FR3066919A1 - Composition de phycocyanine pour son utilisation pour inhiber la resorption osseuse. - Google Patents

Abstract

La présente invention est relative à une composition de phycocyanine pour son utilisation pour inhiber la résorption osseuse chez l'homme ou l'animal.

Description

TITRE DE L’INVENTION

Composition de phycocyanine pour son utilisation pour inhiber la résorption osseuse.

DOMAINE DE L’INVENTION

La présente invention se rapporte au domaine de l’inhibition de la résorption osseuse chez l’homme ou l’animal.

ETAT DE LA TECHNIQUE

L'os n'est pas un tissu statique. L'os subit un remodelage constant par destruction et synthèse de novo du tissu osseux dans un processus complexe impliquant deux types principaux de cellules, respectivement les ostéoblastes qui produisent du tissu osseux nouveau et les ostéoclastes qui détruisent l'os.

Le remodelage du tissu osseux coordonne, la vie durant, la résorption et la formation osseuses et assure ainsi le renouvellement du squelette, en sauvegardant sa structure. Lorsque le système est en équilibre, comme par exemple, avant la ménopause, il assure l'intégrité de la résistance mécanique du squelette en empêchant le vieillissement excessif de ses composantes. C'est par l'interaction du jeu cellulaire des ostéoclastes et des ostéoblastes que cette fonction essentielle est assurée. Le processus de remodelage est toujours initialisé par de la résorption, suivie après un certain délai par la formation osseuse.

Les ostéoblastes, cellules responsables de la formation de l'os, se différencient à partir de cellules précurseurs et expriment et secrétent des protéines structurales telles que le collagène de type 1, ainsi que des enzymes (phosphatase alcaline) et de nombreux peptides régulateurs et les BMP (Bone Morphogenetic proteins) (Stein G. et al., 1990, Curr. Opin CellBiol. vol. 2 : 1018-1027 ; Harris S étal., 1994, J. Bone Miner Res Vol. 9 : 855-863).

Les ostéoclastes sont des cellules multinucléées qui sont responsables de la perte osseuse, dans un processus communément désigné la résorption osseuse.

En période de croissance de l'homme ou l'animal, l'activité de formation de l'os prédomine : c'est l'acquisition du capital osseux.

A l'âge adulte, chez l'homme ou l'animal, l'action équilibrée des ostéoblastes et des ostéoclastes permet un maintien dans le temps de la masse osseuse et assure simultanément un remodelage du tissu osseux par résorption et synthèse de novo de l'os.

Cependant, avec l'âge, il se produit un déséquilibre dans le processus de remodelage osseux, qui aboutit à une perte d'os, qui est désignée ostéopénie.

L'ostéopénie liée à l'âge est un phénomène universel, non pathologique en soi, mais qui constitue le terrain de l'ostéoporose puisque la réduction de la masse osseuse est le facteur étiologique essentiel dans la genèse de cette affection, ce qui n'exclut cependant pas l'influence d'autres paramètres tels que, par exemple, l'architecture du squelette ou la propension à chuter.

En effet, exacerbée, cette ostéopénie aboutit au risque fracturaire (densité minérale audessous de laquelle le moindre choc est susceptible de provoquer une fracture) qui détermine l'apparition de l'ostéoporose.

On peut donc concevoir l'ostéoporose (post-ménopausique ou sénile) comme une pathologie infantile dont la prophylaxie pourrait être basée aussi bien (i) sur une optimisation du capital osseux (acquis au cours de la croissance de l'individu), que (ii) sur un ralentissement de la perte osseuse liée au vieillissement.

On observe une grande hétérogénéité dans la valeur du pic de masse osseuse selon les individus, par suite de variations dans le processus de croissance osseuse dès le plus jeune âge. Ainsi, la masse osseuse maximale atteinte avant 30 ans, aussi désignée pic de masse osseuse, est-elle très variable d'un individu à l'autre. Avec l'âge, les individus possédant une valeur faible de pic de masse osseuse sont désavantagés.

Par conséquent une prise en charge précoce de l'individu doit être privilégiée, puisque les deux phases critiques pour le capital osseux sont :

- la période de croissance, permettant l'acquisition de la masse osseuse maximale (pic de masse osseuse) ;

- le vieillissement, conditionnant la vitesse de perte de la masse osseuse.

Parmi les désordres pathologiques liés à un déséquilibre du métabolisme osseux, on peut citer notamment l'ostéoporose, la maladie de Paget, la perte osseuse ou encore l'ostéolyse observée à proximité d'une prothèse.

II existe d'autres facteurs susceptibles d'accroître la perte osseuse conduisant à l'ostéoporose, telle que la consommation de cigarettes, l'abus d'alcool, un mode de vie sédentaire, un faible apport en calcium, une alimentation déséquilibrée ou encore une carence en vitamine D.

Ces différentes causes d’accroissement de la perte osseuse doivent être distinguées des causes liées à des pathologies comme le cancer ou le diabète.

Parmi les troubles liés à une résorption osseuse anormale, le plus commun est l'ostéoporose, dont la manifestation la plus fréquence est observée chez les femmes, après le début de la ménopause.

L'ostéoporose est une maladie squelettique systémique caractérisée par une réduction de la masse osseuse et une détérioration de la microarchitecture du tissu osseux, associées à une augmentation de la fragilité de l'os et de sa susceptibilité à la fracture.

Selon la classification clinique retenue par l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), l'état de santé de l'os d'un individu est déterminé par la valeur de la densité minérale osseuse (DM0), telle que mesurée par ostéodensitométrie, comparée à une valeur normale prédéterminée, cette valeur normale prédéterminée étant celle de la moyenne du pic de la densité minérale osseuse de la population âgée de 30 ans.

On distingue deux types d'ostéoporose, respectivement de type I et de type II.

L'ostéoporose de type I est six fois plus fréquente chez la femme que chez l'homme. L'ostéoporose de type I survient surtout dans un sous-groupe de femmes ménopausées, âgées de 51 à 75 ans, et est caractérisée par une perte osseuse exagérée prédominant dans l'os trabéculaire. Les fractures des corps vertébraux et de l'extrémité inférieure de l'avantbras en sont les complications habituelles.

L'ostéoporose de type I est principalement liée à la carence hormonale oestrogénique de la ménopause, et dans une certaine mesure également de l'andropause.

L'ostéoporose de type II atteint une large population d'hommes et de femmes de plus de 70 ans et est associée à des fractures du col du fémur, de l'extrémité supérieure de l'humérus et du tibia, c'est à dire des sites osseux contenant à la fois de l'os cortical et de l'os trabéculaire. Les taux circulants de parathormone (PTH) sont souvent élevés.

L'ostéoporose de type II est deux fois plus fréquente chez la femme.

Les stratégies visant à rétablir une imprégnation oestrogénique (et androgénique chez l'homme) par hormonothérapie substitutive étaient initialement fortement encouragées, notamment pour atténuer la cohorte des signes fonctionnels de la ménopause, et surtout réduire les risques vasculaires et osseux engendrés par la carence hormonale.

Néanmoins, pour diverses raisons (contre-indications, réticence à prescrire des hormones, risques accrus de cancer, etc), ce type de traitement prophylactique n’est plus appliqué en première intention. Les professionnels de santé sont donc actuellement relativement démunis en terme d’outils prophylactiques. Des traitements liés à une insuffisance du remodelage osseux sont en particulier recherchés parmi ceux qui exercent une inhibition de la résorption osseuse. Une variété d’agents inhibiteurs de la résorption osseuse sont connus, et prescrits notamment dans le traitement de l’ostéoporose, notamment de l’ostéoporose liée à l’âge.

Parmi les inhibiteurs de la résorption osseuse, on connaît les modulateurs sélectifs du récepteur oestrogénique (ou SERMs, pour Sélective Estrogenic Receptor Modulators), tels que le raloxifène. Toutefois, ce composé est dépourvu d’effet au niveau des fractures de l’extrémité supérieure du fémur (Etude More) et il est contre-indiqué chez les patients ayant des antécédents thromboemboliques. En outre ce traitement accroît la fréquence des bouffées de chaleur. On connaît également des stéroïdes synthétiques, comme la tibolone, qui possède une activité oestrogénique et progestative, avec une faible propriété androgénique, mais qui peut provoquer des leucorrhées, des vaginites, une mastodynie, ainsi qu’une prise de poids.

De fait, il existe aujourd'hui de nombreux composés actifs sur l'inhibition de la résorption osseuse, parmi lesquels on peut citer la famille des biphosphonates, comme l'étidronate ou l'alendronate (brevet européen n EP 210 728, demande de brevet US publiée sous le n 2001/0046977), les oxazolidinones thioamides (demande de brevet US publiée sous le n 2002/0010341), ou encore les composés isoflavones (demande de brevet US publiée sous le n 2002/0035074).

Parmi les agents couramment utilisés comme inhibiteurs de la résorption osseuse, on peut citer l’alendronate, le risedronate, l’ibandronate et l’acide zolédronique. On peut également citer le denosumab, lequel est un anticorps monoclonal ciblant le système RANK/RANKL. Les autorisations de mise sur le marché en tant que médicaments de ces différents composés sont restreintes à une indication curative de l’ostéoporose. Ces inhibiteurs de la résorption osseuse ne sont pas actuellement prescrits pour une activité préventive de l’ostéoporose. De plus, Tutilisation de ces inhibiteurs de la résorption osseuse entraîne une variété d’effets secondaires tels que (i) des effets gastrointestinaux indésirables pour l’alendronate, le risedronate et l’ibandronate; (ii) des lésions buccales et une ostéonécrose de la mâchoire, voire des fractures, pour l’acide zolédronique, et (iii) des atteintes cardiaques pour le denosumab.

Bien qu'il existe aujourd'hui une relative grande diversité de composés pour stimuler la formation osseuse et/ou inhiber la résorption osseuse, les professionnels de santé expriment un besoin constant pour de nouveaux composés actifs, notamment du fait du succès limité des traitements actuels et des importants effets secondaires auxquels ils sont associés.

De plus, compte-tenu du caractère chronique de certains états provoqués par un déséquilibre du métabolisme osseux, il existe un besoin pour de nouveaux composés actifs susceptibles de pouvoir être utilisés pendant une longue période de temps chez l'homme ou l'animal.

C'est pourquoi les professionnels de la santé, ainsi que les instances officielles de réglementation (rapport sur l'ostéoporose dans la Communauté Européenne, 1998), recommandent d'intégrer des thérapies validées complémentaires, voire alternatives. Une approche nutritionnelle notamment répond tout à fait à ces critères.

Il existe donc un besoin exprimé pour de nouveaux moyens destinés à prévenir ou traiter des déséquilibres du métabolisme osseux, en particulier de nouveaux moyens pour prévenir ou traiter la résorption osseuse, en particulier la résorption osseuse liée à l’âge chez l’homme ou l’animal.

RESUME DE L’INVENTION

La présente invention est relative à une composition de phycocyanine, pour son utilisation pour inhiber la résorption osseuse chez l’homme ou l’animal.

