WO2003100043A1

WO2003100043A1 - Nouvelle (d)-2-hydroxy acide oxydase derivee d'un micro-organisme et procede biochimique permettant de produire de l'acide glycoxylique

Info

Publication number: WO2003100043A1
Application number: PCT/JP2003/006367
Authority: WO
Inventors: Akira Iwasaki; Takehiko Matsumoto; Motohisa Washida; Hiroshi Watanabe; Sakayu Shimizu
Original assignee: Kaneka Corporation
Priority date: 2002-05-24
Filing date: 2003-05-22
Publication date: 2003-12-04
Also published as: EP1507001A4; EP1507001A1; AU2003242374A1; US20050170481A1; JPWO2003100043A1; JP4318637B2

Description

明糸田書微生物由来新規（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼ、およびそれを用いたダリオキシル酸の生化学的製造方法技術分野

本発明はグリコール酸をダリオキシル酸へ変換する能力を有する微生物由来の新規（D) —2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼに関する。本発明はまた、前記ォキシダーゼおよび Zまたは該ォキシダーゼを産生する微生物、もしくはその処理物を用いてグリコール酸を酸化することによってダリオキシル酸へ変換することを特徴とするダリォキシル酸の生化学的製造法に関する。背景技術

ダリオキシル酸はバニリン、ェチルバニリンなどの合成原料として用いられ、農薬、さらには医薬品の合成の中間体としても有用な化合物である。従来よりダリォキシル酸の製造方法としては、ダリォキサールの硝酸酸化などの化学的手法が知られており、また現在はダリォキシル酸のほとんどがこれら化学的手法により製造されている。しかしながら、ダリオキサ一ルの硝酸酸化などの化学的手法はダリオキシル酸以外の有機酸などの副生成物を生じやすく、製造されたダリオキシル酸の品質に好ましくない影響を与え、これら副生成物を除去するためには煩雑な工程を必要とする。また、大量に使用された硝酸などの中和工程で生成する大量の塩類廃棄物の処理が問題となる。

一方、ダリオキシル酸の生化学的製造方法としては、ホウレンソゥ由来のダリコ一ル酸ォキシダーゼを用い、ダリコール酸をダリオキシル酸へ変換する方法（特表平 7— 5 0 2 8 9 5号公報、特表平 8— 5 0 8 1 5 9号公報）が知られている。グリコール酸ォキシダーゼは従来より主に緑色植物にその存在が認められている酵素である。しかしながら、ホウレンソゥなどの植物由来のグリコール酸ォキシダーゼはダリオキシル酸に対しても比較的高い活性を有しており、その結果これらグリコ一ル酸ォキシダ一ゼを用いた場合、ダリオキシル酸がさらに酸化されシユウ酸などの副生成物が生じる。シユウ酸などの副生成物の生成を防止するため大量のアミン類の添加が必要であるが、高価なアミン類を大量に使用することは工業的には大きな問題となる。さらに植物由来のダリコール酸ォキシダ一ゼを用いる方法では、植物から抽出して得られる高価な酵素を使用するため、工業生産においてはそのコスト高が問題となる。

一方、礒部らはァスペルギルス ·ジャポニカスの生産するグリセロールォキシダーゼが、グリコール酸を酸化する活性を有することを報告している。しかし、グリセロールォキシダーゼのグリコール酸に対する活性は低く、ダリオキシル酸蓄積には多量の酵素を必要とする（特開平 7— 1 6 3 3 8 0号公報、 Biosc i . Biotech. Bi ochem. , 59 (4) , 576-581, 1995) 。さらに礒部らはァスペルギルス属由来のグリセロールォキシダーゼ以外に、グリセロールデヒド口ゲナ一ゼ生産菌であるジォトリカム属、ダルコノバクター属、ァセトパクター属の微生物がダリコール酸をダリオキシル酸へ変換、蓄積する能力を有することを報告しており、グリセロールデヒドロゲナ一ゼによるダリコール酸のダリオキシル酸への変換を示唆している（特開平 7— 1 6 3 3 8 0号公報）。またシユードモナス属、アルカリゲネス属の微生物がダリコール酸をダリオキシル酸へ変換、蓄積する能力を有することが報告されているが、これら菌株におけるグリコール酸をダリオキシル酸へと変換する酵素に関する詳細な知見は報告されていない（特開平 8— 3 2 2 5 8 1号公報）。このように、微生物由来のグリセ口一ルォキシダ一ゼもしくはグリセ口一ルデヒドロゲナ一ゼ、または該微生物を利用したダリコール酸からダリオキシル酸への変換について若干の報告はあるが、該酵素または該微生物は、活性や完成度の点で、工業的利用に適したレベルのものではない。

