WO2004004760A1

WO2004004760A1 - ネコ伝染性腹膜炎ワクチン

Info

Publication number: WO2004004760A1
Application number: PCT/JP2003/008524
Authority: WO
Inventors: Kenji Motokawa; Hajime Kusuhara; Hiroyuki Koyama; Tsutomu Hohdatsu; Setsuo Arai
Original assignee: The Kitasato Institute
Priority date: 2002-07-04
Filing date: 2003-07-04
Publication date: 2004-01-15
Also published as: JP4242607B2; US20120107390A1; AU2003246274B8; EP1543838A1; EP1543838A4; JP2004035494A; TWI329515B; US20060083755A1; DE60334226D1; CA2491726C; AU2003246274A1; CA2491726A1; TW200402306A; AU2003246274B2; EP1543838B1

Abstract

　特定の構造を有するＮ蛋白質、またはその断片を抗原として用いた、ＦＩＰのワクチンが提供された。本発明における望ましい抗原は、特定のＩ型ウイルス株(ＫＵ−２)に由来するＮ蛋白質である。このＮ蛋白質を含むワクチンは、幅広いFIPVに対して予防効果を与える。また、Ｎ蛋白質は感染増強エピトープを含まないので、安全性が高い。更に、実際のＦＩＰの原因の70%以上を占めるＩ型ウイルスに対する予防効果を達成することができる。

Description

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ネコ伝染性腹膜炎ワクチン技術分野

本発明はネコ伝染性腹膜炎ウィルス（fel ine infect ious per i toni t is virus ;FI PV)の感染によって起こるネコ伝染性腹膜炎 (FIP)の予防、あるいは治療に関する。背景技術

FIPはウィルス感染と免疫機構が関与した複雑な疾患である。 FIPは、腹腔内化膿性肉芽腫と腹水貯留を特徴とする慢性 ·進行性疾患である。腹腔内化膿性肉芽腫は、灰白質で隆起した結節を形成する。その病変は腹腔内に限らず全身の臓器に及ぶ。 FIPの病型は臨床 ·病理学的に腹水型（滲出型）と乾燥型（非滲出型）に分けられる。前者は線維素性腹膜炎とこれに由来する腹水の貯留を特徴とする。また後者は、各種臓器における多発性化膿性肉芽腫形成を特徴とする。しかし、両者は完全に独立しているわけではなく、共存する例も少なくない。感染後どちらの病型に進行するかは感染ネコの細胞性免疫の強さにより決定されると考えられている。

FIPVは大きさが約 100〜150服のエンベロープを有するウィルスで、コロナウイルス科のコロナウィルス属に属する。エンベロープの表面には、長さ約 20nmで先端部分が大きくなつているいわゆる王冠に似た突起物（spike)を持っている。ウイルスのゲノムは 1分子の 1本鎖 RNAからなり、ウィルスは細胞質で増殖し、小胞体を通って出芽、成熟する。ウィルスは、次の 3つの主要構造蛋白質から構成されている。

匿 leocaps id (N) protein

transmembrane (M) protein peplomer (S) protein

FIPVは、増殖の遅い I型と増殖の早い I I型に分けられる。 F I P V I型に分類されるウィルス間では、その遺伝子塩基配列にバリエーションがあることが報告されているが、 F I P V I I型に分類されるウィルスではそういった報告はない。一方で、ネコの FIPV感染の約 7 0 %は I型のウィルスによると報告されている（宝達ら， Arch. Vi rol . 117, 85， 1991)。

FIPの発病機序については、これまで多くの感染実験やウィルス学的、免疫学的研究がなされてきた。その結果、 FIPV感染においては、免疫システムが症状の重篤化にも関与していることがわかっている。

マクロファージは、一般にウィルス感染症に対する非特異的な生体防御因子の 1つとして重要な役割を果たす。しかし一方では、マクロファージの生体防御機構が感染を増強する場合のあることが明らかにされている。たとえば FIPを含め、いくつかのウィルス感染症においては、抗体が感染を増強する現象が確認されている。すなわち、特異抗体と結合したウィルスが Fcレセプターを介してマクロファージに侵入し、その結果かえって感染が促進され、症状が悪化することが報告されている。抗体と Fcレセプタ一を介するマクロファージへのウィルスの進入は、マクロファ一ジ上のウィルスレセプ夕一を必要としない。

この現象は、抗体依存性感染増強作用（Ant ibody-dependent Enhancement of In fec t ion)と呼ばれる。 FIPVもマクロファ一ジに感染するウィルスである。そして，上記の抗体依存性感染増強作用で F I P発症が増強されていることが報告されている従来のワクチン開発戦略は、主として中和抗体の誘導を目的としてきた。このようなワクチン開発戦略は、 FIPに対してそのまま応用することは難しいと考えられる。

しかし FIPワクチンの研究開発は、これまで主に従来のワクチン開発の戦略に基づいて進められてきた。その際、 FIPにおける抗体依存性感染増強作用のメカニズムを十分考慮しない場合には、必ずしも望ましい結果を得られなかった。以下に，これまでのワクチン開発の試みについて説明する。

これまでに FIPVの不活化ワクチン、 FIPVを弱毒化した生ワクチンなど、さまざまなワクチンについてその感染防御効果が調べられてきた。しかし、いずれも十分な効果が得られず、逆に感染を早める結果となった。

1980年 Pedersenと Boyleは、あらかじめ FIPV抗体が陽性の子ネコ、あるいは抗体陽性ネコの血清またはその精製 IgGを受身免疫した子ネコは、強毒 FIPVを腹腔内接種することによって、抗体陰性の子ネコよりもより急速に重篤な症状が起こることを示した。 (Pedersen NC， Boyle JF. Immunologic phenomena in the ef fusive form of fel ine infect ious peri toni t is. Am J Vet Res. 1980 Jun;41 (6) : 868-7 6. )

1981年 Wei ssと Scot tらも、同様に、感染ネコの血清を SPFの子ネコに受身免疫し、腹腔内にウィルスを接種した。彼らの結果も、抗体を受身免疫したネコで、 FIPV 感染が早まり接種後 24時間で体温が上昇し、それ以後死亡するまで持続した。その生存期間は 9〜 10日で、対照の抗体陰性ネコの 14〜 52日より明らかに短かつた (W eiss RC, Scot t FW. Ant ibody-mediated enhancement of disease in fel ine inf ect ious peri toni t is : comparisons wi th dengue hemorrhagic fever. Comp Immu nol Microbiol Infec t Dis. 1981 ;4 (2) : 175-89. ) ₀

その後、抗体依存性の感染増強作用は他の研究者によっても確認された。現在では抗体による FIPV感染の増強作用が、 FIPのワクチン開発の大きな障害であることは、多くの研究者の間で広く認識されている。

既に述べたように、 FIPVは N、 M、および Sの 3つの主要構造蛋白質から構成されている。これまでの研究成果から、中和ェピトープと感染増強のェピトープは S 蛋白質上に存在し、しかも、両者は密接に関連していることが明らかとなっている。従来のワクチン開発戦略においては、 S蛋白質を抗原とするワクチンの開発が最初に試みられている。しかし、 S蛋白質を利用した感染防御ワクチンは、同時に感染増強のェピトープを含むことになり、常に感染増強の危険性をともなうことになる。

事実、 I I型ウィルスの中和に関する抗原決定基をコードする遺伝子 (S蛋白質）をワクシニアウィルスに組み込んだ組換えワクチンが作製されたが、感染は防御されず、発症が早まる結果となっている（Vennema H， de Groot RJ, Harbour DA, Dalderup M, Gruf fydd-Jones T， Horzinek MC, Spaan WJ. Early death af te r feline infectious peritonitis virus challenge due to recombinant vaccin ia virus immunization. J Virol. 1990 Mar ;64 (3) :1407 - 9.)。

一方、アメリカの研究グループによって、温度感受性株の生ウィルスワクチンが開発された。このワクチンは、温度感受性株を鼻腔内に接種し局所の免疫を高めることを目的としている（Gerber JD, Ingersoll JD, Gas t AM, Christianson K K, Selzer NL, Landon RM, Pfeiffer NE, Sharpee RL, Beckenhauer WH. Protect ion against feline infectious peritonitis by intranasal Inoculation of a temperature-sensitive FIPV vaccine. Vaccine. 1990 Dec;8(6) :536 - 42.)。おそらく、温度感受性株は高温では増殖できないため、体内に侵入しても、その増殖部位が限局されるものと予測される。

このワクチンはアメリカ、ヨーロッパですでに臨床応用されている。しかし、その効果および安全性の評価は、研究者によって異なっている。ヮクチネーションしたネコを実験的に攻撃した場合、その攻撃ウィルス量によっては、逆に感染が増強する場合もあることが報告されている（Scott，FW.， Corapi, WV. , and Olse n, CW. Evaluation of the safety and efficacy of Pri ucell-FIP vaccine. Fe line Hlt Top. 1992, 7: 6-8.； Scott, FW., Corapi, WV. , and Olsen, CW. Inde pendent evaluation of a modified live FIPV vaccine under experimental con ditions. Feline Practice 1995, 23: 74—76.)。

また、 M蛋白質や N蛋白質をコードする遺伝子をワクシニアウィルスやボックスウィルスに組み込んだ組換えワクチンが FIP発症に対してある程度有効であることが報告されている（Vennema H, de Groot RJ, Harbour DA, Horzinek MC, Spa an WJ. Primary structure of the membrane and nucleocapsid protein genes o f feline infectious peritonitis virus and immunogenic ity of recombinant v accinia viruses in kittens. Virology. 1991 Mar;181(l) :327-35. ； Wasmoen T L, Kadakia NP, Unfer RC, Fickbohm BL, Cook CP, C u HJ， Acree WM.Protectio n of cats from infectious peritonitis by vaccination with a recombinant r accoon poxvirus expressing the nucleocapsid gene of feline infectious per itonitis virus. Adv Exp Med Biol. 1995;380:221-8.)。しかし、このワクチンは組換え生ワクチンであるため、その野外応用には安全性を含め多くの問題をクリア一しなければならない。

このように現時点では、 FIPV感染の防御効果と安全性に関して十分に満足し得るワクチンは開発されていない。発明の開示

本発明は、 FIPの感染予防、あるいは治療に有用なワクチンの提供を課題とする < たとえば、従来のウィルス感染症に対するワクチン開発の一般的方法から類推して、 FIP感染防御のメカニズムとして 2つの有力な標的が考えられる。まず、 FI PVは経口 '経鼻感染後、粘膜のバリア一を通過し、マクロファージを介して全身へ拡がっていく。粘膜バリア一の通過および FIP症状の発現はウィルスの感染量および病原性の強さにより異なる。そこで FIPV感染防御の第 1の標的は粘膜でのゥィルス増殖と組織への侵入をおさえることである。

次に、粘膜のバリアーを通過し、食細胞内に持続感染した FIPVを増殖させないためには、細胞性免疫を高めることが必要である。つまりウィルス感染細胞を免疫システムによって排除することができれば理想的である。これが FIPV感染防御の第 2の標的である。事実 FIPVに感染耐過したネコは、細胞性免疫が高まっていることが報告されている。

このような背景のもとで、本発明者らは、ウィルス構成蛋白質のうち感染増強ェピトープを含まない N蛋白質に注目した。しかし一般に、 N蛋白質はウィルス粒子や感染細胞の表面には存在しないため、 N蛋白質のみの免疫では感染増強を起こさない反面、感染を完全に防御することは難しいと推測された。実際、 I I型 F IPVの N蛋白質をコードする遺伝子を枠にシニアウィルスで発現させた組み換え体がワクチンに利用された報告がある（US 5811104)。しかしこの報告ではその感染予防効果を裏付けるデータは得られていない。したがってこれらの結果は、 F I P V I I型の N蛋白質を抗原として用いても、感染あるいは発症の予防効果に優れたワクチンの開発が困難であることを示していた。

一方、 I型の N蛋白質を利用したワクチンについては報告がない。その要因としては次のような理由が考えられる。まず I型の F I P Vは、組織培養による増殖速度が遅いため扱いにくい実験材料であると言える。さらに I型の F I P Vは、ネコに対する病原性が I I型よりも低く F I P発症率が低い。これらの理由による I型の FIPVの感染実験のデザインの難しさなどから、 FIPワクチンの研究において F I P V I型を材料とすることに困難を伴うためである。しかし、これらの理由によって、 F I P V I型に有効なワクチンの開発の重要性は否定されない。というのは、実際の臨床現場で F I Pの 7 0 %以上は I型ウィルスの感染が原因となっており、 I I型のウィルスが分離される割合は低いのである。

したがって本発明者らは、実用上の効果を期待できるワクチンを得るためには、 I型に由来する抗原の使用が重要な条件となると考えた。そして、ワクチン原料として利用しうる、 I型ウィルス由来抗原について探索を続けた。その結果本発明者らは、 I型のウィルスに由来する特定のアミノ酸配列を有する N蛋白質を抗原とするワクチンが、幅広い FIPVに対する予防効果を与えうることを見出し本発明を完成した。すなわち本発明は、以下に示す F I Pの予防あるいは治療用ワクチン、予防あるいは治療方法に関する。更に本発明は、 F I Pの検査方法と検査用試薬にも関する。

〔 1〕以下の a) - e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列を含む蛋白質を有効成分として含有するネコ伝染性腹膜炎ゥィルスの治療および Zまたは予防用ワクチン。

a) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、 b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、

c) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域の塩基配列と 93%以上の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、

d) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と 93%以上の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、および

e) a) -d)に記載されたポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるアミノ酸配列から選択された、 4 5アミノ酸残基以上からなる連続するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。

