WO2004003020A1 - 外リンパ瘻の検出方法 - Google Patents

外リンパ瘻の検出方法

Info

Publication number
WO2004003020A1
WO2004003020A1 PCT/JP2003/008123 JP0308123W WO2004003020A1 WO 2004003020 A1 WO2004003020 A1 WO 2004003020A1 JP 0308123 W JP0308123 W JP 0308123W WO 2004003020 A1 WO2004003020 A1 WO 2004003020A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
antibody
seq
perilymph
amino acid
fistula
Prior art date
Application number
PCT/JP2003/008123
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tetsuo Ikezono
Toshiaki Yagi
Akira Omori
Original Assignee
Nippon Medical School Foundation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nippon Medical School Foundation filed Critical Nippon Medical School Foundation
Priority to AT03736265T priority Critical patent/ATE495194T1/de
Priority to AU2003243985A priority patent/AU2003243985B2/en
Priority to EP03736265A priority patent/EP1533319B1/en
Priority to US10/517,778 priority patent/US7863005B2/en
Priority to DE60335723T priority patent/DE60335723D1/de
Publication of WO2004003020A1 publication Critical patent/WO2004003020A1/ja

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting a perilymph fistula, an antibody, a reagent, and a kit used for the method.
  • Perilymph fistula is a disease in which the perilymph present in the inner ear tissue passes through the inner ear window (round window and / or oval window) or the fissura ante fenestram (bone cleft between the inner and middle ears). It is a disease that leaks into the room (middle ear) and causes hearing and balance disorders. Causes include congenital malformations, syphilis, stapes surgery, and head trauma.
  • idiopathic (unknown cause), etc. are considered. It is also known to be caused by sudden changes in cerebrospinal fluid pressure and inner ear pressure caused by actions that can be normally performed in daily life, such as nose sneezing, sneezing, coughing, stiffness, diving, climbing, trauma, etc. It causes acute sensorineural deafness, dizziness, and a part of balance disorder.
  • Sudden deafness is a disease in which the cause of acute sensorineural hearing loss cannot be clearly identified and accounts for the highest proportion of acute sensorineural hearing loss.
  • perilymphatic fistula was observed in 8 of 11 patients who underwent a trial tympanotomy in a patient with sudden deafness (Kunihide Yoshioka, “Oto-rhino-laryngology perspective”) Vol. 26, Suppl. 6; 1983: p. 517-539). It has also been shown that patients with perilymph fistula have been included in Meniere's disease, which is one of acute sensorineural hearing loss and is known as a syndrome that is increasing in modern society.
  • Perilymphatic fistula is the only disease that can be expected to improve hearing and balance dysfunction due to surgery in acute sensorineural hearing loss.Since rapid treatment affects the cure rate, it is simple, reliable, and powerful. The development of diagnostic methods that are less invasive to patients is strongly desired.
  • C0CH is a gene identified as a causative gene of asymptomatic hereditary hearing loss DFNA9, and the C0CH protein encoded by the gene is named Coch 1 in (NG Robert son, Narure Genet. J 20; 1998: p. 299-303; and the NCBI 0MIM homepage; http: // www. Ncbi. Nlm. Nih. Gov /).
  • the present inventors focused on the fact that this Coch 1 in is an important protein in human hearing loss and performed a proteome analysis of Coch 1 in in the inner ear tissue of the cochlea.
  • An object of the present invention is to provide a method for detecting a perilymph fistula which is simple, reliable, and has a low invasiveness to a patient.
  • Another object of the present invention is to provide an antibody, a reagent, and a kit for use in the above-described detection method of the present invention.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to achieve the above object, and as a result, used as a sample a body fluid present in the middle ear of a patient suspected of suffering from perilymphatic fistula. We found that perilymph fistula can be detected by using the presence of 1 in as an index.
  • the present invention has been accomplished based on these findings. That is, according to the present invention, the following inventions are provided.
  • a method for detecting perilymphatic fistula comprising detecting the presence of Coch1 in in a body fluid present in the middle ear.
  • the immunological method is performed using an antibody that recognizes an antigenic determinant contained in the amino acid sequence represented by amino acid numbers 36 to 127 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing, (4) or The method according to (5).
  • a reagent for detecting perilymph fistula comprising an anti-Cochlin antibody.
  • the anti-Coch 1 in antibody has an amino acid number of 36 to 127 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • a reagent kit for detecting perilymph fistula comprising the reagent for detecting perilymph fistula according to any one of (9) to (12).
  • Fig. 1 shows the results of Western blotting of human, mouse, and guinea pig inner ear tissue extracts and perilymph using three antibodies: anti-p63 / 44-40, anti-p63Z44, and anti-LCCL antibodies.
  • 2 shows the results of analysis by the set method.
  • FIG. 2 shows the results of analyzing various samples derived from humans by Western blotting using an anti-LCCL antibody.
  • the column numbers 1 to 12 correspond to the respective column numbers described in Table 1, and the description below the photograph indicates the sample provided for the column.
  • each sample name “ten” indicates that a 16 kDa protein was detected, and “one” indicates that it was not detected.
  • Figure 3 shows the results of various human-derived samples analyzed by anti-LCCL antibody by Western blotting.
  • the column numbers 13 to 24 correspond to the respective column numbers shown in Table 1, and the description below the photograph shows the sample provided for the column.
  • each sample name “+” indicates that a 16 kDa protein was detected, and “one” indicates that no protein was detected.
  • FIG. 4 shows the results of analyzing various samples derived from human by Western blotting using an anti-LCCL antibody.
  • the jewel numbers 25 to 3.6 correspond to the jewel numbers described in Table 1, and the description below the photograph shows the sample provided for the jewel.
  • Each sample In the description below the name, “ten” indicates that a 16 kDa protein was detected, and “one” indicates that it was not detected.
  • the upper photo shows the results when the film was exposed to light for 1 hour during detection by chemiluminescence, and the lower photo shows the results when the same nitrocellulose membrane was exposed for 10 seconds.
  • FIG. 5 shows the results of analysis of various human samples by Western blotting using an anti-LCCL antibody.
  • the column numbers 37 to 48 correspond to the respective tank numbers described in Table 1, and the description below the photograph shows the sample used for the corresponding tank.
  • each sample name “ten” indicates that a 16 kDa protein was detected, and “one” indicates that no protein was detected. "Soil” indicates that it could not be determined.
  • FIG. 6 shows the results of analyzing various samples derived from humans by Western blotting using an anti-LCCL antibody.
  • the cell numbers of 49 to 60 correspond to the respective cell numbers described in Table 1, and the description below the photograph indicates the sample used for the corresponding cell.
  • each sample name “ten” indicates that a 16 kDa protein was detected, and “one” indicates that no protein was detected.
  • FIG. 7 shows the results of analysis of various human samples by Western blotting using an anti-LCCL antibody.
  • the jewel numbers 61 to 72 correspond to the jewel numbers described in Table 1, and the description below the photograph shows the sample provided for the jewel.
  • each sample name “ten” indicates that a 16 kDa protein was detected, and “one” indicates that no protein was detected. .
  • FIG. 8 shows the results of Western blot analysis of the perilymph and inner ear tissue extracts of the mouse using four types of antibodies, an anti-LCCL antibody, an anti-LCCL1, an anti-LCCL2 antibody, and an anti-LCCL3 antibody.
  • FIG. 9 shows the results of analyzing various samples of human origin by Western blotting using an anti-LCCL3 antibody.
  • the lower figure shows the resolution around 16kDa in the upper figure.
  • the tube numbers 73 to 83 correspond to the respective well numbers described in Table 2, and the description below the photo shows the sample used for the well.
  • each sample name “+” indicates that a 16 kDa protein was detected, and “one” indicates that no protein was detected.
  • FIG. 10 shows the positional relationship of the antigen polypeptide for producing the antibody of the present invention on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the perilymph fistula is defined as the perilymph present in the inner ear tissue due to any factor causing the inner ear window (either round window or oval window or both) or fissura ante fenestram (inner ear and middle ear). It is a disease that leaks into the tympanic cavity (middle ear) from the bone cleft between the two and causes hearing and balance dysfunction. The disease can be detected by confirming that the perilymph has leaked into the middle ear.
  • Coch 1 in is a protein encoded by a gene C0CH identified as a causative gene of non-symptomatic hereditary hearing loss DFNA9 (NG Robertson, Nature Genet., 20, 299-303 (1998)).
  • the protein has three different ⁇ -ends and three isoforms p63 and p44 having a molecular weight of 63 kDa, 44 kDa, and 40 kDa in animal species such as human, pest, guinea pig, and rat. , Exists as p40 (Ikezono et al., Biochem. Biopys. Acta, 1535, 3, 258-265 (2001)).
  • the amino acid sequence of Coch 1 in corresponding to SEQ ID NO: 1 in the sequence listing is described in Nature Genet.,
  • the isoform p63 having the largest molecular weight of 63 kDa in humans is a protein comprising an amino acid sequence represented by amino acid numbers 25 to 550 in the amino acid sequence.
  • Isoform p44 is a protein having the amino acid sequence represented by amino acid numbers 133 to 550 in the amino acid sequence
  • isoform P40 is a protein having the amino acid sequence represented by amino acid numbers 152 to 550.
  • a portion represented by amino acids Nos. 1 to 24 is a signal sequence.
  • Coch 1 in used as an indicator of the possibility of perilymph fistula includes a fragment containing the N-terminal amino acid sequence of isoform p63 (hereinafter, this may be referred to as “N-terminal fragment”). Is preferably used.
  • the fragment may be a protein having any size as long as it contains the N-terminal amino acid sequence of Coch 1 in isoform p63.
  • the fragment may be any of amino acids 36 to 127 of SEQ ID NO: 1.
  • An N-terminal fragment having a molecular weight of about 16 kDa, which is recognized by an antibody or the like, which is characterized by recognizing an antigenic determinant contained in the polypeptide represented by the described amino acid sequence, is particularly preferred.
  • a body fluid present in the middle ear of a patient suspected of suffering from perilymphatic fistula is used.
  • the bodily fluids that may be present in the human middle ear include, for example, perilymph, cerebrospinal fluid (Cerebro-Spinal Fluid; hereinafter, this may be referred to as “CSF”), blood, saliva, and middle ear mucosa.
  • CSF cerebrospinal fluid
  • Examples include the produced middle ear mucus.
  • CSF flows into the inner ear through the 8th cranial nerve pathway or cochlear canal of the inner ear canal due to surgery, etc., flows into the middle ear, and also flows due to trauma, fracture, deformed inner ear, etc. It is known.
  • Blood may be present in the middle ear due to bleeding from trauma, bleeding from the middle ear mucosa, and the like. It is known that saliva from the nasopharynx flows into the middle ear by backflow from the eustachian tube. Also, middle ear effusion may be present in patients with otitis media with effusion, and otorrhea (pus) may be present in patients with chronic otitis media. Although it is not possible to visually discriminate these bodily fluids, they are collected and analyzed, and the presence of Cochlin in the sample is analyzed. Can be determined, and can be used as an indicator of the possibility of perilymphatic fistula.
  • the method of collecting body fluids in the middle ear is as low as possible with minimal invasiveness to the patient, as much as possible without mixing blood, drugs, etc., or other proteins. Any method may be used. For example, a small incision may be made in the eardrum and a syringe or the like may be inserted and the bodily fluid may be sucked and collected as it is, or a swab may be inserted and wiped off the existing bodily fluid to collect the bodily fluid. ,.
  • a method of injecting an appropriate amount of an appropriate solution such as physiological saline using a syringe or the like and then collecting the entire solution with the syringe or the like is preferably used.
  • the solution recovered by such a method is referred to as “middle ear washing solution”.
  • the solution used here a solution that is physiologically acceptable in terms of composition, pH, temperature, and the like and has a small burden on the patient is selected.
  • middle ear since the middle ear communicates with the nasopharynx and oropharynx via the Eustachian tube, body fluid from the middle ear that reaches the nasopharynx and oropharynx through the Eustachian tube may be collected. Specifically, for example, it can be collected by inserting a cotton swab or the like from the oral cavity or nasal cavity, and wiping the bodily fluid present in the nasopharynx or oropharynx.
  • the body fluid thus collected is preferably subjected to analysis immediately after collection, but is stored under low-temperature conditions of 4 to 180 ° C, preferably 120 to 170 ° C. You can also.
  • a preservative that suppresses protein denaturation or a preservative that prevents spoilage may be added as necessary.
  • these samples may be subjected to pretreatment such as concentration and purification, if necessary, prior to analysis. As these specific techniques, known techniques such as concentration and purification of proteins which are generally used may be used.
  • an immunological method using an antibody that recognizes the above-mentioned Coch 1 in or a partial polypeptide thereof is used.
  • an immunologically detecting proteins include, for example, Western blotting, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), chemiluminescent immunoassay, fluorescent antibody assay, radioimmunoassay, latex agglutination, immunoassay. Any method known per se, such as a turbidimetric method or an immunochromatography method, can be used, and among them, a Western blotting method, an ELISA method and the like are preferably used.
  • the detection method of the present invention is carried out by an immunoassay using a labeled antibody such as an enzyme immunoassay (ELISA), a chemiluminescence immunoassay, a fluorescent antibody assay, or a radioimmunoassay
  • a labeled antibody such as an enzyme immunoassay (ELISA), a chemiluminescence immunoassay, a fluorescent antibody assay, or a radioimmunoassay
  • the sandwich method is used.
  • it can be performed by a competition method.
  • at least one of the immobilized antibody and the labeled antibody is an anti-Coch 1 in antibody.
  • the solid phase carrier used in the sandwich method may be any insoluble carrier that can be used to carry the antibody.
  • examples thereof include (1) plastics made of polystyrene resin, polycarbonate resin, silicon resin, nylon resin, etc., and glass. Plates, test tubes, tubes, or other materials having an internal volume such as representative water-insoluble substances, beads, balls, filters, membranes, etc .; and (2) cellulose-based carriers, agarose-based carriers, poly Acrylamide-based carriers, dextran-based carriers, polystyrene-based carriers, polybutyl alcohol-based carriers, polyamino acid-based carriers, and insoluble carriers used in affinity chromatography such as porous silicic acid-based carriers. Can be.
  • the operation method of measurement is a known method (for example, “Clinical Pathology Extra Edition, Special Issue No. 53, Imnoassy Technology and Application for Clinical Examination” edited by The Japanese Society of Clinical Pathology, Clinical Pathology Publishing Association, 1983, Ed. Eiji Ishikawa et al., “Enzyme Immunoassay”, 3rd edition, Medical Shoin, 1998, Tsunehiro Kitagawa et al., Ed., Protein Nucleic Acid Enzyme Separate Volume No. 31 Enzyme Immunoassay, Kyoritsu Edition, 1 9 8 7 years).
  • the immobilized antibody is reacted with the sample, and the labeled antibody is reacted at the same time or the labeled antibody is reacted after washing to form a complex of the immobilized antibody, the antigen and the labeled antibody. Then, the unbound labeled antibody is separated by washing, and the amount of antigen in the sample can be measured from the amount of the bound labeled antibody.
  • ELISA enzyme immunoassay
  • a labeling enzyme is reacted with a substrate under optimal conditions, and the amount of the reaction product is measured by an optical method or the like.
  • the detection method of the present invention is a method of measuring the production of aggregates of immune complexes, such as in the case of latex agglutination reaction or immunoturbidimetry, by measuring the transmitted light or scattered light by an optical method or by visually measuring
  • phosphate buffer, glycine buffer, Tris buffer, Good buffer, etc. can be used as the solvent, and reaction accelerators such as polyethylene glycol / re and non-specific reaction suppression An agent may be included.
  • the solid support may be polystyrene, styrene-butadiene copolymer, (meth) acrylate polymer, latex, gelatin, ribosome, microcapsule, erythrocyte, Particles made of a material such as silica, alumina, carbon black, a metal compound, a metal, a ceramic or a magnetic material can be used.
  • Known methods such as a physical adsorption method, a chemical bonding method, or a combination of these methods can be used as a method for carrying the compound.
  • the measurement can be performed by a known method.For example, when the measurement is performed by an optical method, the sample is reacted with an antibody, or the sample is reacted with an antibody supported on a solid support, and the end point method is used. Alternatively, the transmitted light and the scattered light are measured by the rate method.
  • the amount of Coch 1 in in the body fluid can be determined by performing quantification by a commonly known protein quantification method known per se.
  • the antibodies used in the immunological method as described above include the Coch Anything that recognizes 1 in can be used. That is, according to the present invention, there is provided a reagent for detecting perilymph fistula comprising an anti-Coch1i ⁇ antibody.
  • the anti-Coch1 in antibody is, for example, a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof (hereinafter, may be referred to as “antigen polypeptide”) as an antigen.
  • antigen polypeptide a polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof (hereinafter, may be referred to as “antigen polypeptide”) as an antigen.
  • an antibody that recognizes an antigenic determinant contained in an antigenic polypeptide having an amino acid sequence specific to the protein consisting of the N-terminal fragment hereinafter, this may be referred to as “epitope” may be used.
  • this may be referred to as “anti-Coch 1 in N-terminal fragment antibody”).
  • an antibody that recognizes an antigenic determinant contained in an antigen polypeptide specific to a protein consisting of an N-terminal fragment having a molecular weight of about 16 kDa is particularly preferably used. More specifically, such an antibody is, for example, an antibody that recognizes an antigenic determinant contained in the amino acid sequence represented by amino acid numbers 36 to 127 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • Such an antibody of the present invention is preferably an antibody that does not react with other proteins or the like contained in body fluids other than the perilymph that may be present in the human middle ear, but has a sufficient reactivity with Cochlin. Anything that is high and can distinguish perilymph from other body fluids can be used. Specifically, for example, when detection is performed using the Western blotting method, depending on the position of the band detected by the antibody and the like, the band derived from Coch 1 i11 and the band derived from other proteins are different. It only needs to be clearly distinguishable.
  • the amino acid sequence of Coch 1 in possessed by multiple target animal species is aligned using appropriate sequence analysis software, etc., and the amino acid sequence common to each animal species is determined. From among them, a partial sequence that easily becomes an epitope may be selected.
  • the length of the antigen polypeptide is such that it can be recognized as an antigen in the immunized animal when immunization is performed using the polypeptide according to the method described below. Any length is acceptable. Specifically, for example, an amino acid having a length of 5 to 30 residues, preferably 10 to 25 residues is used.
  • an antigen polypeptide may be a synthetic polypeptide chemically synthesized according to a known method, or may be extracted and purified from a natural product.
  • the antigen polypeptide selected in this manner includes, from the polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or a partial sequence thereof in the sequence listing, the amino acid sequence of Coch 1 in which is present in the perilymph. Any material can be used as long as it is included.
  • an antigen polypeptide for producing an anti-Coch1 in N-terminal fragment antibody may be any polypeptide having an amino acid sequence containing at least one antigenic determinant of the N-terminal fragment. More specifically, for example, a polyamino acid having an amino acid sequence containing at least one antigenic determinant among the amino acid sequences represented by amino acid numbers 36 to 127 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing Peptides are preferably used.
  • amino acid numbers 36 to 50 (SEQ ID NO: 2), 63 to 83 (SEQ ID NO: 5), 95 to 111 (SEQ ID NO: 6), and 114 to 127 (SEQ ID NO: 1 in the sequence listing)
  • the polypeptide represented by SEQ ID NO: 7) is preferably used. Among them, polypeptides represented by amino acid numbers 36 to 50 (SEQ ID NO: 2) or 114 to 127 (SEQ ID NO: 7) are particularly preferable.
  • an antigen polypeptide for producing an antibody capable of recognizing all three isoforms of isoforms p63, p44, and p40 for example, a sequence shown in Sequence Listing Polypeptides represented by the amino acid numbers 163 to 181 of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 4) are preferably used.
  • Examples of antigen polypeptides for preparing antibodies capable of recognizing the two isoforms of isoforms p63 and p44 include, for example, amino acid numbers 137 to 151 (SEQ ID NO: 3) of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Polypeptides represented by are preferably used.
  • FIG. 10 shows the positional relationship of these antigenic polypeptides on the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • the production of the antibody can be carried out using a commonly used method known per se.
  • the antibody of the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but a polyclonal antibody is preferably used.
  • a carrier protein such as KLH (keyhole 'limpet' hemocyanin), BSA (bovine serum albumin), and pig thyroid globulin
  • KLH keyhole 'limpet' hemocyanin
  • BSA bovine serum albumin
  • pig thyroid globulin a carrier protein
  • the antigen polypeptide is bound using a suitable condensing agent such as maleimide to prepare an antigen for immunization (immunogen).
  • the binding of the antigen polypeptide to the carrier protein may be carried out by a commonly used method known per se.
  • the antigen polypeptide is bound by maleimidation.
  • KLH is preferably added to Sulf 0-SMCC (Sulfosuccimidyl
  • a cysteine is added to the N-terminal or C-terminal, whichever is desired to generate a bond.
  • the antigen polypeptide thus reacted is reacted, it can be easily bound via a thiol to prepare an immunogen.
  • cysteine is contained in the amino acid sequence of the selected antigen polypeptide, the cysteine can be used for binding. Further, in the case of using KLH that has been carpoimidated, the peptide bond can be formed by dehydration condensation with an antigen polypeptide to form a peptide bond.
  • the solution containing the immunogen thus prepared is mixed with an adjuvant, if necessary, and injected into the subcutaneous or intraperitoneal cavity of an animal usually used for antibody production, such as egrets, mice, rats, guinea pigs, sheep, goats, and chickens. Immunization is repeated every 2-3 weeks. Immunity Thereafter, it is preferable to conduct a test blood collection as appropriate, and confirm that the titer (antibody titer) is sufficiently increased by immunological methods such as ELISA and Western blotting.
  • An antiserum can be obtained by collecting blood from animals that have been confirmed to have a sufficiently high titer and separating the serum.
  • a water-soluble fraction is collected from egg yolk collected from chicken eggs to prepare an egg yolk extract, which can be used in the same manner as antiserum.
  • the obtained antiserum or the like can be used as it is without purification, but it is preferable to use it after purifying it by the following method.
  • a purification method using Protein A a salting-out method using ammonium sulfate, a method of purifying an immunoglobulin fraction by ion exchange chromatography, or a method in which a specific polypeptide is immobilized.
  • Purification by affinity column chromatography using a column may be mentioned.
  • the purification method using Protein A and the method using affinity column chromatography are either combined or combined. It is preferable to carry out.
  • the polypeptide for purification to be immobilized on the column depending on the amino acid sequence of the antigen polypeptide used, a polypeptide containing the same sequence or a partial sequence thereof is selected and used.
  • a polypeptide containing the same sequence or a partial sequence thereof is selected and used.
  • antibody-producing cells are collected from the lupus of the immunized animal in the same manner as described above, and fused with cultured cells such as myeloma cells derived from syngeneic animals, etc. in a conventional manner. Then, a hybridoma is produced (Milstein et al., Nature, 256, 495 (1975)). After culturing, the antibody titer can be appropriately confirmed by ELISA, Western blotting, or the like, and a monoclonal antibody that recognizes the desired epitope can be produced, and a hybridoma having a high antibody-producing ability can be selected. The desired monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant of the hybridoma thus selected.
  • the antibodies thus obtained are all antibodies that specifically recognize Coch 1 in. It is known that Cochlin such as inner ear tissue exists Tissues are collected from an appropriate animal species, prepared as an extract, and the extract is used as a positive control, or a polypeptide having an amino acid sequence used as an antigen polypeptide is chemically synthesized. It can be confirmed by analyzing the reactivity with these. It is also preferable to confirm the reactivity with Coch 1 in present in the perilymph using the perilymph as a sample.
  • IgG1 when IgG1 is treated with papain, it is cleaved upstream of the disulfide bond existing between the two heavy chains in the hinge region, and is cut from VL (light chain variable region) and CL (light chain constant region).
  • H chain fragment consisting of L chain and VH (H chain variable region) and CHyl (y1 region in H chain constant region) produced two homologous antibody fragments linked by disulfide bonds at the C-terminal region. can do.
  • Fab ' Each of these two homologous antibody fragments will be referred to as Fab '.
  • the antibody of the present invention can be used as an immobilized antibody carried on an insoluble carrier such as a solid phase carrier, or as a labeled antibody labeled with a labeling substance. All such immobilized antibodies and labeled antibodies are within the scope of the present invention.
  • immobilized antibody refers to an antibody that is supported on an insoluble carrier by physical adsorption or chemical bonding. These immobilized antibodies can be used to detect or quantify Cochlin in body fluids present in the middle ear.
  • immobilized antibodies can be used to detect or quantify Cochlin in body fluids present in the middle ear.
  • the insoluble carrier that can be used for supporting the polymer include (1) plastics made of resin, polycarbonate resin, silicone resin, nylon resin, and the like, and plastics made of water-insoluble material typified by glass and the like.
  • Test tubes, tubes, tubes, etc. which have an internal volume, beads, poles, filters, membranes, etc .; (2) cellulose-based carriers, agarose-based carriers, polyacrylamide-based carriers, dextran-based carriers, polystyrene-based carriers, Insoluble carriers used in affinity mouth chromatography, such as polyvinyl alcohol-based carriers, polyamino acid-based carriers, or porous silica-based carriers, may be mentioned.