一般に、ダリコール酸のダリオキシル酸への酸化反応においてォキシダーゼを利用すれば、基質であるグリコール酸以外には酸素があればよく、デヒドロゲナーゼのように、 NADまたは NAD Pなどの酸化型補酵素、反応により生じた還元型補酵素を酸化型への再生するための酵素および基質などの別途添加を必要としない。したがってグリコール酸からダリオキシル酸への酸化反応にォキシダ一ゼを用いることは工業的に有利な方法である。しかしながら、前述したように、現在ダリコール酸に対し高い活性および選択性を示すォキシダーゼタイプの酵素は見出されていない。発明の開示

したがって、本発明は、グリコール酸をダリオキシル酸へ変換する活性を有する微生物由来のォキシダ一ゼ、および該微生物由来のォキシダ一ゼまたは該酵素を生産する微生物を利用した効率的なダリォキシル酸の製造方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、ダリオキシル酸の効率的な製造方法を開発すべく鋭意検討を行った結果、ダリコール酸に対し高いォキシダーゼ活性を有する微生物を土壌より見出し、その微生物より該活性を有する酵素を単離、精製し、詳細な検討を行うことにより本発明を完成するに至った。すなわち、本発明はダリコール酸をダリオキシル酸へ変換する新規なォキシダ一ゼ、ならびに該酵素を生産する微生物の菌体および Zまたは菌体処理物をグリコ一ル酸に作用させダリオキシル酸に変換、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とするダリオキシル酸の製造方法である。図面の簡単な説明

図 1は、ォキシダーゼ反応の活性測定法の原理を示す図である。

図 2は、本願発明の酵素の温度安定性を示す図である。

図 3は、本願発明の酵素の反応至適 pHを示す図である。醒は緩衝液として 1Mリン酸緩衝液を、口は緩衝液として 0. lMTr i s _HC

1緩衝液を使用した。

図 4は、本願発明の酵素の pH安定性を示す図である。

. 発明を実施するための最良の形態

本発明のグリコール酸をダリオキシル酸へと変換する酵素は、下記（1 ) および（2) の理化学的性質：

(1) 作用： 2—ヒドロキシ酸に作用し、対応する 2—ケト酸を生成する、

(2) 基質特異性：グリコ一ル酸、および D—乳酸に活性を示し、 L—乳酸に活性を示さない、

を有することを 1つの大きな特徴とする（D) —2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼである。

さらに本発明の酵素としては、下記（3) の理化学的性質：

(3) L— 2—ヒドロキシイソカプロン酸、メタノール、エタノール、 1 一プロパノール、 2一プロパノール、エチレングリコール、 1, 2—プロパンジオール、およびグリセリンには活性を示さない、

を有する前記（D) —2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼがあげられる。

さらに本発明の酵素としては、下記理化学的性質：

(4) 分子量： SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約 6 0, 000D a、

(5) 安定性： pH7. 2で 40 、 20分間処理した後、 90 %以上の活性を保持している、

(6) 至適反応 pH： 7〜 10、

を有する前記（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼがあげられる。本発明の（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼの起源として用いられる微生物としては特に限定はしないが、たとえばアースロバクタ一（Ar t h r o b a c t e r) 属細菌があげられ、好ましくは、本発明者によつて初めて土壌より単離され、同定された、アースロバクタ一 'スピーシーズ（Ar t h r ob a c t e r s p. ) KNK-GA1 (寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566 ) 、寄託日平成 14年 3月 7日、受託番号 FERM BP— 8375 ) があげられる。前記アースロバクタ一 ·スピ一シ一ズ KNK—GA 1株

(寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 3 05— 8566) 、寄託日平成 14年 3月 7日、受託番号 FERM BP— 8375) (以下、単に KNK—GA 1株（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 - 8566) 、寄託日平成 14年 3月 7日、受託番号 FERM BP— 8375) という場合もある）の菌学的な性質を以下に示す。

細胞の形態

グラム染色： +

胞子形成

運動性

コロニーの形態：円形、全縁なめらか、低凸状、光沢ありクリーム色生育（ 37 °C) ： +

(41。C)

