WO2003096002A1

WO2003096002A1 - Instrument et procede de mesure du signal d'action d'un echantillon biologique

Info

Publication number: WO2003096002A1
Application number: PCT/JP2003/005735
Authority: WO
Inventors: Hiroaki Oka; Nobuhiko Ozaki; Hirokazu Sugihara
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
Priority date: 2002-05-13
Filing date: 2003-05-08
Publication date: 2003-11-20
Also published as: JPWO2003096002A1; US7594984B2; CN1633595A; CN100370247C; US20040106139A1; US7172860B2; US20070134651A1; JP3624292B2; AU2003234787A1

Description

明細書生体試料の活動信号計測装置および計測方法技術分野

本発明は、細胞などの生体試料が発する活動信号を計測する装置および方法に関する。背景技術

従来、生体試料の活動に伴い発せられる物理化学的信号は、電気的信号や、生体試料に取り込まれた指示薬により発せられる蛍光強度信号などのデジタル信号として、測定装置に取り込まれて測定される。例えば、細胞のチャンネル活性度は、単一チャンネルレベルで測定する場合、パッチクランプなどの微小電極プローブと専用の制御装置とを用いた電気生理測定装置によって得られるチャンネル通過電気量を表すデジタル信号から、チャンネルの開閉時間、タイミング、回数などを算出することにより測定される。

パッチクランプ法は、マイクロピぺットの先端部分につけた細胞膜の微小部分 (パッチ）を用いて、単一のチャネルタンパク質分子を介するイオンの輸送を微小電極プローブによって電気的に記録する方法である。パッチクランプ法は、細胞生物学の技術の中で、 1個のタンパク質分子の機能をリアルタイムで調べることのできる数少ない方法の 1つである（例えば、細胞の分子生物学、第 3版、 G a r 1 and Pub l i s h i ng, I nc > New Yo rk、 1994、日本語版、中村桂子ら監訳、 181〜 182頁、 1995年、教育社を参照）。蛍光色素法は、特定のイオンの濃度変化に応じて光を発する発光指示薬または蛍光色素と画像処理法とを組み合わせることにより、細胞の電気的活動を測定する方法である。例えば、 CCDカメラを用いて撮影した細胞の蛍光画像に基づいて、細胞内のイオンの移動をモニタする。蛍光色素法では、細胞全体のイオンチヤンネル活性は、一般に、細胞内に流入するイオンの全体量を蛍光測定法によつて測定する。ところが、パッチクランプ法は、マイクロピペットの作製およびその操作などに特殊な技術を必要とし、 1つの試料の測定に多くの時間を要するため、大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングするのには適していない。また、蛍光色素法は、大量の薬品候補化合物を高速でスクリーニングできるが、細胞を染色する工程が必要であり、測定において、色素の影響によるバックグラウンドが高い上に、時間とともに脱色するため S ZN比が悪いという欠点がある。

生体試料の電気化学的変ィ匕を観察する方法を開示する従来文献として、特許第

2 9 4 9 8 4 5号、米国特許第 5 8 1 0 7 2 5号、米国特許第 5 5 6 3 0 6 7号、特開平 9一 8 2 7 3 1 8号、国際公開第 0 1 / 2 5 7 6 9号、米国特許第 5 1 8 7 0 6 9号、国際公開第 9 8 / 5 4 2 9 4号、国際公開第 9 9ノ 6 6 3 2 9号、国際公開第 9 9 / 3 1 5 0 3号などが挙げられる。

特許第 2 9 4 9 8 4 5号、米国特許第 5 8 1 0 7 2 5号、米国特許第 5 5 6 3 0 6 7号、および特開平 9— 8 2 7 3 1 8号は、ガラス基板上にフォトリソダラフ技術を用いて微小電極を構成し、細胞の電気的変化を多点で細胞外測定できることを特徴とする一体化複合電極とそれを用いた計測システムを開示する。国際公開第 0 1 / 2 5 7 6 9号は、絶縁基板上に貫通孔を備え、この貫通孔にイオンチヤンネルを含む細胞などの生体試料を配置することによって、細胞などおよび絶縁基板表面上にギガシ一ルドを構成し、このギガシールドにより隔てられた 2つの領域に設置された基準電極および測定電極を用いて、イオンチャネルをイオンが通過するときに発生する電流を測定できる基板を開示する。

米国特許第 5 1 8 7 0 6 9号は、電極上で細胞を培養し、インピーダンス変化を測定することにより、細胞の増殖をモニタできるデバイスを開示する。

国際公開第 9 8 / 5 4 2 9 4号は、平板電極上に細胞を接着させ、その電気的信号を測定するデバイスを,示する。

国際公開第 9 9/ 6 6 3 2 9号は、多孔性の材料上にある細胞の活動状態を、抵抗またはインピーダンス変化により観察するデバイス、およびそれを用いたァッセィ法を開示する。国際公開第 9 9 / 3 1 5 0 3号は、貫通孔を備えた基板を用い、この貫通孔に細胞をトラップすることによりパツチクランプを形成し、電流変化を測定する方法を開示する。