〔 2〕以下の a) -e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有効成分として含有するネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および Zまたは予防用ワクチン。

a) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコ一ド領域を含むポリヌクレオチド、 b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、

e) a) -d)に記載されたポリヌクレオチドのいずれかによつてコードされるアミノ酸配列から選択された、 4 5アミノ酸残基以上からなる連続するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。

〔3〕ポリヌクレオチドが、 a)または b)に記載のポリヌクレオチドである〔1〕または〔2〕に記載のワクチン。〔4〕以下の a)- e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列からなる蛋白質との結合能を有する抗体を有効成分として含有するネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および/または予防用抗体製剤。

e) a) - d)に記載されたポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるアミノ酸配列から選択された、 4 5アミノ酸残基以上からなる連続するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。

〔5〕〔1〕、〔2〕、および〔3〕のいずれかに記載のワクチンを少なくとも 1回ネコに投与するプロセスを含む、ネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および Zまたは予防のための方法。

〔6〕〔4〕に記載の抗体製剤を少なくとも 1回ネコに投与するプロセスを含む、ネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および Zまたは予防のための方法。

〔 7〕以下の a) _e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列を含む蛋白質とネコの血清をィンキュベ一トし、該蛋白質と結合する抗体を検出する工程を含む、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス感染の検査方法。

a) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、 b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコ一ドする塩基配列を含むポリヌクレオチド、

〔8〕以下の a) - e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列を含む蛋白質を含む、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス感染の検査用 a) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、 b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、

e) a)-d)に記載されたポリヌクレオチドのいずれかによつてコードされるアミノ酸配列から選択された、 4 5アミノ酸残基以上からなる連続するアミノ酸配列をコ一ドするポリヌクレオチド。

あるいは本発明は、上記 a)- e)のいずれかに記載のポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質の、ネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および/または予防用ワクチンの製造における使用に関する。更に本発明は、上記 a) - e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質との結合能を有する抗体の、ネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および/または予防用抗体製剤の製造における使用に関する。配列番号： 1に示す塩基配列、並びにこの塩基配列によってコードされるアミノ酸配列（配列番号： 2 ) は、 F I P Vの I型の株 KU— 2に由来する。 KU— 2の遺伝子の塩基配列、並びに遺伝子によってコードされているァミノ酸配列は公知である（K. Motokawa et al. Microviol. Immunol. , 40/6, 425-433, 1996)。しかしこの遺伝子を利用して、 F I Ρの予防や治療が可能となることは知られていない。

先に述べたように、 F I P Vの I型に分類された株の塩基配列は、株間での相同性が低い。表 1に、これまでに Ν蛋白質をコードする遺伝子の塩基配列が特定された F I P Vの代表的な株や近縁の他のウィルス間の相同性をまとめた。たとえば、 KU— 2の Ν蛋白質に対する他の株の Ν蛋白質の相同性は、 9 2 %に満たない。この相同性は、 I I型やネコ ·腸コロナウィルスの Ν蛋白質との相同性と同程度である。

つまり、 I型のウィルスは、バリエ一シヨンが大きい。 Ν蛋白質のアミノ酸配列の比較結果を図 2に示した。図 2からは、各ウィルス間のアミノ酸配列の相違、あるいは KU— 2株のアミノ酸配列が、他の株と相違していることがわかる。したがって、 I型のいずれかのウィルスを材料として作成したワクチンの予防や治療の効果は、株間で相違すると予測された。このような従来の知見に基づく予測に反し、本発明は、特定の株に由来するウィルス抗原が、幅広い株に対する有効性と、高い安全性とを有するワクチンの製造に有用であるという新規な知見に基づいている。

すなわち本発明は、以下の a)-e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列を含む蛋白質を有効成分として含有するネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および/または予防用ワクチンに関する。

a) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、 b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレォチド、 c) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域の塩基配列と 93 以上の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、

e) a) - d)に記載されたポリヌクレオチドのいずれかによつてコードされるアミノ酸配列から選択された、 4 5アミノ酸残基以上からなる連続するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。

本発明によるワクチンは、 F I P Vの KU— 2株由来の N蛋白質を有効成分とすることができる。 KU— 2株の N蛋白質のアミノ酸配列を配列番号： 2に、またこのアミノ酸配列をコードする塩基配列を配列番号： 1、並びに図 1に示した。本発明のワクチンにおける有効成分には、この他、 c) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコ一ド領域の塩基配列と 93%以上の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、あるいは d) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列と 93 以上の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質を用いることができる。なお I型に分類された既知の F I P Vの N蛋白質と、 KU— 2株の N蛋白質の相同性は、いずれも 9 3 % 未満である。

一般に、高い相同性を有するアミノ酸配列からなる蛋白質の免疫学的な性状は類似する。本発明において、望ましいアミノ酸配列は、配列番号： 2に対して、通常 9 3 %以上、より望ましくは 9 5 %以上、更に望ましくは 9 8 %以上、あるいは 9 9 %以上の相同性を有するアミノ酸配列である。

アミノ酸配列の相同性を求める手法は公知である。たとえば、 Karl in and Al ts chulによるアルゴリズム BLAST (Proc. Nat l. Acad. Sci. USA 90 : 5873-5877, 199 3)は、アミノ酸配列の相同性を決定するための代表的なアルゴリズムである。このアルゴリズムを実現するプログラムが BLASTX (Al t schul et al . J. Mol. Biol . 2 15 :403-410, 1990)である。 BLASTXによってアミノ酸配列を解析する場合には、パラメ一夕一はたとえば score = 50、 wordlength = 3とする。あるいは BLASTと Gapp ed BLASTプログラムを用いる場合には、各プログラムのデフォルトパラメ一ターを用いることができる。

たとえば実施例においては、表 1のホモロジ一は、遺伝情報処理ソフトウェア G ENETYXのマキシマムマッチングを用いて算出した（Takashi K and Gotho 0 (1984)

J. Biochem. 92 : 1173-1177)。パラメ一ターは次のとおりである。

matching condi t ion .'matches—l , mismatches=lgaps=l , 冊 =2

その他、 Lipman- Pearson法（Lipman DJ and Pearson WR (1985) Sc ience 227 : 14 35- 1441)に基づいてホモロジ一を決定することもできる。 Lipman- Pearson法におけるパラメ一夕一は次のとおりである。

uni t s i ze to compare=2 (amino ac id) or 5 (nuc l eot i de;

本発明のワクチンの有効成分とする蛋白質のアミノ酸配列において、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列に導入しうるアミノ酸残基の変異の数は、通常 2 5 以下、あるいは 2 0以下、望ましくは 0— 1 5、より望ましくは 0— 5、更に望ましくは 0— 3である。一般に蛋白質の性質をできるだけ損なわないようにするためには、置換されるアミノ酸は、置換前のアミノ酸と似た性質を有するァミノ酸であることが好ましい。このようなアミノ酸の置換は、保存的置換と呼ばれている。

例えば、 Al a、 Val、 Leu、 I le、 Pro, Met, Phe、 Trpは、共に非極性アミノ酸に分類されるため、互いに似た性質を有する。また、非荷電性としては、 Gly、 Ser、 Thr、 Cys、 Tyr、 Asn、 Ginが挙げられる。また、酸性アミノ酸としては、 Aspおよび Gluが挙げられる。また、塩基性アミノ酸としては、 Lys、 Arg、 Hi sが挙げられる。

更に本発明のワクチンは、 e) a) - d)に記載されたポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるアミノ酸配列から選択された、 4 5アミノ酸残基以上からなる連続するアミノ酸配列を含む蛋白質を有効成分とすることができる。ワクチンの有効成分は、免疫担当細胞に免疫学的な刺激を与えることができれば、必ずしも抗原蛋白質の全体構造を維持していなくてもよい。一般には 1 5アミノ酸残基以上を有するポリペプチドによる免疫刺激は、困難を伴わずに検出できるとされる。一方、連続する 2 0アミノ酸あるいは 3 0アミノ酸からなるアミノ酸配列は、当該蛋白質に固有のアミノ酸配列を構成するとされている。特に 4 5アミノ酸残基を越えるアミノ酸配列は、配列番号： 2に特異的なアミノ酸配列を構成する。したがって、条件 e)を満たす部分アミノ酸配列からなる蛋白質は、 a) -d)のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列から選択されたアミノ酸配列と同様の抗原刺激を免疫担当細胞に与えることができる。本発明における望ましいポリペプチドは、 4 5以上、あるいは 5 0以上、望ましくは 5 5以上、より望ましくは 6 5以上のアミノ酸残基を含む、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列から選択された連続するァミノ酸配列を有するポリペプチドである。

本発明において、望ましい部分アミノ酸配列は、前記 a) - d)に記載されたポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列中、ェピトープとして予測された塩基配列を含むことができる。当業者は、与えられたアミノ酸配列をもとに、ェピトープを予測することができる。ェピトープは、アミノ酸配列の様々な特徴に基づいて予測される。例えば、親水性 Z疎水性、電荷、糖鎖結合配列、ジスルフィド結合、蛋白質の二次構造、 T細胞抗原性部位などの情報が、パラメーターの予測に利用される。蛋白質の二次構造は、 Chou-Fasman法や Robson法などによって予測することができる。また T細胞抗原性部位は、 IAパターンや Rothbard/Tayl or パターンなどに基づレゝて予測されている。

その他、また、モノクローナル抗体を利用してェピトープを解析することにより実験的にェピト一プを特定することこともできる。この方法は、免疫原を構成するアミノ酸配列を構成する部分アミノ酸配列からなるペプチド断片に対する抗体の反応性に基づいて、その抗体が認識するェピトープを決定する方法である。ぺプチド断片のアミノ酸配列は、少しずつオーバーラップするようにデザィンされる。この解析方法によって、免疫システムが、免疫原として用いた蛋白質の、どのアミノ酸配列を認識したのかを明らかにすることができる。

前記 a) -d)に記載されたポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列からなる蛋白質は、 FIPVの増殖を抑制する免疫応答を誘導する一方、感染増強ェピトープを含まない。したがって、安全性と予防効果に優れたワクチンを提供することができる。更に、この蛋白質のェピトープを構成するアミノ酸配列からなる蛋白質断片も同様に、宿主の目的とする免疫応答を誘導し FIPVの予防効果を達成しうる。

本発明における望ましい蛋白質断片として、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と免疫学的に同等な活性を有する断片を示すことができる。免疫学的に同等とは、宿主に投与されたときに、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質を投与した場合と同等の免疫応答を誘導することを言う。

本発明における蛋白質断片は、単一であることもできるし、異なるアミノ酸配列からなる複数の断片を用いることもできる。したがって、単一では免疫学的に同等といえない断片であっても、複数の断片の組み合せによって免疫学的に同等な活性を示す断片の組み合せは本発明に含まれる。更に、蛋白質断片以外の補助的な成分の組み合せによって免疫学的に同等な活性を達成できる断片を含むワクチンは、本発明に含まれる。

たとえば、特定のアジュバントを配合することによって、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質と免疫学的に同等な活性を示す蛋白質断片を本発明に用いることができる。その他、適当なキャリアー蛋白質との融合蛋白質とすることによって免疫学的に同等な活性を維持する蛋白質断片も、本発明に用いることができる。

投与された蛋白質に対する宿主の免疫応答は、たとえば次のような指標に基づいて比較することができる。

—投与された蛋白質に対する抗体価、一細胞性免疫の活性化作用

一感染源のチャレンジに対する生体防御機構のレベル

投与された蛋白質に対する抗体価は、各種のィムノアッセィによって測定することができる。より具体的には、配列番号： 2に記載のアミノ酸配列からなる蛋白質を感作したプレートに被検動物の血液試料を加え、更に当該動物のィムノグロブリンに対する標識抗体を反応させることによって、抗体価を測定することができる。

また投与された蛋白質による細胞性免疫の活性化作用は、たとえば末梢血中の T細胞の活性化の程度をで測定することによって評価することができる < 具体的には、標的細胞に対する被検 T細胞の攻撃活性を測定する方法として、 C T L assayが知られている。更に最近では、サイト力インゃパ一フォリンを指標として、 T細胞の活性化レベルを把握する方法も用いられている。 T細胞の活性化の指標には、 I L— 2ゃァ -IFNなどが用いられる。パーフォリンは、細胞障害性に関与する生体分子である。これらの指標は、 ELISA、 real t ime PCR, EL I SPOT 法などによって測定される。一般に、これらの測定手技は、高度な細胞培養技術を必要とする CTL assayに比べて簡便である。

さらに免疫学的な同等性は、実際に蛋白質を投与した固体に、病原体をチヤレンジし、その防御レベルを比較することによって確認することもできる。防御レベルは、病原体を接種後の、体重や体温の変化、あるいは生存日数等に基づいて比較することができる。

本発明における前記 a) - e)に記載のポリヌクレオチドの由来は制限されない。したがって、天然のポリヌクレオチドであっても、人為的または自発的に変異が導入されたポリヌクレオチドであってもよい。また、人工的にデザインされた配列からなるポリヌクレオチドであってもよい。