Dans certains modes de réalisation, ladite composition est une composition nutritionnelle adaptée pour une administration orale. Avantageusement, ladite composition nutritionnelle vise à prévenir une perte osseuse, aussi appelée ostéopénie, en particulier chez des individus chez lesquels la survenue d’une perte osseuse peut être attendue, par exemple en raison de l’âge ou encore d’une perte osseuse susceptible de survenir du fait d’autres facteurs, comme par exemple la prise de médicaments.

Dans certains autres modes de réalisation, ladite composition est une composition pharmaceutique à usage humain ou vétérinaire.

Dans certains modes de réalisation, ladite composition nutritionnelle ou ladite composition pharmaceutique est destinée à prévenir la perte osseuse, aussi appelée ostéopénie. Dans certains modes de réalisation, ladite composition nutritionnelle ou ladite composition pharmaceutique est destinée à prévenir la perte osseuse qui se produit avec le vieillissement ou en raison de la prise de médicaments., ou encore à prévenir la perte osseuse survenant au cours de certaines maladies telles que l’obésité, le diabète, les pathologies thyroïdiennes et les pathologies des glandes surrénales.

Dans certains modes de réalisation, ladite composition nutritionnelle est adaptée à une administration, en particulier à une administration orale, d'une quantité quotidienne allant de 0,01 à 10 000 mg du composé phycocyanine.

Dans certains modes de réalisation, ladite composition nutritionnelle est adaptée à une administration quotidienne, en particulier à une administration orale quotidienne, allant de 0,05 mg/kg à 1 000 mg/kg, avantageusement de 1 mg/kg à 200 mg/kg, ce qui inclut de 10 mg/kg à 100 mg/kg.

On rappelle qu’en moyenne, il est considéré qu’un homme ou une femme adulte pèse environ 80 kg.

Dans certains modes de réalisation, ladite composition pharmaceutique est adaptée à une administration, en particulier à une administration orale, d'une quantité quotidienne allant de 1 mg à 10 000 mg du composé phycocyanine, ce qui inclut l’adaptation à une administration quotidienne allant de 4 mg à 8000 mg.

Dans certains modes de réalisation, ladite composition pharmaceutique est adaptée à une administration quotidienne, en particulier à une administration orale quotidienne, allant de 0,05 mg/kg à 1 000 mg/kg, avantageusement de 1 mg/kg à 200 mg/kg, et de manière préférée de 10 mg/kg à 100 mg/kg.

Une composition de phycocyanine selon l’invention peut être destinée à prévenir ou traiter tout type d’ostéopénie.

Dans certains modes de réalisation, ladite composition est destinée à prévenir ou traiter une pathologie choisie parmi l'ostéoporose de type I ou de type II, les ostéoporoses secondaires, la maladie de Paget, la perte osseuse ou l'ostéolyse observée à proximité d'une prothèse.

DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure 1 illustre les résultats de mesure de la masse osseuse dans les différents groupes d’animaux. En ordonnées : valeurs de densité minérale osseuse (DM0), exprimée en gramme par centimètre cube (g/cm³ ou g/cc). En abscisse, les résultats pour chacun des groupes d’animaux, de la gauche vers la droite de la figure 1 : (i) SH-Control : groupe témoin ayant subi une pseudo-chirurgie ; (ii) OVX-Control : groupe témoin ayant subi une ovariectomie ; (iii) OVX-Spiruline : groupe ovariectomisé ayant reçu un régime alimentaire supplémenté en spiruline lysée ; (iv) OVX-phycocyanine : groupe ovariectomisé ayant reçu un régime alimentaire supplémenté en phycocyanine purifiée.

La Figure 2 illustre les résultats de mesure de la prolifération d’une lignée cellulaire de pré-ostéoblastes de souris (lignée MC3T3-E1). En ordonnées : indice de prolifération des ostéoblastes (correspondant à l’activité mitochondriale cellulaire exprimée en variation de densité optique par heure (Δ DO/h)). En abscisse, les conditions de cultures des préostéoblastes, de la gauche vers la droite de la figure 2 : (i) C10% : milieu de culture supplémenté à 10% (v/v) de sérum de veau foetal ; (ii) C2% : milieu de culture supplémenté à 2% (v/v) de sérum de veau foetal ; (iii) Phi00 : milieu de culture supplémenté à 100 pg/ml de phycocyanine purifiée, (iv) Ph250 : milieu de culture supplémenté à 250 pg/ml de phycocyanine purifiée, (v) Phi000 : milieu de culture supplémenté à 1000 pg/ml de phycocyanine purifiée, (vi) Ph2500 : milieu de culture supplémenté à 2500 pg/ml de phycocyanine purifiée.

La Figure 3 illustre les résultats de prolifération d’une lignée d’ostéoclastes de souris (lignée RAW264.7) exposés à différentes conditions de culture. En ordonnées : indice de prolifération des ostéoclastes (correspondant à l’activité mitochondriale cellulaire exprimée en variation de densité optique par minute (Δ DO/mn)). En abscisse, les conditions de culture des ostéoclastes, de la gauche vers la droite de la figure 3 : (i) C2% : milieu de culture supplémenté à 2% (v/v) de sérum de veau foetal ; (ii) C10% : milieu de culture supplémenté à 10% (v/v) de sérum de veau foetal ; (iii) Phy5 : milieu de culture supplémenté à 5 pg/ml de phycocyanine purifiée, (iv) PhylO : milieu de culture supplémenté à 10 pg/ml de phycocyanine purifiée, (v) Phy25 : milieu de culture supplémenté à 25 pg/ml de phycocyanine purifiée, (vi) PhylOO : milieu de culture supplémenté à 100 pg/ml de phycocyanine purifiée, (vii) Phy250 : milieu de culture supplémenté à 250 pg/ml de phycocyanine purifiée, (vi) PhylOOO : milieu de culture supplémenté à 1000 pg/ml de phycocyanine purifiée.

La Figure 4 illustre les mesures de l’activité enzymatique de la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) exprimée par les ostéoclastes (cellules de la lignée Raw 264.7) en culture. En ordonnées : activité TRAP, exprimée en variation de densité optique par heure et par milligramme de protéines (Δ DO/h/mg protéines). En abscisse, de la gauche vers la droite de la figure 5 : les conditions de culture des ostéoclastes suivantes : (i) C : Milieu de culture seul ; (ii) RL : milieu de culture supplémenté à 50 ng/ml de RANK-L ; (iii) RL5 : milieu RL supplémenté à 5 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (iv) RL 10 : milieu RL supplémenté à 10 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (v) RL25 : milieu RL supplémenté à 25 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (vi) RL50 : milieu RL supplémenté à 50 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (vii) RL100 : milieu RL supplémenté à 100 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (iii) Cl00 : milieu seul supplémenté à 100 pg/ml de phycocyanine purifiée.

La Figure 5 illustre les mesures de l’activité enzymatique de la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) exprimée par les ostéoclastes (cellules de la lignée Raw 264.7) en culture. En ordonnées : activité TRAP, exprimée en variation de densité optique par heure et par milligramme de protéines (Δ DO/h/mg protéines). En abscisse, de la gauche vers la droite de la figure 5 : les conditions de culture des ostéoclastes suivantes : (i) C : milieu de culture seul ; (ii) RL : milieu de culture supplémenté à 50 ng/ml de RANK-L ; (iii) groupe de deux barres. Barre de droite (gris) : : RL5 : milieu RL supplémenté à 5 pg/ml de phycocyanine purifiée ; barre de gauche (noir) : milieu RL supplémenté à la même dose d’une phycocyanine 4 fois plus pure (Sigma) (dosage sur la base d’une analyse colorimétrique) ; (iv) groupe de deux barres. Barre de droite (gris) : RL 10 : milieu RL supplémenté à 10 pg/ml de phycocyanine purifiée ; barre de gauche (noir) : milieu RL supplémenté à la même dose d’une phycocyanine 4 fois plus pure (Sigma) (dosage sur la base d’une analyse colorimétrique) ; (v) groupe de deux barres. Barre de droite (gris) : RL25 : milieu RL supplémenté à 25 pg/ml de phycocyanine purifiée ; barre de gauche (noir) : milieu RL supplémenté à la même dose d’une phycocyanine 4 fois plus pure (Sigma) (dosage sur la base d’une analyse colorimétrique) (vi) groupe de deux barres. Barre de droite (gris) : RL50 : milieu RL supplémenté à 50 pg/ml de phycocyanine purifiée ; barre de gauche (noir) : milieu RL supplémenté à la même dose d’une phycocyanine 4 fois plus pure (Sigma) (dosage sur la base d’une analyse colorimétrique) ;

La Figure 6 illustre l’expression du gène codant TRAP dans des cultures d’ostéoclastes de la lignée RAW 264.7. En ordonnées : niveau d’expression du gène codant TRAP, exprimé en nombre d’augmentations (fold increase). En abscisse, de la gauche vers la droite de la figure 7, les différentes conditions de culture auxquelles sont exposées les cellules : (i)

Control : milieu de culture seul ; (ii) RL : milieu de culture supplémenté à 50 ng/ml de RANK-L ; (iii) RL + Phy5 : milieu RL supplémenté à 5 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (iv) RL + PhylO : milieu RL supplémenté à 10 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (v) RL + Phy25 : milieu RL supplémenté à 25 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (vi) RL + Phy50 : milieu RL supplémenté à 50 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (vii) RL + PhylOO : milieu RL supplémenté à 100 pg/ml de phycocyanine purifiée.

La Figure 7 illustre l’expression du gène codant Nox4 dans des cultures d’ostéoclastes de la lignée RAW 264.7. En ordonnées : niveau d’expression du gène codant Nox4, exprimé en nombre d’augmentations (fold increase). En abscisse, de la gauche vers la droite de la figure 8, les différentes conditions de culture auxquelles sont exposées les cellules : (i) Control : milieu de culture seul ; (ii) RL : milieu de culture supplémenté à 50 ng/ml de RANK-L ; (iii) RL + Phy5 : milieu RL supplémenté à 5 pg/ml de phycocyanine purifiée ;

(iv) RL + PhylO : milieu RL supplémenté à 10 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (v) RL + Phy25 : milieu RL supplémenté à 25 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (vi) RL + Phy50 : milieu RL supplémenté à 50 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (vii) RL + PhylOO : milieu RL supplémenté à 100 pg/ml de phycocyanine purifiée.

La Figure 8 illustre l’expression du gène codant NFATC1 dans des cultures d’ostéoclastes de la lignée RAW 264.7. En ordonnées : niveau d’expression du gène codant Nox4, exprimé en nombre d’augmentations (fold increase). En abscisse, de la gauche vers la droite de la figure 9, les différentes conditions de culture auxquelles sont exposées les cellules: (i) Control : milieu de culture seul ; (ii) RL : milieu de culture supplémenté à 50 ng/ml de RANK-L ; (iii) RL + Phy5 : milieu RL supplémenté à 5 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (iv) RL + PhylO : milieu RL supplémenté à 10 pg/ml de phycocyanine purifiée ;

(v) RL + Phy25 : milieu RL supplémenté à 25 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (vi) RL + Phy50 : milieu RL supplémenté à 50 pg/ml de phycocyanine purifiée ; (vii) RL + PhylOO : milieu RL supplémenté à 100 pg/ml de phycocyanine purifiée.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION

Les inventeurs ont montré que la phycocyanine possède un effet inhibiteur sur l’activité ostéoclastique dans des modèles in vivo et in vitro de dérégulation induite du métabolisme osseux.

