WO2004002496A1 - Utilisation de l'hesperidine ou l'un de ses derives pour la fabrication d'un medicament destine a stimuler la formation osseuse - Google Patents

Utilisation de l'hesperidine ou l'un de ses derives pour la fabrication d'un medicament destine a stimuler la formation osseuse

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WO2004002496A1
WO2004002496A1 PCT/FR2003/002005 FR0302005W WO2004002496A1 WO 2004002496 A1 WO2004002496 A1 WO 2004002496A1 FR 0302005 W FR0302005 W FR 0302005W WO 2004002496 A1 WO2004002496 A1 WO 2004002496A1
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WO
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bone
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hesperidin
intended
composition
Prior art date
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PCT/FR2003/002005
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Marie-Noëlle HORCAJADA
Véronique COXAM
Christine Morand
Marie-Jeanne Davicco
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Institut National De La Recherche Agronomique (Inra)
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    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the invention relates to the field of maintaining or restoring the balance of bone metabolism in humans or animals, in particular for the prevention or treatment of disorders linked to an imbalance in bone metabolism due to the contribution nutritional or therapeutic administration of a composition stimulating bone formation and / or inhibiting bone resorption.
  • Bone is not a static tissue. The bone undergoes constant remodeling
  • osteoblasts which produce new bone tissue
  • osteoclasts which destroy bone
  • osteoblasts cells responsible for the formation of bone.
  • Osteoblasts also synthesize many growth-regulating peptides, including BMPs (for "Bone Morphogenetic Proteins”), which are stored in the bone matrix, and which are thought to be responsible for the normal formation of BMPs (for "Bone Morphogenetic Proteins")
  • BMPs peptides are expressed by osteoblasts in culture when these cells proliferate and differentiate.
  • Osteoclasts are multinucleated cells that are responsible for bone loss, in a process commonly known as bone resorption.
  • the joint action of osteoblasts and osteoclasts allows bone mass to be maintained over time and simultaneously ensures remodeling of bone tissue by resorption and de novo synthesis of the bone.
  • osteoporotic individuals In a healthy adult subject, the rate of formation of osteoclasts and osteoblasts is such that there is a balance between bone formation and bone resorption. However, in osteoporotic individuals, there is an imbalance in the bone remodeling process, which results in bone loss that takes place at a faster rate than its rate of formation. Although this imbalance exists, to some extent, in most individuals as they age, it is much more severe and occurs at a younger age in osteoporotic individuals.
  • disorders or pathologies such as osteoporosis, Paget's disease, bone loss or osteolysis observed near a prosthesis, diseases of metastatic bone, hypercalcemia due to cancer, multiple myelomas, and periodontal disease.
  • Some of the disorders or pathologies of bone metabolism can be caused after long-term immobilization, for example a long-term hospitalization, or even after a stay in weightlessness.
  • osteoporosis is a systemic skeletal disease characterized by a reduction in bone mass and a deterioration in the microarchitecture of bone tissue, associated with an increase in the fragility of the bone and its susceptibility to fracture.
  • factors that can increase bone loss leading to osteoporosis such as cigarette smoking, alcohol abuse, a sedentary lifestyle, low calcium intake, an unbalanced diet or even vitamin D deficiency
  • osteoporosis like other disorders associated with bone loss, is a chronic disorder, its prevention and treatment should be considered over a long period of time.
  • osteoporosis should therefore no longer be restricted to the elderly.
  • This need is also present in periodontal diseases, metastatic bone diseases, osteolytic diseases and conditions in which repair of the connective tissue is sought, for example for the healing or regeneration of defects or trauma of the cartilage.
  • Bone growth stimulation is also sought in primary and secondary hyperparathyroidism, as well as in osteoporosis associated with diabetes and in osteoporosis associated with glucocorticoids.
  • hesperidin which is a compound of the flavonoid family, is capable of acting on bone metabolism by stimulating the formation of bone and by inhibiting bone resorption. It is therefore provided according to the invention, a nutritional composition and a pharmaceutical composition for human or veterinary use comprising, as active compound, the hesperidin compound or one of its derivatives.
  • the invention also relates to the use of the hesperidin compound or one of its derivatives for the manufacture of a composition intended to stimulate the formation of bone and / or to inhibit bone resorption in humans or the animal, in particular the dog, the cat or the horse.
  • the above use is characterized in that said composition is a nutritional composition suitable for oral administration.
  • composition is a pharmaceutical composition for oral, parenteral or intravenous administration.
  • FIG. 1 illustrates the maintenance of an equivalent body composition (% of body fat relative to body weight) between the different batches of animals, respectively normal animals (TSH), ovariectomized animals (TOVX), normal animals treated with hesperidin (HpSH) and ovariectomized animals treated with hesperidin (HpOVX). On the ordinate, the percentage of fat mass.
  • TSH normal animals
  • TOVX ovariectomized animals
  • HpSH normal animals treated with hesperidin
  • HpOVX ovariectomized animals treated with hesperidin
  • FIG. 2 illustrates the increase in the metaphyseal femoral density in intact or ovariectomized rats receiving the hesperidin diet, compared to those subjected to a standard diet. On the ordinate, the bone density, in g / cm 3 .
  • FIG. 3 illustrates the prevention, by hesperidin, of the increase in bone resorption induced by ovahectomy, evaluated by measuring the urinary excretion of deoxypyridinoline. In ordinates, measurement of the deoxypyridinole / creatinine molar ratio in urine.
  • FIG. 4 illustrates the stimulation of the osteoblastic activity (evaluated by the measurement of the plasma levels of osteocalcin) in the treated rats compared to the control animals. On the ordinate, plasma osteocalcin level, expressed in mg / l.
  • FIG. 5 illustrates the kinetics of osteoblastic differentiation (increased activity of alkaline phosphatase) stimulated by hesperetin at 10 and 50 ⁇ M on hPOB-tert cells at passage 31.
  • the activity of alkaline phosphatase is expressed in ⁇ M of paranitrophenol / hour / mg of protein.
  • the time is expressed in days.
  • Figure 7 illustrates the control of food consumption over time in untreated ovariectomized rats (Control OVX) or treated with hesperidin (OVX Hesp), and in normal control rats (Control SH) or treated with hesperidin (SH Hesp).
  • Control OVX untreated ovariectomized rats
  • Control SH normal control rats
  • SH Hesp normal control rats
  • Figure 8 illustrates the profile of the evolution of the weight of the rats in batches (SH), (SH Hesp), (OVX) and (OVX Hesp).
  • SH SH
  • SH Hesp SH Hesp
  • OVX OVX Hesp
  • Figure 9 illustrates the body composition, as a percentage of fat mass, of the rats in batches (SH), (SH Hesp), (OVX) and (OVX Hesp). On the abscissa: lot of animals; on the ordinate: body composition, expressed as a percentage of fat mass.
  • Figure 10 illustrates the weight of the rat uterus in batches
  • FIG 11 illustrates the total femoral density (T-BMD) in rats in batches (SH), (SH Hesp), (OVX) and (OVX Hesp).
  • SH total femoral density
  • OVX OVX Hesp
  • Figure 12 illustrates the mineral density of the proximal femoral metaphysis (M-BMDp) in rats in batches (SH), (SH Hesp), (OVX) and (OVX Hesp).
  • SH proximal femoral metaphysis
  • OVX proximal femoral metaphysis
  • Figure 13 illustrates the femoral diaphyseal mineral density (D-BMD) in rats in batches (SH), (SH Hesp), (OVX) and (OVX Hesp).
  • D-BMD femoral diaphyseal mineral density
  • Figure 14 illustrates the load at femoral rupture in rats in batches (SH), (SH Hesp), (OVX) and (OVX Hesp).
  • SH SH Hesp
  • OVX OVX Hesp
  • N Newtons
  • a nutritional composition and a pharmaceutical composition for human or veterinary use intended to stimulate the formation of bone and / or to inhibit bone resorption in humans or animals and comprising, as of active compound, the hesperidin compound or one of its derivatives.
  • Hesperidin is a natural glucoside compound found mainly in citrus fruits, that is to say fruits of the genus Citrus.
  • Hesperidin is mainly present in the skin of citrus fruits but is also found in large quantities in the pulp and therefore the juice of citrus fruits, including oranges and lemons.
  • Hesperidin is a glucosylated compound comprising a flavanone nucleus of hesperitin (3 ', 5', 5-trihydroxy-4'-methoxyflavanone) to which is covalently linked a glucoside part of rutinose L- rhamnosyl- ( ⁇ 1- » 6) -glucose) attached to the hydroxyl group present on the carbon in position 7 of the hesperitin.
  • the hesperidin compound is a compound from the flavonoid family which is commonly used in combination with vitamin C, in order to potentiate the biological activity of vitamin C, in particular by reducing the denaturation of vitamin C by oxidation.
  • hesperidin is proposed as an auxiliary agent in the treatment of cardiovascular pathologies, in particular hypertension and hemorrhages.
  • Hesperidin has also been described as a chondroprotective agent, because of its capacity to inhibit the destruction of the matrix of chondrocytes derived from cartilage (patent application No. EP 633 022). Hesperidin has also been proposed in the prior art as an agent for preventing pigmentation of the skin (German patent application No. DE 19742 025), as an agent for inhibiting HMG-CoA reductase (US Patent No. 5,763,414 ) or acyl CoA-cholesterol-O-acyl transferase (PCT application No. WO 99 / 21.549) or platelet aggregation (Korean patent application No. KR 276 979).
  • hesperidin stimulates bone formation and inhibits bone resorption.
  • hesperidin induces an increase in the density of metaphyseal bone tissue (trabecular bone) and in the density of diaphyseal bone (cortical bone), thereby inducing an improvement in bone mineralization.
  • Hesperidin also stimulates bone accretion as evidenced by the sharp increase in plasma osteocalcin levels observed in animals fed a diet supplemented with this compound.
  • Hesperidin has also been shown to halt the multiplication of osteoblast precursor cells and their differentiation into mature osteoblasts, as seen by inducing an increase in alkaline phosphatase activity. Likewise, hesperidin induces an increase in calcium accumulation in osteoblasts.
  • hesperidin inhibits bone resorption in ovariectomized rats, which is the benchmark animal experimental model mimicking human osteoporosis.
  • hesperidin allows the maintenance of bone capital during aging in individuals who have finished their growth, in particular in individuals in a situation of hormonal deficiency, as is observed in ovariectomized rats 6 months old, who are a model mimicking the physiological situation of menopause.
  • the present invention therefore relates to the use of the hesperidin compound or one of its derivatives for the manufacture of a composition capable of maintaining or restoring the balance of bone metabolism in humans or animals, in stimulating bone formation and / or inhibiting bone resorption.
  • hesperidin By hesperidin is meant the compound (S) -7 - [[6-0- (6-deoxy- ⁇ -L- mannopyranosyl) - ⁇ -D-glucopyranosyl] oxy] -2,3-dihydro-5-hydroxy- 2- (3- hydroxy-4-methoxyphenyl) -4H-1-benzopyran-4-one.
