to a mechanism called desquamation. An imbalance between the production of cells at the level of the basal layer and the scaling rate can in particular lead to the formation of scales on the surface of the skin.
  • polypeptides involved in inter-corneocyte cohesion is one of the ways which can allow the development of products intended to combat the effects of an excess or a defect in polypeptide (s) of this type, in particular to the surface of the skin.
  • One of the objects of the invention is precisely to propose the use for cosmetic and / or therapeutic purposes of a polypeptide involved in the regulation of the phenomenon of epidermal differentiation / proliferation.
  • the inventors have demonstrated in human keratinocytes, isolated and purified a polypeptide having in its peptide sequence- (SEQ ID NO 5), the sequence FLNDSGAQNSNV (SEQ ID ⁇ O: 1) corresponding to a signature PROSITE PS00141 of the sites active proteases of the family of proteases called aspartic acid.
  • SASPase protein is further characterized by the presence in its peptide sequence of the following sequences: - AQFLNA ⁇ ASAEEAIIGTDNLQ (SEQ ID ⁇ O: 2) and
  • the inventors have demonstrated that the protein represented by the sequence SEQ ID ⁇ O: 5, also called SASPase protein, possessed significant proteolytic activity and notably observed this activity with respect to casein and insulin as shown in the examples below.
  • SASPase activated a form truncated protein corresponding to the sequence SEQ ID NO: 6 capable in turn of dimerizing.
  • One aspect of the invention therefore relates to an isolated and purified polypeptide belonging to the family of aspartic acid proteases, characterized in that it has a peptide sequence represented by the sequence SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27.
  • SEQ ID NO: 6 corresponds to an activated form of SEQ ID NO: 5.
  • SEQ ID NO: 16 corresponds to the sequence SEQ ID NO: 6 deleted from its first two amino acids. Another activated form of the sequence is SEQ ID NO: 25.
  • SEQ ID NO: 5 It is obtained from a truncated form of SASPase (SEQ ID NO: 36) deleted from the site coding for the sequence FANS (SEQ ID NO: 29). It is more particularly generated at pH 5.00 in acetate buffer.
  • sequence SEQ ID NO: 27 corresponds to the sequence SEQ ID NO: 25 deleted from part of its C-terminal fragment.
  • the invention extends to all the homologous forms of the various polypeptides or peptide sequences mentioned.
  • the expression “homolog of a polypeptide or of a peptide sequence” is understood to mean any polypeptide or any peptide sequence having a sequence homology of at least 85%, in particular of at least 90% and in particular of at least 95 % and having, where appropriate, the same type of biological activity as said polypeptide or said peptide sequence.
  • the invention extends in particular to homologous forms of the polypeptides mentioned above, that is to say showing the same biological activity and having at least 85%, in particular at least 90% and in particular at least 95% homology in sequence with the sequence SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or
  • the invention extends to proteins having at least 30% homology with the sequence of SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 provided that the homology with the sequence of the active site SEQ ID NO: 1 contained in the
  • SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27 or at least
  • the invention also extends to proteins having both the motif
  • modifications, also called mutations or variations according to the invention can be derived either from the deletion of one or more amino acids of the sequence SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO : 27, or the addition of one or more amino acids to the sequence SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27, or again the substitution of a or several amino acids with the sequence SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27.
  • the corresponding sequences are also referred to as variants in the context of the present invention.
  • sequence SEQ ID NO: 4 corresponding to the truncated SEQ ID NO: 5 of its N-terminal fragment A 1- 84.
  • sequence SEQ ID NO: 7 corresponding to the sequence of the N-terminal part of the SASPase protein (SEQ ID NO: 5).
  • the interaction of this fragment with a biological ligand could be an important step for the activation of the SASPase protein and in particular the generation of its activated form (SEQ ID NO: 6).
  • sequence SEQ ID NO: 8 corresponding to the sequence of the so-called transmembrane part of the SASPase protein (SEQ ID NO: 5).
  • sequence SEQ ID NO: 9 corresponding to the sequence of a peptide derived from the C-terminal part of the SASPase protein (SEQ ID NO: 5).
  • sequences SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO 30 correspond to two activation sites.
  • SASPase protein SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: 6 The fusion proteins of the SASPase protein (SEQ ID NO: 5), of its activated forms SEQ ID NO: 6, are also covered under the term variant.
  • SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 with another polypeptide, a hydrophilic or hydrophobic targeting agent or a bioconversion precursor capable of in particular to control the activation of said protein.
  • polypeptides can undergo post-translational modifications such as the formation of disulfide bonds, specific proteolytic cleavages, the addition of carbohydrates (glycosylation), phosphorylation in particular at the level of serines and / or threonines and / or tyrosines, and / or the association with lipids.
  • polypeptide of the invention may have undergone one or more post-translational modifications.
  • the polypeptides according to the invention can be N-glycosylated, phosphorylated, myristoylated, amidated and / or citrullinated.
  • the invention also relates to the claimed polypeptides having undergone or not post-translational modifications.
  • the invention also extends to multimeric forms and preferably to the dimeric form of the peptide sequence SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27.
  • the dimeric form of the peptide sequence SEQ ID NO: 6 is in particular characterized in example V below. It can in particular be obtained by molecular association of the monomeric form or by expression of its cDNA coding for the active dimer, incorporating as linking agent between the two monomeric entities, a motif composed of 2 to 6 amino acids.
  • the claimed polypeptides can be of natural or synthetic origin.
  • synthetic is meant here any polypeptide obtained chemically or by production in an organism after introduction into this organism of the elements necessary for this production.
  • They can come from any possible origin, namely either animal, in particular mammals and even more particularly human, or plant, or from microorganisms (for example viruses, phages, bacteria, yeasts among others) or also from fungi, or resulting from an overexpression in a eukaryotic system, for example a mammalian cell, without prejudging whether they are present naturally or not in said organism of origin.
  • microorganisms for example viruses, phages, bacteria, yeasts among others
  • fungi or resulting from an overexpression in a eukaryotic system, for example a mammalian cell, without prejudging whether they are present naturally or not in said organism of origin.
  • polypeptides in accordance with the invention are of natural origin, purified from mammalian tissues, more particularly from mammalian skin.
  • polypeptides are purified from human skin and even more particularly from human epidemic. It is known that in a polypeptide, one or more amino acid residues can be replaced by amino acid residues having a similar hydropathic index without changing the biological properties of the polypeptide.
  • the hydropathic index is an index assigned to amino acids according to their hydrophobicity and their charge (Kyte et al. (1982), J. Mol. Biol., 157: 105).
  • the subject of the invention is also a polypeptide as described above in which at least one amino acid residue has been replaced by an amino acid residue having a similar hydropathic index.
  • the theoretical isoelectric point of a polypeptide can be deduced from its chain of amino acids.
  • the polypeptides of the invention are theoretically acidic polypeptides.
  • polypeptides of sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 or SEQ ID NO: 16 have an isoelectric point between 3 and 9, more particularly between 4 and 6 and in particular approximately 5.8.
  • the term “apparent molecular mass” is understood to mean the molecular mass obtained for the polypeptide by comparison of the electrophoretic mobility thereof with those of standard proteins of known molecular weight on polyacrylamide / sodium dodecylsulfate gel, or also by comparison of the elution volume. of the polypeptide with that of standard proteins of molecular weights known in exclusion chromatography (according to the techniques described in “Protein Purification”, JC. Janson and L. Ryden, VCH Publisher Inc. NY, 1989). (The method used in the context of the invention is that based on electrophoretic mobility).
  • the invention therefore relates to a polypeptide of sequence SEQ ID NO: 6 having an apparent molecular mass of between 5 and 30 kilodaltons (kD), in particular between 9 and 15 kD, and more particularly between 11 and 14 kD.
  • this polypeptide of the invention has an apparent molecular mass of the order of 12kD.
  • the inventors have characterized the expression of the polypeptide whose sequence is represented by the sequence SEQ ID NO: 5 in a large number of human biological tissues such as the fetal liver, the placenta, the muscle, lung, small intestine and especially at the level of the brain and the heart and more particularly at the level of the epidermis where the expression is particularly high.
  • a second aspect of the invention relates to a cosmetic or pharmaceutical composition
  • a cosmetic or pharmaceutical composition comprising, in a physiologically acceptable medium, at least one purified natural or synthetic polypeptide whose sequence comprises at least one peptide sequence represented in whole or in part by at least one sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16 , SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27 and their counterparts.
  • the present invention relates to a cosmetic or pharmaceutical composition
  • a cosmetic or pharmaceutical composition comprising, in a physiologically acceptable medium, at least one purified natural or synthetic polypeptide whose peptide sequence is represented in whole or in part by the sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 or their counterparts, and in particular which is represented by the peptide sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27.
  • the present invention also relates to a cosmetic or pharmaceutical composition
  • a cosmetic or pharmaceutical composition comprising at least one purified natural or synthetic polypeptide whose peptide sequence is represented in whole or in part by at least one sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27 and their counterparts and in particular at least one polypeptide of sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 in multimeric and preferably dimeric form .
  • polypeptide is intended to cover, in the compositions claimed, natural or synthetic polypeptides, whether obtained by proteolysis or by synthesis, the various post-translational forms thereof and in particular those described above or any natural or synthetic polypeptide whose sequence is wholly or partially constituted by the above-mentioned sequences such as, for example, the variants described above.
  • the present invention also relates to a cosmetic or pharmaceutical composition in which said polypeptide is in the form of a polypeptide of sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 fused with another polypeptide, a hydrophilic or hydrophobic targeting agent or a bioconversion precursor.
  • the invention also relates to a cosmetic or pharmaceutical composition
  • a cosmetic or pharmaceutical composition comprising in a physiologically acceptable medium at least a mixture of polypeptides derived from the proteolysis of a polypeptide whose sequence is represented in whole or in part by the sequence SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 or their counterparts and more particularly, the sequence of which is represented by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27.
  • compositions of the invention are, of course, a function of the desired effect and can therefore vary to a large extent.
  • the composition may contain a polypeptide in accordance with the invention in an amount representing from 0.00001% to 50% of the total weight of the composition and preferably in an amount representing from 0.001% to 10% by weight total of the composition and even more preferably in an amount representing from 0.1% to 1% of the total weight of the composition.
  • polypeptides in accordance with the invention are involved in the regulation of these two phenomena, they advantageously constitute potential targets for treating any disorder resulting from a dysfunction of cell proliferation or differentiation, in particular epidermal cells. Consequently, in addition to the fact that the polypeptides according to the invention can be used directly as active material in a cosmetic or pharmaceutical composition, they can also themselves serve as a target in a cosmetic or pharmaceutical treatment or be used as a diagnostic tools.
  • the inventors have further characterized the presence of cleavage sites in the peptide sequence SEQ ID NO: 5, partly localized in its N-terminal part and also present in the active forms SEQ ID NO: 6, and SEQ ID NO: 16 and partly present in its C-terminal part and also present in the active forms SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27. More specifically, the cleavage sites deduced from the self-activation of SASPase itself are F / A, N / S, E / L, A / L, PJF, H / S, F / E, E / A. Obviously, these cleavage sites can be determining at the level of the activation of the protein, either to block it, or on the contrary to activate its hydrolysis.
  • the relevant sites more precisely located in the N-terminal region are F / A and N / S and appear in the FANS sequence known as SEQ ID NO: 29. They seem in particular involved in the generation of the activated form represented by SEQ TD NO: 25.
  • the second potential activation or inactivation region of the SASPase SEQ ID NO: 5 protein it more particularly corresponds to the DLELIE sequence called SEQ ID NO: 30 and in particular includes the E / L cut-off site.
  • Dabcyl / EDANS Another chemical couple such as Dabcyl / EDANS can be used to create another type of quenched substrate.
  • a specific SASPase inhibitor by replacing one of the amino acids of such a peptide, by modifying the peptide bond or by adding a chemical group so that the bond is made non-hydrolyzable by the enzyme but that the peptide still has an affinity for the active site.
  • an unnatural amino acid is added, the peptide bond is reduced or chemical groups of the aldehyde, chloromethyl-ketone or diazomethyl-ketone type are added.
  • the inventors have in particular shown that specific modifications made to the level of the peptide substrate represented by SEQ ID NO: 30 could have a significant effect in terms of their affinity for the enzyme.
  • the corresponding modified sequences prove to be capable of constituting potential inhibitors or activators of SASPase.
  • the present invention also relates to the use of a chemical or biological compound for the preparation of a composition intended to interact with a polypeptide whose peptide sequence comprises at least one sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 30 and their homologs and more particularly with a polypeptide of sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 27 or SEQ ID NO: 30 or to modulate its biological activity.
  • This biological compound can in particular be a protease having a specific site for recognition and / or fixation and cleavage within the amino acid sequence of said polypeptide and preferably of a polypeptide having as primary sequence the sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27.
  • retropepsin-type protease inhibitors have also been shown to have an effect on the activity of the SASPase protein.
  • retropepsin inhibitors in particular marketed by Bachem.
  • This inhibitor can also be selected to interfere with the dimerization of SASPase (SEQ ID NO: 5) or one of its activated forms represented by SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27, prior to its proteolytic activity.
  • This inhibitor can also be an endogenous inhibitor capable of specifically inhibiting SASPase or its self-activation.
  • this biological compound can be an activator. Mention may in particular be made of these of the RP3 retropepsin modulator characterized in Example VIII below. It can also be an antibody specific for said polypeptide.
  • the present invention extends to the use of a biological or chemical compound for the preparation of a composition intended to inhibit the dimerization of the polypeptide of sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27.
  • the present invention also relates to the use of a polypeptide whose sequence comprises at least and in particular is represented by a sequence chosen from SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 and
  • SEQ ID NO: 35 to prepare a composition intended to modulate the activity of SASPase.
  • compositions claimed and considered according to the invention can be compositions used in the cosmetic, dermatological, dermato-cosmetic and pharmacological fields.
  • a physiologically acceptable medium is according to the invention a cosmetically or pharmaceutically acceptable medium compatible with the skin, the mucous membranes, the nails and / or the hair.
  • compositions according to the invention can be applied to the nails, the hair and more particularly to the skin and the mucous membranes. They are particularly advantageous for acting on one or more epidermal mechanisms such as the degradation of protein (s), the activation of enzyme (s), and / or the regulation of the phenomenon of epidermal differentiation / proliferation.
  • epidermal mechanisms such as the degradation of protein (s), the activation of enzyme (s), and / or the regulation of the phenomenon of epidermal differentiation / proliferation.
  • compositions according to the invention are particularly useful for compensating for an imbalance in epidermal differentiation / proliferation. More particularly, they can be useful for regulating the phenomena of hydration, inflammation, melanogenesis, and / or scaling, the phenomenon of aging, defense mechanisms, for the regulation of differentiation / proliferation on certain cell types. and cutaneous: keratinocytes, melanocytes, Langerhans cells, sebocytes, adipocytes, as well as the regulation of secretion phenomena and invasion processes.