  • a labeled antibody refers to an antibody labeled with a labeling substance, and these labeled antibodies can be used for detecting or quantifying Coch 1 in contained in a body fluid present in the middle ear.
  • the labeling substance that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it can be detected by binding to the antibody by physical or chemical bonding or the like.
  • Specific examples of the labeling substance include an enzyme, a fluorescent substance, a phosphorescent luminescent substance, biotin, avidin, and a radioisotope.
  • peroxidase alkaline phosphatase, ⁇ -D-galactosidase
  • Enzymes such as gnorecos oxidase, gnorecos-1 6-phosphate dehydrogenase, alcohol dehydrogenase, malate dehydrogenase, penicillinase, catalase, apoglucose oxidase, perease, luciferase or aceti / recoline esterase; full O less Si Ni source thio Xia sulfonates, Fikobiri protein, rare earth metal chelates, Danshiruku port ride or tetramethyl loader Min fluorescent substance such as isothiocyanate Xia sulfonate, 3 H, 14 C, 125 I or 131 1 radioisotope such as Body, piotin, Avidin or chemical luminous materials and the like.
  • a known method such as a glutaraldehyde method, a maleimide method,
  • radioisotopes and fluorescent substances alone can produce a detectable signal
  • enzymes, chemiluminescent substances, biotin and avidin are detectable alone.
  • the inability to produce a useful signal results in further reaction with one or more other substances producing a detectable signal.
  • enzymes require at least a substrate, and various substrates may be used depending on the method for measuring enzyme activity (colorimetric, fluorescent, bioluminescent, or chemiluminescent, etc.). Used.
  • biotin at least avidin or enzyme-modified avidin is generally reacted. If necessary, various coloring substances depending on the substrate may be used.
  • the above-described anti-Coch1in antibody (including fragments thereof, labeled antibodies, immobilized antibodies, etc.) can be used as a reagent for detecting perilymph fistula.
  • the form of the reagent is not particularly limited, and may be solid or liquid (solution, suspension, etc.). In the case of a liquid, the reagent can be prepared by dissolving or suspending the antibody in an appropriate solvent (such as a buffer that can stably store the antibody).
  • the reagent kit of the present invention comprises a widespread antibody that detects at least the presence of Chop1 inn derived from perilymph in a sample, and is used for detecting the above-described perilymph fistula.
  • the perilymphatic fistula of the present invention can be detected simply and quickly when necessary, and the results can be used for discrimination from other diseases, determination of treatment strategy, and the like. it can.
  • the reagent kit of the present invention may have any configuration as long as it can perform the detection method of the present invention.
  • the kit contains at least an antibody for detecting the presence of Cochlin, an enzyme-labeled secondary antibody, and It can include a solid phase for adsorbing Coch 1 in in the sample, enzyme substrates, buffers such as diluents and washing solutions, and positive controls.
  • the reagent kit of the present invention includes at least an antibody for detecting the presence of Cochlin in a sample, and can be prepared by combining known reagents and the like which are known per se.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • DAB 3,3'-Diaminobenzidine
  • Hidden J Horse Radish Peroxidase
  • anti-LCCL antibodies antibodies that recognize only isoform p63
  • anti-p63 Z44 antibody antibodies that recognizes all isoforms
  • anti-p63Z44 / 40 antibody (Hereinafter, this may be referred to as "anti-p63Z44 / 40 antibody”.
  • the production of the antibody was outsourced to Takara Shuzo Co., Ltd.
  • the antigenic polypeptides used for the production of the three types of antibodies include human, mouse, and mouse Cochlin amino acids (J (NGG Robertson, Nature Genet.,
  • an antigen polypeptide for preparing anti-p63 / 44 antibody a polypeptide consisting of 15 amino acids present at the N-terminus of isoform p44 and common to isoforms p63 and p44 (sequence: No. 3, corresponding to amino acid numbers 137 to 151 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing). Furthermore, as an antigen polypeptide for producing anti-p63 / 44/40 antibody, a polypeptide consisting of a 19 amino acid sequence common to all isoforms present at the N-terminus of isoform P40 (SEQ ID NO: 4. SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (corresponding to amino acid numbers 163 to 181 of 1)).
  • each of the antigenic polypeptides was prepared by chemical synthesis, and bound to 2 mg of KLH (keyhole limpet 'hemocyanin) by the maleimide method via Cys (cysteine) to obtain an immunogen.
  • KLH keyhole limpet 'hemocyanin
  • Cys cyste
  • the antigen polypeptide for preparing the anti-P63Z44 antibody since the amino acid sequence does not contain cysteine, the antigen polypeptide for preparing the anti-P63Z44 antibody is used. Is a C-terminal, and an antigen polypeptide for preparing an anti-P63Z44Z40 antibody was used by synthesizing a polypeptide having a cysteine added to the N-terminal.
  • This immunogen was sensitized four times at a two-week interval to one rabbit, but after the third sensitization, titration by ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) was performed. A titer increase was confirmed.
  • 1 ml of antiserum was collected according to a known method, and the total amount of the obtained antiserum was purified by Protein A.
  • a peptide affinity column prepared by binding 80% of the antiserum purified by Protein A to 5 g of Sepharose activated with CNBr and 5 mg of the antigen polypeptide in advance. For further purification. Each operation was performed in accordance with a commonly used method known per se.
  • the specificity of the antibody prepared in the above (2) was confirmed by Western blotting using an inner ear protein solution (positive control) prepared from the inner ear tissue of the mouse as an antigen.
  • an inner ear protein solution positive control
  • lml of protein extract Complete mini Ca (-) (Boehringer Mannheim)
  • l tab in ice was added.
  • Distilled water was added to 1M Tris-HCl (pH 6.8) 18.75 ml, 2-mercaptoethanl 15 ml, glycerol 30 ml, 10% SDS 6.9 ml, 0.1% bromophenol blue 3 ml to make a total of 100 ml.
  • the final concentration is 0.188M Tris buffer, 2.39mM SDS.
  • Tris Base 15 g / l, Glycine 72 g / l, and SDS 5 g / l were dissolved in MilliQ (MILLIPORE) water to prepare a 5-fold concentrated solution for stocks. This was diluted at the time of use and used at a final concentration of 25 mM Tris, 192 mM Glycine, SDS lg / 1 (pH 8.3).
  • Dry milk (snow milk made by Snow Brand) was dissolved in 0.2% Tween in PBS (pH 7.4) to a final concentration of 5%.
  • Dry milk (Sukimushi / Skimmi) was dissolved in 0.1% Tween in PBS (pH 7.4) to a final concentration of 1%.
  • the DAB solution was prepared and used at the time of use. DAB 10 mg; was dissolved in (10mg tablet. Cat No. 049-22831 ( Wako Co., Ltd.)) a 20ml of 50mM Tris Buffer (. PH7 6) , a 30% H 2 0 2 20 ⁇ 1 was added Caro. This was used after being filtered with a 0.45 ⁇ filter (MILLIPORE).
  • the samples used were human, pelvic, and guinea pig inner ear tissues and perilymph. For human samples, patients should be informed about the collection and use for research purposes. Used after consent was obtained and consent was obtained.
  • the inner ear tissue extract was weighed from the human inner ear labyrinth collected during surgery for acoustic nerve tumor, and 1 ml of protein extract (Complete mini Ca (-) (Boehringer Mannheim)) for 180 mg tissue volume 1 tab was dissolved in 10 ml PBS, 0.5 SDS (PH7.4)), and the remaining tissue could not be visually observed using a Lab Tube Mixer and Disposal Stirrer (GHI).
  • GPI Lab Tube Mixer and Disposal Stirrer
  • the mixture was centrifuged at 100 g for 15 minutes, and the resulting supernatant was used as an inner ear protein solution. This was used for electrophoresis at 2 ⁇ ⁇ and 0.5 ⁇ .
  • the perilymph was drilled in the cochlea's basal rotational perilymph cavity during a cochlear implant surgery, and the perilymph leaked during electrode insertion was collected and 21 of these were electrophoresed.
  • the extract of the guinea pig inner ear tissue was prepared by extracting 1 ml of protein extract (Complete Mini a) from ice against 180 mg of the inner ear membrane maze collected from the Hartley guinea pig temporal bone (purchased from Sankyo Lab Service Co., Ltd.). -) (Boehrmger MannheimfiM) 1 tab dissolved in 10 ml PBS, 0.5% SDS (pH 7.4)) was added, and the mixture was visually observed using a Lab Tube Mixer and Disposal Stirrer (GHI). After homogenizing until no residual tissue could be confirmed, the mixture was centrifuged at 1000 g for 15 minutes, and the resulting supernatant was used as an inner ear protein solution. This was used at 0.5 ⁇ l. For the perilymph, the eardrum was excised and reached the middle ear. The stapes were removed and the perilymph was collected from the oval window. Of these, 21 were used.
  • sample buffer prepared in the above (1) For a sample volume of 200, 85 and 2-mercaptoethanl were mixed with the sample buffer prepared in the above (1) at a ratio of 15 and dissolved. After incubating each prepared sample solution at 95 ° C for 3 minutes, it was cooled to room temperature, centrifuged at 3000 rpm for 10 seconds, and 15 ⁇ l of each was taken for electrophoresis.
  • the nitrocell membrane was immersed in Ponzo-stain solution for 5 minutes, and then decolorized with MilliQ water to confirm that the protein in each sample solution was stained. After confirmation, decolorization was performed while shaking in distilled water for 5 minutes.
  • the three nitrocellulose membranes were immersed in a blocking buffer at 4 ° C for 24 hours to block non-specific reactions. This was washed three times with a washing buffer for 5 minutes, and reacted with the primary antibody prepared in 1 above.
  • the primary antibody the anti-LCCL antibody was diluted 1000-fold with the antibody dilution buffer, and the anti-p63 / 44 antibody and the anti-p63Z44Z40 antibody were diluted 500-fold with the same buffer, and added to each nitrocellulose membrane. . The reaction was performed for 2 hours with shaking.
  • the obtained membrane after the reaction was washed three times with the above-mentioned washing buffer for 15 minutes, and then reacted with the secondary antibody.
  • a secondary antibody a goat-derived anti rabbit IgG antibody (HRP-labeled; Cat. No. p-0448 (manufactured by Dako)) diluted 1000-fold with the antibody dilution buffer was used. Allowed to react for hours. This was washed three times with the washing krffer for 15 minutes, and reacted with the DAB solution prepared in the above (1) to develop color. The reaction was stopped by immersion in distilled water.
  • FIG. 1 shows the results of each analysis.
  • middle ear lavage fluid collected from a patient with suspected perilymph fistula who developed acute sensorineural hearing loss.
  • Middle ear lavage fluid obtained from patients with Meniere's disease was used as the disease to be distinguished from perilymphatic fistula.
  • cochlear implant surgery Abumi Perilymph leaked from the inner ear of each patient with bone surgery, lateral semicircular canal fistula, and trauma was used as a sample. Each sample was fully explained to the patient about its use for collection and research purposes and was used after consent was obtained.
  • CSF was tested for meningitis and encephalitis, and a portion of the CSF from patients with normal results was used.
  • Serum used was venous blood of a healthy person. Saliva was collected from healthy subjects.
  • the middle ear wash containing exudate from otitis media with effusion, the middle ear wash containing otorrhea from chronic otitis media, and the middle ear wash from a patient with Meniere's disease each use a small incision in the patient's eardrum and use a syringe. After injecting a small amount of physiological saline, this was collected again by syringe and collected.
  • the middle ear lavage fluid of a patient suspected of having perilymphatic fistula was collected when an open tympanic surgery was performed.
  • the middle ear lavage fluid before perilymphatic fistula operation was collected from the eardrum using a syringe in the same manner as when collecting the middle ear lavage fluid from patients with Meniere's disease without opening the tympanic cavity. .
  • the collection of perilymph leaked from the inner ear of patients with various injuries was performed as follows. First, the perilymph of cochlear implant patients was drilled in the cochlear perilymphatic cavity during drilling of the cochlear implant surgery, and the perilymph that leaked when the electrode was inserted was collected. The perilymph of a patient who underwent stapes surgery for otosclerosis recovered the perilymph that leaked when a stapes bottom plate (oval window) was opened and a prosthetic ossicle was introduced. . As for the middle ear washing solution before the stapes surgery operation, the middle ear was washed with physiological saline before making a hole in the stapes bone, and the washing solution was collected.
  • the perilymph of a patient with an outer semicircular canal fistula was washed with saline to remove the hole in the outer semicircular canal protuberance of the middle ear and the surrounding area when a total external auditory canal extirpation operation was performed to remove external auditory canal cancer. Then, the washing solution was recovered.
  • perilymph of trauma patients perilymph (traumatic temporal bone fracture bloody middle ear effusion) leaked due to inner ear fracture due to trauma was collected.
  • the perilymph of ⁇ e inner ear surgery patients those which were diluted 5-fold, 50-fold, and 500-fold, respectively, were further prepared and used in the same manner.
  • Example 2 Each of these samples, and the perilymph and inner ear protein solutions (positive control) used in Example 2 above were sampled as shown in Table 1 below, and the volume was determined.
  • the sample buffer prepared in (1) above was mixed with 85 and 2-mercaptoethanl at a ratio of 15 and dissolved. After incubating each prepared sample solution at 95 ° C for 3 minutes, it was cooled to room temperature, centrifuged at 3000 rpm for 10 seconds, and 15 ⁇ l of each was taken for electrophoresis.
  • Each sample solution prepared in the above (2) was applied to a 15% polyacrylamide gel (Lady Gel J; length 73 mm ⁇ width 80 mmcm ⁇ thickness lmm (manufactured by Bio-Rad)), and electrophoresis apparatus (manufactured by Bio-Rad) And electrophoresed using the running buffer prepared in (1) above. Electrophoresis was performed at 27 mA [per gel] for 60 minutes.
  • the gel electrophoresed in (3) above is transferred to a nitrocellulose membrane (0.45 ⁇ m; 100 V) for 90 minutes using the transfer buffer prepared in (1).
  • the nitrocellulose membrane was immersed in Ponzo monostaining solution for 5 minutes, then decolorized with MilliQ water, and the appearance of the protein in each sample solution was confirmed. After confirmation, decolorization was performed while shaking in distilled water for 5 minutes.
  • nitrocellulose membrane after transfer was immersed in a blocking buffer at 4 ° C for 24 hours to block non-specific reactions. This was washed three times with a washing buffer for 5 minutes and reacted with the primary antibody.
  • a primary antibody an anti-LCCL antibody was diluted 1000-fold with an antibody dilution buffer, and added to a ditrosenololose membrane. The reaction was performed for 2 hours with shaking.
  • a goat-derived anti rabbit IgG antibody (HRP label) (manufactured by Dako; Cat. No. # p-0448) diluted 1000-fold with the antibody dilution buffer was used. The reaction was continued for 1 hour. This was washed three times with the above wash buffer for 15 minutes, and then subjected to chemiluminescence using a chemiluminescence kit (ECL plus; manufactured by Amersham Pharmacia Biotech), and the generated signal was transferred to a film (Kodak Scientific). Imaging Film; Cat. No. # 165-1454 (Kodak)). The exposure time of the film was determined by blotting the samples of Well Nos. 1 to 12 in Table 1 About 2 min.
  • HRP label goat-derived anti rabbit IgG antibody
  • the time for the two-port cellulose membrane was 1 hour.
  • the difference between the exposure times was determined by performing two experiments, one for 10 seconds exposure and one hour exposure. Compared. Fourth nitrocellulose membrane on which samples Nos. 37 to 48 were blotted, fifth nitrocellulose membrane on which samples Nos. 49 to 60 were blotted, and Well No. 61 The sixth nitrocellulose membrane on which the 72 samples were blotted was exposed for 5 minutes each.
  • FIGS. The results are shown in FIGS. In the figure, the numbers above the photographs indicate the well numbers in Table 1, and the lower numbers indicate the samples provided for the wells.
  • Fig. 2 is a nitrocellulose membrane of a profile obtained by blotting the samples of Well Nos. 1 to 12 in Table 1
  • Fig. 3 is a second nitrocellulose blot of the samples of Well Nos. 13 to 24.
  • Cellulose membrane Fig. 4 shows a third nitrocellulose membrane obtained by blotting samples of Well Nos. 25 to 36
  • Fig. 5 shows a fourth nitrocellulose blotted sample of Well Nos. 37 to 48. Trotrocellulose J3 Mo
  • Fig. 6 is the fifth nitrocellulose membrane plotting the samples of Well No. 49 to 60
  • FIG. 7 is the sixth blotting sample of Well No. 61 to 72.
  • 4 is a photograph showing the result of detection of a nitrocellulose membrane by a chemiluminescence method.
  • Table 1 shows the sample amount, well number, and results of electrophoresis of each sample.
  • CSF Human cerebrospinal fluid
  • the perilymph taken from humans can be detected even when diluted up to 50-fold.
  • the middle ear lavage fluid obtained from a patient suspected of having perilymph fistula 5 cases were positive and 3 cases were negative (29 in Fig. 4; 65, 66, 68 and 69 in Fig. 7 were positive; 30, 41 and 42 in Fig. 5 are negative).
  • Meniere's disease 21 in Fig. 3, 35, 36 in Fig. 4, 38, 39 in Fig. 5, 54, 55 in Fig. 6) ⁇ 57
  • Patients with otitis media with effusion 22 to 24 in Fig.
  • the 16 kDa protein is likely to be present in other body fluids that may be present in the human middle ear, namely, CSF, serum, saliva, middle ear lavage before stapes surgery, and middle ear effusion It was not detected in exudates, otorrhea of chronic otitis media, etc., nor was it detected in the middle ear washings of patients with Meniere's disease, and was detected only in human perilymph. It turned out to be very useful.
  • Example 1 three types of antibodies that recognize only isoform p63 were prepared separately from the anti-LCCL antibody. The production of the antibody was outsourced to Takara Shuzo Co., Ltd.
  • antigen polypeptide used for preparing three kinds of antibodies that recognize only isoform p63 examples include a polypeptide consisting of 21 amino acids corresponding to amino acid numbers 63 to 83 in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
  • SEQ ID NO: 5 Antibody produced as an antigen polypeptide may be hereinafter referred to as “anti-LCCL1 antibody”
  • anti-LCCL2 antibody a polypeptide consisting of 17 amino acids corresponding to amino acid numbers 95 to 111
  • anti-LCCL2 antibody an antibody prepared using this as an antigen polypeptide may be hereinafter referred to as "anti-LCCL2 antibody”
  • a polypeptide comprising an amino acid SEQ ID NO: 7 (an antibody prepared using the same as an antigen polypeptide may be hereinafter referred to as "anti-LCCL3 antibody”) was selected.
  • the amino acid sequence does not contain cystine
  • a polypeptide having a cysteine added to the C-terminus of each antigen-producing antigen polypeptide is used. This was synthesized and used.
  • the inner ear tissue and perilymph of the cypress were used.
  • As the inner ear tissue extract 0.3 M 1 prepared by the same method as in 1 (3) of Example 1 was used.
  • the external auditory canal of the temporal bone purchased from Tokyo Shibaura Organs Co., Ltd.
  • the eardrum was excised and reached the middle ear
  • the labial bone was removed and the perilymph was removed from the oval window.
  • 1 ⁇ l of the collected perilymph was used.
  • 2-mercaptoethanl was mixed at a ratio of 15 and dissolved.
  • Each of the prepared sample solutions was incubated at 95 ° C for 3 minutes, cooled to room temperature, centrifuged at 3000 rpm for 10 seconds, and 15 ⁇ l of each was taken for electrophoresis.
  • the nitrocellulose membrane was immersed in Ponzo-stain solution for 5 minutes, then decolorized with MilliQ water, and the appearance of the protein in each sample solution was confirmed.
  • the nitrocellulose membrane was immersed in a blocking buffer at 4 ° C for 24 hours to block non-specific reactions. This was washed three times with a washing buffer for 5 minutes.
  • anti-LCCL antibody, anti-LCCL1, anti-LCCL2 antibody and anti-LCCL3 antibody were all diluted 1000-fold with an antibody dilution buffer and added to a nitrocellulose membrane. The reaction was performed for 2 hours with shaking.
  • Fig. 8 shows the results of analyzing the lanes cut into strips by arranging them in the antibody order in the perilymph and the inner ear.
  • the anti-LCCL1, anti-LCCL2, and anti-LCCL3 antibodies also detected a 16-kDa protein that was present only in the perilymph. Was done. For the examination, an anti-LCCL3 antibody was used.
  • the samples used were a middle ear lavage fluid obtained from a patient with Meniere's disease, a perilymph sample leaked from the inner ear of a patient undergoing cochlear implant surgery and stapes surgery, and a middle ear lavage fluid collected from a patient suspected of perilymphatic fistula. .
  • Each sample was fully explained to the patient about its use for collection and research purposes and was used after obtaining consent.
  • Example 1 (3) (2) The sample used was a force that was collected in the same manner as in Example 1 (3) (2) or a sample that was collected in Example 1 (3) (2). All the preparation methods were performed in the same manner as in Example 1 (3) (2).
  • FIG. 9 shows the blots of the wells No. 73-83 in Table 2.
  • 4 is a photograph showing the results of detection of a nitrocellulose membrane by a chemiluminescence method.
  • Table 2 shows the sample amount, well No., and results of electrophoresis for each sample. For comparison, for the samples collected from the same patient as the samples used for the anti-LCCL antibody, the test results for the anti-LCCL antibody are also described.
  • 2D-GE isoelectric focusing gel electrophoresis in the first dimension
  • SDS-PAGE polyacrylamide gel electrophoresis
  • one-dimensional SDS-PAGE alone can be used to separate multiple proteins that cannot be separated due to their close molecular weights, or the delicate nature of proteins that are affected by various factors such as phosphorylation, addition of sugar chains, and amino acid substitution. And analyze changes.
  • 2D-GE, plotting, and staining with an anti-LCCL antibody and an anti-LCCL3 antibody were performed by the methods described in detail below.
  • sample additive solution (7 16 urea, 2 ⁇ thiourea, 2 ° /. Triton X-100, 2% Pharmalyte, 40 mM DTT, protease inhibitor) to one volume (approximately 16 ⁇ l) of the sample ( ⁇ perilymph).
  • sample additive solution 7 16 urea, 2 ⁇ thiourea, 2 ° /. Triton X-100, 2% Pharmalyte, 40 mM DTT, protease inhibitor
  • IPG gel (purchased in dry state) was ⁇ -perfected with about 10 ml of swelling solution (7 M urea, 2 M thiourea, 2% Triton X-100, 2% Pharmalyte N 40 mM DTT) and used for the first dimension migration. .
  • the electrophoresis was performed using an electrophoresis apparatus (Multiphorll) manufactured by Amersham Biosciences, Inc., and 120 ⁇ l of the sample solution was swollen with a force t! Applied to the sample forceps provided on the anode side.
  • the electrophoresis was performed at 300 V for 60 seconds, then gradually increased from 300 V to 3500 V in 90 minutes, and further performed at 3500 V for 18 hours. During the run, the instrument was cooled to 15 ° C.
  • the IPG gel was washed with equilibration solution (7 M urea, 25% glycerol, 50 mM Tris-HC1 buffer (pH 6.8), 2% SDS, 33 mM DTT, 1.6 % Bromophenol buffer) for 30 minutes, and this is subjected to second-dimensional SDS-polyacrylamide electrophoresis.
  • equilibration solution 7 M urea, 25% glycerol, 50 mM Tris-HC1 buffer (pH 6.8), 2% SDS, 33 mM DTT, 1.6 % Bromophenol buffer
  • SDS-PAGE As the SDS-PAGE gel, one having a size of 24 ⁇ 24 ⁇ 0.1 cm was used. The polyacrylamide concentration of the gel for concentration of this gel is 3%, the gel for separation is 15%, and the other gel composition is the same as general SDS-PAGE conditions. Also swimming As a working slow buffer solution, a solution having a composition of 25 mM Tris, 192 mM glycine, and 0.1% SDS was used. Electrophoresis was performed at 50 mA in the concentrated gel and 70 mA in the separation gel.
  • the gel was equilibrated with a blocking buffer (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.05% SDS, 10 ° /. Methanol) for 30 minutes. It was transferred to a PVDF membrane (Applied Biosystems: Pro-Blot) using Nippon Aid One Co., Ltd .: NA-1515B).
  • a blocking buffer 25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.05% SDS, 10 ° /. Methanol
  • the primary antibody solution a solution prepared by diluting the anti-LCCL antibody (6 ⁇ l) prepared in Example 1 with a diluent (1% skim milk, Tween 20, PBS, 6 ml) 1000-fold was used.
  • the primary antibody solution was added to the membrane that had been washed in advance, and the mixture was shaken at room temperature for 2 hours to react. Then, the membrane was washed three times with a washing solution for 15 minutes.
  • an anti-rabbit IgG-HRP conjugate (manufactured by Chappel, 2.41) diluted 2500-fold with the diluent was used.
  • This secondary antibody solution was added to the washed membrane, shaken at room temperature for 1 hour to react, and then washed three times with a washing solution for 15 minutes. Antibody recognition spots were detected on the washed membrane using an ECL kit manufactured by Amersham Biosciences.
  • the membrane that was detected by the ECL kit in 4 above was applied to the stripping solution (100mM 2- Immerse in mercaptoethanol, 2% SDS, 62.5 mM Tris-HCl buffer (pH 6.8)), shake for 30 minutes in a 50 ° C incubator, and strip the anti-LCCL antibody. .
  • the protein was detected in the same pattern as that obtained in 4 above.
  • the pattern of the detected protein spots was the same, so that the anti-LCCL antibody prepared in Example 1 above and the anti-LCCL antibody prepared in Example 2 above were used. It was confirmed that the same protein was detected with the prepared anti-LCCL3 antibody. In other words, this indicates that the anti-LCCL antibody and the anti-LCCL3 antibody are antibodies that can be equally used in the method for detecting perilymph fistula of the present invention.
  • the antigen polypeptide used for preparing the anti-LCCL antibody is a peptide represented by amino acid number 36 to 50 of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing
  • the antigen polypeptide used for preparing the anti-LCCL3 antibody is Since the peptide is represented by amino acid numbers 114 to 127, the protein of about 16 kD detected in the perilymph in the above Examples 1 to 2 is represented by amino acid numbers 36 to 127 of SEQ ID NO: 1. It was confirmed that the protein was a protein consisting of an N-terminal fragment of Coch 1 in and containing almost the same amino acid sequence.
  • the method for detecting an extralymphatic fistula of the present invention is not limited to the anti-LCCL antibody, anti-LCCL1 antibody, anti-LCC2 antibody, and anti-LCCL3 antibody prepared in this example, but may include the amino acid number of SEQ ID NO: 1. It has been found that any antibody that recognizes an antigenic determinant contained in the amino acid sequence represented by 36 to 12a can be arbitrarily prepared and selected with an excellent antibody titer.
  • a physiological tissue adhesive Beriplast 1 ⁇ Aventice Pharma Co., Ltd.
  • perilymphatic fistula is the only disease of acute sensorineural hearing loss for which hearing can be expected to recover by surgery, and the cure rate increases with early treatment. Therefore, the results of the method of the present invention, the results of the conventional method, and the presence / absence of hearing recovery by fistula closure were compared for these eight patients. As described above, patients suspected of having perilymphatic fistula are those who have given sufficient consent and provided consent to sample collection and their use for research purposes.
  • a hearing test was performed using an audiometer (Rion M-75 or M-75N) in accordance with the hearing test method specified by the Japanese Society of Audiology, 250 Hz, 500 Hz, Evaluation was carried out using the average value of the singing sounds at five frequencies of 1000 Hz, 2000 Hz and 4000 Hz. According to the Ministry of Health, Labor and Welfare Acute Hearing Loss Investigation Research Group's seminal criteria for hearing recovery, healing was performed when the test value recovered to the same level as before or after the operation in healthy ears or before the onset.
  • hearing loss can be improved by surgery if the invasion of the tissue takes a long time from onset to surgery, if the invasion of the tissue progresses, if the symptoms are severe, elderly, or if there are complications. I can't see it.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Non-Biological Materials By The Use Of Chemical Means (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Fluid Adsorption Or Reactions (AREA)

