CN114716558A - 一种双特异性抗体及其治疗癌症的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双特异性抗体及其治疗癌症的应用，包括特异性结合第一抗原的第一抗原结合域和特异性结合第二抗原的第二抗原结合域，第一抗原为CD19，第二抗原为CD3，其中靶向CD19的第一抗原结合域能够与目标抗原高亲和力结合，提高肿瘤细胞识别的靶向性，而靶向CD3的第二抗原结合域却选择了具有中等亲和力的单域抗体结构，不仅能够有效介导T细胞免疫应答，还能够防止双特异性抗体聚集于体内脾脏、淋巴结等T细胞富集的组织中而影响抗肿瘤效果；选用具有轻链和重链结构的传统抗体结构域，与单域抗体结构域组合，可延长双特异性抗体的体内半衰期，提高抗肿瘤活性；此外，本发明中所提供的双特异性抗体还能够降低治疗过程中过度的免疫因子分泌，有助于降低毒副作用。

Description

一种双特异性抗体及其治疗癌症的应用

技术领域：

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体提供了一种双特异性抗体及其治疗癌症的应用。

背景技术：

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的、难治愈性疾病之一，在我国也呈现逐年上升的趋势，在已知的恶性肿瘤中白血病、淋巴瘤、骨髓瘤等血液肿瘤的治疗越来越受到人们的重视。血液肿瘤细胞多起源于骨髓，通常认为是由于部分未成熟的血细胞前体细胞不受控制的快速克隆性增殖并累积而导致，还可影响其他正常非造血组织和器官中细胞的生长增殖，其临床表现包括发热，感染，不同程度贫血，肝、脾、淋巴结肿大，骨关节疼痛以及造血功能紊乱引起的并发症。血液肿瘤可分为多种类型，以白血病为例，按照细胞分型和病程发展速度，可以分为急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)、急性淋巴系白血病(Acute lymphocytic leukemia,ALL)、慢性髓系白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)、慢性淋巴系白血病(Chronic lymphocytic leukemia,CLL)等不同类型。白血病通常具有难治愈性，例如AML发病迅速、难治疗性高、易复发，目前临床上治疗AML的方式包括化学药物治疗、放射治疗、骨髓移植、肿瘤免疫治疗等等，但是常规疗法的治疗效果却差强人意，以目前广泛采用的AML初期标准治疗方案为例，即患者持续静脉滴注阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C)7天，同时联合蒽环类抗生素如伊达比星(Idarubicin)、柔红霉素(Daunorubicin，DNR)和米托蒽醌(mitoxantrone)持续静脉滴注3天，从而构成7+3治疗方案，这种方案患者的完全缓解率仅为33.3％；据报道，Idhifa、Vyxeos、Venetoclax等新型靶向药物的完全缓解率也为30-40％，难以取得令人满意的疗效。嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T细胞)是近年来迅速发展起来的免疫治疗方法，采用该方法可使得患者完全缓解率大幅提升至50％以上，但是这种方式却面临免疫因子风暴、脱靶效应、基因插入风险、神经毒性高等困境。因此，开发一种有效性高、靶向性好、副作用可控的血液肿瘤治疗药物仍然是肿瘤研究的当务之急。

双特异性抗体(bispecific antibody，BsAb，简称双抗)是指一个抗体分子可以与两个不同抗原或同一抗原的两个不同抗原表位相结合，双抗的概念于上世纪60年代提出，但由于受到生物工程技术和基因技术的限制，直到近十年才取得了突破性进步，2009年，欧洲医药管理局批准了靶向EpCAM和CD3的双抗catumaxomab用于恶性腹水治疗，成为首个被批准的双抗药物；2014年，美国食品药物管理局批准靶向CD19和CD3的双抗blinatumomab，用于治疗急性淋巴白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)中最常见的费城染色体阴性的复发或难治的前体B细胞急性淋巴细胞白血病(precursor B-cell lymphoblasticleukemia，BCP-ALL)，随后进一步拓展为包括费城染色体阳性的复发或难治的BCP-ALL。值得注意的是，除具有轻链和重链结构的传统抗体外，双特异性纳米抗体(bispecificnanobody，BsNb)也被开发出来，这种双抗具有更强的特异性、靶向性和更低的脱靶毒性的特点，并且与靶标抗原的结合力得到增强和血清半衰期也得到延长，使得其在感染、肿瘤及免疫领域诊断与治疗中已成为研究热点。