  • compositions claimed prove to be advantageous in the following fields: to treat dermatological conditions linked to a disorder of keratinization relating to differentiation and proliferation in particular to treat acne vulgaris, comedonian, polymorphic, rosacea, nodulocystic acne, conglobata, acne senile, secondary acne such as solar, medical or professional acne,
  • keratinization disorders in particular ichthyoses, ichthyosiform states, Darrier disease, palmoplantar deratoderma, leukoplakias and leukoplasiform states, lichen.
  • cutaneous or mucous (buccal), - to treat other dermatological conditions linked to a keratinization disorder with an inflammatory and / or immuno-allergic component and in particular all forms of psoriasis, whether cutaneous, mucous or nail, and even psoriatic arthritis, or even cutaneous atopy such as eczema, or urticaria or gingival enlargement; the compounds can also be used in certain inflammatory conditions which do not have a keratinization disorder,
  • compositions according to the invention are in particular useful for the treatment of acne-prone skin, for hair regrowth, for hair loss, to fight against the oily appearance of the skin or hair, in protection against the harmful aspects of the sun or in the treatment of physiologically dry skin, to prevent and / or to fight against photoinduced or chronological aging. They can also be useful for improving reconstructed skin.
  • the polypeptide and / or its derivatives and / or modulators of its activity or of its activation can also be used directly in the culture medium.
  • Another object of the invention is a cosmetic treatment process intended to combat skin disorders linked to a dysfunction of proliferation and / or cell differentiation such as in particular dry skin, hyperkeratosis, parakeratosis, sebogenesis disorders, neoplasias and / or signs of skin aging, characterized in that a cosmetic composition comprising at least one polypeptide whose peptide sequence comprises at least one sequence chosen from SEQ is applied to the skin, mucous membranes and / or keratin fibers ID NO: 1 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27 and in particular which is represented in whole or in part by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27, and more particularly which has the sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, S
  • the treatment method of the invention is a cosmetic method intended to improve the aesthetic appearance of the individual undergoing proliferation and / or epidermal differentiation disorders.
  • the invention also relates to the use of a polypeptide whose peptide sequence comprises at least one sequence chosen from SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27 and in particular which is represented in whole or in part by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27, and more particularly which has the sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 or a mixture derived from proteolysis of one of these polypeptides for the preparation of a pharmaceutical composition intended for the treatment of dermatological conditions and in particular those mentioned above.
  • the invention relates to the use of a polypeptide or a mixture as described above for the preparation of a pharmaceutical composition intended for treating ichthyosis, psoriasis or any pathology involving hyperkeratosis, parakeratosis or having an inflammatory component. It can also be pain-relieving compositions, compositions for treating certain skin diseases such as eczema, rosacea, psoriasis, lichens, severe pruritus.
  • polypeptides of sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 have significant structural homologies with the retroviral proteins, as it is shown in the examples and in FIG. 4, and in particular with those of the human immunodeficiency virus, they are also capable of behaving as agents capable of modulating viral infection or of being modulated by certain viral antiproteases.
  • the subject of the present invention is also the use of a polypeptide whose peptide sequence comprises at least one sequence chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27, and their counterparts, in particular is represented in whole or in part by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27 and more particularly which has the sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27 for the preparation of an antiviral composition.
  • compositions can in particular be useful for treating epidermal pathologies associated with a vims of the papillomavirus, HERPES or HIV type.
  • compositions may be advantageous for treating the side effects linked to an inhibition of endogenous SASPase by the drugs directed against these vims or other pathological vims. More particularly, this specific application of the polypeptides according to the invention takes advantage of the homology of structure observed between SASPase and viral retropepsins, as illustrated by the examples below.
  • the treatment generally involves an application to the skin of the subject to be treated of the composition as described above.
  • a subject of the present invention is also the use of a polypeptide whose peptide sequence is chosen from the sequences SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 as a tool in a diagnostic or screening method or for the preparation of '' a diagnostic tool.
  • the invention relates to the use of a polypeptide whose peptide sequence is chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27 and their counterparts, more particularly of a polypeptide which has the sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27 or its proteolysis fragments and any synthetic peptide deduced from its sequence, to prepare or purify, possibly from the epidermis, any molecule capable of modulating its interaction with possible ligands.
  • the invention relates to the use of a polypeptide whose peptide sequence is chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27 and their counterparts, and more particularly of a polypeptide which has the sequence SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27, its proteolysis fragments or any synthetic peptide deduced from its sequence, to select new ones antiviral molecules with fewer side effects.
  • a subject of the invention is also the use of a polypeptide whose peptide sequence is chosen from SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 , SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 27 and their counterparts, and more particularly of a polypeptide which has the sequence SEQ ID NO: 5 , SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27, of its proteolysis fragments, or of any synthetic peptide deduced from its sequence, to prepare antiserams and / or specific monoclonal antibodies, aiming in particular to purify said polypeptide and its fragments or to modulate its activity.
  • the invention also relates to any use of said sequence to produce antibodies or fragments of recombinant antibodies, whatever the biological system used to produce the latter.
  • the subject of the invention is also a poly- or mono-clonal antibody characterized in that it specifically recognizes a polypeptide whose peptide sequence is represented in whole or in part by SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27, and more particularly which consists of the sequence SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27.
  • the invention also relates to the use of this antibody for the preparation of a composition intended for the diagnosis of a deficiency or an overexpression of the SASPase protein (SEQ ID NO: 5).
  • the antibody can be an antibody prepared by immunization of any animal species which can be used for this purpose, particularly the rabbit.
  • the antibody can be prepared by immunization using a polypeptide of the invention whether it is of natural or synthetic or recombinant origin, preferably purified.
  • polypeptide of the invention can be derived from different deoxyribonucleic acid sequences, natural or synthetic.
  • synthetic deoxyribonucleic acid sequence is meant here any sequence obtained chemically or by genetic manipulation.
  • Said deoxyribonucleic acid sequences can come from all possible origins, namely animal, in particular mammals and even more particularly human, or plant, or from microorganisms (viras, phages, bacteria among others) or also from fungi, without prejudging the fact that they are present natural way or not in said organism of origin.
  • the invention relates to isolated and purified deoxyribonucleic acid fragments encoding the claimed polypeptides.
  • the subject of the invention is a fragment of isolated and purified deoxyribonucleic acid whose nucleotide sequence comprises at least the nucleotide sequence coding SEQ ID NO: 24 and in particular is represented by the nucleotide coding SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 or
  • nucleic acid sequences according to the invention can in particular be used to prepare corresponding sense or antisense ribonucleic acid sequences.
  • the subject of the invention is also any polynucleotide, ribonucleic or deoxyribonucleic acid, sense or antisense, in particular “Small interferential RNA”, corresponding at least to the nucleotide coding sequence SEQ ID NO: 19,
  • SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28.
  • the nucleic acid sequences of the invention can also be used to produce oligonucleotide primers, which hybridize in high stringency conditions with the sequence SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19,
  • SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24,
  • SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 28 These sense and / or antisense oligonucleotide primers can be useful for specific sequencing or amplification reactions according to the so-called PCR technique.
  • polymerase chain reaction or any other variant thereof for the purpose of cloning, identifying or diagnosing a polypeptide represented by SEQ ID NO: 1,
  • SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 25 or SEQ ID NO: 27.
  • probes or primers of the invention are marked, prior to their use.
  • several techniques are available to a person skilled in the art, for example fluorescent, radioactive, chemiluminescent or enzymatic labeling.
  • SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28 can also be introduced into an expression vector thus allowing the synthesis of a corresponding recombinant protein.
  • the invention therefore also relates to a recombinant expression vector containing all or part of the nucleotide sequence coding SEQ ID NO: 19,
  • SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 or SEQ ID NO: 28.
  • the subject of the invention is also a cosmetic or pharmaceutical composition
  • a cosmetic or pharmaceutical composition comprising, in a physiologically acceptable medium, a deoxyribonucleic acid sequence, natural or synthetic, coding for the primary amino acid sequence of a polypeptide according to the invention or a sense or antisense ribonucleic acid sequence, in particular interference antisense, corresponding to said sequence SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 26 or
  • any composition of the invention can be ingested, injected or applied to the skin (on any cutaneous area of the body) or on the mucous membranes
  • a composition of the invention is applied to the skin or the mucous membranes.
  • it can be in all the dosage forms normally used.
  • the composition may take the form in particular of aqueous or oily solutions or of dispersions of the lotion or serum type, of emulsions of liquid or semi-liquid consistency of the milk type, obtained by dispersion of a phase fatty in an aqueous phase (O / W) or vice versa (W / O), or of suspensions or emulsions of soft consistency of the aqueous or anhydrous cream or gel type, or of microcapsules or microparticles, or of vesicular dispersions of the ionic type and /or not ionic or foam.
  • These compositions are prepared according to the usual methods.
  • the composition may be in the form of aqueous, oily lotions or in the form of sera.
  • the eyes it can be in the form of drops and for ingestion, it can be in the form of capsules, granules, syrups or tablets.
  • compositions according to the invention are those conventionally used in the fields under consideration.
  • compositions constitute in particular cleaning, protection, treatment or care creams for the face, for the hands, for the feet, for large anatomical folds or for the body (for example day, night creams, makeup removal creams, foundation creams, sunscreen creams), fluid foundations, makeup removal milks, body protection or care milks, sunscreen milks, lotions , gels or foams for skin care, such as cleansing lotions, sunscreen lotions, artificial tanning lotions, bath compositions, deodorant compositions comprising a bactericidal agent, aftershave gels or lotions , depilatory creams, compositions against insect bites, pain relieving compositions, compositions for treating certain skin diseases such as eczema, rosacea, psoriasis, lichens and p severe rural areas.
  • the compositions according to the invention may also consist of solid preparations constituting soaps or cleaning bars.
  • compositions can also be packaged in the form of an aerosol composition also comprising a propellant under pressure.
  • a composition according to the invention can also be a composition for the care of the scalp, and in particular a shampoo, a styling lotion, a treating lotion, a styling cream or gel, a composition of dyes (in particular dyes of oxidation) possibly in the form of coloring shampoos, restructuring hair lotions, a perm composition (in particular a composition for the first time of a perm), a fall prevention lotion or gel, an antiparasitic, anti-dandruff shampoo etc.
  • a composition can also be for oral use, for example a toothpaste.
  • the composition may contain conventional adjuvants and additives for compositions for oral use and in particular surfactants, thickening agents, humectants, polishing agents such as silica, various active ingredients such as fluorides, in particular sodium fluoride, and optionally sweetening agents such as saccharinate sodium.
  • the proportion of the fatty phase can vary from approximately 5% to 80% by weight, and preferably from approximately 5% to 50% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the oils, waxes, emulsifiers and co-emulsifiers used in the composition in the form of an emulsion are chosen from those conventionally used in the cosmetic field.
  • the emulsifier and the co-emulsifier are present in the composition in a proportion ranging from 0.3% to 30% by weight, and preferably from 0.5% to 20% by weight relative to the total weight of the composition.
  • the emulsion may, in addition, contain lipid vesicles.
  • the fatty phase can represent more than 90% of the total weight of the composition.
  • the cosmetic composition may also contain adjuvants customary in the cosmetic field, such as hydrophilic or lipophilic gelling agents, hydrophilic or lipophilic additives, preservatives, antioxidants, solvents, perfumes, fillers, filters, odor absorbers and coloring matters.
  • the amounts of these various adjuvants are those conventionally used in the cosmetic field, and for example vary from approximately 0.01% to 10% of the total weight of the composition.
  • These adjuvants depending on their nature, can be introduced into the fatty phase, into the aqueous phase and / or into the lipid spherals.
  • emulsifiers used in the invention there may be mentioned for example glycerol stearate, polysorbate 60 and the PEG-6 / PEG-32 / glycol stearate sold under the name Tefose ® 63 by the company Gattefosse.
  • solvents which can be used in the invention mention may be made of lower alcohols in particular ethanol and isopropanol and propylene glycol.
  • hydrophilic gelling agents which can be used in the invention, mention may be made of carboxyvinyl polymers (carbomer, acrylic copolymers such as acrylate / alkylacrylate copolymers, polyacrylamides, polysaccharides such as hydroxypropylcellulose, natural gums and clays, and , as lipophilic gelling agents, mention may be made of modified clays such as bentones, metal salts of fatty acids such as aluminum stearates, hydrophobic silica, ethylcellulose and polyethylene.
  • carboxyvinyl polymers carboxyvinyl polymers
  • acrylic copolymers such as acrylate / alkylacrylate copolymers
  • polyacrylamides polysaccharides
  • polysaccharides such as hydroxypropylcellulose
  • natural gums and clays and , as lipophilic gelling agents
  • modified clays such as bentones, metal salts of fatty acids such as aluminum stearates, hydrophobic silica
  • composition may contain other hydrophilic active agents such as proteins or protein hydrolysates, amino acids, polyols, urea, allantoin, sugars and sugar derivatives, water-soluble vitamins, plant extracts and hydroxy acids.
  • hydrophilic active agents such as proteins or protein hydrolysates, amino acids, polyols, urea, allantoin, sugars and sugar derivatives, water-soluble vitamins, plant extracts and hydroxy acids.
  • retinol and its derivatives
  • tocopherol vitamin E
  • essential fatty acids ceramides
  • essential oils ceramides
  • the composition can combine at least one other active agent intended in particular for the prevention and / or treatment of skin conditions.
  • active agents there may be mentioned by way of example: agents which decrease differentiation and / or proliferation and / or skin pigmentation such as retinoic acid and its isomers, retinol and its esters, vitamin D and its derivatives, estrogens such as estradiol, kojic acid or hydroquinone;
  • antibacterials such as clindamycin phosphate, erythromycin or antibiotics of the tetracycline class; - antiparasitics, in particular metronidazole, crotamiton or pyrethroids; antifungals, in particular compounds belonging to the class of imidazoles such as econazole, ketoconazole or miconazole or their salts, polyene compounds, such as amphotericin B, compounds of the allylamine family, such as terbinafine , or octopirox; antiviral agents such as acyclovir; steroidal anti-inflammatory agents, such as hydrocortisone, betamethasone valerate or clobetasol propionate, or non-steroidal anti-inflammatory agents such as, for example, ibuprofen and its salts, diclofenac and its salts, acetylsalicylic acid, acetaminophen or glycyrrhizic acid; an
  • - keratolytic agents such as ⁇ - and ⁇ - hydroxycarboxylic or ⁇ -ketocarboxylic acids, their salts, amides or esters and more particularly hydroxy acids such as glycolic acid, lactic acid, salicylic acid, acid citric and in general the acid of f uits, and n-octanoyl-5-salicylic acid; anti-free radical agents, such as ⁇ -tocopherol or its esters, superoxide dismutases, certain metal chelators or ascorbic acid and its esters; antiseborrheics such as progesterone; anti-dandruff drugs like octopirox or zinc pyrithione;
  • the composition according to the invention also comprises at least one agent chosen from antibacterial, antiparasitic, antifungal, antiviral, anti-inflammatory, antipruritic, anesthetic, keratolytic, anti-free radical, anti-seborrheic agents, anti-dandruff, anti-acne and / or agents that decrease differentiation and / or proliferation and / or skin pigmentation.
