WO2003097865A1

WO2003097865A1 - Procede destine a empecher la formation de couleurs erronees de n-(carboxymethylaminocarbonyl)-4,4'-bis(dimethylamino)diphenylamine sodium, solution de reactifs destinee a ce procede et procede de mesure faisant intervenir ledit procede

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Publication number: WO2003097865A1
Application number: PCT/JP2003/005642
Authority: WO
Inventors: Satoshi Yonehara; Tsuguki Komori
Original assignee: Arkray, Inc.
Priority date: 2002-05-21
Filing date: 2003-05-02
Publication date: 2003-11-27
Also published as: EP1512751B1; EP1512751A4; JP4143698B2; CN1330773C; ATE412770T1; US7432072B2; US20050176086A1; JPWO2003097865A1; DE60324423D1; CN1656232A; EP1512751A1; AU2003231415A1

Description

明細書

N -（カルホ'、キシメチルァミノカルホ'、二ル）— 4, 4， -ビス（シ'メチルァミノ）シ'、フエニルァミンナトリウムの誤発色防止方法および前記方法を用いた試薬溶液ならびに測定方法技術分野

本発明は、 N -（力) キシメチルァミノカルホ'ニル） -4， 4， -ビス（シ"層ミノ）シ"フユニルァミンナトリウムの誤発色を防止する方法および前記方法を用いた試薬溶液ならびに酸化還元反応を利用した測定方法に関する。背景技術

従来から、試料中の測定対象物の量を酸化還元反応を利用して測定する方法が、広く実施されており、例えば、以下のように行われている。まず、酸化物質である測定対象物や、測定対象物から発生した酸化物質に、ペルォキシダ一ゼ（以下、「P〇D」という）および還元剤を添加し、前記 P O Dを触媒として前記酸化物質と前記還元剤との間で酸化還元反応させる。前記還元剤として、酸化されることによって発色する還元剤を用いれば、その発色量と前記酸化物質量とは相関関係にあるため、前記発色量の測定により前記酸化物質量を決定できる。このような酸化により発色する還元剤として、 N -（カルホ'キシメチルァミノカルホ"二ル）- 4， 4 ' -ビス（シ "メチルァミノ）シ'フエニルァミンナトリウムが使用されている。しかしながら、このような測定方法は、測定感度が十分ではないために、測定精度が向上しない場合があった。発明の開示そこで、本発明者らは、鋭意研究の結果、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムの存在下で前記酸化還元反応を行えば、測定感度を向上できることを見出し、別途出願している。しかし、この方法によると、前述のように測定感度は向上するが、新たな問題として、 N- (カルホ"キシメチルァミノカル) Tニル) -4, 4' -ビス (シ'メチルァミノ）シ"フエニルァミンナトリウムとテトラゾリゥム化合物とアジ化ナトリゥムとの 3成分が溶液中で共存することによって、前記酸化還元反応前に、発色基質である N- (カルホ'キシメチルァミノカルホ'二ル）- 4， 4 ， -ビス（シ'メチルァミノ）シ 'フ Iニルァミンナトリウムが誤発色を起すことがわかった。このように誤発色が生じると、例えば、前述のように発色量を測定する場合に、バックグラウンドが高くなるという問題があり、また、十分量添加したはずの発色基質が、酸化還元反応において不足する場合もある。そこで、本発明の目的は、 N -（カルホ'キシメチルァミノカルホ'ニル） -4, 4' -ビス（シ'メチルァミノ）シ'フ Iニルァミンナトリウムの誤発色を防止する方法の提供である。前記目的を達成するために、本発明の誤発色防止方法は、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを含む水性溶媒中における N- (力ルホ"キシメチルァミノカルホ"二ル）- 4,4' -ビス（シ"メチルァミノ）シ'フエニルァミンナトリウム（以下、「DA— 6 4」ともいう）の誤発色を防止する方法であって、界面活性剤を前記水性溶媒に共存させ、テトラゾリゥム化合物、アジ化ナトリウムおよび DA— 6 4を前記水性溶媒中で混合し、かつ、前記 DA— 6 4 1 ΐΐΐ ο 1 に対するテトラゾリゥム化合物の割合を 0. 0 1〜 l mmo 1の範囲、アジ化ナトリウムの割合を 0. 0 0 3〜0. 5 mm o lの範囲および前記界面活性剤の割合を 0. 0 0 6〜0. 4mmo lの範囲とし、 D A— 6 4、テトラゾリゥム化合物、アジ化ナトリウムおよび界面活性剤を含む前記水性溶媒の P Hを 6〜9とすることを特徴とする。

このように、界面活性剤の存在下で前記 3つの成分を混合し、かつ、各成分の濃度および混合液の pHを前記範囲に設定すれば、「D A_ 6, 4、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリウム」が水性溶媒中で共存しても、前述のような D A— 64の誤発色を抑制できる。したがって、このような誤発色防止方法を利用して、後述するような酸化還元反応を用いた測定を行えば、吸光度測定におけるバックグラウンドの上昇が抑制でき、測定対象物を高精度で測定できる。なお、これらの各成分の添加順序は、特に制限されず、 DA— 64、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリウムの全てを水性溶媒中で混合する際に、前記界面活性剤が共存していればよい。このため、例えば、予め水性溶媒に界面活性剤を添加してから、他の 3成分をそれぞれ添加してもよいし、水性溶媒にテトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを添加した後に、界面活性剤の存在下、 D A— 64を添加してもよく、これらの添加順序には制限されない。つぎに、本発明の試薬溶液は、 DA— 64、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリウムを含む D A— 64試薬溶液であって、さらに界面活性剤を含み、かつ、前記 D A— 64 l ^mo lに対して、テトラゾリゥム化合物が 0. 0 1〜 lmmo lの範囲、アジ化ナトリウムが 0. 0 0 3〜0. 5 mm o 1の範囲および界面活性剤が 0. 006〜0. 4 mmo 1の範囲であり、その ρ Hが 6〜 9の範囲である。