カタラーゼ： +

ォキシダーゼ

OFテスト（グルコース）

前記 K N K— G A 1株（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 _ 8566) 、寄託日平成 14年 3月 7日、受託番号 FERM BP- 8375) 由来の（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼは、たとえば以下のようにして単離、精製することができる。まず、 KNK— GA1株（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、寄託日平成 14年 3月 7 日、受託番号 FERM BP-8375) を適当な培地で培養する。この際に用いる培地としては特に限定しないが、たとえば、グリコール酸 5 g、酵母エキス 1 g、リン酸ニ水素力リウム 3. 5 g、リン酸水素ニァンモニゥム 6. 5 g、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 5 g、硫酸亜鉛 7水和物 0. 02 g、硫酸第一鉄 7水和物 0. 03 g、硫酸銅 5水和物 0. 00 2 g、塩化カルシウム 2水和物 0. l g、塩化ナトリウム 0. 3 g (いずれも 1Lあたり）の組成よりなる培地（pH7) を好ましく用いることができる。

得られた培養液から遠心分離により菌体を集め、 0. 05Mリン酸緩衝液（pH7) などに懸濁し、ダイノミル（Dyno— Mi 1 1社製）などで破碎し、遠心分離により菌体残渣を除き、上清（無細胞抽出液）を得る。得られた上清に硫酸プロ夕ミンを添加し、生じた不溶物を遠心分離により除き、核酸を除去する。目的の活性を有する酵素は、得られたプロ夕ミン処理液より、塩析（硫酸アンモニゥムなど）、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィーなどに代表される各種クロマトグラフィ一により、さらに精製され得る。

本発明の（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼは、上記 KNK - GA 1株（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一、あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、寄託日平成 14年 3月 7日、受託番号 FER M BP— 8375) 由来の（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼとほぼ同一の性質を有する酵素であれば、天然酵素であってもよく、または組替え酵素であってもよい。たとえば、組替え酵素は、 KNK— GA1株（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 30 5— 8566) 、寄託日平成 14年 3月 7日、受託番号 FERM B P-8375) に由来する（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼのアミノ酸配列中の 1つまたは数個のアミノ酸を置換、欠失、挿入または付加させることにより作製することができる。また、 KNK— GA1株（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託セン夕一、あて名日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8 566) 、寄託日平成 14年 3月 7日、受託番号 FERM BP— 8 375) を変異処理したものや、他の天然または非天然微生物から得られる（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼであってもよい。

本明細書におけるォキシダーゼ反応の活性測定法は図 1に示すように、酸化反応により発生する H ₂〇 ₂をペルォキシダーゼ存在下に 4ーァミノアンチピリンと N—ェチルー (2—ヒドロキシ— 3—スルフォプロピル） —m—トルイジンと反応させ、生成するキノンィミン色素の吸収を測定することにより行なう。

基本的には、ォキシダ一ゼ反応の活性測定法は、下記組成を有する 10 OmMリン酸緩衝液（pH7) 0. 9m 1に、酵素液 0. 1mlを添加し、 30°Cでの波長 555 nmの吸光度の増加を測定することにより行なう。本明細書において、 1分間に l ino 1の H₂〇₂を生成する酵素活性を 1 un i tと定義する。

組成：

グリコール酸 10mM、

4—ァミノアンチピリン（以下 4—AA) 0. 67 mM、

N—ェチルー N— (2—ヒドロキシ一 3—スルフォプロヒル) — m—トルィジン（以下 T〇OS) 1. 09mM、

ヮサビ由来ペルォキシダーゼ（以下 POD) 2U/m 1

また、グリコール酸およびダリオキシル酸の定量は、高速液体クロマトグラフィ一で分析することができる。高速液体クロマトグラフィーによる分析は、たとえば、バイオラッド ·アミネックス HPX— 87H (7. 8 mmx 300 mm) カラムを用い、溶媒として 5 mMの H₂ S 0₄水溶液を用い、流速 4m 1 /m i nで行う。検出は 23 OmMの吸光度を測定することにより行う。本条件においては、開始からグリコール酸は 20 分後、ダリオキシル酸は開始から 15分後に溶出される。

本発明の（D) —2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼおよびホウレンソゥ、レムナミナ一（Lemna mi no r) (J. Biochem. , 16, 1373-13 78, 1984) 、スパトグロッサムパシフィカム（S p a t og l o s s u m p a c i f i cum) (J. Phycol., 32, 790-798, 1996) など植物、藻類由来のダリコール酸ォキシダ一ゼの基質特異性を表 1に示す。表 1において、各酵素のグリコール酸に対する活性を 100%とした。表 1

既知の植物由来グリコール酸ォキシダーゼと本発明の酸素の基質特異性の比較相対活性 (％)