  • FIGURES - Figure 1 Photograph of the 2D electrophoresis gel obtained according to the example
  • Not I- (dT) 18 is designed to attach to long series of A, for example poly A +. Used in reverse transcription reactions, Not I- (dT) 18 binds to poly A +.
  • the final protein concentration is 11 mg / ml.
  • Two-dimensional gel The two-dimensional separation of the proteins contained in the El extract is carried out on a device of the Pharmacia brand (Multiphor II model). The two-dimensional separation of the proteins was carried out according to the supplier's recommendations except that for the rebalancing of the IPG gel after migration in the first direction, the iodoacetamide was omitted. The coloring of the spots, the recovery of these spots and the sequencing of the polypeptides which they contained were carried out according to the techniques described in Méhul B, Bernard D, Simonetti L, Bernard MA, Schmidt R: Identification and cloning of a new calmodulin -like protein from human epidermis.
  • Proteins were detected by black amide staining.
  • the spots corresponding to proteins identified by Edman sequencing are located with the name of these proteins.
  • the spot called SASPase makes it possible to locate an epidermal form of the protein having an apparent PM of 12 kD and a pi of 5.8.
  • the results obtained made it possible to characterize the sequences SEQ ID NO: 1,
  • RNA Complementary DNA
  • cDNA Complementary DNA
  • kit "First Strand cDNA Synthesis ®” marketed by the company Amersham Pharmacia Biotech according to the manufacturer's instructions using as a primer, the oligonucleotide Not I- ( dT) 18 .
  • SASPase (SEQ ID NO: 4), devoid of the 84 N-terminal amino acid residues of SASPase called ⁇ 1-84 were amplified by PCR using as primers, the pair of SC131 / SC130 oligonucleotides (SEQ ID NO : 11 and SEQ ID NO: 12).
  • tSASPase The SASPase cDNA obtained previously is introduced into the plasmid vector pGex-4T-3 sold by the company Amersham Pharmacia Biotech, by cleavage / ligation at the BamH-1 restriction sites / EcoRI.
  • This recombinant plasmid which contains in phase in the reading frame, the coding sequence of SASPase (SEQ ID NO: 5) and the coding sequence of glutathione S-transferase (GST) is then introduced into E. coli strain BL21 (DE3 ) marketed by the company Amerscham Pharmacia Biotech.
  • the recombinant fusion protein expressed by the bacteria can be cut by thrombin under mild conditions, the construction being such that the fusion protein obtained carries a cleavage site by this protease.
  • the expression product is purified by affinity chromatography on a gluthation-sepharose column.
  • EXAMPLE III Obtaining the activated SASPase (SEQ ID NO: 6)
  • the recombinant fusion protein GST-SASPase ⁇ 1-84 (SEQ ID NO: 4) eluted from the glutathione sepharose column obtained in Example II, is incubated with thrombin in PBS buffer, pH8 for 18 hours at 22 ° C.
  • the buffer is exchanged by filtration on G25 ® Biorad gel against a 100 mM acetate solution, pH 4.5.
  • the mixture thus obtained is subjected to cation chromatography using a NaCl gradient (0 to 1 M NaCl).
  • the fractions containing GST and thrombin are eliminated and the fraction eluted with the 750 mM NaCl solution is recovered.
  • the 12kD form corresponds to the activated form of SASPase.
  • Edman sequencing indicates that the isolated product corresponds to the activated SASPase (SEQ ID NO: 6).
  • the deletion of the site coding for the FANS sequence on the truncated form of the SASPase (SEQ ID NO: 4) using the Quick Change Site-directed Mutagenesis kit (Stratagene) and suitable primers is carried out using as plasmid DNA the plasmid construction of the sequence of SASPase C27 (SEQ ID NO : 4) in the vector ⁇ GEX-4T3.
  • a protein whose protein sequence is represented by SEQ ID NO: 36 is obtained.
  • SEQ ID NO: 27 of theoretical mass 16794.43 is obtained from SEQ ID NO: 25 by assuming an activation in C-terminal identical to the form SEQ ID NO: 6.
  • SASPase a Activity with respect to a substrate This activity has been demonstrated according to the following protocol: Insulin oxidized beta chain (Sigma) is used as substrate. The concentration is 50 ⁇ g in 1.5 ml of 0.1M acetate buffer, pH 5.0. 50 ⁇ l of purified 12 kD SASPase (SEQ ID NO: 6) are added (approximately 1 mg / ml) by gel filtration to initialize the hydrolysis. Controls without enzyme or without substrate are used as controls. Over time (1 h to 24 h at 37 ° C.) HPLCs are carried out to monitor the hydrolysis. The peaks appearing rapidly correspond to the main hydrolysis sites and those appearing only after 24 hours at the secondary sites. The peaks are collected after their fractionation and sequences in N-terminal (sequencing of EDMAN, Institut Pasteur).
  • FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO: 15).
  • E / L (only described for matrilysin which is capable of activating urokinase and MMP 1, 2 and 9).
  • the Quick Change Site-directed Mutagenesis kit (Stratagene) is used for the creation of SASPase mutants.
  • SASPase SEQ ID NO: 5 is modified at the level of aspartic acid No. 212, that is to say its potential active site.
  • two oligonucleotides are synthesized so that amino acid 212 is substituted either in alanine (A / D mutant) or in glutamic acid (E / D mutant).
  • PCR amplification is carried out with each pair of mutated oligonucleotides, the plasmid construction of the sequence of SASPase C27 in the vector pGEX-4T3 is used as DNA template.
  • Competent bacteria (XL1 blue) are then transformed with each PCR product.
  • Several clones are amplified and sequenced in order to verify the presence of the desired mutation and only of this.
  • the mutated recombinant proteins are produced according to the same protocol as for the wild form, SASPase C27; (SEQ ID NO: 4). Each recombinant protein produced in the form of a fusion protein is then incubated in a 1M acetate buffer, pH 4; 5 at 37 ° C. Samples over time are taken and analyzed by SDS-PAGE.
  • the analyzes were performed by Northern blotting, using commercial polyA + RNA blot membranes (Ambion ®) using the protocol described by the manufacturer and by RT-PCR using a cDNA collection of membranes "rapid-scan ®” products marketed by OriGene Technologies, Inc.
  • the analysis by Northern Blot was carried out using as a probe the cDNA encoding the form (truncated ⁇ l-84) of SASPase (SEQ ID NO: 4) isolated from the recombinant plasmid prepared in Example II and in using a membrane containing different RNA samples.
  • the PCR is carried out using the Taq polymerase sold by the company Promega, as primers, the pair of oligonucleotides SCI 34 (SEQ ID NO: 13) / SC135 (SEQ ID NO: 14) under the following conditions: 1 cycle of 3 min. at 94 ° C,
  • results show that SASPase is appreciably expressed in almost all of the tissues tested at a low level in the fetal liver, fetal brain, ovary, adrenal gland, thyroid, placenta, testes, stomach, muscle, lung, liver, spleen and heart, and even weaker in the bone marrow, pancreas, saliva, and small intestine. This expression is however significant in the brain and particularly very high in the skin.
  • a crosslinking study using BS3 is carried out on activated SASPase (SEQ ID NO: 6), obtained by acidification and purification by exclusion chromatography (gel filtration) of the recombinant fusion protein GST- SASPase ⁇ 1-84.
  • Example III To the activated SASPase (SEQ ID NO: 6) obtained in Example III, placed in ice, 1 ⁇ g of BS3 is added in 60 ⁇ l of 50 mM phosphate buffer, pH 7, containing 150 mM NaCl, 0.1 % TX100, 5 mM EDTA. A BS3-free control sample is also prepared. After 90 min, 2 ⁇ l of 1 M Tris-HCl, pH 8, are introduced into the reaction media to stop the reaction. The products obtained are then analyzed by gel filtration on gel, and by SDS-PAGE electrophoresis.
  • the activated SASPase incubated with BS3 forms a stable multimeric complex which, by gel filtration on gel, separates into three major peaks. Three distinct bands are also observable on gel after SDS-PAGE electrophoresis, the apparent molecular masses of which, determined by comparison with the markers of the molecular masses, are respectively 12kD, between 10-14kD, 30-45kD and 60-100kD.
  • Example II 10 ⁇ l of GST-SASPase ⁇ 1-84 fusion proteins (approximately 3 mg / ml) obtained in Example II are incubated in 200 ⁇ l of 0.1 M acetate buffer, adjusted to different pH in the presence of the casein substrate sold under the name of Enzchek by the company Molecular Probes and used at the concentrations recommended by the supplier.
  • the influence of pH on self-activation is also carried out and shows an optimization for pH between 3 and 6.9 and preferably between 4 and 6.
  • - RP2 corresponds to the sequence Ac-Leu-Leu-Met-aldehyde and is marketed by Bachem under the reference N 1315.0005 and
  • - RP3 corresponds to the Ac-Leu-Leu-Nle-aldehyde sequence and is marketed by Bachem under the reference N 1320.0005.
  • Corneodesmosine is a marker for desquamation because it intervenes in coméocytaire cohesion at the level of coméodesmosomes. The more the protein is degraded, the more significant the detachment of the corneocytes. Degradation of corneodesmosine is therefore a key step in scaling.
  • Acetonic powders are prepared from varnished stripping (Méhul B, Bernard D, Simonetti L, Bernard MA, Schmidt R: Identification and cloning of a new calmodulin-like protein from human epidermis. J Biol Chem 275: 12841-12347, 2000 ) taken from the lower legs of volunteers with dry skin. Aliquots of 2 mg of stratum corneum powder are introduced separately into Eppendorf tubes, then immersed in the solutions to be tested at the rate of 100 ⁇ l / mg. The solutions are prepared in acetate buffer pH 5. A control without protease is prepared in parallel to assess the natural degradation of corneodesmosine. For each test, three samples are prepared.
  • a positive degradation control (+) is prepared using 5 mM EDTA. A test is carried out in the presence of 60 ⁇ g of activated SASPase. A negative control represents the natural degradation of corneodesmosine under the operating conditions of the test. d) Results
  • the peptide substrate considered is used (SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 35) quenched using the fluorescent system Abz / (N02) Tyr at the rate of lOO ⁇ M in DMSO then lO ⁇ L of this stock mother solution is added for lOO ⁇ l of 0.1 M acetate buffer pH 5.00.

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Abstract

La présente invention concerne une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins un polypeptide naturel ou synthétique purifié dont la séquence peptidique est représentée en tout ou partie par au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues.

Description

UTILISATION DE PROTEASES ASPARTIOUES DANS LE DOMAINE COSMETIQUE ET THERAPEUTIQUE La présente invention a pour objet principal l'utilisation, dans les domaines cosmétique et thérapeutique, d'une nouvelle protéase à acide aspartique dite SASPase, des formes tronquées ou dérivées de ladite protéine ou d'un mélange de polypeptides issu de sa protéolyse notamment en vue de traiter les troubles liés à un dysfonctionnement de la prolifération et/ou de la différenciation cellulaire.
L'invention a également pour objet des séquences d'acide désoxyribonucléique codant ladite protéase à acide aspartique SASPase et ses formes dites activées, les séquences polypeptidiques correspondantes et les utilisations desdites séquences désoxyribonucléiques.
Les protéases sont des enzymes hydrolytiques capables de couper des liaisons peptidiques. Un certain nombre d'entre elles sont aujourd'hui connues comme jouant un rôle essentiel au niveau de l'équilibre et de la physiologie de l'épidémie. L'épidémie est conventionnellement divisé en une couche basale de kératinocytes constituant la couche germinative de l'épidémie, une couche dite épineuse constituée de plusieurs couches de cellules polyédriques disposées sur les couches germinatives, une à trois couches dites granuleuses constituées de cellules aplaties contenant des inclusions cytoplasmiques distinctes, les grains de kératohyaline et enfin, un ensemble de couches supérieures appelées couches cornées (ou stratum corneum), constituée de kératinocytes au stade terminal de leur différenciation appelés cornéocytes.
Les cornéocytes sont des cellules anucléées principalement constituées d'une matière fibreuse contenant des cytokératines, entourée d'une enveloppe comée. Il y a en permanence production de nouveaux kératinocytes pour compenser la perte en continu de cellules épidermiques au niveau de la couche cornée selon un mécanisme dénommé desquamation. Un déséquilibre entre la production des cellules au niveau de la couche basale et le taux de desquamation peut notamment conduire à des formations d'écaillés à la surface de la peau.
En l'occurrence, de nombreuses pathologies cutanées se caractérisent par la production d'une couche comée épaissie et par une desquamation anormale, c'est-à-dire par une hyperkératose. A titre d'exemple, on peut citer : - la xérose (ou sécheresse cutanée), - les ichthyoses, le psoriasis,
- certaines lésions tumorales bénignes ou malignes, et les hyperkératoses réactionnelles. A l'inverse, certaines manifestations pathologiques entraînent un amincissement de l'épiderme et plus particulièrement de la couche cornée. Ce type de manifestations se traduit alors par une fragilité excessive du revêtement cutané. A titre représentatif de ces troubles, on peut notamment citer les réactions d'origine immunitaire généralement induites par mise en présence ou contact avec un ou plusieurs agents exogènes.
En conséquence, la connaissance des polypeptides impliqués dans la cohésion inter cornéocytaire est une des voies qui peut permettre l'élaboration de produits destinés à lutter contre les effets d'un excès ou d'un défaut en polypeptide(s) de ce type, en particulier à la surface de la peau. L'un des objets de l'invention est précisément de proposer l'utilisation dans un but cosmétique et/ou thérapeutique d'un polypeptide impliqué dans la régulation du phénomène de différenciation/prolifération épidermique.
Plus précisément, les inventeurs ont mis en évidence dans des kératinocytes humains, isolé et purifié un polypeptide possédant dans sa séquence peptidique- (SEQ ID NO 5), la séquence FLNDSGAQNSNV (SEQ ID ΝO : 1) correspondant à une signature PROSITE PS00141 des sites actifs des protéases de la famille des protéases dites à acide aspartique.
Ce polypeptide encore dénommé ci-après protéine SASPase, est par ailleurs caractérisé par la présence dans sa séquence peptidique des séquences suivantes : - AQFLNAΝASAEEAIIGTDNLQ (SEQ ID ΝO : 2) et
- ILGNWDTAV (SEQ ID ΝO : 3).
De manière inattendue les inventeurs ont mis en évidence que la protéine représentée par la séquence SEQ ID ΝO : 5, encore appelée protéine SASPase, possédait une activité protéolytique significative et ont notamment constaté cette activité vis-à-vis de la caséine et de l'insuline comme le montre les exemples ci-après.
Ils ont par ailleurs observé que cette protéine SASPase était autocatalytique et générait à un pH compris entre 3 et 7, et de préférence supérieur ou égal à 4,5 une forme tronquée dite « SASPase activée », correspondant à la séquence SEQ ID NO : 6 capable à son tour de se dimériser.
