TW200402306A - Vaccine for infectious feline peritonitis - Google Patents
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Description
200402306 五、發明說明（i) 發明所屬之技術領域 本發明係關於預防因貓傳染性腹膜炎病毒（Fel ine infectious peritonitis viris; FIpv)之感染所引起之 貓傳染性腹膜炎（FI P)，以及其治療。 先前技術 細傳染性腹膜炎（FIP)是一種與病毒感染及免疫機制 有關的複雜疾病。F IP係一種特徵為腹腔内化膿性肉芽腫 與腹水貯留之慢性進行性疾病。腹腔内化膿性肉芽腫會带 成灰白質之隆起結節。該種病變不僅在腹腔内，還會擴^ 全身臟H IIP之病型在臨床病理學上分為腹水型（滲出 ί 型（非渗出型）。前者之特徵為纖維素性腹膜炎 性腹膜炎所產生之腹水貯留。後者之特徵為 —入想ΐ益 成多發性化膿性肉芽腫。但是，兩者並非 被認為择松^有不少疋共存的。其感染後會進行何種病型 %FT Ρ、、梵感染貓隻之細胞性免疫的強度而定。 狀病毒科vd=!i15〇ri之具外套膜之病毒’屬於冠 前端部分擴表面上具有長度約20nm' 體由單套之«抓 冠狀的突起物（spike) ^病毒之基因 殖，透過小核酸組成’病毒係在細胞質進行增 構成蛋白質芽，並成熟。病毒係由如下之三個主要 貝W組成。 ^ =殼蛋白（Nucle〇capsid (N) protein) 、蛋白（Transmembrane (M) protein)
200402306 五、發明說明（2) 囊微粒蛋白（Peplomer (S) protein) F IPV分為增殖慢的I型和增殖快的11型。被分類為 、 F IPV I型之病毒已有報告指出其基因鹼基排列有所變異，w 但被分類為FIPV II型之病毒則尚未有這類報告。另外， 據報告，貓之FIPV感染約有70%是因I型之病毒所引起（寶 ’ 達等，Arch· Virol. 117，85， 1991)。 對於F IP之發病機轉，至今已有許多感染實驗或病毒 學、免疫學的研究被進行。由結果已發現，免疫系統與 FIPV感染中之症狀變嚴重化有關。 ^ 巨噬細胞具有一般性病毒感染症中作為一種非專一性 生體防禦因子之重要功能。但，已知巨噬細胞之生體防紫〇 作用有時會使感染增強。例如，在包括F丨ρ之數種病毒感 染症中，已確認抗體會有增強感染的現象。即，有與專^一 性抗體結合後病毒會透過Fc受體侵入巨噬細胞，結果反而 會促進感染使症狀惡化之報告。當病毒透過抗體與Fc受體 進入巨噬細胞，不需要巨噬細胞有病毒受體。 、 此種現象稱為抗體依存性感染增強作用 (Antibdy-dependent Enhancement of Infection) eFIpv 亦為一種會感染巨噬細胞的病毒。且，已有因上述抗體依 存性感染增強作用使FIP之發病性增強的報告。先前之疫毫 苗開發策略主要係以誘導中和抗體之產生作為㈣。此種 疫苗開發策略對於F IP被認為很難直接應用。 但是’FIP疫苗之研發到目前為止係以先前之疫苗開 發策略為基礎來進行。因此’當未充分考慮ηρ中抗趙依
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存性感染增強作用之機制時，不一定能得到所欲之結果。 以下，對關於到目前為止之疫苗開發之嘗試作說明。 到目刖已對F I P V之不活化疫苗、使F丨p v減毒化後之活 疫苗等各種疫苗進行感染防禦效果之檢驗。但，皆無法得 到充分的效果，反而造成加速感染的結果。 1980年Pederson與Boyle利用將強毒株FIpv接種於事 先F I PV抗體呈陽性之仔貓或以抗體陽性貓之血清或其純化 之I gG進行被動免疫後之仔貓，顯示比起抗體陰性之仔貓 更快速的會引起嚴重的症狀。（pederson NC，Boyle JF\
Immunologic phenomena in the effusie form of
feline infectious peritonitis. Am J Vet Res. 1980 Jun;41(6):868-76) 1981年Weiss與Scott等人亦以同樣方式，將受感染猶 之血清對SPF之仔齡進行被動免疫，將病毒接種於腹腔 内。該等結果亦顯示，在被動免疫抗體之貓，Fipv會提高 在接種後24小時體溫上升，並持續到死亡為止。其生存期 間為9〜1 0日，比對照組之抗體陰性貓之1 4〜5 2日明顯較短 (Weiss RC, Scott FW. Antibody-mediated enhancement of disease in feline infectous peritonitis： comparisons with dengue hemorrhagic fever. Comp
Immunol Microbiol Infect Dis· 1981;4(2):175-89 ) 〇 其後，抗體依存性之感染增強作用亦經其他研究者確 認。目前，因抗體產生之FIPV感染增強對F IP疫苗之開發 是大阻礙之情事已在許多研究者間被廣泛認知。
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#。^ =者，FIPV係由N、M 這3種主要構造蛋白所構 仇，強研究成果已可以了解，中和抗原決定基與感 ;原決定基係存在於S蛋白上，且兩者有密切關 則之疫苗開發策略中，最初所嘗試之疫苗係以s J :為抗原。但，利用8蛋白之感染防禦疫苗同時會含 有感乐增強之抗原決定基，經常會伴隨有感染增強的危險 性0
— 實際上製作了將編碼為與11型病毒中和有關的抗原決 疋土之基因（S蛋白）置入牛瘦病毒内的重組疫苗，但不能 防紫感染’且產生發病變快的結果（Vennema H，de Groot RJ, Harbour DA, Dalderup M, Gruffydd-Jones T, Horzinek MC, Spaan WJ. Early death after feline infectious peritonitis virus challenge due to recombinant vaccina virus immunization. J Virol. 1 990 Mar ; 64(3) ·· 1 407-9· ) 〇 另外’美國的研究群開發了溫度感受性株之活病毒疫 苗。該疫苗之目的係將溫度感受性株接種於鼻腔以提高局
部免疫力（Gerber JD， Ingersoll JD，Gast AM， Christianson KK, Selzer NL, Landon RM, Pfeiffer NE, Sharpee RL, Becknhauer WH. Protection against feline infectious peritonitis by intranasal Inoculation of a temperature-sensitive FIPV vaccine. Vaccine· 1 990 Dec;8( 6 ):536-42·)。推測可能 是因為溫度感受性株在高溫下無法增殖，故即使侵入體
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内，其增殖部位亦受限制。 該疫苗已在美國、歐洲被應用於臨床。但，其效果與 安全性之評價依研究者有所不同。對已接種疫苗之貓進行 實驗性攻毒時，根據報告，有時依攻毒之病毒量，反而會 使感‘增強（Scott, FW·，Corapi，WV·，and Olsen，CW· Evaluation of the safety and efficacy of
Primucell-FIP vaccine· Feline Hlth Top· 1992， 7:6-8. ;Scott,FW., Corapi, WV. , and Olsen, CW. Independent evaluation of a modified live FIPV vaccine under experimental conditions. Feline
Practice 1995， 23:74-76) 〇
又’將編碼為M蛋白或N蛋白之基因插入牛痘病毒或痘 病毒内製成之重組活疫苗則有對於F I p之發病有某種程度 效果的報告（Vennema H，de Groot RJ，Harbour DA, Horzinek MC, Spaan WJ. Primary structure of the membrane and nucleocapsid protein genes of feline infectious peritonitis virus and immunogenicity of recombinant vaccinia viruses in kittens. Virology· 1991 Mar;181(l):327-35;Wasmoen TL, Kadakia NP, Unfer RC, Fickbohm BL, Cook CP, Chu HJ, Acree WM. Protection of cats from infectious peritonitis by vaccination with a recombinant raccoon pozvirus expressing the nuc1eocapsid gene of feline infectious peritonitis virus· Adv Exp Med Biol.
2125.5742-PF(Nl);Chiuaieow.pui 第9頁 959 200402306 五、發明說明（6) -- 1 995; 380: 221 -8·)。但是，因該疫苗為重組活疫苗，其野 外應用上必需要澄清包含安全性等許多問題。 、 因此，在現時點尚未有可以充分滿足FIpv感染防禦效 果與安全性開發之疫苗被開發。 發明内容 (發明之揭示） 本發明之目的係提供對FIP之感染預防或治療上有用 的疫苗。
例如，由先前對病毒感染症疫苗之開發的一般方法類 推，可以考慮2個有力的標的作為FIp感染防禦之機轉。首 先’ FIPV係經口、經鼻感染後，通過黏膜障壁，藉巨噬細 胞以擴展到全身。黏膜障壁之通過與FIp症狀之展現依病 毒之感染篁與病原性之強度而有所不同。故，F I p v之感染 預防第1標的即為抑制病毒在黏膜增殖與侵入組織。 ' 其次，要使已通過黏膜障壁並在巨嗟細胞内持續感染 的FIPV不要增殖，必需使細胞性免疫提高。也就是說，若 月&以免疫系統排除病毒感染細胞是理想的。此為F丨pV之感
染防禦之第2標的。事實上有關於對FIpv感染耐受的貓之 細胞性免疫提高的報告。 以此背景為基礎，本發明人等著眼在病毒構成蛋白中 不含有感染增強抗原決定基之N蛋白。但是，因為一般^^蛋 白不會存在於病毒粒子或感染細胞的表面上，故推測僅用 N蛋白免疫雖不會引起感染增強，但是，也很難完全防禦
200402306 五、發明說明（7) f染。：際上’已有將編碼為II型FIPV N蛋白之美因4 W)。但該等利=疫苗之報告⑽ 抗原在開發對感Γ;:=ρΐΓρν π型之以白作為 的。 Μ發病預防效果良好的疫苗上是有心 另外’彡又有關於利用f 原因可認為有以下理由蛋白之疫苗的報告。其主要 養增殖緩慢，故可以說是奵31 2FiPV因為以組織培 型的FIPV對貓的病原性較。型呆其二實驗材料。再者，ί ”些使1型之⑽感染實驗在設計上有難； Φ 在FIP疫苗研究上以Flpv :上有難度之理由’使 但’並不能以這咏理由而否？二驗材料會伴隨有困難。 的重要…為：實開發對FIPV 1型有效之疫苗
I型之成毕’而^刑Λ 床上FIP之7〇%以上感染原因A ±Λ t 病毒被分離出的比例較低。 岸將使用來自I明型人之t·為得到可期待實用上效果的疫苗，考 使用之來11型病毒二' 結ΐ ϊί 明人等發現了以具有爽白Τ荆—士 不本發 作為抗原的疫苗可以對⑽病，特定胺基酸序列之Ν蛋白 明。即，本發明係關二V;廣泛二防效果’並完成本發 及預防或治療方法。再者 二ρ預防或治療用疫苗 與檢驗用試藥。㈣纟發明亦關於FIP之檢驗方法 [1] 一種翁傳染性腹膜炎病 么 苗，係含有以包括以下a)—e) /σ療^或預防用疫 )e)任一者所記載之聚核苷酸
