WO2003084985A1 - Peptide chimiquement modifie a l'aide de polyethyleneglycol - Google Patents

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WO2003084985A1
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PCT/JP2003/004614
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Yasushi Taguchi
Kyousuke Haze
Shinichi Kuriyama
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Mochida Pharmaceutical Co., Ltd.
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids

Definitions

  • the present invention provides a single-helix structure model based on the Edmonson-Wheel-Plot method, comprising two hydrophobic faces and two hydrophilic faces alternately arranged, and at least one of the two hydrophilic faces is positive.
  • Peptide chemically modified with polyethylene glycol hereinafter abbreviated as “PEG”
  • PEG chemically modified peptide a sequence consisting of 18 amino acids, which is a charged surface
  • the present invention also relates to a complex of a chemically modified PEG peptide and a substance that binds to the peptide, and a method for producing the same.
  • the present invention relates to a carrier modified with a PEG chemically modified peptide, and a method for producing the same.
  • the present invention also relates to a method for delivering a substance bound or included in a carrier modified with a PEG chemically modified peptide into cells.
  • RNA and their derivatives, modified and modified forms Iwayu Therapeutic methods of administering such nucleic acids into the body have been attempted. This involves increasing or decreasing the expression level of a specific gene or functional expression of a specific bioactive factor by administering the nucleic acid into the body, or producing the bioactive substance encoded by the introduced nucleic acid in the body.
  • vectors transfection agents
  • One of the representative examples of these vectors is a viral vector. It utilizes the ability of the virus to infect cells originally possessed by the virus. Examples thereof include retrovirus vectors and adenovirus vectors. Examples of applications include adenosine deaminase for gene therapy of adenosine deminase deficiency. 270, 475 (1995)) and the introduction of the p53 gene for the treatment of cancer (Swisser S. G. et al., J. Natl. Cancer Inst., Vol. 91, 763 (1999)).
  • wild-type viruses pathogenic viruses
  • there is a problem that the process for preparing the vector is extremely complicated, and it is generally difficult to industrialize the vector.
  • a liposome vector Another representative example of a vector is a liposome vector. It utilizes the property of charged ribosomes being attached to and taken up by cells.It is known that ribosomes contain nucleic acids and that ribosomes form attached masses around nucleic acids. I have.
  • An example of an application of nucleic acid encapsulated in ribosomes is the introduction of interferon] 3 gene for the treatment of brain tumors (M. Miz un o eta 1., Cancer Res., Vol. 50, 7826 (1990)).
  • An example of the application of the method in which ribosomes form an adherent mass around nucleic acids is that they are often used in cell engineering experiments.
  • ribosome vector is far superior to the viral vector in terms of safety when the main component is a natural phospholipid, the process of preparing the vector and the complex of the vector and the nucleic acid There are problems that the production process is complicated and the efficiency of introducing nucleic acids into cells is low. In addition, when the constituent components of the ribosome are synthetic lipids, there is a problem that the efficiency and operability of introducing the nucleic acid into cells are improved, but toxicity appears. Furthermore, all ribosomes have problems in formulation due to poor storage stability after complex formation with nucleic acids.
  • Examples of other vectors include peptide vectors, and as one of them, polylysine and its modified products have been studied.
  • This vector utilizes the property that a positively charged peptide electrostatically binds to a negatively charged nucleic acid and easily adheres to cells.
  • polylysine when polylysine is used alone as a peptide vector, covalently linked oligonucleotides are introduced into cells (Lemaitre M. et al., Proc. Natl. Accad. Sci. USA, Vol. 84, 648 (1987)), it is often necessary to modify polylysine with sugars, glycoproteins, phospholipids, etc. in order to substantially introduce electrostatically bound oligonucleotides or plasmids into cells.
  • a peptide vector is one in which a peptide alone can be used as a nucleic acid vector.
  • An amphipathic basic peptide having an ⁇ -helix structure is a peptide vector of a nucleic acid alone due to its structural characteristics.
  • the introduction efficiency is high (Nii dome T. etal., J. Biol. Chem., Vol. 272, 15307 (1997)).