  • derivative of hesperidin means the following compounds according to the invention:
  • hesperetin compound consisting of the non-glycosylated flavanone nucleus of hesperidin, which has the following formula: (S) -2,3-dihydro-5,7- dihydroxy-2- (3-hydroxy-4-methoxyphenyl) - 4H-1-benzopyran-4- one; 3 ', 5,7-trihydroxy -4'-methoxyflavanone;
  • hesperidin which comprises a chain of 1 to 20 glucose residues linked together by a bond 1, 4, the chain of glucose residues being itself linked by a 1,4-type bond in position 4 of the glucose residue of hesperidin;
  • methyl-hesperidin compounds in particular the compound 3 1 - methyl-7- (rhamnosyl-2-methyl-glucosyl) hesperidin and the compound 3 1 - methyl hesperidin, these compounds, as well as their preparation process being described in the US patent No. 858,784);
  • stimulation of bone formation is meant, according to the invention, the ability of hesperidin or one of its derivatives to stimulate the activity of osteoblasts and thus promote the synthesis of the protein framework of bone and the deposition of minerals, especially calcium, on this protein web, that is to say to stimulate the mineralization of bone, also called bone accretion.
  • the skilled person may in particular have recourse to conventional densitometry measurements and verify that the intake of hesperidin or one of its derivatives, at a given dose, induces an increase in bone density.
  • inhibiting bone resorption is meant according to the invention, an inhibition of the activity of destruction of bone tissue by osteoclast cells.
  • a person skilled in the art can measure the urinary excretion of deoxypyridinoline, as described in the examples, a decrease in the expression of deoxypyridinoline reflecting an inhibition of bone resorption.
  • the contribution of hesperidin or one of its derivatives to an animal organism simultaneously induces a stimulation of bone formation and an inhibition of bone resorption, the overall increase in bone mineralization, and therefore of the bone density, being the result of the induction of these two mechanisms.
  • a nutritional composition or a therapeutic composition containing hesperidin or one of its derivatives as active compound is intended first of all for the prevention of bone loss due to an imbalance in the remodeling of bone tissue, in humans or the animal, in particular in a non-human mammal, in particular a domestic mammal such as the dog or the cat, or even a horse, in particular a thoroughbred.
  • a composition as defined above is also intended to promote bone growth in young individuals in order to obtain individuals having a high bone density and, if possible, concomitantly a peak of high bone mass.
  • a composition according to the invention is useful during the growth phase of man as well as of other mammals, in particular large breed dogs or pedigrees, or even race horses.
  • composition containing hesperidin or one of its derivatives is also intended for individuals exhibiting symptoms of bone deficit, or liable to suffer from bone deficit, that is to say an imbalance in the ratio between the formation of bone and bone resorption which, if continued, induces a decrease in bone mass.
  • a composition according to the invention is also intended for individuals with 'symptoms of bone deficit resulting from a fracture, surgery or a dental disease.
  • a nutritional or pharmaceutical composition for human or veterinary use according to the invention is useful in the treatment of pathologies such as osteoporosis, Paget's disease, bone loss or osteolysis observed near a prosthesis, metastatic bone disease, hypercalcemia due to cancer, multiple myeloma, periodontal disease or osteoarthritis.
  • composition according to the invention may be in the form of a nutritional composition or also in the form of a pharmaceutical composition, as described below. It has also been shown according to the invention that hesperidin induces the cessation of multiplication and causes the differentiation of osteoblast cells without requiring the presence of auxiliary agents such as osteoblastic differentiation factors such as vitamin D3 and dexamethasone, unlike many anti-osteoporosis compounds described in the state of the art.
  • This experimental observation underlines the advantage of hesperidin and its derivatives for stimulating bone formation and inhibiting bone resorption, since these compounds are biologically active used alone and consequently do not need to be added to the organism in the form of a combination of hesperidin or one of its derivatives with another compound such as a vitamin.
  • hesperidin induces an increase not only in the density of trabecular bone, but also in the density of cortical bone, demonstrates the high level of biological activity of this molecule.
  • the trabecular bone which forms the head of the bone and which is strongly vascularized, is the privileged place of the exchanges of calcium between the bone and the blood circulation, while the cortical bone, which forms the body right of the bone and which is very poorly vascularized, is much less likely to be affected quickly from change in its mineralization.
  • Nutritional compositions containing hesperidin or one of its derivatives are nutritional compositions containing hesperidin or one of its derivatives.
  • many disorders linked to an imbalance in bone metabolism, such as osteoporosis progress gradually over a long period of time and require chronic treatment. Their prevention or treatment can therefore be achieved by a regular supply of hesperidin or one of its derivatives, preferably in the form of a nutritional composition.
  • a regular nutritional supply of hesperidin to young growing individuals, men or animals is likely to allow obtaining a high bone density and a high bone mass peak, by stimulating the formation of l 'bone, when these individuals reach adulthood.
  • a subject of the invention is also a nutritional composition for stimulating bone formation and / or inhibiting bone resorption, characterized in that it comprises, as active nutritional compound, the hesperidin compound or one of its derivatives.
  • nutritional composition is meant according to the invention, a composition containing hesperidin or one of its derivatives and constituting a food composition or even a food supplement not possessing the characteristics of a medicament.
  • a nutritional composition according to the invention is preferably suitable for oral administration.
  • a nutritional composition according to the invention is a dietetic food used for the maintenance of good health of the man or the animal which ingests it.
  • a nutritional composition is also commonly designated “functional food", which is intended to be consumed either as an integral part of the diet or as a dietary supplement, but the content of hesperidin or one of its derivatives implies a physiological role that goes beyond providing basic nutritional needs.
  • said nutritional composition is intended to stimulate the formation of bone in young individuals in the growth phase.
  • said nutritional composition is intended to prevent bone loss which occurs with aging.
  • said nutritional composition is intended to prevent or treat disorders linked to an imbalance in the relationship between bone formation and bone resorption.
  • said nutritional composition is intended to treat a bone deficit resulting from a fracture.
  • said nutritional composition is intended to prevent or treat pathologies chosen from osteoporosis, Paget's disease, bone loss or osteolysis observed near a prosthesis, diseases of the metastatic bone, hypercalcemia due to cancer, multiple myelomas, periodontal disease or osteoarthritis.
  • a nutritional composition according to the invention characterized in that it comprises the hesperidin compound or one of its derivatives, as active compound, can be presented in a wide variety of forms of food and drink compositions, including juices, preferably fruit juices, yogurts, ice creams, cheeses, baked products such as bread, cookies and cakes, dairy products, desserts, confectionery products, cereal bars, breakfast cereals, food seasoning products (especially spices and sauces), fruit salads, fruit compotes, etc.
  • juices preferably fruit juices, yogurts, ice creams, cheeses
  • baked products such as bread, cookies and cakes, dairy products, desserts, confectionery products, cereal bars, breakfast cereals, food seasoning products (especially spices and sauces), fruit salads, fruit compotes, etc.
  • a nutritional composition according to the invention characterized in that it comprises the hesperidin compound or one of its derivatives, as active compound, can also be in the form of a wide variety of products intended for animal feed, in particular for dogs or cats, whether in wet form, semi-wet form or dry form, in particular in the form of kibbles.
  • hesperidin is a compound found naturally in citrus fruits of the genus Citrus, in particular in oranges and lemons, this compound being mainly found in the skin of fruits, but also found in significant quantities in pulp, as described in particular by MANSELL et al. (MANSELL RL et al., 1983, J. Agric. Food Chem., Vol.
  • a nutritional composition according to the invention can be in the form of a citrus juice, in particular an orange juice or a lemon juice, if necessary in the form of a concentrated citrus juice.
  • a nutritional composition according to the invention can consist of a food composition enriched with citrus fruit or citrus extract, in particular orange or lemon.
  • a nutritional composition according to the invention is in the form of any product, in particular any drink, flavored with citrus zest, citrus juice, citrus pulp or any other extract. citrus, including orange and lemon.
  • a nutritional composition according to the invention which is in a liquid form or in a solid form, in particular in the form of a powder, can consist of an extraction product obtained from the skin or the pulp. of a citrus fruit, or even comprise an extraction product obtained from the skin or the pulp of a citrus fruit.
  • a nutritional composition according to the invention is in the form of a drink, for example mineral water; to which has been added an extract from the skin or pulp of a citrus fruit, including an orange or a lemon.
  • the extraction product can be initially enriched with hesperidin if an extraction process specially adapted to achieve such an objective is implemented, such as the process described in Japanese patent application N ° JP 8 188 593, in which the citrus fruit pressing product is adjusted to pH 11.5 - 12.5 then the liquid obtained after pressing and adjusting the pH is centrifuged, before a second adjustment of the pH to pH 5-5.5 then a heating and a final centrifugation step prior to recovery of the product enriched in hisperidine.
  • Another extraction process capable of being used for obtaining an extract enriched with hesperidin is that described in British patent application No. GB 486,898.
  • hesperidin or one of its derivatives produced by chemical synthesis.
  • a nutritional composition according to the invention comprises an amount of hesperidin compound or one of its derivatives suitable for daily oral administration of between 0.01 mg and 500 mg.
  • a nutritional composition according to the invention comprises an amount of active compound suitable for a daily intake of hesperidin or one of its derivatives, provided by said composition, of between 0.01 mg and 500 mg, preferably between 0.1 mg and 500 mg and most preferably between 1 mg and 500 mg.
  • a nutritional composition according to the invention is suitable for daily administration of active compound, provided by said composition, of between 1 mg and 500 mg, preferably 10 mg and 500 mg of hesperidin or one of its derivatives.
  • a mineral water supplemented with hesperidin or one of its derivatives will contain from 0.01 to 500 mg of active compounds per liter, by estimating the average daily human consumption of mineral water as being about 1 liter.
  • the above nutritional composition may comprise other nutritional compounds, in combination with hesperidin or one of its derivatives.
  • the nutritional composition according to the invention can also comprise a source of calcium, for example in the form of an organic or inorganic physiologically acceptable compound, such as inorganic calcium salts (calcium chloride, calcium phosphate, sodium sulfate calcium, calcium oxide, calcium hydroxide or calcium carbonate) or organic components containing calcium such as skim milk powder, calcium caseinate or organic calcium salts (calcium citrate, calcium maleate or their mixtures).
  • a source of calcium for example in the form of an organic or inorganic physiologically acceptable compound, such as inorganic calcium salts (calcium chloride, calcium phosphate, sodium sulfate calcium, calcium oxide, calcium hydroxide or calcium carbonate) or organic components containing calcium such as skim milk powder, calcium caseinate or organic calcium salts (calcium citrate, calcium maleate or their mixtures).
  • the amount of calcium contained in a nutritional composition according to the invention is suitable for daily administration, provided by said composition, of between 100 mg and 1000 mg, preferably between 200 mg and 700 mg and very preferably between 300
  • a nutritional composition according to the invention can also comprise vitamins, such as vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K, vitamin C, folic acid, thiamine, riboflavin, vitamin B 6 , vitamin B ⁇ 2 , niacin, biotin or even pantothenic acid.
  • vitamins such as vitamin A, vitamin D, vitamin E, vitamin K, vitamin C, folic acid, thiamine, riboflavin, vitamin B 6 , vitamin B ⁇ 2 , niacin, biotin or even pantothenic acid.
  • a nutritional composition according to the invention can also comprise mineral elements and trace elements such as sodium, potassium, phosphorus, magnesium, copper, zinc, iron, selenium, chromium and molybdenum.
  • soluble fibers such as agar-agar, an alginate, carob, carrageenan, gum arabic, guar gum, karaya gum, pectin or xanthan gum, these soluble fibers being in a hydrolyzed or non-hydrolyzed form.
  • It can also include energy source compounds, in particular one or more selected carbohydrate sources among maltodextrins, starch, lactose, glucose, sucrose, fructose, xylitol and sorbitol.