このような組成の試薬溶液も、前述の誤発色防止方法と同様に、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムの存在下であっても、 D A— 64の誤発色を防止できる。このため、溶液状態で、安定に保存することが可能となり、例えば、以下の測定方法等に有用である。つぎに、本発明の測定方法は、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムの存在下、試料中の測定対象物由来の酸化物質と発色基質である D A— 6 4とを酸化還元酵素により反応させ、前記発色基質の発色量を測定することにより、前記酸化物質の量を測定する方法であって、界面活性剤の存在下、テトラゾリゥム化合物、アジ化ナトリウムおよび発色基質を水性溶媒中で混合し、かつ、前記発色基質 D A— 6 4 1 rn o 1に対するテトラゾリゥム化合物の割合を 0 . 0 1〜 1 mm o 1の範囲、アジ化ナトリウムの割合を 0 . 0 0 3〜0 . 5 mm o lの範囲および界面活性剤の割合を 0 . 0 0 6〜0 . 4 mm o 1の範囲とし、前記混合液の p Hを 6〜9とすることを特徴とする。

このような測定方法は、測定感度に優れるだけでなく、 D A— 6 4の誤発色によるバックグラウンドの上昇も抑制できるため、測定精度にも優れる。なお、本発明において、「測定対象物由来の酸化物質」とは、測定対象物そのもの、もしくは、その中の酸化物質、または測定対象物から酸化還元酵素等を用いて発生した酸化物質の双方を意味する。

本発明の測定方法において、前記水性溶媒は、測定対象物を含む試料溶液であることが好ましく、例えば、前記試料溶液に、テトラゾリゥム化およびアジ化ナトリウムを添加した後、界面活性剤の存在下、さらに N -（カルホキシメチルァミノカルホ"ニル） - 4， 4，一ビス（シ"唐ミノ）シ'フエニルァミンナトリウムおよび酸化還元酵素を添加して、前記酸化還元酵素による反応を行うことが好ましい。

本発明の測定方法において、前記測定試料の種類は、特に制限されず、例えば、全血、血漿、血清、血球等の血液試料の他に、尿、髄液等の生体試料や、ジュース等の飲料水、醤油、ソース等の食品類等の試料に対しても適用できる。

本発明の測定方法において、測定対象物としては、前記酸化還元反応を利用するものであれば特に制限されない。例えば、全血中成分、赤血球内成分、血漿中成分、血清中成分、尿成分、髄液成分等があげられるが、好ましくは赤血球内成分である。例えば、前記赤血球成分を測定する場合、全血をそのまま溶血させたものを試料としてもよいし、全血から赤血球を分離して、前記赤血球を溶血させたものを試料として用いてもよい。また、具体的な測定対象物としては、例えば、糖化へモグロビン、糖化アルブミン等の糖化タンパク質、糖化ペプチド、糖化アミノ酸、グルコース、尿酸、コレステロール、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等もあげられ、より好ましくは糖化タンパク質であり、特に好ましくは糖化ヘモグロビンである。糖化ヘモグロビンは、生体血糖値の過去の履歴を反映するため、糖尿病診断や治療等における重要な指標とされている。本発明によれば、その量を高精度に測定できるため、糖化ヘモグロビンの指標としての信頼性が向上し、臨床医療の分野においても有益だからである。本発明の測定方法において、測定対象物が糖化タンパク質の場合、前記糖化タンパク質の糖化部分をフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ（以下、「F A O D」という）で酸化分解することにより過酸化水素を生成させることが好ましい。また、前記糖化ペプチド、糖化アミノ酸も、同様に F A O Dを作用させることが好ましい。このようにして生成した過酸化水素は、前述の測定対象物由来の酸化物質に相当する。なお、前記糖化タンパク質や糖化ペプチドは、必要に応じて、前記 F A O D処理前に、プロテアーゼ処理することが好ましい。前記 F A O Dとしては、下記式（ 1 ) に示す反応を触媒する F A O D であることが好ましい。 R¹— CO_CH₂ - NH R² + H₂0 + 0₂ R ¹ - C O- CHO + NH₂— R² + H₂〇₂ ( 1 ) 前記式（ 1) において、 R¹は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（R¹) は、反応前の糖がァルド一スの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、ァマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（R¹) は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（R¹) は、例えば、

一 [CH (OH) ]_n_CH₂〇H

で示すことができ、 nは、 0〜6の整数である。

前記式（ 1) において、 R²は、特に制限されないが、例えば、糖化アミノ酸、糖化ペプチドまたは糖化タンパク質の場合、 α—ァミノ基が糖化されている場合と、それ以外のァミノ基が糖化されている場合とで異なる。

前記式（ 1) において、 α—ァミノ基が糖化されている場合、 R²は、下記式（2) で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。一 CHR³ - CO - R⁴ … (2) 前記式（2) において、 R³はアミノ酸側鎖基を示す。また、 R⁴は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（3) で示すことができる。下記式（3) において、 nは、 0以上の整数であり、 R³は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。一 (NH- CHR³- CO) _n-OH … (3) また、前記式（ 1) において、 α—アミノ基以外のァミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、 R²は下記式（4 ) で示すことができる。

—R⁵— CH (NH- R⁶) 一 CO— R⁷ … （4) 前記式（4) において、 R⁵は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、 R⁵は