  • this peptide shows a typical dihedral structure consisting of a hydrophobic surface and a charged surface (hydrophilic surface) in an ⁇ -helix structure model by the Edmonson-Wheel plot method, and has the ability to introduce nucleic acids into cells. In order to maintain it, it is necessary to increase the ratio of the hydrophobic surface, and as a result, it has a drawback of poor water solubility.
  • the ratio of the hydrophobic surface is reduced to improve the water solubility, the ability to introduce nucleic acids into cells decreases. Further, the ratio of the hydrophilic surface, which is the charged surface of the peptide, is small, and when the nucleic acid is electrostatically bound, the hydrophilicity of the peptide disappears, and the complex of the peptide and the nucleic acid becomes extremely poorly soluble. It also has the disadvantage of easily forming aggregates that are substantially problematic. In addition, it is highly toxic when administered to animals because it readily aggregates in serum.
  • the peptide vector generally has excellent operability such that a complex is formed simply by mixing with a nucleic acid, but particularly easily in blood. It has the drawback of being easy to form agglomerates, and its complex with nucleic acids also has poor solubility and high toxicity, and has practical drawbacks.
  • any vector has no selectivity for cells into which the nucleic acid is to be introduced, and the nucleic acid is introduced into cells into which the nucleic acid is not desired, as well as cells into which the nucleic acid is desired.
  • phosphatidylserine and phosphatidylethanolamine are aminophospholipids contained in the components of the lipid bilayer that forms the cell surface, and the ratio of the phospholipids contained in the outer and inner layers of the lipid bilayer varies depending on the state of the cell. is there.
  • a phospholipid that increases the proportion of the outer layer of the lipid bilayer of the cell membrane when the cell is exposed to some kind of stimulus Al J. Schroiteta 1., Bioch im. Biophys. Acta, Vol.
  • Phosphatidylserine is also contained in granules in cells (for example, mast cells and basophils) in which allergens bind to IgE antibodies on the cell surface and cause allergic reactions (decondylar granule reactions). It is known that the components contained are phospholipids that appear on the cell surface during degranulation (Martin, S. et al., Int. Arch. Allergy and Immunol., Vo. l. 123, 249 (2000)). Recent findings indicate that cells treated with apoptosis-inducing substances (eg, anticancer drugs) or irradiated and irradiated with apoptosis-related genes, such as p53, transmit signals.
  • apoptosis-inducing substances eg, anticancer drugs
  • irradiated and irradiated with apoptosis-related genes such as p53
  • PEG modification of ribosomes containing the anticancer drug doxorubicin enhances the drug's effect compared to unmodified ribosomes.
  • Examples of other than liposomes include PEG-modified polylysine used for gene transfer (Le eMetal., Mol. Ther., 4, 339 (2001)).
  • Polylysine is very toxic as is, but PEG modification reduces toxicity It is known to
  • PEG modification is a useful technique, but has the problem that the specific activity of the modified peptide-polypeptide is reduced. This is because the active center is also PEGylated. For example, it has been shown that PEGylation of arginase reduces the specific activity to 65% (Sa Voca KV eta 1, Bioch im. Biophys. Acta, 578, 47 (1979 )).
  • a PEG-modified antibody when used as a means for imparting site directivity to a PEG-modified carrier, the antibody is susceptible to steric hindrance by the PEG molecule and has a problem in that the effect is unlikely to appear. Therefore, development of a means for imparting more useful site directivity is desired.
  • an object of the present invention is to provide a peptide with a high level of safety, easy production of a complex with a substance that binds to a peptide (excellent operability), and excellent solubility of the complex. It is an object of the present invention to provide a novel PEG chemically modified peptide which is excellent in the selectivity of a substance to be bound and has high transfer efficiency, does not decrease the specific activity due to PEG chemical modification, and a method for producing the same.
  • Another object of the present invention is to provide a complex of a chemically modified PEG peptide and a substance that binds to the peptide, and a method for producing the same.
  • an object of the present invention is to provide a chemically modified peptide of PEG for imparting site-directivity to a carrier that binds or contains a drug, and is modified by the peptide.