Abstract

　本発明の目的は、簡便、確実で、かつ患者への侵襲度の低い外リンパ瘻の検出方法を提供することである。本発明によれば、中耳に存在する体液中のＣｏｃｈｌｉｎの存在を検出することを含む、外リンパ瘻の検出方法が提供される。

Description

' 明細書
外リンパ瘻の検出方法
技術分野
本発明は外リンパ瘻の検出方法、 それに用いる抗体、 試薬、 及びキットに関す る。 背景技術
外リンパ瘻（Perilymph fistula)は、内耳組織に存在する外リンパが内耳窓（正 円窓、 卵円窓のいずれかまたは両者） あるいは fissura ante fenestram (内耳と 中耳の間の骨裂隙） から鼓室内 （中耳） に漏出して聴覚 ·平衡感覚の障害を生じ る疾患であり、 発生原因としては、 先天性奇形、 梅毒、 アブミ骨手術、 頭部外傷
(圧外傷を含む） 、 特発性 （原因不明） 等が考えられている。 例えば、 鼻かみ、 くしゃみ、 咳、 力み、 潜水、 登山、 外傷等のような、 日常生活において通常行わ れ得る行動によって生じる髄液圧や内耳圧の急激な変化によっても引き起こされ ることが知られており、 急性感音難聴や、 めまい，平衡障害の一部を占める疾患 となっている。
しかしこの外リンパ瘻の診断は、従来、診断基準（浅野ら著「耳展」 34, 4 ; 1991 年： p. 411 425) に従って生理学的所見、症状、病歴等を総合的に検証する方法に より行われているために不確定な場合が多く、 また、 確定診断として選択される 鼓室開放術は患者への侵襲度が問題となっていた。 さらには、 鼓室開放術を行つ ても目視により外リンパの漏出が確認できず、 確定診断がなされないケースも多 数存在していた。
一方、 突発性難聴とは、 急性感音難聴のうち原因を明確に特定できないもので あって、 急性感音難聴の中で最も高い割合を占めている疾患である。 しかし、 こ の突発性難聴の患者に試験的鼓室開放術を行つた結果、 1 1例中 8例に外リンパ 瘻が認められたことが報告されている （吉岡邦英著 「耳鼻咽喉科展望」 Vol. 26, Suppl. 6； 1983年： p. 517-539) 。 また、 急性感音難聴の一つであり、 現代 社会において増加傾向にある症候群として知られるメニエール病の中にも、 かね てより外リンパ瘻患者が含まれていることが示されている。 実際に多数のメニェ ール病患者を解析した結果を元にメ二エール病と診断された患者の中にも外リン パ瘻患者が含まれていることを示し、 鑑別診断の必要性について述べた報告もあ る（D. C. Fitzgerald著「Ann. Otol. Rhinol. Laryngol.」 110； 2001年： p. 430-436)。 これらのことは、 前記診断基準に合致しない症例の中にも外リンパ瘻が含まれて いることを示している。 し力 し、 外リンパ瘻の確定診断の方法が確立されていな いことから、 臨床現場においては未だ実質的な鑑別は難しいのが実状であり、 こ れらの問題は解決されていない。 外リンパ瘻は、 急性感音難聴の中でも手術によ り聴覚 ·平衡覚障害の改善が期待できる唯一の疾患である上、 迅速な治療が治癒 率を左右することから、 簡便、 確実で、 力 患者への侵襲度の低い診断方法の開 発が強く望まれている。
今日までに、 外リンパ瘻の診断に用い得るマーカーを探索して ApoD及び ApoJを 指標として用いることを提案した報告 （Thalmann et al. , 著 [Otolaryngology - Head and Neck SurgeryJ 111, 3， 1； 1994年： p. 273-280)、 GMl (monosialoganglioside 1) を指標にして外リンパ瘻診断を試みた報告（神崎仁ら著「厚生労働省特定疾患 対策研究事業 ·急性高度感音難聴に関する調査研究班 ·平成 1 1年度報告書」 ； 2000年： ρ· 41-43) 、 Prostagrandin D synthaseを指標として用いることを提案し た報告 (G. Bachmann, et al.著「J. Laryngol. otol. J 115； 2001年： p. 132-135) 、 Transferrinを指標にして外リンパ瘻診断を試みた報告 （Rauch S. D.著
「Laryngoscope」 110 ( 4 ) ； 2000年： p. 545- 552) 等があるものの、 いずれも臨 床的に用い得るようなものではなかった。 - 一方、 C0CHは、非症候性遺伝性難聴 DFNA9の原因遺伝子として同定された遺伝子 であり、 該遺伝子によりコードされる C0CH蛋白質は C o c h 1 i nと命名されて いる （N. G. Robert son著 「Narure Genet. J 20； 1998年： p. 299- 303；および NCBI 0MIM ホームぺ―ン ； http : //www. ncbi. nlm. nih. gov/) 。 本発明者らは、 この C o c h 1 i nがヒトの難聴において重要な蛋白質である ことに着目してゥシ内耳組織における C o c h 1 i nのプロテオーム解析を行い、 C o c 1 i n力^つの異なる N末端を持ち、 それぞれ 63 k Da、 44kDa, 及ぴ 40kDa の分子量を有する 3種類のァイソフォーム p63、 p44、 及び p40として存在している ことを明らかにしている。 また、 N末端には LCCL (Trexler et al.著
「Eur. J. Biochem. J 267； 2000年： p. 5751-5757) と呼ばれるモジュールがあり、 これまでに見つかつている DFNA9に関わる突然変異は全てこのモジュール内に存 在し、かつアイソフォーム p63のみに含まれており、他のアイソフォームには存在 しないこと等を報告している （Ikezono et al.著 「Biochem. Biophys. Acta」 1535 (3) ； 2001年： p. 258- 265) 。 し力 し、 上記の報告はゥシ内耳組織の二次元ゲ ル電気泳動法（2D- GE) によるプロテオーム解析を行ったものにすぎず、 C o c h 1 i nの臨床的意義等については十分な検討がなされていなかった。
また、 N. G. Robertsonらは、 C o c h 1 i nに対する抗体を作製して内耳組織の 免疫組織染色等を行い、 内耳組織における C o c h 1 i nの発現について解析し ている （N. G. Robert son著 「Hum. Mo 1. Genet.」 10 (22) ； 2001年： p. 2493- 2500) 。 しかし、 この報告も、 内耳組織における蛋白質の局在化等の解析を行っているに すぎず、 外リンパ中の C o c h 1 i riの存在についての知見はなかった。 発明の開示 ·
本発明は、 簡便、 確実で、 かつ患者への侵襲度の低い外リンパ瘻の検出方法を 提供することを解決すべき課題とした。 本発明はさらに、 上記した本発明の検出 方法で用いるための抗体、 試薬及びキットを提供することを解決すべき課題とし た。
本発明者らは、 上記課題を達成するために鋭意検討を進めた結果、 外リンパ瘻 に罹患していることが疑われる患者の中耳に存在する体液を試料とし、 該試料中 の C o c h 1 i nの存在を指標にすることにより外リンパ瘻が検出できることを 見出した。 本発明はこれらの知見に基づいて成し遂げられたものである。 すなわち本発明によれば、 以下の発明が提供される。
(1) 中耳に存在する体液中の C o c h 1 i nの存在を検出することを含む、 外リンパ瘻の検出方法。
(2) 外リンパ瘻に罹患していることが疑われる患者の中耳に存在する体液中 の C o c h 1 i nの存在を検出し、 検出された C o c h 1 i nの存在を外リンパ 瘻の可能性の指標とする、 （1) に記載の方法。
(3) C o c h 1 i nの存在の検出が、 C o c h 1 i nの N末端フラグメント よりなる蛋白質の存在を検出することにより行われる、 （1) または （2) に記 載の方法。
(4) C o c h 1 i nの存在の検出が、 免疫学的方法により行われる、 （1) から （3) の何れかに記載の方法。
(5) 免疫学的方法が、 抗 C o c h 1 i n N末端フラグメント抗体を用いて 行われる、 （4) に記載の方法。
( 6 ) 免疫学的方法が、配列表の配列番号： 1のァミノ酸番号 36〜127で表され るアミノ酸配列中に含まれる抗原決定基を認識する抗体を用いて行われる、 （4) または （5) に記載の方法。
(7) 免疫学的方法が、 配列表の配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 6 または配列番号： 7に記載のァミノ酸配列で表されるポリぺプチドに含まれる抗 原決定基を認識することを特徴とする抗 C o c h 1 i n N末端フラグメント抗 体を用いて行われる、 （4) から （6) の何れかに記載の方法。
(8) 配列表の配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 6または配列番号： 7に記載のアミノ酸配列で表されるポリべプチドに含まれる抗原決定基を認識す ることを特徴とする抗 Co c h 1 i n N末端フラグメント抗体。
(9) 抗 C o c h l i n抗体から成る外リンパ瘻検出用試薬。
(10) 抗 C o c h 1 i n抗体が抗 C o c h 1 i n N末端フラグメント抗体 である、 （9) に記載の外リンパ瘻検出用試薬。
(1 1) 抗 C o c h 1 i n抗体が配列表の配列番号： 1のァミノ酸番号 36〜127 で表されるァミノ酸配列中に含まれる抗原決定基を認識する抗体である、 （ 9 ) または （1 0 ) に記載の外リンパ瘻検出用試薬。
( 1 2 ) 抗 C o c h 1 i n抗体が配列表の配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列 番号： 6または配列番号： 7に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドに含 まれる抗原決定基を認識することを特徴とする抗 C o c h 1 i n N末端フラグ メント抗体である、 （9 ) から （1 1 ) のいずれかに記載の外リンパ瘻検出用試
( 1 3 ) ( 9 ) から （1 2 ) の何れかに記載の外リンパ瘻検出用試薬を含む、 外リンパ瘻検出用試薬キット。 図面の簡単な説明
図 1は、 ヒ ト、 ゥシ、 モルモッ トの内耳組織抽出液及ぴ外リンパを、抗 p63/44 ノ40抗体、 抗 p63Z44抗体、 及び抗 LCCL抗体の 3種類の抗体を用いてウェスタンブ 口ット法により解析した結果を示す。
図 2は、 ヒト由来の各種試料を、 抗 LCCL抗体を用いてウェスタンブロット法に より解析した結果を示す。 図中、 1〜1 2のゥヱル番号は、 表 1に記載の各ゥェ ル番号に対応し、 写真の下の記載はそのゥエルに供された試料を示す。 各試料名 の下の記載は、 「十」 は 16kDaの蛋白質が検出されたことを示し、 「一」 は検出さ れなかったことを示す。
図 3は、 ヒト由来の各種試料を、 抗 LCCL抗体を用いてウェスタンブロット法に より解析した結果を示す。 図中、 1 3〜2 4のゥヱル番号は、 表 1に記載の各ゥ エル番号に対応し、 写真の下の記载はそのゥエルに供された試料を示す。 各試料 名の下の記載は、 「 +」 は 16kDaの蛋白質が検出されたことを示し、 「一」 は検出 されなかったことを示す。
図 4は、 ヒ ト由来の各種試料を、 抗 LCCL抗体を用いてウェスタンプロット法に より解析した結果を示す。 図中、 2 5〜3.6のゥエル番号は、 表 1に記載の各ゥ エル番号に対応し、 写真の下の記載はそのゥエルに供された試料を示す。 各試料 名の下の記載は、 「十」 は 16kDaの蛋白質が検出されたことを示し、 「一」 は検出 されなかったことを示す。上の写真は化学発光法による検出の際に 1時間フィルム に感光させた場合の結果を示し、 下の写真は同じニトロセルロース膜を 10秒間感 光させた場合の結果を示す。
図 5は、 ヒト由来の各種試料を、 抗 LCCL抗体を用いてウェスタンブロット法に より解析した結果を示す。 図中、 3 7〜4 8のゥ ル番号は、 表 1に記載の各ゥ エル番号に対応し、 写真の下の記載はそのゥエルに供された試料を示す。 各試料 名の下の記載は、 「十」 は 16kDaの蛋白質が検出されたことを示し、 「一」 は検出 されなかったことを示す。 「土」 は判別不能だったことを示す。
図 6は、 ヒト由来の各種試料を、 抗 LCCL抗体を用いてウェスタンプロット法に より解析した結果を示す。 図中、 4 9〜6 0のゥ ル番号は、 表 1に記載の各ゥ エル番号に対応し、 写真の下の記載はそのゥエルに供された試料を示す。 各試料 名の下の記載は、 「十」 は 16kDaの蛋白質が検出されたことを示し、 「一」 は検出 されなかったことを示す。
図 7は、 ヒト由来の各種試料を、 抗 LCCL抗体を用いてウェスタンブロット法に より解析した結果を示す。 図中、 6 1〜7 2のゥエル番号は、 表 1に記載の各ゥ エル番号に対応し、 写真の下の記載はそのゥエルに供された試料を示す。 各試料 名の下の記載は、 「十」 は 16kDaの蛋白質が検出されたことを示し、 「一」 は検出 されなかったことを示す。 .
図 8は、ゥシ外リンパ及び内耳組織抽出液を、抗 LCCL抗体、抗 LCCL1抗体、抗 LCCL2 抗体、抗 LCCL3抗体の 4種類の抗体を用いてウェスタンプロット法により解析した 結果を示す。
図 9は、 ヒト由来の各種試料を、抗 LCCL3抗体を用いてウェスタンブロット法に より解析した結果を示す。下の図は上の図の 16kDa付近の解像度をあげたものであ る。 図中、 7 3〜8 3のゥ ル番号は、 表 2に記載の各ゥエル番号に対応し、 写 真の下の記載はそのゥエルに供された試料を示す。各試料名の下の記載は、 「 +」 は 16kDaの蛋白質が検出されたことを示し、 「一」は検出されなかつたことを示す。 図 1 0は、 本発明の抗体を作製するための抗原ポリペプチドの、 配列番号： 1 に記載のァミノ酸配列上の位置関係を示す。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の形態について更に詳細に説明する。
本明細書において、 蛋白質の精製及び解析、 並びに抗体の作製等の手法は、 特 に明記しない限り、 新生化学実験講座 （日本生化学会編；東京化学同人） 、
Antibodies - A Laboratory Manual (E. Harlow, et al. , Cold Spring Harbor Laboratory (1988) )等の一般的実験書に記載の方法またはそれに準じて行うこと ができる。
1 . 外リンパ瘻の検出方法
本発明において、 外リンパ瘻 （Perilymph fistula) とは、 内耳組織に存在する 外リンパが何らかの要因により内耳窓 （正円窓、 卵円窓のいずれかまたは両者） あるいは fissura ante fenestram (内耳と中耳の間の骨裂隙） から鼓室内 （中耳） に漏出して聴覚 ·平衡感覚の障害を生じる疾患である。 該疾患は、 外リンパが中 耳へ漏出していることを確認することにより検出することができる。 本発明の外 リンパ瘻の検出方法は、 該疾患に罹患していることが疑われる患者の中耳に存在 し得る体液のうち、 外リンパのみに存在する C o c h 1 i nの存在を検出して、 該患者が外リンパ瘻に罹患している可能性の指標とすることを特徴とする方法で ある。 本法によれば、 外リンパ瘻発症の要因や機構によらず検出を行うことがで きる。
C o c h 1 i nとは、非症候性遺伝性難聴 DFNA9の原因遺伝子として同定された 遺伝子 C0CHによりコードされる蛋白質である （N. G. Robertson, Nature Genet. , 20, 299-303 (1998) ) 。 該蛋白質は、 ヒト、 ゥシ、 モルモット、 ラット等の動物種 において、 3つの異なる Ν末端を持ち、 63 k Da、 44kDa、 及ぴ 40kDaの分子量を有す る 3種類のァイソフォーム p63、 p44、 p40として存在する （Ikezono et al. , Biochem. Biop ys. Acta, 1535, 3, 258-265 (2001) ) 。 本明細書において配列表の配 列番号： 1に承す C o c h 1 i nのァミノ酸配列は、 Nature Genet.，
20， 299-303 (1998)に記載されているヒト C o c h 1 i nのアミノ酸配列であり、 本明細書中でのアミノ酸番号は該配列におけるアミノ酸番号を用いる。 例えば、 ヒトにおいて最も大きな 63 k Daの分子量を有するァイソフォーム p63とは、該アミ ノ酸配列におけるアミノ酸番号 25〜550で表されるァミノ酸配列よりなる蛋白質 である。 アイソフォーム p44とは該アミノ酸配列におけるアミノ酸番号 133〜550 で表されるアミノ酸配列よりなる蛋白質であり、ァイソフォーム P40とはアミノ酸 番号 152〜550で表されるアミノ酸配列よりなる蛋白質である。 また、 該アミノ酸 配列においてァミノ酸番号 1〜 2 4で表される部分はシグナル配列である。
本発明において、 外リンパ瘻の可能性の指標として用いられる C o c h 1 i n としては、アイソフォーム p63の N末端のアミノ酸配列を含むフラグメント（以下、 これを「N末端フラグメント」 と称することがある） よりなる蛋白質が好ましく用 レヽられる。 該フラグメントとしては、 C o c h 1 i nのァイソフォーム p63の N末 端のアミノ酸配列を含むものであればいかなる大きさを有する蛋白質でもよいが、 例えば、配列番号： 1のアミノ酸番号 36〜127で表されるアミノ酸配列、さらには、 その中でも後逾する配列番号： 2、配列番号： 5、配列番号： 6または配列番号： 7に記載のァミノ酸配列で表されるポリぺプチドに含まれる抗原決定基を認識す ることを特徴とする抗 C o c h 1 i n N末端フラグメント抗体により認識され る約 16kDaの分子量を有する N末端フラグメント、 特には配列番号： 2及ぴ Zまた は配列番号： 7に記載のアミノ酸配列で表されるポリぺプチドに含まれる抗原決 定基を認識することを特徴とする抗体等により認識される約 16kDaの分子量を有 する N末端フラグメントが特に好ましい。 また、該フラグメントの他、 ヒ トの中耳 に存在し得る他の体液中には実質的に存在せず、 外リンパのみに存在するもので あれば、 配列表の配列番号： 1に記載のアミノ酸配列またはその部分配列を有す る蛋白質であればいかなるものでも用いることができる。 具体的には、 例えば、 アイソフォーム p63でもよいし、ァイソフォーム p44もしくは p40でもよく、それら のフラグメントよりなる蛋白質等でもよい。 本明細書中では、 上記のような蛋白 質を以下、 単に 「C o c h l i n」 と称することがある。 なお、 上記した C o c h 1 i nの 3つのアイソフォームおよび N末端フラグメントの分子量 （k D a ) は、 いずれも 2次元電気泳動法を用いて、 サイズマーカーを利用してキヤリブレ ーシヨンされ、 算出された値である。