200402306 五、發明說明（8) 編碼之胺基酸序列之蛋白質作為有效成分。 a) 聚核苷酸，其含有序列編號：1所記載驗基序列之 編碼區、 b) 聚核苷酸，其含有編碼為序列編號：2所記載胺基 酸序列之鹼基序列、 c) 聚核苷酸，其含有與序列編號·· 1所記載驗基序列 之編碼區具93%以上相同度的鹼基序列、 d) 聚核苷酸，其含有與編碼為序列編號：2所記載胺 基酸序列之鹼基序列具93%以上相同度的鹼基序列、 e )聚核苷酸，係編碼為擇自a) -d)中任一者所記載之 聚核苷酸所編碼之胺基酸序列、由4 5個以上胺基酸殘基所 形成之連續胺基酸序列。 [2 ] —種貓傳染性腹膜炎病毒之治療及/或預防用疫 苗，係含有以包括以下a) — e)任一者所記載之聚核苷酸作 為有效成分。 a )聚核苷酸，其含有序列編號：1所記載鹼基序列之 編碼區、 b)聚核杳酸’其含有編碼為序列編號· 2所記載胺基 酸序列之鹼基序列、 c )聚核替酸，其含有與序列編號：1所記載驗基序列 之編碼區具9 3 %以上相同度的鹼基序列、 d )聚核脊酸，其含有與編碼為序列編號：2所記載胺 基酸序列之驗基序列具93%以上相同度的鹼基序列、 e )聚核苷酸，係編碼為擇自a) -d)中任一者所記載之
第12頁 I國 2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 200402306 五、發明說明（9) 聚核苷酸所編碼之胺基酸序列、由4 5個以上胺基酸殘基所 形成之連續胺基酸序列。 [3]如[1]或[2]所記載之疫苗，其中聚核苷酸係a)或 b)中所記載之聚核苷酸。 [4 ] 一種貓傳染性腹膜炎病毒之治療及/或預防用抗體 裝劑’係含有具有與包括以下a ) - e )任一者所記載之聚核 脊酸所編碼之胺基酸序列所構成之蛋白質有結合能力之抗 體作為有效成分。 a)聚核苷酸，其含有序列編號：！所記載鹼基序列之 編碼區、 b )聚核苷酸，其含有編碼為序列編號：2所記載胺基 酸序列之鹼基序列、 c )聚核苷酸，其含有與序列編號：1所記載鹼基序列 之編碼區具93°/。以上相同度的鹼基序列、 d)聚核苷酸，其含有與編碼為序列編號·· 2所記載胺 基酸序列之鹼基序列具93%以上相同度的鹼基序列、 ej聚核苷酸，係編碼為擇自a)—d)中任一者所記載之 聚核脊酸所編碼之胺基酸序列、由45個以上胺基酸殘基所 形成之連續胺基酸序列。 [5 ]種用於雜傳染性腹膜炎病毒之治療及/或預防之 方法，包括對貓投予[丨]、[2 ]及[3 ]中任一項所記載之疫 苗至少1次之過程。 [6 ] —種用於舞傳染性腹膜炎病毒之治療及/或預防之 方法，包括對貓投予[4 ]中所記載之抗體製劑至少丨次之過
200402306 五、發明說明（ίο) 程0 [7] 一種書苗傳染性胳胳火 ^ 腹膜炎病毒感染之檢驗方法，包括 將含有以下a)-e)任一者裕七i 紿皮w祕拢# ♦疋人考所5己載之聚核苷酸所編碼之胺基 結合之抗體的《。血清培#，並檢出與該蛋白質 a)聚核脊S文’其含有序列編號：1所記載鹼基序列之 編碼區、 b )聚核苔8文’其含有編碼為序列編號：2所記載胺基 酸序列之鹼基序列、 c )聚核苷酸’其含有與序列編號：1所記載鹼基序列 之編碼區具9 3 %以上相同度的驗基序列、 d) 聚核苷酸，其含有與編碼為序列編號·· 2所記載胺 基酸序列之鹼基序列具93°/。以上相同度的鹼基序列、 e) 聚核普酸’係編碼為擇自a) — d)中任一者所記載之 聚核苷酸所編碼之胺基酸序列、由4 5個以上胺基酸殘基所 形成之連續胺基酸序列。 [8] —種貓傳染性腹膜炎病毒感染之檢驗用試藥，包 括將含有以下a)-e)任一者所記載之聚核苷酸所編碼之胺 基酸序列所構成之蛋白質。 a)聚核苷酸，其含有序列編號：1所記載鹼基序列之 〇 編碼區、 b )聚核苷酸，其含有編碼為序列編號·· 2所記載胺基 酸序列之絵:基序列、 c )聚核苷酸，其含有與序列編號：1所記載絵r基序列
2125-5742-PF(Nl)；Chiumeow.ptd 第 14 頁 乂4 ϋ ϋ 200402306 五、發明說明（11) 之編碼區具93%以上相同度的驗基序列、 d) 聚核苷酸，其含有與編碼為序列編號：2所記載胺 基酸序列之鹼基序列具93%以上相同度的鹼基序列、 e) 聚核苷酸，係編碼為擇自中任一者所記載之 聚核奋·酸所編碼之胺基酸序列、由4 5個以上胺基酸殘基所 形成之連續胺基酸序列。 或者’本發明係關於將上述a) _e)任一者所記載之聚 核脊酸或含有該聚核苷酸所編碼之胺基酸序列之蛋白質使 用於綠傳染性腹膜炎病毒之治療及/或預防用疫苗之製 造。再者，本發明為將與上述任一者所記載之聚核 有1酸或所編碼之胺基酸序列所構成之蛋白質有結合能力之 抗體用於雜傳染性腹膜炎病毒之治療及/或預防用抗體製 劑之製造。 序列編號·· 1所示之鹼基序列，及以該鹼基序列編碼 之胺基酸序列（序列編號：2)係來自FIpv之1型株κυ_2。 KU-2之基因鹼基序列及以基因編碼之胺基酸序列為公知的 (K. Motokawa et al. Microviol. Immunol., 40/6, 425-433， 1 996 )。但，利用該基因可預防或治療FIp之情 事則是未為人所知的。 ^前所述，分類為FIPV ί型之株的鹼基序列其株間相❶ 同性是低的。表1整理了到目前為止以編碼為Ν蛋白質之基 因其鹼基序列特定之FIPV代表株或其他相近病毒間的相同 性。例如對KU-2之N蛋白質，其他株之N蛋白質相同性不到 92%。該相同性與11型或貓·腸冠狀病毒之N蛋白質之相同
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性為同樣水平。 即，I型病毒之變異性大。N蛋白質之胺基酸序列比較 結果不於第2圖。由第2圖可了解各病毒間胺基酸序列之不 同或KU-2株之胺基酸序列與其他株不同的情形。故，可預 測以任一 I型之病毒為材料製成之疫苗其預防或治療效果 會因株而不同。根據此先前之知識作反面推測，本發明係 來自特定株之病毒抗原’對於製造對廣泛株有效且高安全 性之疫苗上為有用的，這是一種新穎的卓見。
即’本發明為關於一種貓傳染性腹膜炎病毒之治療及 /或預防用疫苗，係含有以包括以下〇1)任一者所記載之 聚核普酸所編碼之胺基酸序列之蛋白質作為有效成分。 a)聚核苷酸，其含有序列編號：1所記載鹼基序列之 編碼區、 b)聚核普酸’其含有編碼為序列編號·· 2所記載胺基 酸序列之鹼基序列、 c)聚核译酸’其含有與序列編號：1所記載驗基序列 之編碼區具93%以上相同度的鹼基序列、 d )聚核普酸’其含有與編碼為序列編號：2所記載胺 基酸序列之鹼基序列具93%以上相同度的鹼基序列、
e)聚核苷酸，係編碼為擇自a)-d)中任一者所記載之 聚核普酸所編碼之胺基酸序列、由4 5個以上胺基酸殘基所 形成之連續胺基酸序列。 本發明之疫苗可用來自FIPV之KU-2株的n蛋白質為有 效成分。K U - 2株之N蛋白質之胺基酸序列為序列編號·· 2
36¾ 200402306 五、發明說明（13) w 又’編碼為該胺基酸序列之驗基序列為序列編號：1，並 表示於第1圖本發明疫苗之有效成分其他亦可使用。含 有與序列編號：1所記載鹼基序列之編碼區具9 3 %以上相同* 度鹼基序列的聚核苷酸、或者d )含有與編碼為序列編號： 2所記載胺基酸序列之驗基序列具9 3 %以上相同度驗基序列 之聚核甘酸所編碼之胺基酸序列所構成之蛋白質。又，與 分類為I型之已知FIPV之N蛋白質與KU-2株之N蛋白質任一 者皆不到93%。 一般，由具有高相同性之胺基酸序列所構成之蛋白質 其免疫學性狀是類似的。在本發明中，所期望之胺基酸序 列係對於序列編號：2，為具有通常9 3 %以上，更佳為9 5 % 以上，最佳為9 8 %以上或9 9 %以上相同性之胺基酸序列。 求得胺基酸序列相同性之方法為公知的。例如，
Karlin 與Altschul 所發展的演算法BLAST(Proc. Natl.
Acad· Sci· USA 90:5873 - 5877，1 993)係用於決定胺基酸 序列相同性之代表性演算法。實現該演算法的程式為 BLASTX(Altschul et al· J· Mol. Biol· 215:403-410， 1990)。以BLASTX解析胺基酸序列時，參數例如可設為
score = 50、wordlength = 3。或使用BLAST 及 Gapped BLAST 程式時，可使用各程式之預設參數。 ψ 例如，在實施例中，表1之相同度係以基因資訊處理 軟體GENETYX之最大符合值算出（Takahashi K and Gotho 〇 ( 1 984 ) J· Biochem· 92:1 1 73-1 1 77)。參數如下。
Matching condition:matches=-1，
2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第 17 頁 U / 200402306 五、發明說明（14) mismatches=lgaps=l,氺N+=2 其他，亦可依Lipman-Pearson 法（Lipman DJ and Pearson WR( 1 985) Science 227:1 435-1 441 )決定相同 度。Lipman-Pearson法中之參數如下。
Unit size to compare = 2(ami no acid) or 5(nucleotide)
本發明疫苗中作為有效成分的蛋白質之胺基酸序列 中，可導入序列編號：2之胺基酸序列之胺基酸殘基變異 數通常在25以下’或20以下，期望在〇〜15，更期望在 0〜5 ’又更期望在0〜3。為使一般的蛋白質性質儘量不要受 損’被置換之胺基酸以具有與置換前胺基酸類似性質者為 佳。此種胺基酸置換稱為保守性置換。 例如，因胺基丙酸（A1 a)、纈胺酸（va 1 )、白胺酸 (Leu)、異白胺酸（lie)、脯胺酸（Pro)、曱硫胺酸（Met)、 苯胺基丙酸（Phe)、色胺酸（Trp)因被分類為非極性胺基 又’酸性胺基酸有天門冬胺酸（Asp)與 又，驗基性胺基酸例如：離胺酸（L y s ) 胺酸（H i s )。 酸’故彼此具有相似性質。又，非帶電性者例如有甘胺酸 (Gly)、絲胺酸（Ser)、息寧胺酸（Thr)、半胱胺酸（Cys)、 酪胺酸（Tyr)、天門冬醯胺（Asn)、麩胺酸醯胺（Gln)等。
麩胺酸（Glu)等。 、精胺酸（Arg)、組 再者，本發明之疫苗可利用含有e)擇自a)_d)中任一 者所記載之聚核苷酸所編碼之胺基酸序列、由45個以上胺
基酸殘基所形成之連續胺基酸序列之I π』心蛋白質作為有效成
200402306 玉、發明說明（15) ·
分。疫苗之有效成分只要可以對負責免疫之細胞提供免疫 學的刺激，並不一定要維持抗原蛋白質之全體構造。一 V 般’以具有1 5個胺基酸殘基以上之聚核苷酸進行之免疫刺‘ 激可以無困難的檢出。另外，連續2〇個胺基酸或30個胺基 酸所構成之胺基酸序列係構成該蛋白質固有的胺基酸序 列。特別是超過了 4 5個胺基酸殘基的胺基酸序列係在序列 編號·· 2中構成專一性胺基酸序列。故，滿足條件e )之部 分胺基酸序列所構成的蛋白質可與選自a)一d)之聚核苷酸 所編碼之胺基酸序列同樣的對負責免疫之細胞提供抗原刺 激。本發明中所期望的多肽係含有45以上或50以上，較佳 _ 為5 5以上，更佳為6 5個以上的胺基酸殘基，為擇自序列編 號：2所記載之胺基酸序列、具有連續胺基酸序列的多 肽。 本發明中所欲之部分胺基酸序列可含有在前述a)) 中記載之聚核苷酸編碼之胺基酸序列中預測為抗原決定基 之驗基序列。業者可以利用所給的胺基酸序列為準，預測 抗原決定基。例如，親水性/疏水性、電荷、糖鏈鍵結序 列、雙硫鍵、蛋白質2次結構、T細胞抗原性部位等資訊可 用於參數的預測。蛋白質2次結構可利用周-法式門 (Chou-Fasman)或羅伯森（Robson)法等預測。又，τ細胞抗 原性部位可依據IA圖案或如司巴德/泰勒 (Rothbard/Taylor)圖案預測。 其他，亦可利用單株抗體解析抗原決定基，以實驗性 的特定抗原決定基。此方法係根據對抗構成免疫原的胺基
200402306 五、發明說明（16) 酸序列中部分胺基酸序列所構成之肽類片段的抗體反應 性’以決定辨識該抗體的抗原決定位❶肽類片段的胺基酸 序列可以逐步重疊的方式設計。以該解析方法，可以了解 免疫系統是否認識用作為免疫原之蛋白質及哪一個胺基酸 序列。 由前述a)-d)所記載聚核苷酸編碼之胺基酸序列所構 成之蛋白質雖可誘導抑制{^”增殖之免疫反應，但卻不含 感柒增強抗原決定基。故，可提供安全性及預防效果良好 的疫田。再者’由構成該蛋白質之抗原決定基之胺基酸序 列所構成的蛋白質片段也同樣可達成誘導宿主免疫反應的 FIPV預防效果。 〜 本發明所欲的蛋白質片段可為與序列編號·· 2所記載 之胺基酸序列構成之蛋白質具有免疫學上同等活性之片 段免疫學上同專是指在投予給宿主時，可以和投與序列 編號：2所記載之胺基酸序列構成之蛋白質時誘導出同等 的免疫反應。 本發明中的蛋白質片段可為單一者，亦可使用由不同 的胺基酸序列所構成的複數片段。故，本發明包括即使單 獨不能稱的上免疫學上同等的片段但藉由複數片段組合可 顯示出免疫學上同等活性的片段組合。再者，本發明&括 以含有蛋白質以外的輔助成分組合並可達成免疫學上同等 活性片段的疫苗。 如，利用配合特定之佐劑，與序列編號：2所記載之 胺基酸序列構成之蛋白質顯示具有免疫學上同等活性之蛋