La phycocyanine est une protéine de la famille des phycobiliprotéines, lesquelles sont présentes dans certaines cyanobactéries. La phycocyanine est constituée de deux sousunités protéiques, respectivement les sous-unités alpha et beta. La phycocyanine comporte une pluralité de groupes chromophores prosthétiques de type biline, ces groupes chromophores étant liés à la phycocyanine de manière covalente, par l’intermédiaire de liaisons thioether, à des résidus cystéine. La phycocyanine comporte un groupe biline lié à la sous-unité alpha et deux groupes biline liés à la sous-unité beta. La phycocyanine est présente dans les cyanobactéries, telle que Spirulinaplatensis, sous la forme d’un mélange complexe de trimères, d’hexamères et de decamères (Romay et al., 2003, Current Protein and Peptide Science, Vol. 4 : 207-216).

La phycocyanine est donc une protéine retrouvée dans des extraits obtenus à partir de cyanobactéries du genre Spirulina, et en particulier à partir de Spirulina platensis. Les extraits de Spiruline ont une composition complexe. De tels extraits comprennent classiquement de 50% à 70% en poids de protéines, de 4% à 7% en poids de lipides (83% de fraction saponifiable et 17% de fraction non saponifiable), de 15% à 25% en poids de glucides, par rapport au poids de la matière sèche. Les extraits de spiruline comprennent aussi des vitamines hydrosolubles (p.ex. vitamines Bl, B2, B6, B9, B12 et vitamine C), des vitamines liposolubles (p.ex. beta-carotène, tocophérols), des pigments, de nombreux minéraux et oligo-éléments (p.ex. calcium, phosphore, magnésium, fer, zinc, cuivre, chrome, manganèse, sodium, potassium). Il est tiré parti qualitativement de la richesse en protéines des extraits de spiruline dans des compléments alimentaires, en raison de la présence de l’ensemble des acides aminés essentiels (isoleucine, leucine, lysine, méthionine, phénylalanine, tryptophane et valine). Les extraits de spiruline sont connus pour une variété de propriétés bénéfiques pour la santé, incluant une stimulation du système immunitaire, des propriétés antivirales, anticancéreuses, antioxydantes, détoxifiantes, ainsi que des effets à l’encontre de l’hyperlipidémie. Des extraits de spiruline sont commercialisés aujourd’hui comme compléments alimentaires, en raison de ses nombreux effets bénéfiques allégués. Toutefois, les extraits de spiruline peuvent aussi entraîner des effets indésirables, tels que l’induction d’une altération du métabolisme osseux, entraînant une réduction de la densité minérale osseuse, en particulier chez des individus ayant une déficience hormonale, et plus spécifiquement chez des individus ayant une déficience en œstrogènes (Ishimi et al., Biosci Biotechnol Biochem, Vol. 70(n°2) : 363-368).

C’est donc de manière tout à fait inattendue que les inventeurs ont montré que la phycocyanine, qui est l’un des composants protéiques majoritairement présents dans des extraits de spiruline, possède, à l’inverse des extraits de spiruline, des propriétés d’inhibition de la réduction du métabolisme osseux qui est observé chez les individus ayant une déficience en œstrogène.

Plus précisément, les inventeurs ont montré qu’une composition de phycocyanine possède des propriétés d’inhibition de l’activité ostéoclastique chez des individus affectés d’une déficience en œstrogènes. Il est ainsi montré dans les exemples qu’une composition de phycocyanine permet d’inhiber l’effet de réduction de la densité minérale osseuse (processus de déminéralisation) chez des individus ayant un déficit en œstrogènes. Il est notamment montré que les individus ayant reçu une composition de phycocyanine présentent une augmentation du niveau du marqueur protéique OPG (ostéoprotégérine), par rapport aux individus n’ayant pas reçu cette composition. Il est aussi montré une amélioration du rapport OPG/RANKL, RANKL (pour « Receptor Activator of Nuclear Factor Kappa B Ligand ») étant une protéine synthétisée par les ostéoblastes qui agit sur la différenciation et l’activation des ostéoclastes lorsqu’elle se lie au récepteur RANK. L’augmentation du niveau d’expression du marqueur OPG ainsi que du rapport OPG/RANK-L chez les individus ayant reçu une composition de phycocyanine est indicative d’un effet inhibiteur de la différenciation et de l’activation des ostéoclastes et d’une orientation favorable du métabolisme osseux (vers l’ostéoformation).

Il est aussi montré qu’une composition de phycocyanine induit une inhibition de la prolifération et de la différenciation des ostéoclastes in vitro. Notamment, une composition de phycocyanine inhibe un marqueur protéique de l’activité ostéoclastique tel que la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP, pour « Tartrate-Resistant Acid Phosphatase »). Il est aussi montré qu’une composition de phycocyanine inhibe l’expression de gènes marqueurs de la différenciation des ostéoclastes, tels que les gènes trap (codant la protéine TRAP) et nfatcl (codant la protéine NFATC1), ainsi que de gènes indicatifs d’un stress oxydatif, tel que nox4 (codant la protéine N0X4).

Les inventeurs ont également montré qu’une composition de phycocyanine induit une prolifération des ostéoblastes.

De plus, comme cela est montré dans les exemples, la phycocyanine ne présente pas de manière détectable d'effet mimant l'activité d'un composé de type oestrogénique, dit aussi effet « estrogen-like », comme en témoignent le faible poids des cornes utérines, ainsi que l'absence de prise de poids des rates traitées. Ces résultats confirment l'intérêt de la phycocyanine pour la prévention ou le traitement de la résorption osseuse chez l'homme ou l'animal, tout particulièrement dans une situation de déficit hormonal. En raison de l’absence d’effet « estogen-like » provoqué par une composition de phycocyanine au sens de l’invention, une telle composition peut être administrée indifféremment (i) à l’homme ou à la femme et (ii) à tout animal non-humain, y compris à tout mammifère non humain, de sexe mâle ou femelle.

L’ensemble de ces résultats expérimentaux montrent que l’administration d’une composition de phycocyanine possède une action bénéfique sur le métabolisme osseux chez des individus affectés d’un déficit en œstrogène. Ces résultats montrent qu’une composition de phycocyanine permet de prévenir, au moins en partie, la perte osseuse qui est provoquée par une réduction de l’imprégnation oestrogénique.

Sans vouloir être liés par une quelconque théorie, les inventeurs pensent que l’activité d’une composition de phycocyanine sur le métabolisme osseux des individus ayant un déficit en œstrogènes est due principalement à une activité d’inhibition de la résorption osseuse, bien qu’une partie de l’activité d’une composition de phycocyanine puisse être due également à une activité de stimulation de la formation de l’os, puisqu’une induction de la prolifération des ostéoblastes est aussi montrée.

La présente invention est relative à une composition de phycocyanine pour son utilisation pour inhiber la résorption osseuse chez l’homme ou l’animal.

Dans certains modes de réalisation, ladite composition de phycocyanine est une composition nutritionnelle. Dans des modes de réalisation préférés d’une composition nutritionnelle de phycocyanine, une telle composition est adaptée pour une administration orale.

Par « phycocyanine », on entend selon l’invention la protéine référencée sous le n° CAS 11016-15-2. Préférentiellement, il s’agit d’une phycocyanine originaire d’une cyanobactérie de l’espèce Spirulinaplatensis.

Par Phycocyanine, on entend la protéine entière, ce qui n’englobe pas des fragments peptidiques de cette protéine.

Par « composition de phycocyanine », on entend selon l’invention une composition enrichie en phycocyanine, c’est-à-dire une composition comprenant au moins 40% en poids de phycocyanine, par rapport au poids sec total de la composition.

Dans la présente description, on entend par « poids sec », le poids en matière sèche de ladite composition. Le poids de matière sèche peut être déterminé par l’homme du métier selon toute technique connue, y compris après élimination de l’eau par dessiccation de la composition à l’étuve jusqu’à évaporation complète de l’eau qui était initialement contenue dans celle-ci. L’étape de dessiccation à l’étuve peut être conventionnellement réalisée à une température variant de 103°C à 110°C à pression atmosphérique.

Selon la présente description, une composition de phycocyanine comprenant au moins 40% en poids de phycocyanine, par rapport au poids sec de la composition, englobe les compositions de phycocyanine comprenant au moins 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%,

62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%,

77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%,

92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% et 99% en poids de phycocyanine, par rapport au poids sec total de la composition.

Selon cette définition, une composition de phycocyanine comprend au plus 60% en poids de composés autres que a phycocyanine, par rapport au poids sec de la composition, ce qui englobe les compositions de phycocyanine comprenant au plus 59%, 58%, 57%, 56%,

55%, 54%, 53%, 52%, 51%, 50%, 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%,

40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%,

25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%,

10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% et 1% en poids de composés autres que la phycocyanine, par rapport au poids sec total de la composition.

Dans une composition de phycocyanine conforme à l’invention, les composés autres que la phycocyanine peuvent être des composés présents initialement dans le matériau de départ qui a été utilisé, par exemple dans le matériau de départ issu de spiruline, préalablement à la mise en œuvre d’un procédé d’extraction et d’enrichissement en phycocyanine à partir du matériau brut de départ.

Une variété de compositions comprenant au moins 40% en poids de phycocyanine sont accessibles dans le commerce. On peut citer notamment les compositions suivantes : (i) C

Phycocyanin commercialisées par la société Sigma-Aldrich sous la référence n° P2172 et n° P6161, (ii) C-Phycocyanin (Spirulina sp) commercialisée par la société Prozyme (Hayward, Canada) sous la référence n° PB 11, (iii) C-phycocyanin commercialisée par la société Soley Institute (Istamboul, Turquie) sous la référence A620/280.

La phycocyanine peut aussi être obtenue par extraction à partir de certaines cyanobactéries telle que la cyanobactérie Arthrospira platensis, selon des méthodes connues de l’homme du métier. Afin d’obtenir une composition de phycocyanine à partir de Arthrospira plalerisis, l’homme du métier peut notamment se référer aux méthodes décrites par Moraes et al. (2011, Brazilian Journal of Chemical Engineering, Vol. 28 (n°l) : 45-49), Kamble et al. (2013, J Applied Pharmaceutical Science, Vol. 3 (n°8) : 149-153), Sivasankari et al. (International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences , Vol. 3 (n°8) : 904909), Slimane et al. (2014, Bull InstNatn Scien Tech Mer de Salammbô, Vol. 42 : 13-15); Kumar et al. (2014, J Plant Physiol, Vol. 19 (n°2) : 184-188), Manirafasha et al. (2017, Journal of Applied Phycology, : 1-10, doi:10.1007/sl0811-016-0989-y), Paswan et al. (2016, J Fluoresc. Vol. 26(2):577-83. doi: 10.1007/sl0895-015-1742-7); Chethana et al. (2015, JFood Sci Technol. Vol. 52(4):2415-21. doi: 10.1007/sl3197-014-1287-9), Seo et al. (2013, Int J Mol Sci. Vol. 14(1): 1778-87. doi: 10.3390/ijmsl4011778) ou encore dans la demande PCT n° WO 2014/045177.