本発明の検出方法に供せられる試料としては、 外リンパ瘻に罹患していること が疑われる患者の中耳に存在する体液が用いられる。 ヒトの中耳内に存在し得る 体液としては、 例えば、 外リンパ、 脳脊髄液 （Cerebro - Spinal Fluid；以下、 こ れを 「CSF」 と称することがある） 、 血液、 唾液、 中耳粘膜より産生される中耳粘 液等が挙げられる。例えば、 CSFは、手術等により内耳道の第 8脳神経の経路もし くは蝸牛小管を通って内耳に流入したものが中耳へ流入したり、 外傷、 骨折、 内 耳の奇形等によっても流入することが知られている。 血液は、 外傷による出血、 中耳粘膜からの出血等により中耳に存在し得る。 唾液は、 上咽頭に存在するもの が耳管から逆流することにより中耳に流入することが知られている。 また、 滲出 性中耳炎患者では中耳滲出液、 慢性中耳炎患者では耳漏 （膿） 等も存在し得る。 これらの体液を目視により判別することはできないが、 これらを採取して解析を 行い、 該試料中の C o c h l i nの存在を解析することにより、 試料として採取 された体 ί?夜が外リンパであるか否かを判別することができ、 外リンパ瘻の可能性 の指標とすることができる。
中耳内に存在する体液の採取方法としては、 できるだけ血液、 薬剤等を混入さ せず、 また、 他の蛋白質等を混入させずに採取できる方法であって、 患者への侵 襲度の低い方法であればいかなる方法でもよい。 例えば、 鼓膜を微小に切開し、 シリンジ等を挿入してそのまま該体液を吸引して採取してもよいし、 綿棒等を挿 入して存在する体液をぬぐい取ることにより採取してもよレ、。 採取されるべき体 液が極微量である場合には、 シリンジ等を用いて生理食塩水等の適当な溶液を適 量注入した後、 該溶液ごとシリンジ等で回収する方法が好ましく用いられる。 本 発明においては、 このような方法により回収された溶液を 「中耳洗浄液」 と称す る。 ここで用いられる溶液としては、 組成、 pH、 温度等において生理学的に許容 され、 患者に与える負担の少ない溶液が選択される。 また、 中耳は耳管を経由し て上咽頭、 中咽頭と通じていることから、 耳管を通じて上咽頭、 中咽頭に達した 中耳由来の体液を採取してもよい。 具体的には、 例えば、 口腔または鼻腔から綿 棒等を挿入し、 上咽頭もしくは中咽頭に存在する体液をぬぐい取ることにより採 取することができる。
かくして採取された体液は、採取後、直ちに解析に供されることが好ましいが、 4〜一 8 0 °C、 好ましくは一 2 0〜一 7 0 °C等の低温条件下で保存しておくこと もできる。 保存に際しては、 必要に応じて蛋白質の変性等を抑制するような保存 剤や、腐敗を防止するための防腐剤等を添加してもよレ、。また、これらの試料は、 必要に応じて濃縮、 精製等の前処理を行ってから解析に供してもよい。 これらの 具体的手法は、 それ自体公知の通常用いられる蛋白質の濃縮、 精製等の手法を用 いればよい。
上記したような方法により採取された外リンパ瘻に罹患していることが疑われ る患者の中耳に存在する体液において、 C o c h 1 i nの存在を検出するための 方法としては、 公知の蛋白質の検出 ·解析方法であればいかなる方法でも用いる ことができる。 具体的には、 C o c h 1 i nの存在の検出は、 免疫学的方法で行 つてもよいし、 非免疫学的方法 （液体クロマトグラフィー、 二次元電気泳動、 質 量分析、 及びこれらの組み合わせ等） で行ってもよい。 これらの中でも、 本発明 においては、前記 C o c h 1 i nまたはその部分ポリペプチドを認識する抗体（以 下、 これを 「抗 C o c h l i n抗体」 と称することがある） を用いた免疫学的方 法を用いることが好ましい。 免疫学的に蛋白質の検出を行う方法としては、 例え ば、 ウェスタンプロッティング法、 酵素免疫測定法 （ELISA法） 、 化学発光免疫測 定法、 蛍光抗体法、 放射免疫測定法、 ラテックス凝集法、 免疫比濁法、 免疫クロ マトグラフィ一法等のそれ自体公知の通常用いられる方法であればいかなる方法 でも用い得るが、 この中でも、 ウェスタンブロッテイング法、 ELISA法等が好まし く用いられる。 本発明の検出方法を、酵素免疫測定法 （ELISA法） 、 化学発光免疫測定法、 蛍光 抗体法、 または放射免疫測定法等の標識抗体を用いた免疫測定法により実施する 場合には、 サンドイッチ法または競合法により行うこともできる。 サンドイッチ 法の場合には固相化抗体及ぴ標識抗体のうち少なくとも 1種が、 抗 C o c h 1 i n抗体であればよレ、。
サンドィツチ法で用いる固相担体としては、 抗体を担持させるのに使用できる 不溶性担体であればよく、 例えば、 （1 ) ポリスチレン樹脂、 ポリカーボネート 樹脂、 シリコン樹脂あるいはナイロン樹脂等からなるプラスチックや、 ガラス等 に代表されるような水に不溶性の物質からなるプレート、 試験管若しくはチュー ブ等の内容積を有するもの、 ビーズ、 ボール、 フィルター、 あるいはメンブレン 等、 並びに （2 ) セルロース系担体、 ァガロース系担体、 ポリアクリルアミド系 担体、デキストラン系担体、ポリスチレン系担体、ポリビュルアルコール系担体、 ポリアミノ酸系担体あるレ、は多孔性シリ力系担体等のようなァフィ二ティーク口 マトグラフィ一に用いられる不溶性担体を挙げることができる。
測定の操作法は公知の方法 （例えば、 日本臨床病理学会編 「臨床病理臨時増刊 特集第 5 3号 臨床検査のためのィムノアツセィ一技術と応用一」 ， 臨床病理刊行 会， 1 9 8 3年， 石川榮治ら編 「酵素免疫測定法」 ， 第 3版， 医学書院， 1 9 8 7年,北川常廣ら編 「蛋白質核酸酵素別冊 N o . 3 1 酵素免疫測定法」 ， 共立出 版， 1 9 8 7年） に準じて行うことができる。
例えば、 固相化抗体と試料を反応させ、 同時に標識抗体を反応させる力 \ また は洗浄の後に標識抗体を反応させて、 固相化抗体一抗原一標識抗体の複合体を形 成させる。 そして未結合の標識抗体を洗浄分離して、 結合標識抗体の量より試料 中の抗原量を測定することができる。 具体的には、 酵素免疫測定法 （E L I S A 法） の場合は標識酵素にその至適条件下で基質を反応させ、 その反応生成物の量 を光学的方法等により測定する。 蛍光免疫測定法の場合には蛍光物質標識による 蛍光強度を、 放射免疫測定法の場合には放射性物質標識による放射線量を測定す る。 化学発光免疫測定法の場合は発光反応系による発光量を測定する。 本発明の検出方法を、 ラテックス凝集反応、 または免疫比濁法等の場合のよう こ免疫複合体凝集物の生成を、 その透過光や散乱光を光学的方法により測るか、 目視的に測る測定法により実施する場合には、 溶媒としてリン酸緩衝液、 グリシ ン緩衝液、 トリス緩衝液またはグッド緩衝液等を用いることができ、 更にポリェ チレンダリコー/レ等の反応促進剤や非特異的反応抑制剤を含ませてもよい。
抗体を固相担体に担持させて用いる場合には、 固相担体としては、 ポリスチレ ン、 スチレン一ブタジエン共重合体、 （メタ） アクリル酸エステル類ポリマー、 ラテックス、 ゼラチン、 リボソーム、 マイクロカプセル、 赤血球、 シリカ、 アル ミナ、 カーボンブラック、 金属化合物、 金属、 セラミックスまたは磁性体等の材 質よりなる粒子を使用することができる。
この担持の方法としては、 物理的吸着法、 化学的結合法またはこれらの方法の 併用等の公知の方法を使うことができる。 測定の操作法は公知の方法により行う ことができるが、 例えば、 光学的方法により測定する場合には、 試料と抗体、 ま たは試料と固相担体に担持させた抗体を反応させ、 ェンドボイント法またはレー 卜法により、 透過光や散乱光を測定する。
また、 目視的に測定する場合には、 プレートやマイクロタイタープレート等の 容器中で、 試料と固相担体に担持させた抗体を反応させ、 凝集の状態を目視的に 半 U定する。 なお、 目視的に測定する代わりにマイクロプレートリーダー等の機器 を用いて測定を行ってもよい。
上記した方法を用いて患者の中耳内に存在する体液を試料とした解析を行い、 該試料中に C o c h 1 i nの存在が検出された場合に、 該患者が外リンパ瘻に罹 患している可能 1"生があると判定することができる。 また、 それ自体公知の通常用 レヽられる蛋白質の定量法によって定量を行い、 該体液における C o c h 1 i nの 存在量を求めることもできる。
2 . C o c h 1 i nを検出するための抗体及びそれを用いた試薬
上記したような免疫学的方法において用いられる抗体としては、 前記 C o c h 1 i nを認識するものであればいかなるものでも用い得る。 即ち、 本発明によれ ば、 抗 C o c h 1 i η抗体から成る外リンパ瘻検出用試薬が提供される。
抗 C o c h 1 i n抗体は、 例えば、 配列表の配列番号： 1に記載のアミノ酸配 列またはその部分配列を有するポリペプチド（以下、 これを 「抗原ポリペプチド」 と称することがある）を抗原として作製することができる。具体的には、例えば、 前記 N末端フラグメントよりなる蛋白質に特異的なアミノ酸配列を有する抗原ポ リペプチドに含まれる抗原決定基 （以下、 これを 「ェピトープ」 と称することが ある） を認識する抗体 （以下、 これを 「抗 C o c h 1 i n N末端フラグメント抗 体」 と称することがある） 等が好ましく用いられる。 さらには、 抗 C o c h l i n N末端フラグメント抗体の中でも、約 16kDaの分子量を有する N末端フラグメン トよりなる蛋白質に特異的な抗原ポリべプチドに含まれる抗原決定基を認識する 抗体が特に好ましく用いられる。より具体的には、このような抗体とは、例えば、 配列表の配列番号： 1のアミノ酸番号 36〜127で表されるアミノ酸配列中に含まれ る抗原決定基を認識する抗体である。
このような本発明の抗体は、 ヒトの中耳に存在し得る外リンパ以外の体液中に 含まれる他の蛋白質等と反応しない抗体であることが好ましいが、 C o c h l i nとの反応性が十分に高く、 外リンパと他の体液とを区別し得るものであれば用 いることができる。 具体的には、 例えば、 ウェスタンブロッテイング法を用いて 検出を行う場合には、 該抗体により検出されるバンドの位置等により、 C o c h 1 i 11由来のパンドと他の蛋白質由来のバンドとが明確に区別できるものであれ ばよい。
抗原ポリぺプチドとしては、 それ自体公知の方法に従って抗原性が高く抗原決 定基として適した配列を選択して用いればよい。例えば、 「Epitope Adviser」 （富 士通九州システムエンジニアリング社製） 等の市販のェピトープ解析ソフトを用 いて C o c h l i nのアミノ酸配列を解析し、 立体構造上露出していること、 疎 水性及び親水性、 構造の柔軟性、 極性等を総合的に予測してェピトープとなり易 い形状を有していると推定された配列を選択することができる。 また、 例えば、 多くの動物種において反応する抗体を作製する場合には、 目的の複数の動物種が 有する C o c h 1 i nのアミノ酸配列を適当な配列解析ソフト等でァライメント し、 各動物種に共通のアミノ酸配列の中から、 ェピトープとなり易い部分配列を 選択すればよい。 また、 ある特定の動物種が有する C o c h 1 i nに特異的に結 合する抗体を作製する場合には、 他の動物種が有する C o c h 1 i nのアミノ酸 配列とのホモロジ一が低い部分を選択すればよレ、。
また、 抗原ポリペプチドの長さは、 後述するような方法に従って該ポリべプチ ドを用いて免疫を行った際に、 免疫された動物において抗原として認識され得る ような長さを有していればいかなる長さでもよい。 具体的には、 例えば、 ァミノ 酸 5〜30残基、好ましくは 10〜25残基の長さのもの等が用いられる。 このような抗 原ポリべプチドは、 公知の方法に従って化学的に合成された合成ポリべプチドで も、 天然物から抽出 ·精製したものでもよい。
かくして選択される抗原ポリべプチドとしては、 配列表の配列番号： 1に記載 のアミノ酸配列またはその部分配列を有するポリぺプチドの中から、 外リンパに 存在する C o c h 1 i nが有するアミノ酸配列を含むものであれば任意に選択し て用いることができる。例えば、抗 C o c h 1 i n N末端フラグメント抗体を作 製するための抗原ポリペプチドとしては、前記 N末端フラグメントが有する抗原決 定基を少なくとも 1つ含むァミノ酸配列を有するポリぺプチドであれば、 いかな るものでも用い得るが、 具体的には、 例えば、 配列表の配列番号： 1のアミノ酸 番号 36〜127で表されるアミノ酸配列のうち、 少なくとも 1つの抗原決定基を含む アミノ酸配列を有するポリペプチドが好ましく用いられる。 より具体的には、 配 列表の配列番号： 1のアミノ酸番号 36〜50 (配列番号： 2 ) 、 63〜83 (配列番号： 5 ) 、 95〜111 (配列番号： 6 ) 、 114〜127 (配列番号： 7 ) で表されるポリぺプ チド等が好ましく用いられる。 その中でも、 アミノ酸番号 36〜50 (配列番号： 2 ) または 114〜127 (配列番号： 7 ) で表されるポリペプチドが特に好ましい。
また、 例えば、 ァイソフォーム p63、 p44、 p40の 3つのアイソフォームを全て認 識し得る抗体を作製するための抗原ポリペプチドとしては、 例えば、 配列表の配 列番号： 1のァミノ酸番号 163〜181 (配列番号： 4 ) で表されるポリぺプチド等 が好ましく用いられる。ァイソフォーム p63、 p44の 2つのアイソフォームを認識し 得る抗体を作製するための抗原ポリペプチドとしては、 例えば、 配列表の配列番 号： 1のァミノ酸番号 137〜151 (配列番号： 3 ) で表されるポリぺプチド等が好 ましく用いられる。
これらの抗原ポリペプチドの、 配列番号： 1に記載のアミノ酸配列上の位置関 係を図 1 0として記載する。
抗体の作製は、それ自体公知の通常用いられる方法を用いて行うことができる。 本発明の抗体は、 ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、 ポリ クローナル抗体が好ましく用いられる。 具体的には、 例えば、 ポリクローナル抗 体を作製する場合には、 KLH (キーホール'リンぺット 'へモシァニン) 、 BSA (牛 血清アルブミン） 、 豚甲状腺グロブリン等の担体蛋白に、 カルポジイミ ド、 マレ イミド等の適当な縮合剤を用いて前記抗原ポリペプチドを結合させ、 免疫用の抗 原 （免疫原） を作製する。 ここで、 担体蛋白への抗原ポリペプチドの結合は、 そ れ自体公知の通常用いられる方法により行えばょレ、が、例えば KLHを担体蛋白とし て用いて、 マレイミド化により抗原ポリペプチドを結合させる方法の場合には、 KLHに、 好ましくは Sulf 0- SMCC (Sulfosuccimidyl
4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate) 等の二官能性の縮合剤を反 応させてマレイミド化し、 これに N末端または C末端のうち結合を生じさせたい方 の末端にシスティンを付加した抗原ポリぺプチドを反応させれば、 チオールを介 して容易に結合して免疫原を調製することができる。 選択した抗原ポリべプチド のアミノ酸配列中にシスティンが含まれる場合には、 これを利用して結合させる こともできる。 また、カルポジイミド化された KLHを用いた場合には、抗原ポリぺ プチドとの脱水縮合によりぺプチド結合を形成させて結合させることができる。 このように調製した免疫原を含む溶液を、必要に応じてアジュバントと混合し、 ゥサギ、 マウス、 ラット、 モルモット、 ヒッジ、 ャギ、 ニヮトリ等、 通常抗体の 製造に用いられる動物の皮下または腹腔に 2〜3週間毎に繰り返し免疫する。 免疫 後、適宜試験的に採血を行って、 ELISA法、 ウェスタンブロッテイング法等の免疫 学的方法により力価 （抗体価） が十分に上昇していることを確認することが好ま しい。 十分な力価の上昇が確認された動物から採血を行い、 血清を分離すること によって抗血清が得られる。 ニヮトリの場合には、 鶏卵から採取した卵黄から水 溶性の画分を分取して卵黄抽出液を調製し、 これも抗血清同様に用いることがで きる。
本発明においては、 得られた抗血清等を精製することなくそのまま用いること もできるが、以下の方法により精製して用いることが好ましレ、。例えば、 Protein Aを用いた精製法、硫酸アンモニゥムを用いた塩析による方法、イオン交換クロマ トグラフィ一等によって、 ィムノグロブリン画分を精製する方法、 あるいは、 特 定のポリぺプチドを固定化したカラムを用いたァフィ二ティーカラムクロマトグ ラフィ一によつて精製する方法等が挙げられるが、 このうち、 Protein Aを用いた 精製法とァフィ二ティーカラムクロマトグラフィーを用いる方法を、 いずれかも しくは組み合わせて行うことが好ましい。 ここで、 カラムに固定化する精製用の ポリペプチドとしては、 用いた抗原ポリペプチドのアミノ酸配列に応じて、 それ と同じ配列、 もしくはその一部の配列を含むポリぺプチドを選択して用いればよ レ、。
また、 モノクローナル抗体を作製する場合には、 上記と同様にして免疫した動 物の月卑臓から抗体産生細胞を採取し、 常法によって、 同系動物等由来のミエロー マ細胞等の培養細胞と融合させてハイブリ ドーマを作製 （Milstein et al. , Nature, 256, 495 (1975) ) する。 培養を行って、 適宜 ELISA法やウェスタンブロッ ティング法等により抗体価を確認して、 目的のェピトープを認識するモノクロー ナル抗体を産生し、 かつ、 抗体産生能の高いハイプリ ドーマを選択すればよい。 かくして選択されるハイプリ ドーマの培養上清から、 目的のモノクローナル抗体 を得ることができる。
かくして得られる抗体は、 いずれも C o c h 1 i nを特異的に認識する抗体で ある。 このことは、 内耳組織等の C o c h l i nが存在することが知られている 組織を適当な動物種から採取し、 これを抽出液として調製して、 該抽出液を陽性 コントロールとして用いたり、 または、 抗原ポリペプチドとして用いたアミノ酸 配列を有するポリぺプチドを化学的に合成し、 これらとの反応性を解析すること 等によって確認できる。 また、 外リンパを試料として、 外リンパ中に存在する C o c h 1 i nとの反応性を確認することも好ましい。