その他、本出願に関する先行例として、特開平 1 1— 3 2 6 1 6 6号公報、特開平 5— 1 5 7 7 2 8号公報、および特開昭 6 2 - 7 3 1 5 2号公報を挙げることができる。発明の開示

本発明は、生体試料が発する活動信号を容易、迅速且つ高精度に検出することができる生体試料の活動信号計測装置および計測方法の提供を目的とする。

本発明の前記目的は、生体試料の活動信号を計測する装置であって、生体試料を含む被測定液を収容する測定チャンバと、少なくとも一方面に測定電極を備える多孔性絶縁基板と、前記測定チャンバ内の被測定液を搬送して、前記測定電極側から前記多孔性絶縁基板を通過させる搬送装置とを備え、前記搬送装置を作動させて、被測定液に含まれる生体試料を前記測定電極において捕捉することにより、該測定電極を介して生体試料の活動信号を計測することができる生体試料の活動信号計測装置により達成される。

また、本発明の前記目的は、生体試料の活動信号を計測する方法であって、生体試料を含む被測定液を測定チヤンバに注入するステツプと、前記測定チヤンバから被測定液を搬送して、少なくとも一方面に測定電極を備える多孔性絶縁基板を通過させることにより、前記測定電極において生体試料を捕捉するステツプと、前記測定電極を介して生体試料の活動信号を計測するステップとを備える生体試料の活動信号計測方法により達成される。図面の簡単な説明

第 1図は、本発明の第 1の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の要部概略構成図である。

第 2図は、第 1図に示す装置の要部拡大図である。

第 3図（A) および（B) は、生体試料（細胞）の活動状況を示す模式図である。

第 4図は、本発明の第 2の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略平面図である。

第 5図は、第 4図に示す装置の細胞隔離部の（A) 平面図および（B) 断面図である。

第 6図は、第 4図に示す装置の多孔性絶縁基板の（A) 平面図および（B) 断面図である。

第 7図は、第 4図に示す装置の一部断面図である。

第 8図は、第 4図に示す装置の他の一部断面図である。

第 9図（A) および（B) は、本発明の第 3の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略構成を示すプロック図である。

第 10図は、 Ca rbacho 1濃度に対する標準偏差の平均値の変動を示す図である。

第 11図（A) および（B) は、本発明の第 4の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略構成を示すプロック図である。

第 12図は、 Ca rbacho lを投与する前後における標準偏差のばらつきを正規分布で近似した結果を示す図である。

第 13図は、従来の方法により求めた C a rbacho 1を投与する前後における標準偏差のばらつきを正規分布で近似した結果を示す図である。

第 14図は、得られた正規分布の平均値および半値幅をそれぞれ基準値と比較したときの隔たり量を示す図である。

第 15図は、本発明の他の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略構成を示すブロック図である。

第 16図は、本発明の更に他の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略構成を示すブロック図である。発明を実施するための最良の形態

以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。

(実施の形態 1) 図 1は、本発明の第 1の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の要部概略構成図である。この装置は、多孔性絶縁基板 5の上面（生体試料を配置する側の面）に、細胞などの生体試料の物理化学的信号を検出する測定電極 1を形成し、この測定電極 1から導電線 2が導出されるように構成されている。物理化学的信号とは、細胞などの生体試料が発する信号のうち、細胞のイオンチャンネルのような測定対象の特定部位から発生する信号、または、薬剤に応答する細胞のィォンチヤンネルや受容体の活性化のような測定対象における特定の事象に起因して変化する信号などである。

多孔性絶縁基板 5として、本実施形態においてはナイロンメッシュを用いるが、これに限定されず、セルロース混合エステル >親水性ポリビニリデンジフロラィド、疎水性ポリビニリデンジフ口ライド、ポリテトラフルォロエチレン、ポリカーポネ一卜、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフ夕レートなどを用いてもよい。具体的には、ァイソポア（ポリエチレンテレフタレート製：ミリポア社製）ゃォムニポア（ポリテトラルフルォロエチレン製：ミリポア社製）などを好ましく用いることができる。また、多孔性絶縁基板 5のサイズとして、通常、 1〜： L O O O mの孔径および 1〜： L 0 0 0 0 mの厚さを有するものが選択される。代表的な例として、 5 の孔径および 1 0 mの厚さを挙げることができるが、 1 0 0 m以上の厚さの多孔性絶縁基板も好適に用いることができる。