Par inhibition de la résorption osseuse, on entend selon l'invention, une inhibition de l'activité de destruction du tissu osseux par les ostéoclastes. Pour vérifier que l'apport de phycocyanine, chez l'homme ou l'animal, inhibe la résorption osseuse, l'homme du métier peut par exemple mesurer l'excrétion urinaire de désoxypyridinoline, une diminution de l'excrétion de la désoxypyridinoline étant le reflet d'une inhibition de la résorption osseuse (in : Les marqueurs biologiques de remodelage osseux : variations pré-analytique et recommandations pour leur utilisation., P. Garnero, F. Bianchi, P.C. Carlier, V. Genty, N. Jacob, S. Kamel, C. Kindermans, E.Pluvier, M. Pressac & J.C. Souberbielle. Annales de Biologie Clinique, 58 (6), 683-704 (2000)). De manière préférée, pour mesurer l’inhibition de la résorption osseuse, l’homme du métier peut mesurer le niveau sérique d’un autre marqueur protéique, le télopeptide C de pontage du collagène de type 1 (ou « CTX » pour « Collagen type 1 cross-linked C-telopeptide »): Pour la mesure du niveau sérique du CTX, l’homme du métier peut se référer à l’article de Ganero et al. (2017,. Mol Diagn Ther. doi: 10.1007/s40291-017-0272-l). Pour la mesure du niveau sérique du CTX, l’homme du métier peut par exemple utiliser des kits de mesure commercialisés, tels que le kit CTX (Osteoporosis test) commercialisé par la Société LifeLabs®, encore le kit de test CTX commercialisé par la Société Roche, le kit de test ELISA commercialisé sous la référence n° LS-F20998 par la Société LifeSpan BioSciences Inc., ou encore le kit de test ELISA commercialisé sous la référence n° AC-02F1 par la Société Immunodiagnosticsystem (IDS)

Une composition nutritionnelle ou une composition thérapeutique de phycocyanine comme composé actif est destinée tout d'abord à la prévention de la perte osseuse due à un déséquilibre dans le remodelage du tissu osseux, chez l'homme ou l'animal, en particulier chez un mammifère non humain, notamment un mammifère domestique comme le chien ou le chat, les équins tel que le cheval, ou encore chez les animaux autres que les mammifères telles que les espèces aviaires, ce qui inclut les espèces aviaires d’élevage tels que les poules, les oies, les canards, les dindons, les pigeons etc..

La composition de phycocyanine est notamment destinée aux individus présentant des symptômes de déficit osseux (ostéopénie), ou susceptibles de souffrir de déficit osseux, c'est- à-dire d'un déséquilibre du rapport entre la formation de l'os et la résorption osseuse lequel, s'il se poursuit, induit une diminution de la masse osseuse.

Pour déterminer si un sujet présente un état d'ostéopénie (masse osseuse réduite), et nécessite en conséquence un apport de phycocyanine, l'homme du métier pourra se référer notamment au rapport de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) de 1994 intitulé Assessment of fracture risk and its application to screening for post-menopausal osteoporosis WHO Technical Sériés- 843.

Une composition nutritionnelle ou pharmaceutique à destination humaine ou vétérinaire selon l’invention est utile pour prévenir la perte osseuse qui se produit avec le vieillissement.

En particulier, une composition nutritionnelle ou pharmaceutique à destination humaine ou vétérinaire selon l'invention est utile dans le traitement de situations physiologiques telles que l'ostéoporose de type I ou de type II, les ostéoporoses secondaires, la maladie de Paget, la perte osseuse ou l'ostéolyse observée à proximité d'une prothèse.

Les ostéoporoses secondaires englobent la résorption osseuse qui est provoquée dans des situations physiologiques induites lors de la survenue de maladies telles que l’ostéosarcome, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthite rhumatoïde, les syndromes de malabsorption, T hypogonadisme, l’hyperparathyroïdie primaire, le diabète, l’obésité, la maladie pulmonaire obstructive chronique, la maladie chronique hépatique, l’insuffisance rénale chronique, les troubles neurologiques, le sida, l’hyperthyroïdie non traitée et l’ostéomalacie.

Ainsi, le traitement des ostéoporoses secondaires concerne le traitement de situations physiologiques de résorption osseuse qui ne sont pas la cause de la maladie à traiter mais sont un déséquilibre physiologique concomitant à la maladie à traiter. , . En d’autres termes, l’administration d’une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description à un patient affecté d’une pathologie spécifique ne vise pas à exercer un effet curatif sur la maladie elle-même. L’administration à un patient d’une composition de phycocyanine vise donc à inhiber la résorption osseuse qui est concomitante à la survenue de ladite pathologie.

Une composition de phycocyanine selon l'invention peut se présenter sous la forme d'une composition nutritionnelle ou encore sous la forme d'une composition pharmaceutique, comme cela est décrit ci-après.

Compositions nutritionnelles de phycocyanine.

Comme cela a déjà été mentionné ci-dessus, de nombreux troubles liés à un déséquilibre du métabolisme osseux, telle que l'ostéoporose, évoluent progressivement sur une longue période de temps et nécessitent des traitements chroniques. Leur prévention ou leur traitement peut donc être réalisé grâce à un apport régulier de phycocyanine, préférentiellement sous la forme d'une composition nutritionnelle.

En particulier, un apport nutritionnel régulier de phycocyanine est utile pour prévenir la perte osseuse qui se produit au cours du vieillissement.

L'invention a pour objet une composition nutritionnelle pour inhiber la résorption osseuse, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de composé nutritionnel actif, de la phycocyanine.

Par composition nutritionnelle, on entend une composition comprenant, en tant qu’agent actif à l’encontre de la résorption osseuse, une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description et constituant une composition alimentaire ou encore un supplément alimentaire ne possédant pas les caractéristiques d'un médicament.

Une composition nutritionnelle selon l’invention peut comprendre de 1% en poids à 90% en poids d’une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description.

Les différentes utilisations de la phycocyanine pour la fabrication d'une composition nutritionnelle seront définies ci-après en relation avec les caractéristiques techniques de ladite composition nutritionnelle.

Une composition nutritionnelle selon l'invention est préférentiellement adaptée pour une administration orale.

Selon un premier aspect, une composition nutritionnelle selon l'invention est un aliment diététique utilisé pour le maintien d'une bonne santé de l'homme ou l'animal qui l'ingère. Une telle composition nutritionnelle est également communément désignée aliment fonctionnel, lequel est destiné à être consommé, soit comme partie intégrante du régime alimentaire, soit comme supplément alimentaire, mais dont le contenu en phycocyanine implique un rôle physiologique allant au-delà de la fourniture des besoins nutritifs de base. Une composition nutritionnelle selon l’invention englobe des compositions alimentaires enrichies en phycocyanine.

Selon certains aspects, ladite composition nutritionnelle est destinée à prévenir la perte osseuse qui se produit avec le vieillissement (ostéopénie).

Selon d’autres aspects, ladite composition nutritionnelle est destinée à prévenir ou traiter des troubles liés à un déséquilibre du rapport entre la formation de l'os et la résorption osseuse.

Selon encore d’autres aspects, ladite composition nutritionnelle est destinée à prévenir des troubles physiologiques choisis parmi l’ostéopénie, l'ostéoporose de type I ou de type II, les ostéoporoses secondaires, la maladie de Paget et la perte osseuse ou l'ostéolyse observée à proximité d'une prothèse.

Une composition nutritionnelle, laquelle comprend une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description, peut se présenter sous une grande diversité de formes de compositions alimentaires et de boissons, y compris des jus (de fruits ou de légumes ou d’algues), laits végétaux, huiles, beurres, margarines, matières grasses végétales, conserves (par exemple thon à l'huile), soupes, préparations à base de lait (yaourts, fromage blanc), glaces, fromages (par exemple des fromages conservés dans de l'huile), produits cuits (tels que le pain, les biscuits, crêpes et les gâteaux), desserts, produits de confiserie, barres de céréales, céréales pour le petit déjeuner, condiments, produits d'assaisonnement des aliments (notamment épices et sauces).

Dans certains modes de réalisation, une composition nutritionnelle selon l’invention peut se présenter sous forme liquide, par exemple sous forme d’une solution aqueuse ou sous la forme d’une solution huileuse.

Dans d’autres modes de réalisation, une composition nutritionnelle selon l’invention peut se présenter sous une forme solide, par exemple sous forme de poudre. Notamment, la composition nutritionnelle peut-être lyophilisée et se présenter sous la forme d’une poudre. Une composition nutritionnelle selon l'invention peut aussi se présenter sous la forme d'une grande diversité de produits destinés à l'alimentation animale, qu'ils soient sous forme humide, sous forme semi-humide ou sous forme sèche, notamment sous la forme de croquettes, granulés.

Dans certains modes de réalisation d’une composition nutritionnelle selon l’invention, la composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description et qui est comprise dans ladite composition nutritionnelle, se présente sous la forme d'un produit d'extraction obtenu à partir d'une cyanobactérie, appartenant à la famille des spirulines, et en particulier de Spirulinaplatensis.

Dans d’autres modes de réalisation, une composition nutritionnelle selon l'invention se présente sous la forme de tout produit, en particulier toute boisson, par exemple une boisson aromatisée.

Selon un autre aspect, dans une composition nutritionnelle selon l'invention, la composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description peut être produite par extraction ou par synthèse. On peut en particulier utiliser une phycocyanine recombinante produite par des cellules hôtes transfectées ou transformées par un polynucléotide comprenant une cassette d’expression codant la phycocyanine.

De préférence, une composition nutritionnelle selon l'invention comprend une quantité de phycocyanine adaptée à une administration orale quotidienne variant de 0,05 mg à 10 000 mg.

A titre illustratif, dans des modes de réalisation dans lesquels on fabrique une composition nutritionnelle en utilisant une composition de phycocyanine ayant une teneur en phycocyanine de 50 pour cent en poids par rapport au poids total de la composition de phycocyanine, on parvient à une composition nutritionnelle comprenant 1 000 mg de phycocyanine en incluant 2 000 mg de composition de phycocyanine à la composition nutritionnelle en préparation.

Pour une consommation chez l'homme, une composition nutritionnelle selon l'invention comprend une quantité de phycocyanine adaptée à un apport quotidien en phycocyanine, fourni par ladite composition, variant de 1 mg à 10 000 mg, avantageusement de 4 mg à 8 000 mg, ce qui inclut de 5 mg à 6 000 mg.

Les résultats des exemples montrent une efficacité d’une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description, pour inhiber la résorption osseuse, lorsque qu’une telle composition est administrée chez la souris en une quantité quotidienne de phycocyanine de 1 mg, soit à raison d’une dose quotidienne de 500 mg par kilogramme de poids vif.