であり、

例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、 R⁵は、

-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH (NH₂) - である。

また、前記式（4) において、 R⁶は、水素、アミノ酸残基またはべプチド残基であり、例えば、下記式（5) で示すことができる。なお、下記式（ 5) において、 nは 0以上の整数であり、 R³は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。一 (CO-CHR³-NH) _n-H … (5) また、前記式（4) において、 R⁷は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（6) で示すことができる。なお、下記式（6) において、 nは 0以上の整数であり、 R³は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。一（NH - CHR³— CO) _n - OH … （6) 前記 FAODとしては、例えば、 —ァミノ基が糖化された糖化アミノ酸に特異的に作用する市販の商品名フルクトシルーアミノ酸ォキシダ —ゼ（FAOX— Ε) (キッコ一マン社製）、ひ—アミノ基およびリジン等の ε—ァミノ基等が糖化された糖化アミノ酸に特異的に作用する商品名 FOD (旭化成社製）、商品名 ΚΑΟ (ジェンザィム社製）等があげられる。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の測定方法の実施例における、吸光度の経時的変化を示したグラフである。

発明を実施するための最良の形態

本発明による D Α— 64の誤発色の防止は、例えば、以下に示すように行うことができる。

水性溶媒に界面活性剤を溶解し、この溶液にテトラゾリゥム化合物、アジ化ナトリウムおよび DA— 64を混合する。この際、 DA— 64 1 ^mo 1に対して、テトラゾリゥム化合物を 0. 0 1〜 1 mmo 1の範囲、アジ化ナトリウムを 0. 0 0 3〜0. 5mmo lの範囲および前記界面活性剤を 0. 0 06〜0. 4 mm o 1の範囲に設定し、前記混合液の pHを 6〜9に調整すればよい。

各成分の割合は、好ましくは、 DA— 64 l〃mo lに対して、テトラゾリゥム化合物 0. 02〜0. 8 mm o lの範囲、アジ化ナトリウム 0. 0 1 ~0. 3 mm o 1の範囲および前記界面活性剤 0. 0 1〜0 . 4 mm o 1の範囲であり、特に好ましくは DA— 64 1 m o 1に対して、テトラゾリゥム化合物 0. 0 3〜0. 6 mm o lの範囲、アジ化ナトリウム 0. 0 1〜0. 2 mm o 1の範囲および前記界面活性剤 0 . 04〜0. 3 mm o lの範囲である。また、前記混合液の ρΗは、好ましくは 6〜 9であり、より好ましくは 6. 5〜 8である。各成分の添加順序は、前述のように特に制限されず、テトラゾリゥム化合物、アジ化ナトリウムおよび D Α— 64の 3成分を混合する際に、前記界面活性剤が前記範囲で共存していればよい。

前記水性溶媒としては、特に制限されないが、例えば、水、各種緩衝液等があげられる。前記緩衝液としては、例えば、 T r i s _HC l、リン酸ナトリウム、 EP P S、 HE P E S、 TE S等が使用でき、好ましくは T r i s— HC 1、リン酸ナトリウムである。また、前記緩衝液の濃度は、例えば、 1 0〜3 0 OmMの範囲であり、好ましくは 5 0〜 30 0 mMである。前記界面活性剤としては、特に制限されないが、例えば、 B r i j 3 5、 B r i j 58、ポリオキシエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテルや、 T r i t o nX— 1 0 0、 T r i t o n X- 1 14等のポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテルや、 T we e n 20、 Tw e e n 6 0等のポリオキシエチレンソルビタンェ一テル等があげられる。前記テトラゾリゥム化合物としては、例えば、テトラゾ一ル環の少なくとも 2箇所に環構造置換基を有する構造であることが好ましく、より好ましくは、 3箇所に環構造置換基を有する構造である。

前記テトラゾリゥム化合物が、前述のように、前記テトラゾ一ル環の少なくとも 2箇所に環構造置換基を有する場合、前記置換基を、前記テトラゾ一ル環の 2位および 3位に有することが好ましい。また、テトラゾリゥム化合物が 3箇所に環構造置換基を有する場合は、前記置換基を、前記テトラゾ一ル環の 2位、 3位および 5位に有することが好ましいまた、テトラゾリゥム化合物は、少なくとも 2つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。前記ベンゼン環以外の環構造置換基としては、例えば、環骨格に Sまたは〇を含み、かつ共鳴構造である置換基があげられ、例えば、チェニル基、チアゾィル基等である。また、前記テトラゾリゥム化合物は、テトラゾール環の少なくとも 3 箇所に環構造置換基を有し、前記環構造置換基のうち少なくとも 2つの環構造置換基の環構造がベンゼン環であることが好ましい。

また、少なくとも 1つの環構造置換基が官能基を有することが好ましく、前記官能基の数が多いことがより好ましい。

前記官能基としては、電子吸引性の官能基が好ましく、例えば、ハロゲン基、エーテル基、エステル基、カルポキシ基、ァシル基、ニトロソ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基等があげられる。この他にも、例えば、ヒドロペルォキシ基、ォキシ基、エポキシ基、ェピジォキシ基、ォキソ基等の酸素を含む特性基や、メルカプト基、アルキルチオ基、メチルチオメチル基、チォキソ基、スルフィノ基、ベンゼンスルホニル基、フエニルスルホニル基、 P-トルエンスルホニル基、 p-トリルスルホニル基、トシル基、スルファモイル基、イソチオシァネート基等の硫黄を含む特性基等があげられる。これらの電子吸引性官能基の中でも、好ましくは、ニトロ基、スルホ基、ハロゲン基、カルポキシ基、ヒドロキシ基、メトキシ基、エトキシ基である。また、前記電子吸引性の官能基の他に、例えば、フエニル基（C₆H₅—）、スチリル基（C₆H₅CH = CH—）等の不飽和炭化水素基等もあげられる。なお、前記官能基は、解離によりイオン化していてもよい。