  • energy source compounds in particular one or more selected carbohydrate sources among maltodextrins, starch, lactose, glucose, sucrose, fructose, xylitol and sorbitol.
  • a nutritional composition according to the invention can also include natural or artificial flavors, for example fruit flavors such as bananas, orange, peach, pineapple or raspberry, or other vegetable flavors such as vanilla, cocoa, coffee, etc.
  • fruit flavors such as bananas, orange, peach, pineapple or raspberry
  • other vegetable flavors such as vanilla, cocoa, coffee, etc.
  • composition intended to stimulate bone formation or to inhibit bone resorption according to the invention can also be presented in the form of a pharmaceutical composition, as described below.
  • a subject of the invention is also a human or veterinary pharmaceutical composition for stimulating bone formation and / or for inhibiting bone resorption, characterized in that it comprises, as active principle, the hesperidin compound or the one of its derivatives.
  • the invention relates to the use of hesperidin or one of these derivatives for the manufacture of a pharmaceutical composition for human or veterinary use for the prevention or treatment of a pathology linked to an imbalance of the bone metabolism, that is to say a pharmaceutical composition capable of stimulating the formation of bone and / or of inhibiting bone resorption.
  • a pharmaceutical composition according to the invention comprises, as active principle, hesperidin or one of its derivatives, in an amount suitable for stimulating the formation of bone or inhibiting bone resorption in individuals requiring such treatment .
  • a pharmaceutical composition according to the invention is useful for stimulating the formation of bone in young individuals, man or animals, in the growth phase, in order to increase the bone density reached at the start of age. adult and increase maximum bone mass (peak bone mass) in early adulthood.
  • a human or veterinary pharmaceutical composition according to the invention is useful for preventing bone loss which occurs with age, during aging.
  • a human or veterinary pharmaceutical composition according to the invention is useful for preventing or treating disorders or pathologies linked to an imbalance in the relationship between the formation of bone and bone resorption.
  • a human or veterinary pharmaceutical composition according to the invention is useful for treating a bone deficit resulting from a fracture.
  • a pharmaceutical composition for human or veterinary use according to the invention is useful in the treatment of pathologies linked to an imbalance in bone turnover, such as osteoporosis, Paget's disease, bone loss or osteolysis. observed near a prosthesis, metastatic bone disease, hypercalcemia due to cancer, multiple myeloma, periodontal disease or osteoarthritis.
  • It may be a human or veterinary pharmaceutical composition, in particular for the dog or the cat, or even the horse, in particular a thoroughbred.
  • the pharmaceutical composition according to the invention is in a form for oral, parenteral or intravenous administration.
  • a pharmaceutical composition according to the invention advantageously comprises, an amount of hesperidin or one of its derivatives suitable for daily administration of the active compound, provided by said composition, of between 0 , 01 mg and 500 mg.
  • a pharmaceutical composition according to the invention comprises amount of hesperidin or one of its derivatives suitable for daily administration of the active compound, provided by said composition, between 1 mg and 500 mg.
  • a pharmaceutical composition according to the invention comprises hesperidin or one of its derivatives in association with at least one excipient chosen from the group consisting of pharmaceutically acceptable excipients.
  • compositions according to the invention can be easily found by those skilled in the art, for example in the work Remmingston's Pharmaceutical Sciences, Mid. Publishing Co, Easton, PA, USA.
  • a person skilled in the art may advantageously refer to the latest edition of the European Pharmacopoeia or the Pharmacopoeia of the United States of America (USP).
  • a person skilled in the art may in particular advantageously refer to the fourth edition "2002" of the European Pharmacopoeia, or even to the edition USP 25-NF 20 of the American Pharmacopoeia (U.S. Pharmacopeia).
  • a pharmaceutical composition as defined above is suitable for oral, parenteral or intravenous administration.
  • the pharmaceutical composition according to the invention comprises at least one pharmaceutical or physiologically acceptable excipient
  • it is in particular an excipient suitable for administration of the composition by the oral route or an excipient suitable for administration of the composition parenterally.
  • the invention also relates to a method for preventing or treating a disorder linked to an imbalance in bone metabolism, in particular a disorder associated with loss of bone mass, said method comprising a step during which patients are administered a therapeutically effective amount of hesperidin or one of its derivatives or alternatively of a pharmaceutical composition containing hesperidin or one of its derivatives.
  • a pharmaceutical composition comprising hesperidin or one of its derivatives according to the invention is either in a solid form or in a liquid form.
  • a solid pharmaceutical composition is preferred, in the form of tablets, capsules or capsules.
  • a pharmaceutical composition is preferred in the form of an aqueous suspension or of a non-aqueous suspension, or alternatively in the form of a water-in-oil or oil-in-water emulsion.
  • Solid pharmaceutical forms may include, as vehicles, adjuvants or excipients, at least one diluent, flavor, solubilizing agent, lubricating agent, suspending agent, binding agent, disintegrating agent and encapsulation.
  • Such compounds are, for example, magnesium carbonate, magnesium stearate, talc, lactose, pectin, dextrin, starch, gelatin, cellulose materials, cocoa butter, etc.
  • compositions in liquid form can also comprise water, optionally in admixture with propylene glycol or polyethylene glycol, and optionally also coloring agents, flavorings, stabilizers and thickening agents.
  • hesperidin or one of its derivatives can be prepared in accordance with the teaching of the various patent documents cited previously in the description.
  • a pharmaceutical grade product containing hesperidin in a pure or almost pure form such as hesperidin marketed by NINGBO LIWAH PHARMACEUTICAL Co Ltd., belonging to the SANJIU group, will be used as the source of hesperidin.
  • ENTREPRISE GROUP which comprises 95% by weight of hesperidin in ethyl acetate.
  • Example 1 Effect of hesperidin on bone metabolism in the ovariectomized spleen.
  • Hesperetin is a flavanone whose glycosylated form (hesperidin) is specific to citrus fruits, and more particularly to orange. This flavonoid is not present in other plant products.
  • the experimental diets were supplemented with hesperidin.
  • TSH and 10 TOVX pseudo-operated or ovariectomized rats receiving a standard control diet for 3 months.
  • 10 Hp SH and 10 Hp OVX pseudo-operated or ovariectomized rats receiving a standard control diet supplemented with hesperidin (0.5%) for 3 months.
  • Uterine weight was assessed to validate castration.
  • Densities are expressed in g / cm 2 .
  • M-BMD Diaphyseal femoral density
  • the diaphyseal area consists of cortical bone.
  • Oophorectomy induces a significant increase in bone resorption (p ⁇ 0.01 vs T SH). This phenomenon is avoided by the consumption of hesperidin in OVX rats. Similarly, in Hp SH rats, urinary excretion of DPD is significantly reduced compared to TSH.
  • Hesperidin is actually a glycoside of hesperetin (hesperetin-7-
  • Example 1 All of the results of this experiment indicate that hesperidin is capable of preventing bone loss following estrogen deficiency in the ovariectomized spleen. This effect seems to be due to a decrease in bone resorption, coupled with an acceleration of osteoblastic activity. A beneficial effect of this flavanone is even observed in intact rats (pseudo-operated) therefore having a hormonal status and a normal bone metabolism.
  • Example 2 Effect of hesperetin on hPOB-tert cells (immortalized line of human periosteum osteoblasts, Darimont et al., 2002).
  • alkaline phosphatase therefore osteoblastic differentiation
  • hesperitin in the medium, in a dose-dependent manner.
  • Doses 10 and 50 ⁇ M increase this process from the 4th day of experimentation, a plateau being reached on the 8th day of incubation. If hesperetin at 50 ⁇ M proves to be the most effective, a concentration of 1 ⁇ M, on the contrary, would be devoid of effect, compared to untreated cells.
  • Example 3 Effect of hesperidin on bone metabolism in six month old ovariectomized spleen.
  • the animals were housed in individual cages at a controlled temperature of 21 ⁇ 1 ° C, according to a nocturnal cycle from 12h to 12h. After the surgery on D0, the animals were accustomed for seven days. At the end of this adaptation period, the rodents were divided on the basis of the weight parameters into 4 lots homogeneous and received daily for 72 days 22 g of the following diets:
  • the animals were anesthetized by intraperitoneal injection of chloral (Fluka; 8% solution; 0.4 ml / 100g bodyweight). Blood samples were taken from the abdominal aorta. The uterus has been weighed. The femurs were removed and removed from the adjacent soft tissue, and then stored. in 80% ethanol for the determination of bone density.
  • the quantity of food distributed was calculated on the basis of the lowest average consumption level in the week preceding the test (batch SH).
  • the body composition of the animals in the different groups was not changed significantly, regardless of the treatment undergone by the individuals.
  • Bone mineral density The results of measurement of bone mineral density are shown in FIGS. 11, 12 and 13. The results of measurement of the total femoral mineral density are shown in FIG. 11. The results of measurement of mineral density of the proximal femoral metaphysis are shown in Figure 12. The measurement results of the femoral diaphyseal mineral density are shown in Figure 13.
  • Castration resulted in demineralization of the femur, demonstrated by a reduced total bone mineral density (g / cm 2 ). This process is avoided (at least partially) by the consumption of hesperidin. A similar profile is demonstrated at the trabecular level (Fig. 12), as well as in the cortical bone (Fig. 13).
  • the biomechanical properties of the femur are deteriorated by estrogen deficiency.
  • the consumption of hesperidin (OVX Hp) has made it possible to preserve or even improve them in intact animals.
  • Example 3 shows that hesperidin has osteoprotective activity, in an experimental model of bone loss linked to aging.

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Abstract

L'invention concerne l'utilisation du composé hespéridine ou de l'un de ses dérivés pour la fabrication d'une composition destinée à stimuler la formation de l'os et/ou à inhiber la résorption osseuse chez l'homme ou l'animal.

Description

UTILISATION DE L'HESPERIDINE OU L'UN DE SES DERIVES POUR LA FABRICATION D'UN MEDICAMENT DESTINE A STIMULER LA FORMATION OSSEUSE
DOMAINE DE L'INVENTION
5 L'invention se rapporte au domaine du maintien ou du rétablissement de l'équilibre du métabolisme osseux chez l'homme ou l'animal, notamment pour la prévention ou le traitement de troubles liés à un déséquilibre du métabolisme osseux grâce à l'apport nutritionnel ou à l'administration thérapeutique d'une composition stimulant la formation 10 de l'os et/ou inhibant la résorption osseuse.
ETAT DE LA TECHNIQUE,
L'os n'est pas un tissu statique. L'os subit un remodelage constant
15 par destruction et synthèse de novo du tissu osseux dans un processus complexe impliquant deux types principaux de cellules, respectivement les ostéoblastes qui produisent du tissu osseux nouveau et les ostéoclastes qui détruisent l'os.
Les activités de ces cellules sont régulées par un grand nombre
20 de cytokines et de facteurs de croissance, dont la plupart ont été identifiés et clones comme cela est décrit dans la revue générale de Mundy (Mundy, G.R., 1996, Clin. Orthop., vol.324 :24-28 ; Mundy, G.R., 1993, J.Bone Miner Res, vol.8 : S 505 - S 510).