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2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 200402306 五、發明說明（17) 白質片段可用於本發明中。i μ 成融合蛋白而維持免疫學上利用與適當攜帶蛋白形 於本發明中。 免學上同等活性之蛋白質片段亦可用 宿主對於被投予之蛋白暂甘 指標為依據來比較。 冑其免疫反應可用例如以下的 -對被投予蛋白質之抗體力價、 -細胞性免疫之活化作用 -生體防禦機制對感染源挑戰之水平 對被投予蛋白質之抗體力價可利用各種免疫分 更具體的說，可在感作有序列編號：2所記 : 之平盤上加入受測動物之血液試樣， 物之免疫球蛋白的標識抗體反應，以測定 田"Γ丄：被投予蛋白質產生之細胞性免疫活化作用可利 用例如末梢血中τ細胞之活化程度於體外測定來評價。呈 Π CTL試驗法為—種已知之測定受測τ細胞對標的細 胞之攻擊活性的方法。丨，最近有一種以細胞素 (cytokine)或穿孔素（perferin)作為指標以掌握了細胞 活化水，的方法亦被使用β τ細胞活化之指標可用I或 二IFN等。穿孔素係一種與細胞障礙有關之生體分子。一 該等測疋法較需要高度細胞培養技術之CTL·測定法來 的簡便。 者，免疫學上之同等性亦可利用實際在投予蛋白質 ' 内挑碱病原體，並比較其防禦水平來確認。防禦水
200402306 五、發明說明（18) 平可依據接種病原體後之體重或體溫變化、或生存日數等 來比較。 本發明對於前述a)-e)所記載之聚核苷酸的來源並不 限制。故’可為天然的聚核脊酸或人為的或自發性導入變 異之聚核苷酸。又，亦可為由人工設計的序列所構成之聚 核苷酸。 天然來源之聚核苷酸包括例如KU-2株之聚核苷酸或來 自由KU-2株誘導變異株之聚核苷酸。此外，亦可用具有來 自與KU-2株有高相同性鹼基序列之pipy之聚核苷酸。另 外，本發明中以人工設計之聚核苷酸例如可為在KU-2鹼基 序列上導入人為變異之聚核苷酸者。 本發明之聚核脊酸可利用公知之雜交技術（Sambrook J·， Fritsch， Ε· F·， and Maniatis Τ· Molecular cloning: A Laboratory Manual (2nd edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor·)調製。去氧核糖核酸之單離亦可利用聚合酶連鎖 反應技術（Sambrook J.，Fritsch，E. F·，and Maniatis T. Molecular cloning： A Laboratory Manual (2nd edition). Cold Spring Harbor Laboratory Press,
Cold Spring Harbor·)。 即，業者可依雜交法或PCR法，篩選來自病毒之去氧 核糖核酸並單離去氧核糖核酸。雜交法所需之探針或PCR 法所需之引子的鹼基序列可依據例如KU-2株N蛋白質之互 補去氧核糖核酸（cDNA)序列（序列編號：丨）設計。
200402306 五、發明說明（19) ------ •將變異導入胺基酸的方法是為人所知的。例如，可 ‘ 用製作含有變異病毒之病毒庫或編碼為變異N蛋白質之 v 氧核糖核酸庫，以篩選編碼為所欲胺基酸序列的去氧核糖 核酸來單離之。或者亦可由自然界中篩選含變異之病^ 再者，亦可利用公知的基因工程技術，在特定部位導入變— 異。為在特定部位導入變異，可利用例如 S〇E(splicing-by-overlap —extensi〇n)一pcR&(H〇，ν·
Hunt, H.D., Horton, R. Μ. , Pullen, J, K. , and Pease, L.R.(1989)· Gene 77, 5卜59) 、Kunkel 法（Kunkel， τ A (1985) Proc Natl Acad Sci USA;82(2):488-92)。 ^作為本發明疫苗有效成分之蛋白質可利用公知的方法丨® 知到。例如可將前述a)-e)任一項所記載之聚核苷酸插入 適當之表現載體，藉導入宿主細胞來表現。可作為表現宿 主者可為細菌、酵母菌、昆蟲細胞、哺乳動物細胞或哺乳 動物等。更具體的說，細菌可用大腸桿菌 (Escherichis coli )、酵母可用分裂酵母 (Schizosaccharanyces pombe )或者可用哺乳動物細胞之CH0細胞 或C0S細胞表現。 可對該等宿主作轉形之載體可用公知載體。其中又以 昆蟲細胞及桿狀病毒（匕3(：111(^丨]：113)載體之表現系在本發 明疫苗之製造是有用的。 才干狀病毒（加州苜蓿夜蛾核多角體病毒；Aut〇grapha californica polyhedrosis virus;AcNPV)係一種以昆蟲 為宿主’具有雙股環狀去氧核糖核酸基因體之病毒。在受
2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第23頁 200402306 五、發明說明（20) =染了，核内作出之多角體（polyhedra)含有多數病毒粒 子容：：：源。構成多角體之蛋白質之一的多角體蛋白質 :表=該強力多角體蛋白促進子活性之表現系為丄 蚕表現系。 ^角體蛋白基因在感染後期顯示有非常高的表現量。 二念：養細胞中沒有病毒增殖所必需的蛋白質。故，若 ^夕角體蛋白促進子下游之多角體蛋白基因以外來性基因 待與多角體蛋白同樣高表現。桿狀病毒表現系 具體而S係以如下的步驟建構。 -對外來性基因之轉形載體作次選殖 -調製重組病毒 -表現蛋白質 外來性 約 10kb 氧核糖 性基因 例如， ，及 可使用 可附 加各種 用於本 ，=小約l30kbp的桿狀病毒基因體要直接插入 S疋：困難的。故，外來性基因首先要先插入由 枋舻5主體？成的轉形載體。將轉形載體與病毒去 ^ -文同時於宿主細胞内轉型並利用相同重組將外來 播入0 ντ 1 ο轉形載體可利用桿狀病毒重組用之市售載體。 PVL1 392 或pVL1 393(皆 a 土 hb # m PPAK8 或pPAK9(皆為；2 2 恩(Pharmingen)製） t#Mn2WNi(C1〇nteCh)製）為最佳 加組胺酸標示之載體端二加訊息序列之載體， 機能之載體都有=或3;數促進子之載體等附 售。該專市售的載體任一者皆可 200402306
發明。 f染細胞之培養上清因係重組成功之病毒與未發生重 組病毒兩者所產生的，故可依需要選擇出重組病毒。重組 病毒可利用菌斑（plague)之形成來進行選擇。即，受到重 組病毒感染的細胞因無法形成多角體會形成菌斑，利用此 特性來分離重組病毒。所得到之重組病毒為使其力價提 高’可依需要進行反覆感染來放大。 對重組效率低的環狀野生型AcNPV之去氧核糖核酸， 能使重組效率更高之變異病毒亦已實用化了。例如，使用 市售之桿狀病毒時，可期待接近1〇〇%之高重組率。因此結 果，不需要進行菌斑純化的步驟。具體而言，有Bacul〇 Gold(TM)線狀化桿狀病毒（法明基恩製）或BacpAK6 viral MA Bsu 36 I digested(可龍德克製）等變異桿狀病毒是 市售的。 桿狀病毒之重組或蛋白質表現係利用昆蟲細胞。最普 通之佰主細胞為昆蟲細胞株g f 9。s f 9可從法明基恩、可龍 德克或ATCC等處購得。其他，本發明中亦可利用Sf 21 (因 飛陀基恩（Invitrogen)、法明基恩）nveTM(因飛陀 基恩）等昆蟲細胞。
該等昆蟲細胞可維持在適當的培養基中。培養基可利 用如葛雷司昆蟲培養基（Grace Insect Medium)、TMN-FH 昆蟲培養基或ExceU 400等市售培養基。昆蟲細胞一般係 培養於2 7 °C左右，不像如動物細胞需要二氧化碳。s f 9即 使在單層培養或懸浮培養亦可增殖良好。
2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第25頁 200402306 五、發明說明（22) 對昆蟲細胞之轉移載體及桿狀病毒去氧核糖核酸之轉 染亦為公知的。具體而言，可使用脂質體（Li po fee tin)試 劑’使轉移載體及桿狀病毒去氧核糖核酸感染細胞。感染 ，，繼續培養’培養上清中會產生重组病毒。上清中之病 毒可依需要放大，再使其感染更多昆蟲細胞，以大量表現 外來性基因。將表現後之細胞回收，可將外來性基因之表 現產物加以純化。 桿狀病毒表現系與以大腸桿菌等作為宿主之表現系比 較’ 一般而言具有如下的優點。 一表現量高
一分子量大之蛋白質表現水平亦較高 一可產生在動物細胞中表現同樣之轉譯後修飾 -可進行複數種蛋白質之表現及再構成 •另外’亦可以大腸桿菌中必要之複製基因（c〇丨E工 or 1 )及支持在哺乳動物細胞中表現之複製基因（SV4〇 ) 及帶有SV40早期促進子之載體作成動物細胞表現載體。此 種表現載體係將前述a ) — e)中記載之聚核苷酸組入早期促 進子下游並在大腸桿菌中選殖。將選殖後之表現載體回 收，以磷酸鈣沉澱法或脂質體轉形到適當動物細胞（如來 自猴腎之C0S細胞等），便可在動物細胞内表現N蛋白質。 以如上方式所表現之蛋白質可利用公知手法純化為純 粹蛋白質。為求純化，亦可將!^蛋白質表現為與各種結合 性蛋白融合之蛋白質，再應用親和性層析來純化。此種精 製方法公知者有將與組胺酸標記融合之蛋白質吸附於鎳管
200402306 五、發明說明（23) 柱以純化之系統。以親和性層析法等所回收之N蛋白質可 利用離子層析更進一步純化。 用於本發明疫苗中之蛋白質除依基因重組生產之外， 亦可從使感染F I PV之培養細胞得到。ρ IPV之培養可使用來 自哺乳動物之初代細胞或株化細胞。特別是來自貓的細胞 對FIPV培養是適合的。源自貓之株化細胞例如有fcw4細胞 或CRFK細胞。該等細胞可由細胞銀行取得。使用貓株化細 胞之FIPV培養方法為公知的（Hodatsu T, Sasamoto T， Okada S, Koyama H. Antigenic analysis of feline coronaviruses with monoclonal antibodies (Mabs)rpreparation of Mabs which discriminate between FIPV strain 79-1146 and FECV strain 79-1 683· Vet Microbiol· 1991 Jun;28(l):13-24·)。 又，亦可使用來自豬或犬等其他動物之細胞。 再者，疫苗所需之必要蛋白質亦可以化學合成。將胺 基酸依序鍵結以合成具有目的胺基酸序列之寡肽類之方法 為公知的。特別是，由較短之胺基酸序列所構成之蛋白 片段可以很容易由化學合成。或，很難以化學合成之由長 胺基酸構成的蛋白質亦可藉由將募肽類相互鍵結而合成。 所知到之N蛋白質除將n蛋白質本身作為疫苗使用之 外，亦可適用藥學處方使製劑化。例如，可以盥藥理與 可容許之載體或媒介體，具體而言，滅菌水或=理食二上 水、植物油、乳化劑、懸濁劑、界面活性劑、安定劑 進行適當組合以製劑化。本發明之疫苗亦可配合適當之佐
200402306 五、發明說明（24) * ί發明之疫苗可利用與任意之佐劑配合，使作用裎 =發明中可利用之佐劑例如有以下所示之成分 鋁鹽等無機物 w 、 微生物或來自微生物之物f :活：作用物質 -BCG 、 -县素 -胞壁㈣胜⑽㈣yl dipeptide) 酸等 -百日咳菌 角魚歸及其關連物 -百曰咳毒素 -霍亂毒素等 佐劑可單獨使用，或與複數物質組合使用。若為疫苗 專家’可依實驗選擇適當佐劑之組合。佐劑依種類： 主要刺激體液性免疫者與主要刺激細胞性免疫者。例如， 主要刺激體液性免疫之佐劑已知有磷酸鋁。
或QS-2W息素類、百日咳毒素、另卜二"A 激細胞性免疫。一邊參考此類資讯的门專已知“刺 抗原組合使用之恰當佐劑。 町』選释興系種 —又，本發明係關於含有前述a)_e)中任一者記載之聚 核甘酸為有效成分的描傳染性腹膜炎 用疫苗。*前所述，具有前述=;^毒治療及/或預防 甘酸所編碼之胺基酸序列的蛋白質對 毒之治療及/*預防用疫以有二對7傳染上腹膜炎病 任一者記載之聚核苷酸導入活體，利 將則述3 6 )中 期待與投予本發明疫苗有1¾樣之效果。、活胃内表現’可