Un aspect de l'invention concerne donc un polypeptide isolé et purifié, appartenant à la famille des protéases à acide aspartique caractérisé en ce qu'il possède une séquence peptidique représentée par la séquence SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
La SEQ ID NO : 6 correspond à une forme activée de la SEQ ID NO : 5.
La SEQ ID NO : 16 correspond à la séquence SEQ ID NO : 6 délétée de ses deux premiers acides aminés. La séquence SEQ ID NO : 25 est une autre forme activée de la
SEQ ID NO : 5. Elle est obtenue à partir d'une forme tronquée de la SASPase (SEQ ID NO : 36) délétée du site codant pour la séquence FANS (SEQ ID NO : 29). Elle est plus particulièrement générée à pH 5.00 dans du tampon acétate.
La séquence SEQ ID NO : 27 correspond à la séquence SEQ ID NO : 25 délétée d'une partie de son fragment C-terminal.
D'une façon générale, l'invention s'étend à toutes les formes homologues des différents polypeptides ou séquences peptidiques cités. Classiquement, on entend par homologue d'un polypeptide ou d'une séquence peptidique, tout polypeptide ou toute séquence peptidique ayant une homologie de séquence d'au moins 85 %, notamment d'au moins 90 % et en particulier d'au moins 95 % et ayant le cas échéant le même type d'activité biologique que ledit polypeptide ou que ladite séquence peptidique.
Ces formes homologues englobent les variants définis ci-après.
L'invention s'étend en particulier aux formes homologues des polypeptides cités précédemment, c'est-à-dire manifestant la même activité biologique et possédant au moins 85 %, notamment au moins 90 % et en particulier au moins 95 % d'homologie de séquence avec la séquence SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou
SEQ ID NO : 27.
De même, l'invention s'étend aux protéines possédant au moins une homologie de 30 % avec la séquence de SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 à la condition que l'homologie avec la séquence du site actif SEQ ID NO : 1 contenue dans les
SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 soit d'au moins
80 %. L'invention s'étend également aux protéines possédant à la fois le motif
"aspartyl protéase rétroviral type" défini sous la référence de motif PROSITE : PS50175 ainsi qu'au moins un domaine transmembranaire tel que prédit par les algorithmes reconnus pour une telle détection parmi lesquels on peux citer: PRED-TMR2, TMHMM, TMpred et SOSUI.
Les modifications, dites encore mutations ou variations selon l'invention peuvent dériver, soit de la délétion d'un ou plusieurs acides aminés de la séquence SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27, ou de l'addition d'un ou plusieurs acides aminés à la séquence SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27, soit encore de la substitution d'un ou plusieurs acides aminés à la séquence SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27. Les séquences correspondantes sont encore désignées sous le terme de variants dans le cadre de la présente invention.
A titre illustratif des variants de délétion on peut plus particulièrement citer les séquences peptidiques suivantes :
La séquence SEQ ID NO : 4 correspondant à la SEQ ID NO : 5 tronquée de son fragment N-terminal A 1- 84.
La séquence SEQ ID NO : 7 correspondant à la séquence de la partie N-terminale de la protéine SASPase (SEQ ID NO : 5). L'interaction de ce fragment avec un ligand biologique pourrait être une étape importante pour l'activation de la protéine SASPase et notamment la génération de sa forme activée (SEQ ID NO : 6).
La séquence SEQ ID NO : 8 correspondant à la séquence de la partie dite transmembranaire de la protéine SASPase (SEQ ID NO : 5).
La séquence SEQ ID NO : 9 correspondant à la séquence d'un peptide issu de la partie C-terminale de la protéine SASPase (SEQ ID NO : 5).
Les séquences SEQ ID NO : 29 et SEQ ID NO 30 correspondent à deux sites d'activation.
Sont également couverts sous le terme de variant, les protéines de fusion de la protéine SASPase (SEQ ID NO : 5), de ses formes activées SEQ ID NO : 6,
SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 avec un autre polypeptide, un agent de ciblage hydrophile ou hydrophobe ou un précurseur de bioconversion susceptible notamment de contrôler l'activation de ladite protéine.
Il est connu que les polypeptides peuvent subir des modifications post- traductionnelles comme la formation de liaisons disulfures, les clivages protéolytiques spécifiques, l'addition de glucides (glycosylation), la phosphorylation en particulier au niveau des serines et/ou des thréonines et/ou des tyrosines, et/ou l'association à des lipides.
Le polypeptide de l'invention peut avoir subi une ou plusieurs modifications post-traductionnelles. En particulier, les polypeptides selon l'invention peuvent être N-glycosylés, phosphorylés, myristoylés, amidés et/ou citrullinés.
Ainsi, l'invention concerne également les polypeptides revendiqués ayant subi ou non des modifications post-traductionnelles.
L'invention s'étend également aux formes multimères et de préférence à la forme dimère de la séquence peptidique SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27. La forme dimère de la séquence peptidique SEQ ID NO : 6 est en particulier caractérisée en exemple V ci-après. Elle peut notamment être obtenue par association moléculaire de la forme monomerique ou par expression de son ADNc codant pour le dimère actif, incorporant à titre d'agent de liaison entre les deux entités monomériques, un motif composé de 2 à 6 acides aminés.
Les polypeptides revendiqués peuvent être d'origine naturelle ou synthétique. Par synthétique, on entend ici tout polypeptide obtenu chimiquement ou par production dans un organisme après introduction dans cet organisme des éléments nécessaires à cette production.
Ils peuvent être issus de toute origine possible à savoir soit animale, en particulier de mammifères et encore plus particulièrement humaine, soit végétale, soit de micro-organismes (par exemple virus, phages, bactéries, levures entre autres) ou encore de champignons, ou issu d'une surexpression dans un système eucaryote, par exemple une cellule de mammifère, sans préjuger du fait qu'ils soient présents de manière naturelle ou non dans ledit organisme d'origine.
En particulier, les polypeptides conformes à l'invention sont d'origine naturelle, purifiés à partir de tissus de mammifères, plus particulièrement à partir de peau de mammifères.
En particulier, ils sont purifiés à partir de peau humaine et encore plus particulièrement à partir d' épidémie humain. On sait que dans un polypeptide, un ou plusieurs résidus d'acide aminé peuvent être remplacés par des résidus d'acide aminé ayant un indice hydropathique similaire sans pour autant changer les propriétés biologiques du polypeptide.
L'indice hydropathique est un indice attribué aux acides aminés en fonction de leur hydrophobicité et de leur charge (Kyte et al. (1982), J. Mol. Biol., 157 : 105).
Ainsi l'invention a également pour objet un polypeptide tel que décrit ci-dessus dans lequel un résidu d'acide aminé au moins a été remplacé par un résidu d'acide aminé ayant un indice hydropathique similaire.
On peut également classer les polypeptides en fonction de leur point isoélectrique.
Le point isoélectrique théorique d'un polypeptide peut être déduit de son enchaînement en acides aminés. Les polypeptides de l'invention sont théoriquement des polypeptides acides.
Ainsi les polypeptides de séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6 ou SEQ ID NO : 16 possèdent un point isoélectrique compris entre 3 et 9, plus particulièrement entre 4 et 6 et notamment d'environ 5,8.
On sait en outre que la séquence primaire en acides aminés ainsi que les diverses modifications post-traductionnelles subies par un polypeptide font que ledit polypeptide peut être caractérisé par sa masse moléculaire apparente exprimée en kilodaltons.
On entend par masse moléculaire apparente, la masse moléculaire obtenue pour le polypeptide par comparaison de la mobilité électrophorétique de celui-ci avec celles de protéines standards de poids moléculaires connus sur gel de polyacrylamide/sodium dodécylsulfate, ou encore par comparaison du volume d'élution du polypeptide avec celui de protéines standard de poids moléculaires connus en chromatographie d'exclusion (selon les techniques décrites dans « Protein Purification », J-C. Janson et L. Ryden, VCH Publisher Inc. N.Y., 1989). (La méthode retenue dans le cadre de l'invention est celle reposant sur la mobilité électrophorétique).
La connaissance de l'enchaînement en acides aminés du polypeptide de l' invention permet d' en déterminer le poids moléculaire théorique.
L'invention concerne donc un polypeptide de séquence SEQ ID NO : 6 ayant une masse moléculaire apparente comprise entre 5 et 30 kilodaltons (kD), notamment entre 9 et 15 kD, et plus particulièrement entre 11 et 14 kD. En particulier, ce polypeptide de l'invention a une masse moléculaire apparente de l'ordre de 12kD.
Comme il ressort des exemples présentés ci-après, les inventeurs ont caractérisé l'expression du polypeptide dont la séquence est représentée par la séquence SEQ ID NO : 5 dans un grand nombre de tissus biologiques humains tel que le foie foetal, le placenta, le muscle, le poumon, l'intestin grêle et surtout au niveau du cerveau et du cœur et plus particulièrement au niveau de l'épiderme où l'expression est particulièrement élevée.
Il a par ailleurs été constaté que la SASPase de séquence SEQ ID NO : 5 dégradait la coméodesmosine, qui est un marqueur de la desquamation.
Enfin, la présence, dans la séquence polypeptidique de la SASPase (SEQ ID NO : 5) d'un site autocatalytique correspondant à un site décrit pour la protéase de type matrilysine capable d'activer les MMP de type 1, 2, et 9, témoigne d'une activité potentielle de la SASPase, ainsi que de ses formes activées (SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27) ou de ses fragments, sur des substrats endogènes et donc d'applications potentielles en cicatrisation, ré-épithialisation, vieillissement, angiogénèse et cancérisation (processus d'invasion) pour ladite protéine et ses différentes formes activées ou fragments.
L'ensemble de ces informations, valide donc l'implication du polypeptide conforme à l'invention dans le processus de prolifération et/ou différenciation cellulaire et identifie celui-ci en tant que nouvelle cible dermato/cosmétologique et thérapeutique.
En conséquence, un second aspect de l'invention concerne une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins un polypeptide naturel ou synthétique purifié dont la séquence comprend au moins une séquence peptidique représentée en tout ou partie par au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues.
En particulier, la présente invention concerne une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins un polypeptide naturel ou synthétique purifié dont la séquence peptidique est représentée en tout ou partie par la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16 ou SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 ou leurs homologues, et en particulier qui est représentée par la séquence peptidique SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
La présente invention concerne également une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant au moins un polypeptide naturel ou synthétique purifié dont la séquence peptidique est représentée en tout ou partie par au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues et en particulier au moins un polypeptide de séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 sous une forme multimère et de préférence dimère.
Au sens de l'invention, et sans indication contraire, on entend couvrir sous le terme polypeptide dans les compositions revendiquées les polypeptides naturels ou synthétiques, qu'il soit obtenu par protéolyse ou par synthèse, les différentes formes post- traductionnelles de ceux-ci et notamment celles décrites précédemment ou encore tout polypeptide naturel ou synthétique dont la séquence est totalement ou partiellement constituée par les séquences précitées comme par exemple les variants décrits ci-dessus.
La présente invention concerne également une composition cosmétique ou pharmaceutique dans laquelle ledit polypeptide se présente sous la forme d'un polypeptide de séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 fusionné avec un autre polypeptide, un agent de ciblage hydrophile ou hydrophobe ou un précurseur de bioconversion.
Il est par ailleurs connu que la séquence primaire en acides aminés d'un polypeptide détermine des sites spécifiquement reconnus par les protéases qui, une fois la reconnaissance de ces sites effective vont, avec ou sans fixation audit polypeptide, induire son clivage par protéolyse.
En conséquence, l'invention vise également une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable au moins un mélange de polypeptides issu de la protéolyse d'un polypeptide dont la séquence est représentée en tout ou partie par la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 ou leurs homologues et plus particulièrement, dont la séquence est représentée par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
La quantité de polypeptide contenue dans les compositions de l'invention est, bien entendu, fonction de l'effet recherché et peut donc varier dans une large mesure.
Pour donner un ordre de grandeur, la composition peut contenir un polypeptide conforme à l'invention en une quantité représentant de 0,00001 % à 50 % du poids total de la composition et préférentiellement en une quantité représentant de 0,001 % à 10 % du poids total de la composition et encore plus préférentiellement en une quantité représentant de 0,1 % à 1 % du poids total de la composition.
Comme décrit précédemment, un certain nombre de désordres sont associés à des troubles de différenciation et/ou prolifération cellulaire. Dans la mesure où les polypeptides conformes à l'invention sont impliqués au niveau de la régulation de ces deux phénomènes, ils constituent avantageusement des cibles potentielles pour traiter tout désordre résultant d'un dysfonctionnement de la prolifération ou de la différenciation cellulaires en particulier épidermiques. En conséquence, outre le fait que les polypeptides selon l'invention peuvent être utilisés directement à titre de matière active dans une composition cosmétique ou pharmaceutique, ils peuvent également eux-mêmes servir de cible dans un traitement cosmétique ou pharmaceutique ou être utilisés à titre d'outils de diagnostic.
Les inventeurs ont par ailleurs caractérisé la présence de sites de coupure dans la séquence peptidique SEQ ID NO : 5, en partie localisés dans sa partie N-terminale et également présents dans les formes actives SEQ ID NO : 6, et SEQ ID NO : 16 et en partie présents dans sa partie C-terminale et également présents dans les formes actives SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27. Plus précisément, les sites de coupure déduits de l'autoactivation de la SASPase elle-même sont F/A, N/S, E/L, A/L, PJF, H/S, F/E, E/A. A l'évidence, ces sites de coupure peuvent être déterminants au niveau de l'activation de la protéine, soit pour la bloquer, soit au contraire pour activer son hydrolyse.
Les sites pertinents plus précisément localisés dans la région N-terminale sont F/A et N/S et figurent dans la séquence FANS dite SEQ ID NO : 29. Ils semblent en particulier impliqués dans la génération de la forme activée représentée par la SEQ TD NO : 25.
En ce qui concerne la seconde région potentielle d'activation ou d'inactivation de la protéine SASPase SEQ ID NO : 5, elle correspond plus particulièrement à la séquence DLELIE dite SEQ ID NO : 30 et comprend notamment le site de coupure E/L.
A partir de ces sites de coupure, on peut envisager d'effectuer la synthèse de différents types de peptides soit modifiés, soit portant un fluorophore quenché et qui serviront de substrat ou d'inhibiteurs. Le minimum de séquence utilisable est évidemment le dipeptide (acides aminés de part et d'autre du site de coupure) mais en général on utilise des peptides de 8 à 12 acides aminés où le site de coupure est en position centrale. Par exemple, on sait que la SASPase coupe l'insuline en position E/A. On peut donc imaginer de développer un substrat de type peptidique incorporant ce site de coupure en le modifiant chimiquement à chacune de ses extrémités par un groupement fluorophore quenché de type : Abz(NO2)Tyr (extrémité-N : acide aminobenzoïque : extrémité-C : nitrotyrosine (amide)). L'hydrolyse de ce peptide par la protéase séparera le fluorophore et le quencheur et sera donc suivi par un accroissement de la fluorescence.
Un autre couple chimique tel que Dabcyl/EDANS peut être utilisé pour créer un autre type de substrat quenché.