前記テトラゾリゥム化合物は、テトラゾール環の 2位および 3位にベンゼン環を有し、前記ベンゼン環のうち少なくとも一方が、ハロゲン基、カルポキシ基、ニトロ基、ヒドロキシ基、スルホ基、メトキシ基およびエトキシ基からなる群から選択された少なくとも 1つの官能基を有することが好ましい。なお、前記両方のベンゼン環が、前記官能基を有してもよい。前記ベンゼン環において、いずれの箇所（ortho-、 meta -、 p ra -）に前記官能基を有してもよい。また、官能基の数も特に制限されず、同じ官能基を有しても、異なる官能基を有してもよい。

前記テトラゾリゥム化合物は、例えば、前記テトラゾ一ル環の 2位、 3位および 5位にベンゼン環構造置換基を有する化合物として、例えば、 2- (4-ョ一ドフエ二ル） -3- (4 -二トロフエニル） - 5- (2，4-ジスルホフエ二ル）- 2H-テトラゾリゥム塩、 2- (4-ョ一ドフエ二ル）- 3- (2，4-ジニト口フエ二ル）- 5- (2, 4_ジスルホフエニル） -2H-テトラゾリゥム塩、 2-(2 -メトキシ -4-二ト口フエ二ル）- 3- (4 -二トロフエニル） -5- (2， 4-ジスルホフェニル）- 2H-テトラゾリゥム塩、 2-(4-ョードフエ二ル）- 3- (4-ニトロフェニル）-5-フエニル- 2H-テトラゾリウム塩、 3， 3， -（1，1， -ビフエ二ル- 4,4' -ジル）-ビス（2， 5 -ジフエ二ル）- 2H-テトラゾリゥム塩、 3,3' -[3, 3 ， -ジメトキシ-（1， 1， -ビフエニル） -4， 4' -ジル]-ビス [2- (4-ニトロフェニル）-5-フエニル- 2H-テトラゾリゥム塩]、 2, 3-ジフエニル- 5- (4 -クロロフエニル）テトラゾリゥム塩、 2, 5-ジフエニル -3- (p-ジフエニル）テトラゾリゥム塩、 2， 3-ジフエニル _5- (p-ジフエニル）テトラゾリゥム塩、 2, 5-ジフエニル- 3- (4-スチリルフエニル）テトラゾリゥム塩、 2， 5 -ジフエニル- 3- (m-トリル）テトラゾリゥム塩および 2, 5 -ジフエニル- 3- (P- トリル）テトラゾリゥム塩等があげられる。

また、前記テトラゾリゥム化合物は、前述のような化合物には制限されず、この他に、前記テトラゾール環の 2箇所にベンゼン環構造置換基および 1箇所にその他の環構造置換基を有する化合物も使用でき、例えば、 2， 3-ジフエニル- 5- (2-チェニル）テトラゾリゥム塩、 2-ベンゾチアゾィル -3- (4-カルボキシ- 2-メトキシフエ二ル）- 5- [4- (2-スルホェチルカルパモイル）フエ二ル] - 2H-テトラゾリゥム塩、 2， 2 ' -ジベンゾチアゾィル -5, 5， -ビス [4-ジ（2-スルホェチル）力ルバモイルフエ二ル] - 3, 3 ' -（3, 3， -ジメトキシ- 4, 4 ' -ビフエ二レン）ジテトラゾリゥム塩および 3- (4, 5-ジメチル -2-チアゾィル）-2， 5-ジフエニル- 2H-テトラゾリゥム塩等があげられる。

また、前記テトラゾ一ル環の 2箇所にベンゼン環構造置換基および 1 箇所に環構造でない置換基を有するテトラゾリゥム化合物も使用でき、例えば、 2， 3-ジフエニル- 5-シァノテトラゾリゥム塩、 2, 3-ジフエ二ル- 5-力ルポキシテトラゾリゥム塩、 2, 3-ジフエニル- 5-メチルテトラゾリゥム塩、 2， 3-ジフエ二ル -5 -ェチルテトラゾリゥム塩等があげられる。前述のテトラゾリゥム化合物の中でも、前述のように、環構造置換基を 3つ有する化合物が好ましく、より好ましくは、環構造がベンゼン環である置換基を 3つ有し、かつ電子吸引性官能基を多く有するものであり、特に好ましくは、 2- (4-ョ一ドフエニル） -3- (2， 4-ジニトロフエニル ) -5- (2, 4-ジスルホフエニル） -2H-テトラゾリゥム塩である。なお、このようなテトラゾリゥム化合物は、例えば、塩でもよいし、イオン化された状態等であってもよい。また、前記テトラゾリゥム化合物は、一種類でもよいし、二種類以上を併用してもよい。このように、 DA— 6 4の誤発色を防止するために調製された溶液は、 DA— 6 4試薬溶液として使用できる。用途としては、特に制限されないが、例えば、後述する酸化還元反応における発色基質の試薬溶液として使用できる。つぎに、本発明の酸化還元反応を用いた測定方法について、血球中の糖化夕ンパク質を測定する例をあげて説明する。

まず、全血をそのまま溶血することによって、または全血から遠心分離等の常法により血球画分を分離してこれを溶血することによって、溶血試料を調製する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、前記界面活性剤を用いる方法が好ましい。

前記界面活性剤としては、例えば、ホ。リオキシ Iチレン- p - 1 -ォクチルフ 1ニルェ-テル ( T r i t o n系界面活性剤等）、ホ°リエチレンソルビタンアルキル Iステル（Twe e n系界面活性剤等）、ホ。リオキシエチレンアルキルェ-テル（B r i j系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、 T r i t o n X— 1 00、 Twe e n— 20、 B r i j 3 5等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が、 1〜 1 0 体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が 0. 0 1〜 5重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で、数秒（約 5秒）〜 1 0分程度攪拌すればよい。つぎに、前記溶血試料に対し界面活性剤を添加する。なお、前述のような界面活性剤による溶血処理を行った場合、すでに下記添加割合となつていれば界面活性剤をさらに添加する必要はなく、また、下記添加割合に満たない場合は、不足分を添加すればよい。