2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第28頁 200402306 — 五、發明說明（25) 本發明之疫苗中 ^ 導入活體。為達此目一則述聚核苷酸係於可表現狀態下被 區功能之下游插入^ ，可將例如在宿主中具有表現控制 使用具有藥劑感受:迷聚核普酸的載體後導入活趙内。若 之投予以誘導目的A之促進子作為表現控制區，可依藥劑 那黴素感受性之促之表現。此種促進子已知例如有卡 促進子，τ將目的茂者，可在特定部位誘導表現之 將編碼為抗原因表現部位加以特定。 為疫苗之手法稱為烏^ ^ 體投予，在活體内表現以作 原之基因亦與適當基因疫苗中編碼為欲表現抗 内。已知，僅將c體或不附隨攜帶體而導入活體 酸注射到肌肉内以充足量去氧核糖核 體時可利用載體白質之表現。另外，使用攜帶 載體係利用牛痞佐査· · . 、Μ 牛痘病I且古毒（inia VlrUS)等病毒載體。 主毋八有186kb之去氧核糖核酸基因體。是痘病毒屬 之病f。牛痘病毒是接種疫苗（vaccinati⑽） :殖疫苗：已有許多人接種且具有實績。再者，因牛痘之病 毋不會移行到核内而係在細胞質内進行轉錄與複製，故導 入之基因插入宿主基因體的危險性小。因此，牛痘病毒為 在科學性上看來安全性亦高的載體。除此之外，牛痘病毒 載體對細胞性免疫之刺激活性較體液性免疫為大。其容易 誘導細胞性免疫之特徵對於細胞性免疫重要性高的^”預 防或治療是一種有利的特徵。 牛痘病毒之外，腺病毒、腺病毒伴隨病毒、反轉錄病
i25-5742-PF(Nl)；Chiumeow.ptd 第29頁 200402306 五、發明說明（26) _ 毒等被用為基因治療用載體 可使用在本發明。 該#病毒載體任一者皆 •病毋载體以外，使用人工攜帶體之其 试。攜帶體例如有脂質體或金膠體；。疫田亦被嘗 附。吸附去氧核糖:=t，5負電荷之去氧核糖核酸吸 具有負電荷之細胞表面鱗脂質層。接：到：體，會結合到 因吸附到細胞膜或因胞飲作用進入細二膜=氣核糖核酸會 在：進子下游指入基因之載體去核：；：時=用 係使用在以基因餘(gene gun)將基mm膠體 質體(裸露去氧核糖核酸)之金踢體粒=墙=吸： 麼接種。當金膠體粒子進入組織時 =體進灯- 妙酸達以藉導入少量去氧核糖 核酸可達成充分的疫苗效果。 里去氣核糖 ，本f明疫苗對動物之投予除例如動脈内注射'靜脈内 注射二皮下注射以外，可依鼻腔内、經支氣管、肌肉内或 經口等該業界公知的方法進行。投予量依動物之體重或年 齡投=方法、使用目的荨會有變動，只要是該業界之任 應可適當選擇適當投藥量。一般，貓疫苗係於生下8週後 以2〜3週的間隔接種2次。 本發明之疫苗對於描等貓科動物的FIp預防及/或治療 是有用的。根據疫學或病毒學的資料，認為野生貓科動物
第30頁 2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 200402306 五、發明說明（27^ 一 —------- 之FIPV亦與貓者A相 中亦為有效。相近的。故，本發明之疫苗在猫科動物 ^ Ϊ三本發明係關於以對含有前述a ) - e )中任一者記 ^ ^ :=酸所編碼之胺基酸序列所構成之蛋白質有結合 =狀5二二f有效成分的截傳染性腹膜炎病毒治療及/或 預防用抗體製劑。 如^所述，由前述3)4)中任一者記載之聚核苷酸所 編碼之胺基酸序列構成之蛋白質雖可誘導抑制F I 增殖之 免疫反應，但不含感染增強抗原決定基。結果是，利用此 蛋白質可以提供安全性與預防效果良好的疫苗。再者，利 用將對前述a)-d)中任一者記載之聚核苔酸所編碼之胺基 酸序列所構成之蛋白質有結合能力之抗體對宿主投予，亦 可達成，貓傳染性腹膜炎病毒之治療及/或預防效果。 該等具有與蛋白質結合能力之抗體之投予可在短期内 給予宿主得到與以蛋白質投予所誘導出之免疫反應類似之 $態。其結果為，被投予之抗體可抑制以”之增殖。又因 刖述蛋白質不含感染增強抗原決定基，可以避免因抗體所 發生之感染增強誘導。 本發明之貌傳染性腹膜炎病毒治療及/或預防用抗體 製劑可利用將前述a)-e)中任一者記載之聚核苷酸所編 之胺基酸序列所構成之蛋白質作為抗原，對免疫動物免疫 以付到。传到抗體之手法可為任意。例如，亦可將免疫動 物之抗體產生細胞回收，利用選殖得到單株抗體。本發明 之抗體製劑期望來自與投予抗體之動物為同種動物。^自
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五、發明說明（28) 同種動物之抗體安全且更容易達到治療或預防的效 或也可將來自異種之抗體分子以抗體工程之方 化。例如，將免疫球蛋白之不變區以貓免疫球蛋白 = 構築嵌合抗體之技術為公知的。更具體的說，利用將編碼 為任意動物之免疫球蛋白變異區之基因接合在貓免疫球蛋 白基因上，便可僅將免疫球蛋白之不變區形成貓由來蛋白 質。 免疫球蛋白之不變區較變異區容易被辨識為異物。 故，藉使不變區貓由來化，可以提高免疫球蛋白之安全性 及在活體内之安定性。利用此技術，使具有目的結合親和 性之抗體嵌合化，可得到適於對貓投予之免疫球蛋白。 利用此技術，已有將對貓庖疹病毒及貓卡利希病毒之 小鼠單株抗體貓化的嵌合抗體被商品化（Umehasi M， Nishiyama K， Akiyama S, Kimachi K, Imamura T, Tomita Y, Sakaguchi S, Makino H, Shigaki T, Shinya N, Matsuda J, Tokiyoshi S. Development of Mouse-cat chimeric antibodies against feline viral rh i notrache i t i s and feline cal icivirus infection. Sc i. Rep. Chemo-Sero-Therap. Res. Inst., 6:39-48(1997))。 再者，亦可利用將貓免疫球蛋白之超變異區置換為具 有與目的結合親和性抗體之超變異區，以得到貓化抗體。 免疫球蛋白之變異區係由決定與抗原決定基之結合親和性 的互補決定區（complementary determing region;CDR)與
200402306 五、發明說明（29) - ’ 一""' * — 持框架區構成。CDR之構造具有極高度變異，亦稱超 =區。另-方面，框架部分之保守性則高。因與抗原之 …CT親和性主要係依CDR決定，故利用置換CDR可以變 疫球蛋白之結合親和性。
具體而言，設計可黏合框架部分之引子，以PCR取得 ••扁碼為CDR之互補去氧核糖核酸。若將所得到之互補去氧 核糖核酸置換貓免疫球蛋白之CDR ,則可得到具有由任音 $免疫球蛋白所得到CDR之雜免疫球蛋白。即，利用將; f目的結合親和性之任一種免疫球蛋白之CDR置換貓免疫 ^蛋白之CDR ,可以在貓免疫球蛋白中導入所需之結合親 _本發明之抗體製劑可含有與以前述a)-d)中記載聚核 甘酸編碼之胺基酸序列構成之蛋白質具有結合能力之完全 免疫球蛋白或其變異區作為有效成分。對免疫球蛋白抗原 之結合活性係以變異區維持。故，可僅使用變異區作為 =成分。同時，因不變區在免疫反應中對與補體之結合活 ―、與淋巴球上Fc受體之結合活性等具有重要機能亦為 =。故，本發明之抗體製劑以具備不變區之免疫球蛋白分 子作為有效成分的抗體製劑為佳。 本發明之抗體製劑中抗 包括未純化之免疫球蛋白。 分亦包括在抗體中。另外， 徵為基礎說明時使用之用語 有具有所需結合親和性之免 體不僅為免疫球蛋白本身，尚 故，抗血清等含免疫球蛋白區 免疫球蛋白係對抗體以構造特 。抗體及免疫球蛋白只要是含 疫球蛋白，則可利用為本發明
200402306 五、發明說明（30) 之抗體製劑。因此，並不一定非為純化抗體或單株抗體。 抗體可直接或應用藥學處方使製劑化。例如，可以與 藥理學上可容許之載體或媒介體，具體而言，滅菌水或生 理食鹽水、植物油、乳化劑、懸濁劑、界面活性劑、安定 劑等，進行適當組合以製劑化。 本發明之抗體製劑對動物之投予除例如動脈内注射、 靜脈内注射、皮下注射以外，可依鼻腔内、經支氣管、肌 肉内或經口等該業界公知的方法進行。投予量依動物之體 重或年齡、投予方法、使用目的等會有變動，只要是該業 界之任應可適當選擇適當投藥量。 再者，本發明係關於包括將本發明疫苗或本發明抗體 製劑對貓投予至少1次過程之用於貓傳染性腹膜炎病毒治 療及/或預防用方法。本發明之方法可適用在屬於貓科所 有的動物。疫苗或抗體製劑之調製方法及對動物之投予方 法如前所述。 本發明之疫苗或抗體製劑對貓之FIPV預防及/或治療 是有用的。本發明中，FIPV預防係指藉由對!?1?¥無感染經 驗的動物或具有感染後發病前狀態之動物給予預防性投 樂’以阻礙發病。發病之阻礙包括以下之作用。 防止發病本身之作用 延緩發病之作用 減輕發病後症狀之作用 使發病後治癒加快的作用 使發病後延命率提高之作用，或
2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第34頁 200402306 五、發明說明（31) 阻礙由已發病個體向其他個體傳染力之作用 又，本發明之治療係指對已發病個體投藥，以緩和疾 病症狀。症狀之緩和例如包含如下作用。 緩和症狀之作用 加快治癒之作用，或 使發病後延命率提高之作用 此外，本發明係關於一種貓傳染性腹膜炎病毒感染之 檢驗方法，包括將含有前述a)-e)任一者所記載之聚核苔 酸所編碼之胺基酸序列所構成之蛋白質與貓血清培養'並 檢出與該蛋白質結合之抗體、的過程。如實施例所示，來自 KU-2之N蛋白質可與FIPV之廣泛株之抗血清強烈反應。此 情形顯示KU_2之N蛋白質作為FIPV疫苗之有用性高，同時 也可作為其作為診斷用抗原亦有用的證明。 病毒感染症之診斷一般係以活體試樣中所含有之病毒 抗原或抗病毒抗體作為指標來實施。特別是抗病毒抗體因 在病毒抗原消失之後仍可檢測到，故在作為診斷指標上是 重要的。在抗病毒抗體之檢出上病毒抗原是必需的^ 另外，先前，屬於FIPV I型之病毒顯示構造上之低類 似性。故，為確實將受測動物之抗FIPV抗體存在檢出，被 遇為可能必需將每株所不同的蛋白質都要準備。若以單一 蛋白質可能無法檢出對抗構造上不同抗原的抗體。但若依 本發明之檢查方法，可用單一蛋白質作為抗原，以充分的 感度檢驗對抗不同株之抗血清。故，本發明之檢查方法對 於篩選貓FIPV是有用的。 一 /
200402306 五、發明說明（32) 即，本發明係提供一種貓傳染性腹膜炎病毒感染之篩 方法，包括將含有前述a)_e)任一者所記載之聚核苷酸 :編碼之胺I酸序列所構成 < 蛋白質與猫血清培養，並檢 結合之抗體的過程。本發明中，㈣染性腹 、炎病毒感木之篩選方法係指以用於以不特定多數貓 象，以找出有FIPV感染經驗可能性之編的一種檢查方法。 使用特定抗原進行抗體檢測之方法是公知， :將=感=相上，並將結合於該抗原之抗體J可辨 補I；抗體)檢測。或，將試樣中所含之抗體 :捉在固相上’利用使該抗體與抗原反應 專一性之抗體存在。在任一老夕古冰由炎击^ =锨机原· 體或抗原，可以先作桿記。γ : ; a谷易檢出抗 L巧物貝、發光物質、著色粒子或放射性同位素。使 払圮成为結合在蛋白質之方法是公知的。 - 此外’以固定有抗原之粒子載體因抗體所吐夕、较巷从 方法因m > : f 的。以粒子凝集為指標之 法因為不而進仃固相與液相之分離 續檢驗之方法是有用的。 τ '肝大里4樣連 被檢出含有與前述a)_e)任一 編碼之胺錢序列所構成蛋白質社人夕上之聚核甘酸所 為有FIPV之感毕崾驗ΐ蛋質一抗體之個體被診斷 可診斷症狀程度。例如，浐栌 彳貝之變化’亦 增殖。故，抗體力俨牲样體力仏升两會繼續引起病毒 性古。若、r·妝=持、，Λ升的個體伴隨病毒增殖的可能 …症狀減輪後抗體力價下降，該個趙會被診 2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第36頁 1 200402306 五、發明說明（33) . 在回復之可能性是高的。 本發明亦係關於一種貓傳染性腹膜炎病毒感染之檢驗 ‘ 試藥，包括前述a)-e)任一者所記載之聚核苷酸所編碼之 β 胺基酸序列所構成之蛋白質。本發明之試藥中包括前述a) . -e )任一者所記載之聚核苷酸所編碼之胺基酸序列所構成 之蛋白質可依上述各種免疫試驗法形式，固定於固相或粒 子上。又，可依上述各種免疫試驗法形式，將標記抗體、 檢驗標記所需之附加試藥、陽性對照或陰性對照等組合以 製成診斷用套組。 實施方式 ® 用於實施發明之最佳形態 以下對本發明依實施例更具體說明。 [1 ]病毒蛋白質之純化 FIPV I型KU-2株之由來： 疫苗抗原之製作及重組體之製作係使用在北里大學獸 醫畜產學部獸醫傳染病學教室内之F丨p發病貓所分離到之 FIPV KU-2株。該病毒被分類為pipy I型。 FIPV II型KU-2株之由來： 純化N蛋白質之製作係使用在北里大學獸醫畜產學部 ¥ 獸醫傳染病學教室内之j?IP發病貓所分離到之FIpv Ku-1 株。該病毒被分類為F I p v π型。 病毒之培養· 病毋係以田月口兒由來株化細胞（f e 1丨s c a t u s w h ο 1 e