On peut également envisager un substrat chromogénique en couplant le peptide avec le groupement paranitroanilide.
De la même façon, on peut envisager de développer un inhibiteur spécifique de la SASPase en remplaçant l'un des acides aminés d'un tel peptide, en modifiant la liaison peptidique ou en rajoutant un groupement chimique afin que la liaison soit rendue non hydrolysable par l'enzyme mais que le peptide ait toujours une affinité pour le site actif. Par exemple, on ajoute un acide aminé non naturel, on réduit la liaison peptide ou on ajoute des groupements chimiques de type aldéhyde, chlorométhyl-ketone ou diazométhyl-cétone.
Les inventeurs ont notamment montré que des modifications ponctuelles apportées au niveau du substrat peptidique figuré par SEQ ID NO : 30 pouvaient avoir un effet significatif au niveau de leur affinité pour l'enzyme.
Plus précisément, les séquences correspondantes modifiées s'avèrent susceptibles de constituer des inhibiteurs ou activateurs potentiels de la SASPase.
A titre illustratif de ces modulateurs potentiels, on peut plus particulièrement proposer des substrats peptidiques possédant au moins les séquences suivantes :
EFDLELIEED SEQ ID NO : 31
EFDLDLIEED SEQ ID NO : 32 EFDLDLIEWD SEQ ID NO : 33
EFDLDLIHWD SEQ ID NO : 34
EPNLDLIEED SEQ ID NO : 35
II a en particulier été constaté un effet activateur des substrats représentés par les séquences SEQ ID NO : 31 et SEQ ID NO : 32.
En conséquence, la présente invention concerne également l'utilisation d'un composé chimique ou biologique pour la préparation d'une composition destinée à interagir avec un polypeptide dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 27 et SEQ ID NO : 30 et leurs homologues et plus particulièrement avec un polypeptide de séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25, SEQ ID NO : 27 ou SEQ ID NO : 30 ou d'en moduler l'activité biologique.
Ce composé biologique peut notamment être une protéase présentant un site spécifique de reconnaissance et/ou de fixation et de coupure au sein de la séquence d'acides aminés dudit polypeptide et de préférence d'un polypeptide ayant comme séquence primaire la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16 ou SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
En l'occurrence, il a été montré que des inhibiteurs de protéases de type rétropepsines manifestaient également un effet vis-à-vis de l'activité de la protéine SASPase. A titre illustratif des inhibiteurs pouvant être utilisés selon l'invention, on peut notamment citer les inhibiteurs de rétropepsines, notamment commercialisés par Bachem. Cet inhibiteur peut également être sélectionné pour interférer sur la dimérisation de la SASPase (SEQ ID NO : 5) ou de l'une de ses formes activées représentées par SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27, préalablement à son activité protéolytique. Cet inhibiteur peut également être un inhibiteur endogène capable d'inhiber spécifiquement la SASPase ou son autoactivation. De même, ce composé biologique peut être un activateur. A titre représentatif de ceux-ci on peut notamment citer le modulateur de rétropepsine RP3 caractérisé en exemple VIII ci-après. Il peut également s'agir d'un anticorps spécifique dudit polypeptide.
De même, la présente invention s'étend à l'utilisation d'un composé biologique ou chimique pour la préparation d'une composition destinée à inhiber la dimérisation du polypeptide de séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide dont la séquence comprend au moins et en particulier est représentée par une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 et
SEQ ID NO : 35, pour préparer une composition destinée à moduler l'activité de la SASPase.
Les compositions pharmaceutiques ou cosmétiques revendiquées et considérées selon l'invention peuvent être des compositions utilisées dans les domaines cosmétique, dermatologique, dermato-cosmétique et pharmacologique. Un milieu physiologiquement acceptable est selon l'invention un milieu cosmétiquement ou pharmaceutiquement acceptable compatible avec la peau, les muqueuses, les ongles et/ou les cheveux.
Les compositions selon l'invention peuvent être appliquées sur les ongles, les cheveux et plus particulièrement sur la peau et les muqueuses. Elles sont particulièrement avantageuses pour agir sur un ou plusieurs mécanismes épidermiques tels que la dégradation de protéine(s), l'activation d'enzyme(s), et/ou la régulation du phénomène de différenciation/prolifération épidermique.
En l'occurrence, les compositions selon l'invention sont particulièrement utiles pour suppléer à un déséquilibre de la différenciation/prolifération épidermique. Plus particulièrement, elles peuvent être utiles pour réguler les phénomènes d'hydratation, d'inflammation, de mélanogénèse, et/ou de desquamation, le phénomène de vieillissement, les mécanismes de défense, pour la régulation de la différenciation/prolifération sur certains types cellulaires et cutanés : kératinocytes, mélanocytes, cellules de Langerhans, sébocytes, adipocytes, ainsi que la régulation des phénomènes de sécrétion et de processus d'invasion.
D'une manière plus précise, les compositions revendiquées s'avèrent intéressantes dans les domaines suivants : pour traiter les affections dermatologiques liées à un désordre de la kératinisation portant sur la différenciation et sur la prolifération notamment pour traiter les acnés vulgaires, comédoniennes, polymorphes, rosacées, les acnés nodulokystiques, conglobata, les acnés séniles, les acnés secondaires telles que l'acné solaire, médicamenteuse ou professionnelle,
- pour traiter d'autres types de troubles de la kératinisation, notamment les ichtyoses, les état ichtyosiformes, la maladie de Darrier, les dératodermies palmoplantaires, les leucoplasies et les états leucoplasiformes, le lichen . cutané ou muqueux (buccal), - pour traiter d'autres affections dermatologiques liées à un trouble de la kératinisation avec une composante inflammatoire et/ou immuno-allergique et notamment toutes les formes de psoriasis qu'il soit cutané, muqueux ou unguéal, et même le rhumatisme psoriatique, ou encore l'atopie cutanée telle que l'eczéma, ou l'urticaire ou encore rhypertrophie gingivale ; les composés peuvent également être utilisés dans certaines affections inflammatoires ne présentant pas de trouble de la kératinisation,
- pour traiter toutes les proliférations dermiques ou épidermiques qu'elles soient bénignes ou malignes, qu'elles soient ou non d'origine virale telles que verrues vulgaires, les verrues planes et l'épidermodysplasie verruciforme, les papillomatoses orales ou florides et les proliférations pouvant être induites par les ultra- violets notamment dans le cas des épithélioma baso- et spino-cellulaires, pour traiter d'autres désordres dermatologiques tels que les dermatoses huileuses et les maladies du collagène,
- pour réparer ou lutter contre le vieillissement de la peau, qu'il soit photoinduit ou chronologique ou pour réduire les pigmentations et les kératoses actiniques, ou toutes pathologies associées au vieillissement chronologique ou actinique,
- pour prévenir ou guérir les stigmates de l'atrophie épidermique et/ou dermique induite par les corticostéroïdes locaux ou systématiques, ou toute autre forme d'atrophie cutanée,
- pour prévenir ou traiter les troubles de la cicatrisation ou pour prévenir ou pour réparer les vergetures, et
- pour lutter contre les troubles de la fonction sébacée tels que l'hyperséborrhée de l'acné ou la séborrhée simple. Dans le cas d'une application dans le domaine cosmétique, en particulier pour l'hygiène corporelle et capillaire, les compositions selon l'invention sont notamment utiles pour le traitement des peaux à tendance acnéique, pour la repousse des cheveux, l' antichute, pour lutter contre l'aspect gras de la peau ou des cheveux, dans la protection contre les aspects néfastes du soleil ou dans le traitement des peaux physiologiquement sèches, pour prévenir et/ou pour lutter contre le vieillissement photoinduit ou chronologique. Elles peuvent également être utiles pour améliorer les peaux reconstruites. On peut également utiliser directement dans le milieu de culture le polypeptide et/ou ses dérivés et/ou des modulateurs de son activité ou de son activation. Un autre objet de l'invention est un procédé de traitement cosmétique destiné à lutter contre les troubles cutanés liés à un dysfonctionnement de la prolifération et/ou de la différenciation cellulaire comme notamment les peaux sèches, Phyperkératose, la parakératose, les troubles de sébogénèse, les néoplasies et/ou les signes de vieillissement cutané caractérisé en ce que l'on applique sur la peau, les muqueuses et/ou les fibres kératiniques une composition cosmétique comprenant au moins un polypeptide dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1 SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8 SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et en particulier qui est représentée en tout ou partie par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27, et plus particulièrement qui possède la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 ou d'un mélange issu de la protéolyse de l'un de ces polypeptides.
Le procédé de traitement de l'invention est un procédé cosmétique destiné à améliorer l'aspect esthétique de l'individu subissant des troubles de la prolifération et/ou de la différenciation épidermique.
L'invention concerne également l'utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1 SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8 SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et notamment qui est représentée en tout ou partie par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7 SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27, et plus particulièrement qui possède la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 ou d'un mélange issu de la protéolyse de l'un de ces polypeptides pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des affections dermatologiques et notamment celles citées précédemment. En particulier, l'invention concerne l'utilisation d'un polypeptide ou d'un mélange tel que décrit précédemment pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à traiter l'ichtyose, le psoriasis ou toute pathologie impliquant une hyperkératose, une parakératose ou ayant une composante inflammatoire. Il peut également s'agir de compositions anti-douleur, de compositions pour traiter certaines maladies de la peau comme l'eczéma, la rosacée, le psoriasis, les lichens, les prurits sévères.
Dans la mesure où les polypeptides de séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 possèdent des homologies de structure importantes avec les protéines rétrovirales, comme il est montré dans les exemples et en figure 4, et notamment avec celles du vims de l'immunodéficience humaine, ils sont également susceptibles de se comporter comme des agents capables de moduler l'infection virale ou d'être modulés par certaines antiprotéases virales.
En conséquence, la présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27, et leurs homologues, notamment est représentée en tout ou partie par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et plus particulièrement qui possède la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 pour la préparation d'une composition antivirale.
Ces compositions peuvent notamment être utiles pour traiter des pathologies épidermiques, associées à un vims de type papillomaviras, HERPES ou HIV.
De même, de telles compositions peuvent être avantageuses pour traiter les effets secondaires liés à une inhibition de la SASPase endogène par les médicaments dirigés contre ces vims ou autres vims pathologiques. Plus particulièrement, cette application spécifique des polypeptides selon l'invention, met à profit l'homologie de structure constatée entre la SASPase et les rétropepsines virales, comme illustrée par les exemples ci-après.
Le traitement implique généralement une application sur la peau du sujet à traiter de la composition telle que décrite précédemment. La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique est choisie parmi les séquences SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16 et SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 à titre d'outil dans une méthode de diagnostic ou de criblage ou pour la préparation d'un outil de diagnostic. Plus précisément, l'invention vise l'utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique est choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues, plus particulièrement d'un polypeptide qui possède la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 ou de ses fragments de protéolyse et de tout peptide synthétique déduit de sa séquence, pour préparer ou purifier, éventuellement à partir d'épiderme, toute molécule, susceptible de moduler son interaction avec d'éventuels ligands.
En outre, l'invention vise l'utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique est choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues, et plus particulièrement d'un polypeptide qui possède la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27, de ses fragments de protéolyse ou de tout peptide synthétique déduit de sa séquence, pour sélectionner de nouvelles molécules antivirales présentant moins d'effets secondaires.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique est choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues, et plus particulièrement d'un polypeptide qui possède la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27, de ses fragments de protéolyse, ou de tout peptide synthétique déduit de sa séquence, pour préparer des antisérams et/ou des anticorps monoclonaux spécifiques, visant notamment à purifier ledit polypeptide et ses fragments ou à moduler son activité.
Par extension, l'invention a également pour objet toute utilisation de ladite séquence pour produire des anticorps ou fragments d'anticorps recombinants, quel que soit le système biologique utilisé pour produire ces derniers.
L'invention a encore pour objet un anticorps poly- ou mono-clonal caractérisé par le fait qu'il reconnaît spécifiquement un polypeptide dont la séquence peptidique est représentée en tout ou partie par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27, et plus particulièrement qui est constituée par la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
L'invention vise également l'utilisation de cet anticorps pour la préparation d'une composition destinée au diagnostic d'une déficience ou d'une surexpression de la protéine SASPase (SEQ ID NO : 5).
Elle concerne également l'utilisation d'un anticorps pour la préparation d'une composition visant à bloquer l'activité et/ou activer la SASPase dans le traitement de pathologies caractérisées par une surexpression et/ou une activité exagérée de la SASPase.
L'anticorps peut être un anticorps préparé par immunisation de toute espèce animale utilisable à cette fin, particulièrement le lapin. L'anticorps peut être préparé par immunisation à l'aide d'un polypeptide de l'invention que celui-ci soit d'origine naturelle ou synthétique ou recombinante de préférence purifié.
On sait qu'une protéine est synthétisée dans les cellules à partir d'une matrice d'acide désoxyribonucléique (ADN) codant pour ladite protéine. On sait également que le code génétique est dégénéré. Ainsi, la séquence d'acides aminés du polypeptide de l'invention peut être issue de différentes séquences d'acide désoxyribonucléique, naturelles ou synthétiques. Par séquence d'acide désoxyribonucléique synthétique, on entend ici toute séquence obtenue chimiquement ou par manipulation génétique.
Lesdites séquences d'acide désoxyribonucléique peuvent être issues de toutes origines possibles à savoir soit animale, en particulier de mammifères et encore plus particulièrement humaine, soit végétale, soit de micro-organismes (viras, phages, bactéries entre autres) ou encore de champignons, sans préjuger du fait qu'elles soient présentes de manière naturelle ou non dans ledit organisme d'origine.
En l'occurrence, l'invention se rapporte aux fragments d'acide désoxyribonucléique isolés et purifiés codant les polypeptides revendiqués.
Au cours de ces travaux, la demanderesse a pu isoler et purifier les fragments d'acide désoxyribonucléique codant les séquences primaires d'acides aminés des polypeptides de séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 à partir de peau humaine.
L'invention a pour objet un fragment d'acide désoxyribonucléique isolé et purifié dont la séquence nucléotidique comprend au moins la séquence nucléotidique codante SEQ ID NO : 24 et en particulier est représentée par la séquence nucléotidique codante SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26 ou
SEQ ID NO : 28.
Les séquences d'acides nucléiques selon l'invention peuvent notamment être utilisées pour préparer des séquences d'acide ribonucléique correspondantes sens ou antisens.
L'invention a également pour objet tout polynucléotide, acide ribonucléique ou désoxyribonucléique, sens ou antisens, notamment « Small interferential RNA », correspondants au moins à la séquence nucléotidique codante SEQ ID NO : 19,
SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26 ou SEQ ID NO : 28. Les séquences d'acides nucléiques de l'invention peuvent également être utilisées pour réaliser des amorces oligonucléotidiques, qui s'hybrident dans des conditions de forte stringence à la séquence SEQ ID NO : 17, SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19,
SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 21, SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24,
SEQ ID NO : 26 et SEQ ID NO : 28. Ces amorces oligonucléotidiques sens et/ou antisens peuvent être utiles pour des réactions de séquençage ou d'amplification spécifique selon la technique dite de PCR
(réaction de polymérisation en chaîne) ou toute autre variante de celle-ci dans le but de clonage, d'identification ou de diagnostic d'un polypeptide représenté par SEQ ID NO : 1,
SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
En particulier, les sondes ou amorces de l'invention sont marquées, préalablement à leur utilisation. Pour cela, plusieurs techniques sont à la portée de l'homme du métier comme par exemple le marquage fluorescent, radioactif, chimioluminescent ou enzymatique.