この計測装置は、以下のようにして製造される。まず、多孔性絶縁基板 5に測定電極 1および導電線 2を形成する。測定電極 1および導電線 2の形成は、導電性材料のスパッ夕により行うことが好ましい。本実施形態においては、導電性材料として金を用い、アルゴンなどの不活性ガスの存在下、低真空条件にある一対の電極間に高周波によるプラズマを発生させ、陰極上の金をイオンエネルギーではじき飛ばし、対向する陽極上にある多孔性絶縁基板上に形成する。電極および導電線の形成は、スパッ夕法以外に、真空蒸着法や印刷法などにより形成することも可能である。また、導電性材料として金を使用する代わりに、白金、銅、銀、銀および塩化銀、白金および白金黒などから選択してもよい。また、金属材料以外に、導電性プラスチックからなる導電性材料を用いることもできる。測定電極 1のスパッ夕時には、マスクを用いず、多孔性絶縁基板 5の深部に電極材料が侵入するように形成するのが好ましい。一方、導電線 2は、あらかじめ多孔性絶縁基板 5をマスク（図示せず）で覆ってパターニングし、多孔性絶縁基板 5の深部への導電性材料の侵入を抑制することが好ましい。

形成された測定電極 1の形状は、本実施形態においては円板状であるが、測定対象に応じて任意の形状とすることができる。また、測定電極 1のサイズについても特に制限はないが、本実施形態においては、後述する測定チャンバ Aの水平断面積と略同じ大きさの水平断面積を有する。

こうして、測定電極 1および導電線 2を多孔性絶縁基板 5に形成した後、この多孔性絶縁基板 5を細胞隔離部 3と支持基板 6との間に挟持する。細胞隔離部 3 及び支持基板 6はそれぞれ開口を有しており、細胞隔離部 3の開口、多孔性絶縁基板 5の測定電極 1および支持基板 6の開口の各中心が略一致するように配置する。これにより、細胞隔離部 3の開口壁および多孔性絶縁基板 5によって画定される測定チヤンバ A (図 1における細胞隔離部 3に形成された開口部の空間全体に相当）が形成される。細胞隔離部 3と支持基板 6とは、開口周縁に介在させた接着剤からなる接着層 4により固定される。この接着層 4は、易剥離性および止水性を有することが好ましく、例えば、一液型 R TVゴム（脱酢酸タイプ） KE 4 2 T (信越化学工業株式会社）を挙げることができる。

測定チャンバ Aの側壁には基準電極 7が設けられており、基準電極 7は、測定チャンバ Aに収容した被測定液 2 3に浸漬される。基準電極 7は、測定対象となる生体試料の活動信号を検出するための基準電位を与えるものであり、例えば、 A g— A g C lからなる。また、被測定液 2 3として、 DME M培養液を例示することができ、培養する細胞として、動物由来細胞を例示することができる。測定チヤンバ Aの上部は蓋体 2 1によつて覆われており、これによつて被測定液 2 3の蒸発を防止することができる。尚、蓋体 2 1は、被測定液 2 3の種類や測定条件などによっては必ずしも必要でなぐ蓋体 2 1を設けない構成にすることもできる。

次に、支持基板 6の下面側に、接着層 9を介して吸引ラインアタッチメント 8 を固定する。吸引ラインアタッチメント 8は、下方から上方に向けてテーパ状に拡がる吸引部 8 aと、この吸引部 8 aに接続される吸引ライン 8 bとを有しており、吸引部 8 aが支持基板 .6の開口と略一致するように、位置合わせが行われる。こうして、多孔性絶縁基板 5、支持基板 6の開口壁および吸弓 I部 8 aの内壁によつて画定される吸引チャンバ Bが形成される。この吸引ラインアタッチメント 8 は、被測定液 2 3を吸引して搬送するための搬送装置として機能し、吸引ライン 8 bに吸引ポンプ（図示せず）に接続される。このようにして、生体試料の活動信号計測装置を構成することができる。

次に、この装置を用いた生体試料の活動信号計測方法を説明する。まず、測定チャンバ Aに細胞培養液などの被測定液 2 3を注入する。測定チャンバ Aに供給される被測定液 2 3の量は、例えば、 5 0マイクロリツトルである。

吸引部 8 aに吸引力を作用させない状態では、多孔性絶縁基板 5を介して吸引チャンパ Bに落下する被測定液 2 3の量はごく僅かであり、通常は測定チャンパ Aにおける被測定液 2 3の量の 1 5 0以下である。