  • a carrier and a method for producing the carrier are provided.
  • Another object of the present invention is to provide a method for delivering a substance bound or included in a carrier modified by a PEG chemically modified peptide into cells. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted intensive research to solve the above problems,
  • a peptide having an affinity can be a vector of a peptide-binding substance, which has a high efficiency of introducing a substance that binds to a cell into cells, has low toxicity, and has excellent solubility.
  • Peptides having structural characteristics defined by their amino acid sequences have a high level of accumulation in specific phospholipids and have excellent selectivity for introducing peptide-binding substances into specific cells.
  • the chemically modified peptide of PEG obtained by chemically modifying the peptide with PEG can serve as an element for imparting site-directivity to a carrier that binds or contains a drug.
  • the present inventors have found that a substance bound or included in a carrier modified with the PEG chemically modified peptide can be efficiently delivered to a specific cell. Was completed.
  • a PEG chemically modified peptide of the following (1) to (9) or (21), or a conjugate of a PEG chemically modified peptide of (10) to (19) or (24) and a peptide binding substance , (20), (22) or (23), their production method, (25) or (27) a carrier modified with the PEG chemically modified peptide, (26) their production method, (28) are provided.
  • the sequence consisting of the 18 amino acids is composed of four alternately arranged two hydrophobic surfaces and two hydrophilic surfaces,
  • One of the hydrophobic surfaces is composed of 5 to 7 amino acids, and the composition ratio of the hydrophobic amino acids is 80 mol% or more; and one of the hydrophilic surfaces is composed of 5 to 6 amino acids, and the composition of the hydrophilic amino acids.
  • the ratio is at least 80 mol%, and the constituent ratio of the amino acid selected from arginine or lysine is at least 50 mol%,
  • Another one of said hydrophobic surfaces is composed of 2-4 hydrophobic amino acids
  • a chemically modified PEG peptide wherein another one of the hydrophilic surfaces is composed of 3 to 5 amino acids, and a composition ratio of the hydrophilic amino acid is 80 mol% or more.
  • the total number of amino acids is 20 or more, both ends are N-terminal and C-terminal, and any continuous 18 amino acids excluding both amino acids are composed of the above 18 amino acids.
  • X3, X10, X12, X21, X28, and X30 are each a hydrophobic amino acid, a neutral hydrophilic amino acid or a basic hydrophilic amino acid,
  • X6, X17, X24, and X35 are each hydrophobic amino acids
  • X7, X14, X18, X25, X32, and X36 are each a neutral hydrophilic amino acid or a basic hydrophilic amino acid.
  • XI and X37 are hydrophilic amino acids
  • X3, X10, X12, X21, X28 and X30 are each a hydrophobic amino acid, a neutral hydrophilic amino acid or a basic hydrophilic amino acid,
  • X6, X17, X24, and X35 are each hydrophobic amino acids
  • X7, X14, X18, X25, X32, and X36 are each a neutral hydrophilic amino acid or a basic hydrophilic amino acid.
  • amino acids from X2 to X36 may be deleted, added, inserted or substituted as long as at least 18 amino acids are conserved continuously.
  • XI is threonine
  • X37 is serine
  • X2, X5, X9, X20, X23, and X27 are each arginine or lysine, and X3 and X21 are each one of tyrosine, phenylalanine, serine, or arginine;
  • X4, X17, X22, and X35 are each leucine
  • X6, X15, X24, and X33 are each leucine or isoleucine; X7, X13, X25, and X31 are each histidine or arginine; X8 and X26 are each proline;
  • X10 and X28 are either serine, arginine or leucine, respectively, XII and X29 are tributophan or leucine, respectively.
  • X12 and X30 are each valine, leucine or serine;
  • X14 and X32 are each glutamine, asparagine or arginine;
  • X16 and X34 are alanine or arginine, respectively;
  • X18 is any of arginine, lysine or serine, X19 is leucine or threonine,
  • X36 is arginine or serine.