Les méthodes de diagnostic in vitro dans lesquelles ces sondes nucléotidiques sont mises en œuvre pour la détection de synthèses de séquences nucléiques codant pour un polypeptide selon l'invention sont incluses dans la présente invention.
Le fragment d'ADN correspondant à la séquence SEQ ID NO : 19,
SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26 ou SEQ ID NO : 28 peut également être introduit dans un vecteur d'expression permettant ainsi la synthèse d'une protéine dite recombinante correspondante. L'invention a donc également pour objet un vecteur d'expression recombinant contenant tout ou partie de la séquence nucléotidique codante SEQ ID NO : 19,
SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26 ou SEQ ID NO : 28.
L'invention a également pour objet une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable une séquence d'acide désoxyribonucléique, naturelle ou synthétique, codant pour la séquence primaire d'acides aminés d'un polypeptide conforme à l'invention ou une séquence d'acide ribonucléique sens ou antisens, notamment antisens interférentiel, correspondants à ladite séquence SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26 ou
SEQ ID NO : 28. D'une manière générale, toute composition de l'invention peut être ingérée, injectée ou appliquée sur la peau (sur toute zone cutanée du corps) ou sur les muqueuses
(buccale, jugale, gingivale, génitale, conjonctivale, ...).
De préférence, une composition de l'invention est appliquée sur la peau ou les muqueuses. Selon le mode d'administration considéré, elle peut se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées.
Pour une application topique sur la peau, la composition peut avoir la forme notamment de solutions aqueuses ou huileuses ou de dispersions du type lotion ou sérum, d'émulsions de consistance liquide ou semi-liquide du type lait, obtenues par dispersion d'une phase grasse dans une phase aqueuse (H/E) ou inversement (E/H), ou de suspensions ou émulsions de consistance molle du type crème ou gel aqueux ou anhydres, ou encore de microcapsules ou microparticules, ou de dispersions vésiculaires de type ionique et/ou non ionique ou de mousses. Ces compositions sont préparées selon les méthodes usuelles.
Pour l'injection, la composition peut se présenter sous forme de lotions aqueuses, huileuses ou sous forme de sérums. Pour les yeux, elle peut se présenter sous forme de gouttes et pour l'ingestion, elle peut se présenter sous forme de capsules, de granulés, de sirops ou de comprimés.
Les quantités des différents constituants des compositions selon l'invention sont celles classiquement utilisées dans les domaines considérés.
Dans le domaine de la cosmétique, ces compositions constituent notamment des crèmes de nettoyage, de protection, de traitement ou de soin pour le visage, pour les mains, pour les pieds, pour les grands plis anatomiques ou pour le corps (par exemple crèmes de jour, crèmes de nuit, crèmes de démaquillage, crèmes de fond de teint, crèmes anti-solaires), des fonds de teint fluides, des laits de démaquillage, des laits corporels de protection ou de soin, des laits anti-solaires, des lotions, gels ou mousses pour le soin de la peau, comme des lotions de nettoyage, des lotions anti-solaires, des lotions de bronzage artificiel, des compositions pour le bain, des compositions désodorisantes comprenant un agent bactéricide, des gels ou lotions après-rasage, des crèmes épilatoires, des compositions contre les piqûres d'insectes, des compositions anti-douleur, des compositions pour traiter certaines maladies de la peau comme l'eczéma, la rosasée, le psoriasis, les lichens et les prurits sévères. Les compositions selon l'invention peuvent également consister en des préparations solides constituant des savons ou des pains de nettoyage.
Les compositions peuvent aussi être conditionnées sous forme de composition pour aérosol comprenant également un agent propulseur sous pression.
Une composition selon l'invention peut aussi être une composition pour les soins du cuir chevelu, et notamment un shampoing, une lotion de mise en plis, une lotion traitante, une crème ou un gel coiffant, une composition de teintures (notamment teintures d'oxydation) éventuellement sous forme de shampoings colorants, de lotions restructurantes pour les cheveux, une composition de permanente (notamment une composition pour le premier temps d'une permanente), une lotion ou un gel antichute, un shampoing antiparasitaire, antipelliculaire etc.
Une composition peut aussi être à usage bucco-dentaire, par exemple une pâte dentifrice. Dans ce cas, la composition peut contenir des adjuvants et additifs usuels pour les compositions à usage buccal et notamment des agents tensioactifs, des agents épaississants, des agents humectants, des agents de polissage tels que la silice, divers ingrédients actifs comme les fluorures, en particulier le fluorure de sodium, et éventuellement des agents édulcorants comme le saccharinate de sodium. Lorsque la composition est une émulsion, la proportion de la phase grasse peut varier d'environ 5 % à 80 % en poids, et de préférence d'environ 5 % à 50 % en poids par rapport au poids total de la composition. Les huiles, les cires, les émulsionnants et les co- émulsionnants utilisés dans la composition sous forme d'émulsion sont choisis parmi ceux classiquement utilisés dans le domaine cosmétique. L'émulsionnant et le co-émulsionnant sont présents, dans la composition, en une proportion allant de 0,3 % à 30 % en poids, et de préférence de 0,5 % à 20 % en poids par rapport au poids total de la composition. L' émulsion peut, en outre, contenir des vésicules lipidiques.
Lorsque la composition est une solution ou un gel huileux, la phase grasse peut représenter plus de 90 % du poids total de la composition. De façon connue, la composition cosmétique peut contenir également des adjuvants habituels dans le domaine cosmétique, tels que les gélifiants hydrophiles ou lipophiles, les additifs hydrophiles ou lipophiles, les conservateurs, les antioxydants, les solvants, les parfums, les charges, les filtres, les absorbeurs d'odeurs et les matières colorantes. Les quantités de ces différents adjuvants sont celles classiquement utilisées dans le domaine cosmétique, et par exemple varient d'environ 0,01 % à 10 % du poids total de la composition. Ces adjuvants, selon leur nature, peuvent être introduits dans la phase grasse, dans la phase aqueuse et/ou dans les sphérales lipidiques.
Comme huiles ou cires utilisables dans l'invention, on peut citer les huiles minérales (huile de vaseline), les huiles végétales (fraction liquide du beurre de karité, huile de tournesol), les huiles animales (perhydrosqualène), les huiles de synthèse (huile de Purcellin), les huiles ou cires siliconées (cyclométhicone) et les huiles fluorées (perfluoropolyéthers), les cires d'abeille, de carnauba ou paraffine. On peut ajouter à ces huiles des alcools gras et des acides gras (acide stéarique). Comme émulsionnants utilisables dans l'invention, on peut citer par exemple le stéarate de glycérol, le polysorbate 60 et le mélange de PEG-6/PEG-32/Glycol Stéarate vendu sous la dénomination de Tefose® 63 par la société Gattefosse.
Comme solvants utilisables dans l'invention, on peut citer les alcools inférieurs notamment l'éthanol et l'isopropanol et le propylène glycol.
Comme gélifiants hydrophiles utilisables dans l'invention, on peut citer les polymères carboxyvinyliques (carbomer , les copolymères acryliques tels que les copolymères d'acrylates/alkylacrylates, les polyacrylamides, les polysaccharides tels que l'hydroxypropylcellulose, les gommes naturelles et les argiles, et, comme gélifiants lipophiles, on peut citer les argiles modifiées comme les bentones, les sels métalliques d'acides gras comme les stéarates d'aluminium, la silice hydrophobe, l'éthylcellulose et le polyéthylène.
La composition peut contenir d'autres actifs hydrophiles comme les protéines ou les hydrolysats de protéines, les acides aminés, les polyols, l'urée, l'allantoïne, les sucres et les dérivés de sucre, les vitamines hydrosolubles, les extraits végétaux et les hydroxyacides.
Comme actifs lipophiles, on peut utiliser le rétinol (vitamine A) et ses dérivés, le tocophérol (vitamine E) et ses dérivés, les acides gras essentiels, les céramides, les huiles essentielles, l'acide salicylique et ses dérivés.
Selon l'invention la composition peut associer au moins un autre agent actif destiné notamment à la prévention et/ou au traitement des affections cutanées. Parmi ces agents actifs, on peut citer à titre d'exemple : les agents diminuant la différenciation et/ou la prolifération et/ou la pigmentation cutanée tels que l'acide rétinoïque et ses isomères, le rétinol et ses esters, la vitamine D et ses dérivés, les oestrogènes tels que l'oestradiol, l'acide kojique ou l'hydroquinone ;
- les antibactériens tels que le phosphate de clindamycine, l'érythromycine ou les antibiotiques de la classe des tétracyclines ; - les antiparasitaires, en particulier le métronidazole, le crotamiton ou les pyréthrinoïdes ; les antifongiques, en particulier les composés appartenant à la classe des imidazoles tels que l'éconazole, kétoconazole ou le miconazole ou leurs sels, les composés polyènes, tels que l'amphotéricine B, les composés de la famille des allylamines, tels que la terbinafine, ou encore l'octopirox ; les agents antiviraux tels que l'acyclovir ; les agents anti-inflammatoires stéroïdiens, tels que Phydrocortisone, le valérate de bétaméthasone ou le propionate de clobétasol, ou les agents antiinflammatoires non-stéroïdiens comme par exemple l'ibuprofène et ses sels, le diclofénac et ses sels, l'acide acétylsalicylique, l'acétaminophène ou l'acide glycyrrhizique ; les agents anesthésiques tels que le chlorhydrate de lidocaïne et ses dérivés ; les agents antiprurigineux comme la thénaldine, la triméprazine ou la cyproheptadine ;
- les agents kératolytiques tels que les acides α- et β- hydroxycarboxyliques ou β-cétocarboxyliques, leurs sels, amides ou esters et plus particulièrement les hydroxyacides tels que l'acide glycolique, l'acide lactique, l'acide salicylique, l'acide citrique et de manière générale les acides de f uits, et l'acide n- octanoyl-5-salicylique ; les agents anti-radicaux libres, tels que l'α-tocophérol ou ses esters, les superoxydes dismutases, certains chélatants de métaux ou l'acide ascorbique et ses esters ; les antiséborrhéiques tels que la progestérone ; les antipelliculaires comme l'octopirox ou la pyrithione de zinc ;
- les antiacnéiques comme l'acide rétinoïque ou le peroxyde de benzoyle. Ainsi, selon le mode particulier, la composition selon l'invention comprend également au moins un agent choisi parmi les agents antibactériens, antiparasitaires, antifongiques, antiviraux, anti-inflammatoires, antiprurigineux, anesthésiques, kératolytiques, anti-radicaux libres, anti-séborrhéiques, antipelliculaires, antiacnéiques et/ou les agents diminuant la différenciation et/ou la prolifération et/ou la pigmentation cutanée.
Les exemples figurant ci-après sont présentés à titre illustratif et non limitatif de l'invention.
FIGURES - Figure 1 : Photographie du gel d'électrophorèse 2D obtenu selon l'exemple
I,
- Figure 2 : Représentation de l'influence du pH sur l'activité protéolytique de la SASPase,
- Figure 3 : Analyse de l'activité d'un certain nombre de modulateurs conventionnels vis-à-vis de l'activité protéolytique de la SASPase,
- Figure 4 : Représentation des homologies de structure entre la SASPase et des protéases,
- Figure 5 : Représentation de l'hydrolyse des substrats représentés par les séquences SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 35 par la SASPase.
EXEMPLES
Matériels
Les oligonucléotides utilisés dans les différentes expériences sont présentés ci- après dans le tableau I.
TABLEAU I
Figure imgf000025_0001
Not I-(dT)18 est conçu pour se fixer aux longues séries de A, par exemple les poly A +. Utilisé dans les réactions de transcription inverse, Not I-(dT)18 se fixe au poly A +.
EXEMPLE I - Identification et isolement de la SASPase par électrophorèse bidimensionnelle sur sel et séquencase a) Préparation à partir d'épiderme humain
Tampons :
I : SDS 0,3 % ; tris-HCl 28 mM : tris-base 22 mM 2D : 8M urée ; 2 % (p/v) 3-[(3-cholamidopropyl)diméthylammonio]-l- propane-sulfonate (CHAPS) ; Dithiothréitol 20 mM ; tampon 0,5 % (v/v) rmobiline pH gradient (IPG) pH = 3 9-10 de 18 cm commercialisé par la société Amersham Pharmacia Biotech. Des extraits d'épiderme reconstruit humain sont préparés à partir de
30 nacelles du kit Episkin J13. 15 ml de tampon I sont ajoutés aux 30 épidémies reconstruits et le tout est ottérisé, porté à ébullition pendant 10 mn puis repottérisé. La solution est alors centrifugée à 10.000 g pendant 10 mn. Le surnageant est recueilli et filtré sur membrane 0,22 μm. On obtient ainsi 12 ml de surnageant SI. On ajoute alors au surnageant SI, de l'acétone froide (10 v/2v). Après 20 mn d'incubation, on centrifuge le mélange obtenu à 9.400 g pendant 10 mn. Le surnageant est alors éliminé et le culot est séché à température ambiante pendant 20 mn. Le culot est alors repris dans 2 ml de tampon 2D. On obtient ainsi l'extrait EL La concentration en protéine finale est de 11 mg/ml. b) Gel bidimensionnel La séparation en deux dimensions des protéines contenues dans l'extrait El est réalisée sur un appareil de marque Pharmacia (modèle Multiphor II). La séparation en deux dimensions des protéines a été réalisée selon les recommandations du fournisseur hormis le fait que pour la rééquilibration du gel IPG après migration dans la première direction, l'iodoacétamide a été omis. La coloration des spots, la récupération de ceux-ci et le séquençage des polypeptides qu'ils contenaient ont été réalisés selon les techniques décrites dans Méhul B, Bernard D, Simonetti L, Bernard MA, Schmidt R : Identification and cloning of a new calmodulin-like protein from human epidermis. J Biol Chem 275 : 12841-12347, 2000, ou encore « A practical guide to protein and peptide purification for microsequencing » (Paul Matsudaira éditeur, seconde édition 1993). En figure 1 est représenté le gel d' électrophorèse correspondant.