本発明のレムナスパトグロッサムホウレンソゥ

ミナ一パシフィカムクリコ一ノレ酸 100 100 100 100

L一乳酸 0 81 60 26

D—乳酸 82 0 7 0

DL— 2—ヒドロキシ酪酸 42 71 57 55

DL— 2—ヒドロキシ吉草酸 32 70 52 91

DL— 2—ヒドロキシカプロン酸 7 29 13

DL— 2—ヒドロキシイソカプロン酸 10 51

L— 2—ヒドロキシイソカプロン酸 0 68 30 77 ダリオキシル酸 4 8 35 14 既知のグリコール酸ォキシダ一ゼはグリコール酸以外にも 2—ヒドロキシ酸に活性を示すが、いずれも L—乳酸、 L一 2—ヒドロキシイソ力プロン酸に活' I生を示し、かつ D—乳酸にはほとんど活性を示さず、その立体特異性より現在は（S ) —2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼ（E C 1 . 1 . 3 . 1 5 ) として分類されている。一方、本発明の（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼはダリコール酸に高い活性を示すが、それ以外にも D— 乳酸などの D体の 2—ヒドロキシ酸に活性を示す一方で、 L一乳酸には活性を示さない。また、 2—ヒドロキシイソカブロン酸についても、 D L体には活性が検出されるが、 L体には活性を示さない。したがって、本発明の（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼは、 D体に特異的な活性を有すると推察される。他に、 D体の 2—ヒドロキシ酸に対し作用する酵素としては土壌グラム陰性菌由来の乳酸ォキシダーゼが報告されている（Appl . Biochem. Biotechnol . , 56, 277-288, 1996) 。しかしこの酵素は L一乳酸に対しても D—乳酸に対する活性の 5 7 %の活性を有しており、その反応は D体特異的というものではない。以上のことより本発明の酵素は、 D体の 2—ヒドロキシ酸に活性を示し、かつダリコール酸に対して高い活性を示す微生物により見出された新規な

(D) 一 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼと特徴づけられる。また、本（D ) _ 2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼは、別の命名法では、（R) —2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼと表記される場合もある。 D体の 2—ヒドロキシ酸のみに選択的に作用し、 L体の 2—ヒドロキシ酸には作用しない（D) —2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼは、本発明で初めて見いだされた。従来のグリコール酸ォキシダーゼでは、基質が D体の場合には、ほとんど反応しないか反応しても低い活性しか示すことができなかったが、本発明の（ D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼによって、初めて D体の 2—ヒドロキシ酸を効率的に反応させることが可能となった。したがって、本発明の

(D) 一 2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼは、グリコール酸をダリオキシル酸に変換させるだけでなく、 D体の 2—ヒドロキシ酸が基質の場合の反応や D体を選択的に反応させることを目的とする光学分割にも利用できるという点で優れている。

また、表 1に示すように従来のグリコール酸ォキシダ一ゼ ( ( S ) - 2 —ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼ）はダリオキシル酸に対しても比較的高い活性を有することが知られているが、本発明の酵素はダリオキシル酸に対して比較的低い活性しか示さない。したがって、本発明の酵素はグリコール酸からダリオキシル酸への変換において、ダリオキシル酸の酵素的酸化によるシユウ酸などの副生成物の生成が少ないなどの点でも有利である。本発明のダリオキシル酸の製造方法は、前記微生物由来の（D) —2— ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼ、または該酵素を産生する微生物の培養液、該培養液より分離した微生物菌体、微生物菌体の処理物のいずれかをダリコール酸に作用させ、ダリコール酸をダリオキシル酸へと変換蓄積せしめることを 1つの大きな特徴とする。ここで、微生物菌体処理物とは、たとえば、粗酵素液、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、またはそれら菌体の破砕物などを意味する。用語「粗酵素液」には、たとえば、培養液から菌体を遠心分離したのち、適当な緩衝液中に懸濁し、グラスビーズなどを用いる物理的手法、酵素などを用いる生化学的手法などにより該菌体を破碎または溶解した溶液、さらには遠心分離により該溶液中の固形物を除去して得た無細胞抽出液が含まれる。また、さらには、当業者が通常用いる手法、たとえば、透析、硫酸アンモニゥム沈殿、クロマトグラフィーを単独でまたは組み合わせて用い前記無細胞抽出液を部分的に精製した酵素液も、「粗酵素液」に含まれる。さらに微生物菌体処理物は、酵素あるいは菌体のまま公知の手段で固定化されて用いることもできる。固定化は当業者に周知の方法（たとえば、架橋法、物理的吸着法、包括法など）で行ない得る。このように、本発明のダリオキシル酸の製造方法においては、酵素を精製することなく微生物培養液や菌体をそのまま用いることもできるので、ェ業生産において優位な製造方法である。