L’homme du métier peut déterminer, à l’aide de méthodes connues, les doses efficaces chez d’autres mammifères, y compris chez l’homme (Hemon et al., Colloque Science et décision en santé environnementale”, Sep 1996, Metz, France.ineris-00971997 ; Meyer C., ed. sc., 2017, Dictionnaire des Sciences Animales. [On line], Montpellier, France, Cirad. [21/05/2017], <URL : http://dico-sciences-animales.cirad.fr/>).

Selon ces méthodes connues, cela signifie qu’une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description est efficace, pour inhiber la résorption osseuse chez l’homme, à une dose quotidienne de phycocyanine de 55 mg par kilogramme de poids vif, soit une dose quotidienne de phycocyanine de (i) 4 400 mg pour un humain de 80 kgs et de (ii) de 5 500 mg pour un humain de 100 kgs.

Ainsi, dans certains modes de réalisation, une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description est adaptée à une administration quotidienne chez l’homme d’une quantité de phycocyanine allant de 4 mg à 10 000 mg, selon notamment le poids de l’individu considéré.

De manière illustrative, une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description est efficace, pour inhiber la résorption osseuse chez le chat, à une dose quotidienne de phycocyanine de 100 mg par kilogramme de poids vif-.

Par exemple également, une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description est efficace, pour inhiber la résorption osseuse chez le chien, à une dose quotidienne de phycocyanine 70 mg par kilogramme de poids vif.

A titre d’autre illustration, une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description est efficace, pour inhiber la résorption osseuse chez le cheval, à une dose quotidienne de phycocyanine de 30 mg par kilogramme de poids vif.

De manière générale, une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description est de préférence adaptée pour une administration quotidienne de phycocyanine allant de 0,05 mg/kg à 1 000 mg/kg, ce qui englobe de 1 mg/kg à 200 mg/kg, par exemple de 10 mg/kg à 100 mg/kg.

Selon encore un autre aspect, la composition nutritionnelle ci-dessus peut comprendre d'autres composés nutritionnels, en combinaison avec la phycocyanine.

Dans certains modes de réalisation, en particulier dans les modes de réalisation dans lesquels la composition de phycocyanine est préparée par purification de la phycocyanine à partir d’extraits, tout spécialement à partir d’extraits de cyanobactéries, la composition de phycocyanine peut comprendre, outre la protéine phycocyanine, également des composés susceptibles de consister en des composés nutritionnels, telles que des vitamines, des lipides, des glucides, des oligoéléments, des sels minéraux, ou encore d’autres phytoconstituants, qui étaient initialement contenus dans un extrait brut de départ.

Dans d’autres modes de réalisation, la composition nutritionnelle comprend d’autres composés nutritionnels, lesquels ont été ajoutés à la composition de phycocyanine de départ.

Ainsi, la composition nutritionnelle selon l'invention peut également comprendre une source de calcium, par exemple sous la forme d'un composé organique ou inorganique physiologiquement acceptable, tels que des sels de calcium inorganique (chlorure de calcium, phosphate de calcium, sulfate de calcium, oxyde de calcium, hydroxyde de calcium ou carbonate de calcium) ou des composants organiques contenant du calcium telle que la poudre de lait écrémé, le caséinate de calcium ou encore des sels organiques de calcium (citrate de calcium, maléate de calcium ou leurs mélanges).

La quantité de calcium contenue dans une composition nutritionnelle selon l'invention est adaptée pour une administration quotidienne, fournie par ladite composition, comprise entre 100 mg et 1000 mg, de préférence entre 200 mg et 700 mg et de manière tout à fait préférée entre 300 mg et 600 mg de calcium.

Une composition nutritionnelle selon l'invention peut également comprendre des vitamines, telle que la vitamine A, la vitamine D, la vitamine E, la vitamine K, la vitamine C, l'acide folique, la thiamine, la riboflavine, la vitamine B6, la vitamine B12, la niacine, la biotine ou encore l'acide pantothénique.

Une composition nutritionnelle selon l'invention peut également comprendre des éléments minéraux et des éléments trace tels que le sodium, le potassium, le phosphore, le magnésium, le cuivre, le zinc, le fer, le sélénium, le chrome et le molybdène.

Elle peut également comprendre des fibres solubles telles que l'agar-agar, un alginate, du caroube, du carragheenan, de la gomme arabique, de la gomme de guar, de la gomme de karaya, de la pectine ou de la gomme xanthane, ces fibres solubles étant sous une forme hydrolysée ou non hydrolysée.

Elle peut de plus comprendre des protéines, par exemple des protéines à valeur nutritionnelle, tels que des hydrolysats de protéines, en particulier des hydrolysats de protéines de lait, des isolats de protéines de lait contenant de la caséine micellaire, des hydrolysats de protéines de viande, des protéines végétales, etc.

Elle peut aussi comprendre des composés source d'énergie, notamment une ou plusieurs sources d'hydrates de carbone choisis parmi les maltodextrines, l'amidon, le lactose, le glucose, le sucrose, le fructose, le xylitol, les sucres fermentescibles tels que l’inuline et les fructo-oligosaccharides, le sorbitol et éventuellement les acides gras tels que les oméga-3. En outre, une composition nutritionnelle selon l'invention peut également comprendre des épices, des herbes aromatiques ou encore d’autres micro-nutriments tels que d’autres polyphénols, des stérols, des acides phénoliques, des stilbènes, des caroténoïdes, des iridoïdes, des organo-souffrés et des terpènes.

Comme cela a déjà été mentionné précédemment, une composition de phycocyanine destinée à inhiber la résorption osseuse selon l'invention peut aussi être comprise dans une composition pharmaceutique, comme décrit ci-dessous.

Compositions pharmaceutiques humaines ou vétérinaires selon l'invention.

L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire pour son utilisation pour inhiber la résorption osseuse, caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description.

En particulier, l'invention concerne l'utilisation d’une composition de phycocyanine pour la fabrication d'une composition pharmaceutique à usage humain ou vétérinaire pour la prévention ou le traitement d'une pathologie liée à un déséquilibre du métabolisme osseux, et tout spécialement une composition pharmaceutique apte à inhiber la résorption osseuse.

Les utilisations d’une composition de phycocyanine pour la fabrication d'une composition pharmaceutique seront décrites en relation avec les caractéristiques techniques de ladite composition pharmaceutique ci- après.

Une composition pharmaceutique selon l'invention comprend, en tant que principe actif, une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description, en une quantité adaptée pour inhiber la résorption osseuse chez des individus nécessitant un tel traitement.

Selon certains aspects, une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire selon l'invention est utile pour prévenir la perte osseuse qui se produit, au cours du vieillissement.

Dans certains modes de réalisation, une composition pharmaceutique à destination humaine ou vétérinaire selon l'invention est utile dans la prévention de la perte osseuse qui se produit au cours du vieillissement (ostéopénie).

Selon certains autres aspects, une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire selon l'invention est utile pour prévenir ou traiter des troubles ou des pathologies liés à un déséquilibre du rapport entre la formation de l'os et la résorption osseuse.

Dans certains modes de réalisation, une composition pharmaceutique à destination humaine ou vétérinaire selon l'invention est utile dans le traitement de troubles physiologiques liées à un déséquilibre du remodelage osseux, telles que, l’ostéopénie, l'ostéoporose de type I ou de type 11, les ostéoporoses secondaires, la maladie de Paget et la perte osseuse ou l'ostéolyse observée à proximité d'une prothèse.

Les ostéoporoses secondaires englobent la résorption osseuse qui est provoquée dans des situations physiologiques induites lors de la survenue de maladies telles que l’ostéosarcome, la polyarthrite rhumatoïde, la spondylarthite rhumatoïde, les syndromes de malabsorption, l’hypogonadisme, l’hyperparathyroïdie primaire, le diabète, l’obésité, la maladie pulmonaire obstructive chronique, la maladie chronique hépatique, l’insuffisance rénale chronique, les troubles neurologiques, le sida, l’hyperthyroïdie non traitée et l’ostéomalacie.

Ainsi, le traitement des ostéoporoses secondaires concerne le traitement de situations physiologiques de résorption osseuse qui ne sont pas à l’origine d’une maladie à traiter, mais sont concomitantes à la maladie à traiter. En d’autres termes, l’administration d’une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description à un patient affecté d’une polyarthrite rhumatoïde ne vise pas à exercer un effet curatif sur la maladie elle-même. L’administration à ce patient d’une composition de phycocyanine vise exclusivement à inhiber la résorption osseuse qui est concomitante à la survenue d’une polyarthrite rhumatoïde.

Il peut s'agir d'une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire, en particulier pour le chien ou le chat, les équins tel que le cheval, ou encore chez les espèces aviaires, ce qui inclut les espèces aviaires d’élevage tels que les poules, les oies, les canards, les dindons, les pigeons etc..

La composition pharmaceutique selon l'invention se présente sous une forme pour l'administration orale, parentérale, intramusculaire ou intra-veineuse.

Dans sa forme destinée à l'administration humaine, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend avantageusement, une quantité de phycocyanine adaptée pour une administration quotidienne du composé actif, fournie par ladite composition, variant de 0,01 mg à 10 000 mg.

Pour une administration chez l'homme, une composition pharmaceutique selon l'invention comprend une quantité de composé actif adaptée à un apport quotidien en phycocyanine, fourni par ladite composition, variant de 0,01 mg à 10 000 mg, de préférence de 1 mg à 8 000 mg et de manière tout à fait préférée de 10 mg à 6 000 mg.

De manière générale, une composition pharmaceutique telle que définie dans la présente description est de préférence adaptée pour une administration quotidienne allant de 0,05 mg/kg à 1 000 mg/kg, ce qui englobe de 1 mg/kg à 200 mg/kg, par exemple de 10 mg/kg à 100 mg/kg.

Une composition pharmaceutique selon l'invention comprend une composition de phycocyanine telle que définie dans la présente description en association avec au moins un excipient choisi dans le groupe constitué par les excipients pharmaceutiquement acceptables.

Des techniques de préparation de compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être aisément retrouvées par l'homme du métier, par exemple dans l'ouvrage Remmingston's Pharmaceutical Sciences, Mid. Publishing Co, Easton, PA, USA.

Des adjuvants, des véhicules et des excipients physiologiquement acceptables sont aussi décrits dans l'ouvrage intitulé « Handbook of Pharmaceutical Excipients, Seconde édition, American Pharmaceutical Association, 1994 ».

Pour formuler une composition pharmaceutique selon l'invention, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à la dernière édition de la Pharmacopée Européenne ou de la Pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique (USP).

L'homme du métier pourra notamment avantageusement se référer à la quatrième édition 2002 de la Pharmacopée Européenne, ou encore à l'édition USP 25-NF 20 de la Pharmacopée Américaine (U. S. Pharmacopeia).

Une composition pharmaceutique telle que définie ci-dessus est adaptée pour une administration orale, parentérale, intramusculaire ou intra-veineuse.

Lorsque la composition pharmaceutique selon l'invention comprend au moins un excipient pharmaceutique ou physiologiquement acceptable, il s'agit en particulier d'un excipient approprié pour une administration de la composition par voie orale ou d'un excipient approprié pour une administration de la composition par voie parentérale.