CD19是最常用的抗白血病治疗靶点之一，其为B细胞表面的跨膜蛋白，主要生物学功能是与CD21和CD81形成复合物，在识别抗原时构成B细胞双重抗原结合模型，参与B细胞中钙离子的转运，调节B细胞的活化与增殖。CD19多表达于B细胞肿瘤细胞表面，但不表达于其他正常组织，这使得它成为了理想的抗肿瘤靶点。以blinatumomab为代表的多个靶向CD19的单抗或双抗抗体药物已被开发出来，并在临床治疗中觉得了较好的治疗效果，使得CD19成为抗肿瘤“明星靶点”，相关研究成逐年攀升状态，如WO2022002154A1、WO2021165248A1、CN111944051A、EP3962948A1等专利申请中均提供了靶向CD19的抗体药物。

T细胞表面的白细胞分化簇3(cluster of differentiation 3，CD3)可介导T细胞活化和募集T细胞至肿瘤靶标细胞周围，这使得CD3双特异性抗体(CD3-BsAbs)成为癌症免疫治疗领域中一种新兴的治疗方式。CD3-BsAbs通过同时结合肿瘤细胞上表达的肿瘤相关抗原(TAA)和T细胞上的CD3发挥作用，CD3-BsAbs将这两种细胞类型交联允许形成免疫突触，类似于天然T细胞受体(TCR)/肽-主要组织相容性复合物(MHC)复合物，这种突触既能够特异性结合肿瘤靶细胞，又能够有效诱导T细胞活化，从而导致炎症细胞因子和溶细胞分子的分泌，这些分子能够在此过程中杀死肿瘤细胞，从而发挥多重抗肿瘤作用。CD3-BsAb疗法是一种被动形式的免疫疗法，与表达嵌合抗原受体转基因的T细胞的过继细胞治疗具有类似的亲缘关系，CAR由直接连接到细胞内CD3ζ链的TAA结合域和来自共刺激受体(例如4-1BB)组成，从而在抗原识别时激活T细胞。CD3-BsAbs和CAR T细胞在许多方面都相似：两者都针对表面TAA，都利用T细胞效应功能，并且都成功地用于临床治疗血液系统恶性肿瘤，并显示出相似类型的毒性特征。但与CD3-BsAbs相比，目前临床批准的CAR-T细胞的一些缺点是：(1)患者需要在输注CAR-T细胞之前进行淋巴清扫，(2)必须为每个患者单独生产CAR-T细胞，而CD3-BsAbs可以作为现成的可大规模生产的治疗药物，(3)CAR-T细胞在肿瘤被清除后留在患者体内，导致在靶向CD19的CAR-T细胞存在情况下持续B细胞耗竭，而CD3-BsAbs随着时间的推移从血液中清除。由此可见CD3-BsAb相比于CAR-T细胞具有更多的临床使用优势。

本申请提供了一种新型靶向CD19和CD3的双特异性抗体，该抗体能够高效识别肿瘤细胞，有效募集T细胞，发挥强大的肿瘤杀伤作用；该双特异性抗体采用传统抗体结构与纳米抗体结构相结合的形式，既能够延长抗体在体内半衰期，又可能降低免疫因子风暴的风险，同时提高治疗的安全性和有效性；该双特异性抗体在治疗血液瘤方面，具有一定的广谱性，对多种血液肿瘤细胞具有杀伤作用，为相应抗肿瘤药物的开发提供了新途径。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明中提供了一种双特异性抗体，包括：特异性结合第一抗原的第一抗原结合域和特异性结合第二抗原的第二抗原结合域；所述第一抗原为CD19，第一抗原结合域包括如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，如SEQ IDNO:3所示的HCDR3，如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ IDNO:6所示的LCDR3；所述第二抗原为CD3，第二抗原结合域为单域抗原结合域，包括如SEQ IDNO:7所示的CDR1，如SEQ ID NO:8所示的CDR2，如SEQ ID NO:9所示的CDR3。