反応条件は使用する酵素、微生物またはその処理物、基質濃度などにより異なるが、反応は酸素存在下で行ない、反応温度は 1 0 T：〜 7 0 °C、熱安定性の観点から 1 0 °C〜5 0でが好ましく、反応 p Hは 4〜1 2、最適 p H、 p H安定性の観点から p H 6〜 1 0が好ましい。

なお、ォキシダ一ゼによるダリコール酸のダリオキシル酸への酸化において、過酸化水素が生成するが、この過酸化水素は酵素を失活させたり、ダリオキシル酸をギ酸へと分解する場合もある。しかし、反応系に力タラーゼを添加することによりォキシダーゼ反応により生じた過酸化水素を分解、除去し、酵素の失活ゃグリオキシル酸の分解を防ぐことが可能である。以下、実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。

実施例 1 グリコール酸 10 g、酵母エキス 0. 1 g、硝酸アンモニゥム 2 g、リン酸水素二カリウム l g、リン酸二水素ナトリウム 1 g、硫酸マグネシゥム 7水和物 0. 2 g、および塩化カルシウム 2水和物 0. 1 g (いずれも 1L当たり）の組成からなる S培地（pH7) 5mlを試験管にいれて高圧蒸気殺菌した。そののち、該 S培地に、日本国内より採取した土壌サンプル各 2 gを 10 m 1の生理食塩水に懸濁しその上清液 0. 2m lを加えて、 28°Cで 3〜7日間集積培養を行なった。菌が生育した培養液を 2% の寒天を含む S培地プレートに 0. 1mlずつ塗布し、 28でで3〜7日間培養を行なった。生育したコロニーについて、それぞれの菌体を試験管中 S培地 5mlで 28°C、 3日間の振とう培養後、菌体を遠心分離により集め生理食塩水で洗浄したのち、 10 OmMリン酸緩衝液（pH7) 0. 5m 1に懸濁した。その菌体懸濁液 0. 1m lをグリコール酸 10 OmM、 4-AA 1. 34mM、 T〇〇S 2. 18mM、およびペルォキシダ —ゼ 4 UZm 1を含有する 100 mMリン酸緩衝液 0. lmlに添加し、 28 °Cで 2時間振とうした。振とう後に反応液が紫色になったもの、すなわちダリコール酸に対する反応により過酸化水素が生じたものをグリコール酸酸化活性陽性株として取得した。 '

さらにこのようにして得られたダリコール酸酸化活性陽性株については、 S培地 5m 1に植菌後、 28°Cで 2日間振とう培養を行ない前培養液を得、ついで、 50 Oml容坂ロフラスコ中 S培地 5 Omlに、前培養液 0. 5 mlを植菌し、 28 で 3日間振とう培養を行なった。得られた培養液 2 Omlより菌体を遠心分離により集め生理食塩水で洗浄した後、ダリコール酸 100 mMを含有する 100 mMリン酸緩衝液（p H 7 ) 5 m 1に菌体を懸濁し、 28 で 6時間振とうさせた。反応後の上澄液を高速液体ク口マトグラフィ一により分析し、ダリォキシル酸の生成の確認および生成したダリオキシル酸を定量した。その結果、グリコール酸をダリオキシル酸へ変換する活性を有する菌株を取得した。本菌株をアースロバクタ一 · スピ一シ一ズ KNK— GA 1株と命名し、平成 14年 3月 7日（原寄託日）に、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター（あて名：日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 一 8566) ) に寄託した（受託番号 FERM BP— 8375) 。実施例 2

土壌より分離した KNK-GA1株（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば巿東 1 丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、寄託日平成 1 4年 3月 7日、受託番号 FERM B P— 8375 ) を 500 m 1容坂口フラスコ中、グリコール酸 5 g、酵母エキス l g、リン酸二水素力リウム 3. 5 g、リン酸水素二アンモニゥム 6. 5 g、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 5 g、硫酸亜鉛 7水和物 0. 02 g、硫酸第一鉄 7水和物 0. 0 3 g、硫酸銅 5水和物 0. 002 g、塩化カルシウム 2水和物 0. l g、および塩化ナトリウム 0. 3 g (いずれも 1Lあたり）の組成よりなる培地（pH7) 50mlに植菌し、 28 °Cで 2日間振とう培養を行なった。得られた培養液 10mlより菌体を遠心分離により試験管中に集め、菌体を 2mlの 100 mMリン酸緩衝液 (pH7) に懸濁し、その菌体懸濁液 0. 9m 1に 1Mグリコール酸溶液 0. lm 1を添加し、試験管中、 28 °C、 16時間振とう反応を行なった。得られた反応液を高速液体クロマトグラフィ一により分析した。その結果、 3 OmMのダリオキシル酸が生成していた。

