CN105238791A - 一种用于检测耳病的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耳病检测的试剂盒。本发明提供的核酸适体，与人COCH蛋白具有较好的亲和能力。利用本发明的核酸适体，可以捕获中耳溶液中的人COCH蛋白，将其制备成为相应的试剂盒，将用于耳病的筛查。利用本发明的试剂盒，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。

Description

一种用于检测耳病的试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测耳病的试剂盒及其检测方法。

背景技术

外淋巴瘘(Perilymphfistula)是存在于内耳组织的外淋巴由内耳窗(圆窗、卵圆窗其中之一或两者)或前窗小裂(内耳与外耳之间的骨裂隙)向鼓室内(中耳)漏出，从而产生听觉、平衡感障碍的疾病，其发生原因可能是先天性畸形、梅毒、镫骨手术、头部外伤(包括气压伤)、特发性(原因不明)等。已知例如由擤鼻涕、喷嚏、咳、憋劲、潜水、登山、外伤等日常生活中通常进行的行动所产生的脑脊液压、内耳压急剧变化而引起，是在急性感音性耳聋或眩晕·平衡障碍中占一定比例的疾病。

但一直以来，该外淋巴瘘的诊断是按照诊断基准，通过综合检查生理学诊察、症状、病史等的方法进行的，因此有很多不确定的情况，另外，为确诊而选择进行的鼓室开放术对患者的侵袭度也成为一个问题。并且，即使进行鼓室开放术，也无法通过目视确认外淋巴的漏出，有很多不能确诊的病例。

COCH是作为遗传性无综合征耳聋DFNA9的原因基因而鉴定出的基因，由该基因编码的COCH蛋白被命名为Cochlin。以存在于被疑为罹患外淋巴瘘患者中耳中的体液为试样，以该试样中的Cochlin的存在作为指标，可以检测外淋巴瘘。

核酸适体（Aptamer,又称适配体,适配子）是能高亲和性、高特异性的结合某种生物革El标的单链寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸适体是通过指数富集配体系统进化技术(Systemat1cEvolut1onofL1gandsbyExponent1alenr1chment,SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链DNA/RNA。已报道核酸适体的靶标包括金属离子、有机小分子、多肽、蛋白质、细胞甚至组织等。核酸适体的分子识别功能与抗体类似，具有与抗体分子相当甚至更强的靶标识别能力，但与抗体相比具有很多优良的特性，如分子量小，能批量生产，不易失活，无免疫原性、容易合成与标记、快速的穿透组织、良好的代谢动力学、不同批次之间产品不会存在差异和具有很好化学稳定性，在生物检测、疾病诊断治疗等领域具有重要的应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异结合COCH的核酸适体及其试剂盒。

本发明提供的核酸适体，是序列表的序列1-16所示的单链DNA。

所述核酸适体与COCH蛋白具有较好的亲和能力。

还可将所述核酸适体进行修饰或改造，得到所述核酸适体的衍生物。

所述核酸适体的衍生物可为如下任意一种：

a)将所述核酸适体删除部分或增加部分互补的核苷酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

b)将所述核酸适体进行核苷酸取代或部分修饰，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

c)将所述核酸适体的骨架改造为硫代磷酸酯骨架，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

d)将核酸适体改造为肽核酸，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物；

e)将所述核酸适体连接上荧光、放射性和治疗性物质后，得到的与所述核酸适体具有相同功能的核酸适体的衍生物。

所述核酸适体可用于制备检测COCH的试剂盒。

利用本发明的核酸适体，可以捕获中耳中的体液中的COCH，从而用于相关耳病筛查。利用本发明的核酸适体，具有高灵敏、成本低、易制备、易保存的优点。本发明具有很高的应用价值。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、COCH蛋白的获得

通过筛选，得到了COCH蛋白序列，如下所示：ThrArgGlyLeuAspIleArgLysGluLysAlaAspValLeuCysProGlyGlyCysProLeuGluGluPheSerValTyrGlyAsnIleValTyrAlaSerValSerSerIleCysGlyAlaAlaValHisArgGlyValIleSerAsnSerGlyGlyProValArgValTyrSerLeuProGlyArgGluAsnTyrSerSerValAspAlaAsnGlyIleGlnSerGlnMetLeuSerArgTrpSerAlaSerPheThrValThrLysGlyLysSer。将上述的多肽通过本领域常规的真核表达方式进行表达，获得了相应的目的多肽。