次に、吸引ポンプ（図示せず）を作動させて、測定チャンバ Aの被測定液 2 3 を吸引する。これにより、吸引チャンバ Bは減圧されるので、被測定液 2 3は多？し性絶縁基板 5を通過し、吸引チャンバ Bを介して吸引ライン 8 bを矢示の方向に流れる。一方、被測定液 2 3に含まれる細胞などの生体試料 2 5は多孔性絶縁基板 5を通過することができず、図 2に示すように、測定電極 1に吸着される。この生体試料 2 5が発する活動信号は、測定電極 1と基準電極 7との間に生じる電位差として検出することができる。例えば、生体試料 2 5が細胞である場合、図 3 (A) に示すように、静止状態の細胞は、イオンチャンネルの開閉が平衡状態にあり、チャンネル毎のコンダクタンスの変化が小さいため、発生電圧変化が小さく、細胞膜近傍電位の振幅が略均一となる。これに対し、図 3 (B) に示すように、活動状態の細胞は、イオンチャンネルの開閉が非平衡状態にあり、チヤンネル毎のコンダクタンスの変化が大きいため、発生電圧変化が大きく、細胞膜近傍電位の振幅が不均一となる。したがって、検出される電位差の時系列変化に基づいて、細胞の活動状態を ffiiiすることができる。

測定終了後は、吸引ポンプ（図示せず）を作動させながら測定チャンバ Aに生理食塩水などの洗浄液を供給することにより装置内部を洗浄し、必要に応じて多孔性絶縁基板 5を取り替えた後、次の被測定液 2 3を測定チャンバ Aに注入する。こうして、例えぱ¾品候補となる化合物を含む各種溶液に対して、生体試料の活動信号の測定を順次行うことができる。

このように、本実施形態の計測方法によれば、被測定液 2 3を測定チャンバ A に供給し吸引ラインアタッチメント 8を介して吸引するだけで、生体試料 2 5を測定電極 1に密着させることができ、接触抵抗を増大させて、信号検出感度を上げることができる。更に、被測定液 2 3の入れ換えや洗浄も、吸引ラインァタツチメント 8により短時間で行うことができる。この結果、生体試料の活動信号を容易、迅速且つ高精度に検出することができる。

(実施の形態 2 )

図 4は、本発明の第 2の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略平面図である。この装置は、図 1に示す第 1の実施形態の装置における測定電極 1 をマトリクス状に 1 6個配置したものであり、本実施形態においては各測定電極 1の直径を 2 mmとし、隣接する測定電極 1の間隔を l mmとしている。測定電極 1の数、配置、大きさ、形状などは、本実施形態のものに限定されないが、好ましい一例を挙げると、測定電極1の面積は1 111²〜1 0

形状はほぼ円または矩形、隣接する測定電極 1の間隔は 1 0〜： L 0 0 0 0 mで、配置はマトリクス状である。本実施形態において、上記第 1の実施形態と同様の構成部分に同一の符号を付して、詳細な説明を省略する。

図 4において、測定電極 1およびこれに接続される導電線 2は、多孔性絶縁基板 5の表面側に配置されている。多孔性絶縁基板 5の表面における複数の導電線 2の間に熱またはレーザを作用させることにより、多孔性構造を破壊して絶縁性をより高めるようにしてもよい。また、基準電極 7及びこれに接続される導電線 1 2は、各測定電極 1に対応させて、細胞隔離部 3の開口内壁および上面にそれぞれ設けられている。細胞隔離部 3は、通常は透明な材質からなる。

図 5は、細胞隔離部 3の（A) 平面図および（B) 断面図であり、図 6は、多孔性絶縁基板 5の（A) 平面図および（B) 断面図である。図 5に示すように、測定チャンバ Aは、複数の測定電極（図示せず）がそれぞれ配置される細胞隔離部 3の各開口部に形成される。図 6 (B) に示すように、測定電極 1は、導電性材料をマスクなしでスパッ夕することにより、多孔性絶縁基板 5の内部まで含浸させて形成される一方、導電線 2は、多孔性絶縁基板 5の上面に形成したマスク層 1 0を介してスパッ夕することにより、多孔性絶縁基板 5の内部への侵入を抑制して形成される。図 7および図 8は、図 4に示す装置の部分断面図であり、図 7は、領域 Cを拡大して示し、図 8は、領域 Dを拡大して示している。被測定液 2 3に含まれる細胞などの生体試料 2 5は、第 1の実施形態と同様に、吸引ラインアタッチメント（図示せず）によって吸引されることにより、測定電極 1に吸着される。吸引ラインアタッチメントの吸引部（図 1の符号 8 aに相当）は、各測定電極 1に対応して複数設けられており、共通の吸引ライン（図 1の符号 8 b に相当）を介して、各測定電極 1に生体試料 2 5を同時に吸着させることができる。これにより、各種条件下における生体試料の活動信号の計測を短時間で行うことができる。各測定電極 1への生体試料 2 5の吸着は、共通の吸引ラインを設ける代わりに測定電極 1毎に個別に吸引ラインを設けることにより、それぞれ異なるタイミングにすることもできる。