高速液体クロマトグラフィーによる分析条件は、バイオラッド ·ァミネックス HPX— 87H (7. 8mmX 30 Omm) カラムを用い、溶媒として 5mMの H₂S〇₄水溶液を用い、流速 4m lZmi nで行なつた。検出は 230 mMの吸光度を測定することにより行なつた。実施例 3

実施例 2記載の方法により得た KNK— GA1株（寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 、寄託日平成 14年 3月 7日、受託番号 FERM BP— 8375) の培養液 50mlより菌体を遠心分離により集め、 0. 1Mリン酸緩衝液（p H 7 ) で洗浄後、菌体を 0. 1 Mリン酸緩衝液（ p H 7 ) 4m 1に懸濁した。該菌体懸濁液をミニビ一トビータ一（B I〇 S P E C社製）で破砕後、遠心分離により上清液（無細胞抽出液）を得た。試験管中で、無細胞抽出液 1. 7m 1に 1Mグリコール酸溶液を 0. 2m 1、 40， 000 U/m 1のカタラーゼ溶液を 0. 1ml添加し、 28°Cで 4時間振とうした。反応後の反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、 4 OmM のダリオキシリレ酸が生成していた。

実施例 4

実施例 3で得た無細胞抽出液 2 m 1を 0. 1 Mリン酸緩衝液 4 Lにより透析を行なった。そののち、透析後の無細胞抽出液 1. 7mlに 1Mダリコール酸溶液を 0. 2m 1、 40, 00 OU/m 1の力タラ一ゼ溶液を 0 . 1ml添加し、試験管中で、 28°Cで 4時間振とうした。反応後の反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析したところ、 32mMのダリオキシル酸が生成していた。

実施例 5

実施例 4で得た透析後の無細胞抽出液 0. 1mlに、 4一 AA 1. 3 4mM、 TOOS 2. 19mM、 POD 6 U/m 1を含む 0. 1 Mリン酸緩衝液（pH 7) 0. 05mlを添加し、さらに 10 OmMグリコール酸溶液を 0. 05ml加え、試験管中で、 28°C、 2分間振とうした。その結果、反応液は濃い紫色を呈した。対照として 10 OmMグリコール酸溶液の代わりに、 0. 1 Mリン酸緩衝液 0. 05mlを添加した場合、反応液は変色しなかった。このことより、本無細胞抽出液によるグリコール酸の酸化により過酸化水素が生成していることが確認され、グリコール酸の酸ィヒを触媒している酵素はォキシダーゼであることが確認された。実施例 6

土壌より分離したアースロバクタ一 ·スピ一シ一ズ KNK— GA1株 (寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一、あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 3 05— 8566) 、寄託日平成 14年 3月 7日、受託番号 FERM BP— 8375) を 50 Oml容坂ロフラスコ中グルコース 20 g、酵母エキス l g、 Nu t r i en t b r o t h 8 g (いずれも 1 Lあたり）の組成よりなる培地（pH 7) 100mlに植菌し、 28 で 1日間培養し、前培養液を得た。ついで、 5リットル容ミニジャー中にグリコール酸 5 g、酵母エキス l g、リン酸二水素カリウム 3. 5 g、リン酸水素ニァンモニゥム 6. 5 g、硫酸マグネシウム 7水和物 0. 5 g、硫酸亜鉛 7水和物 0. 02 g、硫酸第一鉄 7水和物 0. 03 g、硫酸銅 5水和物 0. 0 02 g、塩ィ匕カルシウム 2水和物 0. l g、塩化ナトリウム 0. 3 g (いずれも 1Lあたり）の組成よりなる培地（pH7) 3Lに、得られた前培養液を植菌し、 0. 5vvm、 350 r pm、 pH7. 2以下（水酸化ナトリウム水溶液でコントロール）で培養を行ない、培養開始から 7、 21、 27, 32時間後にダリコール酸をそれぞれ 15 gずつ添加し、 45時間培養した。