实施例2核酸适体的筛选和制备

设计两端包含大约20个核苷酸、中间包括40个核苷酸的随机核酸文库如下：

5‘-AATCGATTGGACATCGATGAC(N40)TGACAAGGGTCATTCATGAAC-3’；N40代表40个随机核苷酸。

将单链DNA文库扩增为双链DNA,产物经2%琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化；以回收的双链DNA为模板，体外转录出单链RNA随机文库，转录产物经PAGE纯化。75μgRNA文库经硝酸纤维素膜反筛去除与膜结合的RNA分子，然后与2ugCOCH蛋白，37°C孵育30min，反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜；然后将滤膜剪碎，置于洗脱缓冲液（6mol/L尿素，0.55mol/L醋酸铵，l.5mmol/LEDTA,0.15%SDS)中煮沸5min，离心，取上清，无水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20μ1DEPC水中；以RNA为模板RT-PCR扩增双链DNA，体外转录出RNA文库用于下一轮筛选；每轮筛选过程中RT-PCR得到双链DNA文库，以该双链DNA为模板体外转录出RNA适配子库，筛选共进行10轮。得到了16个适配子，其序列分别为SEQIDNO:1-16所示。具体序列如下所示：

COCH-1：AATCGATTGGACATCGATGACTATATTACGAATACTCCTCCGATCGCCACTTATAATTTTTTGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：1）

COCH-2：AATCGATTGGACATCGATGACCTATAATATGCCAACGCCATTCACCATCCCTACCTTAATATGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：2）

COCH-3：AATCGATTGGACATCGATGACCATCACATCACCCACCTTATTAACACAGACCTACCTTATTTGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：3）

COCH-4：AATCGATTGGACATCGATGACTCACCTCGACATTACACAATACATGTCATCCCCATACACATGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：4）

COCH-5：AATCGATTGGACATCGATGACTCCGCCATACACACCAGACCACTCGCTCTTCCTTATTTTCTGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：5）

COCH-6：AATCGATTGGACATCGATGACCTAACTACTATACTAACCGCCCTCTTAGAATTTATCCACATGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：6）

COCH-7：AATCGATTGGACATCGATGACACCTCTCGCACATACCTTATTCTATCAAAATATAGAACAATGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：7）

COCH-8：AATCGATTGGACATCGATGACCAAGAATATACAAAACCGCAACACGCTCCTCTCCACTCCTTGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：8）

COCH-9：AATCGATTGGACATCGATGACTCACACCTATAGAATTCGCCTCCCATACACCGCCTACAATTGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：9）

COCH-10：AATCGATTGGACATCGATGACACACTCACTATTCGCTATATCGCTACCTATATACCTGATATGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：10）

COCH-11：AATCGATTGGACATCGATGACATACTCTATAACTATTACTCGCTAAGAACCCATAACAACATGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：11）

COCH-12：AATCGATTGGACATCGATGACACACACAACGCCCTCACATACACCGCCACAATTCTAACAATGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：12）

COCH-13：AATCGATTGGACATCGATGACTATCCGAATTACCCTTTATTACATCGCTAATTACGATCCATGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：13）

COCH-14：AATCGATTGGACATCGATGACTATACAACCATTACAGAACCTAGTATTACACATACGCTATTGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：14）

COCH-15：AATCGATTGGACATCGATGACAGACATACGCTATCTATACCTATTACTTACCTAGATACTTTGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：15）

COCH-16：AATCGATTGGACATCGATGACCTACTACTACGCCTCTCGCTATTACTCCTCATAAGATCCATGACAAGGGTCATTCATGAAC（SEQIDNO：16）

实施例3蛋白结合适配子的性能测定

将适配子分别取2.0μg，用牛小肠碱性磷酸酶（CIP)37°C消化lh，纯化回收去磷酸化的RNA；通过T4多核苷酸激酶标记[γ-32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。10nmol放射性标记的适配子分别与不同浓度（1-200nM)的COCH37°C孵育30min，各组反应液经硝酸纤维素膜滤过，洗涤滤膜，干燥滤膜，液闪计数仪测定滤膜上残留的放射量，同一样品平行做两次测定。计算各个适配子与leptin的解离常数。结果如下：