L'invention concerne aussi une méthode pour prévenir ou traiter un trouble lié à un déséquilibre du métabolisme osseux, en particulier un trouble associé à une perte de la masse osseuse, ladite méthode comprenant une étape au cours de laquelle on administre aux patients une quantité thérapeutiquement efficace d’une composition de phycocyanine ou encore d'une composition pharmaceutique contenant de la phycocyanine.

Une composition pharmaceutique comprenant de la phycocyanine selon l'invention se présente indifféremment sous une forme solide ou sous une forme liquide.

Pour une administration orale, on préférera une composition pharmaceutique solide, sous la forme de comprimés, de capsules ou de gélules.

Sous la forme liquide, on préférera une composition pharmaceutique sous la forme d'une suspension aqueuse ou d'une suspension lipidique, ou encore sous la forme d'une émulsion eau-dans- huile ou huile-dans-eau.

Des formes pharmaceutiques solides peuvent comprendre, en tant que véhicules, adjuvants ou excipients, au moins un agent diluant, un arôme, un agent solubilisant, un agent lubrifiant, un agent de suspension, un agent liant, un agent désintégrant et un agent d'encapsulation, l'identité et la fonction de ces différents excipients classiques étant documentées complètement dans la Pharmacopée Européenne ou dans la Pharmacopée des Etats-Unis d'Amérique (USP).

Dans certains modes de réalisation, une composition pharmaceutique solide englobe celles se présentant sous la forme de nanoparticules, ce qui inclut les nanoparticules de silice mésoporeuse, le cas échéant fonctionnalisées ; lesquelles permettent une libération contrôlée, le cas échéant une libération retardée, de la composition de phycocyanine.

De tels composés sont par exemple le carbonate de magnésium, le stéarate de magnésium, le talc, le lactose, la pectine, la dextrine, l'amidon, la gélatine, des matériaux cellulosiques, du beurre de cacao, etc.

Les compositions sous forme liquide peuvent comprendre également de l'eau, le cas échéant en mélange avec du propylène glycol ou du polyéthylène glycol, et éventuellement aussi des agents de coloration, des arômes, des stabilisants et des agents épaississants tels que des sucres dans les formes liquides du type sirop.

Pour la fabrication d'une composition pharmaceutique selon l'invention, la composition de phycocyanine, peut être préparée conformément à l'enseignement des différents documents de brevets cités précédemment dans la description.

L'invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.

EXEMPLES

A. MATERIELS ET METHODES

A.l. Etude animale

A. 1.1. Choix du modèle animal

L'expérimentation a été conduite sur des souris ovariectomisées à 8 semaines, un modèle adapté à l'étude de l’ostéoporose post-ménopausique et ayant déjà été utilisé à plusieurs reprises pour tester des interventions nutritionnelles ou le potentiel d'extraits végétaux.

A. 1.2. Aspects législatifs et techniques

Les procédures liées à l’expérimentation animale ont été approuvées par le Comité d’éthique de l’institut, en respectant les recommandations de TUnion Européenne. Les souris ont été logées au sein de l’animalerie de TUnité de Nutrition Humaine, dans un environnement contrôlé : cycle lumière - obscurité 12h-12h, température ambiante comprise entre 20 et 22°C, humidité relative de 50-60%, modalités d'hébergement : une souris par cage avec eau en accès libre.

Un régime standard (AIN 93) a été fourni par TUnité de Préparation des Aliments Expérimentaux (UE0300 UPAE) du Centre INRA de Jouy-en-Josas. En fonction des lots expérimentaux, les souris ont été supplémentées par gavage avec deux composants différents :

a) Dans le premier groupe, la supplémentation est constituée de 500 mg /kg poids vif de spiruline lysée (10 mg/j/souris), apportant 1 mg de phycocyanine.

b) Dans le deuxième cas, les animaux recevaient 500 mg /kg poids vif de phycocyanine purifiée à partir de la Spiruline (soit 10 mg/j/ souris). La dose de spiruline choisie était basée sur le fait que les compléments alimentaires disponibles sur le marché apportent quotidiennement jusqu’à 4 g de micro-algues pour un poids corporel moyen de 60 kg. En ce qui concerne l'extrapolation à l'animal, en se référant à la correspondance du poids métabolique (P^0,75), une souris consommera 12,5 mg /jour de spiruline, soit 500 mg/kg de poids vif.

Quarante-huit souris C57BL/6j femelles, âgées de huit semaines, ont été acquises auprès des laboratoires Janvier (Saint-Berthevin, France). Après 3 jours d’acclimatation, les rongeurs ont été aléatoirement répartis en 4 groupes de 12 animaux :

- deux groupes ont reçu un régime standard dit «contrôle» (Ctrl),

- les deux autres ont été exposés aux gavages test décrits ci-dessus (Spiruline ou Phycocyanine lyophilisées qui a été reprise dans une volume de 250 μΐ de sérum physiologique, puis administrée).

Le calcul de puissance déterminant le nombre minimum d'animaux requis pour démontrer un effet significatif a été établi par compilation des données de la littérature et des études précédemment réalisées (caractérisation discriminante sur la densité minérale osseuse définie comme critère principal).

Après 7 jours d'exposition à ces différents régimes, un des deux groupes soumis au régime standard a subi une pseudo chirurgie (SH-Ctrl ; groupe placebo). Tous les autres animaux ont été ovariectomisés et attribués aux groupes suivants : OVX-Ctrl, OVX-Spiruline, OVX- Phycocyanine. Les interventions chirurgicales ont été réalisées sous anesthésie (mélange d’Imalgène 1000 (lg pour lOmL) et de Rompun 2% (0,5g de xylasine pour 25mL)). Le mélange injecté (à l’aide d’une aiguille 26Gxl/2) est de lmL d’Imalgène, 0,5mL de Rompun, complété à lOmL avec du sérum physiologique. Ces lOmL de solution sont calculés pour 1kg de souris, soit 0,1g de kétamine et 0,01g de xylazine par kg de rongeur. Une goutte d’antibiotique est déposée sur la plaie après l’intervention pour réduire le risque d’infection, puis les agrafes sont posées. Pour limiter la douleur au réveil, une injection sous-cutanée, contenant une dose de buprénorphine (buprécar) à 0,1 mg/kg et de métacam à 1 mg/kg, est réalisée après l’anesthésie. Au réveil, les animaux ont eu accès à une eau contenant du paracétamol (2g/L) pendant 24h. Sur la base d’une consommation moyenne de 3mL par jour, cette solution de paracétamol permet à la souris d’ingérer 6mg de paracétamol sur 24h, soit l’équivalent de 300mg/kg de poids corporel, la DL50 étant fixée à 800mg/kg de poids corporel en injection intra-péritonéale. Pendant ces 24h, la prostration, le déplacement de l’animal et sa prise alimentaire ont été contrôlés.

Les différents régimes alimentaires ont été initiés une semaine avant l’intervention chirurgicale. Après 6 semaines d’expérimentation, les rongeurs ont été anesthésiés. Le mélange injecté était le même que celui utilisé pour l’ovariectomie (lmL d’Imalgène, 0,5mL de Rompun, complété à lOmL avec du sérum physiologique). Le sang a ensuite été prélevé en intracardiaque dans un tube Sarstedt, puis laissé à température ambiante pendant 30 minutes. Les tubes ont ensuite été centrifugés pendant 5 min à 20°C et 10000 x g. Le sérum a alors été collecté et aliquoté dans deux tubes différents (un pour chaque marqueur sérique à doser) qui ont ensuite été conservés dans un congélateur à -80°C jusqu’au dosage. Après le prélèvement sanguin, l’animal était directement euthanasié par dislocation cervicale. Le foie, la rate et l’utérus des animaux ont été prélevés et pesés, afin de contrôler la présence ou non d’une inflammation et de valider l’ovariectomie. Les fémurs gauches et droits ont également été récupérés. Un fémur sur deux a été placé dans une solution de formaldéhyde et stocké pendant une semaine à 4°C, puis transvasé dans de l’éthanol et enfin conservé à nouveau à 4°C jusqu’à l’analyse au densitomètre. L’autre fémur a été gardé directement dans des tubes dans de l’azote liquide, puis congelés à -80°C.

A. 1.3. Analyses pratiquées

A. 1.3.1. Pesée des animaux et contrôle de consommation

Le poids des animaux a été mesuré une fois par semaine. Des contrôles de consommation sur 2 jours ont été réalisés également de façon hebdomadaire.

A. 1.3.2. Echo-MRI

Le fonctionnement de l’Echo-MRI est basé sur le principe de l’imagerie par résonance magnétique nucléaire qui exploite les propriétés magnétiques des atomes et permet de déterminer la masse grasse, la masse maigre, l’eau libre et l’eau corporelle totale d’un petit animal vivant non anesthésié. Les rongeurs pénètrent dans un tube de contention en plexiglass transparent dont la taille est adaptée au poids corporel. La souris rentre d'ellemême jusqu’au fond du tube. Une légère contrainte est alors appliquée à l’aide d’un piston pour maintenir l'animal en place au fond du tube. Le temps total de contention n’excède pas 2 minutes. Une seule mesure est réalisée sur chaque individu. Deux évaluations de la composition corporelle ont été réalisées avec un EchoMRI-900 : une première quelques jours avant l’ovariectomie, une deuxième après 38 jours de traitement.

A. 1.3.3. Poids de la rate et du foie

Lors du sacrifice, la rate et le foie sont méticuleusement extraits des murins et sont immédiatement pesés.

A. 1.3.4. Biomarqueurs du métabolisme osseux

La résorption osseuse a été évaluée à l’aide de Kit Elisa de dosage immunologique RatLaps™ EIA (Immunodiagnostic Systems Ltd) qui permet de quantifier le télopeptide C du collagène de type I (CTX 1), et par l’intermédiaire du test Elisa Ret D Mouse Trance/Rank L/ TNFSF11 pour le Rank L.

En ce qui concerne la formation osseuse, le propeptide du collagène de type l(PINP) a été mesuré à l’aide d’un kit Elisa de type IDS Rat/ Mouse PINP EIA. Ce test spécifique permet de déterminer la libération de PINP durant la synthèse du collagène osseux. L’ostéoprotégérine a été dosée à l’aide du kit fourni par R&D Systems Quantikine Elisa Mouse OPG/TNFRSF 1 lb, soit un test Elisa. Les modes opératoires sont fournis par les fabricants des kits.