  • amino acids from X2 to X36 may be deleted, added, inserted or substituted as long as at least 18 amino acids are conserved at least continuously.
  • a complex comprising a chemically modified PEG peptide comprising a sequence consisting of the following 18 amino acids, and a substance that binds to the peptide,
  • the structure is composed of two alternately arranged hydrophobic surfaces and two hydrophilic surfaces,
  • One of the hydrophobic surfaces is composed of 5 to 7 amino acids, and the composition ratio of the hydrophobic amino acids is 80 mol% or more;
  • One of the hydrophilic surfaces is composed of 5 to 6 amino acids, and the composition of hydrophilic amino acid The ratio is at least 80 mol%, and the constituent ratio of the amino acid selected from arginine or lysine is at least 50 mol%,
  • Another one of said hydrophobic surfaces is composed of 2-4 hydrophobic amino acids
  • the complex wherein another one of the hydrophilic surfaces is composed of 3 to 5 amino acids, and a composition ratio of the hydrophilic amino acid is 80 mol% or more.
  • the total number of amino acids is 20 or more, both ends are N-terminal and C-terminal, and any continuous 18 amino acids excluding the amino acids at both ends indicate a sequence consisting of the 18 amino acids.
  • X3, X10, X12, X21, X28, and X30 are each a hydrophobic amino acid, a neutral hydrophilic amino acid, or a basic hydrophilic amino acid;
  • X6, XI7, X24, and X35 are each hydrophobic amino acids
  • X7, X14, X18, X25, X32, and X36 are each a neutral hydrophilic amino acid or a basic hydrophilic amino acid.
  • XI and X37 are hydrophilic amino acids
  • X3, X10, X12, X21, X28 and X30 are each a hydrophobic amino acid, a neutral hydrophilic amino acid or a basic hydrophilic amino acid,
  • X6, X17, X24, and X35 are each hydrophobic amino acids
  • X7, X14, X18, X25, X32, and X36 are each a neutral hydrophilic amino acid or a basic hydrophilic amino acid.
  • amino acids from X2 to X36 may be deleted, added, inserted or substituted as long as at least 18 amino acids are conserved continuously.
  • XI is threonine
  • X37 is serine
  • X2, X5, X9, X20, X23, and X27 are each arginine or lysine, and X3 and X21 are each one of tyrosine, phenylalanine, serine, or arginine;
  • X4, X17, X22, and X35 are each leucine
  • X6, X15, X24, and X33 are each leucine or isoleucine; X7, X13, X25, and X31 are each histidine or arginine; X8 and X26 are each proline;
  • X16 and X34 are alanine or arginine, respectively;
  • X18 is any of arginine, lysine or serine
  • X19 is leucine or threonine
  • X36 is arginine or serine.
  • amino acids from X2 to X36 may be deleted, added, inserted or substituted as long as at least 18 amino acids are continuously conserved.
  • (22) a) reacting a peptide containing a sequence consisting of 18 amino acids with activated polyethylene glycol (PEG),
  • (26) a) reacting a peptide comprising a sequence comprising 18 amino acids or a peptide comprising a sequence comprising 18 amino acids with a cysteine bound to the N-terminus or C-terminus, and an activated PEG;
  • FIG. 1 are conceptual diagrams of the ⁇ -helix structure model based on the Edmonson-Wheel plot method (however, amino acids enclosed in the mouth are hydrophobic amino acids, and ⁇ Amino acids surrounded by are basic hydrophilic amino acids, and amino acids without boxes are neutral hydrophilic amino acids (the same applies to the following drawings).
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of the tetrahedral structure of the 18 amino acid sequence of the peptide used in the present invention.
  • FIG. 3 are diagrams showing examples of the tetrahedral structure of the peptide used in the present invention, which is differently allocated to each surface.
  • (A) in Fig. 4 represents (C1), and (b) represents (C2).
  • (C1) and (C2) are diagrams showing examples of the tetrahedral structure of the peptide used in the present invention, which is differently allocated to each surface.
  • FIG. 5 show the four-sided structure of the peptide containing the 18 amino acid sequence of the present invention. It is a figure which shows the example of a structure.