界面活性剤は、後述する酸化還元反応溶液における終濃度が、 0. 0 06〜 80 mm o 1 /Lの範囲になるよう添加すればよく、好ましくは 0. 05〜 40 mm o 1 /Lの範囲、特に好ましくは 0. 2〜20mm o 1 ZLの範囲である。また、界面活性剤を添加した溶血試料における界面活性剤の濃度は、例えば、 0. 1〜 200 mmo 1 /Lの範囲であり、好ましくは 0. 5〜1 0 Ommo 1 /Lの範囲、特に好ましくは 2 〜 10 Ommo 1 /Lの範囲である。続いて、前記界面活性剤を含む溶血試料に対し、さらにテトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを添加する。

テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムは、前記酸化還元反応溶液における終濃度がそれぞれ、テトラゾリゥム化合物 0. 01〜40 mmo 1 /Lの範囲、アジ化ナトリウム 0. 01 5〜2 Ommo 1 /Lの範囲となるように添加すればよく、好ましくはテトラゾリゥム化合物 0 . 1〜 32mmo 1 ZLの範囲、アジ化ナトリウム 0. 05〜 12 mm o 1 ZLの範囲であり、特に好ましくはテトラゾリゥム化合物 0. 1 5 〜 24mmo 1 の範囲、アジ化ナトリウム 0. 05〜8mmo l ZL の範囲である。

また、前記テトラゾリゥム化合物（A) とアジ化ナトリウム（B) の添加割合（モル比 A： B) は、例えば、 A： B = 10 ： 1〜 1 ： 1の範囲であり、好ましくは 6 ： 1〜1. 5 ： 1の範囲、より好ましくは 4 ： 1〜 2 ： 1の範囲である。

具体的には、前記テトラゾリゥム化合物は、例えば、処理溶液中の血球濃度が、 1〜 10体積％の場合、濃度 0. 02〜 2000mmo lZ Lの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは 0. 1 〜 1 0 0 0 mm o 1 /Lの範囲、特に好ましくは 0. 4〜2 0 0 mm o 1 ZLの範囲である。また、アジ化ナトリウムは、例えば、処理溶液中の血球濃度が、 1〜： L 0体積％の場合、濃度 0 · 0 06〜 80 0 mmo 1 ZLの範囲になるように添加することが好ましく、より好ましくは 0 . 04〜40 Ommo 1 ZLの範囲、特に好ましくは 0. 1〜 8 0 mm o 1 /Lの範囲である。

前記テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムは、そのまま前記溶血試料に添加してもよい。しかし、操作の簡便性等の点から、溶媒に溶解したテトラゾリゥム化合物溶液およびアジ化ナトリゥム溶液として、または、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリウムの両方を含有する溶液（テトラゾリゥム化合物 ·アジ化ナトリウム混合液）として使用することが好ましい。

前記溶液の溶媒としては、例えば、 MOP S、 CHE S、 T r i s— HC 1、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、 HEP E S、 TE S等の緩衝液が使用できる。前記溶媒の pHは、例えば、 5〜 1 2の範囲であり、好ましくは、 6〜： L 0の範囲である。

また、より一層の感度向上が可能であることから、調製した前記テトラゾリウム化合物 · アジ化ナトリウム混合液を、前記溶血試料に添加する前に、一定時間放置することによってエージングすることが好ましい。このエージング処理によって、感度が、エージングしない場合よりも、例えば、約 1. 2〜 3倍に向上する。

前記エージングにおいて、例えば、処理温度は、 4〜80°Cの範囲が好ましく、より好ましくは 2 5〜 7 5°Cの範囲であり、特に好ましくは 40〜 7 0 °Cの範囲である。処理時間は、例えば、 1 0分〜 2 00時間の範囲であり、好ましくは 1時間〜 1 8 0時間の範囲であり、より好ましくは 3時間〜 100時間の範囲である。前記溶血試料に対して、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナ卜リウムを直接または前記溶液として添加した後、通常、処理温度 1 0〜40 °Cの範囲で、 1〜 1 0分インキュベートし、前記試料の前処理を行う。このように試料をテトラゾリゥム化合物で前処理することによって、前記試料中に含まれる還元物質等が酸化還元反応に与える影響を除去でき、測定精度も向上できるからである。このようにテトラゾリゥム化合物は、還元物質の影響除去による測定精度の向上にも寄与するが、テトラゾリゥム化合物とアジ化ナトリゥムとの共存によって測定感度も向上する。続いて、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを添加した前処理済み溶血試料について、プロテア一ゼ処理を行う。これは、後の処理に使用する F A O Dを測定対象物に作用し易くするためである。

前記プロテア一ゼとしては、特に制限されないが、例えば、セリンブ口テアーゼ、チオールプロテアーゼ、メタ口プロティナ一ゼ等が使用でき、具体的には、トリプシン、プロテナ一ゼ K：、キモトリブシン、パパイン、ブロメライン、ズブチリシン、エラス夕ーゼ、アミノぺプチダーゼ等が好ましい。また、分解する糖化タンパク質が糖化ヘモグロビンの場合、前記プロテアーゼは、前記糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテア一ゼであり、ブロメライン、パパイン、ブ夕滕臓由来トリプシン、メタ口プロティナ一ゼ、 Bacillus sub t i 1 i s由来のプロテアーゼ等が好ましい。前記 Bacillus subt i 1 is由来プロテア一ゼとしては、商品名プロテア一ゼ N (例えば、フル力社製）、商品名プロテアーゼ N「アマノ」（天野製薬社製）等があげられる。前記メタ口プロティナーゼとしては、 Bacillus属由来メタ口プロティナ一ゼ（E C 3. 4. 24. 4) 等があげられる。これらの中でもより好ましくはメタ口プロティナーゼ、ブロメライン、パパインであり、特に好ましくはメタ口プロティナ一ゼである。このように、選択的に分解するプロテア一ゼを使用すれば、特定のタンパク質の分解物を選択的に調製できる。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件は、使用するプロテア一ゼの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される。