天然に由来するポリヌクレオチドには、たとえば KU _ 2株のポリヌクレオチドゃ、 KU— 2株から誘導された変異株に由来するポリヌクレオチドなどが含まれる。その他、 KU— 2株と相同性の高い塩基配列を有する F I PVに由来するポリヌクレオチドを用いることもできる。一方、本発明における人工的にデザィンされたポリヌクレオチドには、たとえば KU— 2株の塩基配列に、人為的な変異を導入したポリヌクレオチドを示すことができる。

本発明のポリヌクレオチドは、例えば、公知のハイブリダィゼ一シヨン技術（S ambrook J. , Fritsch, E. F. , and Maniatis T. Molecular cloning ： A Laborat ory Manual (2nd edition) . Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Sprin g Harbor.) を利用して調製することができる。 DNAの単離には、ポリメラーゼ連鎖反応技術 (Sambrook J. , Fritsch, E. F. , and Maniatis T. Molecular clo ning ： A Laboratory Manual (2nd edition) . Cold Spring Harbor Laboratory P ress, Cold Spring Harbor.) を利用することもできる。

即ち、当業者においては、ハイブリダィゼーシヨン法や PCR法により、ウィルス由来の D N Aなどをスクリーニングし D N Aを単離することができる。ハイブリダイゼ一ション法に必要なプローブや、 PCR法に必要なプライマーの塩基配列は、例えば KU— 株 N蛋白質の cDNA配列（配列番号： 1 ) に基づいて設計することができる。

アミノ酸に変異を導入する方法はよく知られている。例えば、変異ウィルスを含むウィルスライブラリ一や、変異 N蛋白質をコードする DN Aライブラリ一等を作製し、望みのアミノ酸配列をコードする DNAをスクリーニングすることによって単離することができる。あるいは変異の入ったウィルスを自然界からスクリーニングすることもできる。更に、公知の遺伝子工学的技術を用いて、部位 (特) 異的に変異を導入することも可能である。部位特異的に変異を導入するためには、例えば、 SOE (splicing― by- overlap- extention) - PCR法 (Ho, S.N. , Hunt, H.D., Horton, R.M., Pullen, J.K., and Pease, L.R. (1989). Gene 77, 5ト 59)、 Kun kel法 (Kunkel, T.A. (1985) Proc Natl Acad Sci U S A; 82 (2) :488 - 92)法を用いることができる。本発明のワクチンの有効成分とする蛋白質は、公知の方法によって得ることができる。たとえば前記 a)-e)のいずれかに記載のポリクレオチドを適当な発現べク夕一に挿入し、宿主細胞に導入することにより発現させることができる。宿主としては、細菌、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞、あるいは哺乳動物等を示すことができる。より具体的には、細菌では大腸菌 (Escherichia Col i)を、酵母では分裂酵母 Shi zosaccharomyces pombeを、あるいは哺乳動物細胞としては CHO細胞や CO S細胞等を示すことができる。

これらの宿主への形質転換が可能なベクターには、公知のベクタ一を利用することができる。中でも、昆虫細胞とバキュロウィルスべクタ一を用いた発現系は、本発明のワクチンの製造に有用である。

ノ^キュロゥイリレス (Autographa cal i forica nuc lear polyhedros is virus ;AcNP V)は、昆虫を宿主とする、 2本鎖の環状 DNAゲノムを有するウィルスである。感染細胞の核内で作り出される多角体 (polyhedra)が多くのウィルス粒子を含み、感染源となる。多角体を構成する蛋白質の一つである多角体蛋白質「ポリヒドリン」は、強力なプロモー夕一によって発現が制御されている。この強力なポリヒドリンプロモー夕一の活性を利用した発現系が、バキュロウィルス発現系である。

ポリヒドリン遺伝子は、感染の後期には非常に高い発現量を示す。しかし、培養細胞においては、ウィルスの増殖に必須の蛋白質ではない。そこで、ポリヒドリンプロモーターの下流のポリヒドリン遺伝子を外来性遺伝子に組み換えれば、ポリヒドリンと同様の高発現を期待できる。バキュロウィルス発現系は、具体的には、次のようなステップにしたがって構築される。

一外来性遺伝子のトランスファーベクターへのサブクローニング

一組み換えウィルスの調製

一蛋白質の発現

約 1 3 O kbpの大きさを有するバキュロウィルスゲノムに、外来性遺伝子を直接揷入することは難しい。そこで外来性遺伝子は、まず 1 O kb程度のプラスミドからなるトランスファ一ベクタ一に揷入される。トランスファ一ベクタ一とウィルス DNAを宿主細胞に同時にトランスフエクシヨンし、相同組み換えを利用してウイルスに外来性遺伝子を組み込む。

トランスファ一ベクターには、バキュロウィルス組み換え用の市販のベクタ一を利用することができる。たとえば、 pVL1392、あるいは PVL1393 (いずれも Pharm ingen製) 、並びに pPAK8、あるいは pPAK9 (いずれも Clontech製）は、最も良く使われるトランスファーベクタ一である。その他に、 N末端にシグナル配列を付加できるベクタ一、ヒスチジンタグを付加できるベクタ一、あるいは複数のプロモ一夕一を配置したベクタ一など、いろいろな機能を付加されたベクターも市販されている。これらの市販のベクターは、いずれも本発明に利用することができる。感染細胞の培養上清には、組み換えに成功したウィルスと、組み換えが起きていないウィルスの両方が産生されるので、必要に応じて組み換えウィルスを選択することができる。組み換えウィルスは、プラーク形成を利用して選択することができる。すなわち、組み換えウィルスを感染させた細胞は、多角体を形成できないために透明なプラークを形成することを利用して、組み換えウィルスを分離する。組み換えが起きていないウィルスは、大量の多角体を発現するので、白いプラークを形成する。得られた組み換えウィルスは、タイ夕一を上げるために、必要に応じて感染を繰り返して、増幅することができる。

組み換え効率が低い環状野生型 AcNPVの DNAに対して、より組み換え効率を向上させた変異ウィルスも実用化されている。たとえば、市販の変異バキュ口ウィルスを用いた場合には、 1 0 0 %近い高い組み換え効率が期待できる。その結果、プラーク精製のステップは必須ではなくなつている。具体的には、 Bacul o Gol d^(T ^M) L inear i zed Baculovi rus (Pharmingen製）や、 BacPAK6 vi ral DNA Bsu 36 I di ges ted (Clontech製）等の変異バキュロウィルスが市販されている。

バキュロウィルスの組み換えや、蛋白質発現には、昆虫細胞が利用される。最も一般的な宿主細胞は、昆虫細胞株 Sf 9である。 Sf 9は、 Pharmingeiu Clontech, あるいは ATCCなどから購入することができる。その他、 Sf21 (Invi trogen, Pharm ingen) 、あるいは High f ive^TM(Invi trogen)等の昆虫細胞も本発明に利用することができる。

これらの昆虫細胞は、適当な培地中で維持することができる。培地には、たとえば、 Grace Insect Medium, TMN-FH Insect Medium, あるいは Excel l 400などの市販の培地を利用することができる。昆虫細胞は、一般に、 2 7 °C前後で培養され、動物細胞のように C O ₂は必須ではない。 Sf9は、単層培養でも浮遊培養でも良く増殖する。

昆虫細胞へのトランスファーベクター、およびバキュ口ウイルス DNAのトランスフエクシヨンも公知である。具体的には、 Lipofect in Reagentを使い、トランスファ一ベクタ一とバキュロウィルス DNAを細胞に感染させる。感染後、培養を継続すれば、培養上清に組み換えウィルスが産生される。上清中のウィルスを必要に応じて増幅し、更に大量の昆虫細胞に感染させて外来性遺伝子を大量発現させる。発現後の細胞を回収して、外来性遺伝子の発現産物を精製することができる。

バキュロウィルス発現系は、大腸菌などを宿主とする発現系と比較して、一般に、次のような利点を有するとされている。

一発現量が高い

一分子量の大きい蛋白質の発現レベルも比較的高い

一動物細胞における発現と同様の翻訳後修飾が起きる

一複数種の蛋白質の発現と再構成が可能

他方動物細胞発現べクタ一としては、大腸菌における複製に必要な複製遺伝子 (ColEl ori) と、哺乳動物細胞での発現を支える複製遺伝子（SV40 ori) および S V40初期プロモータ一を持ったベクタ一等を利用することができる。このような発現ベクターの初期プロモーターの下流に前記 a) - e)に記載のポリクレオチドを組み込み、大腸菌においてクロ一ニングする。クローニングした発現べクタ一を回収し、リン酸カルシウム沈殿法やリボソーム法によって適当な動物細胞（サル腎由来の COS細胞など）に形質転換すれば、動物細胞で N蛋白質を発現させることがでぎる。

以上のようにして発現させた蛋白質は、公知の手法により精製して純粋な蛋白質とすることができる。精製のために、各種の結合性蛋白質との融合タンパク質として N蛋白質を発現させ、これをァフィ二ティクロマトグラフィーによって精製する手法を応用することもできる。このような精製方法としては、ヒスチジンタグとの融合タンパク質をニッケルカラムで吸着精製する系等が公知である。ァフィニティクロマトグラフィーなどで回収された N蛋白質は、イオン交換クロマトグラフィ一等を利用して更に精製することができる。

本発明のワクチンに用いる蛋白質は、遺伝子組み換えによる生産方法の他、 F I P Vを感染させた培養細胞から得ることもできる。 F I P Vの培養には、哺乳動物由来の初代細胞あるいは株化細胞を使用することができる。特にネコに由来する細胞は、 F I P Vの培養に好適である。ネコ由来の株化細胞としては、例えば fcwf4細胞や CRFK細胞を示すことができる。これらの細胞は、細胞バンクから入手することができる。ネコ株化細胞を用いた F I P Vの培養方法は公知である（Ho hdatsu T, Sasamoio T, Okada S， Koyama H. Ant igenic analys is of fel ine cor onaviruses wi th monoc lonal ant ibodies (MAbs)： preparat ion of MAbs which d iscriminaie between FIPV strain 79-1146 and FECV s train 79-1683. Vet Micro biol. 1991 Jun; 28 (l) : 13-24. ) ₀ またブタゃィヌなど他の動物由来の細胞も使用することができる。

更に、ワクチンに必要な蛋白質は化学的に合成することができる。アミノ酸を順番に結合して目的とするアミノ酸配列を有するオリゴペプチドとする合成方法は、公知である。特に、比較的短いアミノ酸配列からなる蛋白質断片は、容易に化学的に合成することができる。あるいは、化学的な合成が難しい長いアミノ酸配列からなる蛋白質も、オリゴペプチドを相互に連結することによって合成することができる。得られた N蛋白質は、 N蛋白質そのものをワクチンとして使用する他に、薬学的処方を適用して製剤化されうる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤などと適宜組み合わせて製剤化することができる。本発明のワクチンには、適宜ァジュバントを配合することができる。

本発明のワクチンには、任意のアジュバントを配合することによって、その作用を向上させることができる。本発明に利用することができるアジュバントとして、たとえば次のような成分を示すことができる。

アルミニウム塩などの無機物質界面活性作用物質

微生物もしくは微生物由来物質一サポニン

-BCG 一デォキシコ一ル酸など

一ムラミルジペプチドスクアレンとその関連物質

一百日せき菌

一百日せきトキシン

—コレラトキシンなど

アジュバントは、単独で使用するか、もしくは複数の物質を組み合わせて使用することができる。ワクチン学の専門家ならば、実験により好適なアジュバントの組み合わせ決定することができる。アジュバントの種類により、主に液性免疫が刺激されるものと細胞性免疫が主に刺激されるものとが知られている。例えば液性免疫を主に刺激するアジュバントとしてリン酸アルミニウムが知られている, 一方、 Qui l Aや Q S— 2 1などのサポニン類、百日咳トキシン、コレラトキシンなどは細胞性免疫を刺激しやすいことが知られている。このような情報を参考にしながら、ある抗原との組み合わせで使用する好適なアジュバントを選択することができる。

また本発明は、前記 a) -e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有効成分として含有するネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および Zまたは予防用ワクチンに関する。先に述べたように a)- e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質は、ネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および Zまたは予防用ワクチンとして有用である。したがって、前記 a) _e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを生体に導入し、生体内で発現させることによって、本発明のワクチンの投与と同様の効果を期待できる。

本発明のワクチンにおいて、前記ポリヌクレオチドは、発現可能な状態で生体内に導入される。そのためには、たとえば宿主において機能する発現制御領域の下流に前記ポリヌクレオチドを挿入したベクターとして、生体に導入することができる。発現制御領域として、薬剤感受性を有するプロモーターを用いれば、薬剤の投与によって目的とする遺伝子の発現を誘導することができる。このようなプロモ一夕一として、例えばカナマイシン感受性のプロモーターが知られているあるいは、部位特異的に発現が誘導されるプロモーターを用いれば、目的とする遺伝子の発現部位を特定することができる。

抗原をコードする遺伝子を生体に投与し、生体において発現させ、ワクチンとして作用させる手法は遺伝子ワクチンと呼ばれている。遺伝子ワクチンにおいては、発現させるべき抗原をコードする遺伝子が、適当なキャリアーとともにあるいはキヤリァーを伴わずに生体内に導入される。適当な緩衝液に浮遊した十分な量の D N Aを筋肉内に注射したのみでも蛋白質の発現を誘導できることが知られている。一方キャリア一を用いる場合には、ベクターや人工的な担体が利用される。