ついで、得られた培養液から遠心分離により菌体を集め 0. 05Mリン酸緩衝液（PH7) 1. 2 Lに懸濁した。

得られた菌体懸濁液をダイノミルにより破砕後、遠心分離により上清液 1. 1 Lを得た。上清液に 5 %硫酸プロタミン水溶液を 62 m 1添加し 3 0分間攪拌後、遠心分離により沈殿物を除き、 1. 2 Lの上清液を得た。得られた上清液 1. 2 Lを氷冷下ス夕一ラーで攪拌しながら、硫酸アンモニゥムを徐々に添加し、添加した硫酸アンモニゥムの飽和度が 25〜4 0%の範囲にあるときに沈殿する夕ンパク質を遠心分離により集めた。得られた硫安沈殿タンパク質を 320m 1の 0. 05Mリン酸緩衝液（ PH7) で溶解し、同緩衝液 15 Lにより透析を行なったのち、 0. 05 Mリン酸緩衝液（pH7. 2) で予め平衡化した DEAE—トヨパール 6 50M (東ソ一製）カラム（カラム直径： 4 cm、高さ： 20 cm) にチヤージし、 0— 0. 2 Mの塩化ナトリウム直線濃度勾配により、流速 90 m 1 Zh rで溶出させ活性画分を集めた。得られた活性画分に硫酸アンモニゥム濃度が 0. 6Mになるように 1. 2 M硫酸アンモニゥムを含む 0. 05 Mリン酸緩衝液を添加後、 0. 6 M硫酸アンモニゥムを含む 0. 05 Mリン酸緩衝液（pH7. 2) で予め平衡化した Ph e ny 1—トヨパール 65 OM (東ソ一製）カラム（カラム直径： 2. 4 cm、高さ： 24 c m) にチャージした。ついで、 0. 6 M— 0Mの硫酸アンモニゥム直線濃度勾配により、流速 7 Oml /h rで溶出させ活性画分を集め、 0. 05 Mリン酸緩衝液 (pH7) により透析した。そののち、透析後の液を、 0 . 05Mリン酸緩衝液（pH7. 2) で予め平衡化した S up e r Qトヨパール 650M (東ソ一製）カラム（カラム直径： 2. 4 cm、高さ： 2 O cm) にチャージし、 0M— 0. 3 Mの塩ィ匕ナトリウム直線濃度勾配により、流速 5 Oml /h rで溶出させ、活性画分を集めた。得られた活性画分の硫酸アンモニゥム濃度が 0. 4 Mになるように調整し、 0. 4M硫酸アンモニゥムを含む 0. 05Mリン酸緩衝液（pH7. 2) で予め平衡化した Bu t y 1—トヨパール 650 S (東ソ一製）カラム（カラム直径 : 1. 4 cm、高さ： 10 cm) にチャージし、 0. 4M—0Mの硫酸ァンモニゥム直線濃度勾配により、流速 3 Om 1 Zh rで溶出させ活性画分を集めた。そののち、活性画分の硫酸アンモニゥム濃度を 0. 6Mに調整したのち、 0. 6 M硫酸アンモニゥムを含む 0. 05Mリン酸緩衝液（p H7. 2) で予め平衡化した RESOURCE 15 PHE (Ame r s ham ph a rma c i a b i o t e c h社製) カラム（6ml) にチャージし、 0. 6 M—0Mの硫酸アンモニゥム直線濃度勾配により流速 2m l /mi nで溶出させ活性画分を集めた。

得られた活性画分を S D S _ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供したところ、分子量 60， 000D aに相当するところに、単一バンドが形成された。

実施例 7 .

実施例 6において得られた酵素の酵素化学的性質について検討した。酵素活性の測定は、基本的には 10 OmMリン酸緩衝液またはトリス緩衝液中、グリコール酸などの基質 10mM、 4-AA 0. 67mM、 T ◦ OS 1. 09mM、 POD 2 UZm 1、および酵素溶液 0. 1m l を含む 1. 0mlの反応液を 301：、 100秒間反応させ、波長 555 n mの吸光度の増加を測定することにより行なった。

(基質特異性）

表 2に示す各種アルコールおよびアルデヒド化合物を基質として反応した結果、本願発明の酵素は表 2に示すような基質特異性を示した。

表 2

本発明の酵素の基質特異性

(熱安定性）

0. 05Μリン酸緩衝液（ρΗ7) 中、 30〜70で、 20分間処理したのち、グリコール酸を基質として活性を測定した。その結果を図 2に示す。 30〜 50 °Cでは、処理前の 90 %以上の活性が残存していた。

(作用至適 pH)

1Mリン酸緩衝液、および 0. 1Mトリス—塩酸緩衝液を用いて、 pH 5〜 10の範囲で基質としてダリコール酸を用いて活性測定を行なった。その結果を図 3に示す。至適 pHは 7〜 9であった。

(PH安定性） pH5. 4〜8. 3の 0. 05 Mリン酸緩衝液中、 5°C、 24時間保存したのち、グリコール酸を基質として活性を測定して、保存前の活性と比較した。その結果を図 4に示す。