前記緩衝液としては、例えば、 CHE S緩衝液、 CAP SO緩衝液、 CAP S緩衝液、リン酸緩衝液、 T r i s緩衝液、 EP P S緩衝液、 H E P E S緩衝液等が使用できる。その pHは、例えば、 6〜 1 3の範囲であり、好ましくは？〜 1 0の範囲である。また、プロテアーゼ処理溶液における前記緩衝液の最終濃度は、例えば、 l〜 2 0 0mmo l/ の範囲である。

具体的には、例えば、前記プロテア一ゼとしてメタ口プロティナ一ゼを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のメ夕口プロティナーゼ濃度 2〜2 0， 0 0 0 KUZL、反応液中の血球濃度 0. 05〜 1 5体積％、反応温度 1 5〜3 7° (、反応時間 1分〜 24 時間、 pH 6〜 1 2の範囲である。

また、例えば、前記プロテア一ゼとしてプロテアーゼ Kを用いて前記前処理済み溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテア一ゼ濃度 1〜： 1 0, 0 0 0 KU/L、反応液中の血球濃度 0. 0 5〜 1 5体積 %、反応温度 1 5〜3 7°C、反応時間 1分〜 24時間、 pH6〜 l 2の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、 EP P S緩衝液、 P I PE S緩衝液等が使用できる。つぎに、前記プロテア一ゼ処理により得られた分解物を、前記 FAO Dで処理する。この FAOD処理により、前記式（1) に示す反応が触媒される。

この F AO D処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、その処理条件は、使用する FAODの種類、測定対象物である糖化タンパク質の種類およびその濃度等により適宜決定される具体的には、例えば、反応液中の FAOD濃度 50〜 50, 000 U /L、反応液中の血球濃度 0. 0 1〜 1体積％、反応温度 1 5〜 3 7°C 、反応時間 1〜6 0分、 pH6〜9の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。つぎに、前記 FAOD処理で生成した過酸化水素を、 PODおよび D A- 64を用いて酸化還元反応により測定する。

発色基質である D A— 64は、この酸化還元反応溶液における終濃度が、 0. 0 0 1〜2 Ommo 1 /Lの範囲となるように添加すればよく、好ましくは 0. 0 0 5〜2mmo 1 /Lの範囲、特に好ましくは 0. 0 1〜0. 5 mm o 1 /Lの範囲である。

また、 DA— 64 (C) と、すでに添加した界面活性剤（D)、テトラゾリゥム化合物（E) およびアジ化ナトリウム（F) との添加割合（モル比 C ： D : E : F) は、 1 : 6 : 1 0 : 3〜 1 : 2 000 : 1 0 0 0 : 5 0 0の範囲であり、好ましくは 1 : 1 0 : 20 : 1 0〜； L : 1 0 00 : 8 00 : 300の範囲であり、より好ましくは 1 ： 40 ： 3 0 ： 1 0〜 1 : 5 00 : 60 0 : 200の範囲である。

この酸化還元反応溶液の p Hは、 6〜 9の範囲であり、好ましくは 6 〜8の範囲である。

前記酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、前記生成した過酸化水素の濃度等により適宜決定される。具体的には、例えば

、反応液中の P O D濃度 1 0 ~ 1 0 0， 0 0 0 1 U /L、発色性基質濃度 0 . 0 0 1〜2 O mm o 1 /L、反応温度 1 5〜3 7 °C、反応時間 0 . 1〜3 0分、 p H 6〜8である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、例えば、前記プロテアーゼ処理および F A O D処理等と同様の緩衝液等が使用できる。

前記 D A— 6 4は、酸化還元反応により発色するため、この反応液について、例えば、検出波長 6 5 0〜 7 6 0 n mの範囲における吸光度（発色程度）を分光光度計で測定すれば、過酸化水素の量を測定できる。そして、測定した過酸化水素量と、予め準備した過酸化水素量と糖化夕ンパク質量との相関関係を示す検量線とを用いて、試料中の糖化タンパク質量を求めることができる。

このように、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムだけでなく、さらに界面活性剤を添加し、その添加割合を前述の範囲に設定すれば、 D A— 6 4の誤発色を防止できるため、バックグラウンドの上昇を抑制した、高い測定精度が実現できる。また、前述のように、測定対象物は、酸化還元反応を利用するものであれば、特に制限されず、前記糖化タンパク質の他に、例えば、糖化べプチド、糖化アミノ酸、グルコース、コレステロール、尿酸、クレアチニン、サルコシン、グリセロール等があげられる。これらを測定する場合は、例えば、前述と同様にして測定対象物由来の酸化物質を生成して、その量を酸化還元反応によって測定すればよい。前記測定対象物由来の酸化物質として、例えば、過酸化水素を発生させ、前記各測定対象物の量を測定する場合は、例えば、前記グルコースにはグルコースォキシダーゼを、前記コレステロールにはコレステロ一ルォキシダ一ゼを、前記尿酸にはゥリカーゼを、前記クレアチニンにはサルコシンォキシダーゼを、前記サルコシンにはサルコシンォキシダーゼを、前記グリセロールにはグリセロールォキシダーゼを、それぞれ作用させて過酸化水素を発生させればよい。この過酸化水素量の測定方法は、前述と同様にして行うことができる。また、糖化ペプチド、糖化ァミノ酸は、例えば、前記糖化タンパク質の測定と同様にして測定できる

実施例

(処理液 A)

A-1 ：ホ。リオキシヱチレン（9)ラウリルヱ-テル (PEGLE) 7 g /L (12mmol/L)を含む

40龍 ol/L CHES緩衝液（pH9.5)