现有技术中提出了多种CD3-BsAb，本发明中选择使用CD19靶点与CD3靶点配合，开发用于治疗白血病、淋巴瘤和骨髓瘤等血液肿瘤的新型双特异性抗体。该抗体具有全新的CDR区，其中靶向CD19的第一抗原结合域能够与目标抗原高亲和力结合，提高肿瘤细胞识别的靶向性，而靶向CD3的第二抗原结合域却选择使用了具有中等亲和力的单域抗体结构，不仅能够有效介导T细胞免疫应答，还能够防止双特异性抗体聚集于体内脾脏、淋巴结等T细胞富集的组织中而影响抗肿瘤效果；选用具有轻链和重链结构的传统抗体结构域，与单域抗体结构域组合，可延长双特异性抗体的体内半衰期，提高抗肿瘤活性；此外，本发明中所提供的双特异性抗体还能够降低治疗过程中的免疫因子分泌，有助于降低毒副作用。

进一步的，第一抗原结合域包括如SEQ ID NO:10所示的重链可变区。

进一步的，第一抗原结合域包括如SEQ ID NO:11所示的轻链可变区。

进一步的，第二抗原结合域包括如SEQ ID NO:12所示的单域可变区。

进一步的，其中所述双特异性抗体是IgG1抗体。

提供了一种核苷酸，编码所述的双特异性抗体。

提供了一种药物组合物，其包含所述的双特异性抗体。

提供了一种所述双特异性抗体或所述核苷酸或所述药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

进一步的，所述肿瘤选自淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。

CD19是一种在恶性肿瘤中广泛表达的靶点，据报道它与白血病、淋巴瘤、急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴性白血病(ALL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性淋巴性白血病(CLL)、骨髓增生异常综合征、B细胞急性淋巴性白血病(BALL)、T细胞急性淋巴性白血病(TALL)、B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤、伯基特氏淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、小细胞-或大细胞滤泡性淋巴瘤、恶性淋巴组织增生性疾病、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、多发性骨髓瘤、脊髓发育不良、骨髓增生异常综合征、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突状细胞瘤、和华氏巨球蛋白血症等多种血液肿瘤相关；除血液肿瘤之外，CD19也与肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、乳腺癌、淋巴癌、结肠癌、肾癌、尿路上皮癌、前列腺癌、咽癌、直肠癌、肾细胞癌、小肠癌、食管癌、黑色素瘤、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑色素瘤、子宫癌、卵巢癌、结直肠癌、肛门区癌、腹膜癌、胃癌、食管癌、唾液腺癌、睾丸癌、子宫癌、输卵管癌、子宫内膜癌、宫颈癌、阴道癌、外阴癌、阴茎癌、恶性胶质瘤、成神经细胞瘤、宫颈癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、儿童实体瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤(CNS)、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质细胞瘤、垂体腺瘤、卡波济氏肉瘤、神经内分泌瘤(包括类癌瘤、胃泌素瘤、和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌等实体肿瘤相关。因此，本发明中所提供的双特异性抗体可用于治疗多种血液肿瘤和实体肿瘤。

有益效果

本发明提供了一种靶向CD19和CD3的新型双特异性抗体，具有全新的CDR区，其中靶向CD19的第一抗原结合域能够与目标抗原高亲和力结合，提高肿瘤细胞识别的靶向性，而靶向CD3的第二抗原结合域却选择了具有中等亲和力的单域抗体结构，不仅能够有效介导T细胞免疫应答，还能够防止双特异性抗体聚集于体内脾脏、淋巴结等T细胞富集的组织中而影响抗肿瘤效果；选用具有轻链和重链结构的传统抗体结构域，与单域抗体结构域组合，可延长双特异性抗体的体内半衰期，提高抗肿瘤活性；此外，本发明中所提供的双特异性抗体还能够降低治疗过程中过度的免疫因子分泌，有助于降低毒副作用。