  • FIG. 7 (a) is a graph showing the average residue ellipticity curve obtained by measuring the CD spectrum of SDS ( ⁇ )
  • FIG. 7 (b) is the graph showing the average residue ellipticity obtained by measuring the CD spectrum of SDS (+). It is a figure showing a curve.
  • FIG. 8 (a) shows the average residue ellipticity curve obtained by measuring the CD spectrum of SDS (-), and FIG. 8 (b) shows the average residue ellipticity obtained by measuring the CD spectrum of SDS (+). It is a figure showing a curve.
  • FIG. 9 (a) is a diagram showing the average residue ellipticity curve obtained by measuring the CD spectrum of SDS (—), and FIG. 9 (b) is the graph showing the average residue ellipticity obtained by measuring the CD spectrum of SDS (+). It is a figure showing a curve.
  • FIG. 10 is an electrophoretogram of a mixture of the peptide of SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide.
  • FIG. 11 is an electrophoretogram of a mixture of the peptide of SEQ ID NO: 1 and a plasmid.
  • FIG. 12 is a diagram showing the ability to introduce a plasmid into cells depending on the presence or absence of the peptide of SEQ ID NO: 1, using the luciferase activity expressed by the plasmid as an index.
  • FIG. 13 is a diagram showing that introduction of a plasmid containing the HSV-tk gene into cells using the peptide of SEQ ID NO: 16 enhances GCV sensitivity.
  • FIG. 12 is a diagram showing the ability to introduce a plasmid into cells depending on the presence or absence of the peptide of SEQ ID NO: 1, using the luciferase activity expressed by the plasmid as an index.
  • FIG. 13 is a diagram showing that introduction of a plasmid containing the HSV-tk gene into cells using the peptide of SEQ ID NO: 16 enhances GCV sensitivity.
  • FIG. 14 is a diagram showing the ability of the peptide of SEQ ID NO: 1 to introduce a plasmid into cells, using the luciferase activity expressed by the plasmid as an index before and after storing the complex with the plasmid in step 4. is there.
  • FIG. 15 is an electrophoretogram of the oligonucleotide after the nuclease treatment of the mixture of the peptide of SEQ ID NO: 1 and the oligonucleotide.
  • FIG. 16 is an electropherogram of the plasmid after the mixture of the peptide of SEQ ID NO: 16 and the plasmid has been treated with nuclease.
  • the control is a nuclease-untreated plasmid.
  • FIG. 17 is a diagram showing the specific affinity of the peptide of SEQ ID NO: 1 and phosphatidylserine measured using Biacore 2000.
  • FIG. 18 shows that the peptide of SEQ ID NO: 25 showed no affinity for phosphatidylserine and phosphatidylcholine, as measured using Biacore 2000.
  • FIG. 19 is a diagram showing, using flow cytometry, that phosphatidylserine is expressed on the cell surface when the cells are stimulated by degranulation.
  • FIG. 20 is a diagram showing that the peptide of SEQ ID NO: 16 transfects more cells into which phosphatidylserine is expressed on the cell surface due to degranulation reaction.
  • FIG. 21 is a diagram showing that the peptide of SEQ ID NO: 16 has the ability to introduce plasmid into cancer cells transplanted into mice, using the luciferase activity expressed by the plasmid as an indicator.
  • Figure 22 shows that the introduction of a plasmid containing the HSV-tk gene into a cancer cell transplanted into a mouse using the peptide of SEQ ID NO: 16 and GCV administration prolong the survival time of the mouse. is there.
  • FIG. 4 is a diagram comparing the gene transfer ability of the PEG and the unmodified PEG.
  • FIG. 24 is a diagram comparing the gene transfection ability of a plasmid peptide complex modified with PEG and an unmodified PEG of the same using anaphylactic shock mice.
  • FIG. 25 is a diagram in which the PEG-modified peptide present in the PEG-modified plasmid peptide complex was identified by SDS-PAGE. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the chemically modified PEG peptide of the present invention is obtained by chemically modifying a peptide containing a sequence consisting of 18 amino acids (hereinafter abbreviated as “peptide used in the present invention”), for example, with activated PEG, which will be described in detail later. Obtained.