(分子量）

本精製酵素を 1%の 2—メルカプトエタノール存在下、 10%SDS— ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、標準タンパクとの相対移動度よりその分子量を推定した。その結果、本酵素は、分子量は約 60000D aに相当するところに単一のバンドを形成した。

実施例 8

実施例 6で得た精製酵素 1U、グリコール酸 15mg、および力夕ラーゼ 4000 Uを含む 200 mMリン酸緩衝液（ p H 7 ) lmlを試験管中、 20°C、 5時間振とう反応を行ない、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィ一で分析した。その結果、 3. 5 mgのダリオキシル酸、および 0. 02 mgのギ酸が生成していた。シユウ酸は検出できなかった。

高速液体クロマトグラフィーによる分析条件は、バイオラッド ·ァミネックス HPX—87H (7. 8mmX 300mm) カラムを用い、溶媒として 5mMの H₂S 0₄水溶液を用い、流速 4m l/m i nで行なつた。検出は 23 OmMの吸光度を測定することにより行なった。

実施例 9

実施例 6で得た精製酵素 1U、グリコール酸 15mg、および力夕ラーゼ 0 Uまたは 4000 Uを含む 200 mMリン酸緩衝液（ p H 7 ) lml を試験管中、 20° (：、 2時間振とう反応を行ない、得られた反応液を高速液体クロマトグラフィーで分析した。その結果、力タラ一ゼ 4000Uを添加した場合、 2. 3 mgダリオキシル酸および 0. 02mgのギ酸が生成したが、力タラ一ゼを添加しなかった場合、ダリオキシル酸は 0. 08 mgしか蓄積されず、 1. 6 mgのギ酸が生成していた。比較例 1

実施例 7と同様に、ホウレンソゥ由来のグリコール酸ォキシダーゼ（シダマ社製）について各種 2—ヒドロキシ酸化合物に対する活性を調べ、その結果を実施例 7で得た本発明の酵素と比較した。表 3

ホウレンソゥ由来グリコール酸ォキシダ一ゼと本発明の酵素の基質特異性の比較

産業上の利用可能性

本発明の（D ) — 2 _ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼは、効率よくグリコール酸をダリオキシル酸へと変換する能力を有しており、該酵素または該酵素を生産する微生物を用いるグリコ一ル酸からのグリオキシル酸の製造方法によれば、温和な条件で、副生成物を生じることなくダリオキシル酸を製造することが可能である。また、本発明の（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼは、 D体の 2—ヒドロキシ酸のみに選択的に作用する、初めて見い出された酵素である。

Claims

言青求の範囲

1. 下記（1) および（2) の理化学的性質を有する（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼ

(1) 作用： 2—ヒドロキシ酸に作用し、対応する 2_ケト酸を生成する、

(2) 基質特異性：グリコール酸および D_乳酸に活性を示し、 L一乳酸に活性を示さない。

2. さらに、下記（3) の理化学的性質を有する請求の範囲第 1項記載の (D) 一 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼ

(3) L一 2—ヒドロキシイソカプロン酸、メタノール、エタノール、 1—プロパノ一ル、 2—プロパノール、エチレングリコール、 1 , 2 - プ口パンジオールおよびグリセリンには活性を示さない。

3. さらに、下記（4) 〜（6) の理化学的性質を有する請求の範囲第 1 項または第 2項記載の（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼ

(4) 分子量： SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動分析において約 60， 000D a、

(5) 熱安定性： pH7. 2で 40t:、 20分間処理したのち、 90% 以上の活性を保持している、

(6) 至適反応 pH： 7〜10。

4. アースロバクター属に属する微生物より得られる請求の範囲第 1項〜第 3項のいずれかに記載の（D) — 2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼ。

5. アースロバクター属に属する微生物がアースロバクタ一 ·スピ一シーズ KNK— GA1 (寄託機関独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター、あて名日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305 - 8566) 、寄託日平成 14年 3月 7日、受託番号 F E RM B P— 8 3 7 5 ) である請求の範囲第 4項記載の (D) 一 2—ヒドロキシ酸ォキシダ一ゼ。

6. 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼ、または該酵素を産生する微生物の培養液、該培養液より分離した微生物菌体、微生物菌体の処理物のいずれかをグリコール酸に作用させ、グリオキシル酸へと変換せしめ、ダリオキシル酸を採取することを特徴とするダリオキシル酸の製造方法。

7. 前記反応をカタラーゼ存在下で行なう請求の範囲第 6項記載のグリォキシル酸の製造方法。

8. 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼが請求項 1〜 5のいずれかに記載の（ D) - 2—ヒドロキシ酸ォキシダーゼであるところの請求の範囲第 6項または第 7項記載のダリォキシル酸の製造方法。