附图说明

图1：双特异性抗体结构示意图

图2：双特异性抗体对THP-1细胞的杀伤作用；

图3：双特异性抗体对NALM6细胞的杀伤作用；

图4：双特异性抗体对NCI-H929细胞的杀伤作用；

图5：双特异性抗体对OCI-Ly7细胞的杀伤作用；

图6：双特异性抗体药代动力学研究；

图7：动物体内肿瘤体积变化；

图8：TNF-α表达水平变化图；

图9：IFN-γ表达水平变化图。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。

以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1 CD3单域抗体制备

选取健康成年羊驼，将重组人源CD3抗原(本实验室保存)与弗氏完全佐剂按1:1的比例混匀，背部皮下多点注射免疫羊驼，共免疫四次，免疫间隔为2周。免疫成功之后采集羊驼外周血10mL，用于构建噬菌体展示文库。

将采集到的羊驼外周血利用淋巴细胞分离液试剂盒(Sigma-Aldrich)分离淋巴细胞；取1×10⁷个细胞，采用Trizol法提取总RNA，步骤为：向含有淋巴细胞的EP管中加入1mLTrizol(购自Sigma公司)，反复吹打，置冰上放置5分钟；加入250μL氯仿，涡旋30秒后继续置冰上放置5分钟；4℃，12000g离心15分钟，吸取水相转入新的EP管中；加入等量异丙醇，置冰上放置10分钟；4℃，12000g离心10分钟，弃上清；用1mL预冷的70％乙醇洗涤，4℃，7500g离心5分钟，弃上清并干燥5分钟；加入30μL RNase-free水溶解沉淀，得到总RNA。以所述总RNA为模板，使用逆转录试剂盒(购自Roche公司)将其转化为cDNA，然后通过两轮PCR反应扩增和富集cDNA，并在产物两端引入Pst I和Not I酶切位点。通过酶切、连接反应将目标核酸分子连接至pMECS载体上，通过电转化法将携带有目标核酸的载体转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，PCR法筛选阳性克隆并保存于-20℃冰箱中。

取上述冻存的感受态细胞，复苏后接种于YT-AG培养基，培养至对数生长期后，加入VCSM13噬菌体，37℃静止感染60min；常温4000rpm离心10分钟，弃去上清，使用含氨苄青霉素和卡那霉素的YT-AK培养基重悬菌体，37℃200rpm培养过夜；离心取上清置于50mL离心管中，加入PEG/NaCl(20％/2.5M)溶液充分混合，室温静置5min，4000rpm离心弃上清，沉淀用4℃预冷的PBS洗涤离心；经测试噬菌体滴度，符合进一步实验要求。

通过ELISA方法筛选阳性克隆；将筛选获得的阳性克隆，提取质粒电转化入大肠杆菌HB2151中，涂布于含有氨苄青霉素和葡萄糖的LB培养平板上，37℃培养过夜；挑取单克隆接种于含有氨苄青霉素的液体LB培养液中，37℃摇床培养过夜，至OD600nm值达到0.6以上时，加入1M IPTG，28℃摇床培养12h，离心收集大肠杆菌，超声法破碎菌体，通过镍柱亲和层析法纯化抗体，共筛选获得1A2、1B7、2C5、3D6、3E3和5H9等6个符合要求的靶向CD3单域抗体。

使用Fortebio生物大分子相互作用仪(购自美国艾瑞生物公司)，检测上述单域抗体与人CD3的亲和力，结果如表1所示：

表1 各个单域抗体与目标抗原的亲和力检测

据报道，在CD3-BsAb双抗中，靶向CD3的抗原结合域与目标抗原CD3的亲和力不宜过高，否则会导致CD3-BsAb过度富集于脾脏和淋巴结等富含T细胞的组织中，而影响CD3-BsAb与肿瘤细胞的结合(参见Mandikian,D.et al.Relative Target Affinities of T-Cell-Dependent Bispecific Antibodies Determine Biodistribution in a SolidTumor Mouse Model.Mol.Cancer Ther.2018,17,776–785)，因此本发明中选用亲和力处于中等范围的2C5抗体用于构建双特异性性抗体，以便防止CD3-BsAb的脱靶效应。