なお、 本明細書で抗体と言う場合、 全長の抗体だけではなく抗体の断片も包含 する。抗体の断片とは、機能性の断片であることが好ましく、例えば、 F ( a b ' ) 2、 F a b ' などが挙げられる。 F ( a b ' ) 2、 F a b ' とは、 ィムノグロブリ ンを、 蛋白分解酵素 （例えば、 ペプシンまたはパパイン等） で処理することによ り製造されるもので、 ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存在するジスルフィド結合 の前後で消化されて生成される抗体断片である。 さらに、 抗体の断片の中には、 該抗体をコードする遺伝子由来の抗原結合部位を含む蛋白質も包含される。
例えば、 I g G 1をパパインで処理すると、 ヒンジ領域中の 2本の H鎖間に存 在するジスルフイド結合の上流で切断されて VL ( L鎖可変領域） と CL ( L鎖定 常領域） からなる L鎖、 及び VH (H鎖可変領域） と CH y l (H鎖定常領域中の y 1領域）とからなる H鎖フラグメントが C末端領域でジスルフィド結合により結合 した相同な 2つの抗体フラグメントを製造することができる。 これら 2つの相同 な抗体フラグメントを各々 F a b 'とレ、う。また I g Gをペプシンで処理すると、 ヒンジ領域中の 2本の H鎮間に存在するジスルフィド結合の下流で切断されて前 記 2つの F a b ' がヒンジ領域でつながったものよりやや大きい抗体フラグメン トを製造することができる。 この抗体フラグメントを F ( a b ' ) 2という。 また、 本発明の抗体は、 固相担体などの不溶性担体上に担持された固定化抗体 として使用したり、 標識物質で標識した標識抗体として使用することができる。 このような固定化抗体や標識抗体は全て本発明の範囲内である。
固定化抗体とは、 不溶性担体に物理的吸着あるいは化学的結合等によって坦持 された状態にある抗体を言う。 これらの固定化抗体は、 中耳に存在する体液中に 含まれる C o c h l i nを検出または定量するために用いることができる。 抗体 を担持させるのに使用できる不溶性担体としては、 例えば、 （ 1 ) 樹脂、 ポリカーボネート樹脂、 シリコン樹脂あるいはナイロン樹脂等からなるプ ラスチックや、ガラス等に代表されるような水に不溶性の物質からなるプレー ト、 試験管若しくはチューブ等の内容積を有するもの、ビーズ、ポール、フィルター、 あるいはメンブレン等、 並びに （2 ) セルロース系担体、 ァガロース系担体、 ポ リアクリルアミ ド系担体、 デキストラン系担体、 ポリスチレン系担体、 ポリビニ ルアルコール系担体、 ポリアミノ酸系担体あるいは多孔性シリカ系担体等のよう なァフィ二ティーク口マトグラフィ一に用いられる不溶性担体を挙げることがで さる。
標識抗体とは、 標識物質で標識された抗体を意味し、 これらの標識抗体は、 中 耳に存在する体液中に含まれる C o c h 1 i nを検出または定量するために用い ることができる。 本発明で用いることができる標識物質は、 抗体に物理的結合ま たは化学的結合等により結合させることによりそれらの存在を検出可能にするも のであれば特に限定されない。 標識物質の具体例としては、 酵素、 蛍光物質、 ィ匕 学発光物質、 ビォチン、 アビジンあるいは放射性同位体等が挙げられ、 より具体 的には、 ペルォキシダーゼ、 アルカリフォスファターゼ、 β— D—ガラクトシダ ーゼ、 グノレコースォキシダーゼ、 グノレコース一 6—ホスフェートデヒドロゲナー ゼ、アルコール脱水素酵素、 リンゴ酸脱水素酵素、ぺニシリナーゼ、カタラーゼ、 アポグルコースォキシダーゼ、 ゥレアーゼ、 ルシフェラーゼ若しくはァセチ /レコ リンエステラーゼ等の酵素、 フルォレスセィンィソチオシァネート、 フィコビリ タンパク、 希土類金属キレート、 ダンシルク口ライド若しくはテトラメチルロー ダミンイソチオシァネート等の蛍光物質、 3H、 14C、 125 I若しくは131 1等の放射 性同位体、 ピオチン、 アビジン、 または化学発光物質が挙げられる。 標識物質と 抗体との結合法は、 グルタルアルデヒド法、 マレイミド法、 ピリジルジスルフィ ド法または過ョゥ素酸法等の公知の方法を用いることができる。
ここで、 放射性同位体及び蛍光物質は単独で検出可能なシグナルをもたらすこ とができるが、 酵素、 化学発光物質、 ピオチン及ぴアビジンは、 単独では検出可 能なシグナルをちたらすことができないため、 さらに 1種以上の他の物質と反応 することにより検出可能なシグナルを生じる。 例えば、 酵素の場合には少なくと も基質が必要で feり、 酵素活性を測定する方法 （比色法、 蛍光法、 生物発光法あ るいは化学発光法等） に依存して種々の基質が用いられる。 また、 ビォチンの場 合には少なくともアビジンあるいは酵素修飾アビジンを反応させるのが一般的で ある。 必要に応じてさらに該基質に依存する種々の発色物質が用いられる。
上記した抗 C o c h 1 i n抗体（その断片、標識抗体、 固相化抗体などを含む） は、 外リンパ瘻検出用試薬として使用することができる。 当該試薬の形態は特に 限定されず、 固体でも液体 （溶液、 懸濁液など） でもよレ、。 液体の場合には適当 な溶媒 （抗体を安定に保存できる緩衝液など） に上記抗体を溶解または懸濁する ことによって試薬を調製することができる。
3 . 外リンパ瘻の検出を行うために用いる試薬キット
本発明の試薬キットは、 少なくとも試料中の外リンパ由来の C o c h 1 i nの 存在を検出する广こめの抗体を含んでなり、 上記した外リンパ瘻の検出に用いられ るためのものである。 該試薬キットを用いれば、 本発明の外リンパ瘻の検出を必 要時に簡便 ·迅速に行うことができ、 その結果を、 他の疾患との鑑別や、 治療方 針の決定等に役立てることができる。
本発明の試薬キットは、 本発明の検出方法を行うことのできるものであればい かなる構成であってもよレ、。例えば、 ELISA法を用いて C o c h 1 i nの検出を行 う試薬キットの場合には、 少なくとも C o c h l i nの存在を検出するための抗 体と、 酵素標識された二次抗体を含み、 その他に、 試料中の C o c h 1 i nを吸 着させるための固相、 酵素基質、 希釈液や洗浄液等の緩衝液、 陽性コントロール 等を含めること力 Sできる。 このように、 本発明の試薬キットは、 少なくとも試料 中の C o c h l i nの存在を検出するための抗体を含み、 それ自体公知の通常用 いられる試薬等を組み合わせて作製することができる。 実施例
以下、 実施例により本発明を説明するが、 本発明はこれらの実施例により何ら 限定されるものではない。
なお、 下記の実施例において、 「SDS」 はドデシル硫酸ナトリウム、 「PBS」 は Phosphate Buffered Saline, 「DAB」 は 3， 3' - Diaminobenzidine、 「匿 J は Horse Radish Peroxidaseを意味する。 実施例
1 . 抗体の作製
C o c h 1 i nの 3種類のァイソフォームに対するポリクローナル抗体として、 ァイソフォーム p63のみを認識する抗体（以下、 これを 「抗 LCCL抗体」 と称するこ とがある） 、 ァイソフォーム p63及ぴ p44を認識する抗体 （以下、 これを 「抗 p63 Z44抗体」 と称することがある） 、 及び、 全てのァイソフォームを認識する抗体
(以下、 これを「抗 p63Z44/40抗体」 と称することがある）の 3種類を作製した。 抗体の作製は、 宝酒造株式会社に外注した。
( 1 ) 抗原ポリぺプチドのァミノ酸配列の選択
3種類の抗体の作製に用いる抗原ポリペプチドとしては、 ヒト、 ゥシ、マウスの C o c h l i nのァミノ酸酉己歹 (J (N. G. Robertson, Nature Genet. ,
20， 299-303 (1998) ； Ikezono et al. , Biochem. Biophys. Acta,
1535, 3, 258-265 (2001) ) をァライメントし、 それらの種に共通の配列であって、 かつ抗原性に優れた部分を選択した。選択にあたっては、 「Epitope Adviser」 （富 士通九州システムエンジニアリング社製） を用いて行った解析の結果を参考にし た。 その結果より、 抗 LCCL抗体作製用の抗原ポリペプチドとしてはァイソフォー ム p63の N末端に存在する 15アミノ酸よりなるポリペプチド （配列番号： 2 ) を選 択した。 これは、配列表の配列番号： 1のアミノ酸番号 36〜50に相当する。 抗 p63 /44抗体作製用の抗原ポリべプチドとしては、 ァイソフォーム p44の N末端に存在 し、 ァイソフォーム p63及び p44に共通の 15アミノ酸よりなるポリペプチド （配列 番号： 3、 配列表の配列番号： 1のアミノ酸番号 137〜151に相当） を選択した。 さらに、抗 p63ノ 44/40抗体作製用の抗原ポリべプチドとしては、ァイソフォーム P40の N末端に存在する全てのァイソフォームに共通の 19アミノ酸の配列よりなる ポリぺプチド （配列番号： 4、 配列表の配列番号： 1のァミノ酸番号 163〜181に 相当） を、 それぞれ選択した。
( 2 ) 抗体の作製
上記 （1 ) において選択されたアミノ酸配列を有する各抗原ポリペプチドを用 いたポリクローナル抗体の作製を、 宝酒造株式会社に外注した。 宝酒造株式会社 による抗体作製の手順は、 次のとおりであつた。
まず、前記抗原ポリペプチド 10mg (80%)をそれぞれ化学合成により調製し、 KLH (キーホール · リンペット 'へモシァニン） 2mgに、 Cys (システィン) を介した マレイミド法によって結合させて免疫原とした。ここで、抗 P63/44抗体及ぴ抗 p63 Z44Z40抗体作製用の抗原ポリぺプチドについては、 該ァミノ酸配列中にシステ ィンが含まれていないので、 抗 P63Z44抗体作製用の抗原ポリぺプチドは C末端、 抗 P63Z44Z40抗体作製用の抗原ポリぺプチドは N末端にシスティンが付加された ポリペプチドを合成し、 これを用いた。 この免疫原を、 ゥサギ 1羽に対して 2週間 間隔で計 4回感作したが、 3回目の感作の後には、 ELISA法（酵素免疫測定法） によ る力価測定を実施して力価上昇を確認した。 感作後、 公知の方法に従って抗血清 lmlを採取して、 得られた抗血清全量を Protein Aにより精製した。 次に、 Protein Aで精製された抗血清のうち 80%相当量を、 CNBrで活性化したセファロース 5gにあ らかじめ前記抗原ポリぺプチド 5mgを結合させて調製しておいたぺプチドアフィ 二ティカラムに通してさらに精製した。 各操作は、 それ自体公知の通常用いられ る方法に従って行った。
( 3 ) 抗体の特異性の確認
上記 （2 ) において作製された抗体の特異性は、 ゥシの内耳組織より調製した 内耳蛋白質溶液 （陽性コントロール） を抗原としたウェスタンブロッテイングに より確認した。 まず、ゥシ側頭骨（東京芝浦臓器（株）より購入）から採取した内耳膜迷路 180mg に対し、 氷中で lmlの蛋白抽出液 (Complete mini Ca (-) (Boehringer Mannheim 社製） l tabを、 10ml PBS、 0. 5%SDSに溶解したもの（pH7. 4) ) を添カロし、 ラブチュ ーブミキサー及ぴディスポ撹拌ぺストル（GHI社製）を用いて肉眼的に残存組織が 確認できなくなるまでホモジェネートした後、 1000gで 15分間遠心分離して、得ら れた上清を内耳蛋白質溶液とした。 陽性コントロールとしては、 該溶液 0. 5 μ 1を 使用した。ウェスタンプロッティングは、後記 2に詳述する方法に従って行った。 その結果、 抗 LCCL抗体を用いた解析では約 63 k Daの位置にバンドが見られ、 ァ イソフォーム p63を認識していることが確認された。 抗 P63/44抗体を用いた解析 では、約 63 1^ 03及ぴ441^)3の位置にバンドが検出され、この抗体がァイソフォーム p63及ぴ p44を認識することが確認された。また、抗 p63Z44Z40抗体を用いた解析 では、 ァイソフォーム p63、 p44、 p40の 3本のバンドが検出され、 この抗体が全て のァイソフォームを認識することが確認された。 このように、作製した 3種類の抗 体を用いれば、内耳組織に存在する 3種類の C o c h 1 i nのアイソフォームを区 別できることが示された。
2 . 1の抗体を用いた外リンパ及ぴ内耳組織の解析
上記 1において作製した 3種類の抗体を用いて、ウェスタンプロッティングによ る外リンパ及び内耳組織の解析を行った。
( 1 ) 電気泳動及びウェスタンブロッテイング用試薬の調製
( i ) sample bufferの調製
1M Tris-HCl (pH 6. 8) 18. 75ml, 2-mercaptoethanl 15ml, glycerol 30ml, 10% SDS 6. 9ml, 0. 1% bromophenol blue 3ml に、 蒸留水を加えて合計 100mlに調製し た。 最終濃度は、 0. 188M Tris buffer, 2. 39mM SDS。
、 i i ) size markerの調製
市販のサイズマーカー (prestained protein marker weight standards, High range着色済みタンパク質分子量スタンダード（高分子量用）； Cat. No. #26041-020 (Gibco社製） ) 1 vialを、 500 μ 1の ImM DTT、 10°/。glycerolに溶解し、 5分間煮沸 後、冷却して 20 μ 1/tubeに分注し、 - 80°Cに保存した。用時にこれを融解して用い た。
i i i ) running bufferの調製
Tri s Base 15g/l， Glycine 72g/l, SDS 5g/lを MilliQ (MILLIPORE社製） 水に溶 解してストツク用の 5倍濃縮液を調製した。 これを用時希釈して最終濃度 25mM Tris, 192mM Glycine, SDS lg/1 (pH 8. 3)で用いた。
( i v ) transfer buff erの調製
3. 03g Tris, 14. 4g glycine, 200ml Methanolを蒸留水に溶解し、 最終濃度 25mM Tris, 192mM Glycine, 20% v/v Methanol (pH 8. 3)とした。
( v ) washing bufferとしては、 0. l%Tween PBS (pH7. 4)を用いた。
( v i ) blocking bufferの調製
dry milk (雪印社製スキムミルク）を、最終濃度が 5%になるように 0. 2% Tween in PBS (pH7. 4)に溶解した。
( V i i ) antibody dilution bufferの調製
dry milk (雪印社製スキムミ/レク）を、最終濃度が 1%になるように 0. 1% Tween in PBS (pH7. 4)に溶解した。
( v i i i ) ポンゾ一染色液の調製
30g Tricnloroacetic Acid、 30g Sulfosal icylic Acid、 2g PonseauSを 100ml の MilliQ水に溶解し、 ストック用の 10 X濃縮液とした。 使用時に Mi lliQ水で 10倍 希釈して使用した。
( i x ) MB液の調製
DAB溶液は、 用時調製して用いた。 DAB 10mg (10mg tablet； Cat. No. 049-22831 (Wako社製） ) を 20mlの 50mM Tris Buffer (pH7. 6) に溶解後、 30% H202 20 μ 1を 添カロした。これを 0. 45 μ ηιのフィルター（MILLIPORE社製）で濾過してから用いた。
( 2 ) 試料の調製
試料としては、 ヒ ト、 ゥシ、 モルモットの内耳組織及び外リンパを用いた。 ヒト試料については、 患者に対して採取及び研究目的の使用について十分な説 明を行い、 同意を得られた後に用いた。 内耳組織の抽出液は、 聴神経腫瘍手術の 際に採取されたヒト内耳膜迷路を計量し、 組織量 180mgに対して lmlの蛋白抽出液 (Complete mini Ca (-) (Boehringer Mannheim社製） 1 tabを、 10ml PBS、 0. 5 SDS に溶解したもの（PH7. 4) )を添加し、ラブチューブミキサー及ぴディスポ撹拌ぺス トル（GHI社製）を用いて肉眼的に残存組織が確認できなくなるまでホモジェネー トした後、 lOOOgで 15分間遠心分離して、 得られた上清を内耳蛋白質溶液とした。 電気泳動には、 これを 2 μ ΐ及ぴ 0. 5 μ ΐ用いた。 外リンパは、 人工内耳装着手術時 にドリルで蝸牛の基底回転外リンパ腔に孔をあけ、 電極を挿入する際に漏出した 外リンパを回収してこのうち 2 1を泳動した。
ゥシ試料としては、 内耳組織の抽出液には、 上記 1の （3 ) で調製したものを 1と同様に 0. 5 1を用いた。 また、 ゥシ側頭骨 （東京芝浦臓器 （株） より購入） の外耳道を手術用ドリルで削開し、 鼓膜を切除して中耳に到達、 アブミ骨を摘出 除去し卵円窓より外リンパを採取した。 このとき、 内耳組織の混入なく外リンパ を採取するように留意した。 試料としては、 採取した外リンパのうち 2 μ ΐを用い た。 モルモッ ト内耳組織の抽出液は、 ハートレイ系モルモッ ト側頭骨 （三共ラボ サービス （株） より購入） から採取した内耳膜迷路 180mgに対して、 氷中で lmlの 蛋白抽出液（Complete miniし a (-) (Boehrmger MannheimfiM) 1 tabを、 10ml PBS、 0. 5%SDSに溶解したもの（pH7. 4) ) を添加し、 ラブチューブミキサー及ぴディスポ 撹拌ぺストル（GHI社製）を用いて肉眼的に残存組織が確認できなくなるまでホモ ジェネートした後、 1000gで 15分間遠心分離して、得られた上清を内耳蛋白質溶液 とした。 これを 0. 5 μ 1用いた。 外リンパは、 鼓膜を切除して中耳に到達、 アブミ 骨を摘出除去し卵円窓より外リンパを採取した。 このうち 2 1を用いた。
各試料の容量 200に対して、 上記 （1 ) で調製した sample bufferを 85、 2 - mercaptoethanlを 15の割合で混合し、溶解させた。調製された各試料溶液は 95°C で 3分間インキュベートした後、 室温に冷却して 3000rpmで 10秒間遠心分離し、 各 15 μ 1を分取して泳動に供した。
( 3 ) ポリアクリルアミドゲル電気泳動 各抗体検出用として、 15%ポリアクリルアミドゲル （レディゲル J；縦 73mmX iR
80mmcmX厚さ lmm (Bio- Rad社製） ) 計 3枚に上記 （2 ) で調製した各試料溶液をァ プライし、電気泳動装置（Bio- Rad社製）に装着して、上記（ 1 )で調製した running bufferを使用して泳動を行った。泳動は 60分、 27mA [ 1枚のゲルあたり]で行った。