(実施の形態 3 )

図 9は、本発明の第 3の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略構成を示すブロック図である。この装置は、上記第 1の実施形態における装置を測定部（信号源） 1 0 1とし、この測定部 1 0 1において検出される電気信号を処理する機能を有するものであり、図 9 (A) に示すように、単位標準偏差計算部 1 0 2、平均値計算部 1 0 5、活性度評価部 1 2 0およびデータ表示部 1 1 0を備えている。単位標準偏差計算部 1 0 2は、測定部 1 0 1において検出された時系列データに基づき、所定のサンプル数を一単位として標準偏差を算出する。所定サンプル数を含む各単位は、時間的に連続してもよく、或いは一定の時間間隔をおいてもよい。平均値計算部 1 0 5は、得られた複数の標準偏差の平均値を算出する。活性度評価部 1 2 0は、標準偏差の平均値に基づいて、生体試料の活性度を評価する。活性度評価部 1 2 0は、活性度計算部 1 0 8および活性度分類部 1 0 9を備えており、計測の目的に応じて、入力された情報に基づいて活性度を計算したり、予め格納された情報と比較して活性度を分類することができる。デ一夕表示部 1 1 0は、得られた活性度を画面表示する。この装置によれば、一定のサンプリング速度で取り込まれたデジタル信号（所定の時系列データ）からノィズを除去して、例えばイオンチャンネルの開閉を表す有意信号を抽出、測定および分類することができる。

図 9 (B) に示すように、単位標準偏差計算部 102、平均値計算部 105および活性度評価部 108は、これらの計算を実行するためのプログラムが記録されたハ一ドディスクを内蔵するコンピュータにより構成することができ、データ表示部 110は、 CRTにより構成することができる。尚、図 9 (B) に示すように、コンピュータは、正規分布近似部 103、刺激発生部 104および平均値 · 半値幅計算部 106を更に備えており、これらについては後述する。

上記構成を有する本実施形態の装置を用いて、モノアラガイより調製した神経細胞を材料に、化学物質 C a rbacho 1の神経細胞に対する作用を測定した。 Ca r bacho lは、神経伝達物質であるァセチルコリンのアナログであることが知られる化学物質である。 Ca r bacho l (S i gma社製）を人工脳一脊髄液に溶解し、 0, 0. 1， 0. 3， 1, 3， 10， 30，および 100 Mの濃度で神経細胞に作用させたときの細胞が発する電気信号をそれぞれ測定した。そして、各 Ca rbacho l濃度について、測定部 101から得た 10秒間の時系列データから 100ミリ秒ごとの時系列データをサンプリングし、標準偏差を計算した。得られた標準偏差の平均値をプロットした結果を図 10に示す。標準偏差の平均値は、細胞膜近傍電位の揺らぎを表しており、この値によってイオンチヤンネルの活性度を評価することができる。図 10に示すように、 C a r bacho 1濃度が大きくなるにつれて標準偏差の平均値も大きくなるが、 1 0 をピークに標準偏差の平均値は小さくなる。このように、本実施形態に係る計測方法および装置により、モノアラガイの神経細胞におけるイオンチャネルの活性が、 Ca rbacho l濃度に依存することを確認することができた。更に、本実験結果に基づいて、神経細胞の全チャネル活性度を類推することが可能である。

(実施の形態 4)

図 11は、本発明の第 4の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置の概略構成を示すブロック図である。この装置は、図 11 (B) に示すように、上記第 3の実施形態と同様の構成（図 9 (B)参照）を備えている。そして、図 9 (A) における平均値計算部 105を使用しない一方、正規分布近似部 103および平均値 ·半値幅計算部 106を使用することにより、図 11 ( A) に示すように構成される。

正規分布近似部 103は、単位標準偏差計算部 102で得られた複数の標準偏差を、所定幅ごとに設定された複数の階級に分類する。そして、この階級を X軸とし、各階級に分類された標準偏差の数を Y軸にプロットして、得られたグラフを正規分布に近似する。正規分布に近似する方法としては、指数減少、指数増加、ガウス、ローレンツ、シグマ、多重ピーク、非線形などの各種曲線近似解析を挙げることができる。平均値 ·半値幅計算部 106は、得られた正規分布の平均値および半値幅（ピーク高さの半分となる幅）を計算する。

上記構成を有する本実施形態の装置を用いて、モノアラガイより調製した神経細胞を材料に、化学物質 C a rbacho 1の神経細胞に対する作用を測定した。具体的には、モノアラガイの神経細胞に対し 50 M濃度の C a rbacho 1 を投与する前後における測定部 101の検出信号に基づいて、正規分布近似部 1 03が標準偏差の頻度分布を作成した。