用序列比对软件Vector NTI对2C5克隆株的测序结果进行抗体轻链和重链基因的分析，以确定可变区的框架区(Framework Regions，FR)和互补决定区(ComplementaryDetermining Regions，CDR)。经鉴定，3D6克隆株的CDR区为如SEQ ID NO:7所示的CDR1，如SEQ ID NO:8所示的CDR2，如SEQ ID NO:9所示的CDR3，其可变区如SEQ ID NO:12所示。

实施例2双特异性抗体的设计与制备

2.1双特异性抗体的设计

靶向CD19和CD3的传统结构抗体由本实验室保存，并将其核酸序列克隆至PTT5载体上，其中靶向CD19的抗体具有如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3，如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；以及具有如SEQ ID NO:10所示的重链可变区，如SEQ ID NO:11所示的轻链可变区。

本实施例中分别使用靶向CD3的传统抗体和单域抗体构建双特异性抗体，以便验证相应抗肿瘤效果。如图1A所示，CD19-CD3 VH/VL BsAb具有传统抗体结构，分别结合CD19和CD3靶点；如图1B所示，CD19-CD3 VHH BsAb中具有靶向CD20的传统抗体结构和靶向CD3单域抗体结构，且该单域抗体(选用实施例1中的2C5抗体)对目标抗原具有中等强度的亲和力。

2.2双特异性抗体的制备

构建CD19-CD3 VH/VL BsAb和CD19-CD3 VHH BsAb的表达载体，分别将编码CD19-CD3 VH/VL BsAb、CD19-CD3 VHH BsAb中可变区和人IgG1恒定区的DNA序列导入pcDNA3.3表达载体中。使用Expi293表达系统试剂盒(购自ThermoFisher公司)将重链和轻链表达质粒共转染入Expi293细胞，转染后5天，收集上清液，通过镍柱亲和层析法纯化抗体，分别获得CD19-CD3 VH/VL BsAb和CD19-CD3 VHH BsAb双特异性抗体。通过HPLC-SEC检测抗体纯度，CD19-CD3 VH/VL BsAb抗体纯度为95.4％，CD19-CD3 VHH BsAb抗体纯度为96.7％。

实施例3双特异性抗体体外抗肿瘤实验

3.1效益细胞分离和培养

采用Ficoll密度梯度离心法分离人PBMC细胞：抽取新鲜人外周血10mL与10mL的无血清RPMI1640培养基混合，缓慢加到10mL密度梯度离心液Ficoll上层；室温下，12000rpm离心10min；取出离心管，弃去上层血浆，再小心吸取血浆与Ficoll中间的白层PBMC，放置于50mL离心管中；加入15mL无血清RPMI1640培养基，重悬后3000rpm离心10min，重复操作2次；加入15mL含10％血清的RPMI1640培养基，于37℃5％CO₂条件下培养。

3.2肿瘤细胞培养

本发明中选用人急性髓细胞性白血病细胞系THP-1，急性淋巴细胞白血病细胞系NALM6细胞，多发性骨髓瘤细胞系NCI-H929，弥漫大B细胞淋巴瘤细胞系OCI-Ly7作为实验对象，考察双特异性抗体对抗肿瘤作用。复苏上述细胞，接种于含10％血清的RPMI1640培养基，于37℃5％CO₂条件下培养至对数生长期；使用携带有绿色荧光蛋白GFP基因的慢病毒载体转染上述肿瘤细胞，便于后续实验。

3.3体外抗肿瘤实验

效应细胞与靶细胞按5:1比例接种于96孔板中，并分别加入50ng/mL的CD19-CD3VH/VL BsAb和CD19-CD3 VHH BsAb双特异性抗体，以无菌RPMI1640培养基作为对照，37℃培养24h后，每孔加入2μl 7-AAD，37℃孵育1h后，利用Perkin Elmer Operetta高内涵成像仪进行拍照，检测各组细胞活的细胞数；计算细胞杀伤百分比，浓度杀伤百分比＝(空白组活的细胞数-各浓度抗体组活的细胞数)/空白组活的细胞数。