A. 1.3.5. Analyse morphologique des os

L’étude morphologique des fémurs a été réalisée à l'aide d'un scanner micro-CT eXplore CT 120 (GE Healthcare, Little Chalfont, United Kingdom) dans l’Unité Mixte de Recherche INSERM 990. L’acquisition consiste en 360 prises sur le tissu choisi. Les fémurs gauches sont placés dans une solution tampon PBS avec une milliseconde d’exposition par prise dans un tube pour rayon X (100 kV et 50 mA). Les images sont reconstruites en utilisant un algorithme de faisceau conique modifié avec un voxel isotrope de 0.045 x 0.045 x 0.045 mm3. Les scans obtenus ont été analysés avec le logiciel MicroViewH version 2.3 (General Electric Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA, USA). Un fantôme de calibration de l’hydroxy-apatite (SB3, Gamex RMI, WI, USA) sert de référence pour la conversion des niveaux de gris en valeurs de densité en hydroxyapatite. L’os trabéculaire de la partie distale du fémur a été sélectionné pour déterminer la densité minérale osseuse et le volume osseux (BVF = Volume de la partie osseuse / volume total), après définition d'une région cylindrique (r = 0,7 mm) d’intérêt au centre du fémur, commençant à 0,1 mm de la plaque de croissance et s’étendant à plus de

0,32 mm dans la direction proximale. La densité minérale osseuse a été estimée par la moyenne de niveaux de gris convertie dans la région d’intérêt.

A. 1.3.6. Analyses statistiques

Les résultats sont exprimés par la moyenne et l’erreur type sur la moyenne (SEM). L’étude a été menée sur un total de 13 souris par groupe (5 groupes au total), afin de permettre une analyse statistique sur au moins 8 souris par groupe en fin d’étude. Les analyses statistiques sont basées sur des tests de Fisher à l’aide logiciel XLSTAT (ExcelStat Pro Software, Microsoft Office 2013).

A.2. Etude in vitro

A. 2.1. Lignée cellulaire et condition de culture

Des MC3T3-E1 (lignée immortalisée de pré ostéoblaste) de souris ont été cultivées dans des plaques stériles à la densité de 3x 10⁴ cellules par cm². Les cellules ont été maintenues dans du milieu de culture de type alphaMEM (GIBCO, Paisley, UK) supplémenté avec 1% de pénicilline/streptomycine (GIBCO, Paisley, UK) et 10% de sérum de veau fœtal (FBS, Lonza, Levallois-Perret, France). Lorsque les cellules arrivent à 80 % de confluence environ, celles-ci ont été exposées aux différentes conditions : soit le milieu de culture seul considéré comme le contrôle négatif (C-), soit le milieu contenant 50 g/mL d’acide ascorbique et 10 mM de glycérophosphate seul (considéré comme le contrôle positif) ou bien, en présence de phycocyanine à différentes concentrations (10, 25, 50, 100, 250 pg/ml).

D'autre part, des RAW 264.7 (lignée immortalisée) de souris (ATCC, Washington, DC, USA) ont été utilisées comme modèles de pré ostéoclastes et induites par du Rank L. Les cellules ont été ensemencées dans les puits à une densité de lxlO⁴ cellules/m² et maintenues dans du milieu de culture (oc-minimal essential medium oc-MEM ; GIBCO, Paisley, UK) supplémenté avec 1% de pénicilline/streptomycine (GIBCO, Paisley, UK) et 10% de sérum de veau fœtal (FBS). Lorsque les cellules arrivaient à 80 % de confluence environ, elles ont été exposées à différentes conditions : soit le milieu de culture seul considéré comme le contrôle négatif (C-), soit le milieu de culture contenant soit un milieu de culture seul considéré comme le contrôle négatif ( C-), soit du milieu de culture contenant 50 ng/mL de receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand (RANK-L) (R&D Systems) seul (considéré comme le contrôle positif), ou bien en présence de phycocyanine à différentes concentrations (5, 10, 25, 50, 100 pg/ml).

Les deux types cellulaires ont été cultivés à 37°C dans une atmosphère humide à 5 % de CO2 dans l’air. Le milieu a été changé tous les 2 jours.

A. 2.2. Prolifération cellulaire

La mesure de la prolifération cellulaire repose sur un dosage colorimétrique. Un sel de tétrazolium XTT jaune est réduit par l’activité succinate déshydrogénase des cellules viables, en présence d’un réactif coupleur d’électron. La réaction produit un sel de formazan de couleur orange.

Les RAW264.7 et les MC3T3-E1 ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à une densité de 3,5xl0³ cellules par puits, puis cultivées pendant 2 heures avec :

a) Dans le cas des MC3T3- El, 10 % de sérum seul, 2 % de sérum seul ou avec de la phycocyanine à la concentration de 100, 250, 1000, 2500 pg/ml.

b) Dans le cas des RAW 264.7, 10 % de sérum seul, 2 % de sérum seul ou avec de la phycocyanine à la concentration de 10, 25, 50, 100, 250,1000 pg/ml.

La viabilité cellulaire a été déterminée à 24 heures par une méthode basée sur l’XTT en utilisant un kit de prolifération cellulaire (Cell Prolifération Kit II Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), en suivant les recommandations du fabricant. L’OD a été déterminée à 450 nm.

A. 2.3. Mesure de l’activité de la Phosphatase alcaline (ALP)

La phosphatase alcaline est un marqueur précoce de la formation osseuse. La mesure de son activité est basée sur la capacité de l’enzyme à catalyser l’hydrolyse du pnitrophénylphosphate (p-NPP) en p-nitrophénol, un chromogène avec une absorbance à 405 nm.

L’activité enzymatique de l’ALP a été mesurée sur les ostéoblastes à 0, 2, 7 et 14 jours conformément à la méthode publiée précédemment, adaptée à nos conditions expérimentales. La culture d’ostéoblaste est rincée deux fois avec du PBS (Sigma-Aldrich, 38297 Saint-Quentin Fallavier, France), puis placée à -20°C. Ensuite, les cellules sont lysées et homogénéisées dans du tampon diéthanolamine/magnésium chloride hexahydrate (pH 9,8 ; Sigma-Aldrich). Le lysat cellulaire (10μ1) est ajouté à 200 μΐ de solution de pnitrophényl phosphate (6 mg/ml) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). L’absorbance est mesurée à 405 nm en cinétique (toutes les 150s pendant 30 min), à 30°C, à l'aide d'un lecteur de microplaque ELX808 (BioTek Instruments Inc,Winooski, VT, USA). Enfin la mesure des protéines est réalisée en utilisant le BioRad protein assay (BioRad, Munich, Germany).

L’ALP est exprimée en micromoles de p nitrophénol par heure et par milligramme de protéines.

A. 2.4. Mesure de l’activité de la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP)

La phosphatase acide tartrate résistante est décrite comme marqueur enzymatique des ostéoclastes qui résorbent le tissu osseux. Cet enzyme, désigné aussi comme phosphatase acide du type 5, existe sous les isoformes 5oc et 5β, cette dernière exclusivement étant reconnue comme Pisoforme active 5β du TRAP spécifique des ostéoclastes. La partie inactive de la fraction 5β est produite par les macrophages.

L’activité de TRAP est mesurée conformément à la méthode standard en utilisant un kit phosphatase acide leucocytaire (Sigma Aldrich).

Après 3 jours de cultures, les cellules lysées avec le tampon NP 40 lysis buffer sont incubées à 37°C dans un tampon p nitrophényl phosphate, avec 125 mM de sodium acetate buffer (pH 5.2), et 100 mM de p-nitrophényl phosphate.

L’absorbance est mesurée à 37°C à 405 nm en cinétique à 37°C à l’aide d’un lecteur de plaque

Pour chaque échantillon, la concentration en protéine est mesurée et Trap est exprimée en DO/min/mg protéine.

A. 2.5. TLD A et méthode d’obtention des ADNc

A.2.5.1. Extraction des ARN

L’extraction qui a pour but de récupérer les éléments nécessaires afin d’analyser l’expression des transcrits se déroule en plusieurs étapes. Les acides ribonucléiques (ARNs) sont purifiés suite à une extraction au phénol-chloroforme (Trizol - Roche), puis dosés.

A.2.5.2. Rétro transcription des ARN

Des conditions d’asepsie stricte sont requises pour éviter l’application de faux positifs et la contamination. Pour réaliser la retranscription, nous avons utilisé le High capacity cDNA reverse transcription Kits (applied). Pour chaque échantillon, 20pL de solution sont préparés et déposés dans la glace. La première étape consiste à préparer le 2X reverse transcription master mix, dans la glace, constitué de L’ADN polymérase (enzyme réalisant la rétro transcription d’un ARN en ADNc), d’un tampon d'optimisation de l'activité enzymatique, d’amorces pour la fixation de la polymérase sur le brin d’ARN et bien sûr de nucléotides.

Dans une seconde phase, 10pL de mix sont additionnés à 10pL d’un mélange d’eau et d’ARN extraits à la précédente étape (les proportions au sein du mélange étant adaptées pour que la même concentration d’ARN se retrouve dans chacune des conditions à hauteur de 500 ng), dans le puits d’une plaque 96 puits.

Après centrifugation de la plaque, l’échantillon est placé dans le thermo cycler TC 512 TECHNE pour initier la réaction avec un programme adapté en vue de la réalisation du TLDA.

minutes à 25°C, puis 120 minutes à 37°C et enfin 5 minutes à 85°C.

A. 2.5.3. TLDA

L’objectif est d’amplifier la séquence ciblée et de la quantifier. La technologie TLDA (ou TaqMan® Array) permet de déterminer rapidement le profil d'expression d'un grand nombre de gènes ou de miRNA, sur plusieurs échantillons, dans un volume de réaction réduit. Sa grande sensibilité et sa reproductibilité en font un outil puissant pour réaliser des analyses à partir de très faibles quantités de matériel de départ, et par conséquent, adapté aux études de micro génomique. Les TLDA® sont des cartes micro-fluidiques composées de 384 puits. Elles permettent d’analyser simultanément de 1 à 8 échantillons sur 11 à 380 systèmes d’amorces différents par run de PCR en temps réel (2h30).

Dans cette étude, nous avons utilisé des cartes TLDA spécialement conçues pour l’exploration de 48 gènes impliqués dans le processus de résorption osseuse chez la souris. Pour chaque échantillon, nous avons préparé une solution de 100 μΐ maintenue dans la glace avec 50 μΐ de TAqman® Fast advanced Master Mix et 50 μΐ de cADN dans de l’eau. Avant d’être placé dans l’appareil (Applied Biosystems 7900 HT real time PCR System) et de procéder à l’analyse à l’aide du logiciel SDS, les cartes sont centrifugées 2 fois pendant 1 minute à 1200 RPM.

A.2.5.4. Analyses statistiques

Les résultats sont exprimés en tant que moyennes ± leurs erreurs-types (SEM).

Toutes les données ont été analysées à l'aide du logiciel XLSTAT (Addinsoft, Paris, France).

L’analyse statistique de type ANOVA (test paramétrique) a permis de mettre en évidence les différences entre groupes. Si le résultat a été jugé significatif (P <0 · 05), le test de

Fisher de comparaison multiple a alors été utilisé pour déterminer les différences spécifiques entre les moyennes.

Exemple 1 : Effet in vivo de la phycocyanine sur la résorption osseuse

1.1. Validation de l’étude

La diminution significative du poids des cornes utérines dans le groupe OVX contrôle par rapport au SH-Ctrl, permet de valider la qualité de la castration. Chez les souris ovariectomisées, ce paramètre n'a pas été significativement modifié par les différents régimes expérimentaux.