2125.5742-Pi:(NI);Chiumeow.ptd 200402306 五、發明說明（34) fetus (fcwf-4))培養。培養液係使用在依格式最小必需p 養基(Eagles minimum essential medium, 與L一 1 5 培養基專i混合後之培養基中加入牛胎兒血清 calf serum:FCS)10% 者。 病毒純化： 將lOOTCIDw之病毒接種於225cm2之fcwf-4細胞内於37 C下吸附1小時後，加入培養液培養在二氧化碳培養箱 内。將呈現CPE之細胞以細胞刮去器剝離並回收。將回收 細胞以 ΝΤΕ 緩衝液（l〇mM Tris-HCl(pH7.0)，i〇〇mM NaC1， 2mM EDTA)洗淨3次後懸浮於ΝΤΕ緩衝液5ml。將懸浮細胞以 當氏型均質機破碎後以1 5 〇 〇 X g離心1 〇分鐘以除去細胞 片。將其堆層於30%蔗糖NTE緩衝液中以2〇〇〇〇〇χ g離心2小 時使病毒粒子沉澱。將沉澱以NTE緩衝液〇· 5ml溶解後以 1 500 0g離心5分鐘，以其上清作為病毒溶液。 蛋白分畫： 在純化病毒中加入樣本緩衝液（1〇〇11^1'1^5-11(：1(0116· 又y。sds，2〇%甘油，〇1% BpB〕，於1〇〇它下加熱處理 刀知’再以1 1%聚内烯醯胺凝膠電泳。將電泳 ^ =凝膠取出’由標記蛋白之位置判斷相當於n蛋白質分 ’把含有N蛋白質之位置的凝膠切出。用馬克 二蛋白質回收器（ATT〇,東京）將切出之凝膠中所 t的蛋白質回收，从：^ 所 、 乍為純化Ν蛋白質。所得到之純化Ν蛋白 質作為西方墨點法、PT TCA丄 一 ★ t 原使用 lisa、皮内反應及次單元疫苗之抗 第38頁 2125-5742.PF(Nl)；Chiumeow.ptd 200402306 五、發明說明（35) ^ [2]FIPV I型KU-2株之鹼基序列 病毒核糖核酸之調製： ， 在FIPV I型KU - 2株之純化病毒中加入sds〇.5%後，進 行苯齡萃取及乙醇沉殿以回收核糖核酸。將乾燥後之顆粒 . 狀物浴解於無核糖核酸酶之水以形成核糖核酸溶液。 RT-PCR ： 以下表示使用在選殖之引子鹼基序列。 IΜ P r - 3 F (順義 股）5’ -ggggaarrcaattaaaggcaactactgcca-3,（序列編號： 3) BEP(dT)21(反義 股）5’ -ctgtgaattctgcaggatccttttttttttttttttttttt-3， (序列編號：4)。 各引子上附加有選殖用之限制酶辨識序列。 在反轉錄酵素反應用緩衝液内加入負股引子、反轉錄 酵素及病毒核糖核酸，於42 °C下進行1小時反轉錄反應以 轉錄為互補去氧核糖核酸。在PCr用緩衝液内加入PCR用引 子、Tag聚合酶及互補去氧核糖核酸，進行95 〇c 5分鐘_(95 C1分鐘-55°C1分鐘-72°C2分鐘）30循環-72°C5分鐘之 PCR，使互補去氧核糖核酸放大。pcR產物之專一性以1%瓊_ 脂凝膠電泳確認。 選殖： 選殖使用質體載體-PUC18。將PCR產物以乙醇沉澱 後’以滅菌蒸餾水溶解，加入限制酶後丨〇倍緩衝液與限制
，、· Λ 200402306
酶使消化。將pUC18以相间的阳主丨硫、丨 ^ ^ ^ ^ ^ ^ 的限制酶消化後，以鹼性磷解 酶進订脫磷酸化。將兩者皆】 德胳冬本©祕她分從 乂1 %低融點違脂凝膠進行電泳 後將含去乳核糖核酸之凝膠切出，並進 萃取精製。 進订去氧核糖核6sl之
將純化後之PCR產物與載艚本备 桩田蛵你y 士、e人，戰體之去氧核糖核酸片段在連 接用緩衝液中混合，並加入土条4六k U — 1丨政 老⑺ 去乳核糖核酸連接酶於1 5 〇C下 進灯1小時之連接反應。將環妝 瞧护益ηη nn从, 竹衣狀化後之去氧核糖核酸於大 腸杯iJMl 09株之勝任細胞内進行轉型，並塗布於添加安 必西林（ampiciUin)之瓊脂平板培養基内於37下培養隔 夜0
釣出在培養基上長出之菌落以添加安必西林 (ampicillin)之L-培養液ι·5πιΐ培養隔夜後，將質體抽出 並以限制酶切斷，以U瓊脂電泳確認去氧核糖核酸片段之 大小以確認是否有選殖成功。將確認已選殖好之大腸桿菌 添加安必西林（31„{^(^11丨11)之1^培養液251111培養隔夜後， 進行重組質體去氧核糖核酸之萃取純化。 驗基序列之決定：
將選殖後之互補去氧核糖核酸進一步於Μ丨3mp丨8 /丨9噬 菌體載體上次選殖，由所得到之噬菌體純化之單股去氧核 糖核酸作為定序使用。鹼基序列係依據雙去氧核苷酸連鎖 終結法（dideoxynucleotide chain termination)，以自 動定序儀解析。 驗基序列： 在FIPV基因核糖核酸全長約20kb中，吾等係對KU-2株
200402306 五、發明說明（37) 之3’末端側之9· 2kb鹼基序列進行解析。KU-2株之N蛋白質 其互補去氧核糖核酸之鹼基序列及所推定之胺基酸序列係 表示於第1圖。N基因係由起始密碼子ATG起到終止密碼子 TAA為止之1131個鹼基的〇RF所構成，編碼為377個胺基 酸’推定為表現為估計42. 5kDa之早期蛋白質。 相同性： 第2圖表示屬於FIPV I型之KU-2株、Black株、UCD1 株、FIPVII型之79-1 1 46 株、貓冠狀病毒II型（FECV) 79-1 683株、貓冠狀病毒（CCV) Insvcl株及豬傳染性胃腸 炎（TGEV) Purde株之N基因之蛋白質胺基酸序列的排列。 利用比較該胺基酸序列，可了解0一 2株之基因上存在多數 其他6株所沒有的特徵性胺基酸變異，是κυ_2特有的序 列。 表1表示Ν蛋白質胺基酸序列及驗基序列之相同性。表 中之相同性係使用基因資訊處理軟MGENETYX之最大符合 度算出。參數如以下（Takahashi K and Gotho 〇 ( 1 984) J· Biochem· 92:1 1 73- 1 1 77 )。
Matchinh condition:matches=-l, mismatches=lgaps=l *N + = 2 ，
2125-5742-PF(Nl) ;Cniumeow.ptd 第41頁 200402306 五、發明說明（38) 表1 FIPV工型 KU-2 Black UCD1 FIPV I工型 FECV 79-1683 CCV TGEV KU-2 100 91.2 92.2 91.3 91.3 76.7 76.6 Black 90.72 100 90.9 92.5 93.7 77.7 77.3 驗 * UCD1 91.51 91.51 100 92.2 90.9 11.Ί 77.4 序 FIPV工工型 90.98 92.57 93.10 100 92.6 77.8 78.0 FECV 92.31 94.43 93.37 93.90 100 77.9 77.6 1 CCV 74.02 75.07 75.37 76.38 77.17 100 89. 6 1 TGEV 75.20 75.72 76.50 76.24 77.28 89.53 100 胺基酸序列之栢同性 表中之病毒名分別表示以下之病毒。又，表之數值係 表示對角線上所記載之右上鹼基序列、及左下為胺基酸序 列之相同性。 KU - 2 :FIPV I型之KU - 2株/1型（基因銀行（GenBank)編 號AB086881)
Black :FIPV I 型之Black 株/1 型（基因銀行（GenBank) 編號 AB08 6 903 ) UCD1 :FIPV I型之UCD1株/1型（基因銀行（GenBank)編 號AB086902) FIPV型II :FIPV I型之79 -1 1 46株/II型（基因銀行 (GenBank)編號#X56496 ) FECV :貌之腸冠狀病毒（Feline Enteric cor onavir us)之79 - 1683 株（基因銀行（GenBank)編號 AB086904) CCV :犬之冠狀病毒（Canine coronavirus)之CCV Insavc- 1 株（基因銀行（GenBank)編號#D1 30 96 )
2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第42頁 200402306 五、發明說明（39) TGEV ·傳染性腸胃炎病毒（Transmissible gastroenteri tis virus)之Purdue 株（基因銀行（GenBank) 編號 #M21 627, M14878) 在將KU-2株之N蛋白質胺基酸序列與其他病毒比較 時’對貌之冠狀病毒即FIPV I型、11型、FECV 11型為90% 左右，對CCV與TGEV為75%左右。又，在貓之冠狀病毒彼此 ，比較時’分別亦有9 〇%左右之相同性，顯示雖在該等病 毒間基因大部分是保守性，但各別仍帶有獨特的基因序 列。 系統樹： 第3圖表示由N基因之胺基酸序列作成的系統樹。 N基因之系統樹解析上，為貓冠狀病毒之F I pV !型、 FIPV II型、FECV形成一群，該群與犬（ccv)或豬（TGEV)之 冠狀病毒的距離遠。KU-2株之基因其差雖小，但在貓之冠 狀病毒内具有最遠的進化距離。 [3]重組N蛋白質之表現 RT-PCR ： WFIPV Κϋ —2株之鹼基序列為原型，在可以表現N蛋白 質=長之Ν蛋白質其開放讀取框架（〇pen frame， 與下游製作PCR用引子。在引子上附加有選瘦用 之限制酶辨識序列（BamH I及Sal I)。 =由ΠΡν KU-2株之純化病毒所調製之病毒核糖核酸 =;，使用募dT引子進行反轉錄反應以合成互補去氧 h糖核I。接著，進行95t5分鐘、（95口分鐘_55口分鐘
200402306 五、發明說明（40) -72 °C 2分鐘）3〇循環-7 2 15分鐘之PCR使互補去氧核糖核酸 放大。PCR產物之專一性以1%瓊脂凝膠電泳確認。 選殖： 質體載體pFastBacl之選殖係與對puci8之選殖以同樣 方法實施。使用BamH I及Sal I作為重組用之限制酶。宿 主大腸桿菌使用HB1 0 1株。確認已選殖之大腸桿菌以添加 安必西林之L—培養液培養隔夜，再進行重組pFastBacl質 體去氧核糖核酸之萃取純化。 重組桿狀病毒之製作： 將純化質體去氧核糖核酸轉染大腸桿菌DH1〇BAC株之 勝任細胞，並塗布在添加卡那黴素、四環黴素、慶大黴素 (gentamycin)、IPTG及Bluo-gal之瓊脂平板培養基上，於 37C下培養隔夜。大腸桿菌DH10BAC株具有桿狀病毒穿梭 載體bM0N14272，轉染重組pFastBacl之DH10BAC可將N蛋白 質基因重組為bMON 1 42 72。挑選培養基上產生之菌落中白 色的菌落並鈎菌，以添加卡那黴素、四環黴素、慶大黴素 (gentamycin)、IPTG 及Bluo-gal 之L-培養基25ml 培養隔 夜，再進行重組bMON 1 4272去氧核糖核酸之萃取純化。
將純化後重組b Μ 0 N1 4 2 7 2去氧核糖核酸與c E L L F E C TIN 混合，並轉染於玻璃器皿上之夜蛾科由來細胞福吉匹達夜 · 蛾（Spodoptera fimigiperda ，（ SF - 9 ))。轉染後，除去混合 液，於添加10%FCS之TC-10 0培養液（昆蟲培養液）培養2° 日。回收培養上清中所產生之桿狀病毒，並使用於重組桿 狀病毒表現實驗。
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重組蛋白質之表現： 將SF-9細胞以卜2x l〇6cells/ml接種於培養燒瓶 (22 5cm2)並培養2日。除去培養液並接種重組桿狀病毒，於 2 7 °C下吸附1小時後，加入不含FBS之TC-100培養液培養。' 培養96小時後回收感染細胞以破酸緩衝生理食鹽水（pBS(_)) 洗淨，再加入添加0·2%ΝΡ-40之RSB溶液（0.01M NaCl， 0.0015M MgCl2，0.01M Tris-HCl(pH7.4))4ml 使細胞溶 解。將其以5000rpni離心1 〇分鐘’將沉殿以PBS(-)linl懸浮並 作為重組N蛋白質使用於實驗。 [4 ]專一性之確認 西方墨點法： 五、發明說明（41) 將樣本緩衝液加入製作好之抗原，以1 0 0 °C進行5分鐘 加熱處理後，以11%凝膠之SDS-PAGE展開。取出凝膠，使 用半乾式轉印裝置轉印到PVDF膜上。將轉印膜以（PBS(-〕洗 淨後，於4°C下以BlockAce浸泡隔夜使吸墨。 一次血清使用對抗FIPV N蛋白質之單株抗體（選殖體 編號：E22-2)、對抗FIPV Μ蛋白質之單株抗體（選殖體編 號：F18-2)及對抗FIPV S蛋白質之單株抗體（選殖體編 號：6-4-2)培養上清的混合物。將轉印膜浸泡在培養上清 於37 °C使反應2小時後，以添加〇· 〇5%Tween20之PBS(-)洗 t 淨3次。該等單株抗體係如下之公知的抗體。 選殖體編號·· E22-2及選殖體編號：F18-2 : (Hohdatsh T, Sasamoto T, Okada S, Koyama H.