如图2-5所示，本发明中所提供的双特异性抗体可在体外有效杀死肿瘤细胞，THP-1、NALM6、NCI-H929、OCI-Ly7四种细胞系中均见明显杀伤作用；不同结构的双特异性抗体来看，CD19-CD3 VHH BsAb对于白血病细胞的杀伤能力显著高于CD19-CD3 VH/VL BsAb，但在骨髓瘤和淋巴瘤细胞中二者不具有显著差异。

实施例4双特异性抗体体内代谢初步研究

本实施例以新西兰兔为对象，进行药物代谢动力学初步研究。选取10只新西兰兔，随机分为两组，背部皮下给药，分别注射CD19-CD3 VH/VL BsAb抗体(10mg/kg)、CD19-CD3VHHBsAb抗体(10mg/kg)，在给药后1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h、36h、48h、72h、96h、120h进行耳缘静脉采血，离心取血清进行抗体滴度的测定。结果见图6所示，本发明中所提供的双特异性抗体在给药12h后达到峰值，但CD19-CD3 VH/VL BsAb抗体在给药48h后急剧下降，而CD19-CD3 VHHBsAb抗体在给药72h后仍能够检测到，说明使用单域抗体作为抗原结合域可有效延长双特异性抗体在动物体内的半衰期。

实施例5双特异性抗体体内抗肿瘤实验

为了进一步验证本发明中所提供的双特异性抗体的体内抗肿瘤效果，本节中选择采用THP-1构建动物模型，研究体内抗肿瘤效果。

5.1动物模型制备与治疗

采用C57BL/6小鼠，6-8周龄，实验动物在SPF级恒温恒湿房间内饲养一周；培养THP-1细胞，调整细胞浓度为1×10⁷个/mL，剃去C57BL/6小鼠右侧腹部体毛，将100μL细胞悬液注射入小鼠右前侧胁部皮下。每日观测肿瘤生长情况，当肿瘤直径达到3mm和5mm之间时，将实验动物随机分为三组，每隔3天分别注射CD19-CD3 VH/VL BsAb抗体(5mg/kg)、CD19-CD3 VHHBsAb抗体(5mg/kg)和等体积的生理盐水，共给药4次。

5.2肿瘤体积检测

以实验动物给药的首日记为第0天，此后没隔3天测量一次肿瘤体积，共测量30天。使用游标卡尺测量肿瘤的尺寸，肿瘤体积(L x W²)/2估算，其中L是长度或最长尺寸，W是肿瘤的宽度。

结果如图7所示，在治疗约2周后，双特异性抗体治疗组显示出了明显的肿瘤体积减小趋势，说明本发明所提供的双特异性抗体可在体内显著抑制肿瘤生长过程；在治疗约3周后，CD19-CD3 VHHBsAb抗体的治疗效果开始显著优于CD19-CD3 VH/VL BsAb抗体，这可能与使用单域抗体可延长体内半衰期有关，也可能是由于本发明中选用了具有中等活性的CD3抗体，可以防止双抗集中于脾脏、淋巴等正常组织中，而导致抗肿瘤效果降低所致。

5.3血清中免疫因子浓度检测

给药4周后，小鼠眼眶静脉取血，3000r/min离心15min，取上层血清，采用ELISA试剂盒(购自武汉博士德生物工程有限公司公司)，按照说明书所述步骤分别测量血清中TNF-α和IFN-γ的含量。

据报道TNF-α和IFN-γ是肿瘤免疫治疗而导致的免疫因子风暴中的主要细胞因子之一，虽然适量的TNF-α和IFN-γ有助于杀死肿瘤细胞，但是一旦表达过量，会造成免疫系统的过度应激，损伤正常组织和器官，引起发热、恶性、晕厥、器官衰竭等严重不良反应，所以如何管理和控制肿瘤免疫治疗中出现的免疫因子风暴成为肿瘤治疗中必须认真对待和解决的问题。如图8、9所示，本发明所述提供的双特异抗体注射如动物体内后，TNF-α和IFN-γ表达水平有不同程度的提高，其中CD19-CD3 VHHBsAb治疗组中，上述两种免疫因子的表达水平相较于CD19-CD3 VH/VL BsAb均有所下降，尽管其确切作用机制尚有待研究，但仍为临床应用中有效抑制免疫因子风暴的发生提供了新的开发思路。