図 12は、 Ca r b ac ho 1を投与する前後 10秒間の検出信号からなる時系列データに基づき、 5ミリ秒毎に計算して得た標準偏差によりヒストグラムを作成して正規分布に近似した結果であり、左側のグラフが投与前の状態を示し、右側のグラフが投与後の状態を示している。図 12に示すように、 C a r b a c ho 1の投与により、標準偏差の平均値および半値幅が大きくなつていることがわかる。平均値 ·半値幅計算部 106による算出結果は、投与前の平均値および半値幅が 0. 478および 0. 109であるのに対し、投与後の平均値および半値幅が 0. 703および 0. 175であった。この結果は、 Ca rbacho l を投与することによって、モノアラガイ神経細胞のイオンチャンネルが活性化され、その活性化されたチャンネルの開閉による活動電位の変動を表していると考えられる。

上記実験と同様の条件で、従来の細胞内記録法により投与前後を比較した結果を図 13に示す。本実施形態に係る計測方法は、細胞外記録法によるものであるが、図 1 2と図 1 3とを比較すると、細胞内記録法の場合と同様の結果が得られていることがわかる。このように、本発明の計測方法によれば、従来の細胞内記録法を用いることなぐイオンチャンネルの開閉に伴う細胞活動、およびその変化を容易に測定することができる。したがって、例えば、生体試料と測定用デバイスとの間に高抵抗のシールド（ギガシ一ルド）を形成しなくても生体試料の電気的変化を計測することができ、.生体試料を傷つけるおそれがない。

また、本発明により、細胞への薬物投与の前後またはその投与量に対するィォンチヤンネル活性度の絶対値やチヤンネル活性度の増減を比較することができ、例えば以下に示すように、薬物の作用効果の定性的または定量的な分類を行うことができる。

(実施の形態 5 )

平滑筋細胞の C aイオンチャンネルの活性は、ノルェピネフィリン 1 0 iM剌激時において、二フエジピンにより濃度依存的に阻害されることが、細胞内記録法などによって確認されている。本実施形態においては、上記第 4の実施形態に係る生体試料の活動信号計測装置を用いて薬剤を評価する方法を説明する。

図 1 4は、測定部 1 0 1の検出信号から標準偏差の正規分布グラフを作成し、この正規分布の平均値および半値幅をそれぞれ基準値と比較したときの隔たり量を、相対的移動値および相対的広がりとして表した結果である。二フエジピンにの相対的移動値および相対的広がりを、種々の濃度 ( 0 . I M I O O M) をパラメ一夕として予めデータベースに格納しておき、 2種類の C aチャンネル阻害薬 Aおよび Bについて作用効果の分類を行った。

図 1 4に示すように、化合物 A (△) は、各濃度に対する相対的移動値および相対的広がりの挙動が二フエジピン（〇）とほぼ同様であり、二フエジピンと同様の C aイオンチャンネル阻害剤であると推定される。これに対し、化合物 B (口）は、濃度が変化しても相対的移動値および相対的広がりがほとんど変化せず、二フエジピン（〇）とは挙動が大きく異なっているので、平滑筋細胞には存在しないタイプの C aイオンチャンネル阻害剤である可能性が高いと考えられる。このようにして、種々の薬物についての作用効果を推定することができる。更に、図 1 4に示す相対的移動値および相対的広がりに基づいて、基準値からの隔たり量が所定値の範囲内（例えば、図に破線で示す ± 5 %の円内）に存在するか否かを判断することにより、薬品スクリ一二ングを効率よく行うことができる。

(その他の実施形態）

以上、本発明の各実施形態について説明したが、本発明の具体的な態様は上記実施形態に限定されない。例えば、上記第 4および第 5の実施形態においては、検出信号に基づき得られた正規分布の平均値および半値幅をそれぞれ基準値と比較したときの隔たり量を用いて評価を行っているが、得られた正規分布の標準偏差（または分散）に基づくパラメータを適宜用いて、活性度を評価してもよい。また、図 1 1 (A) に示す第 4および第 5の実施形態の構成においてサンプル振り分け部 1 1 1を更に備えることにより、図 1 5に示す構成にしてもよい。サンプル振り分け部 1 1 1は、細胞膜上に複数種類存在する各イオンチャンネルごとの特徴を解析する時に、非常に有効な手段である。

また、図 1 1 (A) に示す第 4および第 5の実施形態の構成においては、測定部（信号源） 1 0 1を 1つのみ用いているが、第 2の実施形態に示すように複数の測定電極 1 0 1を備える場合には、図 1 6に示すように構成することができる。この計測装置において、信号加算部 1 0 7は、選択した 1または複数の測定部（信号源） 1 0 1において発生した活動信号を加算する。各信号源 1 0 1に対しては、刺激発生部 1 0 4から剌激信号を付与することにより各生体試料を同時に刺激することができ、これによつて加算する複数の活動信号のタイミングを一致させることができる。