A - 2 ： PEGLE 50g/L (85mmol/L) を含む 40mmol/L CHES緩衝液（pH9.5)

(処理液 B)

2- (4 -ョ-ドフエニル) -3- (2, 4-シ'、ニトロフエニル) -5- (2, 4 -シ'、スルホフエニル) - 2H -テトラ、,リウム塩（商品名 WST_3、同仁化学社製） 5mmol/Lとアジ化ナトリウム 1.5mmol /Lとを混合し、 5 0°Cで 24時間インキュベートした。この混合溶液 3 mLと、メタ口プロテアーゼ（アークレイ社製、 10，000KU/L) lmL、 ME S緩衝液（50mmol/L p H5.5) lmL、 N a C 1溶液（500mmol/L ) および精製水 3mLとを混合したものを処理液 Bとした。 (処理液 C)

C-l ： DA- 64 80 1/L

T r i s緩衝液（ρ H7.0) 30 Ommol/L

F AOD (ァ一クレイ社製） 3 0 KU/L

P OD 1 00 KU/U

C-2 ： DA- 64 1 000 1/L

T r i s緩衝液（p H7.0) 30 Ommol/L

F AOD (アークレイ社製） 3 0 KU/L

POD 1 00 KU/U

(方法）

血液を遠心分離（3000 r pm) して血球を回収した。この血球 1 0 Lと前記処理液 A (A-l、 A-2) 3 0 0 Lを混合して、溶血試料を調製した。この溶血試料 1 0 ^しに、前記処理液 B 1 00 Lを添加して 3 7 °Cで 5分間インキュベートし、さらに前記処理液 C (C- 1、 C-2) 2 2 Lを加えて 3 7 °Cでインキュベートし、この反応液の吸光度（波長 7 5 1 nm) を自動分析装置 J CA— BM8 (日本電子株式会社製）を用いて測定した。溶血試料と前記処理液 Bとを混合した時点を 0秒、処理液 C添加時を 3 00秒とした。そして、 F A〇Dと P〇Dとによる反応が終了した後に継続して生じる誤発色を測定するために、 48 6秒〜 6 0 3秒間の吸光度変化量を求めた。下記表 1に、反応液における各成分の終濃度および DA- 64 1 zmo 1に対する添加割合を示し、また、吸光度変化量の結果を図 1および下記表 2に示す。前記図 1は、反応液における吸光度の経時変化を示すグラフである。 (表 1)

実施例 1 比較例 1 比較例 2 比較例 3 処理液 A A— 1 A- 2 A— 1 A - 2 処理液 B B B B B

机理 ·¾液 tlx.し Cし一 1丄し丄し P— 9

反応時終濃度

PEGLE(mmol/L) 0.909 6.44 0.909 6.44

WST-3 ( mol/L) 1.136 1.136 1.136 1.136

NaN 3 (mmol/L) 0.341 0.341 0.341 0.341

1 ノ 1 S ¾ 1 1 fifi 7 1 fifi 7 添加割合

PEGLE(mmol) 0.068 0.483 0.005 0.039

o丄 o v in in υ ιノ 00 0 0 0

丄、 u n nn?n 0 nn?n

DA-64( mol) 1.0 1.0 1.0 1.0

(表 2)

実施例 1 比較例 1 比較例 2 比較例 3 吸光度変化量 0.0049 0.0091 0.0087 0.0099 前記表 1に示すように，比較例 1は、 DA- 64 1 inolに対する： PEGLEが多く（>0.4mmol)、比較例 2は、 DA- 64 1 molに対する PEGLE (<0.00 6mmol), WST-3 (く 0.01mmol)、 NaN₃ (<0.003mmol)がそれぞれ少なく、比較例 3は、 DA- 64 1 molに対する WST- 3 (<0. Olmmol)、 aN₃ «0.00 3mmol)がそれぞれ少ない。このため、比較例 1〜 3は、図 1に示すように誤発色によって高い吸光度を示し、前記表 2に示すように吸光度変化量が大きくなるが、実施例 1によれば、誤発色が防止されることによつて、図 1に示すように吸光度が低くなり、前記表 2に示すように吸光度変化量も抑制された。これらの結果から、本発明の方法によれば、 DA - 6 4の誤発色を防止し、これによつて測定精度を向上できることがわかる

産業上の利用の可能性

以上のように、本発明によれば、発色基質である D A— 6 4の誤発色を防止できるため、この誤発色防止方法を、酸化還元反応を用いた測定に適用すれば、誤発色によるバックグラウンドの増加を抑制でき、測定精度が向上される。また、このような測定方法を、例えば、赤血球中の H b A 1 cの測定に適用すれば、従来よりも測定精度が高い測定を実現でき、この結果、 H b A 1 cの糖尿病診断等の指標物質としての重要性がさらに向上する。

Claims

請求の範囲

1. テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを含む水性溶媒中における N -（カルホ'、キシメチルァミノカルホニル） -4, 4， -ビス (シ'、メチルァミノ）シ'、フエ::ルァミンナトリウムの誤発色を防止する方法であって、界面活性剤を前記水性溶媒に共存させた状態で、テトラゾリゥム化合物、アジ化ナトリウムおよび N- (カルホ"キシメチルァミノカルホ'ニル） - 4, 4， -ビス（シ"唐ミノ）シ'フエニルァミンナトリウムを前記水性溶媒中で混合し、かつ、前記 N- (カルホ"キシチルァミノカルホ、、二ル）- 4,4' -ビス（シ'メチルァミノ）シ'、フエニルァミンナトリウム 1 mo 1に対するテトラゾリゥム化合物の割合を 0. 0 1〜： L mmo 1の範囲、アジ化ナトリウムの割合を 0. 003〜0.