ベクターには、ワクシニアウィルス（Vaccini a vi rus)などのウィルスベクターが利用される。ワクシニアウィルスは、 1 8 6 kbの DNAゲノムを有する、ボックスウィルス属のウィルスである。ワクシニアウィルスは、ワクチン（vaccinaUon)の語源となった種痘ワクチンとして、既に多くのヒトが接種を受けた実績を有している。更にワクシニアウィルスは、核内に移行せず、細胞質内で転写と複製を行うため、導入した遺伝子が宿主のゲノムに組み込まれる危険性が少ない。したがつて、ワクチンァウィルスは、科学的に見ても安全性が高いベクターとなりうる。加えてワクシニアウィルスベクタ一は、液性免疫よりも、細胞性免疫に対する刺激活性が大きいとされている。細胞性免疫を誘導しやすいという特徴は、細胞性免疫の重要性が高い FIPVの予防や治療において、有利な特徴である。

ワクシニアウィルスの他には、アデノウイルス、アデノ随伴ウィルス、レトロウィルスなどが遺伝子治療用のベクタ一として利用されている。これらのウィルスベクタ一は、いずれも本発明に利用することができる。

ウィルスベクタ一以外にも、人工的なキャリアーを用いた遺伝子ワクチンが試みられている。人工的なキャリア一として、リボソームや金コロイド等を示すことができる。

たとえば正電荷したリボソームを負電荷を有する DNAに吸着させる。 DNAを吸着したリボソームは、生体に投与されると、負電荷を有する細胞表面のリン脂質層に結合する。次いで DNAは、細胞膜への吸着やエンドサイト一シスによって細胞膜内に取りこまれる。このとき DNAとしてプロモータ一の下流に遺伝子を挿入したベクタ一を用いれば、当該遺伝子を導入された細胞内において、遺伝子は転写され蛋白質へと翻訳される。金コロイドは、遺伝子銃 (gene gun)を使った遺伝子導入に用いられる。すなわち、プラスミド（naked DNA)を付着させた金コロイド粒子を、圧縮ガスを使って高圧接種する。金コロイド粒子が組織に入りこむときに、遺伝子が細胞内へ導入される。遺伝子銃を使った遺伝子の導入方法は、少量の DNAの導入で高い蛋白質発現レベルを達成することができる。つまり、少量の DNAで十分なワクチン効果を達成できることを意味している。

本発明のワクチンの動物への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、動物の体重や年齢、投与方法、使用目的などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。たとえば、一般にネコのワクチンは、生後 8週以降に 2〜 3週間隔で 2回接種される。

本発明のワクチンは、ネコをはじめとするネコ科動物の F I Pの予防および/ または治療に有用である。疫学的、あるいはウィルス学的なデータに基づいて、野生ネコ科動物の F I P Vも、ネコのそれに近いとされている。したがって、本発明のワクチンは、ネコ科動物においても有効である。

加えて本発明は、前記 a) -e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質との結合能を有する抗体を有効成分として含有するネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および Zまたは予防用抗体製剤に関する。

既に述べたとおり、前記 a) - d)に記載されたポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質は、 FIPVの増殖を抑制する免疫応答を誘導する一方、感染増強ェピトープを含まない。その結果、この蛋白質の利用によって、安全性と予防効果に優れたワクチンを提供することができる。更に、前記 a) - d)に記載されたポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列からなる蛋白質との結合能を有する抗体も、宿主への投与によって、ネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および/または予防効果を達成することができる。

これら蛋白質との結合能を有する抗体の投与は、蛋白質の投与によって誘導される免疫応答と類似した状態を、短期的に宿主に与えることができる。その結果、投与された抗体は、 FIPVの増殖を抑制する。また前記蛋白質が感染増強ェピト一プを含まないことから、抗体に起因する感染増強の誘導を避けることができる。本発明のネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および/または予防用抗体製は、前記 a) -e)に記載のポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列からなる蛋白質を抗原として、免疫動物を免疫することによって得ることができる。抗体を得る手法は任意である。たとえば、抗原を適当なアジュバントともに投与し、免疫動物の血液から抗血清を得ることができる。あるいは、免疫動物の抗体産生細胞を回収し、クローニングすることによってモノクローナル抗体を得ることもできる。本発明の抗体製剤は、抗体を投与する動物と同じ種に由来することが望ましい。同じ種に由来する抗体は、安全であり、治療、あるいは予防効果を、より容易に達成することができる。

あるいは、異なる種に由来する抗体分子を、抗体工学的手法を利用して、ネコ化することもできる。たとえば、ィムノグロブリンの定常領域をネコィムノグロブリンに置換したキメラ抗体を構築する技術が公知である。より具体的には、ネコィムノグロプリン遺伝子に、任意の動物のィムノグロプリンの可変領域をコードする遺伝子を接合することにより、ィムノグロブリンの定常領域のみをネコ由来の蛋白質とすることができる。

ィムノグロブリンの定常領域は、可変領域に比べて異物と認識されやすい。したがって、定常領域をネコ由来とすることで、ィムノグロブリンの安全性、並びに生体内における安定性を高めることができる。このテクノロジ一を利用して、目的とする結合親和性を有する抗体をキメラ化すれば、ネコへの投与に適したィムノグロブリンを得ることができる。

このテクノロジーを利用して、ネコへルぺスウィルスおよびネコ力リシウィルスに対するマウス ·モノクローナル抗体をネコ化したキメラ抗体が商品化されてレる (Umehashi M, Nishiyama K, Akiyama S, Kimachi K, Imamura T, Tomi ta Y, Sakaguchi S, Makino H, Shigaki T， Shinya N, Matsuda J, Tokiyoshi S. Devel opment of Mouse-cat chimeric ant ibodies agains t fel ine viral rhinotrachei t is and fel ine cal ic ivi rus infect ion. Sc i . Rep. C emo-Sero-Therap. Res. I ns t. , 6 : 39-48 (1997) )。

更に、ネコィムノグロブリンの超可変領域を、目的とする結合親和性を有する抗体の超可変領域と置換することによって、ネコ化抗体を得ることもできる。ィムノグロプリンの可変領域は、抗原決定基との結合親和性を決定する相補性決定領域（co即 lemantari ty determining region; CDR)と、それを保持するフレーム領域とによって構成されている。 CDRの構造は極めて高度なバリエーションを有し、超可変領域とも呼ばれている。一方フレーム部分の保存性は高い。抗原との結合親和性は、主に CDRによって決定されていることから、 CDRを置換することによつて、ィムノグロプリンの結合親和性も変更することができる。

具体的には、フレーム部分にァニールするプライマーをデザインし、 PCRによつて CDRをコードしている cDNAを取得する。得られた cDNAで、ネコィムノグロブリンの CDRを置換すれば、任意の種のィムノグロブリンから得た CDRを有するネコィムノグロブリンを得ることができる。つまり、目的とする結合親和性を有する任意の種のィムノグロブリンの CDRを、ネコィムノグロブリンの CDRと置換することによって、ネコィムノグロブリンに、必要な結合親和性を導入することができる。本発明の抗体製剤は、前記 a) - d)に記載されたポリヌクレオチドによってコ一ドされるアミノ酸配列からなる蛋白質に結合能を有する、完全なィムノグロブリン、あるいはその可変領域を有効成分として含有することができる。ィムノグロプリンの抗原に対する結合活性は、可変領域によって維持されている。したがって、可変領域のみを有効成分として用いることができる。しかしながら定常領域は、' 補体との結合活性、リンパ球上の F c受容体との結合活性などの、免疫応答において重要な機能を有していることも事実である。したがって、定常領域を備えたィムノグロプリン分子を有効成分とする抗体製剤は、本発明の抗体製剤として好ましい。

本発明の抗体製剤において、抗体とは、ィムノグロブリンそのもののみならず、未精製のィムノグロブリンを含む。したがって、抗血清などのィムノグロブリン含有分画は、抗体に含まれる。一方ィムノグロブリンは、抗体を構造的な特徴に基づいて説明するときに用いる用語である。抗体、およびィムノグロブリンは、必要とする結合親和性を有するィムノグロプリンを含む限り、本発明の抗体製剤として利用することができる。したがって、必ずしも精製抗体や、モノクローナル抗体である必要はない。

抗体は、そのまま、あるいは薬学的処方を適用して製剤化されうる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤などと適宜組み合わせて製剤化することができる。

本発明の抗体製剤の動物への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射などのほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、動物の体重や年齢、投与方法、使用目的などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。

加えて本発明は、本発明のワクチンあるいは本発明の抗体製剤を少なくとも 1 回ネコに投与するプロセスを含む、ネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および Zまたは予防のための方法に関する。本発明の方法は、ネコ科に属する全ての動物に適用することができる。ワクチンや抗体製剤の調製方法、そして動物への投与方法は、先に述べたとおりである。

本発明のワクチンまたは抗体製剤は、ネコにおける F IPVの予防および Zまたは治療に有用である。本発明において、 FIPVの予防とは、 FIPVの感染経験の無い動物、あるいは感染の後の発症前の状態に有る動物への予防的な投与によって、発症を阻害する作用を言う。発症の阻害とは、たとえば次のような作用が含まれる < 発症そのものを防ぐ作用

発症を遅らせる作用

発症後の症状を軽減する作用

発症後の治癒を早める作用

発症後の延命率を向上させる作用、あるいは

発症した個体から他の個体への感染力を阻害する作用

また本発明における治療とは、発症した個体への投与によって、疾患の症状を緩和する作用を言う。症状の緩和とは、たとえば次のような作用が含まれる。

症状を和らげる作用治癒を早める作用、あるいは

発症後の延命率を向上させる作用

加えて本発明は、前記 a)-e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質とネコの血清をインキュベートし、該蛋白質と結合する抗体を検出する工程を含む、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス感染の検査方法に関する。実施例に示したように、 KU— 2に由来する N蛋白質は、 FIPVの幅広い株の抗血清と強く反応する。このことは、 KU— 2の N蛋白質が、 FIPVのヮクチンとしての有用性が高いことを示すと同時に、診断用抗原としても有用であることを裏付けている。

ウィルス感染症の診断は、一般に、生体試料中に含まれるウィルス抗原ゃ抗ゥィルス抗体を指標として実施される。特に抗ウィルス抗体は、ウィルス抗原が消失した後でも検知できるため、診断指標として重要である。抗ウィルス抗体の検出には、ウィルス抗原が必要である。

一方、先に FIPVの I型に属するウィルスは、構造的な類似性が低いことを示した。そのため、被検動物の抗 FIPV抗体の存在を確実に検出するためには、株ごとに異なる蛋白質を用意しなければならない可能性が考えられる。単一の蛋白質では、構造的に異なる抗原に対する抗体を検出できない恐れがある。一方本発明に基づく検査方法によれば、単一の蛋白質を抗原として、異なる株に対する抗血清を、十分な感度で検査することができる。したがって、本発明の検査方法は、ネコ FIPVのスクリーニングに有用である。

すなわち本発明は、前記 a) - e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコ一ドされるアミノ酸配列を含む蛋白質とネコの血清をィンキュベートし、該蛋白質と結合する抗体を検出する工程を含む、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス感染のスクリーニング方法を提供する。本発明において、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス感染のスクリーニング方法とは、不特定多数のネコを対象として、 FIPVの感染経験を有する可能性のあるネコを見出すための検査方法を言う。特定の抗原を用いて抗体の検出を行う方法は公知である。たとえば、固相上に抗原を固定し、この抗原に結合する抗体を、抗体を認識する抗体（二次抗体）によって検出することができる。あるいは、試料中に含まれる抗体を固相上に捕捉し、この抗体に抗原を反応させることによって、抗原特異的な抗体の存在を検出することができる。いずれの方法においても、抗体や抗原は、検出を容易にするために標識しておくことができる。抗原や抗体の標識には、酵素、蛍光物質、発光物質、着色粒子、あるいは放射性同位元素などが用いられる。蛋白質に標識成分を結合させる方法は公知である。

その他、抗原を感作した粒子担体の、抗体による凝集を指標として抗体を検出する方法も公知である。粒子凝集を指標とする方法は、固相と液相の分離を必要としないので、大量の試料を連続的に試験する方法として有用である。

前記 a) - e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質に結合する抗体が検出された個体は、 FIPVの感染経験を有すると診断される。あるいは、抗体価の変化を追跡することで、症状の程度を診断することもできる。たとえば、抗体価の上昇は、ウィルスの増殖に引き続いて起こる。したがって、抗体価が上昇しつつある個体は、ウィルスの増殖を伴っている可能性が高い。症状が軽快した後に抗体価が低下すれば、その個体は回復している可能性が高いと診断される。

本発明はまた、前記 a)-e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコ一ドされるアミノ酸配列を含む蛋白質を含む、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス感染の検査用試薬に関する。本発明の試薬における前記 a) -e)のいずれかに記載のポリヌクレォチドによってコードされるアミノ酸配列を含む蛋白質は、上記の各種のィムノアツセィフォーマットに応じて、固相や粒子に固定することができる。また、上記の各種のィムノアッセィフォーマットに応じて、標識抗体、標識を検出するために必要な付加的な試薬、陽性対照、あるいは陰性対照等と組み合せて診断用キットとすることができる。図面の簡単な説明

図 1は、 FIPVの I型 KU— 2株由来の N蛋白質遺伝子の塩基配列（配列番号：

1 ) 、およびアミノ酸配列（配列番号： 2 ) を示す図である。

図 2は、 FIPVおよび近縁のウィルスの N蛋白質のアミノ酸配列のァライメント結果を示す図である。各配列は上から順に、 FIPVの I型 KU— 2株（配列番号：