Antigenic analysis of feline coronav i ruses with
lx ^ 200402306 五、發明說明（42) monoclonal antibodies (MAbs):Preparation of Mabs which discriminate between FIPV strain 79-1146 and FECV strain 79-1683. Vet Microbiol. 1991 Jun;28(l):13-24) 選殖體編號：6-4-2 : (Hohdatsh T, Okada S, Koyama H. Characterization of monoclonal antibodies against feline infectious peritonitis virus type II and antigenic relationship between feline, porcine, and caine coronaviruses· Arch Virol· 1991 ;117(1-2):85-95)
-一次血清使用H R P 0標記山羊抗小鼠I g G + Μ + A。浸泡在 加入標記抗體之血清稀釋液内於3 7 °C下反應1小時後，以 添加0.05%Tween20之PBS(-)洗淨3次。將轉印膜浸泡於基 質液（0.02%DAB， 0·00 6% H2 02， 0.05M
Tris HCl(pH7.6))5〜20左右使發色後，以蒸顧水洗淨使反 應停止。 FIPV KU-2株之N蛋白質由該胺基酸序列計算，推定約 為4 5kDa之表現產物。實際上，於昆蟲細胞表現之重組蛋 白質在40〜45kDa處檢出有特異之譜帶，確認為重組pipy n 蛋白質（第4圖）。又，純化N蛋白質亦在同樣位置可見特異 之譜帶（第5圖）。 ' ELISA ： 將製作好的抗原以固相化用緩衝液（〇· 1M碳酸緩衝液） 以2倍系列稀釋為2〜128倍並分注在ELISA平板，於4 °C下靜
^ % 200402306 五、發明說明（43) 置隔夜使固化。將各穴以添加〇· 05%Tween20之PBS(-)洗淨 3次並用於ELISA。 一次血清使用對抗FIPV N蛋白質之單株抗體（選殖體 編號·· E 2 2 - 2 )之培養上清。將培養上清以〇 · 1 m 1 / w e 1 1分注 於固化之穴中後，於3 7 °C使反應1小時，以添加 0· 0 5%Tween2 0之PBS(-)洗淨3次。二次血清使用HRP0標記 山羊抗小鼠IgG + M + A。在加入標記抗體之血清稀釋液内於 37°C下反應1小時後，以添加〇.〇5%Tween20之PBS(-)洗淨3 次。將TMB基質液（四曱基聯苯胺）以〇· iml/wei丨分注後， 於苇溫反應2 0分鐘，將硫酸以〇 · 〇 5 m 1 / w e 11加入並測定 450nm之吸光度。 重組N蛋白質（第6圖）與純化N蛋白質（第7圖）皆僅對抗 F I PV N蛋白質單株抗體會抗原量依存的進行反應，可確認 其專一性。 [5 ]疫苗之製作 抗原之調製
/抗原量之測定係使用西方墨點法。將製作之抗原以2 倍系列稀釋為8倍〜512倍並進行SDS-PAGE，使用抗FIPV N 蛋白質單株抗體（選殖體編號E22-2)以西方墨點法測出。 將可檢出之稀釋倍數最高之譜帶所含有之抗原量定為1單 凡’將其稀釋之倒數作為原液之抗原量。以pBSD稀釋調 整，以使疫苗1用量份中含有丨6單元之抗原量。 佐劑使用日本市售之貓用3種混合不活化疫苗飛利德
200402306 五、發明說明（44) 包PCR( InterVet公司）。該疫苗中含有佐劑L80與氫氧化 銘。將調整為1 6單元/ml之抗原lml與飛利德包PCR1 ml ( 1用 量份）混合，並充分混合作成疫苗。此疫苗以2m 1作為1用 量份。 [6]免疫試驗（1) 動物： 實驗動物使用7〜9個月齡之SPF貓。重組N蛋白質疫苗 之免疫群使用4隻。攻毒對照群使用4隻，並將與SF-9細胞 重組N蛋白質之回收方法相同處理所得到之抗原對其免 疫。 疫苗接種： 以疫苗用量1份間隔3週於頸部皮下接種3次（第8圖）。 在各次免疫進行前採血並測定血清之抗體力價。 以ELISA測定抗體力價： 以固化用緩衝液稀釋純化N蛋白質使為2單位（約 1 OOng/wel 1 )並分注於ELISA平板以4 °C下固化隔夜。洗淨 後’將所採血之貓血清以抗體稀釋液稀釋丨0 〇倍者作為1次 血清，並於37 °C下反應1小時。洗淨後，使hrp〇標記抗貓 Ig於3 7 °C下反應1小時。洗淨後，加入TMB基質液（四曱基 聯苯胺）’於常溫使發色2 〇分鐘，加入反應停止液並測定 450nm之吸光度。 重組N蛋白質之疫苗接種群中任一隻貓在2次免疫後第 週（第3次免疫時）時雖未見抗體力價上升，但3次免疫後 第4週（攻毒時）可確認抗體力價上升。其中，貓編號221可
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確認顯著抗體力價上升，但其餘3隻則僅有微弱反應。作 為對照接種由SF-9細胞調製抗原之接種群中4隹令邱去g ELISA O.D.值之上升（第9圖）。 又王4未見 中和抗體力價之測定： 將96穴盤中已作2倍系列稀釋之貓血清〇· 〇25ml與調整 為200TC D”/〇.〇25ml之病毒液等量混合，於4它下使反廯24 小時。再將fcwf-4細胞以1 X l〇6/well加入，培養48小。 將完全抑制CPE(細胞變性效果）之貓血清其最高稀釋倍數 之倒數作為中和抗體力價。 又，因為通常抗N蛋白質抗體不帶有中和活性，故認 為以N蛋白質免疫所產生之抗體難以單獨用抗體抑制CpE， # 故添加補體實施中和試驗。即，在調整為 2OOTCD5。/ 〇.〇25ml之病毋液内添加1〇%山;血清（補體）使同 樣進行反應。 重組N蛋白質免疫群之中和抗體力價在免疫開始時及3 次免疫後第4週（第70日）任一者皆無論補體是否存在，所 有的描都是10倍以下。在SF-9細胞抗原接種群中也是同樣 結果（表2)。
2125-5742-PF(Nl)；Chiumeow.ptd 第 49 頁 Η H y 200402306 五、發明說明（46) --------- 表 2 cp和；Ιλ體力ί兵 群 貓編號 有補體 抗原接種時 接種後 第7〇日 無補體 抗原接種時 接種後 每70日 桿狀病毒重組Ν 蛋白質抗原接 種群 217 221 191 6 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <ϊδΓ· <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 —<10 <10 <10 <10 SF-9接種群 163 210 170 173 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 <10 ~<ϊδ----'— <10 <10 <10 細胞免疫性之測定： 為確認因疫苗所附加之細胞免疫性程度，測定延遲型 過敏反應對純化N蛋白質抗原之皮内反應。 將左脇腹剃毛後用70%酒精消毒，分別以皮内接種注 射N蛋白質抗原（〇· lmg/ml)及作為控制之pBS㈠〇· “I。抗原 接種部位係約隔4cm之間隔接種。以游標尺測定於接種彳1 ” 24、48、72、96小時在接種部位出現腫脹之範圍。 重組N蛋白貝免疫群之所有貌都可見到對純化n蛋白質 之反應。貓編號21 7在接種後24小時起可看到腫脹，之後、 反應下降到9 6小時後消失。貓編號1 9 1及貓編號2 2 1同樣也 在24小時起可看到腫脹，之後反應下降到96小時後仍可見 到約2〜3mm之腫脹。描編號6在7 2小時腫脹最大時亦只有 2mm之微弱反應，到9 6小時後消失（第1 〇圖）。所有的|苗對 PBS()都沒有腫脹反應。由此結果，可確認因為重組n蛋白 質疫苗可賦予細胞性免疫。 [7]攻毒試驗（1)
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攻毒方法： 在第3次免疫後第4週時實施攻 對免疫試驗（1)之貓 毒試驗（第8圖）。 攻毒用病毒使用FIPV I I型79- 1 1 46株，將其 1 05 TC I D50 (1 m 1)以經口及煙皇技錄 ό祕接 、土 汉厶鼻接種。自接種病毒起到實驗結 束為^每日觀察臨床症狀。每3日測定體溫、體重。同 樣’每3日採取直腸擦栻液，供之後實驗用。又，每6日採 血並分離血清，供之後實驗用。 生存率： 攻毒對照群中4隻有4隻發生FIP症狀，貓編號丨7〇在攻 毒後第23日、貓編號2 1〇在攻毒後第31日、貓編號163在攻 毋後第44日死亡。相對於此，重組Ν蛋白質疫苗接種群之 貓中，貓編號191發生F IP症狀並在第48日死亡，但其餘3 隻雖可認為夂感染但可防止發病，存活了下來（第丨丨圖）。 體溫之變化： 重組N蛋白質抗原免疫群在剛攻毒後雖可見到發熱， 但之後過程依個體而不同。貓編號217在接種後第3日超過 40 C被認為有發熱但之後持續為平均熱度。貓編號221在 接種後第3日及第27日到第42日間接近或超過4〇 °c被認為 有發熱但之後溫度下降。貓編號191在接種後第3日及第27 曰到第3 3日間超過4 0 °C被認為有發熱但之後體溫急速下 降，在第48曰死亡。貓編號6在第3曰超過4〇艺被認為有發 熱但之後持績為平均熱度。 另一方面，攻毒對照群中4隻都確認為雙峰性的發
200402306 五、發明說明（48) 熱。貓編號163在接種後第3曰及第18日〜第21日間、第30 曰〜第3 6日間接近或超過4 0 °C被認為有發熱，之後體溫急 速下降，在第44曰死亡。貓編號2 10在第3曰及第12曰〜第 ， 27曰間超過40 t：被認為有發熱，在第44曰死亡。貓編號 . 170在第3日及第15日〜第18日間接近或超過4〇 °c被認為有 發熱’之後體溫急速下降，在第2 3曰死亡。雜編號1 7 3在 第3曰及第1 8曰〜第2 1曰間超過4 0 °C被認為有發熱，之後體 溫急速下降，在第2 6曰死亡。 體重之變化： 重組N蛋白質抗原免疫群中貓編號2丨7及貓編號6這兩 隻的體種順利增加，貓編號22 1則雖略有下降但大致維持 丨_ 固疋。貓編號1 9 1雖沒有急速下降但緩緩下降，在第4 8日 死亡。攻毒對照群中4隻都從病毒攻毒後開始急速下降， 直到死亡為止持讀下降。 E L I S A抗體力價： 攻毒後每6日將以純化N蛋白質作為抗原者之血清中疒 體力價以EL ISA測定（第12圖）。 几 重組N蛋白質抗原免疫群之4隻中疫苗免疫之反應高的 雜編號221從攻毒後馬上抗體力價開始上升，到第18曰左 右達平穩。疫苗免疫之反應低的其餘3隻從攻毒後第6日 始抗體力價上升，也大約到第18日左右達平穩。攻毒對二 群之抗體力價亦從攻毒後第6日開始上升，但其反應與免、、、 疫群比較，較不急速，到第丨2曰抗體力價還有相當的升 高。任一隻貓的抗體力價都一直上升到死亡時。
200402306 五、發明說明（49) 中和抗體力價： 對攻毒時、攻毒後第12曰、攻毒後第60曰或死亡時的 血清進行中和實驗（不使用補體）（表3)。 表3 中和抗體力價 群 7 9-114 6 株 7 9-114 6 株 *7 9-114 6 株 細賴碉 接種時 接種後第12曰接種後第60曰 桿狀病毒重組N 蛋白質抗原接 種群 217 221 191 6 <10 <10 <10 <10 20 160 40 40 6400 6400 6400 1600 163 <10 80 6400 SF-9接種群 210 <10 80 1600 170 <10 80 800 173 <10 80 1600 ilg *表示在接種後60曰前死亡之貓其死亡B寺之値。 重組Ν蛋白質免疫群之中和抗體力價在攻毒時4隻貓全 部在10倍以下。在攻毒後12日ELISA反應高之編號221其中 和抗體力價雖為160倍，但其他3頭為20〜40倍。攻毒後60 日或死亡的中和抗體力價在生存之3隻中，1隻為1600、2 隻為6400，死亡之1隻為6400倍。攻毒對照群之中和抗體 力價在攻毒時4隻都在10倍以下，攻毒後12曰4隻都是80 倍，死亡時為80 0〜640 0倍。綜合免疫群、攻毒對照群，中 和抗體力價與過程（生死）並不認為有相關性。 病毒分離· 從攻毒後每3日所採取之直腸擦拭液萃取核糖核酸， 以RT_巢式PCR檢測病毒基因以確認活體内病毒之增殖（表 4)。
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五、發明說明（50)