Les protéines ont été détectées par une coloration à l'amide black. Les spots correspondant à des protéines identifiées par séquençage d'Edman sont localisés avec le nom de ces protéines. Le spot nommé SASPase permet de localiser une forme épidermique de la protéine ayant un PM apparent de 12 kD et un pi de 5,8. Les résultats obtenus ont permis de caractériser les séquences SEQ ID NO : 1,
SEQ ID NO : 2 et SEQ ID NO : 3. EXEMPLE IT - Isolement de l'ADNc codant la SASPase à partir de kératinocvte humain et expression de la SASPase (SEQ ID NO : 5) et de sa forme tronquée SA 1-84) (SEQ ID NO : 4) a) Préparation de L 'ADNc Les ARN totaux de kératinocytes provenant d' épidémie humain reconstmit après 13 jours de culture ont été préparés à l'aide du kit de préparation d'ARN « RNeasy Kit® » et purifiés à l'aide du kit « QIAshredder column® », commercialisé par la société QIAGEN selon les instructions du fournisseur.
Les ADN complémentaires (ADNc) des ARN ainsi préparés ont été synthétisés à l'aide du kit « First Strand cDNA Synthesis® » commercialisé par la société Amersham Pharmacia Biotech selon les instructions du fournisseur en utilisant comme amorce, l'oligonucléotide Not I-(dT)18.
Des fragments d' ADNc codant pour la SASPase complète ainsi obtenus ont été amplifiés par des réactions de polymérisation en chaîne (PCR) dans un appareil à cycles thermiques « Thermocycler® » commercialisé par la société Perkin-Elmer en utilisant une ADN polymérase p u commercialisée par la société Promega et comme amorces, le couple d'oligonucléotides SC140 (SEQ ID NO : 10)/SC131 (SEQ ID NO : 11) et les conditions suivantes : 1 cycle (95°C pendant 2 mn.), 35 cycles (94°C pendant 30 sec, 65°C pendant 30 sec, 72°C pendant 2 mn.) et 1 cycle (72°C pendant 7 mn.). De façon similaire, des fragments d'ADNc codant pour la forme tronquée de la
SASPase (SEQ ID NO : 4), dépourvue des 84 résidus d'acides aminés N-terminaux de la SASPase dite Δ 1-84 ont été amplifiés par PCR en utilisant comme amorces, le couple d'oligonucléotides SC131/SC130 (SEQ ID NO : 11 et SEQ ID NO : 12). b) Construction et expression de la SASPase recombinante (tSASPase) L'ADNc de la SASPase obtenu précédemment est introduit dans le vecteur plasmidique pGex-4T-3 commercialisé par la société Amersham Pharmacia Biotech, par coupure/ligature aux sites de restriction BamH-1/EcoRl. Ce plasmide recombinant qui contient en phase dans le cadre de lecture, la séquence codante de la SASPase (SEQ ID NO : 5) et la séquence codante de la glutathion S-transférase (GST) est alors introduit dans E. coli souche BL21 (DE3) commercialisé par la société Amerscham Pharmacia Biotech. La protéine de fusion recombinante exprimée par les bactéries peut être coupée par la thrombine dans des conditions douces, la construction étant telle que la protéine de fusion obtenue porte un site de coupure par cette protéase.
Le produit d'expression est purifié par chromatographie d'affinité sur colonne gluthation-sépharose.
L'ensemble de ces expériences a été réalisé en appliquant strictement les différents protocoles des fournisseurs.
L'analyse par électrophorèse sur gel SDS-PAGE d'une fraction aliquote du produit d'expression obtenu par mise en oeuvre de la méthode décrite précédemment montre que cette méthode permet l'obtention en quantité satisfaisante de la protéine de fusion recombinante GST-SASPase. De façon similaire, on a obtenu l'expression en quantité satisfaisante de la protéine de fusion recombinante GST-SASPase tronquée Δ 1-84 (SEQ ID NO : 4).
EXEMPLE III - Obtention de la SASPase activée (SEQ ID NO : 6) La protéine de fusion recombinante GST-SASPase Δ 1-84 (SEQ ID NO : 4) éluée de la colonne glutathion sépharose obtenue à l'exemple II, est incubée avec de la thrombine dans du tampon PBS, à pH8 pendant 18 heures à 22°C. Le tampon est échangé par filtration sur gel G25® Biorad contre une solution 100 mM acétate, pH 4,5. Le mélange ainsi obtenu est soumis à une chromatographie cationique en utilisant un gradient de NaCl (0 à 1 M NaCl). Les fractions contenant la GST et la thrombine sont éliminées et la fraction éluée par la solution à 750 mM de NaCl est récupérée. Une analyse par électrophorèse sur gel SDS-PAGE effectuée sur la fraction éluée par la solution de NaCl à 750 mM, contenant une activité caséinolytique (donnée non présentée) montre la présence d'une bande majoritaire qui, par comparaison avec les marqueurs de masses moléculaires présente une masse moléculaire apparente de 12kD et une bande minoritaire qui correspond à la forme tronquée SASPase Δl-84 (SEQ ID NO : 4).
La forme de 12kD correspond à la forme activée de la SASPase. Le séquençage d'Edman indique que le produit isolé correspond à la SASPase activée (SEQ ID NO : 6).
EXEMPLE IV - Obtention de la SASPase activée (SEQ ID NO : 25)
La délétion du site codant pour la séquence FANS sur la forme tronquée de la SASPase (SEQ ID NO : 4) à l'aide du kit Quick Change Site-directed Mutagenesis (Stratagene) et des primers adaptés est effectuée en utilisant comme matrice d'ADN la construction plasmidique de la séquence de la SASPase C27 (SEQ ID NO : 4) dans le vecteur ρGEX-4T3. Une protéine dont la séquence protéique est représentée par SEQ ID NO : 36 est obtenue.
Après incubation à pH 5,00 dans du tampon acétate de cette nouvelle protéine il y a, de façon surprenante, génération d'un fragment de bas poids moléculaire (environ 21 kDa en électrophorèse SDS-PAGE) qui possède au plus la séquence SEQ ID NO : 25 de masse théorique 18731.44.
La SEQ ID NO : 27 de masse théorique 16794.43 est obtenue à partir de la SEQ ID NO : 25 en assumant une activation en C-terminal identique à la forme SEQ ID NO : 6.
EXEMPLE V - Caractérisation de l'activité protéolytique de la protéine
SASPase a) Activité vis-à-vis d'un substrat Cette activité a été démontrée selon le protocole suivant : L'insuline chaîne Beta oxydée (Sigma) est utilisée comme substrat. La concentration est de 50μg dans 1,5 ml de tampon acétate 0,1M pH 5,0. On ajoute 50 μl de SASPase 12 kD purifiée (SEQ ID NO : 6) (environ lmg/ml) par gel filtration pour initialiser l'hydrolyse. Des témoins sans enzyme ou sans substrat sont utilisés comme contrôles. Au cours du temps (lh à 24h à 37° C) des HPLC sont effectuées pour suivre l'hydrolyse. Les pics apparaissant rapidement correspondent aux sites d'hydrolyse principaux et ceux n'apparaissant qu'au bout de 24h aux sites secondaires. Les pics sont collectés après leur fractionnement et séquences en N-terminal (séquençage d'EDMAN, Institut Pasteur).
FVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFF (SEQ ID NO : 15). Site principal : E/A (de type pepsin-like) Sites secondaires : L/Y et Y/L (de type pepsin-like)
Ces résultats montrent que la SASPase activée est capable de dégrader l'insuline. La dénaturation thermique (95° C - 10 mn) de la SASPase abolit son activité de dégradation de l'insuline. Son activité caséinolytique a par ailleurs été démontrée (résultats non présentés). b) Activité autocalvti ue
Dans ce second essai, c'est la protéine GST-SASPase (SEQ ID NO : 4 ) qui est elle-même utilisée comme substrat par autocatalyse.
La GST-SASPase à 3mg/ml dans du tampon phosphate 0,1 M pH 7,0 50 % glycérol est acidifiée rapidement à pH 5,0 par du tampon acétate 1M pH 4,5. A chaque temps d'incubation à 37° C un aliquot est pris et la réaction est bloquée par l'ajout d'un équivalent volume de tampon Laemmli sans DTT. A la fin de la cinétique chaque échantillon est analysé par électrophorèse SDS-PAGE (Gel à 15 % d'acrylamide) démontrant une apparition progressive d'une bande majoritaire migrant à un PM apparent de 12 kD consécutive à la disparition de la protéine de fusion.
Cet essai montre que l'on peut également obtenir directement la SASPase activée (SEQ ID NO : 6) par acidification à pH 3 à 6, de préférence 4 à 6 de la protéine de fusion recombinante GST-rSASPase Δl-84 ou GST-SASPase obtenues à l'exemple I suivi par une étape de purification par filtration sur gel (G75).
Par ailleurs, l'analyse des solutions activées par séquençage Edman et par spectromètre de masse de type QTOF fournit pour la protéase autoactivée trois sites de clivage à peu près équivalents en probabilités : F/A (comme certaines cutané métalloprotéases)
N/S (site de coupure non répertorié)
E/L (uniquement décrit pour la matrilysine qui est capable d'activer l'urokinase et les MMP 1, 2 et 9).
EXEMPLE VI - Mutations divisées sur le site actif de la SASPase prouvant son appartenance à la famille des protéases à acide aspartique.
Le kit Quick Change Site-directed Mutagenesis (Stratagene) est utilisé pour la réalisation des mutants de la SASPase.
La séquence de la SASPase SEQ ID NO : 5 est modifiée au niveau de l'acide aspartique n° 212, soit son site actif potentiel. Pour ce faire, deux oligonucléotides sont synthétisés de telle sorte que l'acide aminé 212 soit substitué soit en alanine (mutant A/D), soit en acide glutamique (mutant E/D). Une amplification par PCR est réalisée avec chaque couple d'oligonucléotides mutés, la construction plasmidique de la séquence de la SASPase C27 dans le vecteur pGEX-4T3 est utilisée comme matrice d'ADN.
Des bactéries compétentes (XL1 blue) sont ensuite transformées avec chaque produit de PCR. Plusieurs clones sont amplifiés et séquences afin de vérifier la présence de la mutation souhaitée et seulement de celle-ci.
Autoclivase de la SASPase C27 et de ses mutants :
Une production des protéines recombinantes mutées est réalisée selon le même protocole que pour la forme sauvage, SASPase C27; (SEQ ID NO : 4). Chaque protéine recombinante produite sous forme de protéine de fusion est ensuite incubée dans un tampon acétate 1M, pH 4;5 à 37 °C. Des prélèvements au cours du temps sont réalisés et analysés par SDS-PAGE.
On observe une diminution au cours du temps de la forme entière GST- SASPase C27, ce qui démontre un autoclivage et par conséquent une autoactivation ; de nombreuses bandes de poids moléculaires inférieurs apparaissent. Les formes mutées (A/D) et (E/D), quant à elles, ne s'autoactivent pas.
Cette expérience confirme l'implication de l'acide aspartique n° 212 dans le site actif de la SASPase.
EXEMPLE VII - Analyse de l'expression de la SASPase par Northern Blot
RT-PCR dans des tissus humains et dans des kératinocytes.
Les analyses ont été effectuées par Northern Blot, en utilisant des membranes commerciales polyA + ARN blot (Ambion®) selon le protocole décrit par le fabricant, et par RT-PCR en utilisant une collection d'ADNc des membranes « rapid-scan® » humaines commercialisées par la société OriGene Technologies, Inc.
L'analyse par Northern Blot a été effectuée en utilisant comme sonde l'ADNc codant la forme (tronquée Δl-84) de la SASPase (SEQ ID NO : 4) isolée à partir du plasmide recombinant préparé à l'exemple II et à l'aide d'une membrane contenant différents échantillons d'ARN. La PCR est effectuée en utilisant la Taq polymérase commercialisée par la société Promega, comme amorces, le couple d'oligonucléotides SCI 34 (SEQ ID NO : 13)/SC135 (SEQ ID NO : 14) dans les conditions suivantes : 1 cycle de 3 mn. à 94°C,
25 à 30 cycles (94°C pendant 30 sec, 53°C pendant 30 sec, 72°C pendant 60 sec), et
1 cycle à 72°C pendant 5 mn. Les produits de PCR résultants sont visualisés par coloration au bromure d'éthidium après séparation sur gel d'agarose 2 % (poids/volume).
Des résultats, il ressort que la SASPase est sensiblement exprimée dans la quasi-totalité des tissus testés à un niveau faible dans les foie foetal, cerveau fœtal, ovaire, glande surrénale, thyroïde, placenta, testicules, estomac, muscle, poumon, foie, rate et cœur, et encore plus faible dans la moelle osseuse, le pancréas, la salive, et l'intestin grêle. Cette expression est en revanche significative dans le cerveau et particulièrement très élevée dans la peau.
EXEMPLE VIII - Olisomérisation de la SASPase utilisant un réactif de réticulation
Le protocole utilisé s'inspire de la technique décrite dans T.D. Meek et al. ; Proc, Natl. Acad. Sci. USA vol. 86, pages 1841-1845, March 1989.
Une étude de la réticulation utilisant du BS3 (Pierce) est effectuée sur de la SASPase activée (SEQ ID NO : 6), obtenue par acidification et purification par chromatographie d'exclusion (gel filtration) de la protéine de fusion recombinante GST- SASPase Δ 1-84.
A la SASPase activée (SEQ ID NO : 6) obtenue à l'exemple III, placée dans de la glace, on ajoute 1 μg de BS3 dans 60 μl de tampon phosphate 50 mM, pH 7, contenant 150 mM NaCl, 0,1 % TX100, 5 mM EDTA. On prépare également un échantillon témoin exempt de BS3. Après 90 mn, on introduit dans les milieux réactionnels 2 μl de Tris-HCl 1 M, pH 8, pour stopper la réaction. On analyse ensuite les produits obtenus par gel filtration sur gel, et par électrophorèse SDS-PAGE.
La SASPase activée incubée avec du BS3 forme un complexe multimérique stable qui par gel filtration sur gel, se sépare en trois pics majeurs. Trois bandes distinctes sont également observables sur gel après électrophorèse SDS-PAGE dont les masses moléculaires apparentes, déterminées par comparaison avec les marqueurs des masses moléculaires sont respectivement de 12kD, comprises entre 10-14kD, 30-45kD et 60-100kD.
EXEMPLE IX - Influence du pH ur l'activité protéolvtique de SASPase
10 μl de protéines de fusion GST-SASPase Δ 1-84 (environ 3 mg/ml) obtenus à l'exemple II sont incubés dans 200 μl de tampon acétate 0,1 M, ajusté à différents pH en présence du substrat caséine commercialisé sous la dénomination de Enzchek par la société Molecular Probes et utilisé aux concentrations préconisées par le fournisseur.
Trois répétitions sont effectuées pour chaque essai.
Après 20 heures d'incubation à 37°C, la fluorescence est mesurée sur un lecteur de plaque commercialisé sous la dénomination de Biolumin ® par la société Molecular Probes en utilisant le couple excitation émission : 485/535 nm. Les résultats sont présentés en figure 2.
Ces résultats montrent que dans les conditions expérimentales retenues, l'activité enzymatique de la SASPase est dépendante du pH et présente un optimum à pH 5. Par ailleurs, des essais non présentés en tampon phosphate 0,1 M de pH 6 à 7,5 ne montrent qu'une faible activité résiduelle.
L'influence du pH sur l'auto-activation est également réalisée et montre une optimisation pour des pH entre 3 et 6,9 et de préférence entre 4 et 6.