5 mm o 1の範囲および前記界面活性剤の割合を 0. 0 0 6~0. 4m mo 1の範囲とし、前記テトラゾリゥム化合物、アジ化ナトリウム、 N -

(カルホ'、キシメチルァミノカルホ二ル）- 4, 4， -ビス（シ"メチルァミノ）シ"フエニル 7ミンナトリウムおよび界面活性剤を混合した水性溶媒の pHを 6〜9とする方法。

2. N- (カルホ"キシメチルァミノカルホ'ニル） - 4， 4， -ビス（シ'メチルァミノ）シ'、フエニルァミンナトリウム 1 tmo 1に対するテトラゾリゥム化合物の割合を 0. 0 2〜0. 8 m mo 1の範囲、アジ化ナトリウムの割合を 0. 003〜0. 5mmo 1 の範囲および前記界面活性剤の割合を 0. 0 1〜0. 4mmo lの範囲とする請求の範囲 1記載の方法。

3. テトラゾリゥム化合物が 2- (4 -ョ-ドフエ二ル）- 3- (2, 4 -シ'ニトロフヱニル） -5- ( 2， 4-シ"スルフイドフ I二ル）- 2H-テトラ、ノ"リウム塩である請求の範囲 1記載の方法。

4. 前記水性溶媒に界面活性剤を添加した後に、テトラゾリゥム化合物、アジ化ナトリウムおよび N -（カルホ"キシメチルァミノカルホ二ル）- 4， 4' -ビス（シ" ァミノ）シ"フエニルァミンナトリウムを添加する請求の範囲 1記載の方法。

5 . 前記水性溶媒に、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリウムを添加した後に、界面活性剤の存在下、 N - (カルホ'、キシメチルァミノカルホ'、二ル）- 4， 4 ' 一ビス（シ"唐ミノ）シ'、フエニルァミンナトリウムを添加する請求の範囲 1記載の方法。

6 . N -（カルホ'、キシメチルァミノカルホ'、ニル） - 4, 4， -ビス（シ"贿ミハフエニルァミンナトリウム、テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリゥムを含む N- (カルホ'キシメチルァミノ力ルホ'ニル） - 4， 4 ' -ビス（シ"メチルァミノ）シ'フエニルァミンナトリウム試薬溶液であって、さらに界面活性剤を含み、かつ、前記 N- (カルホ'、キシメチルァミノカルホ'、二ル）- 4, 4 ' -ビス（シ"メチルァミノ）シ"フエニルァミンナトリウム 1 z m o l に対し、テトラゾリゥム化合物が 0 . 0 1〜： L mm o 1の範囲、アジ化ナトリウムが 0 . 0 0 3〜0 . 5 m m o 1の範囲および界面活性剤が 0 . 0 0 6〜0 . 4 mm o lの範囲で含まれており、 p Hが 6〜 9の範囲である試薬溶液。

7 . テトラゾリゥム化合物が、 2_ (4-ョ-ドフ 1ニル）- 3- (2，4- ：:トロフエ::ル） - 5 -（2, 4-シ'、スルフイドフエニル） -2H- Ϊトラ、尸リウム塩である請求の範囲 6記載の試薬溶液。

8 . テトラゾリゥム化合物およびアジ化ナトリウムの存在下、試料中の測定対象物由来の酸化物質と発色基質である N- (カルホ'キシメチルァミノカルホ"；：ル ) -4, 4 ' -ビス ( 唐ミノ）シ'、フエニルァミンナトリウムとを酸化還元酵素により反応させ、前記発色基質の発色量を測定することにより、前記酸化物質の量を測定する方法であって、界面活性剤の存在下、テトラゾリゥム化合物、アジ化ナトリウムおよび発色基質を水性溶媒中で混合し、かつ、前記発色基質 N- (カルホ"キシメチルァミノカルホ'ニル） - 4, 4 ' 一ビス（シ"層ミノ）シ。フエ::ルァミンナトリウム 1 ^mo 1に対するテトラゾリゥム化合物の割合を 0. 0 l〜 lmmo 1 の範囲、アジ化ナトリウムの割合を 0. 0 0 3〜0. 5mmo lの範囲および界面活性剤の割合を 0. 0 0 6〜0. 4mmo lの範囲とし、前記混合液の pHを 6〜9とする測定方法。

9. 前記水性溶媒が、測定対象物を含む試料溶液である請求項 8記載の測定方法。

1 0. 前記試料溶液に、テトラゾリゥム化およびアジ化ナトリウムを添加した後、界面活性剤の存在下、さらに N -（カルホ'キシメチルァミノカルホル）- 4,4

' -ビス（メチルァミノ）シ '、フエニルァミンナトリウムおよび酸化還元酵素を添加して、前記酸化還元酵素による反応を行う請求の範囲 9記載の測定方法

1 1. 前記酸化還元酵素による反応に先立って、前記測定対象物をプ口テアーゼ処理する請求の範囲 1 0記載の測定方法。

1 2. 前記測定対象物のプロテアーゼ分解物に、前記酸化還元酵素を作用させる請求の範囲 1 1記載の測定方法。

1 3. 前記酸化還元酵素が、フルクトシルアミノ酸ォキシダ一ゼである請求の範囲 8記載の測定方法。

14. 測定対象物由来の酸化物質が過酸化水素である請求の範囲 8記載の測定方法。

1 5. 測定対象物が糖化タンパク質である請求の範囲 8記載の測定方法。

1 6 . 測定対象物が、糖化ヘモグロビンである請求の範囲 1 5記載の測定方法。

1 7 . テトラゾリゥム化合物が 2- (4-ョ-ト "フ 1ニル）- 3- (2, 4-シ'ニトロフエニル） - 5- (2, 4-シ'、スルフイドフエ二ル）- 2H-テトラ、ノ'、リウム塩である請求の範囲 8記載の測定方法。