病毒核糖核酸之萃取使用市售套組Sepa RV-R(三光純藥，東京）。將萃取後之核糖核酸 〇· 0/7inl溶解，使成純化核糖核酸。純化核糖核7认 8 0 C、5分鐘急速加熱進行熱變性。將其盘 _岭/4L ; 衝液與引子與反轉錄酵素混合，並於42 t 錄酵素緩 成互補去氧核糖核酸。其次於下述組成之反應1小時合 以反轉錄反應得到之互補去氧核糖核酸丨，加7 加滅菌蒸餾水36 /z 1使總量為5〇 “j。 乍為杈板，# 10 X反應緩衝液4. 8 # 1 2. 5mM/each DNTPs 5 // 1 5OmM引子混合物1 // 1(外部引子套組·
Tag 聚合酶（1 單位/2. 2 #1)2. 2 /z /， °K + )與外部（-））
將該等設定於去氧核糖核酸熱循環機 氧核糖核酸放大。反應係於初始以94或，以PCR法使去 後、94°C1分鐘（熱變性）.55。^分梦進行3分鐘熱變性 (伸長反應）之循環進行30個循^ =黏合）.72t2分鐘 乂取候進行72 °C5分鐘之
200402306 五、發明說明（51) 伸長反應。 使用以外部引子套組放大之PCR產物1 # 1，以内部弓丨 子套組（内部（+ )及内部（-））同樣實施PCR反應。用於PCR之 引子可專一性的辨識FCoV之N基因。各引子之序列如以下 所示。 5, -CAACTGGGGAGATGAACCTT-3,（序列編號：5) 5, -GGTAGCATTTGGCAGCGTTA-3’（序列編號：6) 5’ -ATTGATGGAGTCTTCTGGGTTG-3,（序列編號·· 7) 5’ -TTGGCATTCTTAGGTGTTGTGTC-3’（序列編號： 外部（+) 外部（-） 内部（+ ) 内部（-） 8) 將PCR用引子、Tag聚合酶及互補去氧核糖核酸加入 PCR用緩衝液，並實施30循環之PCR。PCR產物以1%瓊脂凝 膠電泳確認，並判定在特定位置檢出有譜帶者為陽性。 重組N蛋白質免疫群中有2隻檢出病毒。貓編號1 91於 攻毒後第18日、編號6為第3日及第18日各檢出核糖核酸。 攻毒對照群有3隻檢出病毒。貓編號163在第12日及第15 日、編號170在第3日及第9〜18日、編號173在第3日檢出病 毒。編號6、1 7 0、1 7 3在攻毒第3日檢出病毒，但與剛攻毒 後之發熱時期重疊。由病毒分離之結果與生死無法確認其 相關性。 [8]免疫試驗（2) 動物： 使用6個月大之SPF貓與免疫試驗（1)以同樣方式實 施0
2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第55頁 200402306 五、發明說明（52)
重組N蛋白質疫苗之免疫群使用*隻、FIpv π型KIM 株由來之純化Ν蛋白質疫苗之免疫使用4隻、攻毒對照群使 用4隻。 疫苗接種： 疫苗接種與免疫試驗（1)以同樣方式實施。 以ELISA進行抗體力價測定 重組N蛋白質免疫群在2次免疫第3週時數隻只有些許 反應，3次免疫第4週時4隻都有明顯上升（第丨4圖）。純化N 蛋白質免疫群亦在2次免疫第3週時數隻只有些許反應，3 次免疫第4週時4隻都有明顯上升，且值比重組N蛋白質免 疫群還要高。另外，對照群4隻都看不出有反應。 中和抗體力價之測定： 中和抗體之測定係於免疫開始前與3次免疫第4週（攻 毒前）僅以不使用補體的方法對血清實施。 重組N蛋白質免疫群、純化N蛋白質免疫群、對照群任 一者在免疫前·免疫後全部都在10倍以下，檢驗不出中和 抗體（表5)。
2125-5742-PF(Nl);Chiuneow.ptd 第56頁 200402306 五、發明說明（53) __ 中和抗體力價 群 * 免疫—79-1146—79-1146 #—*7 9—1146 株 猫礙调開始時株接種時接種後第12日接種後第60日 桿狀病毒重組N 蛋白質抗原接 種群 177 <10 <10 40 200 242 <10 <10 20 >6400 245 <10 <10 20 3200 247 <10 <10 10 3200
I 175 <10 <10 20 >6400 180 <10 <10 40 80 243 <10 <10 10 >6400 252 <10 <10 40 >6400 純化FIPV抗 原甶來N蛋白 質抗原接種群 178 <10 <10 10 400 SF- 9細胞抗原 181 <10 <10 40 3200 接種群 244 <10 <10 40 6400 249 <10 <10 40 200 *表示在接種後60曰前死亡之貓其死亡fl寺之値。 細胞性免疫之測定： 細胞性免疫係與免疫試驗（1)同樣測定對純化N蛋白質 之延遲型過敏反應。結果以4隻之平均值表示於第15圖。 重組N蛋白質免疫群從接種24小時後可見到腫脹，此24小 時為最大值，之後緩緩消失。純化N蛋白質免疫群從接種 24小時後開始可見到腫脹，到48小時達最大值，之後下降 但直到9 6小時後仍殘有1 mm左右之腫脹。 [9 ]攻毒試驗（2 ) 攻毒方法： 免疫試驗（2)之貓，以與攻毒試驗（1 )同樣方法使感染 FIPV 79-1146。與攻毒試驗（1)以同樣方法實施臨床症狀 之觀察、體溫體重測定、採血及直腸擦拭液之採取。此外 每3日採取咽頭擦拭液以供分離病毒。
2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第 57 頁 200402306 五、發明說明（54) 生存率： 對照群中，貓編號249在攻毒後第23日、編號178在第 29日、編號181在第60日死亡，但編號244生存，以結果 看，4隻中有3隻死亡（第16圖）。相對於此，重組N蛋白質 免疫之群中，僅有貓編號177在第19日死亡，其他3隻存 活。純化N蛋白質免疫群中，貓編號18〇在第19日、編號 175在第77日、編號252在第78日死亡，以結果看，4隻中 有3隻死亡’但若與攻毒對照群比較，可認為有延命效 果，可確認有某種程度的效果。 體溫之變化：
重組N蛋白質免疫之群中，貓編號177自攻毒起體溫持 續上升，到第1 5曰達到最高點後急速下降並死亡。編號 242在第3曰發熱後，雖一度下降但從第3〇曰左右又再發熱 並持續-段時間。其他2隻雖在感染初期有㈣，但之後 大致過程為平均熱度。 純化N蛋白曾争；芦夕被& . ^ . 0 α ^ ^ ,員充反之群中，貓編號180在攻毒第3曰與 二過度後體溫急速下降並死亡。編號252變 在咸·九又如路之问熱後’體溫緩緩下降並死亡。編號1 75
就Ζ 4 4大致以平均埶唐始 於第1 2曰時曾經下降，。亡之3隻在感染初期發熱4 續體溫下降。 馬上再發熱’並於死亡數日刖^ 體重之變化： 重組Ν蛋白質免疫之群中 死亡的貓編號1 7 7從感染後
2125-5742-PF(Nl) ;Qiiuniecw.ptc 第58頁 200402306 五、發明說明（55) 馬上持續減少。編號245及編號247雖順利增加，但編號 242緩緩減少。純化N蛋白質免疫之群中，貓編號18〇急~速 下降並死亡，但編號252緩緩下降並死亡。編號175為唯一 體重有增加者但與編號252在同時期死亡。編號243之體重 順利增加。攻毒對照群中，存活的貓編號244可看到體重 些微增加，但死亡之3隻從剛感染後到死亡為止持續下 降。 ELISA抗體力價：
攻毒後每6日以純化N蛋白質ELISA測定血清中抗體力 價（第17圖）。重組N蛋白質免疫群與純化N蛋白質免疫群基 本上沒有不同，攻毒第6日可觀察到抗體上升到第12曰達 到平穩。純化N蛋白質免疫群之中，貓編號丨8 〇在攻毒時已 為咼值’但攻毒後更加上升。攻毒對照群中4隻皆自攻毒 後第1 2日開始可見到反應，到第3〇日時達到平穩。 中和抗體力價： ~
關於中和抗體力價之變化，重組N蛋白質免疫群、純 化N蛋白質免疫群、攻毒對照群在基本上沒有不同（表5)。 任一者之貓在攻毒前皆為丨〇倍以下，但在攻毒後第丨2日顯 不10〜40倍之抗體力價，感染後第6〇曰仍存活者為 320 0〜6400倍以上。對60日以前死亡者，為8〇〜2〇〇之低 值’但可認為係在抗體充分產生前死亡。 用Fcwf 4細胞分離病毒： 將咽頭擦拭液與直腸擦栻液各〇. 〇5ml/weU接種於培 養在48穴盤之fcwf-4細胞，於37它下吸附i小時。將細胞
200402306 五、發明說明（56) 面以培養液洗淨後，加入維持用MEM0.5ml/well並於37°C 下培養。以2曰以内觀察到CPE者當作是陽性。其結果與 RT-PCR大致顯示同樣結果。直腸擦拭液所分離之病毒在攻 毒第6日〜第1 5日間，重組N蛋白質免疫群之2隻及純化N蛋 白質免疫群中1隻各在卜2曰呈現陽性（表6)。 表6 群 貓編號 FIPV 7 9-114 6株接種爸 日數（ 曰） 0 3 6 9 12 15 M Fcwf4 細胞分離病毒 桿狀病毒重組 Ν蛋白質抗原 接種群 177 - - - 一 + + 242 245 247 - - - - + 一 純化FIPV抗 原甶來Ν蛋白 質抗原接種群 175 - - - - - - 180 - - + - + - 243 - - 一 - - 一 252 - 一 - - - - SF- 9細胞 抗原接種群 178 - - - - - - 181 244 - - - - - -· 249 - - - - - - 以 RT-Npcr 檢出FCoV基Η 桿狀病毒重組 Ν蛋白質抗原 接種群 177 - - - 一 + + 242 245 - - - + + - 247 - 一 - 一 + - 純化FIPV抗 原甶來Ν蛋白 質抗原接種群 175 - - - + - - 180 - - + - + - 243 252 SF-9細胞 抗原接種群 178 - - 一 + - - 181 - - - - - + 244 — - + - - - 24 9 + :分離到病毒者，或撿出FCOV基因者 -：未分離到病毒者，或未檢出FCOVSS者 由咽頭擦拭液分離病毒者，各群皆為全數呈陽性，攻 毒後第3〜9曰幾乎所有個體都分離到病毒（表7 )。 2125-5742-PF(Nl);Chiiniew.ptd 第 60 頁 1^· 200402306 五、發明說明（57) 表7 群 貓編咸 FIPV 7 9-114 6株接種爸 賺( 曰） 0 3 6 9 12 15 用Fcwf 4細胞分 離病毒 年 干狀病母重組 N蛋白質抗原 接種群 177 一 + + + - - 242 - + + - 腳 - 245 - + + + - 讎 247 一 + + + - - 純化FIPV抗 原由來N蛋白 質抗原接種群 175 - + + + - - 180 - - + 一 - - 243 - + + - - - 252 - + + + - - SF-9細胞 抗原接種群 178 - + + - - - 181 一 + - + - - 244 - + - + - - 249 - + + + - - 以 RT-nPCR檢 出FC〇V基因 桿狀病毒重組 N蛋白質抗原 接種群 177 - + + + - - 242 - + + - 一 - 245 一 + + + - - 247 - + + + - - 純化FIPV抗 原甶來N蛋白 質抗原接種群 175 - + + + - - 180 一 + + + - - 243 - + + - - - 252 - + + + - - SF- 9細胞 抗原接種群 178 - + + - + - 181 - + - + - - 244 - + - + - - 249 - + + + + - + :分離到病毒者，或撿出FCOV基因者 -：未分離到病毒者，或未檢出FCoVffig者 病毒分離（RT-巢式PCR): 因攻毒試驗（1)中由直腸擦拭液分離病毒之感度低， 故在攻毒試驗（2 )中亦實施由咽頭擦拭液分離病毒。直腸 擦拭液及咽頭擦拭液係於攻毒後每3日採取，用於實驗。 由直腸擦拭液之RT-PCR與攻毒試驗（1 )所得到之結果大致 相同，在重組N蛋白質免疫群中4隻中3隻、純化N蛋白質免 疫群中有2隻、攻毒對照群有3隻各在卜2曰呈現陽性（表