2 ) 、 Bl ack株、丽株、 FIPV I I型 79- 1146株、 FECV I I型 79-1683株、 CCV In svcl株、および TGEV Purde株の N蛋白質のアミノ酸配列を示す。図中、 . . .は KU 一 2株と同じアミノ酸残基であることを、一はギャップを示す。

図 3は、 FIPVの I型 KU— 2株、 Bl ack株、 UCD1株、 FIPV I I型 79-1146株、 FE CV I I型 79- 1683株、 CCV Insvcl株、および TGEV Purde株の N遺伝子のアミノ酸配列から計算した系統樹を示す図である。図中の数字は進化距離を示す。

図 4は、ウエスタンプロット法による、バキュロウィルス組み換え N蛋白質抗原の特異性の解析結果を示す写真である。図中の矢印は N蛋白質のバンドの位置を示す。 a, b, c, d, e, f , gはそれぞれ 8倍、 1 6倍、 3 2倍、 6 4倍、 1 2 8倍、 2 5 6倍および 5 1 2倍希釈したバキュロウィルス組み換え N蛋白質抗原を示す。 h は精製 FIPV可溶化抗原を示す。

図 5は、ウエスタンプロット法による、精製 FIPV抗原由来 N蛋白質の特異性の解析結果を示す写真である。図中の矢印は N蛋白質のバンドの位置を示す。 aは精製 FIPV抗原由来 N蛋白質、 cは精製 FIPV可溶化抗原を示す。

図 6は、 ELISA法による、バキュロウィルス組み換え N蛋白質抗原の特異性の解析結果を示す図である。横軸は抗原の希釈倍数、縦軸は 450nmの吸光度を示す。図 7は、 ELISA法による、精製 FIPV抗原由来 N蛋白質の特異性の解析結果を示す図である。横軸は抗原の希釈倍数、縦軸は 450nmの吸光度を示す。

図 8は、免疫試験（1)および攻撃試験（1)の日程を示す図である。（a)はバキュ口ウイルス組み換え N蛋白質抗原投与群、（b)は SF-9細胞抗原接種群を示す。図 9は、上は ELISA法による、パキュロウィルス組み換え N蛋白質抗原接種後の抗体価の測定結果を示す図である。下は SF- 9細胞抗原接種後の抗体価を示す図である。図中の数字は実験に用いたネコの番号を示す。横軸は抗原接種後の時間経過、縦軸は 450nmの吸光度を示す。

図 1 0は、バキュロウィルス組み換え N蛋白質抗原免疫ネコにおける遅延型過敏症反応を示す図である。図中の数字は実験に用いたネコの番号を示す。横軸は抗原接種後の時間、縦軸は腫脹の範囲を示す。

図 1 1は、 FIPV79-1146株攻撃後の生存率の推移を示す図である。横軸は 79- 114 6株接種後の日数、縦軸は生存率を示す。実線はバキュロウィルス組み換え N蛋白質抗原免疫ネコの生存率、破線は SF-9細胞抗原を接種したネコの生存率を示す。図 1 2は、上は、バキュロウィルス組み換え N蛋白質抗原接種群における 79 - 11 46株接種後の抗 FIPV抗体価の推移を示す図である。下は、 SF- 9細胞抗原接種群における 79- 1146株接種後の抗 FIPV抗体価の推移を示す図である。図中の数字は実験に用いたネコの番号を示す。横軸は、 79- 1146株接種後の日数、縦軸は 450nmの吸光度を示す。

図 1 3は、免疫試験 (2)および攻撃試験 (2)の日程を示す図である。（a)はバキュロウィルス組み換え N蛋白質抗原接種群、および精製 FIPV抗原由来 N蛋白質抗原接種群、（b)は SF- 9細胞抗原接種群を示す。

図 1 4は、上は ELISA法による、バキュロウィルス組み換え N蛋白質抗原接種後の抗体価の測定結果を示す図である。中央は精製 FIPV抗原由来 N蛋白質接種後の抗体価を示す図である。下は SF- 9細胞抗原接種後の抗体価を示す図である。図中の数字は実験に用いたネコの番号を示す。横軸は抗原接種後の時間経過、縦軸は 4 50nmの吸光度を示す。

図 1 5は、バキュロウィルス組み換え N蛋白質抗原免疫ネコおよび精製 FIPV抗原由来 N蛋白質抗原免疫ネコにおける遅延型過敏症反応を示す図である。横軸は抗原接種後の時間、縦軸は腫脹の直径を示す。図 1 6は、 FIPV79- 1146株攻撃後の生存率の推移を示す図である。横軸は 79- 114 6株接種後の日数、縦軸は生存率を示す。

図 1 7は、上は、パキュロウィルス組み換え N蛋白質抗原接種群における 79-11 46株接種後の抗 FIPV抗体価の推移を示す図である。中央は、精製 FIPV抗原由来 N 蛋白質抗原接種群における 79-1146株接種後の抗 FIPV抗体価の推移を示す図である。下は、 SF- 9細胞抗原接種群における 79- 1146株接種後の抗 FIPV抗体価の推移を示す図である。図中の数字は実験に用いたネコの番号を示す。横軸は、 79- 1146株接種後の日数、縦軸は 450nmの吸光度を示す。

図 1 8は、大腸菌発現抗原に対するネココロナウィルス感染ネコ血清の反応性を調べたウエスタンプロッティングアツセィの結果を示す写真である。各レーンは、レーンの上に示した抗原をブロッテイングしたフィルターで、その上に記載したコロナウィルス株を感染させたネコの血清を反応させた結果を示している。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明を実施例に基づいてさらに具体的に説明する。

〔1〕ウィルス蛋白質の精製

FIPV I型 KU - 2株の由来：

ワクチン抗原の作製および組換え体の作製には、北里大学獣医畜産学部獣医伝染病学教室において FIP発症ネコから分離された FIPV KU- 2株を使用した。本ウイルスは FIPV I型に分類される。

FIPV Π型 KU- 1株の由来：

精製 N蛋白質の作製には、北里大学獣医畜産学部獣医伝染病学教室において FIP 発症ネコから分離された FIPV KU-1株を使用した。本ウィルスは FIPV I I型に分類される。

ウィルスの培養：

ウィルスはネコ胎児由来株化細胞 fel is catus whole fetus (fcwf-4) で培養した。培養液として Eagl es minimum essent i al medium (E-MEM) と L— 15 mediumを等量混合した培養液にゥシ胎児血清（fetal cal f serum: FCS) を 10加えたもの使用した。

ウィルス精製：

100 TCID₅。のウィルスを 225cm²の fcwi- 4細胞に接種し 37°Cで 1時間吸着後、培養液を加え (¾₂ィンキュベー夕一で培養した。 CPEを呈した細胞をセルスクレイパ一で剥離し回収した。回収した細胞は NTE緩衝液 (lOmM Tr i s-HCl (pH7. 0) , lOOmM Na CI, 2mM EDTA) で 3回洗浄した後 NTE緩衝液 5mLに浮遊させた。浮遊細胞をダウンス型ホモジナイザーで破砕した後、 l，500xg 10分間遠心して細胞片を除去した。これを 30%ショ糖 NTE緩衝液に重層して 200，000xg 2時間遠心しウィルス粒子を沈殿させた。沈殿を NTE緩衝液 0. 5mLで溶解した後 15，000xg 5分間遠心し、その上清をゥィルス溶液とした。

蛋白分画：

精製ウィルスにサンプル緩衝液 (lOOmM Tr i s-HCl (pH6. 8) , 4¾ SDS, 20% glyce rol, 0. 1¾ BPB) を加えて 100°Cで 5分間加熱処理し、 11%ポリアクリルアミドゲルで電気泳動 (SDS-PAGE)をおこなった。泳動後のゲルを取り出し、マーカ一蛋白質の位置から N蛋白質の分子量に相当する位置を判断して、 N蛋白質が含まれる位置のゲルを切り出した。マックスィ一ルド蛋白質回収器（ATT0、東京）を用いて切り出したゲルに含まれる蛋白質を回収し、精製 N蛋白質とした。得られた精製 N蛋白質をウエスタンプロット、 ELISA、皮内反応、およびサブユニットヮクチンの抗原として使用した。

〔2〕 FIPV I型 KU- 2株の塩基配列

ウィルス RNAの調製：.

FIPV I型 FIPV Κϋ- 2株の精製ウィルスに SDSを 0. 5%加えた後、フエノール抽出、エタノール沈殿をして RNAを回収した。乾燥したペレットを RNase f reeの水に溶解して RNA溶液とした。 RT-PCR：

クロ一ニングに用いたプライマーの塩基配列を以下に示した。

IMPr-3F (センス側) 5 ' -ggggaa 11 c aa 11 aaaggc aac t ac t gc c a-3 ' (配列番号： 3) BEP (dT) ₂₁ (アンチセンス側) 5'-ctgtgaattctgcaggatccttttttttttttttttttttt-3' (配列番号： 4)

各プライマーにはクローニング用の制限酵素認識配列を付加した。

逆転写酵素反応用緩衝液にマイナス鎖プライマ一、逆転写酵素およびウィルス R

NAを加えて 42 で 1時間逆転写反応をおこない cDNAに転写した。 PCR用緩衝液に PC R用プライマ一、 Taq polymeraseおよび cDNAを加え、 95⁰C5min-(95⁰Clmin-55°Clmi n - 72°C2min)X30cycle_72°C5minの PCRを行い cDNAを増幅した。 PCR産物の特異性は 1¾ Agaroseゲル電気泳動で確認した。

Cloning：

クローニングにはプラスミドベクター pUC18を使用した。 PCR産物をエタノール沈殿後、滅菌蒸留水で溶解し、制限酵素用 10倍緩衝液と制限酵素を加えて消化した。 PUC18は同じ制限酵素で消化した後、アルカリフォスファタ一ゼで脱リン酸ィ匕した。両者とも 1%低融点ァガロースゲルで電気泳動後 DNAを含むゲルを切り出し、 DNAを抽出 *精製した。

Ligation用緩衝液に精製した PCR産物とベクターの DNA断片を混合し、 DNA Ligas eを加えて 15 で 1時間ライゲーション反応をおこなった。環状化した DNAを大腸菌 JM109株のコンビテントセルにトランスフォームし、アンピシリン加寒天平板培地にプレーティングして 37Cでー晚培養した。

培地上にできたコロニーを釣菌して 1.5mLのアンピシリンカロ L- Brothで 1晚培養後、プラスミドを抽出して制限酵素で切断し、 1¾ァガロースゲル電気泳動で DNA断片の大きさを確認して、クローニングの成否を確認した。クローニングされていることを確認した大腸菌を、アンピシリン加 L-Broth 25mLでー晚培養し、組換えプラスミド DNAを抽出 ·精製した。塩基配列決定：

クローニングした cDNAは更に M13mpl8/19ファージベクタ一にサブクローニングし、得られたファージから精製した一本鎖 DNAをシークェンスに使用した。塩基配列は、 Di deoxynuc leot ide chain terminat ion法に基づいて、オートシークェンサ —で解析した。

塩基配列：

FIPVの遺伝子 RNAの全長は約 20kbのうち、我々は KU- 2株についてその 3 ' 末端側の 9. 2kbの塩基配列を解析した。 KU-2株の N蛋白質の cDNAの塩基配列および推定されるアミノ酸配列を図 1に示した。 N遺伝子は開始コドン ATGから終始コドン TAA まで 1, 131塩基の 0RFからなり、 377アミノ酸をコードしており、計算上 42. 5kDaの初期蛋白質を発現すると推定された。

ホモロジ一：

図 2に FIPV I型に属する KU-2株、 Bl ack株、簡株、 FIPV I I型に属する 79- 1146 株、ネコ腸コロナウィルス I I型 (FECV) 79- 1683株、ィヌコロナウィルス（CCV) In svcl株、ブタ伝染性胃腸炎ウィルス（TGEV) Purde株の N遺伝子のアミノ酸配列のァライメントを示した。このアミノ酸配列の比較により、 KU- 2株の遺伝子には他の 6株にはない特徴的なアミノ酸変異が多数存在し、 KU- 2独自の配列を持つことが明らかになった。

表 1には N蛋白質のアミノ酸配列および塩基配列のホモロジ一を示した。表中のホモロジ一は、遺伝情報処理ソフトウエア GENETYXのマキシマムマッチングを用いて算出した。パラメ一夕一は次のとおりである（Takashi K and Gotho 0 (1984) J. Bi ochem. 92 : 1173-1177)。

matching condi t ion:matches=-l , mi smatches=lgaps=l, *N+=2 FIPV I型 FIPV FECV

KU-2 Black UCD1 II型 79-1683 CCV TGEV

KU-2 100 91.2 92.2 91.3 91.3 76.7 76.6

Black 90.72 100 90.9 92.5 93.7 77.7 77.3

UCD1 91.51 91.51 100 92.2 90.9 77.7 77.4

FIPV II型 90.98 92.57 93.10 100 92.6 77.8 78.0

Θ

FECV 92.31 94.43 93.37 93.90 100 77.9 77.6

CCV 74.02 75.07 75.37 76.38 77.17 100 89.6

TGEV 75.20 75.72 76.50 76.24 77.28 89.53 100

アミノ酸配列の相同性表中のウィルス名は、それぞれ以下のウィルスを示す。また表の数値は、対角線上に記載した 100 %の右上が塩基配列の、そして左下がアミノ酸配列の相同性を示す。

KU-2： F I P Vの KU- 2株 I型（GenBank Accession N0.ABO8688I)