Les ostéoblastes, cellules responsables de la formation de l'os, se
25 différencient à partir de cellules précurseurs et expriment et sécrètent de nombreuses enzymes et de nombreuses protéines de structure de la matrice de l'os, y compris le collagène de type I, l'ostéocalcine, l'ostéopontine et la phosphatase alcaline (Stein G. et al., 1990, Curr. Opin Cell Biol. vol.2: 1018-1027; Harris S et al. ,1994, J. Bone Miner Res
30 Vol.9:855-863).
Les ostéoblastes synthétisent aussi de nombreux peptides régulateurs de croissance, y compris les peptides BMPs (pour "Bone Morphogenetic Proteins »), qui sont stockés dans la matrice osseuse, et qui sont vraisemblablement responsables de la formation normale de
35 l'os. Comme la phosphatase alcaline, l'ostéocalcine et l'ostéopontine, les peptides BMPs sont exprimés par des ostéoblastes en culture au moment où ces cellules prolifèrent et se différencient.
Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées qui sont responsables de la perte osseuse, dans un processus communément désigné la résorption osseuse.
Chez un individu en bonne santé, homme ou animal adulte, l'action conjointe des ostéoblastes et des ostéoclastes permet un maintien dans le temps de la masse osseuse et assure simultanément un remodalage du tissu osseux par résorption et synthèse de novo de l'os.
Chez un sujet adulte sain, la vitesse de formation des ostéoclastes et des ostéoblastes est telle qu'il y a un équilibre entre la formation de l'os et la résorption osseuse. Cependant, chez les individus osteoporotiques, il se produit un déséquilibre dans le processus de remodelage osseux, ce qui aboutit à une perte d'os qui se fait à une vitesse plus rapide que sa vitesse de formation. Bien que ce déséquilibre existe, dans une certaine mesure, chez la plupart des individus à mesure qu'ils vieillissent, il est beaucoup plus sévère et se produit à un âge plus jeune chez les individus osteoporotiques.
Ainsi, chez l'homme et les autres mammifères, une grande diversité de troubles sont liés à un métabolisme anormal de la résorption osseuse ou de la formation de l'os, entraînant un déséquilibre du métabolisme ou remodelage osseux. On observe notamment une grande hétérogénéité dans la valeur du pic de masse osseuse selon les individus, cette hétérogénéité étant due à des grandes variations dans le processus de croissance osseuse dès le plus jeune âge. Ainsi, la masse osseuse maximale atteinte au début de l'âge adulte, aussi désignée pic de masse osseuse, est-elle très variable d'un individu à l'autre. Avec l'âge, les individus possédant une valeur faible de pic de masse osseuse, et qui subissent une perte osseuse due au vieillissement, sont désavantagés. Ainsi, quel que soit l'individu, un traitement préventif précoce de la perte osseuse est préconisé, de manière à réduire le plus possible les déséquilibres du remodelage osseux qui se produisent de manière non pathologique avec le vieillissement, notamment les risques de fractures osseuses précoces.
Parmi les désordres pathologiques liés à un déséquilibre du métabolisme osseux, on peut citer notamment les troubles ou les pathologies tels que l'ostéoporose, la maladie de Paget, la perte osseuse ou l'ostéolyse observée à proximité d'une prothèse, les maladies de l'os métastatique, l'hypercalcémie due à un cancer, les myélomes multiples, et les maladies périodontales.
Certains des troubles ou pathologies du métabolisme osseux peuvent être provoqués après une immobilisation de longue durée, par exemple une hospitalisation de longue durée, ou encore après un séjour en apesanteur.
Parmi les troubles liés à une résorption osseuse anormale , le plus commun est l'ostéoporose, dont la manifestation la plus fréquence est observée chez les femmes, après le début de la ménopause. L'ostéoporose est une maladie squelettique systémique caractérisée par une réduction de la masse osseuse et une détérioration de la microarchitecture du tissu osseux, associées à une augmentation de la fragilité de l'os et de sa susceptiblité à la fracture. II existe d'autres facteurs susceptibles d'accroître la perte osseuse conduisant à l'ostéoporose, telle que la consommation de cigarettes, l'abus d'alcool, un mode de vie sédentaire, un faible apport en calcium, une alimentation déséquilibrée ou encore une carence en vitamine D.
Du fait que l'ostéoporose, comme d'autres troubles associés à une perte osseuse, constitue un trouble chronique, sa prévention et son traitement doivent être envisagés sur une longue durée.
Il est couramment admis qu'une prise en charge précoce doit être privilégiée puisque les deux phases critiques pour le capital osseux sont :
- la période de croissance permettant l'acquisition de la masse osseuse maximale (pic de masse osseuse) ;
- le vieillissement conditionnant la vitesse de perte de la masse osseuse.
La prévention de l'ostéoporose ne doit donc plus être restreinte à l'individu âgé. Par ailleurs, chez l'homme ou l'animal, il existe de nombreux états caractérisés par la nécessité d'accroître la formation osseuse. Par exemple, dans le cas de fractures osseuses, il est nécessaire de stimuler la croissance osseuse afin d'accélérer une réparation complète de l'os. Ce besoin est également présent dans les maladies périodontales, les maladies métastatiques de l'os, les maladies ostéolytiques et les états dans lesquels on recherche une réparation du tissu conjonctif, par exemple pour la cicatrisation ou la régénération des défauts ou des traumatismes du cartilage. On recherche également la stimulation d'une croissance osseuse dans le cas d'hyperparathyroïdisme primaire et secondaire, ainsi que dans l'ostéoporose associée au diabète et dans l'ostéoporose associée aux glucocorticoïdes.
Il existe aujourd'hui de nombreux composés actifs sur la stimulation de la formation de l'os ou l'inhibition de la résorption osseuse, parmi lesquels on peut citer la famille des composés polyphosphonates (brevet européen n°EP 210 728), les oxazolidinones thioamide (demande de brevet US publiée sous le n°2002/0010341), les composés amino bis-phosphonates (demande de brevet US publiée sous le n°2001/0046977), ou encore les composés isoflavones (demande de brevet US publiée sous le n°2002/0035074). On a également proposé l'utilisation d'extrait d'une plante du genre Lycopersicon (demande de brevet US publiée sous le n°2002/0009510).
Bien qu'il existe aujourd'hui une grande diversité de composés actifs pour stimuler la formation osseuse et/ou inhiber la résorption osseuse, il existe un besoin constant pour de nouveaux composés actifs, notamment du fait du succès limité des traitements actuels.
De plus, compte-tenu du caractère chronique de certains états provoqués par un déséquilibre du métabolisme osseux, il existe un besoin pour de nouveaux composés actifs susceptibles de pouvoir être utilisés pendant une longue durée chez l'homme ou l'animal, et susceptibles de se présenter sous la forme d'un apport nutritionnel, par exemple sous la forme d'une composition nutritionnelle.
SOMMAIRE DE L'INVENTION. De manière surprenante, le demandeur a montré que l'hespéridine, qui est un composé de la famille des flavonoïdes, est capable d'agir sur le métabolisme osseux en stimulant la formation de l'os et en inhibant la résorption osseuse. II est donc fourni selon l'invention, une composition nutritionnelle et une composition pharmaceutique à usage humain ou vétérinaire comprenant, à titre de composé actif, le composé hespéridine ou l'un de ses dérivés.
L'invention est également relative à l'utilisation du composé hespéridine ou de l'un de ses dérivés pour la fabrication d'une composition destinée à stimuler la formation de l'os et/ou à inhiber la résorption osseuse chez l'homme ou l'animal, en particulier le chien, le chat ou le cheval.
Selon un premier aspect, l'utilisation ci-dessus est caractérisée en ce que ladite composition est une composition nutritionnelle adaptée pour une administration orale.
Selon un second aspect, l'utilisation ci-dessus est caractérisée en ce que ladite composition est une composition pharmaceutique pour une administration orale, parentérale ou intra-veineuse.
DESCRIPTION DES FIGURES.
La figure 1 illustre le maintien d'une composition corporelle (% de masse grasse par rapport au poids corporel) équivalente entre les différents lots d'animaux, respectivement des animaux normaux (TSH), des animaux ovariectomisés (TOVX), des animaux normaux traités par l'hespéridine (HpSH) et des animaux ovariectomisés traités par l'hespéridine (HpOVX). En ordonnées, le pourcentage de masse grasse.
La figure 2 illustre l'augmentation de la densité fémorale métaphysaire chez les rats intacts ou ovariectomisés recevant le régime hespéridine, par comparaison à ceux soumis à une alimentation standard. En ordonnées, la densité osseuse, en g/cm3.
La figure 3 illustre la prévention, par l'hespéridine, de l'augmentation de la résorption osseuse induite par l'ovahectomie, évaluée par la mesure de l'excrétion urinaire de désoxypyridinoline. En ordonnées, mesure du rapport molaire désoxypyridinole/créatinine dans l'urine.
La figure 4 illustre la stimulation de l'activité ostéoblastique (évaluée par la mesure des taux plasmatiques d'ostéocalcine) chez les rates traitées par rapport aux animaux témoins. En ordonnées, taux plasmatique d'ostéocalcine, exprimé en mg/l.
La figure 5 illustre la cinétique de la différentiation ostéoblastique (augmentation de l'activité de la phosphatase alcaline) stimulée par l'hespérétine à 10 et 50μM sur les cellules hPOB-tert à passage 31. En ordonnées, l'activité de la phosphatase alcaline est exprimée en μM de paranitrophénol/heure/mg de protéines. En abscisses, le temps est exprimé en jours.
La figure 6 illustre la stimulation de l'accumulation calcique dans les cellules hPOB-tert (à passage 31) par l'hespéritine ( à 50μM), après 21 jours d'incubation. En ordonnées, mesure du rapport calcium Ca= protéines, exprimée en μgCa++/mg protéines.
La Figure 7 illustre le contrôle de la consommation alimentaire au cours du temps chez des rates ovariectomisées non traitées (OVX Témoin) ou traitées avec l'hespéridine (OVX Hesp), et chez des rates normales témoin (SH Témoin) ou traitées avec l'hespéridine (SH Hesp). En abscisse : temps, de deux jours en deux jours ; En ordonnées : grammes d'aliments consommés.
La Figure 8 illustre le profil de l'évolution du poids des rates dans les lots (SH), (SH Hesp), (OVX) et (OVX Hesp). En abscisse : Nombre de jours ; en ordonnées : poids moyen des animaux +/- déviation standard.
La Figure 9 illustre la composition corporelle, en pourcentage de masse grasse, des rates dans les lots (SH), (SH Hesp), (OVX) et (OVX Hesp). En abscisse : lot d'animaux ; en ordonnées : composition corporelle, exprimée en pourcentage de masse grasse. La Figure 10 illustre le poids de l'utérus des rates dans les lots
(SH), (SH Hesp), (OVX) et (OVX Hesp). En abscisse : lot d'animaux ; en ordonnées : poids moyen des utérus, exprimé en gramme.
La Figure 11 illustre la densité fémorale totale (T-BMD) chez les rates dans les lots (SH), (SH Hesp), (OVX) et (OVX Hesp). En abscisse : lot d'animaux ; en ordonnées : densité minérale fémorale, exprimée en g/cm2.
La Figure 12 illustre la densité minérale de la métaphyse proximale fémorale (M-BMDp) chez les rates dans les lots (SH), (SH Hesp), (OVX) et (OVX Hesp). En abscisse : lot d'animaux ; en ordonnées : densité minérale de la métaphyse proximale fémorale, exprimée en g/cm2.
La Figure 13 illustre la densité minérale diaphysaire fémorale (D- BMD) chez les rates dans les lots (SH), (SH Hesp), (OVX) et (OVX Hesp). En abscisse : lot d'animaux ; en ordonnées : densité minérale diaphysaire fémorale, exprimée en g/cm2.
