CN105238791A - 一种用于检测耳病的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种耳病检测的试剂盒。本发明提供的核酸适体,与人COCH蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体,可以捕获中耳溶液中的人COCH蛋白,将其制备成为相应的试剂盒,将用于耳病的筛查。利用本发明的试剂盒,具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测耳病的试剂盒及其检测方法。
背景技术
外淋巴瘘(Perilymphfistula)是存在于内耳组织的外淋巴由内耳窗(圆窗、卵圆窗其中之一或两者)或前窗小裂(内耳与外耳之间的骨裂隙)向鼓室内(中耳)漏出,从而产生听觉、平衡感障碍的疾病,其发生原因可能是先天性畸形、梅毒、镫骨手术、头部外伤(包括气压伤)、特发性(原因不明)等。已知例如由擤鼻涕、喷嚏、咳、憋劲、潜水、登山、外伤等日常生活中通常进行的行动所产生的脑脊液压、内耳压急剧变化而引起,是在急性感音性耳聋或眩晕·平衡障碍中占一定比例的疾病。
但一直以来,该外淋巴瘘的诊断是按照诊断基准,通过综合检查生理学诊察、症状、病史等的方法进行的,因此有很多不确定的情况,另外,为确诊而选择进行的鼓室开放术对患者的侵袭度也成为一个问题。并且,即使进行鼓室开放术,也无法通过目视确认外淋巴的漏出,有很多不能确诊的病例。
COCH是作为遗传性无综合征耳聋DFNA9的原因基因而鉴定出的基因,由该基因编码的COCH蛋白被命名为Cochlin。以存在于被疑为罹患外淋巴瘘患者中耳中的体液为试样,以该试样中的Cochlin的存在作为指标,可以检测外淋巴瘘。
核酸适体(Aptamer,又称适配体,适配子)是能高亲和性、高特异性的结合某种生物革El标的单链寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1cEvolut1onofL1gandsbyExponent1alenr1chment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似,具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力,但与抗体相比具有很多优良的特性,如分子量小,能批量生产,不易失活,无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性,在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异结合COCH的核酸适体及其试剂盒。
本发明提供的核酸适体,是序列表的序列1-16所示的单链DNA。
所述核酸适体与COCH蛋白具有较好的亲和能力。
还可将所述核酸适体进行修饰或改造,得到所述核酸适体的衍生物。
所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种:
a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸,得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物;
b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰,得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物;
c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架,得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物;
d)将核酸适体改造为肽核酸,得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物;
e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后,得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。
所述核酸适体可用于制备检测COCH的试剂盒。
利用本发明的核酸适体,可以捕获中耳中的体液中的COCH,从而用于相关耳病筛查。利用本发明的核酸适体,具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明,但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。
实施例1、COCH蛋白的获得
通过筛选,得到了COCH蛋白序列,如下所示:ThrArgGlyLeuAspIleArgLysGluLysAlaAspValLeuCysProGlyGlyCysProLeuGluGluPheSerValTyrGlyAsnIleValTyrAlaSerValSerSerIleCysGlyAlaAlaValHisArgGlyValIleSerAsnSerGlyGlyProValArgValTyrSerLeuProGlyArgGluAsnTyrSerSerValAspAlaAsnGlyIleGlnSerGlnMetLeuSerArgTrpSerAlaSerPheThrValThrLysGlyLysSer。将上述的多肽通过本领域常规的真核表达方式进行表达,获得了相应的目的多肽。
实施例2核酸适体的筛选和制备
设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括40个核苷酸的随机核酸文库如下:
5‘-AATCGATTGGACATCGATGAC(N40)TGACAAGGGTCATTCATGAAC-3’;N40代表40个随机核苷酸。
将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化;以回收的双链DNA为模板,体外转录出单链RNA随机文库,转录产物经PAGE纯化。75μgRNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子,然后与2ugCOCH蛋白,37°C孵育30min,反应液经硝酸纤维素膜滤过,洗涤滤膜;然后将滤膜剪碎,置于洗脱缓冲液(6mol/L尿素,0.55mol/L醋酸铵,l.5mmol/LEDTA,0.15%SDS)中煮沸5min,离心,取上清,无水乙醇沉淀RNA,并重新溶解于20μ1DEPC水中;以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA,体外转录出RNA文库用于下一轮筛选;每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库,以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库,筛选共进行10轮。得到了16个适配子,其序列分别为SEQIDNO:1-16所示。具体序列如下所示:
COCH-1:AATCGATTGGACATCGATGACTATATTACGAATACTCCTCCGATCGCCACTTATAATTTTTTGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:1)
COCH-2:AATCGATTGGACATCGATGACCTATAATATGCCAACGCCATTCACCATCCCTACCTTAATATGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:2)
COCH-3:AATCGATTGGACATCGATGACCATCACATCACCCACCTTATTAACACAGACCTACCTTATTTGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:3)
COCH-4:AATCGATTGGACATCGATGACTCACCTCGACATTACACAATACATGTCATCCCCATACACATGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:4)
COCH-5:AATCGATTGGACATCGATGACTCCGCCATACACACCAGACCACTCGCTCTTCCTTATTTTCTGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:5)
COCH-6:AATCGATTGGACATCGATGACCTAACTACTATACTAACCGCCCTCTTAGAATTTATCCACATGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:6)
COCH-7:AATCGATTGGACATCGATGACACCTCTCGCACATACCTTATTCTATCAAAATATAGAACAATGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:7)
COCH-8:AATCGATTGGACATCGATGACCAAGAATATACAAAACCGCAACACGCTCCTCTCCACTCCTTGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:8)
COCH-9:AATCGATTGGACATCGATGACTCACACCTATAGAATTCGCCTCCCATACACCGCCTACAATTGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:9)
COCH-10:AATCGATTGGACATCGATGACACACTCACTATTCGCTATATCGCTACCTATATACCTGATATGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:10)
COCH-11:AATCGATTGGACATCGATGACATACTCTATAACTATTACTCGCTAAGAACCCATAACAACATGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:11)
COCH-12:AATCGATTGGACATCGATGACACACACAACGCCCTCACATACACCGCCACAATTCTAACAATGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:12)
COCH-13:AATCGATTGGACATCGATGACTATCCGAATTACCCTTTATTACATCGCTAATTACGATCCATGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:13)
COCH-14:AATCGATTGGACATCGATGACTATACAACCATTACAGAACCTAGTATTACACATACGCTATTGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:14)
COCH-15:AATCGATTGGACATCGATGACAGACATACGCTATCTATACCTATTACTTACCTAGATACTTTGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:15)
COCH-16:AATCGATTGGACATCGATGACCTACTACTACGCCTCTCGCTATTACTCCTCATAAGATCCATGACAAGGGTCATTCATGAAC(SEQIDNO:16)
实施例3蛋白结合适配子的性能测定
将适配子分别取2.0μg,用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)37°C消化lh,纯化回收去磷酸化的RNA;通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的适配子分别与不同浓度(1-200nM)的COCH37°C孵育30min,各组反应液经硝酸纤维素膜滤过,洗涤滤膜,干燥滤膜,液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量,同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与leptin的解离常数。结果如下:
名称 | 解离常数Kd(单位nM) |
COCH-1 | 11.3 |
COCH-2 | 12.1 |
COCH-3 | 13.0 |
COCH-4 | 12.9 |
COCH-5 | 12.8 |
COCH-6 | 12.7 |
COCH-7 | 13.1 |
COCH-8 | 13.2 |
COCH-9 | 12.7 |
COCH-10 | 12.5 |
COCH-11 | 12.6 |
COCH-12 | 12.4 |
COCH-13 | 13.0 |
COCH-14 | 13.1 |
COCH-15 | 12.8 |
COCH-16 | 12.7 |
PBS空白对照 | 无结合能力 |
实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析
分别采用人血白蛋白,免疫血清球蛋白,霍乱弧菌VgrG3C蛋白,大肠杆菌外膜蛋白A,leptin,COCH蛋白,与16条适配子进行特异性检测,经过结合试验发现,这些适配子都不与这些蛋白相结合,而只与COCH结合保持较高的特异性。
将所述的适配子,取0.2ug,分别置于常温的血清、水溶液中,放置二周。通过RT-PCR检测,发现二周的放置其结构稳定,没有被降解。
实施例5所述适配子疾病的诊断
将16个适配子分别与11个外淋巴瘘患者以及正常人的血液混合30min,通过生物素分离,定量分析其中的COCH蛋白的含量,通过分析发现,11个外淋巴瘘患者中COCH蛋白的含量显著增加,在正常人血液中继续没有检测到COCH。