( 4 ) ウェスタンブロッテイングによる解析
上記（3 )において電気泳動を行ったゲル 3枚を、上記（ 1 )で調製した transfer bufferを使用して、 100Vで 90分間、 ニトロセルロース膜 （0· 45 μ πι ;
Cat. no. #162-0145 (Bio- Rad社製） ) にそれぞれ転写した。 転写装置としてはゥェ ット式ブロッター （Bio-Rad社製） を用いた。
転写後、ニトロセル口一ス膜をポンゾ一染色液に 5分間浸した後、 MilliQ水で脱 色し、各試料溶液中の蛋白質が染色された様子を確認した。確認後、蒸留水中で 5 分間振動させながら脱色した。
次に、 DAB染色法 （酵素発色法） による検出及ぴ解析を行った。 まず、 前記ニト ロセルロース膜 3枚を、 非特異的反応をブロックするために blocking buffer中に 4°Cで 1昼夜浸した。 これを washing bufferで 5分間、 3回洗浄し、 上記 1で作製し た 1次抗体と反応させた。 1次抗体としては、 抗 LCCL抗体は antibody dilution bufferで 1000倍に希釈、 抗 p63/44抗体及ぴ抗 p63Z44Z40抗体は同 bufferで 500 倍に希釈して、 それぞれ 夂ずつのニトロセルロース膜に添加した。反応は、振動 させながら 2時間行った。
得られた反応後の膜を、 前記 washing bufferで 1 5分間、 3回洗浄した後、 2次抗 体との反応を行った。 2次抗体としては、 ャギ由来 anti rabbit IgG antibody (HRP 標識； Cat. No. p- 0448 (Dako社製） ) を、 前記 antibody dilution bufferで 1000 倍に希釈したものを用い、 振動させながら 1時間反応させた。 これを前記 washing krfferで 15分間、 3回洗浄した後、 上記 （1 ) で調製した DAB液と反応させ、 発色 させた。 反応は、 蒸留水に浸すことで停止させた。
それぞれの解析の結果を、 図 1に示した。
抗 LCCL抗体を用いた解析の結果、 ヒト、 ゥシ、 モルモッ トの全ての動物種にお いて、 内耳組織の抽出液で 63 k Daのバンド （図中の矢印で示すバンド） が検出さ れた。外リンパでは、全ての動物種において 16kDaにクリァ一な細目のバンド（図 中のアスタリスク （* ) で示すバンド） が検出された。 抗 p63Z44抗体を用いた解 析では、全ての動物種の内耳組織の抽出液において 63 k Da及ぴ 44kDaのバンドが検 出され、外リンパでは主要なバンドは見られなかった。抗 p63ノ 44/40抗体を用い た解析では、 全ての動物種の内耳組織抽出液において 63 k Da、 44kDa、 40kDaの 3 本のバンドが検出されたが、 外リンパでは主要なバンドは見られなかった。
これらの結果より、 3種類の抗体がいずれの種においても同様の反応を示し、 3 種類のァイソフォームを区別できることが確認できた。 また、 外リンパ中には約 16kDaの蛋白質が存在することがわかり、該蛋白質は抗 LCCL抗体によってのみ認識 され、 抗 P63/44抗体及び抗 p63/44/40抗体には認識されないことから、 ァイソ フォーム p63の N末端部分のアミノ酸配列 （p44及び p40が有していない配列） を有 するフラグメントよりなる蛋白質であることが示唆された。
この外リンパにのみ存在する 16kDaの蛋白質に着目し、抗 LCCL抗体を用いて、 さ らに検討を進めることとした。
3 . 抗 LCCL抗体を用いた外リンパ瘻の検出
上記 2における解析の結果、 本発明の抗体によって外リンパにのみ存在する 16kDaの蛋白質が検出されたことから、該蛋白質を指標とする外リンパ瘻の検出方 法について検討を行った。 検討には、 抗 LCCL抗体を用いた。
( 1 ) 電気泳動及びウェスタンブロッテイング用試薬の調製
すべて、 上記 2の （1 ) と同様にして行った。
( 2 ) 試料の調製
ヒトの中耳に存在し得る外リンパ以外の体液として、 CSF、 血清、 唾液、滲出性 中耳炎の滲出液を含む中耳洗浄液、慢性中耳炎の耳漏を含む中耳洗浄液を用いた。 外リンパ瘻検出の試みとして、 急性感音難聴を発症した外リンパ瘻疑いの患者か ら採取した中耳洗浄液を用いた。 外リンパ瘻と鑑別されるべき疾患として、 メニ エール病の患者から得られた中耳洗浄液を用いた。 また、 人工内耳手術、 アブミ 骨手術、 外側半規管瘻孔、 外傷の各患者の内耳から漏出した外リンパを試料とし て用いた。 各試料については、 患者に対して採取及ぴ研究目的の使用について十 分な説明を行い、 同意を得られた後に用いた。
CSFは、 髄膜炎及び脳炎の疑いで検査が行われ、 結果が正常であった患者の CSF の一部を用いた。 血清は、 健常者の静脈血を用いた。 唾液は健常者から採取した ものを用いた。 滲出性中耳炎の滲出液を含む中耳洗浄液、 慢性中耳炎の耳漏を含 む中耳洗浄液、 及びメニエール病の患者からの中耳洗浄液は、 それぞれ患者の鼓 膜を微小に切開し、 シリンジを用いて微量の生理食塩水を注入した後、 これを再 度シリンジにより回収して採取した。 外リンパ瘻疑いの患者の中耳洗浄液は、 鼓 室開放術が施術された際に採取した。 なお、 外リンパ瘻オペ前の中耳洗浄液につ いては、 鼓室開放せず、 メ二エール病の患者からの中耳洗浄液を採取するときと 同様に、 鼓膜からシリンジを用いて回収を行った。
種々の傷病の患者の内耳から漏出した外リンパの採取は、 次のようにして行つ た。 まず、 人工内耳手術患者の外リンパは、 人工内耳装着手術時にドリルで蝸牛 の基底回転外リンパ腔に孔をあけ、 電極を挿入する際に漏出した外リンパを回収 した。 耳硬化症のためにアブミ骨手術を行った患者の外リンパは、 アブミ骨の底 板 （卵円窓） に孔をあけて人工耳小骨を揷入する際に漏出した外リンパを回収し た。 なお、 アブミ骨手術オペ前の中耳洗浄液については、 アブミ骨に孔をあける 前に中耳を生理食塩水で洗浄し、 その洗浄液を回収した。 外側半規管瘻孔を有す る患者の外リンパとしては、 外耳道癌切除のために外耳道全摘出手術を行った際 に、中耳の外側半規管隆起部分にあいた孔とその周辺部分を生理食塩水で洗浄し、 その洗浄液を回収した。 外傷患者の外リンパとしては、 外傷による内耳骨折によ り漏出した外リンパ （外傷性側頭骨骨折血性中耳滲出液） を採取した。 λェ内耳 手術患者の外リンパについては、 これをそれぞれ 5倍、 50倍、 500倍に希釈したも のをさらに調製し、 これらも同様にして用いた。
これらの各試料と、上記例 2で用いたゥシ外リンパ及びゥシ内耳蛋白質溶液 (陽 性コントロール） について、 それぞれ下記の表 1に示したとおりに分取し、 容量 200に対して上記 （1 ) で調製した sample bufferを 85、 2-mercaptoethanlを 15の 割合で混合し、溶解させた。調製された各試料溶液は 95°Cで 3分間インキュベート した後、 室温に冷却して 3000rpmで 10秒間遠心分離し、 各 15 μ 1を分取して泳動に 供した。
( 3 ) ポリアクリルアミドゲル電気泳動
15%ポリアクリルアミドゲル （レディゲル J；縦 73mmX幅 80mmcmX厚さ lmm (Bio-Rad社製） ）に上記 （2 ) で調製した各試料溶液をアプライし、 電気泳動装 置 （Bio- Rad社製） に装着して、 上記 （1 ) で調製した running bufferを使用して 泳動を行つた。 泳動は 60分、 27mA [ 1枚のゲルあたり ]で行った。
( 4 ) ウェスタンブロッテイングによる解析
上記 （3 ) において電気泳動を行ったゲルを、 上記 （1 ) で調製した transfer bufferを使用して、 100Vで 90分間、 ニトロセルロース膜 (0. 45 μ m；
Cat. no. #162-0145 (BioRad社製） ） に転写した。 転写装置としてはウエット式ブ ロッター （Bio- Rad社製） を用いた。
転写後、ニトロセルロース膜をポンゾ一染色液に 5分間浸した後、 MilliQ水で脱 色し、各試料溶液中の蛋白質が染色された様子を確認した。確認後、蒸留水中で 5 分間振動させながら脱色した。
次に、 化学発光法による検出及び解析を行った。 転写後のニトロセルロース膜 を、非特異的反応をブロックするために blocking buffer中に 4°Cで 1昼夜浸した。 これを washing bufferで 5分間、 3回洗浄し、 1次抗体と反応させた。 1次抗体とし ては、 抗 LCCL抗体を antibody dilution bufferで 1000倍に希釈して、 二トロセノレ ロース膜に添加した。 反応は、 振動させながら 2時間行った。
2次抗体としては、 ャギ由来 anti rabbit IgG antibody (HRP標識） （Dako社製； Cat. No. #p- 0448) を、 前記 antibody dilution bufferで 1000倍に希釈したものを 用レ、、 振動させながら 1時間反応させた。 これを前記 wash bufferで 15分間、 3回洗 浄した後、 化学発光キット (ECL plus；アマシャムフアルマシアバイォテック社 製） を用いて化学発光させ、 発生したシグナルをフィルム （Kodak Scient ic Imaging Film； Cat. No. #165-1454 (Kodak社製） ) に感光させた。 フィルムの露光 時間は、表 1の Well No. 1〜1 2の試料をブロットした 文目の二トロセルロース 膜については約 1分間、 Well No. 1 3〜 2 4の試料をブロットした 2枚目の二ト口 セルロース膜については 1時間とした。 Well No. 2 5〜3 6の試料をブロットした 3枚目の-トロセルロース膜については、 10秒間露光した場合と、 1時間露光した 場合と、 2通りの実験を行って露光時間による違いを比較した。 Well No. 3 7〜4 8の試料をブロットした 4枚目の二トロセルロース膜、 Well No. 4 9〜6 0の試 料をブロットした 5枚目のニトロセルロース膜及び Well No. 6 1〜 7 2の試料を ブロットした 6枚目の二トロセルロース膜はそれぞれ 5分間露光した。
結果を図 2〜7に示した。 図中、 写真の上の数字は表 1の Well No.を、 下の記 載はその Wellに供された試料を示す。 図 2は表 1の Well No. 1〜 1 2の試料をブ ロットした 夂目の二トロセルロース膜、図 3は Well No. 1 3〜2 4の試料をブロ ッ トした 2枚目のニトロセルロース膜、図 4は Well No. 2 5〜3 6の試料をブロッ トした 3枚目の二トロセルロース膜、図 5は Well No. 3 7〜4 8の試料をブロット した 4枚目の二トロセルロース J3莫、 図 6は Well No. 4 9〜6 0の試料をプロット した 5枚目の二トロセルロース膜、 図 7は Well No. 6 1〜7 2の試料をブロット した 6枚目のニトロセルロース膜について、 化学発光法による検出を行った結果 の写真である。 各試料の電気泳動に供したサンプル量、 Well No.、 及び結果の一 覧を表 1に示した。
Well No. 分取した試料 結果
1¾料名
量 1)
ヒト脳脊髄液 (CSF) 1-4 4-7 7
ヒ ト血清 1一 3 8 - 10 3/100
ヒ ト唾液 12 7
人工内耳 1 X I 3, 14 2 +
2 X I 40 2 +
1 X 5 15,47 2 +
1 X 50 16, 26 2 + 1 X 500 17 2 一 外側半規管瘻孔 18 2 +
1 19, 27 2 +
2 20, 28 4 +
3 32 0. 5 + アブ^ ^ 犹千 4 50 2 +
ノ ノ へ
5 52 2 +
6 59 2 +
7 63 2 +
8 71 2 + ァプ、 ^千:^: 5 51 16 ―
ノ ノ へ ^Vvi
6 58 16 ― オペ前
7 62 16 一
1 21, 35, 39 10 ―
2 36 10 ― メ二エー/レ丙 3 38, 57 16 ―
4 54 16 ―
5 55 16 ―
1 22 2 ―
2 23 2
滲出性中耳炎
3 24 2 一
4 46 0. 5 ― 慢性中耳炎 31 10 ― 外傷性側頭骨骨 1 34 2 + 折血性中耳滲出 2 45 2 土 液
1 29 10 +
2 30 16 一
3 41 16 一
4 42 16
外リンパ瘻疑い
5 65 16 +
6 66 16 +
7 68 16 +
8 69 16 +
4 43 丄
オペ目
ゥシ外リンハ。 2 2 + ゥシ内耳組織抽出液 11 0. 5 一 (63kは +)
1, 13, 25, 37， 48,
サイズマーカー
49, 60, 61, 72
ゥエル No. 33， 44, 53, 56， 64, 67, 70は試料アプライせず。 ヒト外リンパ （人工内耳手術 （図 2の 3、 図 3の 14〜1 7、 図 4の 26、 図 5の 40、 47) 、外側半規管瘻孔 （図 3の 18 ) 、 アブミ骨手術（図 3の 19、 20、 図 4の 27、 28及び 32、 図 6の 50、 52及ぴ 59、 図 7の 63、 7 1) 、 外傷 （図 4の 34) の各患者から得られた外リンパ） では、 全例において 約 16kDaに明瞭な細目のバンドが検出された。人工内耳手術患者由来の外リンパを 系列希釈したゥエルの結果 （図 3の 14〜1 7) より、 ヒ トから採取された外リ ンパは、 50倍程度まで希釈しても検出可能であることがわかった。 外リンパ瘻疑 いの患者から得られた中耳洗浄液では、 5例が陽性、 3例は陰性であった （図 4 の 29、 図 7の 65、 66、 68及び 69が陽性、 図 4の 30、 図 5の 41、 4 2が陰性） 。 アブミ骨手術オペ前 （図 6の 5 1、 58、 図 7の 62) 、 メニエー ル病 （図 3の 21、 図 4の 35、 36、 図 5の 38、 39、 図 6の 54、 55及 ぴ 57) 、 滲出性中耳炎 （図 3の 22〜 24) 、 慢性中耳炎 （図 4の 31 ) の各 患者の中耳洗浄液は陰性であった。 ヒ ト CSF (図 2の 4〜 7) 、 ヒ ト血清 （図 2の 8-10) 、 ヒト唾液 （図 2の 12) でも、 該抗体で検出されるバンドは認めら なかった。
ゥシ外リンパではやや幅の広い 16kDaのバンドが検出された （図 2の 2)。 陽性 コントロールであるゥシ内耳蛋白質溶液にはァイソフォーム p63と考えられる 63 kDaのバンドが検出されたが、 蛋白量が多量であるために over exposureとなり、 該当部分が白く抜けたように見られた （図 2の 1 1) 。
また、 図 4に示すように、 1時間の露光を行った場合 （図 4の上の写真） には、 約 16kDaの N末端フラグメント以外のバンドも検出されるが、 それらは明らかに目 的のバンドと区別が可能であった。 例えば、 特に外傷患者の外リンパ （図 4の 3 4)等では、外リンパ採取時に生じた溶血のために約 60kDaにアルブミンと考えら れるバンドが検出される力 16kDaに検出される目的のバンドとは明らかに区別が 可能であった。 また、 10秒間の露光でも試料中の C o c h 1 i nが検出できるこ とも確認された （図 4の下の写真） 。 これらの結果より、該 16kDaの蛋白質は、 ヒトの中耳に存在する可能性のある他 の体液、 すなわち、 CSF、血清、 唾液、 アブミ骨手術オペ前の中耳洗浄液、 滲出性 中耳炎の中耳滲出液、 慢性中耳炎の耳漏等には一切検出されず、 またメニエール 病患者の中耳洗浄液にも検出されないものであって、 ヒト外リンパのみで検出さ れたことから、 外リンパ瘻の検出に非常に有用であることがわかった。
また、 外リンパ瘻疑いの患者で、 オペ前に鼓膜からシリンジで回収した中耳洗 浄液を用いたときと、 鼓膜開放術施術時に回収した中耳洗浄液を用いたときと同 じ結果がでたことから、 本発明の検出方法によって、 鼓膜開放術を行わずに微小 切開とシリンジを用いる方法により外リンパ瘻が検出できることがわかった。 実施例 2
1 . 抗体の作製
実施例 1と同様にァイソフォーム p63のみを認識する抗体を、抗 LCCL抗体とは別 に 3種類作製した。 抗体の作製は、 宝酒造株式会社に外注した。
( 1 ) 抗原ポリぺプチドのァミノ酸配列の選択
ァイソフォーム p63のみを認識する 3種類の抗体の作製に用いる抗原ポリぺプ チドとしては、 配列表の配列番号： 1のァミノ酸番号 63〜83に相当する 2 1アミ ノ酸よりなるポリペプチド （配列番号： 5 ) (これを抗原ポリペプチドとして作 製した抗体を以下、 「抗 LCCL1抗体」 と称することがある） 、 同じくアミノ酸番号 95〜111に相当する 1 7アミノ酸よりなるポリペプチド（配列番号： 6 ) (これを 抗原ポリぺプチドとして作製した抗体を以下、 「抗 LCCL2抗体」 と称することがあ る） 、 更に配列表の配列番号： 1のアミノ酸番号 114〜127に相当する 1 4ァミノ 酸よりなるポリペプチド （配列番号： 7 ) (これを抗原ポリペプチドとして作製 した抗体を以下、 「抗 LCCL3抗体」 と称することがある) をそれぞれ選択した。
( 2 ) 抗体の作製 ' 上記 （1 ) において選択されたアミノ酸配列を有する各抗原ポリペプチドを用 いたポリクローナル抗体の作製を、宝酒造株式会社に外注した。宝酒造株式会社に よる抗体作製の手順は、 実施例 1の 1 (2) と同様に行った。
ここで、 抗 LCCL2抗体、 抗 LCCL3抗体については、 該アミノ酸配列中にシスティ ンが含まれていないので、 それぞれの抗体作製用抗原ポリぺプチドの C末端にシ スティンが付加されたポリぺプチドを合成し、 これを用いた。
(3) 抗体の特異性の確認
上記 （2) において作製された抗体の特異性は実施例 1の 1 (3) と同様の方 法で確認した。 その結果、抗 LCCL1抗体、抗 LCCL2抗体、 抗 LCCL3抗体それぞれの抗 体における解析では約 63kDaの位置にバンドが見られ、ァイソフォーム p63を認識 していることが確認された。
2. 上記 1で作製した抗体を用いた外リンパ及び内耳組織の解析
上記 1において作製した 3種類の抗体を用いて、 ウェスタンブロッティングに よる外リンパ及ぴ内耳組織の解析を行った。
(1) 電気泳動及びウェスタンプロッティング用試薬の調製
すべて、 実施例 1の 2 (1) と同様にして行った。
(2) 試料の調製
試料としては、ゥシの内耳組織及ぴ外リンパを用いた。内耳組織の抽出液には、 上記実施例 1の 1 (3) と同様な方法で調製したものを 0.3M 1用いた。 また、 ゥ シ側頭骨 （東京芝浦臓器 (株）より購入） の外耳道を手術用ドリルで削開し、 鼓膜 を切除して中耳に到達、 ァブミ骨を摘出除去し卵円窓より外リンパを採 した。 このとき、 内耳組織の混入なく外リンパを採取するように留意した。 試料として は、 採取した外リンパのうち 1 μ 1を用いた。