Black： F I PVの Black株ノ I型（GenBank Accession No.AB086903)

UCD1： F I PVの UCD1株 I型（GenBank Accession No.AB086902)

FIPV type II : F I P Vの 79- 1146株 Z I I型（GenBank Acc.#X56496)

FECV：ネコ ·腸コロナウィルス（Feline Enteric Coronavirus)の 79- 1683株 (Ge nBank Accession No.AB086904)

CCV：ィヌ ·コロナウィルス（Canine coronavirus)の CCV Insavc-1株（GenBank A cc.#D13096)

TGEV：伝染性胃腸炎ウィルス（Transmissible gastroenteritis virus)の Purdue 株 (GenBank Acc.#M21627, M14878)

KU-2株の N蛋白質のアミノ酸配列を他のウィルスと比較した場合、ネコのコロナウィルス即ち FIPV I型、 11型、 FECV 11型に対しては 90%程度、 CCVと TGEVに対しては 75%程度であった。またネコのコロナウィルス間で互いに比較した場合でも、それぞれが 90%程度のホモロジ一であり、これらのウィルスの間では、遺伝子の多くの部分は保存されているものの、それぞれが独自の遺伝子配列を持つことが示された。

系統樹：

N遺伝子のアミノ酸配列から作成した系統樹を図 3に示した。

N遺伝子の系統樹解析では、ネコのコロナウィルスである FIPV I型、 FIPV I I型、 FECVがーつのグループを形成しており、このグループはィヌ（CCV)ゃブ夕（TGEV)のコロナウィルスとは距離が離れていることを示した。 Κϋ-2株の N遺伝子は、差は小さいものの、ネコのコロナウィルス内でもっとも離れた進化距離を持っていた

〔3〕組換え Ν蛋白質の発現

RT-PCR：

FIPV KU- 2株の塩基配列を元に、 N蛋白質の全長が発現できるように N蛋白質の Open Reading Frame (0 F) の上流と下流に PCR用プライマーを作製した。プライマーにはクロ一ニング用の制限酵素認識配列（BamH Iおよび Sal I) を付加した。

FIPV KU-2株の精製ウィルスから調製したウィルス RNAを铸型にして、 Ol igo dT プライマ一を用いて逆転写反応をおこない cDNAを合成した。続けて 95°C5min- (9 5°Clmin- 55°Clmin- 72°C2min) X 30cyc le- 72°C5minの PCRを行い cDNAを増幅した。 PC R産物の特異性は 1 % Agar o s eゲル電気泳動で確認した。

Cloning：

プラスミドベクター pFastBaclへのクロ一ニングは、 pUC18へのクローニングと同様に実施した。組換え用の制限酵素には BamH Iおよび Sal Iを使用した。宿主大腸菌には HB101株を使用した。クローニングされていることを確認した大腸菌は、アンピシリン加 L- Broth 25mLでー晚培養し、組換え pFastBaclプラスミド DNAを抽出 '精製した。組換えバキュロウィルスの作製：

精製プラスミド DNAを大腸菌 DH10BAC株のコンビテントセルにトランスフエクトし、カナマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシン、 IFTGおよび Bluo-galを加えた寒天平板培地にプレーティングして 37°Cで一 B免培養した。大腸菌 DH10BAC株はバキュロウィルスシャトルベクターである bM0N14272を有し、組換え pFas tBacl をトランスフエクトした DH10BACは、 N蛋白質遺伝子を bM0N14272に組換えることができる。培地上にできたコロニーのうち白色コロニーを選択して釣菌し、カナマイシン、テトラサイクリン、ゲンタマイシン加 L_Broth 25mLで一 B免培養して、組換え bM0N14272 DNAを抽出 ·精製した。

精製した組換え bM0N14272 DNAを CELLFECTINと混合し、シャーレ上のョ卜ゥガ利- 由来細胞 spodoptera furugiperda (SF-9) にトランスフエクトした。トランスフェクト後、混合液を取り除き、 10¾ FCS加 TC-100培養液（Insec t Medium) にて 2 日間培養した。培養上清中に産生されたバキュロウィルスを回収し、この組換えバキュ口ウイルスを発現実験に使用した。

組換え蛋白質の発現：

SF-9細胞を培養フラスコ（225cm²) に 1〜2 X 10⁶ eel l s/mLで接種し 2日間培養した。培養液を除去して組換えバキュロウィルスを接種し、 27°Cで 1時間吸着後、 FB S f ree TC-100培養液を加え培養した。培養 96時間後に感染細胞を回収してリン酸緩衝生理食塩水 (PBS(-)) で洗浄し、 0. 2¾ NP-40加 RSB液 (0. 01M NaCl, 0. 0015M MgCl₂, 0. 01M Tr i s-HCL (pH7. 4) ) を 4mL加え細胞を溶解した。これを 5, 000rpm 10 分間遠心し、沈殿を PBS⁽—〕 lmLに浮遊したものを組換え N蛋白質として実験に使用した。

〔4〕特異性の確認

ウェスタンブロット：

作製した抗原にサンプル緩衝液を加えて 100でで 5分間加熱処理した後、 11%ゲルの SDS-PAGEで展開した。ゲルを取り出し、セミドライタイプの転写装置を使用して PVDF膜に転写した。転写膜は PBS"で洗浄した後 BlockAceに 4でで一晩浸漬しブロッキングした。

一次血清として FIPV N蛋白質に対するモノクローナル抗体（Clone No. E22- 2) 、 FIPV M蛋白質に対するモノクローナル抗体 (Clone No. F18-2) および FIPV S蛋白質に対するモノクローナル抗体 (Clone No. 6-4-2) の培養上清を混合したもの使用した。転写膜を培養上清に浸漬して 37°Cで 2時間反応させた後、 0.05% T ween20¾PPBS (-)で 3回洗浄した。これらのモノクローナル抗体は以下のとおり公知の抗体である。

Clone No. E22 - 2および Clone No. F18-2:

(Hohdatsu T， Sasamoto Τ, Okada S， Koyama H. Antigenic analysis of feline coronavi ruses with monoclonal antibodies (MAbs)： preparation of Abs whic h discriminate between FIPV strain 79-1146 and FECV strain 79-1683. Vet Mi crobiol. 1991 Jun;28(l) :13-24.)

Clone No. 6-4-2：

(Hohdatsu T, Okada S, Koyama H. Characterization of monoclonal antibodies against feline infectious peritonitis virus type II and antigenic relati onship between feline, porcine, and canine coronaviruses. Arch Virol. 199 1; 117(1-2) :85-95.)

2次血清として HRP0標識ゥサギ抗マウス IgG+M+Aを使用した。標識抗体を加えた血清希釈液に浸漬して 37°Cで 1時間反応させた後、 0.05¾ Tween20加 PBS (-)で 3回洗浄した。転写膜を基質液 (0.02¾ DAB, 0.006% H₂0₂> 0.05M Tris-HCl (pH7.6)) に 5〜20分程度浸漬して発色させた後、蒸留水で洗浄し反応を停止させた。

FIPV KU-2株の N蛋白質はそのアミノ酸配列から計算して約 45kDaの発現産物と推定された。実際に昆虫細胞で発現した組換え蛋白質は 40〜45kDaの位置に特異バンドとして検出され、組換え FIPV N蛋白質であることを確認した（図 4) 。また精製 N蛋白質も同様の位置に特異パンドを認めた（図 5) 。 EL ISA：

作製した抗原を固相化用緩衝液（0. 1M炭酸緩衝液）で 2倍〜 128倍まで 2倍階段希釈して ELISAプレートに分注し、 4°Cでー晚静置して固相化した。各 wel lは 0. 05% T ween20加 PBS (-)で 3回洗浄し EL ISAに用いた。

一次血清として抗 FIPV N蛋白質モノクローナル抗体（Clone No. E22-2) の培養上清を使用した。固相化 wel lに培養上清を 0. lmL/wel lで分注し 37°Cで 1時間反応させた後、 0. 05% Tween20加 PBS (-)で 3回洗浄した。 2次血清として HRP0標識ゥサギ抗マウス IgG+M+Aを使用した。標識抗体を加えた血清希釈液で 37°Cで 1時間反応させた後、 0. 05 Tween20加 PBS (-)で 3回洗浄した。 TMB基質液（tetramethylbenzi dine)を 0. lmL/wel l分注し、常温で 20分間の反応後、 H₂S0₄を 0. 05mL/wel l加えて 450 nmの吸光度を測定した。

組換え N蛋白質（図 6 ) と精製 N蛋白質（図 7 ) は、共に抗 FIPV N蛋白質モノクローナル抗体に対してのみ抗原量依存的に反応し、その特異性が確認できた。

〔5〕ワクチンの作製

抗原の調製：

抗原量の測定にはウェスタンプロッティングを用いた。作製した抗原を 8倍〜 5 12倍まで 2倍階段希釈して SDS-PAGEをおこない、抗 FIPV N蛋白質モノクローナル抗体（Clone No. E22-2) を使用したウェスタンブロッテイングで検出した。検出可能な最も希釈倍率が高いレーンに含まれる抗原量を 1ユニットと定め、その希釈の逆数を原液の抗原量とした。ワクチン 1用量に 1 6ユニットの抗原量が含まれるように PBS^Wで希釈して調整した。

アジュバント：

アジュバントとして日本国内で巿販されているネコ用 3種混合不活化ワクチンであるフェリドバック PCR (InterVet社）を用いた。本ワクチンには Adj uvant L80 と水酸化アルミニウムが含まれている。 16ュニット /iiiLに調整した抗原 IfflLとフエリドバック PCR lmL ( 1用量）を混合し、良く混和してワクチンとした。このワクチン 2mLを 1用量とした。

〔6〕免疫試験（1 )

動物：

実験動物には？〜 9ヶ月齢の SPFネコを用いた。組換え N蛋白質ワクチンの免疫群に 4頭を使用した。攻撃対照群には 4頭を使用し、 SF-9細胞を組換え N蛋白質の回収方法と同様に処理して得られた抗原を免疫した

ワクチン接種：

ワクチン 1用量を 3週間隔で 3回、頸部皮下に接種した（図 8 ) 。各免疫の直前に採血をして、その血清の抗体価を測定した。

EL ISAによる抗体価測定：

精製 N蛋白質を 2単位（およそ 100ng/wel l) になるように固相化用緩衝液で希釈して ELISAプレートに分注し、 4でで一晩固相化した。洗浄後、 1次血清として採血したネコの血清を抗体希釈液で 100倍に希釈して 37°C1時間反応させた。洗浄後、 HRP0標識抗ネコ Igを 37°C 1時間反応させた。洗浄後、基質液（tetramethylbenz i dine)を加え常温で 20分発色させ、反応停止液を加えて 450nmで吸光度を測定した。組換え N蛋白質のワクチンを接種した群のいずれのネコも、 2回免疫後 3週目

( 3回目の免疫時）の時点では抗体価の上昇はみられなかったが、 3回免疫後 4週目（攻撃時）には抗体価の上昇が確認された。このうち Cat No. 221では顕著な抗体価の上昇が確認されたが、残りの 3頭に関しては弱い反応のみが認められた。対照として SF- 9細胞から調製した抗原を接種した群では 4頭とも ELISA O. D.値の上昇は認められなかった（図 9 ) 。

中和抗体価の測定：

96 wel lプレートで 2倍階段希釈したネコ血清 0. 025mLと 200 TCID₅。/0. 025mLに調整したウィルス液を等量混合し、 4°Cで 24時間反応させた。これに fcwf- 4細胞を 1 X 10⁶/wel l加え 48時間培養した。 CPE (細胞変性効果）を完全に抑制したネコ血清の最高希釈倍数の逆数を中和抗体価とした。また、通常抗 N蛋白質抗体は中和活性を持たないため、 N蛋白質の免疫により産生された抗体では抗体単独で CPEを抑制することが難しいと考え、補体を添加した中和試験を実施した。即ち、 200 TCID₅。/0.025mLに調整したウィルス液に 10 ゥサギ血清（補体）を加えて同様に反応させた。

組換え N蛋白質免疫群の中和抗体価は免疫開始時と 3回免疫後 4週目（70日目）のいずれにおいても、補体の存在に関わらず全てのネコにおいて 10倍以下となつた。 SF-9細胞抗原接種群においても同様の結果となった（表 2) 。

表 2 中和抗体価

補あ I 補体なしグループ〇 _ε t NO. 接種後接種後抗原接種時 70曰目抗原接種時 70曰目ノキュロウイレス 217 <10 ぐ 10 <10 <10 鉀み換え Ν蛋白質 221 <10 <10 <10 <10 ¾原揍種群 191 ぐ 10 ぐ 10 <10 ぐ 10

6 <10 <10 <10 <10

163 ぐ 10 <10 <10 <10 210 ぐ 10 <10 <10 ぐ 10

S F-9接種群 170 ぐ 10 ぐ 10 <10 ぐ 10

173 <10 <10 <10 <10 細胞性免疫の測定：

ワクチンにより付加された細胞性免疫の程度を確認するために、精製 N蛋白質抗原に対する遅延型過敏反応を皮内反応として測定した。

左の脇腹を剃毛し後 70 エタノールで消毒し、 N蛋白質抗原（O.lmg/mL) 及びコントロールとして PBS⁽—〉を 0. lmLずつ皮内接種した。抗原接種部位は約 4cmの間隔をもって接種した。接種後 24、 48、 72、 96時間に接種部位に現れた腫脹の範囲をノギスで測定することにより測定した。