1.2. Pesée des animaux et contrôle de consommation

Le gain de masse quotidien (GMQ) a été évalué quotidiennement les 7 premiers jours de traitement, puis de façon hebdomadaire. A partir de la troisième semaine, ce paramètre est significativement supérieur chez les OVX-Ctrl par rapport aux SH-Ctrl.

Les résultats obtenus montrent que les différents régimes alimentaires (ou le gavage) n'ont pas induit de variation significative de ce critère.

Le contrôle de consommation, réalisé de façon hebdomadaire au cours de l’expérimentation, ne montre aucune différence significative entre les deux groupes soumis au régime standard (SH-Ctrl et OVX-Ctrl). La castration ne modifie pas la prise alimentaire. Il en est de même chez les animaux ovariectomisés, recevant le régime standard et ce, malgré le gavage.

Les résultats obtenus n’ont pas montré que l’administration de phycocyanine ait provoqué une variation dans le poids des animaux ou dans leur consommation alimentaire.

1.3. Echo-MRI

En fin d’expérimentation, la masse grasse s'est révélée significativement supérieure chez les OVX-Ctrl, par rapport aux SH-Ctrl. Par contre, la consommation des différents régimes n’a pas eu d’effet statistiquement significatif chez les animaux ovariectomisés.

Ainsi, les résultats n’ont pas montré un effet de l’administration de la phycocyanine sur la masse grasse des animaux.

1.4. Poids de la rate et du foie

Au sacrifice, dans le groupe OVX-Ctrl ce paramètre est statistiquement supérieur à ce qui est observé dans le groupe SH-Ctrl. Une inflammation consécutive à l'intervention chirurgicale a donc pu être décelée. En revanche, elle n'a pas été normalisée par les interventions expérimentales puisqu'aucune différence significative n’est observée au sein des différents groupes OVX.

Les différentes conditions expérimentales, avec ou sans administration de phycocyanine, n'ont pas modifié significativement le poids moyen des foies.

/. 5. Biomarqueurs du métabolisme osseux

En ce qui concerne l’OPG, lequel constitue un marqueur indicatif d’une inhibition de la résorption osseuse, des valeurs significativement plus élevées sont retrouvées dans le groupe SH-Ctrl par rapport à l’OVX-Ctrl, ainsi que dans le groupe OVX phycocyanine par rapport au groupe OVX-Ctrl, comparativement au groupe OVX-Ctrl.

En conséquence, les résultats montrent que la phycocyanine normalise au moins partiellement l’augmentation du marqueur OPG qui est induite par l'intervention chirurgicale.

A l'inverse, le marqueur RankL, lequel constitue un marqueur indicatif de la résorption osseuse, est augmenté par la castration. L’administration de phycocyanine n’a pas apporté de normalisation du niveau de ce marqueur.

Le rapport OPG/RankL, qui constitue un indice de remodelage osseux, est significativement supérieur dans le groupe SH-Ctrl par rapport à la valeur mesurée de ce rapport dans le groupe OVX-Ctrl.

Le rapport OPG/RankL est augmenté chez les rongeurs ovariectomisés auxquels a été administrée de la phycocyanine, ce qui permet d’orienter favorablement le métabolisme pour une préservation du capital osseux.

En ce qui concerne le marqueur PINP, lequel constitue un marqueur indicatif de la formation osseuse, aucune différence statistiquement significative n'est observée entre les différents groupes expérimentaux.

Les mêmes résultats sont observés à l’égard du marqueur CTX 1, lequel est un marqueur indicatif de la résorption osseuse.

/. 6. Analyse de la masse osseuse

La masse osseuse a été mesurée dans les différents groupes d’animaux. Les résultats sont présentés dans le Figure 1.

L’analyse de la densité minérale osseuse (DM0) confirme la diminution, classiquement observée, de ce paramètre chez les souris OVX-Ctrl par rapport aux SH-Ctrl.

Par ailleurs, seul le groupe OVX auquel a été administré de la phycocyanine présente une densité minérale osseuse significativement plus élevée que celle du lot OVX contrôle.

Ces résultats montrent que l’administration de phycocyanine permet de bloquer la résorption osseuse chez les animaux chez lesquels a été expérimentalement provoqué un déficit hormonal par ovariectomie.

Exemple 2 : Confirmation in vitro des effets de la phycocyanine sur la résorption osseuse

Les différentes expérimentations réalisées in vitro ont été conduites avec des doses croissantes de phycocyanine.

2.1. Prolifération cellulaire

La prolifération des ostéoblastes a été mesurée par XTT après 24h d’induction en présence de différentes concentrations de phycocyanine.

L'effet le plus important a été observé dans les cellules exposées aux dose de 100 pg/ml et 250 pg/ml de phycocyanine, par rapport au groupe contrôle 2%. (Figure 2)

A l'inverse, la concentration de 2500 pg/ml s'est avérée inhibitrice, tandis que la dose de 1000 pg/ml n’a pas eu d’effet statistiquement significatif. (Figure 2)

En ce qui concerne les ostéoclastes, la prolifération a été inhibée de façon dose-dépendante dans les cultures cellulaires exposées à la phycocyanine. (Figures 3 et 4)

Ces résultats montrent que la phycocyanine a un effet inhibiteur sur la prolifération des ostéoclastes, ce qui est en accord avec les résultats in vivo qui montrent que la phycocyanine possède un effet inhibiteur sur la résorption osseuse.

2.2. Mesure de l’activité de la Tartrate-Resistant Acid Phosphatase (TRAP)

L’activité de la phosphatase acide résistante eu tartrate (aussi appelée Tartrate-ResistantAcid Phosphatase ou TRAP) a été mesurée dans des cultures d’ostéoclastes. Les résultats sont présentés dans la figure 4.

Les résultats de la figure 4 montrent qu’au cours de la différenciation des ostéoclastes, la mesure de l’activité enzymatique de TRAP est significativement supérieure dans le groupe contrôle RankL par rapport au contrôle. Ce phénomène est inhibé de façon dose dépendante par la phycocyanine.

2.4. TLD A

Pour étudier l’effet de la phycocyanine sur la résorption osseuse, nous avons mesuré l’expression de différents marqueurs, respectivement (i) le marqueur TRAP indicatif de différenciation cellulaire (Figure 6), (ii) le marqueur Nox4 indicatif du stress oxydant (Figure 7) et (iii) le marqueur NFATC1 qui est un facteur de transcription (Figure 8). L’analyse TLDA a été réalisée sur des ARNm extraits des cultures de la lignée Raw 264.7, qui est une lignée cellulaire modèle de pré-ostéoclastes. Les cultures de cellules de la lignée Raw 264.7 ont été exposées à la phycocyanine.

Les résultats montrent :

- une diminution du taux des marqueurs spécifiques des ostéoclastes (tels que la TRAP (Figure 6), le récepteur à la calcitonine, les métalloprotéases),

- du stress oxydant, avec une diminution de l’expression de Nox 4 (voir figure 7),

- une diminution de l’expression du facteur de transcription NFATC1, en présence d'une concentration de phycocyanine de lOOpg/ml (voir figure 8).

Résumé des résultats expérimentaux

L’expérimentation animale réalisée chez des souris ovariectomisées, âgées de 8 semaines, a permis de mettre en évidence une action potentiellement bénéfique sur l’os d'une supplémentation quotidienne en phycocyanine, à la dose de 500 mg/ kg poids corporel. En effet, les résultats de la mesure de la DM0 trabéculaire fémorale indiquent que cette intervention nutritionnelle permet de prévenir, en partie, la perte osseuse induite par la réduction de l'imprégnation oestrogénique, de même que les marqueurs biologiques du remodelage osseux telle que TOPG.

Pour valider ces résultats in vivo, des expériences ont également été conduites sur des lignées murines immortalisées d’ostéoblastes et d’ostéoclastes exposées à diverses concentrations de phycocyanine. Ce composé cible essentiellement la différenciation et la prolifération des ostéoclastes avec une diminution dose dépendante de la synthèse de TRAP et une diminution dose dépendante de l’expression de TRAP, MMP9, du récepteur de la calcitonine, et de NOS 2 et de NFATcl. On retrouve dans une moindre mesure une action pro proliférative sur les ostéoblastes.

Claims (12)

1. REVENDICATIONS

   1. Composition de phycocyanine pour son utilisation pour inhiber la résorption, osseuse chez l’homme ou l’animal.
2. 2. Composition de phycocyanine pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition de phycocyanine est comprise dans une composition nutritionnelle adaptée pour une administration orale.
3. 3. Composition de phycocyanine pour son utilisation selon la revendication 2, ladite composition étant destinée à prévenir la perte osseuse qui se produit avec le vieillissement.
4. 4. Composition de phycocyanine pour son utilisation selon la revendication 2, ladite composition étant destinée à prévenir ou à traiter des pathologies choisies parmi l’ostéoporose de type I ou de type Π, les ostéoporoses secondaires, la maladie de Paget, et l’ostéolyse observée à proximité'd’une prothèse.
5. 5. Composition de phycocyanine pour son utilisation selon l’une des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que ladite composition nutritionnelle se présente sous forme de compositions alimentaires, de boissons, y compris des jus (de fruits ou de légumes ou d’algues), laits végétaux, huiles, beurres, margarines, matières grasses végétales, conserves (par exemple thon à l'huile), soupes, préparations à base de lait (yaourts, fromage blanc), glaces, fromages (par exemple des fromages conservés dans de l'huile), produits cuits (tels que le pain, les biscuits, les crêpes et les gâteaux), desserts, produits de confiserie, barres de céréales, céréales pour le petit déjeuner, condiments, produits d'assaisonnement des aliments (notamment épices et sauces).
6. 6. Composition de phycocyanine pour son utilisation selon l’une des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que ladite composition nutritionnelle se présente sous la forme d'un produit destiné à l'alimentation animale, sous forme humide, semi-humide ou sèche.
7. 7. Composition de phycocyanine pour son utilisation selon l’une des revendications 2 à 7, caractérisée en ce que ladite composition de phycocyanine se présente sous la forme d’un produit d’extraction obtenu à partir de la spiruline.
8. 8. Composition de phycocyanine pour son utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ladite composition de phycocyanine est comprise dans une composition pharmaceutique humaine ou vétérinaire.
9. 9. Composition de phycocyanine pour son utilisation selon la revendication 8. caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est destinée à prévenir la perte osseuse qui se produit au cours du vieillissement.
10. 10. Composition de phycocyanine pour son utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce ladite composition pharmaceutique est destinée à prévenir ou traiter une pathologie liée à un déséquilibre du rapport entre la formation de l’os et la résorption osseuse.
11. 11. Composition de phycocyanine pour son utilisation selon la revendication 8. caractérisée en ce ladite composition pharmaceutique est destinée à prévenir ou traiter une pathologie choisie parmi l'ostéoporose de type I ou de type Π, les ostéoporoses secondaires, la maladie de Paget, la perte osseuse ou l’ostéolyse observée à proximité d'une prothèse.
12. 12. Composition de phycocyanine pour son utilisation selon la revendication 8, caractérisée en ce ladite composition pharmaceutique se présente sous une forme pour l’administration orale, parentérale, intramusculaire ou intraveineuse.