また、上記各実施形態においては、吸引ラインアタッチメントを設けて被測定液を吸引することにより、被測定液が多孔性絶縁基板を通過するように構成しているが、被測定液の搬送手段として吸引ラインアタッチメントの代わりに加圧装置を設けて測定チヤンバを加圧することにより、被測定液が多孔性絶縁基板を通過するように構成することもできる。

また、上記第 3の実施形態において、平均値計算部は、単位標準偏差計算部により算出された複数の標準偏差に基づいて平均値を算出するようにしているが、更に、この複数の標準偏差を時系列に沿って一定数ごとにグループ分けを行い、各グループ毎に平均値を算出するようにしてもよい。各グループの平均値が時系列に沿って増加する場合、この平均値が所定値以上となった時刻、および/または、平均値の増加率が所定値以下となった時刻を特定して、データ表示部に表示させるようにしてもよい。これにより、化学物質が細胞活動に影響を与えるまでのタイムラグの目安を得ることができる。産業上の利用可能性

以上のように、本発明によれば、生体試料が発する活動信号を容易、迅速且つ高精度に検出することができる生体試料の活動信号計測装置および計測方法を提供することができる。

本発明は、例えば、高速薬品スクリーニングや、細胞診断（例えば、がん細胞と正常細胞との識別）などに適用可能であり、手術などの際にオンサイトで実施することができる。

Claims

請求の範囲

1 . 生体試料を含む被測定液を測定チヤンバに注入するステツプと、

前記測定チャンバから被測定液を搬送して、少なくとも一方面に測定電極を備える多孔性絶縁基板を通過させることにより、前記測定電極に生体試料を捕捉させるステップと、

前記測定電極を介して生体試料の活動信号を計測するステップとを備える生体試料の活動信号計測方法。

2 . 前記測定電極に生体試料を捕捉させるステップは、被測定液を吸引して前記多孔性絶縁基板を通過させるステップを備える請求の範囲第 1項に記載の生体試料の活動信号計測方法。

3 . 前記測定電極に生体試料を捕捉させるステップは、前記測定チャンバに収容された被測定液を全て搬送して排出するステツプを含み、

前記活動信号を計測するステツプの後、新たな生体試料を含む被測定液を測定チヤンバに注入するステップを更に備え、

前記測定チヤンバから被測定液を再び搬送することにより、生体試料の活動信号の計測を繰り返す請求の範囲第 1項に記載の生体試料の活動信号計測方法。

4. 前記測定電極に生体試料を捕捉させるステップは、前記測定チャンバに収容された被測定液を全て吸引して前記多孔性絶縁基板を通過させるステツプを備える請求の範囲第 3項に記載の生体試料の活動信号計測方法。

5 . 前記活動信号を計測するステップの後、新たな生体試料を含む被測定液を測定チヤンバに注入するステップの前に、前記多孔性絶縁基板を取り替えるステツプを更に備える請求の範囲第 3項に記載の生体試料の活動信号計測方法。

6 . 前記多孔性絶縁基板は、？し径が 1〜1 0 0 0 ΠΙで、厚さが 1〜： L 0 0 0 0 mの樹脂フィルムからなる請求の範囲第 1項に記載の生体試料の活動信号計測方法。

7 . 前記多孔性絶縁基板は、一方面にマスク層を介して形成され且つ前記測定電極に電気的に接続された導電線を更に備え、

前記測定電極は、前記導電線よりも前記多孔性絶縁基板の深部まで侵入して形成されている請求の範囲第 1項に記載の生体試料の活動信号計測方法。

8. 前記測定電極及び導電線は、前記多孔性絶縁基板の表面に導電性材料をスパッ夕リングすることにより形成されている請求の範囲第 7項に記載の生体試料の活動信号計測方法。

9. 前記被測定液を測定チャンバに注入するステップは、同一または異なる被測定液を複数の測定チャンバにそれぞれ注入するステップを備え、

前記測定電極に生体試料を捕捉させるステツプは、前記各測定チヤンバと連通する共通の吸引ラインを介して前記各測定チヤンバに収容された被測定液を吸引し、前記各測定チヤンバに対応してそれぞれ設けられた複数の測定電極を少なくとも一方面に備える多孔性絶縁基板を通過させることにより、同一または異なる生体試料を前記各測定電極に同時に捕捉させるステップを備える請求の範囲第 1 項に記載の生体試料の活動信号計測方法。