虽然本发明参考其示例性的实施例已经进行了具体显示和描述，本领域的技术人员应当理解的是，在不偏离由所附权利要求书所涵盖的本发明的范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的多种改变。

序列表

<110> 广州明征生物科技有限公司

<120> 一种双特异性抗体及其治疗癌症的应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Pro Cys Tyr Met Ser Ser

1 5

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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1 5 10

<210> 3

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ile Gly Met Ser Pro Val Val Cys Asn Gln Leu Met Thr Ser Thr

1 5 10 15

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ala Ser Gly Thr Gly Thr Pro Phe Tyr Tyr Cys Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Leu Gly Ser Asp Tyr Thr Gln Val

1 5

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

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1 5 10 15

Ser Leu

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

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1 5 10

<210> 8

<211> 12

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<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

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1 5 10

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<400> 9

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1 5 10

<210> 10

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Phe Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Pro Cys

20 25 30

Tyr Met Ser Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

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50 55 60

Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Thr Lys Asn Ser Leu Phe Leu Gln Met

65 70 75 80

Asn Ser Asn Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ile

85 90 95

Gly Met Ser Pro Val Val Cys Asn Gln Leu Met Thr Ser Thr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Val Thr Val Ser Ser Val Gly

115 120

<210> 11

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Thr Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Ile Phe Cys Ala Ser Gly Thr Gly Thr Pro Phe Tyr Tyr

20 25 30

Cys Ala Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Leu Gly Ser Asp Tyr Thr Gln Val Gly Val Pro Asp Arg Phe Gly

50 55 60

Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser

65 70 75 80

Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met Pro Phe Ala Val Tyr Arg Asp

85 90 95

Ser Gln Ala Ile Lys Gly Gly Glu Ser Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys

100 105 110

Arg Glu Val Leu

115

<210> 12

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Thr Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gln Gln Glu Ser Asp Ala Ala

20 25 30

Thr Met Arg Ser Phe Val Ala Ile Arg Trp Ser Gly Glu Ser Pro Tyr

35 40 45

Val Val Asp Ser Val Lys Pro Glu Trp Met Thr Gln Gly Asp Glu Pro

50 55 60

Phe Thr Gln Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Ala Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Arg His Gly Lys Glu Thr Arg Tyr Ala Ala Thr Thr Ser Asn Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

115 120

Claims (9)

1.一种双特异性抗体，包括：特异性结合第一抗原的第一抗原结合域和特异性结合第二抗原的第二抗原结合域；所述第一抗原为CD19，第一抗原结合域包括如SEQ ID NO:1所示的HCDR1，如SEQ ID NO:2所示的HCDR2，如SEQ ID NO:3所示的HCDR3，如SEQ ID NO:4所示的LCDR1，如SEQ ID NO:5所示的LCDR2，和如SEQ ID NO:6所示的LCDR3；所述第二抗原为CD3，第二抗原结合域为单域抗原结合域，包括如SEQ ID NO:7所示的CDR1，如SEQ ID NO:8所示的CDR2，如SEQ ID NO:9所示的CDR3。

2.如权利要求1所述的双特异性抗体，第一抗原结合域包括如SEQ ID NO:10所示的重链可变区。

3.如权利要求1所述的双特异性抗体，第一抗原结合域包括如SEQ ID NO:11所示的轻链可变区。

4.如权利要求1所述的双特异性抗体，第二抗原结合域包括如SEQ ID NO:12所示的单域可变区。

5.如权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体是IgG1抗体。

6.一种核苷酸，编码权利要求1-5中任一项所述的双特异性抗体。

7.一种药物组合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的双特异性抗体。

8.权利要求1至5中任一项所述的双特异性抗体或权利要求6中所述的核苷酸或权利要求7中所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，所述肿瘤选自淋巴瘤、白血病或骨髓瘤。

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