各試料の容量 200に対して、 上記 （1) で調製した sample bufferを 85、
2-mercaptoethanlを 15の割合で混合し、溶解させた。調製された各試料溶液は 95°C で 3分間インキュベートした後、 室温に冷却して 3000rpmで 10秒間遠心分离佳し、 各 15 μ 1を分取して泳動に供した。
(3) ポリアクリルアミドゲル電気泳動
各抗体検出用として、 15 %ポリアクリルアミドゲル （レディゲル J； 縦 73mm X幅 80腿 X厚さ 1讓 （Bio- Rad社製） ) を 2枚作製し、 上記 （2 ) で調製したゥシ内 耳試料溶液のみアプライしたもの、 及ぴ外リンパ試料溶液のみアプライしたもの 作製し、電気泳動装置（Bio-Rad社製） に装着して、上記（1 ) で調製した running bufferを使用して泳動を行った。泳動は 60分、 27mA (—枚のゲルあたり）で行った。
( 4 ) ウェスタンブロッテイングによる解析
上記（ 3 )において電気泳動を行ったゲル 2枚を、上記（ 1 )で調製した transfer bufferを使用して、 100Vで 90分間、 ニトロセルロース膜 （0. 45 /z m ;
Cat. no. #162-0145 (Bio- Rad社製） ） にそれぞれ転写した。 転写装置としてはゥェ ット式プロッター （Bio- Rad社製） を用いた。
転写後、ニトロセルロース膜をポンゾ一染色液に 5分間浸した後、 MilliQ水で脱 色し、 各試料溶液中の蛋白質が染色された様子を確認した。
次に、 DAB染色法 （酵素発色法） による検出及ぴ解析を行った。 まず、 前記ニト ロセルロース膜を、非特異的反応をブロックするために bl ocking buffer中に 4 °C で 1昼夜浸した。 これを washing bufferで 5分間、 3回洗浄した。 1次抗体とし ては、 抗 LCCL抗体、 抗 LCCL1抗体、 抗 LCCL2抗体及ぴ抗 LCCL3抗体共に antibody dilution bufferで 1000倍に希釈し、 ニトロセルロース膜に添加した。 反応は、 振 動させながら 2時間行った。
得られた反応後の膜を、 前記 washing bufferで 1 5分間、 3回洗浄した後、 2 次抗体との反応を行った。 2次抗体としては、 ャギ由来 anti rabbit IgG antibody (HRP標識； Cat. No. p- 0448 (Dako社製） ) を、 前記 antibody dilution bufferで 1000倍に希釈したものを用い、 振動させながら 1時間反応させた。 これを前記 washing bufferで 15分間、 3回洗浄した後、 上記 （1 ) で調製した DAB液と反応さ せ、 発色させた。 反応は、 蒸留水に浸すことで停止させた。
短冊状に切断した各レーンをゥシ外リンパ及ぴゥシ内耳に抗体順に並べ解析し た結果を図 8に示した。
抗 LCCL抗体、抗 LCCL1抗体、抗 LCCL2抗体、抗 LCCL3抗体を用いた解析の結果、 内 耳組織の抽出液で 63 k Daのバンド （図中の矢印で示すバンド） が検出された。 外 リンパでは、 抗 LCCL抗体及び抗 LCCL3抗体で 16kDaに明確なパンドが検出された。 また、 抗 LCCL1抗体、 抗 LCCL2抗体についてもパンドが検出された。 今回はこれら の結果より、上記 4つの抗体がァイソフォーム p63を認識していることが確認され、 更に抗 LCCL抗体、 抗 LCCL1抗体、抗 LCCL2抗体、 抗 LCCL3抗体の各抗体を用いて外リ ンパにのみ存在する 16kDaの蛋白質をも認識できることが判明した。
3 . 抗 LCCL3抗体を用いた外リンパ瘻の検出
上記 2における解析の結果、抗 LCCL1抗体、抗 LCCL2抗体、抗 LCCL3抗体によって も外リンパにのみ存在する 16kDaの蛋白質が検出されたことから、該蛋白質を指標 とする外リンパ瘻の検出方法について検討を行った。検討には、抗 LCCL3抗体を用 レ、た。
( 1 ) ゥスタンプロッテイング用試薬の調製
すべて、 上記実施例 1の 2 ( 1 ) と同様にして行った。
( 2 ) 試料の調製
試料として、 メニエール病の患者から得られた中耳洗浄液と、 人工内耳手術、 アブミ骨手術の患者の内耳から漏出した外リンパ試料及ぴ外リンパ瘻疑いの患者 から採取した中耳洗浄液を用いた。 各試料については、 患者に対して採取及ぴ研 究目的の使用について十分な説明を行い、 同意を得られた後に用いた。
試料は実施例 1の 3 ( 2 ) と同様にして採取する力、 または実施例 1の 3 ( 2 ) で採取したものを用いた。 その調製方法はすべて実施例 1の 3 ( 2 ) と同様にし て行った。
( 3 ) ポリアクリルアミドゲル電気泳動
すべて、 上記実施例 1の 3 ( 3 ) と同様にして行った。
( 4 ) ウェスタンブロッテイングによる解析
すべて実施例 1の 3' ( 4 ) と同様にして行った。 ただし、 フィルムの露光時間 は 5分間とした。
結果を図 9に示した。 図中、 写真の上の数字は表 2の Well No.を、 下の記載はそ の Wellに供された試料を示す。 図 9は表 2の Well No. 73〜83の試料をブロットし たニトロセルロース膜について、 化学発光法による検出を行った結果の写真であ る。 各資料の電気泳動に供したサンプル量、 Well No.、 及ぴ結果の一覧を表 2に 示した。 なお、 比較のため、 抗 LCCL抗体で使用した試料と同じ患者から採取した 試料については、 抗 LCCL抗体での試験結果も記載した。
表 2 ：
Figure imgf000038_0001
* ： ゥエル No. 81は試料アプライせず。 ヒト外リンパ （人工内耳手術 （図 9の 7 4 ) 、 アブミ骨手術 （図 9の 8 2、 8 3 ) ) では、 16kDaにバンドが検出され、 陽性であることが確認できた。 メ-エー ル病 （図 9の 7 5 ) の患者の中耳洗浄液は陰性であった。 外リンノ、。瘻疑いの患者 から得られた中耳洗浄液では、 4例が陽性、 1例は陰†生であった （図 9の 7 6、 7 7、 7 8及び 7 9が陽性、 8 0が陰性） 。 この結果は抗 LCCL抗体による結果と 一致し、 抗 LCCL3抗体と抗 LCCL抗体が共に外リンパにのみ存在する 16kDaの蛋白質 を検出していることから、抗 LCCL3抗体も抗 LCCL抗体と同様に外リ ンパ瘻を検出す るために有用であることがわかった。 実施例 3
上記実施例 1および 2に詳述したとおり、 ヒト、 ゥシ、 モルモット等の外リン パ中には、 抗 LCCL抗体および抗 LCCL3抗体によつて約 16kDの蛋白質が検出された。 そこで、 ゥシ外リンパを用いて、 二次元ゲル電気泳動 （2D- GE) による解析を行つ た。
二次元ゲル電気泳動 （2D- GE) では、 一次元目に等電点ゲル電気泳動、 二次元目 にポリアクリルアミドゲル電気泳動 （SDS-PAGE) を行うことにより、 蛋白質をよ り詳細に解析することができる。 たとえば、 一次元の SDS - PAGEのみでは分子量が 近いために分離できない複数の蛋白質を分離したり、 リン酸化、 糖鎖の付加、 ァ ミノ酸置換等の種々の要因により蛋白質が受けている微妙な変化を解析したりす ることができる。 2D - GE、 プロッティング、 抗 LCCL抗体及ぴ抗 LCCL3抗体による染 色は、 以下に詳述する方法により行った。
1 . 一次元目の等電点電気泳動
一次元目の等電点電気泳動は、 アマシャムバイオサイエンス社
(Buckinghamshire,英国） 製の IPGゲル（pH6-9, 18cm)を用いて行った。 試料のゥ シ外リンパとしては、 上記実施例 1に記載のものと同じものを用いた。
まず、 試料 （ゥシ外リンパ） の 1容 （約 16 μ 1) に試料添加液 （7Μ尿素、 2Μチォ 尿素、 2°/。 TritonX- 100、 2% Pharmalyte, 40mM DTT、 タンパク質分解酵素阻害剤 (Complete mini EDTA (-) , Boehringer Mannheim社, Mannheim ドイツ) を 10ml あたり 1錠添加） を 7容 （112 μ 1) 添加し、 これを試料液とした。 IPGゲル （乾燥状 態の購入品） を約 10mlの膨潤液 （7M尿素、 2Mチォ尿素、 2% TritonX- 100、 2% PharmalyteN 40mM DTT) で β彭潤し、 一次元目の泳動に用いた。
電気泳動はアマシャムバイオサイエンス社製の電気泳動装置 （Multiphorll)に より行い、 120 μ 1の上記試料液を陽極側に設置したサンプル力ップに添力 t!して泳 動した。泳動は、 300Vで 60秒間行った後、 90分で 300Vから 3500Vまで徐々に電圧を 増加させ、 さらに 3500Vで 18時間行った。 泳動中は、 装置を 15°Cに冷却した。
2.二次元目の SDS— PAGE電気泳動
—次元目の泳動が終了した後、 IPGゲルを平衡ィヒ液（7M尿素、 25%グリセ口ール、 50mM Tris - HC1緩衝液 （pH6. 8) 、 2% SDS, 33mM DTT、 1. 6%ブロモフエノールブル 一） で 30分平衡化し、 これを二次元目の SDS-ポリアクリルアミド電気泳動
(SDS-PAGE) に供した。 SDS-PAGEのゲルとしては、 24X 24 X 0. lcmの大きさのもの を用いた。 このゲルの濃縮用ゲルのポリアクリルアミ ド濃度は 3%、 分離用ゲルは 15%であり、その他のゲル組成は一般的な SDS - PAGEの条件と同じである。 また、泳 動用の緩種 Ϊ液としては、 25mM Tris、 192mMグリシン、 0. 1% SDSの組成のものを用 いた。 泳動は、 濃縮ゲル中は 50mAで、 分離ゲル中は 70mAで行った。
3 .ブロッティング
二次元目の電気泳動終了後、 ただちに、 ゲルをブロッテイング用緩衝液 (25mM Tris、 192mMグリシン、 0. 05% SDS、 10°/。メタノール） で 30分間平衡化し、 これをブ ロッテイング装置 （日本エイド一社製： NA- 1515B) を用いて PVDF膜 （アプライド バイオシステムズ社製： Pro-Blot) に転写した。
4 . 抗 LCCL抗体による染色
上記 3でブロッテイングした膜を、 ブロッキング溶 ί夜 （5%スキムミルク、 0. 2°/0 Tween20、 PBS) 中で一昼夜、 4での冷蔵庫で静置してブロッキングした後、 洗浄液 (Tween20、 PBS) で 5分間、 3回振とうして洗浄した。
1次抗体溶液としては、上記実施例 1で作製した抗 LCCL抗体（6 μ 1)を希釈液（1% スキムミルク、 Tween20、 PBS、 6ml) で 1000倍に希釈したものを用いた。 予め洗浄 しておいた膜にこの 1次抗体溶液を添加し、室温で 2時間振とうして反応させた後、 洗浄液で 15分間、 3回振とうして洗浄した。
2次抗体溶液としては、 anti- rabbit IgG-HRP conjugate (Chappel社製、 2. 4 1) を前記希釈液で 2500倍に希釈したものを使用した。洗浄した膜にこの 2次抗体溶液 を添加し、室温で 1時間振とうして反応させた後、洗浄液で 15分間、 3回洗浄した。 洗浄後の膜に、アマシャムバイオサイエンス社製の ECLキットを用いて、抗体認識 スポットの検出を行った。
その結果、 等電点 7. 7〜7. 9付近、 分子量 17. 7〜23. lkD付近に一群の蛋白質が検 出された。 また、 その中でも主要な蛋白質は、 分子量 17. 7〜18. 8kDの蛋白質であ つた。 これら一群の蛋白質は複数の蛋白質が混合されたものではなく、 ひとつの 蛋白質が、 たとえば、 リン酸化、 糖鎖の付加、 アミノ酸置換等の種々の要因によ り微妙に変化したものと考えられた。
5 . 抗 LCCL3抗体による染色
上記 4で ECLキットによる検出を行つた膜を、 ストリツビング溶液 （lOOmM 2 - メルカプトエタノール、 2% SDS、 62. 5mM Tris-HCl緩衝液 (pH6. 8) ) に浸し、 30 分間、 50°Cのインキュベータ中で振とうして、 抗 LCCL抗体をストリッビング （除 去） した。
次に、 この同じ膜を用いて、上記実施例 2で作製した抗 LCCL3抗体による染色を 行った。 染色の手順は、 上記 4に記載の抗 LCCL抗体による染色の場合とすべて同 様に行った。 1次抗体 （抗 LCCL3抗体） の希釈率については、 1000倍とした。
染色の結果、 上記 4で得られたものと同じパターンで蛋白質が検出された。 上記 4及び 5で行つた 2種類の抗体による免疫染色の結果、 検出された蛋白質 のスポットのパターンが同じであったことから、 上記実施例 1で作製した抗 LCCL 抗体と、上記実施例 2で作製した抗 LCCL3抗体とは、同じ蛋白質を検出しているこ とが確認された。 すなわち、 このことにより、抗 LCCL抗体と抗 LCCL3抗体が、本発 明の外リンパ瘻の検出方法に同等に用い得る抗体であることがわかった。
さらに、 抗 LCCL抗体の作製に用いた抗原ポリぺプチドは配列表の配列番号 1の ァミノ酸番号 36〜50で表されるぺプチドであり、抗 LCCL3抗体の作製に用いた抗原 ポリぺプチドはァミノ酸番号 114〜： 127で表されるぺプチドであることから、 上記 実施例 1〜2において外リンパ中に検出された約 16kDの蛋白質が、 配列番号 1の アミノ酸番号 36〜 127で表されるアミノ酸配列をほぼ含む、 C o c h 1 i nの N末 端フラグメントよりなる蛋白質であることが確認された。 従って、 本発明の外リ ンパ瘻の検出方法においては、本実施例において作製された抗 LCCL抗体、抗 LCCL1 抗体、 抗 LCC2抗体、 およぴ抗 LCCL3抗体に限らず、 配列番号 1のアミノ酸番号 36 〜12ァで表されるァミノ酸配列中に含まれる抗原決定基を認識する抗体であれば、 任意に作製し抗体価の優れたものを選択して用いることができることがわかった。 実施例 4
上記実施例 1及び 2において本発明の方法による外リンパ瘻の検出が行われた 外リンパ瘻疑いの患者 8人については、該方法の他に、従来用いられてきた外リン パ瘻の鑑別方法である鼓室開放術 （以下、 これを 「従来方法」 と称することがあ る） により鼓室内における外リンパ漏出の有無を確認した。 また、 同じく全例に ついて、瘻孔があるという推定のもとに内耳窓（正円窓、卵円窓）及び fissura ante fenestramに、患者本人から採取した筋膜をガーゼで圧迫して作製した脱水筋膜小 片を積み重ね、それを生理的組織接着剤（ベリプラスト1\ アベンテイス ファー マ （株） ） で固定し瘻孔を閉鎖した （以下、 これを「瘻孔閉鎖術」と称することが ある） 。 外リンパ瘻は、 急性感音難聴の中でも唯一手術により聴力回復が期待で きる疾患であり、 早期治療を行うことによって治癒率が上がるものである。 そこ で、これら 8人の患者について、本発明の方法による結果と、従来方法による結果、 及び瘻孔閉鎖術の施術による聴力回復の有無を比較検討した。 なお、 前述のとお り、 外リンパ瘻疑いの患者は試料の採取及び研究目的の使用について十分な説明 を行い、 同意を得た患者である。
瘻孔閉鎖術前と術後に日本聴覚医学会が定めた聴力検査法に従い、 ォージオメ 一ター（リオン社製 M- 75または M- 75N)を用いて聴力検查を行レ、、 250Hz, 500Hz、 1000Hz、 2000Hz、 4000Hzの 5周波数の聴カレべノレの平均値を用いて評価した。厚生 労働省急性高度難聴調査研究班の聴力回復の半 定基準に従い、 手術前と手術後で 検查値が健常な耳もしくは発症前と同じレベ/レまで回復したものを 「治癒」 、 5 周波数平均の値が 30デシベル （dB) 以上回復したものを 「著明回復」 、 10dB以上 30dB以下回復したものを 「回復」 、 10dB以內のものを 「不変」 と判定した。 実施 例 1及ぴ 2での外リンパ瘻の検出結果については表 1及び 2に記載したが、 本実 施例との対比として表 3にも改めて記載した。
表 3
Figure imgf000043_0001
この結果、 従来方法の診断結果と本発明方法での結果が一致したものが、 外リ ンパ瘦疑い 8例中 5例、 一致しなかったものが 3例であった。
この診断結果が異なった 3例のうち、外リンパの漏出はなかったが本発明方法で は陽性だった外リンパ瘻疑レ、 1は、高度難聴で手術によって改善が難しい症例であ り、 聴力の改善は見られなかったが外リンパ瘻であると診断された。
また、外リンパの漏出が確認されたが本発明方法では陰性だった 2例のうち、外 リンパ瘻疑い 3は、 鼓室開放術後 1年で更に聴力が悪化したため、 その他の疾患の 可能' 1·生を検討していたところ、 MRI (磁気共鳴ィメージング） によつて聴神経腫瘍 であることが確認された。 現在の厚生労働省診断基準に従って生理学的所見及び 症状から外リンパ瘻が疑われ、 鼓室開放術時に卵円窓、 正円窓からの外リンパの 漏出が手術中に顕微鏡下で視認により確認され、 外リンパ瘻と診断された症例で あっても、 他の疾病の可能性があること及び、 その患者が本発明方法の検査では 陰性であったことから、 本発明の信頼性が示唆された。
外リ ンパ瘻疑い 4では外リンパの漏出を明確にありとしたが、通常みられる外リ ンパの漏出とは明らかに異なる多量の液体が確認されたため、 外リンパの漏出で はなく 、 本発明の試料採取のために注入した生理食塩水を十分除去できていなか つた可能性がある。 外リンパ瘻疑い 7では、外リンパ瘻の漏出もあり、更に本方法でも陽性であると されたが、 瘻孔閉鎖術によっても聴力は改善しなかった。 これは発症から手術ま でに 17日と時間がかかってしまったためと考えられる。 外リンパ瘻であっても、 発症から手術までに時間がかかり組織の侵襲が進んだ場合や、 症状が重い場合、 高齢の場合、 合併症がある場合などは手術を行つても聴力の改善が見られなレ、場 合がある。
外リンパ瘻疑い 8例のうち本発明方法で陽性であった 5例は、 すべて外リンパ瘻 であると確認され、 本発明で陰十生であつた 3例中 1例は別の疾患であることが確認 されたことから、 本発明方法が陽性であること即ち外リンパ瘻であるといえるで あろう。 産業上の利用の可能性
本発明によれば、 簡便、 確実で、 かつ患者への侵襲度の低い外リンパ瘻の検出 方法が提供される。 該方法により、 従来不可能とされてきた外リンパ瘻の確定診 断を、 診断を行う者の主観によらず客観的に行うことができ、 メニエール病、 突 発性難聴等の他の急性感音難聴と外リンパ瘻とを、 臨床現場において実質的に鑑 別することが可能になる。 これにより、 迅速かつ適切な治療方針の決定を行うこ とができ、 治癒率を大きく改善することができる。
本出願は、 2 0 0 2年 6月 2 7日付の日本特許出願（特願 2 0 0 2—1 8 7 4 7
9 ) に基づく優先権を主張する出願であり、その内容は本明細書中に参照として取 り込まれる。また、本明細書にて引用した文献の内容も本明細書中に参照として取 り込まれる。