La Figure 14 illustre la charge à la rupture fémorale chez les rates dans les lots (SH), (SH Hesp), (OVX) et (OVX Hesp). En abscisse : lot d'animaux ; en ordonnées : charge à la rupture fémorale, exprimée en Newtons (N).
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION.
Il est fourni selon l'invention, une composition nutritionnelle et une composition pharmaceutique à usage humain ou vétérinaire destinées à stimuler la formation de l'os et/ou à inhiber la résorption osseuse chez l'homme ou l'animal et comprenant, à titre de composé actif, le composé hespéridine ou l'un de ses dérivés.
L'hespéridine est un composé glucoside naturel retrouvé principalement dans les agrumes, c'est-à-dire les fruits du genre Citrus.
L'hespéridine est présente majoritairement dans la peau des agrumes mais est également retrouvée en grandes quantités dans la pulpe et donc le jus des agrumes, y compris les oranges et les citrons.
L'hespéridine est un composé glucosylé comprenant un noyau flavanone d'hespéritine (3',5',5-trihydroxy-4'-méthoxyflavanone) auquel est liée de manière covalente une partie glucosidique de rutinose L- rhamnosyl-(α 1-»6)-glucose) fixée sur le groupe hydroxyle présent sur le carbone en position 7 de l'hespéritine.
Le composé hespéridine est un composé de la famille des flavonoïdes qui est utilisé couramment en association avec la vitamine C, afin de potentialiser l'activité biologique de la vitamine C, notamment en réduisant la dénaturation de la vitamine C par oxydation. Dans cette application, l'hespéridine est proposée comme agent auxiliaire dans le traitement de pathologies cardio-vasculaires, notamment de l'hypertension et des hémorragies.
L'hespéridine a également été décrite comme agent chondro- protecteur, du fait de sa capacité à inhiber la destruction de la matrice des chondrocytes dérivés du cartilage (demande de brevet n°EP 633 022). L'hespéridine a également été proposée dans l'état de la technique comme agent pour prévenir la pigmentation de la peau (demande de brevet allemand n°DE 19742 025), comme agent inhibiteur de la HMG-CoA réductase (brevet US N°5,763,414) ou de l'acyl CoA- cholestérol-O-acyl transférase (demande PCT N°WO 99/21.549) ou encore de l'agrégation plaquettaire (demande de brevet coréen n°KR 276 979).
De manière surprenante, il a été montré selon l'invention que l'hespéridine stimule la formation de l'os et inhibe la résorption osseuse. Comme cela est illustré par les exemples, l'hespéridine induit une augmentation de la densité du tissu osseux métaphysaire (os trabéculaire) et de la densité de l'os diaphysaire (os cortical), induisant ainsi une amélioration de la minéralisation osseuse.
L'hespéridine stimule également l'accrétion osseuse comme en témoigne la forte augmentation des taux plasmatiques d'ostéocalcine observés chez les animaux ayant reçu une alimentation supplémentee en ce composé.
Il a également été montré que l'hespéridine provoque un arrêt de multiplication des cellules précurseurs des ostéoblastes ainsi que leur différenciation en ostéoblastes matures, comme cela est visualisé par l'induction d'une augmentation de l'activité de la phosphatase alcaline. De même, l'hespéridine induit une augmentation de l'accumulation du calcium dans les ostéoblastes.
De plus, l'hespéridine inhibe la résorption osseuse chez des rats ovariectomisés, qui est le modèle expérimental animal de référence mimant l'ostéoporose humaine. En particulier, il est montré selon l'invention que l'hespéridine permet le maintien du capital osseux au cours du vieillissement chez les individus ayant terminé leur croissance, notamment chez les individus en situation de carence hormonale, comme cela est observé chez les rates ovariectomisées âgées de 6 mois, qui sont un modèle mimant la situation physiologique de ménopause..
Ces deux activités conjointes de l'hespéridine, respectivement de formation de l'os et d'inhibition de la résorption osseuse, lui confèrent une grande utilité en tant que composé actif chez l'homme ou l'animal pour maintenir ou rétablir l'équilibre du métabolisme osseux, c'est-à-dire :
- soit maintenir constante au cours du temps, avec l'âge, les activités des cellules ostéoblastiques et ostéoclastiques et ainsi prévenir des troubles du métabolisme osseux ;
- soit remédier à un déséquilibre du métabolisme osseux, par exemple dans des troubles comme l'ostéoporose, ou encore stimuler la régénération osseuse, par exemple en cas de fêlure ou fracture de l'os. La présente invention a donc pour objet l'utilisation du composé hespéridine ou de l'un de ses dérivés pour la fabrication d'une composition apte à maintenir ou à rétablir l'équilibre du métabolisme osseux chez l'homme ou l'animal, en stimulant la formation de l'os et/ou en inhibant la résorption osseuse.
Par hespéridine, on entend le composé (S)-7-[[6-0-(6-deoxy-α-L- mannopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]oxy]-2,3-dihydro-5-hydroxy-2-(3- hydroxy-4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one. Par « dérivé » de l'hespéridine, on entend selon l'invention les composés suivants :
- le composé hespérétine, constitué du noyau flavanone non glycosylé de l'hespéridine, qui a la formule suivante : (S)-2,3-dihydro-5,7- dihydroxy-2-(3-hydroxy-4-méthoxyphényl)-4H-1-benzopyran-4- one ;3',5,7-trihydroxy -4'-méthoxyflavanone ;
-l'α-glucosyl-hespéridine, qui comporte une chaîne de 1 à 20 résidus de glucose liés entre eux par une liaison 1 ,4, la chaîne de résidus glucose étant liée elle-même par une liaison de type 1,4 en position 4 du résidu glucose de l'hespéridine ; ces dérivés de l'hespéridine et leur procédé de préparation sont décrits notamment dans la demande de brevet N°EP 0 825 196 et dans le brevet US N°6,048,712 ;
- les composés méthyl-hespéridine, notamment le composé 31- méthyl-7-(rhamnosyl-2-méthyl-glucosyl)hespéridine et le composé 31- méthylhespéridine, ces composés, ainsi que leur procédé de préparation étant décrits dans le brevet US N°858,784) ;
- les conjugués d'hespérétine et de sulfate ou de glucuronide, qui sont retrouvés, avec l'hespérétine, comme produits de la métabolisation de l'hespéridine dans la circulation sanguine. Par « stimulation de la formation de l'os », on entend, selon l'invention, la capacité de l'hespéridine ou de l'un de ses dérivés à stimuler l'activité des ostéoblastes et favoriser ainsi la synthèse de la trame protéique de l'os et le dépôt des minéraux, surtout du calcium, sur cette trame protéique, c'est-à-dire à stimuler la minéralisation de l'os, encore appelée accrétion osseuse.
Pour vérifier que l'apport en hespéridine a un homme ou un animal, en particulier un mammifère, stimule la formation de l'os, l'homme du métier pourra notamment avoir recours à des mesures conventionnelles de densitométrie et vérifier que l'apport d'hespéridine ou de l'un de ses dérivés, à une dose donnée, induit un accroissement de la densité osseuse.
L'homme du métier peut également avoir recours à l'un quelconque des autres tests également décrits dans les exemples, telles que la mesure résistance de l'os à la rupture ou encore à la mesure de l'activité de la phosphatase alcaline et la mesure de l'accumulation du calcium dans des cellules ostéoblastes.
Par « inhibition de la résorption osseuse », on entend selon l'invention, une inhibition de l'activité de destruction du tissu osseux par les cellules ostéoclastes. Pour vérifier que l'apport d'hespéridine ou de l'un de ses dérivés, chez l'homme ou l'animal, inhibe la résorption osseuse, l'homme du métier peut mesurer l'excrétion urinaire de désoxypyridinoline, comme décrit dans les exemples, une diminution de l'expression de la désoxypyridinoline étant le reflet d'une inhibition de la résorption osseuse. L'apport d'hespéridine ou de l'un de ses dérivés à un organisme animal induit simultanément une stimulation de la formation de l'os et une inhibition de la résorption osseuse, l'accroissement global de la minéralisation osseuse, et donc de la densité de l'os, étant le résultat de l'induction de ces deux mécanismes.
Pour déterminer si un sujet présente un état de masse osseuse réduite, et nécessite en conséquence un apport d'hespéridine ou de l'un de ses dérivés, l'homme du métier pourra se référer notamment au rapport de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) de 1994 intitulé « Assessment of fracture risk and its application to screening for post- menopausal osteoporosis « WHO Technical Series-843).
Une composition nutritionnelle ou une composition thérapeutique contenant de l'hespéridine ou l'un de ses dérivés comme composé actif est destinée tout d'abord à la prévention de la perte osseuse due à un déséquilibre dans le remodelage du tissu osseux, chez l'homme ou l'animal, en particulier chez un mammifère non humain, notamment un mammifère domestique comme le chien ou le chat, ou encore un cheval, en particulier un pur-sang.
Une composition telle que définie ci-dessus est également destinée à favoriser la croissance osseuse chez les individus jeunes afin d'obtenir des individus possédant une grande densité osseuse et, si possible, concomitamment un pic de masse osseuse élevé. En particulier, une composition selon l'invention est utile pendant la phase de croissance de l'homme ainsi que des autres mammifères, notamment des chiens de grandes races ou à pedigree, ou encore les chevaux de course.
La composition contenant de l'hespéridine ou l'un de ses dérivés est aussi destinée aux individus présentant des symptômes de déficit osseux, ou susceptibles de souffrir de déficit osseux, c'est-à-dire d'un déséquilibre du rapport entre la formation de l'os et la résorption osseuse lequel, s'il se poursuit, induit une diminution de la masse osseuse. Une composition selon l'invention est également destinée aux individus présentant des ' symptômes de déficit osseux résultant d'une fracture, d'une intervention chirurgicale ou encore d'une maladie dentaire. En particulier, une composition nutritionnelle ou pharmaceutique à destination humaine ou vétérinaire selon l'invention est utile dans le traitement de pathologies telles que l'ostéoporose, la maladie de Paget, la perte osseuse ou l'ostéolyse observée à proximité d'une prothèse, les maladies de l'os métastatique, l'hypercalcémie due à un cancer, les myélomes multiples, les maladies périodontales ou encore l'ostéoarthrite. La composition selon l'invention peut se présenter sous la forme d'une composition nutritionnelle ou encore sous la forme d'une composition pharmaceutique, comme cela est décrit ci-après. II a également été montré selon l'invention que l'hespéridine induit l'arrêt de la multiplication et provoque la différenciation des cellules ostéoblastes sans nécessiter la présence d'agents auxiliaires tels que des facteurs de différenciation ostéoblastiques comme la vitamine D3 et la déxaméthasone, au contraire de nombreux composés anti- ostéoporose décrits dans l'état de la technique. Cette observation expérimentale souligne l'intérêt de l'hespéridine et de ses dérivés pour stimuler la formation de l'os et inhiber la résorption osseuse, puisque ces composés sont biologiquement actifs utilisés seuls et ne nécessitent pas en conséquence d'être apportés à l'organisme sous la forme d'une association de l'hespéridine ou de l'un de ses dérivés avec un autre composé telle qu'une vitamine.