名称	解离常数Kd(单位nM)
		COCH-1	11.3
COCH-2	12.1
		COCH-3	13.0
COCH-4	12.9
		COCH-5	12.8
COCH-6	12.7
		COCH-7	13.1
COCH-8	13.2
		COCH-9	12.7
COCH-10	12.5
		COCH-11	12.6
COCH-12	12.4
		COCH-13	13.0
COCH-14	13.1
		COCH-15	12.8
COCH-16	12.7
		PBS空白对照	无结合能力

实施例4所述适配子特异性分析以及稳定性分析

分别采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍乱弧菌VgrG3C蛋白，大肠杆菌外膜蛋白A，leptin，COCH蛋白，与16条适配子进行特异性检测，经过结合试验发现，这些适配子都不与这些蛋白相结合，而只与COCH结合保持较高的特异性。

将所述的适配子，取0.2ug，分别置于常温的血清、水溶液中，放置二周。通过RT-PCR检测，发现二周的放置其结构稳定，没有被降解。

实施例5所述适配子疾病的诊断

将16个适配子分别与11个外淋巴瘘患者以及正常人的血液混合30min，通过生物素分离，定量分析其中的COCH蛋白的含量，通过分析发现，11个外淋巴瘘患者中COCH蛋白的含量显著增加，在正常人血液中继续没有检测到COCH。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

〈110〉窦欣童

〈120〉一种用于检测耳病的试剂盒

〈160〉16

〈210〉1

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-1

AATCGATTGGACATCGATGACTATATTACGAATACTCCTCCGATCGCCACTTATAATTTTTTGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉2

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-2

AATCGATTGGACATCGATGACCTATAATATGCCAACGCCATTCACCATCCCTACCTTAATATGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉3

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-3

AATCGATTGGACATCGATGACCATCACATCACCCACCTTATTAACACAGACCTACCTTATTTGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉4

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-4

AATCGATTGGACATCGATGACTCACCTCGACATTACACAATACATGTCATCCCCATACACATGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉5

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-5

AATCGATTGGACATCGATGACTCCGCCATACACACCAGACCACTCGCTCTTCCTTATTTTCTGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉6

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-6

AATCGATTGGACATCGATGACCTAACTACTATACTAACCGCCCTCTTAGAATTTATCCACATGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉7

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-7

AATCGATTGGACATCGATGACACCTCTCGCACATACCTTATTCTATCAAAATATAGAACAATGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉8

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-8

AATCGATTGGACATCGATGACCAAGAATATACAAAACCGCAACACGCTCCTCTCCACTCCTTGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉9

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-9

AATCGATTGGACATCGATGACTCACACCTATAGAATTCGCCTCCCATACACCGCCTACAATTGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉10

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-10

AATCGATTGGACATCGATGACACACTCACTATTCGCTATATCGCTACCTATATACCTGATATGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉11

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-11

AATCGATTGGACATCGATGACATACTCTATAACTATTACTCGCTAAGAACCCATAACAACATGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉12

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-12

AATCGATTGGACATCGATGACACACACAACGCCCTCACATACACCGCCACAATTCTAACAATGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉13

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-13

AATCGATTGGACATCGATGACTATCCGAATTACCCTTTATTACATCGCTAATTACGATCCATGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉14

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-14

AATCGATTGGACATCGATGACTATACAACCATTACAGAACCTAGTATTACACATACGCTATTGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉15

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-15

AATCGATTGGACATCGATGACAGACATACGCTATCTATACCTATTACTTACCTAGATACTTTGACAAGGGTCATTCATGAAC

〈210〉16

〈211〉82

〈212〉DNA

〈213〉人工序列

〈400〉COCH-16

AATCGATTGGACATCGATGACCTACTACTACGCCTCTCGCTATTACTCCTCATAAGATCCATGACAAGGGTCATTCATGAAC

Claims (4)

1.一种用于耳病检测的试剂盒，其含有能与Cochlin蛋白特异性结合的核酸适体。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述核酸适体的序列为SEQIDNo：1-16任一所述。

3.一种检测耳病的方法，其特征在于利用权利要求1-2任一项所述的试剂盒。

4.如权利要求1-2任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述耳病为外淋巴瘘。