以上仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
〈110〉窦欣童
〈120〉一种用于检测耳病的试剂盒
〈160〉16
〈210〉1
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-1
AATCGATTGGACATCGATGACTATATTACGAATACTCCTCCGATCGCCACTTATAATTTTTTGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉2
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-2
AATCGATTGGACATCGATGACCTATAATATGCCAACGCCATTCACCATCCCTACCTTAATATGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉3
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-3
AATCGATTGGACATCGATGACCATCACATCACCCACCTTATTAACACAGACCTACCTTATTTGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉4
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-4
AATCGATTGGACATCGATGACTCACCTCGACATTACACAATACATGTCATCCCCATACACATGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉5
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-5
AATCGATTGGACATCGATGACTCCGCCATACACACCAGACCACTCGCTCTTCCTTATTTTCTGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉6
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-6
AATCGATTGGACATCGATGACCTAACTACTATACTAACCGCCCTCTTAGAATTTATCCACATGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉7
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-7
AATCGATTGGACATCGATGACACCTCTCGCACATACCTTATTCTATCAAAATATAGAACAATGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉8
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-8
AATCGATTGGACATCGATGACCAAGAATATACAAAACCGCAACACGCTCCTCTCCACTCCTTGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉9
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-9
AATCGATTGGACATCGATGACTCACACCTATAGAATTCGCCTCCCATACACCGCCTACAATTGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉10
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-10
AATCGATTGGACATCGATGACACACTCACTATTCGCTATATCGCTACCTATATACCTGATATGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉11
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-11
AATCGATTGGACATCGATGACATACTCTATAACTATTACTCGCTAAGAACCCATAACAACATGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉12
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-12
AATCGATTGGACATCGATGACACACACAACGCCCTCACATACACCGCCACAATTCTAACAATGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉13
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-13
AATCGATTGGACATCGATGACTATCCGAATTACCCTTTATTACATCGCTAATTACGATCCATGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉14
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-14
AATCGATTGGACATCGATGACTATACAACCATTACAGAACCTAGTATTACACATACGCTATTGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉15
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-15
AATCGATTGGACATCGATGACAGACATACGCTATCTATACCTATTACTTACCTAGATACTTTGACAAGGGTCATTCATGAAC
〈210〉16
〈211〉82
〈212〉DNA
〈213〉人工序列
〈400〉COCH-16
AATCGATTGGACATCGATGACCTACTACTACGCCTCTCGCTATTACTCCTCATAAGATCCATGACAAGGGTCATTCATGAAC
Claims (4)
1.一种用于耳病检测的试剂盒,其含有能与Cochlin蛋白特异性结合的核酸适体。
2.如权利要求1所述的试剂盒,其特征在于:所述核酸适体的序列为SEQIDNo:1-16任一所述。
3.一种检测耳病的方法,其特征在于利用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。
4.如权利要求1-2任一项所述的试剂盒,其特征在于:所述耳病为外淋巴瘘。
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