2125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd 第61頁 200402306 五、發明說明（58) 6德）第3由ΓΛ擦錢之RT_PGR在各群以全數呈陽性，攻毒 所有個體都檢出病毒。但攻毒後第15曰猫 編唬180反轉為陰性（表7)。 以大腸桿菌表現重組蛋白質·· 大腸桿菌表現使用表現與谷胱甘肽—s—轉移酶融合蛋 白貝之貝體載體-PGEX-2T(法馬喜亞（pharmacia)) 蛋白 質之表現使用FIPV ί型KU-2株之基因。為表現以蛋白質整 區、，將起始密碼子ATG到終止密碼子ΤΑΑ插入於GST編碼區 下游之選殖區。S蛋白質之表現使用ku-2株與pipy η型 KU-1株之基因。s蛋白質中，除依株之不同變異大之區域 訊息胜肽序列以外，將編碼為N末端約25〇個胺基酸區與N 蛋白質以同樣方式選殖。將確認轉型之大腸菌於3 7 t下培 養2小時後，加入iPTGlmM再培養3小時，以誘導重組蛋白 質之表現。將此菌液離心收集菌體，以緩衝液洗淨後使用 於西方墨點試驗法。以I? I p V I型K u - 2株N蛋白質與G S T之融 合蛋白質作為r IExN、FIPV I型KU - 2株S蛋白質之一部與 GST之融合蛋白質作為r iexS、FIPV II型KU-1株S蛋白質之 一部與GST之融合蛋白質作為rllExS。 感染貓血清： 對SPF貓5隻分別接種FIPV I型KU-2株、Black株、 UCD1 株、FIPV II 型之79-1146株、FECV II 型之79-1683株 的培養液，使其感染，並經時採寫，以抗體力價達最大時 之血清作為感染血清。 西方墨點法： 2125-5742-PF(Nl) ;Chiusieow.ptd 第62頁 200402306 五、發明說明（59) 將樣本緩衝液加入製作之抗原並加熱處理後，以1 1 % 之SDS-PAGE凝膠展開。將凝膠取出轉印於PVDF膜，洗淨後 於4 °C下浸泡於Block Ace下隔夜使吸墨。一次血清使用感 染各貓冠狀病毒之感染貓血清。將轉印膜浸泡於一次血清 於37 C下反應2小時後，以添加〇· 〇5%Tween20之PBS㈠洗淨3 次。2次血清使用HRP0標記抗貓IgG + M + A。浸泡於添加標記 抗體之血清稀釋液於3 7 °C下反應1小時後，以添加 0.05%Tween20之PBS㈠洗淨3次。將轉印膜浸泡於基質液（〇· 02%DAB、0·006〇/〇Η2Ο2、〇.〇5MTris-HCl(pH7.6))使發色後， 以蒸餾水洗淨使反應停止。結果如第1 8圖。 FIPV I型KU-2株與Black株之感染貓血清會與riExs蛋 白質與r ΙΕχΝ蛋白質反應，但UCD1株感染貓血清雖會與 rlExN蛋白質反應，卻不會與rIExS蛋白質反應。FIpv ! ! 型79 -1146株之感染貓血请會與rIExS蛋白質與“以^蛋白 質反應。FECVII型79-1683株之感染貓血清僅會與"^；』 蛋白質反應。即，KU-2株之重組蛋白質對任一者之貓冠狀 病毒感染血清皆顯示良好之反應性。 產業上之可利用性 、本發明提供用於貓傳染性腹膜炎病毒感染之治療及/ L· 或預防用疫苗及方法。本發明之疫苗係利用具有前述 a)-e)所記載聚核苷酸編碼之胺基酸序列之蛋白質作為抗 因A專蛋白質不含有感染增強抗原 :'。利用該等蛋白質，可製成對廣泛株可期待預防及/或 治療效果之疫苗。又，因岑装
200402306 玉、發明說明（60) 決定基，本發明 描傳染性腹 感染性疾病。到 定。另一方面， 效果良 性腹膜 再 酸編碼 病毒感 診斷方 以雜傳 該疾病 預防醫 又 書作為 之疫苗 膜炎病 目前為 本發明 全性高 預防或 明提供 序列之 方法及 試藥可 炎病毒 況調查 要的資 書中所 數會致死的嚴重 苗，但評價仍未 苗比較，其預防 明疫苗在貓傳染 )所記載聚核苷 寒苗傳染性腹膜炎 試藥。本發明之 廣泛之株感染。 依據之筛選，對 况之調查在F I p v 好，且安 炎病毒之 者，本發 之胺基酸 染之診斷 法或診斷 染性腹膜 之感染狀 學上是重 ，本說明 參考之用 可期待有 毒是一種 止雖已嘗 之疫苗與 。故，可 治療上是 利用具有 蛋白質作 用於該診 容易且迅 感染之診 是有用的 訊。 引用之先 南安全性 發病後多 試各種疫 已知之疫 了解本發 有用的。 前述a) - e 為抗原之 斷方法之 速診斷出 斷方法為 。感染狀 前技術文獻會放入本說明
200402306 圖式簡單說明 第1圖表示FIPV I型KU - 2由來之N蛋白質基因的鹼基序 列（序列編號：1 )及胺基酸序列（序列編號：2 )。 第2圖表示FIPV與近緣之病毒其N蛋白質之胺基酸序列 排列的結果。各序列由上而下為FIPV I型KU-2株（序列編 號：2)、Black 株、UCD1 株、FIPV II 型79-1146株、FECV I I 型 79- 1 683 株、CCV Insvcl 株及TGEV Purde 株之蛋白質 胺基酸序列。圖中…表示與KU-2株相同之胺基酸殘基，-表示缺口。 第3圖表示由FIPV I型KU-2株'Black株、UCD1株、
FIPV II型79-1146株、FECV II型79-1683 株、CCV Insvcl 株及TGEV Purde株之N基因其胺基酸序列計算後之系統 數。圖中數字表示進化距離。 第4圖為顯示以西方墨點法解析桿狀病毒重組N蛋白； 抗原專一性之結果照片。圖中箭號表示N蛋白質譜帶之位 置。3，1)，（：，（1，6，1:，忌各為稀釋8倍、16倍、32倍、64件、 128倍、256倍及512倍之桿狀病毒重組N蛋白質抗\ 示純化之FIPV可溶化抗原。 ^ 第5圖為顯示以西方墨點法經士 古解析柃狀病毒重組N蛋白^ 抗原專一性之結果照片。圖中箭铐 ^
就表不n蛋白質譜揲夕你 置。β為純化FIPV抗原由來N蛋白皙 主、曰帶之位 FIPV可溶化抗原。 c衣不砘化之 狀病毒重組N蛋白質抗为 稀釋倍數，縱軸表j 第6圖表示以ELISA法解析桿 專一性之結果。橫軸表示抗原之 450nm之吸光度。
i!? 1 0 200402306 圈式簡單說明 第7圖表示以ELISA法解析精製的pipy抗原由來n蛋白 質的專一性之結果。橫轴表示抗原之稀釋倍數，縱轴表示 、 450nm之吸光度。 第8圖表示免疫試驗（1)及攻毒試驗（1)之日程。（3)表 示桿狀病毒重組N蛋白質抗原投予群、（b)表示SF — 9細胞抗 原接種群。 第9圖上表示以EL I SA法測定接種桿狀病毒重組n蛋白 質抗原後之抗體力價結果。第9圖下為顯示接種^ — 9細胞 抗原後的抗體力價。圖中數字為用於實驗的貓編號。橫軸 表示接種抗原後經過的時間’縱轴表示45〇nm的吸光度。
第10圖表示桿狀病毒重組N蛋白質抗原免疫貓中之延 遲型過敏症反應。圖中數字為用於實驗的貓編號。橫軸表 示接種抗原後經過的時間，縱軸表示腫脹範圍。 第11圖表示FIPV 79-1146株攻毒後生存率的變化。橫 轴表示79-1146株接種後之日數，縱軸表示生存率。實線 為桿狀病毒重組N蛋白質抗原免疫貓之生存率、虛線表示 接種SF-9細胞抗原後貓之生存率。 第1 2圖上表示桿狀病毒重蛋白質抗原接種群中接 種79-1146株後其抗FIPV抗體力價的變化。第12圖下表示 在SF-9細胞抗原接種群中，接種79_1146株後其抗以”抗 體力價的變化。圖中數字為用於實驗的貓編 接種79-U46後之日數，縱軸表示腫脹範圍。、釉衣 一第13圖表不免疫試驗（2)及攻毒試驗之日程。 表示桿狀病毒重組N蛋白質抗原接種群及純化ηρν由來N蛋
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白質抗原接種群、（b)表示SF-9細胞抗原接種群β 第14圖上表示以EUSA法測定接種桿狀病毒重組Ν蛋白 $抗原後之抗體力價結果。第14圖中央表示純化^”由來 抗原N蛋白質抗原接種後之抗體力價。第14圖下為sF_9細 胞抗原接種後的抗體力價。圖中數字為用於實驗的貓編 號。橫軸表示接種抗原後經過的時間，縱軸表示45〇nm的 吸光度。 第1 5圖表示桿狀病毒重組N蛋白質抗原免疫貓中及純 化F I PV由來抗原ν蛋白質抗原免疫貓中之延遲型過敏症反
應。圖中數字為用於實驗的貓編號。橫軸表示接種抗原後 經過的時間，縱軸表示腫脹範圍。 第16圖表示FIPV79-1146株攻毒後生存率的變化。橫 轴表示79-1146株接種後之日數，縱軸表示生存率。 第17圖上表示桿狀病毒重組N蛋白質抗原接種群中 79- 1 1 46株接種後其抗FIPV抗體力價之變化。第17圖中央 表示純化FIPV由來抗原N蛋白質抗原接種群中79 —丨146株接 種後其抗FIPV抗體力價之變化。第1.7圖下為sf-9細胞抗原 接種群中79-1 1 46株接種後其抗FIPV抗體力價之變化。~圖' 中數子為用於實驗的|苗編號。橫軸表示79-1146株接種後 之曰數，縱軸表示450nm的吸光度。 病毒感染貓血清對大腸桿菌表 法試驗結果照片。在各帶上表 濾、片感染上面記載之冠狀病毒
第1 8圖表示檢驗貓冠狀 現抗原之反應性之西方墨點 示’以帶上所示抗原點墨之 株後與雜血清反應之結果。
Claims (1)
- 200402306六、申請專利範圍 乂 1· 一種貓傳染性腹膜炎病毒之治療及/或預防用疫 苗，包括含有以下a)-e)任一者所記載之聚核苷酸所編碼 之胺基酸序列之蛋白質作為有效成分： a)聚核普酸，其含有序列編號·· 1所記載鹼基序列之 編碼區、 b )聚核脊酸’其含有編碼為序列編號：2所記載胺基 酸序列之驗基序列、 c)聚核苷酸’其含有與序列編號：1所記載鹼基序列 之編碼區具9 3 %以上相同度的驗基序列、d )聚核普酸’其含有與編碼為序列編號：2所記載胺 基酸序列之驗基序列具9 3 %以上相同度的鹼基序列、 e )聚核苷酸，係編碼為擇自a ) — d)中任一者所記載之 聚核甘酸所編碼之胺基酸序列、由4 5個以上胺基酸殘基所 形成之連續胺基酸序列。 2· —種貓傳染性腹獏炎病毒之治療及/或預防用疫 苗，包括以下a)-e)任一者所記載之聚核苷酸作為有效成 分： a )聚核苷酸，其含有序列編號：1所記載鹼基序列之 編碼區、 b)聚核苷酸，其含有編碼為序列編號：2所記載胺基 酸序列之鹼基序列、 c )聚核苷酸，其含有與序列編號：丨所記載鹼基序列 之編碼區具9 3 %以上相同度的驗基序列、 d )聚核苷酸’其含有與編碼為序列編號：2所記載胺2125-5742-F^(Nl);Chiua^ow.ptd 第68頁 200402306 六、申請專利範圍 基酸序列之驗基序列具93%以上相同度的鹼基序列、 聚核脊酸，係編碼為擇自a ) )中任一者所記載之 聚核苷酸所編碼之胺基酸序列、由4 5個以上胺基酸殘基所 形成之連續胺基酸序列。 、3·如申請專利範圍第1項或第2項之疫苗，其中聚核苷 酸為a)或b)所記載之聚核苷酸。 ’ 4 · 一種1苗傳染性腹膜炎病毒之治療及/或預防用抗體 製劑，包括具有與以下a) — e )任一者所記載之聚核苷酸所 編碼之胺基酸序列所構成之蛋白質有結合能力之抗體作為 有效成分： 其含有序列編號：1所記載鹼基序列之a )聚核苷酸 編碼區、 b )聚核苷酸，其含有編碼為序列編號：2所記載胺基 酸序列之驗基序列、 C)聚核苷酸，其含有與序列編號：i所記载鹼基序列 之編碼區具93%以上相同度的鹼基序列、 d) 水核苷酸，其含有與編碼為序列編號：2所記載胺 基酸序列之驗基序列具93%以上相同度的驗基序列、 e) 聚核苷酸，係編碼為擇自㈧乂）中任一者所記載之苷ί 2編碼之胺基酸序列、由45個以上胺基酸殘基月 形成之連續胺基酸序列。 5種細傳染性腹膜炎病毒之治療及/或預防用方 Ϊ二“苗至少投予1次申請專利範圍第1項、第2項及 第3項中任一項所記載之疫苗的過程。200402306 六、申請專利範圍 、6· —種|苗傳染性腹膜炎病毒之治療及/或預防用方 法’包括對描至少投予1次申請專利範圍第4項中所記載之 抗體製劑的過程。 7· —種雜傳染性腹膜炎病毒感染之檢驗方法，包括將 =有由以下a) 任一者所記載之聚核苷酸所編碼之胺基 酸序列之蛋白質與貓血清一起培養，以檢出與該蛋白質結 合抗體之過程： a)聚核脊酸，其含有序列編號：1所記載鹼基序列之 編碼區、b )聚核苔酸，其含有編碼為序列編號：2所記載胺基 酸序列之驗基序列、 C )聚核脊酸，其含有與序列編號：1所記載鹼基序列 之編碼區具93%以上相同度的鹼基序列、 d )聚核脊酸，其含有與編碼為序列編號：2所記載胺 基酸序列之鹼基序列具93%以上相同度的鹼基序列、 ej聚核苔酸，係編碼為擇自㈧―d)中任一者所記載之 聚核苷酸所編碼之胺基酸序列、由45個以上胺基酸殘基所 形成之連續胺基酸序列。 入8. 了種貓傳染性腹膜炎病毒感染之檢驗用試藥，包括含有有以下a ) -e )任一者所記載之聚核苷酸所編碼之胺基 酸序列之蛋白質： a)聚核甘酸’其含有序列編號：1所記載鹼基序列之 編碼區、 b )聚核甘馱，其含有編碼為序列編號：2所記載胺基200402306 六、申請專利範圍 酸序列之鹼基序列、 C )聚核苷酸，其含有與序列編號·〗所記載鹼基序列 之編碼區具9 3 %以上相、同度的鹼基序列、 d)聚核苷酸，其含有與編瑪為序列編號 基酸序列之=基序列具93%以上相同度的驗基序列載胺 =聚核甘酸，係編碼為擇|a)_d)中任一者所記载之 聚核有2酸所編碼之胺基酸序列、由4 5個以上胺基酸殘美 形成之連續胺基酸序列。 土 72125-5742-PF(Nl);Chiumeow.ptd $ 71頁
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