Claims

請求の範囲
1 . 中耳に存在する体液中の C o c h 1 i nの存在を検出することを含む、 外リンパ瘻の検出方法。
2 . 外リンパ瘻に罹患していることが疑われる患者の中耳に存在する体液中 の C o c h 1 i nの存在を検出し、 検出された C o c h 1 i nの存在を外リンパ 瘻の可能性の指標とする、 請求項 1に記載の方法。
3 . C o c h 1 i nの存在の検出が、 C o c h 1 i nの N末端フラグメント よりなる蛋白質の存在を検出することにより行われる、 請求項 1または 2に記載 の方法。
4 . C o c h 1 i nの存在の検出が、 免疫学的方法により行われる、 請求項 1力、ら 3の何れかに記載の方法。
5 . 免疫学的方法が、 抗 C o c h 1 i n N末端フラグメント抗体を用いて 行われる、 請求項 4に記載の方法。
6 . 免疫学的方法が、配列表の配列番号： 1のァミノ酸番号 36〜127で表され るアミノ酸配列中に含まれる抗原決定基を認識する抗体を用いて行われる、 請求 項 4または 5に記載の方法。
7 . 免疫学的方法が、 配列表の配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 6 または配列番号： 7に記載のアミノ酸配列で表されるポリペプチドに含まれる抗 原決定基を認識することを特徴とする抗 C o c h 1 i n N末端フラグメント抗 体を用いて行われる、 請求項 4から 6の何れかに記載の方法。
8 . 配列表の配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列番号： 6または配列番号： 7に記載のアミノ酸配列で表されるポリぺプチドに含まれる抗原決定基を認識す ることを特徴とする抗 C o c h 1 i n N末端フラグメント抗体。
9 . 抗 C o c h 1 i n抗体から成る外リンパ瘻検出用試薬。
1 0 . 抗 C o c h 1 i n抗体が抗 C o c h 1 i n N末端フラグメント抗体 である、 請求項 9に記載の外リンパ瘻検出用試薬。
1 1 . 抗 C o c h 1 i n抗体が配列表の配列番号： 1のアミノ酸番号 36〜127 で表されるアミノ酸配列中に含まれる抗原決定基を認識する抗体である、 請求項 9またま 1 0に記載の外リンパ瘻検出用試薬。
1 2 . 抗 C o c h 1 i n抗体が配列表の配列番号： 2、 配列番号： 5、 配列 番号： 6または配列番号： 7に記載のアミノ酸配列で表されるポリぺプチドに含 まれる抗原決定基を認識することを特徴とする抗 C o c h 1 i n N末端フラグ メント抗体である、請求項 9から 1 1のいずれかに記載の外リンパ瘻検出用試薬。
1 3 . 請求項 9カゝら 1 2の何れかに記載の外リンパ瘻検出用試薬を含む、 外 リンパ瘦検出用試薬キット。
PCT/JP2003/008123 2002-06-27 2003-06-26 外リンパ瘻の検出方法 WO2004003020A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AT03736265T ATE495194T1 (de) 2002-06-27 2003-06-26 Verfahren zum nachweis von perilymphatischen fisteln
AU2003243985A AU2003243985B2 (en) 2002-06-27 2003-06-26 Method for detecting perilymph fistulas
EP03736265A EP1533319B1 (en) 2002-06-27 2003-06-26 Method of detecting perilymphatic fistula
US10/517,778 US7863005B2 (en) 2002-06-27 2003-06-26 Method for detecting perilymphatic fistula
DE60335723T DE60335723D1 (de) 2002-06-27 2003-06-26 Verfahren zum nachweis von perilymphatischen fisteln

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002-187479 2002-06-27
JP2002187479 2002-06-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2004003020A1 true WO2004003020A1 (ja) 2004-01-08

Family

ID=29996788

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2003/008123 WO2004003020A1 (ja) 2002-06-27 2003-06-26 外リンパ瘻の検出方法

Country Status (7)

Country Link
US (1) US7863005B2 (ja)
EP (1) EP1533319B1 (ja)
CN (1) CN100335502C (ja)
AT (1) ATE495194T1 (ja)
AU (1) AU2003243985B2 (ja)
DE (1) DE60335723D1 (ja)
WO (1) WO2004003020A1 (ja)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2692735B1 (en) * 2011-03-31 2017-02-01 Saitama Medical University Antibody reacting with native cochlin-tomoprotein (ctp) and method for measuring ctp using same
CN105238791A (zh) * 2015-11-05 2016-01-13 窦欣童 一种用于检测耳病的试剂盒

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4830024A (en) * 1982-08-16 1989-05-16 Nashner Lewis M Apparatus and method for determining the presence of vestibular perilymph fistulae and other abnormal coupling between the air-filled middle ear and the fluid-filled inner ear
US20020127576A1 (en) * 1997-06-16 2002-09-12 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US6043221A (en) * 1997-07-30 2000-03-28 Amgen Inc. Method for preventing and treating hearing loss using a neuturin protein product
US20030082646A1 (en) * 1998-12-29 2003-05-01 The Regents Of The University Of Michigan Antigenic targets of autoimmune sensorineural hearing loss (AISNHL) and development of tests for diagnosis and management of AISNHL
WO2000071081A2 (en) * 1999-05-26 2000-11-30 Brigham & Women's Hospital Methods of diagnosis and treatment of meniere disease
US6730475B1 (en) * 1999-05-26 2004-05-04 Brigham And Women's Hospital Methods of diagnosis and treatment of meniere disease
US20020004228A1 (en) * 1999-12-09 2002-01-10 Holloway James L. Zvwf1: a member of the von willebrand factor type A domain superfamily

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IKEZONO T. ET AL.: "Identification of the protein product of coch gene (hereditary deafness gene) as the major component of bovine inner ear protein", BIOCHEM. BIOPHYS. ACTA, vol. 1535, no. 3, 2001, pages 258 - 265, XP004277057 *
ROBERTSON N.G. ET AL.: "Inner ear localization of mRNA and protein products of COCH, mutated in the sensorineural deafness and vestibular disorder, DFNA9", HUM. MOL. GENET., vol. 10, no. 22, 2001, pages 2493 - 2500, XP002972247 *
SUSUMU SHINDO ET AL.: "Cochlin kanren tenpaku o mochiita gai-lymph-ro shindan no kokoromi", DAI 104 KAI THE OTO-RHINO-LARYNGOLOGICAL SOCIETY OF JAPAN, INC. SOKAI.GAKUJUTSU KOENKAI YOKOSHU, vol. 106, no. 4, April 2003 (2003-04-01), pages 106 - 401, XP002972246 *

Also Published As

Publication number Publication date
ATE495194T1 (de) 2011-01-15
AU2003243985A1 (en) 2004-01-19
AU2003243985B2 (en) 2009-03-19
CN1665841A (zh) 2005-09-07
DE60335723D1 (de) 2011-02-24
EP1533319A1 (en) 2005-05-25
EP1533319B1 (en) 2011-01-12
US20060246516A1 (en) 2006-11-02
CN100335502C (zh) 2007-09-05
US7863005B2 (en) 2011-01-04
EP1533319A4 (en) 2007-04-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6075881B2 (ja) 乳癌のバイオマーカー
CZ20032787A3 (en) Renal cell carcinoma tumor markers
JP2010502984A (ja) サンプル中の脳脊髄液を検出するための方法およびキット
JP2019060880A (ja) 移植拒絶反応、神経変性疾患又はうつ病と特に関連する潜在的炎症のインビトロ早期検出方法
JP6000239B2 (ja) 未変性Ｃｏｃｈｌｉｎ−ｔｏｍｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＴＰ）に反応する抗体及びそれを用いたＣＴＰの測定方法
EP1424558A1 (en) Reagent for assaying laminin 5 antigen in biological sample and assay method
JP2007319127A (ja) アルツハイマー病の診断方法
WO2011090166A1 (ja) 食道癌マーカー
US7026126B1 (en) Method for detecting megsin protein and use thereof
JP2009085685A (ja) インスリン受容体αサブユニットの測定試薬
JP4172777B2 (ja) 外リンパ瘻の検出方法
WO2004003020A1 (ja) 外リンパ瘻の検出方法
US20240118284A1 (en) Compositions and methods for detecting plxdc1 and plxcd2 in human tissues
JP2014517911A (ja) アディポネクチン受容体ｃ末端フラグメント（ｃｔｆ）免疫グロブリン
JP4560314B2 (ja) 中性アミノ酸トランスポーターによる癌の検出法、及びそのためのキット
JP2000505544A (ja) 肝臓移植レシピエントを含めた個体の肝状態の決定法
US20100047830A1 (en) Compositions and methods for detecting cancers in a subject
JP3504524B2 (ja) 検査方法及び診断キット
JP7106810B2 (ja) 新規肺がんマーカー
EP1956029A1 (en) Vascular aging-predicting factor and utilization of the same
JP4505800B2 (ja) 抗腎タイプｉｖモノクロ−ナル抗体
RU2157540C2 (ru) Способ определения или обнаружения повреждения органа-донора после ксенотрансплантации на основе анализа веществ, полученных из органа-донора
JP2021056148A (ja) 早発卵巣不全を検査する方法

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BG BR BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DZ EC EE ES FI GB GD GE GH GM HR HU ID IL IN IS KE KG KR KZ LC LK LR LS LT LU LV MA MD MG MK MN MW MX MZ NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SK SL SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW

AL Designated countries for regional patents

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): GH GM KE LS MW MZ SD SL SZ TZ UG ZM ZW AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HU IE IT LU MC NL PT RO SE SI SK TR BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

DFPE Request for preliminary examination filed prior to expiration of 19th month from priority date (pct application filed before 20040101)
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 20038151723

Country of ref document: CN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003243985

Country of ref document: AU

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2003736265

Country of ref document: EP

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 2003736265

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2006246516

Country of ref document: US

Ref document number: 10517778

Country of ref document: US

WWP Wipo information: published in national office

Ref document number: 10517778

Country of ref document: US