De plus, le fait que l'hespéridine induise une augmentation non seulement de la densité de l'os trabéculaire, mais également de la densité de l'os cortical démontre le haut niveau d'activité biologique de cette molécule. En effet, l'os trabéculaire, qui forme la tête de l'os et qui est fortement vascularisé, est le lieu privilégié des échanges de calcium entre l'os et la circulation sanguine, alors que l'os cortical, qui forme le corps droit de l'os et qui est très peu vascularisé, est beaucoup moins susceptible d'être affecté rapidement de changement dans sa minéralisation.
Compositions nutritionnelles contenant de l'hespéridine ou l'un de ses dérives. Comme cela a déjà été mentionné ci-dessus, de nombreux troubles liés à un déséquilibre du métabolisme osseux, telle que l'ostéoporose, évoluent progressivement sur une longue période de temps et nécessitent des traitements chroniques. Leur prévention ou leur traitement peut donc être réalisé grâce à un apport régulier d'hespéridine ou de l'un de ses dérivés, préférentiellement sous la forme d'une composition nutritionnelle.
De même, un apport nutritionnel régulier d'hespéridine à des individus jeunes en croissance, hommes ou animaux, est de nature à permettre l'obtention d'une grande densité osseuse et un pic de masse osseuse élevé, par stimulation de la formation de l'os, lorsque ces individus atteignent l'âge adulte.
Egalement, un apport nutritionnel régulier d'hespéridine est utile pour prévenir la perte osseuse qui se produit avec le vieillissement. L'invention a aussi pour objet une composition nutritionnelle pour stimuler la formation de l'os et/ou inhiber la résorption osseuse, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de composé nutritionnel actif, le composé hespéridine ou l'un de ses dérivés.
Par « composition nutritionnelle », on entend selon l'invention, une composition contenant de l'hespéridine ou l'un de ses dérivés et constituant une composition alimentaire ou encore un supplément alimentaire ne possédant pas les caractéristiques d'un médicament.
Les différentes utilisations du composé hespéridine ou de l'un de ses dérivés pour la fabrication d'une composition nutritionnelle seront définies ci-après en relation avec les caractéristiques techniques de ladite composition nutritionnelle.
Une composition nutritionnelle selon l'invention est préférentiellement adaptée pour une administration orale.
Selon un premier aspect, une composition nutritionnelle selon l'invention est un aliment diététique utilisé pour le maintien d'une bonne santé de l'homme ou l'animal qui l'ingère. Une telle composition nutritionnelle est également communément désignée « aliment fonctionnel », lequel est destiné à' être consommé, soit comme partie intégrante du régime alimentaire, soit comme supplément alimentaire, mais dont le contenu en hespéridine ou en l'un de ses dérivés implique un rôle physiologique allant au-delà de la fourniture des besoins nutritifs de base.
Selon un premier aspect, ladite composition nutritionnelle est destinée à stimuler la formation de l'os chez les individus jeunes en phase de croissance.
Selon un second aspect, ladite composition nutritionnelle est destinée à prévenir la perte osseuse qui se produit avec le vieillissement.
Selon un troisième aspect, que ladite composition nutritionnelle est destinée à prévenir ou traiter des troubles liés à un déséquilibre du rapport entre la formation de l'os et la résorption osseuse.
Selon un quatrième aspect, ladite composition nutritionnelle est destinée à traiter un déficit osseux résultant d'une fracture.
Selon encore un autre aspect, que ladite composition nutritionnelle est destinée à prévenir ou à traiter des pathologies choisies parmi l'ostéoporose, la maladie de Paget, la perte osseuse ou l'ostéolyse observée à proximité d'une prothèse, les maladies de l'os métastatique, l'hypercalcémie due à un cancer, les myélomes multiples, les maladies périodontales ou l'ostéoarthrite.
Une composition nutritionnelle selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend le composé hespéridine ou l'un de ses dérivés, en tant que composé actif, peut se présenter sous une grande diversité de formes de compositions alimentaires et de boissons, y compris des jus, préférentiellement des jus de fruits, des yaourts, des glaces, des fromages, des produits cuits tels que le pain, les biscuits et les gâteaux, des produits laitiers, des desserts, des produits de confiserie, des barres de céréales, des céréales pour le petit déjeuner, des produits d'assaisonnement des aliments (notamment épices et sauces), salades de fruits, compotes de fruits, etc..
Une composition nutritionnelle selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle comprend le composé hespéridine ou l'un de ses dérivés, en tant que composé actif, peut aussi se présenter sous la forme d'une grande diversité de produits destinés à l'alimentation animale, en particulier pour le chien ou le chat, qu'ils soient sous forme humide, sous forme semi- humide ou sous forme sèche , notamment sous la forme de croquettes. Comme cela a été décrit précédemment, l'hespéridine est un composé retrouvé naturellement dans les agrumes du genre Citrus, en particulier dans les oranges et les citrons, ce composé étant contenu majoritairement dans la peau des fruits, mais également retrouvé en quantités significatives dans la pulpe, comme cela est décrit notamment par MANSELL et al. (MANSELL R L et al., 1983, J. Agric. Food Chem., vol.31 :156-162), ROUSEFF et al. (ROUSEFF R L et al., 1987, J. Agric. Food Chem, vol.35:1027-1030) ou encore GIL-IZQUIERDO et al. (GIL- IZQUIERDO A et al., 2001 , J. Agric. Food Chem. , vol.49: 1035-1041 ). Selon un premier aspect, une composition nutritionnelle selon l'invention peut se présenter sous la forme d'un jus d'agrume, en particulier un jus d'orange ou un jus de citron, le cas échéant sous la forme d'un concentré de jus d'agrume.
Selon un second aspect, une composition nutritionnelle selon l'invention peut consister en une composition alimentaire enrichie en agrume ou en extrait d'agrume, en particulier d'orange ou de citron.
Selon un troisième aspect, une composition nutritionnelle selon l'invention se présente sous la forme de tout produit, en particulier toute boisson, aromatisée avec des zestes d'agrume, du jus d'agrume, de la pulpe d'agrume ou tout autre extrait d'agrume, y compris l'orange et le citron.
Ainsi, une composition nutritionnelle selon l'invention, qui se présente sous une forme liquide ou sous une forme solide, notamment sous la forme d'une poudre, peut consister en un produit d'extraction obtenu à partir de la peau ou de la pulpe d'un agrume, ou encore comprendre un produit d'extraction obtenu à partir de la peau ou de la pulpe d'un agrume.
Notamment, une composition nutritionnelle selon l'invention se présente sous la forme d'une boisson, par exemple de l'eau minérale; à laquelle a été ajoutée un extrait de la peau ou de la pulpe d'un agrume, y compris d'une orange ou d'un citron.
Selon encore un autre aspect, le produit d'extraction peut être initialement enrichi en hespéridine si l'on met en œuvre un procédé d'extraction spécialement adapté pour atteindre un tel objectif, tel que le procédé décrit dans la demande de brevet japonais N°JP 8 188 593, dans lequel le produit de pressage des fruits du genre Citrus est ajusté à pH 11,5 - 12,5 puis le liquide obtenu après pressage et ajustement du pH est centrifugé, avant un second ajustement du pH à pH 5-5,5 puis un chauffage et une dernière étape de centrifugation préalable à la récupération du produit enrichi en hispéridine. Un autre procédé d'extraction susceptible d'être utilisé pour l'obtention d'un extrait enrichi en hespéridine est celui décrit dans la demande de brevet britannique n°GB 486.898.
Pour l'obtention d'un produit d'extraction enrichi en hespéridine, à partir d'agrumes, et plus spécifiquement à partir d'orange ou de citron, l'homme du métier pourra aussi avantageusement se référer aux procédés décrits respectivement dans le brevet US N°2,400,693 et US
2,442,110.
Selon un autre aspect, dans une composition nutritionnelle selon l'invention, l'hespéridine ou l'un de ses dérivés produit par synthèse chimique.
De préférence, une composition nutritionnelle selon l'invention comprend une quantité de composé hespéridine ou de l'un de ses dérivés adaptée à une administration orale quotidienne comprise entre 0,01 mg et 500 mg.
Pour une consommation chez l'homme, une composition nutritionnelle selon l'invention comprend une quantité de composé actif adaptée à un apport quotidien en hespéridine ou en l'un de ses dérivés, fourni par ladite composition, comprise entre 0,01 mg et 500 mg, de préférence entre 0,1 mg et 500 mg et de manière tout à fait préférée entre 1 mg et 500 mg.
Pour une consommation par un animal, spécifiquement un mammifère non humain, y compris le chien, le chat ou le cheval, une composition nutritionnelle selon l'invention est adaptée à une administration quotidienne de composé actif, fournie par ladite composition, comprise entre 1 mg et 500 mg, de préférence 10 mg et 500 mg d'hespéridine ou l'un de ses dérivés.
A titre illustratif, une eau minérale supplémentee en hespéridine ou l'un de ses dérivés contiendra de 0,01 à 500 mg de composés actifs par litre, en estimant la consommation humaine moyenne quotidienne d'eau minérale comme étant d'environ 1 litre.
Selon encore un autre aspect, la composition nutritionnelle ci- dessus peut comprendre d'autres composés nutritionnels, en combinaison avec l'hespéridine ou l'un de ses dérivés.
Ainsi, la composition nutritionnelle selon l'invention peut également comprendre une source de calcium, par exemple sous la forme d'un composé organique ou inorganique physiologiquement acceptable, tels que des sels de calcium inorganique (chlorure de calcium, phosphate de calcium, sulfate de calcium, oxyde de calcium, hydroxyde de calcium ou carbonate de calcium) ou des composants organiques contenant du calcium telle que la poudre de lait écrémé, le caséinate de calcium ou encore des sels organiques de calcium (citrate de calcium, maléate de calcium ou leurs mélanges). La quantité de calcium contenue dans une composition nutritionnelle selon l'invention est adaptée pour une administration quotidienne, fournie par ladite composition, comprise entre 100 mg et 1000 mg, de préférence entre 200 mg et 700 mg et de manière tout à fait préférée entre 300 mg et 600 mg de calcium. Une composition nutritionnelle selon l'invention peut également comprendre des vitamines, telle que la vitamine A, la vitamine D, la vitamine E, la vitamine K, la vitamine C, l'acide folique, la thiamine, la riboflavine, la vitamine B6, la vitamine Bι2, la niacine, la biotine ou encore l'acide pantothénique. Une composition nutritionnelle selon l'invention peut également comprendre des éléments minéraux et des éléments trace tels que le sodium, le potassium, le phosphore, le magnésium, le cuivre, le zinc, le fer, le sélénium, le chrome et le molybdène.
Elle peut également comprendre des fibres solubles telles que l'agar-agar, un alginate, du caroube, du carragheenan , de la gomme arabique, de la gomme de guar, de la gomme de karaya, de la pectine ou de la gomme xanthane, ces fibres solubles étant sous une forme hydrolysée ou non hydrolysée.
Elle peut aussi comprendre des composés source d'énergie, notamment une ou plusieurs sources d'hydrates de carbone choisis parmi les maltodextrines, l'amidon, le lactose, le glucose, le sucrose, le fructose, le xylitol et le sorbitol.
En outre, une composition nutritionnelle selon l'invention peut également comprendre des arômes naturels ou artificiels, par exemple des arômes de fruits comme la banane, l'orange, la pêche, l'ananas ou la framboise, ou d'autres arômes végétaux comme la vanille, le cacao, le café, etc..
Comme cela a déjà été mentionné précédemment, une composition destinée à stimuler la formation de l'os ou à inhiber la résorption osseuse selon l'invention peut aussi être présentée sous la forme d'une composition pharmaceutique, comme décrit ci-dessous.