組換え N蛋白質免疫群の全てのネコで精製 N蛋白質に対し反応が見られた。 Cat No. 217では接種後 24時間後から腫脹が認められ、その後反応は低下し 96時間後には消失した。 Cat No. 191および Cat No. 221では同様に 24時間後から腫脹が認められ、その後低下したが 96時間後でも 2〜3mm程度の腫脹が認められた。 Cat No. 6では 72時間後に腫脹が認められたが最大時で 2腿と反応が弱く 96時間後には消失した（図 1 0 ) 。 PBS"に対しては、全てのネコにおいて腫脹は認められなかった。この結果から、組換え N蛋白質のワクチンにより細胞性免疫が付与されていることが確認できた。

〔7〕攻撃試験（1 )

攻撃方法：

免疫試験（1 ) のネコに対し、 3回目の免疫後 4週目に攻撃試験を実施した (図 8 ) 。

攻撃用ウィルスとして FIPVの I I型である 79- 1146株を用い、その 10⁵TCID₅。（lm L) を経口および経鼻により接種した。臨床症状はウィルス接種日から実験終了まで毎日観察した。体温、体重は 3日毎に測定した。同じく 3日毎に直腸拭い液を採取して後の実験に使用した。また、 6日ごとに採血して血清を分離し、後の実験に使用した。

生存率：

攻撃対照群は 4頭中 4頭が FIPを発症し、 Cat No. 170が攻撃後 23日目、 No. 173 が 26日目、 No. 210が 31日目、 No. 163が 44日目に死亡した。これに対して、組換え N蛋白質ワクチン接種群のネコは、 Cat No. 191が FIPを発症して 48日目に死亡したものの、残りの 3頭においては、感染は認められたものの発症を防御することができ、生残した（図 1 1 ) 。

体温の推移：

組換え N蛋白質抗原免疫群では、攻撃直後に共通して発熱が認められたものの、その後の経過は個体により異なっていた。 Cat No. 217は接種後 3日目に 40でを越える発熱が認められたが、その後は平熱が続いた。 No. 221は接種後 3日目と 27日目から 42日目にかけて 40°C近いまたは越える発熱が認められたがその後低下した No. 191は 3日目と 27日目から 33日目にかけて 4(TCを越える発熱が認められ、その後体温は急激に低下し 48日目に死亡した。 No. 6は 3日目に 4(TCを越える発熱が認められたが、その後は平熱が続いた。一方、攻撃対照群では 4頭ともに二峰性の発熱が確認された。 Cat No. 163は 3 日目と 18〜21日目、 30〜36日目に 4(TC近いまたは越える発熱が認められ、その後急激に体温が低下し、 44日目に死亡した。 No. 210は 3日目と 12〜27日目にかけて 4 0°Cを越える発熱が認められ 31日目に死亡した。 No. 170は 3日目と 15〜18日目にかけて 40 に近いまたは越える発熱が認められ、その後急激に体温が低下し 23日目に死亡した。 No. 173は 3日目と 18〜21日目にかけて 40 を越える発熱が認められ、その後急激に体温が低下し 26日目に死亡した。

体重の推移：

組換え N蛋白質免疫群のうち Cat No. 217と No. 6の 2頭の体重は順調に増加し、 No. 221ではわずかな減少が認められたがほぼ一定に維持した。 No. 191は急激な減少はなかったが徐々に減少し 48日目に死亡した。攻撃対照群では 4頭ともにゥィルス攻撃後から急激に減少し始め、死亡時まで減少を続けた。

EL ISA抗体価：

攻撃後 6日毎の血清中の抗体価を精製 N蛋白質を抗原に使用した ELISAにおいて測定した（図 1 2 ) 。

組換え N蛋白質免疫群の 4頭のうちワクチン免疫による反応が高かった Ca t No . 221は、攻撃直後から抗体価の上昇が始まり 18日目頃にはプラト一に達した。ヮクチン免疫による反応が低かつた残りの 3頭は攻撃後 6日目から抗体価が上がり始めたが、やはり 18日目頃にはほぼプラト一に達した。攻撃対照群の抗体価は 4 頭ともに攻撃後 6日目から上がり始めたが、その反応は免疫群に比較して急激ではなく、 12日目では抗体価はあまり上がらなかった。いずれのネコの抗体価も死亡時まで上昇し続けた。

中和抗体価：

攻撃時、攻撃後 12日目、攻撃後 60日目あるいは死亡時の血清に関して中和試験 (補体不使用）を行った（表 3 ) 。表 3 中和抗体価 Ϊ5Ε

_→ + wr» ~ 79-1146株 ~ 79-1146株 *79 -" 株—

グループ Ca t NO. 接寧時接種後 12曰 ― 接種 ¾60曰 _

- „ , 217 <10 20 6400 生存《fV ^ 221 <10 160 6400 生荐

&蛋曰質 <10 40 6400 死 £

— ίΛ«接種群 6 <10 40 1600 生存

163 <10 80 6400 死亡 S F- 9細胞抗原 210 <10 80 1600 死亡接種群！ <]0 80 800 5Et

173 < 10 80 1600 死亡

*接種後 60日よりも前に死亡した猫については死亡時の値を示した組換え N蛋白質免疫群の中和抗体価は、攻撃時には 4頭全てのネコで 10倍以下であった。攻撃後 12日後には ELISAで高い反応を示した No. 221の中和抗体価は 160 倍であつたが、他の 3頭は 20〜40倍であった。攻撃後 60日目あるいは死亡の中和抗体価は、生存した 3頭のうち 1頭が 1600、 2頭が 6400倍、死亡した 1頭は 6400 倍であった。攻撃対照群の中和抗体価は、攻撃時には 4頭ともに 10倍以下、攻撃後 12日目には 4頭ともに 80倍、死亡時には 800〜6400倍であった。免疫群、攻撃対照群あわせて中和抗体価と経過（生死）との相関は認められなかった。

ウィルス分離：

攻撃後 3日毎に採取した直腸拭い液から RNAを抽出し、 RT- nested PCRでウィルス遺伝子を検出することにより、生体内におけるウィルスの増殖を確認した（表 4) 。

表 4

" ― 79- 1146株接種後の日数

― グループ C a t NO._ o" ~ 3~ 6 — 9 — 12— 15 ― 18 丁キュロウィル f ~" 2Ϊ7 - ~ —- _ - - ~ ~ 一組み換え N蛋白質？ ¾ ニー二：：一二！：抗原接種群 19】 _ + _ _ _ _ †

S F— 9細胞： i - - - - + + - 抗原接種群 = ：；： = + ：：；：：；：

173 - + - - - - -

ウィルス RNA抽出には市販のキット Sepa Gene RV-R (三光純薬、東京）を使用した。抽出した RMに水 0.007mLを加えて溶解し、精製 RNA溶液とした。精製 RNA溶液を 80°C、 5分間加熱後急冷して熱変性を行った。これに逆転写酵素用緩衝液とブライマ一および逆転写酵素を混合して 42で 1時間反応し cDNAを合成した。次に下記組成の反応液に、逆転写反応によって得られた cDNA 1 ^ 1を铸型として加え、滅菌蒸留水 36 1を加えて総量 50 1とした。

lOX react ion buf fer 4. 8 K

2. 5mM/each dNTPs 5 1、

50 /i.M primer mix 1 ii 1 (outer primer set； outer (+)と outer (-) )、 Taq polymerase (luni t/2. 2 1) 2Λ ιι \

これを DNA thermal cyclerにセットし、 PCR法により DNAを増幅した。反応は始めに 94°C 3分の熱変性後、 94°C 1分 (熱変性） · 55°C 1分（アニーリング） · 72°C 2分 (伸長反応）のサイクルを 30サイクル行い、最後に 72 5分の伸長反応を行った。 outer primer setによって増幅された PCR産物の 1 1を使用して、 inner pr imer set (inner (+)と inner (-)）による PCR反応を同様に実施した。 PCRに用いた primerは FCoVの N遺伝子を特異的に認識する。各プライマ一の塩基配列を以下に示す。

outer (+) ： 5'-CAACTGGGGAGATGAACCTT-3' (配列番号： 5 )

outer (-) ： 5，- GGTAGCATTTGGCAGCGTTA- 3， (配列番号： 6 )

inner (+) ： 5'-ATTGATGGAGTCTTCTGGGTTG-3' (配列番号： 7 )

inner (-) ： 5'-TTGGCATTCTTAGGTGTTGTGTC-3' (配列番号： 8 )

PCR用緩衝液に PCR用プライマー、 Taq polymerase及び cDNAを加え 30 cycleの PCR を実施した。 PCR産物は 1% Agaroseゲル電気泳動で確認し、特定の位置にバンドが検出されたものを陽性と判定した

組換え N蛋白質免疫群では 2頭でウィルスが検出された。 Cat No. 191は攻撃後 1 8日目に、 No. 6は 3日目と 18日目にそれぞれ RNAが検出された。攻撃対照群では 3 頭からウィルスが検出された。 Cat No. 163は 12日目と 15日目に、 No. 170は 3日目と 9〜18日目に、 No. 173は 3日目にウィルスが検出された。 Cat No. 6、 170、 17 3では攻撃 3日目にウィルスが検出されたが、これは攻撃直後の発熱の時期と重なる。ウィルス分離の結果と生死に関しては相関性を確認できなかった。〔8〕免疫試験（2 )

動物：

6ヶ月齢の SPFネコを使用し免疫試験（1 ) と同様に実施した。

組換え N蛋白質ワクチンの免疫群に 4頭、 FIPV I I型 KU- 1株由来の精製 N蛋白質ワクチンの免疫に 4頭、攻撃対照群に 4頭を使用した。

ワクチン接種：

ワクチン接種は免疫試験（1 ) と同様に実施した（図 1 3 ) 。

ELISAによる抗体価測定：

組換え N蛋白質免疫群では、 2回免疫 3週目で数頭がわずかな反応を示し、 3 回免疫 4週目には 4頭ともに明らかな上昇が認められた（図 1 4 ) 。精製 N蛋白質免疫群でも 2回免疫 3週目に数頭がわずかな反応を示し、 3回免疫 4週目には 4頭ともに明らかな上昇が認められ、その値は組換え N蛋白質免疫群よりも高かつた。一方、対照群では 4頭ともに反応は認められなかった。

中和抗体価の測定：

中和抗体の測定は、免疫開始前と 3回免疫 4週目（攻撃前）の血清について、補体を使用しない方法でのみ実施した。

組換え N蛋白質免疫群、精製 N蛋白質免疫群、対照群のいずれの群においても，免疫前 ·免疫後ともに全頭で 10倍以下を示し、中和抗体は検出できなかった（表 5 ) 。

表 5

中和抗体価生死

/9~1146株 79-11461* 79-1146株

グループ Cat No. 免疫開始時

伎挫 Βϊ BctS0t 。

177 ぐ 10 <10 40 200 死亡バキュロウィルス

242 < 10 < 10 20 >6400 生存組み換え N蛋白質

245 < 10 ぐ 10 20 3200 生存抗原接種群

247 < 10 < 10 10 3200 生存

175 ぐ 10 <10 20 >6400 死亡精製 RPV抗原由

180 ぐ 10 ぐ 10 40 80 死亡来 N蛋白質抗原

243 ぐ 10 <10 10 >6400 生存接種群

252 < 10 <10 40 >6400 死亡

178 < 10 ぐ 10 10 400 死亡

SF-9細胞抗原 181 ぐ 10 <10 40 3200 死亡接種群 244 ぐ 10 ぐ 10 40 6400 生存

249 ぐ 10 ぐ 10 40 200 死亡

*接種後 60曰より前に死亡した猫については死亡時の値を示した

細胞性免疫の測定：

細胞性免疫を免疫試験（1 ) と同様に精製 N蛋白質に対する遅延型過敏反応として測定した。結果は各群 4頭の平均値として図 1 5に示した。

組換え N蛋白質免疫群では接種後 24時間後から腫脹が認められ、この 24時間をピークとしてその後は徐々に消失した。精製 N蛋白質免疫群では接種後 24時間後から腫脹が認められ、 48時間後に最大となってその後は低下したが、 96時間後でも 1 腿程度の腫脹が残った。

〔9〕攻撃試験（2 )

攻撃方法：

免疫試験（2 ) のネコに対し、攻撃試験（1 ) と同じ方法で FIPV 79-1146を感染させた（図 1 3 ) 。臨床症状の観察、体温、体重の測定、採血および直腸拭い液採取は攻撃試験（1 ) と同様に実施した。加えて咽喉頭拭い液を 3日毎に採取しウィルス分離に供した。

生存率：

攻撃対照群では Cat No. 249が攻撃後 23日目に、 No. 178が 29日目に、 No. 181が 60日目に死亡したものの No. 244は生残し、結果として 4頭中 3頭が死亡した（図 1 6 ) 。これに対し、組換え N蛋白質を免疫した群では Cat No. 177が 19日目に死亡したのみで 3頭が生残した。精製 N蛋白質の免疫群では Cat No. 180が 19日目、 No. 175が 77日目、 No. 252が 78日目に死亡し、結果として 4頭中 3頭が死亡したものの、攻撃対照群に比較すれば延命効果が認められ、ある程度の効果は確認できた。

体温の推移：

組換え N蛋白質免疫群のうち Cat No. 177は攻撃後から体温上昇を続け、 15日目にピークに達した後急激に低下して死亡した。 No. 242は 3日目に発熱した後、一度低下するものの 30日頃から再度発熱ししばらく持続した。他の 2頭は感染初期の発熱は認めたもののその後はほぼ平熱に経過した。