1 0 . 前記測定電極を介して出力される活動信号の時系列データに基づき、所定のサンプル数毎に標準偏差を算出するステップと、

得られた複数の標準偏差の平均値を算出するステップと、

得られた標準偏差の平均値に基づいて、生体試料の活性度を評価するステップと、

活性度の評価結果を表示するステップとを備える請求の範囲第 1項に記載の生体試料の活動信号計測方法。

1 1 . 前記測定電極を介して出力される活動信号の時系列データに基づき、所定のサンプル数毎に標準偏差を算出するステツプと、

得られた複数の標準偏差を所定幅ごとに設定された複数の階級に分類し、この分類結果を正規分布に近似するステツプと、

得られた正規分布に基づいて生体試料の活性度を評価するステツプと、活性度の評価結果を表示するステップとを備える請求の範囲第 1項に記載の生体試料の活動信号計測方法。

1 2. 前記活性度を評価するステップは、得られた正規分布の平均値および半値幅を算出するステツプと、得られた正規分布の平均値および半値幅に基づいて活性度を評価するステップとを含む請求の範囲第 1 1項に記載の生体試料の活動信号計測方法。

1 3. 生体試料を含む被測定液を収容する測定チャンバと、少なくとも一方面に測定電極を備える多孔性絶縁基板と、

前記測定チヤンバ内の被測定液を搬送して、前記測定電極側から前記多孔性絶縁基板を通過させる搬送装置とを備え、

前記搬送装置を作動させて、被測定液に含まれる生体試料を前記測定電極において捕捉することにより、該測定電極を介して生体試料の活動信号を計測することができる生体試料の活動信号計測装置。

1 4. 前記測定チャンバ内に設けられた基準電極を更に備える請求の範囲第 1 3 項に記載の生体試料の活動信号計測装置。

1 5 . 前記搬送装置は、被測定液を吸引して前記多孔性絶縁基板を通過させる吸引装置を備える請求の範囲第 1 3項に記載の生体試料の活動信号計測装置。

1 6. 前記多孔性絶縁基板は、前記測定チャンバと前記吸引装置との間に着 Ml &に設けられる請求の範囲第 1 5項に記載の生体試料の活動信号計測装置。

1 7 . 前記多孔性絶縁基板は、？し径が 1〜： L O O O ^mで、厚さが 1〜： L 0 0 0 0 の樹脂フィルムからなる請求の範囲第 1 3項に記載の生体試料の活動信号

1 8. 前記測定電極に電気的に接続された導電線を更に備え、

前記導電線は、前記多孔性絶縁基板の一方面にマスク層を介して形成されており、

前記測定電極は、前記導電線よりも前記多孔性絶縁基板の深部まで侵入して形成されている請求の範囲第 1 3項に記載の生体試料の活動信号計測装置。

1 9. 前記測定電極及び導電線は、前記多孔性絶縁基板の表面に導電性材料をスパッ夕リングすることにより形成される請求の範囲第 1 8項に記載の生体試料の活動信号計測装置。

2 0. 前記測定チャンバおよび前記測定電極を複数備え、

前記搬送装置は、前記各測定チヤンバと連通する共通の吸引ラインを有しており、

前記搬送装置の作動により、前記各測定チヤンバに収容された被測定液に含まれる生体試料を、対応する前記測定電極において同時に捕捉することができる請求の範囲第 1 3項に記載の生体試料の活動信号計測装置。

2 1 . 前記測定チャンパ内にそれぞれ設けられた複数の基準電極を更に備える請求の範囲第 2 0項に記載の生体試料の活動信号計測装置。

2 2. 前記測定電極を介して出力される活動信号の時系列データに基づき、所定のサンプル数毎に標準偏差を算出する単位標準偏差計算手段と、

得られた複数の標準偏差の平均値を算出する平均値計算手段と、

得られた標準偏差の平均値に基づいて、生体試料の活性度を評価する活性度評価手段と、

活性度の評価結果を表示する表示手段とを更に備える請求の範囲第 1 3項に記載の生体試料の活動信号計測装置。

2 3. 前記測定電極を介して出力される活動信号の時系列データに基づき、所定のサンプル数毎に標準偏差を算出する単位標準偏差計算手段と、

得られた複数の標準偏差を所定幅ごとに設定された複数の階級に分類し、この分類結果を正規分布に近似する正規分布近似手段と、

得られた正規分布に基づいて生体試料の活性度を評価する活性度評価手段と、活性度の評価結果を表示する表示手段とを更に備える請求の範囲第 1 3項に記載の生体試料の活動信号計測装置。

2 . 得られた正規分布の平均値および半値幅を算出する平均値 ·半値幅計算手段を更に備え、

前記活性度評価手段は、得られた正規分布の平均値および半値幅に基づいて活性度を評価する請求の範囲第 2 3項に記載の生体試料の活動信号計測装置。