Compositions pharmaceutiques humaines ou vétérinaires selon l'invention.
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire pour stimuler la formation de l'os et/ou pour inhiber la résorption osseuse, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, le composé hespéridine ou l'un de ses dérivés.
En particulier, l'invention concerne l'utilisation de l'hespéridine ou de l'un de ces dérivés pour la fabrication d'une composition pharmaceutique à usage humain ou vétérinaire pour la prévention ou le traitement d'une pathologie liée à un déséquilibre du métabolisme osseux, c'est-à-dire une composition pharmaceutique apte à stimuler la formation de l'os et/ou à inhiber la résorption osseuse.
Les utilisations de l'hespéridine pour la fabrication d'une composition pharmaceutique seront décrites en relation avec les caractéristiques techniques de ladite composition pharmaceutique ci- après.
Une composition pharmaceutique selon l'invention comprend, en tant que principe actif, l'hespéridine ou l'un de ses dérivés, en une quantité adaptée pour stimuler la formation de l'os ou inhiber la résorption osseuse chez des individus nécessitant un tel traitement. Selon un premier aspect, une composition pharmaceutique selon l'invention est utile pour stimuler la formation de l'os chez les individus jeunes, homme ou animaux, en phase de croissance, afin d'augmenter la densité osseuse atteinte au début de l'âge adulte et accroître la masse osseuse maximale (pic de masse osseuse) au début de l'âge adulte.
Selon un second aspect, une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire selon l'invention est utile pour prévenir la perte osseuse qui se produit avec l'âge, au cours du vieillissement.
Selon un troisième aspect, une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire selon l'invention est utile pour prévenir ou traiter des troubles ou des pathologies liés à un déséquilibre du rapport entre la formation de l'ose et la résorption osseuse.
Selon un quatrième aspect, une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire selon l'invention est utile pour traiter un déficit osseux résultant d'une fracture.
Selon un cinquième aspect, une composition pharmaceutique à destination humaine ou vétérinaire selon l'invention est utile dans le traitement de pathologies liées à un déséquilibre du remodelage osseux, telles que l'ostéoporose, la maladie de Paget, la perte osseuse ou l'ostéolyse observée à proximité d'une prothèse, les maladies de l'os métastatique, l'hypercalcémie due à un cancer, les myélomes multiples, les maladies périodontales ou encore l'ostéoarthrite.
Il peut s'agir d'une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire, en particulier pour le chien ou le chat, ou encore le cheval, en particulier un pur-sang.
La composition pharmaceutique selon l'invention se présente sous une forme pour l'administration orale, parentérale ou intra-veineuse.
Dans sa forme destinée à l'administration humaine, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend avantageusement, une quantité d'hespéridine ou de l'un de ses dérivés adaptée pour une administration quotidienne du composé actif, fournie par ladite composition, comprise entre 0,01 mg et 500 mg.
Sous sa forme destinée à une administration chez l'animal, particulièrement un mammifère domestique tel que le chien ou le chat, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend une quantité d'hespéridine ou de l'un de ses dérivés adaptée à une administration quotidienne du composé actif, fourni par ladite composition, comprise entre 1 mg et 500 mg.
Une composition pharmaceutique selon l'invention comprend l'hespéridine ou l'un de ses dérivés en association avec au moins un excipient choisi dans le groupe constitué par les excipients pharmaceutiquement acceptables.
Des techniques de préparation de compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être aisément retrouvées par l'homme du métier, par exemple dans l'ouvrage Remmingston's Pharmaceutical Sciences, Mid. Publishing Co, Easton, PA, USA.
Des adjuvants, des véhicules et des excipients physiologiquement acceptables sont aussi décrits dans l'ouvrage intitulé "Handbook of Pharmaceutical Excipients, Seconde édition, American Pharmaceutical Association, 1994.
Pour formuler une composition pharmaceutique selon l'invention, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à la dernière édition de la Pharmacopée Européenne ou de la Pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique (USP). L'homme du métier pourra notamment avantageusement se référer à la quatrième édition « 2002 » de la Pharmacopée Européenne, ou encore à l'édition USP 25-NF 20 de la Pharmacopée Américaine (U.S. Pharmacopeia).
Avantageusement, une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus est adaptée pour une administration orale, parentérale ou intraveineuse.
Lorsque la composition pharmaceutique selon l'invention comprend au moins un excipient pharmaceutique ou physiologiquement acceptable, il s'agit en particulier d'un excipient approprié pour une administration de la composition par voie orale ou d'un excipient approprié pour une administration de la composition par voie parentérale.
L'invention concerne aussi une méthode pour prévenir ou traiter un trouble lié à un déséquilibre du métabolisme osseux, en particulier un trouble associé à une perte de la masse osseuse, ladite méthode comprenant une étape au cours de laquelle on administre aux patients une quantité thérapeutiquement efficace d'hespéridine ou de l'un de ses dérivés ou encore d'une composition pharmaceutique contenant l'hespéridine ou l'un de ses dérivés.
Une composition pharmaceutique comprenant de l'hespéridine ou l'un de ses dérivés selon l'invention se présente indifféremment sous une forme solide ou sous une forme liquide.
Pour une administration orale, on préférera une composition pharmaceutique solide, sous la forme de comprimés, de capsules ou de gélules. Sous la forme liquide, on préférera une composition pharmaceutique sous la forme d'une suspension aqueuse ou d'une suspension non aqueuse, ou encore sous la forme d'une émulsion eau- dans-huile ou huile-dans-eau.
Des formes pharmaceutiques solides peuvent comprendre, en tant que véhicules, adjuvants ou excipients, au moins un agent diluant, un arôme, un agent solubilisant, un agent lubrifiant, un agent de suspension, un agent liant, un agent désintégrant et un agent d'encapsulation.
De tels composés sont par exemple le carbonate de magnésium, le stéarate de magnésium, le talc, le lactose, la pectine, la dextrine, l'amidon, la gélatine, des matériaux cellulosiques, du beurre de cacao, etc.
Les compositions sous forme liquide peuvent comprendre également de l'eau, le cas échéant en mélange avec du propylène glycol ou du polyéthylène glycol, et éventuellement aussi des agents de coloration, des arômes, des stabilisants et des agents épaississants.
Pour la fabrication d'une composition pharmaceutique selon l'invention, l'hespéridine ou l'un de ses dérivés peut être préparée conformément à l'enseignement des différents documents de brevets cités précédemment dans la description. De préférence, on utilisera, comme source d'hespéridine, un produit de grade pharmaceutique contenant l'hespéridine sous une forme pure, ou pratiquement pure, telle que l'hespéridine commercialisée par la Société NINGBO LIWAH PHARMACEUTICAL Co Ltd., appartenant au groupe SANJIU ENTREPRISE GROUP, qui comprend 95% en poids d'hespéridine dans l'acétate d'éthyle. L'invention est en outre illustrée , sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.
Exemple 1 : Effet de l'hespéridine sur le métabolisme osseux chez la rate ovariectomisée.
L'objectif de cette expérimentation était de tester l'impact de l'hespérétine sur le métabolisme osseux de la rate ovariectomisée (OVX) par comparaison à celui de rates témoins pseudo-opérées (SH). L'hespérétine est une flavanone dont la forme glycosylée (hespéridine) est spécifique des agrumes, et plus particulièrement de l'orange. Ce flavonoïde n'est pas présent dans les autres produits végétaux. C'est sous forme d'hespéridine que les régimes expérimentaux ont été supplémentés.
A. MATERIEL ET METHODES
Afin d'étudier I' éventuel impact de cette molécule sur le tissu osseux, 40 rates Wistar âgées de 3 mois (266 ± 2 g) ont été utilisées.
Ces animaux ont été adaptés à un régime semi-synthétique de base pendant les 7 jours précédant le début de la période expérimentale. A J0,
20 rates ont été pseudo-opérées, les 20 autres ovariectomisées.
Réparties en lots de 10, elles ont été soumises à divers régimes alimentaires, pendant 3 mois à l'issu desquels elles ont été sacrifiées. La dernière semaine avant l'abattage, de J85 à J90, les rates ont été mises en bilan et l'urine a été prélevée (sur une période de 24 heures). De même, la composition corporelle des rates a été mesurée. A l'abattage, le plasma et les fémurs ont été prélevés pour différentes analyses [Fémurs : résistance à la rupture, densitométrie ; Plasma : ostéocalcinémie (marqueur de l'activité ostéoblastique), taux d'hespérétine ; Urine : désoxypyridinoline (marqueur de la résorption osseuse)]. Pendant toute la durée de l'expérimentation, les rates étaient pesées une fois par semaine. La quantité journalière d'aliment distribuée à chaque animal était de 20g.
Répartition des lots
10 TSH et 10 TOVX : rates pseudo-opérées ou ovariectomisées recevant un régime témoin standard pendant 3 mois.
10 Hp SH et 10 Hp OVX : rates pseudo-opérées ou ovariectomisées recevant un régime témoin standard supplémenté en hespéridine (0.5%) pendant 3 mois.
B. RESULTATS
B.1 Evolution pondérale et composition corporelle
Les résultats sont présentés figure 1. Les valeurs sont exprimées en Moyennes ± SEM. Les rates ont présenté une évolution pondérale classique. Bien qu'en fin de période expérimentale le poids corporel (g) des animaux OVX était significativement supérieur par comparaison aux pseudo-opérées [T SH : 326.6 ± 9.4 ; T OVX : 363.3 ± 7 ; Hp SH : 335.4 ± 15.4 ; Hp OVX : 406.3 ± 12.7], aucune différence significative concernant la composition corporelle (% masse grasse par rapport au poids corporel total) n'a été observée entre les lots.
B.2 Poids utérin
Le poids utérin a été évalué, afin de valider la castration.
L'ovariectomie a effectivement induit une atrophie de cet organe (mg), par comparaison aux SH (p<0.01). Ce paramètre n'ayant pas été modifié par la consommation d'hespéridine, cette molécule semble donc être dépourvue d'effet utérotrophique. Tableau 1
ΓSH 7OVX Hp SH tfp OVX
1031.9 ± 82.3 139.6 ± 10.2** 659.4 ± 8.96 238.6 ± 2.23**
5.3 Biomécaniaue fémorale Le diamètre et la longueur (mm) des fémurs n'ont pas été modifiés significativement par le traitement.
Figure imgf000025_0001
Bien que l'ovariectomie n'ait pas significativement diminué la résistance à la rupture fémorale (N), les rates ovariectomisées et recevant un régime supplémenté en hespéridine tendent vers une amélioration de ce paramètre.
B.3 Densitométrie
Les densités sont exprimées en g/cm2.
Tableau 3 : Densité fémorale totale (T-BMD)
Figure imgf000025_0002
L'ovariectomie induit une diminution significative de la densité fémorale totale des rates recevant le régime témoin, par comparaison aux pseudoopérées. En revanche, la consommation d'hespéridine prévient totalement cette déminéralisation et, de plus, elle améliore significativement ce paramètre chez les SH. Densité fémorale métaphysaire (M-BMD) (figure 2)
Les résultats relatifs au fémur entier sont également vérifiés au niveau de la zone métaphysaire essentiellement constituée d'os trabéculaire.
L'amélioration de la minéralisation chez les animaux non castrés ayant consommé la molécule est également démontrée (par comparaison aux
T SH).