EXEMPLE X - Etude de l'effet de différents inhibiteurs de la famille des protéases à acide aspartique sur l'activité caséinolytique de la SASPase activée (SEQ ID NO : 6)
10 μl de SASPase activée (SEQ ID NO : 6) auto-activés (environ 3 mg/ml), sont ajoutés dans 200 μl de tampon acétate 0,1 M, pH 5,5, contenant 20 μl de DMSO avec des inhibiteurs de rétropepsines. Un essai témoin est effectué dans les mêmes conditions en absence d'inhibiteur.
On pré-incube le mélange pendant 1 heure à 4°C, puis on ajoute le substrat, de la caséine commercialisée sous la dénomination Enzchzek ®par la société Molecular Probes en quantité suffisante pour obtenir la concentration préconisée par le fournisseur, les solutions ayant été préalablement réchauffées à 37°C.
Le suivi de l'hydrolyse de la caséine est effectué par mesure de la fluorescence sur un lecteur de plaques Biolumin ® commercialisé par la société Molecular Probes en utilisant le couple excitation/émission : 485/535 nm.
Les résultats obtenus sont présentés en figure 3. On constate que les cinétiques d'hydrolyse de la caséine, en présence des inhibiteurs de rétropepsines RPl et RP2 sont plus faibles que le témoin. L'activité de la SASPase est donc inhibée par ces inhibiteurs. - RPl correspond à la séquence Ac-Leu-Val-Phe-aldéhyde et est commercialisé par Bachem sous la référence N 1395.0005,
- RP2 correspond à la séquence Ac-Leu-Leu-Met-aldéhyde et est commercialisé par Bachem sous la référence N 1315.0005 et
- RP3 correspond à la séquence Ac-Leu-Leu-Nle-aldéhyde et est commercialisé par Bachem sous la référence N 1320.0005.
On constate en outre que la cinétique d'hydrolyse de la caséine, en présence de l'inhibiteur de rétropepsine RP3, est significativement plus élevée que celle obtenue dans les conditions témoins. L'activité de la SASPase semble donc être stimulée par cet inhibiteur.
EXEMPLE XI - Etude de l'effet de la SASPase activée (SEQ ID NO : 6) sur la dégradation de la cornéodesmosine extraite de stratum corneum humain. a) Principe
La cornéodesmosine est un marqueur de la desquamation car elle intervient dans la cohésion coméocytaire au niveau des coméodesmosomes. Plus la protéine est dégradée, plus le détachement des cornéocytes est significatif. La dégradation de la cornéodesmosine est donc une étape clé de la desquamation.
Le test utilisé dans cette étude consiste donc à suivre cette dégradation en présence de la substance à tester. b) Préparation de l'échantillon
Des poudres acétoniques sont préparées à partir de stripping vernis (Méhul B, Bernard D, Simonetti L, Bernard MA, Schmidt R : Identification and cloning of a new calmodulin-like protein from human epidermis. J Biol Chem 275 : 12841-12347, 2000) prélevés sur des bas de jambes de personnes volontaires à peau sèche. Des fractions aliquotes de 2 mg de poudre de stratum corneum sont introduites séparément dans des tubes Eppendorfs, puis immergées dans les solutions à tester à raison de 100 μl/mg. Les solutions sont préparées en tampon acétate pH 5. Un témoin sans protéase est préparé en parallèle afin d'évaluer la dégradation naturelle de la cornéodesmosine. Pour chaque test, on prépare trois échantillons. Les échantillons, essais et témoin sont incubés à 30°C sous agitation pendant 24 heures. c) Extraction, séparation et détection des protéines. Les protéines sont extraites avec du tampon Laemmli complet. Elles sont dosées par la méthode de Bradford (kit Bio-Rad®). La concentration de chaque échantillon est ajustée pour permettre la comparaison des échantillons. Les polypeptides sont séparés par électrophorèse SDS-PAGE sur gel d'acrylamide 15 %, puis transférés sur membrane de PVDF. Une immuno-détection par une solution d'anticorps anti-cornéodesmosine utilisée au 1/12500 et d'anticorps secondaires couplés à la peroxydase permet de révéler la cornéodesmosine. Les bandes détectées par chimio-luminescence sont quantifiées à l'aide du logiciel Quantity One ® de la société Biorad. Les membranes sont ensuite colorées à l'amido-black, puis scannées. En outre, les kératines qui sont des protéines majoritaires des extraits cornéocytaires sont quantifiées afin de vérifier l'ajustement à 0,6 mg/ml de tous les échantillons.
Un témoin positif de dégradation (+) est préparé en utilisant 5 mM d'EDTA. Un essai est réalisé en présence de 60 μg de SASPase activée. Un témoin négatif représente la dégradation naturelle de la cornéodesmosine dans les conditions opératoires du test. d) Résultats
TABLEAU II
Figure imgf000035_0001
On constate une diminution significative du pourcentage de cornéodesmosine résiduelle lorsque les poudres acétoniques de stratum corneum sont mises en contact avec la SASPase activée (SEQ ID NO : 6) par rapport aux témoins. EXEMPLE XII - Recherche de substrat pour la mise en évidence de l'activité SASPase :
On utilise le substrat peptidique considéré (SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO :32, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 ou SEQ ID NO : 35) quenché à l'aide du système fluorescent Abz/(N02)Tyr à raison de lOOμM dans DMSO puis on ajoute lOμL de cette solution mère de substrat pour lOOμl de tampon acétate 0,1 M pH 5,00.
On ajoute 10 μg de GST-C27 (protéine de fusion à 1 mg/ml dans du PBS). Incubation 37°C. La lecture de fluorescence est réalisée à 340/450nm sur lecteur de plaques de type Biolumin à différents temps. Les résultats sont présentés en figure 5.
On note que le peptide naturel (wt) est bien hydrolyse par la SASPase mais des substitutions d'acides aminés dans la séquence de ce peptide peuvent générer des substrats pour lesquels la SASPase possède plus d'affinité.
Une recherche (base MEROPS) sur les différentes protéases capables de couper les liaisons peptidiques hydrolysées ou hydrolysables par la SASPase (combinaisons des différents acides aminés trouvés en position PI avec les acides aminés trouvés en position P2 des séquences hydrolysées par la SASPase ) font apparaître, en parallèle avec des protéases de type rétroviral, des protéases qui ont été décrites comme importantes pour peau : la SCCE (desquamation, conversion de la proILlB) les MMP1, 2 et 9 (cicatrisation...), La mu Calpaïn (maturation de l'enveloppe comée, processing de la filaggrine), la thrombine (activation de « Protéase Activated Receptors »), les convertases 1,2,4,5 et 7 (processing de la filaggrine, régulation de la différentiation...).
Ces constatations renforcent l'idée d'un rôle important de la SASPase dans la physiologie cutanée.

Claims

REVENDICATIONS
1. Composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins un polypeptide naturel ou synthétique purifié dont la séquence peptidique est représentée en tout ou partie par au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8 ; SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues.
2. Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit polypeptide possède une séquence peptidique représentée par SEQ ID NO : 5, SEQ ID
NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
3. Composition selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que ledit polypeptide se présente sous une forme multimère et de préférence dimère.
4. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ledit polypeptide a subi une ou plusieurs modifications post-traductionnelles.
5. Composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ledit polypeptide se présente sous la forme d'un polypeptide de séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 fusionné avec un autre polypeptide, un agent de ciblage hydrophile ou hydrophobe ou un précurseur de bioconversion.
6. Composition cosmétique ou pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins un mélange de polypeptides issu de la protéolyse d'un polypeptide dont la séquence est représentée en tout ou partie par la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 ou leurs homologues et plus particulièrement dont la séquence est représentée par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
7. Procédé de traitement cosmétique destiné à lutter contre les troubles cutanés liés à un dysfonctionnement de la prolifération et/ou de la différenciation cellulaire, caractérisé en ce que l'on applique sur la peau, les muqueuses et/ou les fibres kératiniques une composition cosmétique comprenant au moins un polypeptide dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues ou un mélange issu de la protéolyse dudit polypeptide.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit polypeptide possède la séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16,
SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
9. Procédé de traitement cosmétique selon la revendication 7 ou 8, caractérisé en ce qu'il vise à traiter les peaux sèches, l'hyperkératose, la parakératose, les troubles de la sébogénèse, les néoplasies et/ou les signes de vieillissement cutané.
10. Utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues et plus particulièrement dont ladite séquence peptidique est représentée en tout ou partie par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27, ou d'un mélange issu de la protéolyse dudit polypeptide pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement des infections dermatologiques.
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique est destinée à traiter l'ichtyose, le psoriasis, l'eczéma, la rosacée, les lichens, les prarits, ou toutes pathologies impliquant une hyperkératose, une parakératose ou ayant une composante inflammatoire.
12. Utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues pour la préparation d'une composition antivirale.
13. Utilisation selon la revendication 12, caractérisée en ce que ladite séquence peptidique est représentée par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
14. Utilisation d'un composé chimique ou biologique pour la préparation d'une composition destinée à interagir avec ou à moduler l'activité biologique d'un polypeptide dont la séquence peptidique comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues et plus particulièrement dont la séquence peptidique est représentée par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
15. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que le composé est une protéase présentant un site spécifique de reconnaissance et/ou de fixation et de coupure au sein de la séquence dudit polypeptide.
16. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que le composé est un inhibiteur choisi de préférence parmi les inhibiteurs de rétropepsines.
17. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que le composé est un activateur.
18. Utilisation selon la revendication 14, caractérisée en ce que le composé est un anticorps spécifique dudit polypeptide.
19. Utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique est représentée par au moins une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 31, SEQ ID NO : 32, SEQ ID NO : 33, SEQ ID NO : 34 et SEQ ID NO : 35, pour préparer une composition destinée à moduler l'activité de la SASPase.
20. Composition cosmétique ou pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle comprend dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins une séquence nucléotidique codant un polypeptide tel que défini en revendications 1 à 5, ou une séquence sens, antisens ou antisens interférentiel correspondant à ladite séquence nucléotidique.
21. Composition selon la revendication 20, caractérisée en ce que ladite séquence nucléotidique est constituée de la séquence nucléotidique codante
SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26 ou SEQ ID NO : 28.
22. Utilisation d'un composé biologique ou chimique pour la préparation d'une composition destinée à inhiber la dimérisation d'un polypeptide de séquence SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
23. Utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique est choisie parmi
SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues à titre d'outil de criblage.
24. Utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique est choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues pour la préparation d'un outil de diagnostic
25. Utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique est choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues et plus particulièrement d'un polypeptide dont la séquence est représentée par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27, de ses fragments de protéolyse, ou de tout peptide synthétique déduit de la séquence dudit polypeptide, pour préparer ou purifier, éventuellement à partir d'épiderme, toute molécule, susceptible de moduler son interaction avec d'éventuels ligands.
26. Utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique est choisie parmi
SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO : 27 et leurs homologues et plus particulièrement d'un polypeptide dont la séquence est représentée par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27, de ses fragments de protéolyse, ou de tout peptide synthétique déduit de la séquence dudit polypeptide, pour sélectionner de nouvelles molécules antivirales présentant moins d'effets secondaires.
27. Utilisation d'un polypeptide dont la séquence peptidique est choisie parmi SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 et SEQ ID NO 27 et leurs homologues et plus particulièrement d'un polypeptide dont la séquence peptidique est représentée par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ H) NO : 7, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27, de ses fragments de protéolyse, de tout peptide synthétique déduit de la séquence dudit polypeptide, pour préparer des antisérums et/ou des anticorps monoclonaux spécifiques, visant notamment à purifier ledit polypeptide et ses fragments ou à moduler son activité.
28. Polypeptide isolé et purifié appartenant à la famille des protéases à acide aspartique, caractérisé en ce qu'il possède une séquence peptidique représentée par SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
29. Polypeptide selon la revendication 28, caractérisé en ce qu'il possède une masse moléculaire apparente comprise entre 5 et 30 kD, plus particulièrement entre 9 et 15 kD et notamment entre 11 et 14 kD.
30. Polypeptide selon la revendication 28 ou 29, caractérisé en ce qu'il se présente sous une forme multimère et de préférence dimère.
31. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 28 à 30, caractérisé en ce qu'il possède un point isoélectrique théorique compris entre 3 et 9.
32. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 28 à 31, caractérisé en ce qu'il est d'origine naturelle et purifié à partir de tissus de mammifères.
33. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 28 à 32, caractérisé en ce qu'il est purifié à partir de peau humaine et plus particulièrement à partir d'épiderme humain.
34. Polypeptide selon l'une quelconque des revendications 28 à 33, caractérisé en ce qu'il a subi une ou plusieurs modifications post-traductionnelles. . ^'
35. Polypeptide selon la revendication 28 ou l'une des revendications 30 à 34, caractérisé en ce qu'il se présente sous la forme d'un polypeptide de séquence SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 fusionné avec un autre polypeptide, un agent de ciblage hydrophile ou hydrophobe ou un précurseur de bioconversion.
36. Anticorps poly- ou mono-clonal, caractérisé en ce qu'il reconnaît spécifiquement un polypeptide dont la séquence peptidique est représentée par SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27.
37. Utilisation d'un anticorps tel que défini dans la revendication 36 pour la fabrication d'une composition destinée au diagnostic d'une déficience ou d'une surexpression de la protéine SASPase .
38. Utilisation d'un anticorps tel que défini dans la revendication 36 pour la fabrication d'une composition destinée à bloquer l'activité et/ou l'activation de la SASPase dans le traitement de pathologies caractérisées par une surexpression et/ou une activité exagérée de la SASPase.
39. Fragment d'acide désoxyribonucléique isolé et purifié codant un polypeptide tel que défini dans l'une des revendications 28 à 35.
40. Fragment d'acide désoxyribonucléique isolé et purifié constitué de la séquence nucléotidique codante SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26 ou SEQ ID NO : 28.
41. Vecteur d'expression recombinant contenant tout ou partie de la séquence nucléotidique codante SEQ ID NO : 20, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26 ou SEQ ID NO : 28.
42. Utilisation d'au moins une séquence d'acide désoxyribonucléique telle que définie en revendications 39 ou 40 pour préparer une séquence d'acide ribonucléique sens, antisens ou antisens interférentiel.
43. Acide ribonucléique, sens, antisens ou antisens interférentiel correspondant au moins à la séquence nucléotidique codante SEQ ED NO : 20, SEQ ID NO : 24, SEQ ID NO : 26 ou SEQ ID NO : 28.
44. Utilisation d'au moins une séquence sens ou antisens telle que définie en revendication 43 à des fins de clonage ou d'identification d'un polypeptide de séquence
SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 ou de leurs homologues.
45. Utilisation d'au moins une séquence sens ou antisens telle que définie en revendication 43 pour la préparation d'une composition destinée au diagnostic d'un polypeptide de séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 16, SEQ ID NO : 25 ou SEQ ID NO : 27 ou de leurs homologues.
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