精製 N蛋白質免疫群のうち Cat No. 180は攻撃 3日目と 12日目に 40度を超える発熱の後に急激に体温が低下し死亡した。 No. 252は 40で前後の高熱で推移した後、徐々に体温低下し死亡した。 No. 175は感染初期の発熱の後はほぼ平熱を維持したものの、 72日目に再度高熱を発し 77日目に死亡した。 No. 243はほぼ平熱を維持した。攻撃対照群のうち Cat No. 244はほぼ平熱で推移した。死亡した 3頭では感染初期の発熱の後 12日目頃に一度低下したが、すぐに再発熱し、死亡する数日前に体温低下するまで持続した。

体重の推移：

組換え N蛋白質免疫群のうち、死亡した Cat No. 177は感染直後から減少を続けた。 No. 245と No. 247は順調に増加したが、 No. 242は徐々に減少した。精製 N蛋白質免疫群では、 Cat No. 180は急激に減少して死亡したが No. 252 は徐々に減少して死亡した。 No. 175は体重の増加がみられたものの No. 252と同時期に死亡した。 No. 243は順調に体重増加した。攻撃対照群では、生残した Cat No. 244はわずかに体重増加がみられたが、死亡した 3頭は感染直後から死亡時まで減少し続けた c EL ISA抗体価：

攻撃後 6日毎の血清中の抗体価を精製 N蛋白質の ELISAで測定した（図 1 7 ) 。組換え N蛋白質免疫群と精製 N蛋白質免疫群では基本的に違いはなく、攻撃 6日目には抗体上昇がみられ 12日目にはプラトーに達した。精製 N蛋白質免疫群のうち Cat No. 180は攻撃時には既に高値であつたが、攻撃後さらに上昇した。攻撃対照群では 4頭ともに攻撃後 12日目から反応が見られ、 30日目頃にはブラトーに達した。

中和抗体価：

中和抗体価の推移に関しては組換え N蛋白質免疫群、精製 N蛋白質免疫群、攻撃対照群ともに基本的な違いは認められなかった（表 5 ) 。いずれのネコも攻撃前には 10倍以下であつたが、攻撃後 12日目には 10〜40倍の抗体価を示し、感染後 6 0日に生存したものでは 3200〜6400倍以上となった。 60日以前に死亡したものに関しては、 80〜200倍で低かったが、抗体が十分に産生される前に死亡したものと考えられた。

Fcwf 4細胞を用いたウィルス分離：

48穴プレートで培養した fcwf-4細胞に咽喉頭拭い液および直腸拭い液をそれぞれ 0. 05mL/wel l接種し、 37°Cで 1時間吸着した。細胞面を培養液で洗浄後、維持用 MEMを 0. 5mL/wel l加えて 37°Cで培養した。 2日以内に CPEが観察できたものを陽性とした。その結果は RT-PCRとほぼ同様の結果を示した。直腸拭い液からのウィルス分離では攻撃 6日目〜 1 5日目の間に、組換え N蛋白質免疫群の 2頭と精製 N 蛋白質免疫群の 1頭が、それぞれ 1ないし 2日陽性となった（表 6 ) 。

5 表 6

FIPV 79 - 1146株接種後日数（日) グループ Cat

NO. 6 9 12 15

177 一 — 一一 + + バキュロウィルス

242

組み換え N蛋白質

245

抗原接種群

247

175

精製 FIPV抗原

Fcwf- 4を用いた 180 一一十一 +

由来 N蛋白質

ウィルス分離 243

抗原接種群

252

178

SF- 9細胞抗原 181

244

249

177 + バキュロウィルス

242

組み換え N蛋白質

245 一 - - + + 247 +

175 - +

精製 FIPV抗原

RT - nPCRによる 180 + ― + 一由来 N蛋白質

FCoV遺伝子検出 243

252

178 - + - -

SF-9細胞抗原 181 - - - +

244 +

249

+：ウィルス分離されたもの、または FCoV遺伝子が検出されたもの

-：ウィルス分離されなかったもの、または FCoV遺伝子が検出されたもの咽喉頭拭い液からのウィルス分離では、各群ともに全頭が陽性となり、攻撃後 3〜9日目の間ではほとんどの個体からウィルスが分離された（表 7 ) 。

表 7

FIPV 79- 1146株接種後曰 (曰）グループし &t

NO. 0 3 6 9 12 15

177 ― + + +

バキュロウィルス

242 一 + +

組み換え N蛋白質

245 一 + + +

抗原接種群

247 一 + + + _

175 一 + + + 一 "~ ~ 、精製 F IP V抗原

Fcwf_4を用いた 180 + ― ~~

由来 N蛋白質

ウイレス分離 243 一 + +

抗原接種群

252 ― + + + 一

178 一 + + 一

SF-9細胞抗原 181 一 + 一 +

接種群 244 一 + + 一 ―

249 一 + + +

177 一 + + +

バキュロウィルス

242 一 + +

組み換え N蛋白質

245 一 + + +

抗原接種群

247 一 + + +

175 一 + + +

精製 FIPV抗原

RT-nPCRによる 180 一 + + + + + 由来 N蛋白質

FCoV遺伝子検出 243 一 + +

抗原接種群

252 一 + + +

178 一 + + +

SF - 9細胞抗原 181 一 + +

接種群 244 一 + +

249 一 + + + + +：ウィルス分離されたもの、または FCoV遺伝子が検出されたもの一：ウィルス分離されなかったもの、または FCoV遺伝子が検出されたものウィルス分離（RT- nested PCR) ：

攻撃試験（1 ) における直腸拭い液からのウィルス分離は感度が低かったために、攻撃試験（2 ) では咽頭喉拭い液からウィルス分離も実施した。直腸拭い液と咽喉頭拭い液は攻撃後 3日毎に採取し実験に用いた。直腸拭い液からの RT- PCR では攻撃試験（1 ) とほぼ同様の結果が得られ、組換え N蛋白質免疫群では 4頭中 3頭、精製 N蛋白質免疫群では 2頭、攻撃対照群では 3頭が、それぞれ 1〜2 日陽性になった（表 6 ) 。咽喉頭拭い液からの RT-PCRでは各群ともに全頭が陽性となり、攻撃後 3〜9日目の間ではほとんどの個体からウィルスが検出された。しかし攻撃後 15日目には Cai No. 180を除き陰転した（表 7 ) 。

〔1 0〕大腸菌発現抗原に対するネココロナウィルス感染ネコ血清の反応性大腸菌による組換え蛋白質の発現：

大腸菌における発現には glutathion S- trans ferase (GST) との融合蛋白質を発現するプラスミドベクタ一 pGEX- 2T (Pharmacia) を使用した。 N蛋白質の発現には FIPV I型である KU-2株の遺伝子を使用した。 N蛋白質全域が発現するように開始コドン ATGから終始コドン TAAまでを GSTコード領域下流のクローニングサイトに揷入した。 S蛋白質の発現には KU-2株と FIPV I I型である KU-1株の遺伝子を使用した S蛋白質のうち、特に株による変異が大きい領域であるシグナルペプチド配列を除く N末端の約 2 5 0アミノ酸をコ一ドする領域を、 N蛋白質と同様にクロ一二ングした。トランスフォームを確認した大腸菌を 37Όで 2時間培養した後、 IPTG を ImM加えて更に 3時間培養し、組換え蛋白質の発現を誘導した。この菌液を遠心して菌体を集め、緩衝液で洗浄した後ウェスタンプロッティングアツセィに使用した。 FIPV I型 KU-2株 N蛋白質と GSTの融合蛋白質を rIExN 、 FIPV I型 KU- 2株 S蛋白質の一部と GSTの融合蛋白質を rIExS、 FIPV 11型 KU-1株 S蛋白質の一部と GSTの融合蛋白質を rl lExSとした。

感染ネコ血清：

SPFネコ 5頭に、 FIPV I型の KU- 2株、 Bl ack株、麵株、 FIPV 11型の 79- 1146株、 FECV I I型の 79- 1683株の培養液をそれぞれ接種して感染させ、経時的に採血をして抗体価が最大になつた時の血清を感染ネコ血清とした。

ウェスタンブロット：

作製した抗原にサンプル緩衝液を加えて加熱処理した後、 1 ^ゲルの SDS- PAGEで展開した。ゲルを取り出して PVDF膜に転写し、洗浄後 BlockAceに 4°Cで一晚浸漬しブロッキングした。一次血清として各ネココロナウィルスに感染した感染ネコ血清を使用した。転写膜を一次血清に浸漬して 37°Cで 2時間反応させた後、 0. 05% T ween20加 PBS⁽—〉で 3回洗浄した。 2次血清として HRP0標識抗ネコ IgG+M+Aを使用した。標識抗体を加えた血清希釈液に浸漬して 37°Cで 1時間反応させた後、 0. 05% T ween20加 PBS⁽—〉で 3回洗浄した。転写膜を基質液 (0. 02% DAB, 0. 006% H₂0₂, 0. 05M Tr is-HCl (pH7. 6) ) に浸漬して発色させた後、蒸留水で洗浄し反応を停止させた：結果は図 1 8に示した。

FIPV I型である KU-2株と Black株の感染ネコ血清は rIExS蛋白質と r lExN蛋白質に反応したが、 UCD1株感染ネコ血清は r ΙΕχΝ蛋白質に反応したが r IExS蛋白質には反応しなかった。 FIPV I I型である 79- 1146株の感染ネコ血清は rl lExS蛋白質と rlExN 蛋白質に反応した。 FECV I I型である 79-1683株感染ネコ血清は rlExN蛋白質にのみ反応した。即ち、 KU- 2株の組換え N蛋白質はいずれのネココロナウィルス感染血清に対しても良好な反応性を示した。産業上の利用の可能性

本発明は、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス感染の治療および Zまたは予防のためのワクチン、並びに方法を提供する。本発明のワクチンは、前記 a) - e)に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質を抗原として利用する。これらの蛋白質の利用によって、幅広い株に対する予防および/または治療効果を期待できるワクチンとすることができる。またこれらの蛋白質が感染増強ェピトープを含まないため、本発明のワクチンには高い安全性を期待できるネコ伝染性腹膜炎ウィルスは、発症後は致死的な経過を取ることが多い重篤な感染性疾患である。これまでに様々なワクチンが試みられてきたが、その評価は定まっていない。一方本発明のワクチンは、既知のワクチンに比較して予防効果に優れ、かつ安全性も高い。したがって、本発明のワクチンの、ネコ伝染性腹膜炎ウィルスの予防や治療における有用性は明らかである。

更に本発明は、前記 a) - e)に記載のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有する蛋白質を抗原として利用する、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス感染の診断方法、並びにそのための試薬を提供する。本発明の診断方法あるいは診断試薬は、幅広い株の感染を、容易にかつ迅速に診断することができる。ネコ伝染性腹膜炎ウィルス感染の診断方法に基づくスクリーニングによって、この疾患の感染状況の調査に有用である。感染状況の調査は、 FIPVの予防医学上、重要な情報となる。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

Claims

請求の範囲以下の a) - e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列を含む蛋白質を有効成分として含有するネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および Zまたは予防用ワクチン。

e) a) -d)に記載されたポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるァミノ酸配列から選択された、 4 5アミノ酸残基以上からなる連続するアミノ酸配列をコ一ドするポリヌクレオチド。

以下の a) - e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドを有効成分として含有するネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および Zまたは予防用ワクチン。

e) a) - d)に記載されたポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるァミノ酸配列から選択された、 4 5アミノ酸残基以上からなる連続するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。

3 . ポリヌクレオチドが、 a)または b)に記載のポリヌクレオチドである請求項

1または請求項 2に記載のワクチン。

4. 以下の a) - e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列からなる蛋白質との結合能を有する抗体を有効成分として含有するネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および/または予防用抗体製剤。

e) a) - d)に記載されたポリヌクレオチドのいずれかによってコードされるァミノ酸配列から選択された、 4 5アミノ酸残基以上からなる連続するアミノ酸配列をコ一ドするポリヌクレオチド。

5 . 請求項 1、請求項 2、および請求項 3のいずれかに記載のワクチンを少なくとも 1回ネコに投与するプロセスを含む、ネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および Zまたは予防のための方法。

6 . 請求項 4に記載の抗体製剤を少なくとも 1回ネコに投与するプロセスを含む、ネコ伝染性腹膜炎ウィルスの治療および Zまたは予防のための方法。

7 . 以下の a) -e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列を含む蛋白質とネコの血清をィンキュベートし、該蛋白質と結合する抗体を検出する工程を含む、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス感染の検査方法。 a) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域を含むポリヌクレオチド、 b) 配列番号： 2に記載のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、

c) 配列番号： 1に記載の塩基配列のコード領域の塩基配列と 93以上の相同性を有する塩基配列を含むポリヌクレオチド、

e) a) -d)に記載されたポリヌクレオチドのいずれかによつてコ一ドされるァミノ酸配列から選択された、 4 5アミノ酸残基以上からなる連続するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。

以下の a) -e)のいずれかに記載のポリヌクレオチドによってコードされるァミノ酸配列を含む蛋白質を含む、ネコ伝染性腹膜炎ウィルス感染の検査用試薬。

e) a) -d)に記載されたポリヌクレオチドのいずれかによつてコードされるァミノ酸配列から選択された、 4 5アミノ酸残基以上からなる連続するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。