Densité fémorale diaphysaire (M-BMD) :
La zone diaphysaire est constituée d'os cortical.
Tableau 4
Figure imgf000026_0001
La consommation d'hespéridine améliore significativement (p<0.05) ce paramètre, par comparaison aux autres lots recevant un régime standard, aussi bien chez les rates OVX que SH.
B.4 Biomarpueurs osseux
Excrétion urinaire de désoxypyridinoline (figure 3)
L'ovariectomie induit une augmentation significative de la résorption osseuse (p<0.01 vs T SH). Ce phénomène est évité par la consommation d'hespéridine chez les rates OVX. De même, chez les rates Hp SH, l'excrétion urinaire de DPD est significativement diminuée par comparaison aux TSH.
Taux plasmatiαues d'ostéocalcine (figure 4)
La consommation d'hespéridine stimule i'accrétion osseuse (Hp SH vs T SH ; Hp OVX vs T OVX ; p<0.05), l'ostéocalcine étant un témoin de l'activité ostéoblastique. Taux circulants d'hespérétine
L'hespéridine est, en fait, un glycoside de l'hespérétine (hespérétine-7-
Rhamnoglucoside). Le taux plasmatique moyen d'aglycone retrouvé chez les rates OVX, comme les SH, recevant les régimes supplémentés en hespéridine était de 12.53 ± 2.48 μM. Par contre, aucune trace d'hespérétine n'a été détectée chez les rates recevant le régime témoin.
Conclusion de l'Exemple 1 L'ensemble des résultats de cette expérimentation indique que l'hespéridine est capable de prévenir la perte osseuse consécutive à la carence oestrogénique, chez la rate ovariectomisée. Cet effet semblerait être du à une diminution de la résorption osseuse, couplée à une accélération de l'activité ostéoblastique. Un effet bénéfique de cette flavanone est même observé chez des rates intactes (pseudo-opérées) ayant donc un statut hormonal et un métabolisme osseux normal.
Exemple 2 : Effet de l'hespérétine sur les cellules hPOB-tert (lignée immortalisée d'ostéoblastes de périoste humain, Darimont et al., 2002).
Nous avons testé trois concentrations d'hespérétine dans le milieu de culture de hPOB ensemencées à confluence : 1 , 10 et 50 μM. Ces milieux étaient par ailleurs dépourvus de facteurs de différenciation ostéoblastique (Vitamine D3 et Dexaméthasone). Le contrôle contenait du DMSO (l'hespérétine étant dissoute dans le DMSO) à 0.1 %. Les cellules ont été incubées dans ces milieux pendant 35 jours. L'activité de la phosphatase alcaline, marqueur de différenciation ostéoblastique, a été mesurée sur un lysat cellulaire en utilisant un kit commercialisé ' (Sigma n°247). Les cellules avaient été récoltées à 0, 4, 8 et 12 jours d'incubation. Le contenu calcique des cellules, témoin de minéralisation, a été quantifié sur lysat cellulaire après 21 jours d'incubation avec les différents milieux, à l'aide d'un kit commercialisé (Sigma n°587).
RESULTATS
Activité de l'ALP
L'activité de la phosphatase alcaline, donc la différenciation ostéoblastique, est stimulée par la présence d'hespéritine dans le milieu, de façon dose-dépendante. Les doses 10 et 50 μM augmentent ce processus dés le 4ème jour d'expérimentation, un palier étant atteint au 8ème jour d'incubation. Si l'hespérétine à 50 μM s'avère la plus efficace, une concentration de 1 μM, au contraire, serait dépourvue d'effet, par comparaison aux cellules non traitées.
Accumulation du calcium dans les cellules:
Après 21 jours d'incubation, seule la dose à 50μM d'hespérétine semble stimuler le dépôt calcique, par comparaison au contenu de calcium dans les cellules contrôles (0.1% DMSO).
Exemple 3 ; Effet de l'hespéridine sur le métabolisme osseux chez la rate ovariectomisée âgée de six mois.
A. Matériel et Méthodes L'expérimentation a été réalisée sur 48 rates Wistar âgées de 6 mois : 24 ovariectomisées (OVX) et 24 pseudo-opérées (SH).
Les animaux ont été logés dans des cages individuelles à une température contrôlée de 21 ± 1 °C, selon un cycle nyctéméral de 12h- 12h. Après l'intervention chirurgicale à J0, les animaux ont été accoutumés pendant sept jours. A l'issue de cette période d'adaptation, les rongeurs ont été répartis sur la base des paramètres pondéraux en 4 lots homogènes et ont reçu quotidiennement pendant 72 jours 22 g des régimes suivants :
> lot SH : 12 rattes pseudo-opérées alimentées avec le régime contrôle
> lot OVX : 12 rattes ovariectomisées ayant reçu le régime contrôle
> lot SH Hp : 12 rattes pseudo-opérées alimentées avec le régime hespéridine
> lot OVX Hp : 12 rattes ovariectomisées ayant reçu le régime hespéridine.
Au sacrifice (J90), les animaux ont été anesthésiés par injection intra-péritonéale de chloral (Fluka ; solution à 8% ; 0,4 ml/100g de poids vif). Des prélèvements sanguins ont été pratiqués au niveau de l'aorte abdominale. L'utérus a été pesé. Les fémurs ont été prélevés et débarrassés des tissus mous adjacents, puis conservés . dans de l'éthanol à 80% pour la détermination de la densité osseuse.
B. RESULTATS 1. Consommation alimentaire
La quantité d'aliments distribuée a été calculée sur la base du niveau de la consommation moyenne la plus faible la semaine précédant l'essai (lot SH).
Les résultats sont représentés sur la Figure 7. Les résultats de la Figure 7 montrent qu' aucune différence significative au niveau de l'alimentation des animaux des différents lots n'est observée.
2. Evolution pondérale Les résultats de l'évolution pondérale sont représentés sur la
Figure 8. Le profil pondéral des animaux de tous les lots présente une évolution similaire, à savoir une augmentation entre le début et la fin de l'expérience, quel que soit le groupe considéré.
3. Composition corporelle
Les résultats de mesure de la composition corporelle sont représentés sur la Figure 9.
La composition corporelle des animaux dans les différents groupes n'a pas été modifiée de façon significative, quel que soit le traitement subi par les individus.
4. Poids utérin
Les résultats sont représentés sur la Figure 10. L'atrophie utérine consécutive à l'ablation ovarienne n'est pas évitée par la consommation d'hespéridine.
Les résultats présentés à la Figure 10 montrent donc que l'hespéridine est dépourvue d'effet utérotrophique.
5. Densité minérale osseuse Les résultats de mesure de densité minérale osseuse sont représentés sur les figures 11, 12 et 13. Les résultats de mesure de la densité minérale fémorale totale sont représentés sur la Figure 11. Les résultats de mesure de la densité minérale de la métaphyse proximale fémorale sont représentés sur la Figure 12. Les résultats de mesure de la densité minérale diaphysaire fémorale sont représentés sur la Figure 13.
La castration s'est traduite par une déminéralisation du fémur, mise en évidence par une densité minérale osseuse totale (g/cm2) réduite. Ce processus est évité (au moins partiellement) par la consommation d'hespéridine. Un profil similaire est démontré au niveau trabéculaire (Fig. 12), ainsi que dans l'os cortical (Fig. 13)..
6. Propriétés biomécaniques On a analysé les propriétés mécaniques du fémur des individus des différents lots d'animaux. Les résultats sont représentés sur la Figure 14.
Les propriétés biomécaniques du fémur sont détériorées par la carence oestrogénique. La consommation d'hespéridine (OVX Hp) a permis de les préserver, voire de les améliorer chez les animaux intacts.
En conclusion, l'ensemble des résultats de l'exemple 3 montrent que l'hespéridine possède une activité ostéoprotectrices, dans un modèle expérimental de la perte osseuse liée au vieillissement.

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation du composé hespéridine ou de l'un de ses dérivés pour la fabrication d'une composition destinée à stimuler la formation de l'os et/ou à inhiber la résorption osseuse chez l'homme ou l'animal.
2. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce que ladite composition est une composition nutritionnelle adaptée pour une administration orale.
3. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite composition nutritionnelle est destinée à stimuler la formation de l'os chez les individus jeunes en phase de croissance.
4. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite composition nutritionnelle est destinée à prévenir la perte osseuse qui se produit avec le vieillissement.
5. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite composition nutritionnelle est destinée à prévenir ou traiter des troubles liés à un déséquilibre du rapport entre la formation de l'os et la résorption osseuse.
6. Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite composition nutritionnelle est destinée à traiter un déficit osseux résultant d'une fracture.
7. Utilisation selon la revendication 6., caractérisée ne ce que ladite composition nutritionnelle est destinée à prévenir ou à traiter des pathologies choisies parmi l'ostéoporose, la maladie de Paget, la perte osseuse ou l'ostéolyse observée à proximité d'une prothèse, les maladies de l'os métastatique, l'hypercalcémie due à un cancer, les myélomes multiples, les maladies périodontales ou l'ostéoarthrite.
8. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 7, caractérisée en ce ladite composition nutritionnelle se présente sous forme de boissons, y compris des jus, préférentiellement des jus de fruits, des yaourts, des glaces, des fromages, des produits cuits tels que le pain, les biscuits et les gâteaux, des produits laitiers, des desserts, des produits de confiserie, des barres de céréales, des céréales pour le petit déjeuner, des produits d'assaisonnement des aliments, des salades de fruits ou des compotes de fruits.
9. Utilisation selon l'un des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que ladite composition nutritionnelle se présente sous la forme d'un produit destiné à l'alimentation animale, sous forme humide, semi- humide ou sèche.
10. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 9, caractérisée en ce que le composé hisperidine ou l'un de ses dérivés se présente sous la forme d'un produit d'extraction obtenu à partir de la peau ou de la pulpe d'un agrume.
11. Utilisation selon l'une des revendications 2 à 10, caractérisée en ce que ladite composition nutritionnelle est adaptée à une administration orale d'une quantité quotidienne comprise entre 0,01 à 500 mg du composé hisperidine ou de l'un de ses dérivés.
12. Composition nutritionnelle pour stimuler la formation de l'os et/ou inhiber la résorption osseuse, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de composé nutritionnel actif, le composé hisperidine ou l'un de ses dérivés.
13. Utilisation selon la revendication 1 , caractérisée en ce ladite composition est une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire.
14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est destinée à stimuler la formation de l'os chez l'individu jeune en phase de croissance.
15. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est destinée à prévenir la perte osseuse qui se produit au cours du vieillissement.
16. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est destinée à prévenir ou traiter une pathologie liée à un déséquilibre du rapport entre la formation de l'ose et la résorption osseuse.
17. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est destinée à traiter un déficit osseux résultant d'une fracture.
18. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que ladite composition est destinée à prévenir ou traiter une pathologie choisie parmi que l'ostéoporose, la maladie de Paget, la perte osseuse ou l'ostéolyse observée à proximité d'une prothèse, les maladies de l'os métastatique, l'hypercalcémie due à un cancer, les myélomes multiples, les maladies périodontales ou lOstéoarthrite.
19. Utilisation selon l'une des revendications 13 à 18, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique se présente sous une forme pour l'administration orale, parentérale ou intra-veineuse.
20. Utilisation selon l'une des revendications 13 à 18, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est adaptée à une administration orale d'une quantité quotidienne comprise entre 0,01 à 500 mg du composé hisperidine ou de l'un de ses dérivés.
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