  • the method of chemically modifying with PEG is not particularly limited, and examples thereof include a method using activated PEG, a method using PEG and an activator, and the like.
  • the activated PEG used in the chemical modification method is not particularly limited as long as it is activated PEG, and may have a linear or branched structure.
  • mPEG-SPA succin imi dy lesterof me t hoxy po 1 y (et hy l en eglycol) r opion on iccid, manufactured by S hear water
  • mP EG manufactured by the company SBA (succinimi dy lesterof mPEG butanoic ac id)
  • mP EG— SS succin imi dy lesterof mP EG succinate
  • mP EG— SCM s uc cinimidy 1 esterofcar boxyme t hy lated mPEG
  • mPEG-BTC benzotriazole car bona tederi va tiveof mP EG
  • mPEG-e pox i de mPEG—CD I (car bony ldi imi dazole—ac tivated mPEG), mPEG—NP C (p—nitropheny 1 m PEG
  • the activated PEG used in the chemical modification method may be a conjugated phospholipid to PEG.
  • MAL—mPEG—DSPE ma 1 e imi de mod ified and distear oy l pho ph s p ati dy
  • leth ano l ami ne modified mP EG NH S—mP EG—DSPE (N-hydroxysuccin im i dy lcar bon at e.g., activated PEG, such as emodified mPEG_D SPE).
  • the weight average molecular weight of PEG may be about 200 Da to about 100, OO ODa, preferably about 1, OO ODa to about 50,000 Da, more preferably about 2, OO ODa to about 20, OO ODa. ODa.
  • the modified PEGylated peptide maintains the activity of the original peptide and further increases the solubility, diminishes toxicity and reduces toxicity. It is possible to impart more preferable properties such as attenuation.
  • the PEG and the activator used in the method of chemical modification with PEG and an activator can be arbitrarily selected and used as long as they are commonly used.
  • the modification (bonding) position of PEG in the chemically modified PEG peptide of the present invention is not particularly limited, and may be any position.
  • the peptide used in the present invention binds to a peptide binding substance such as a nucleic acid and phosphatidylserine.
  • the position is preferably a position other than the above position, and the N-terminal, C-terminal or side chain position is more preferable.
  • the amount of modification (the amount of binding) of PEG to the peptide used in the present invention is not particularly limited.
  • a gene for a target cell It has excellent effects such as improvement of drug and drug uptake rate, improvement of pharmacological activity, and reduction of toxicity.
  • sequence consisting of 18 amino acids which is an essential structure of the peptide containing a sequence consisting of 18 amino acids, which is a peptide used in the present invention, will be described with reference to the drawings.
  • the Edmonson-Wheel-Plot method is a model that shows the relative positions of amino acids with respect to the center line of the ⁇ -helix, and makes a round with 18 amino acids, and the 19th amino acid comes at the same position as the 1st amino acid Notation as follows.
  • the first amino acid which is the base point
  • the starting point on the notation differs as long as the amino acid sequence is the same.
  • the relative position of each amino acid on the figure does not change. For example, in FIG. 1, (A), ( ⁇ ), and (C) are essentially the same.
  • the “plane” refers to a region composed of amino acids that are consecutively adjacent to each other in a model.
  • the surface may have at least one constituent amino acid, preferably at least two constituent amino acids.
  • Contiguously adjacent to each other refers to, for example, the positional relationship between the first and 12th amino acids and the positional relationship between the 15th, 8th, 1st, and 12th amino acids in FIG. .
  • the positional relationship between the 1st and 10th amino acids is not continuous.
  • the positional relationship between the first and fifth amino acids is not a “continuously adjacent” positional relationship, but the same surface may be formed by including the first and second amino acids.
  • hydrophobic surface is a surface that substantially contains a large amount of hydrophobic amino acids. Hydrophobic amino The acid is not limited as long as it is substantially hydrophobic. It also includes natural hydrophobic amino acids, modified amino acids and synthetic amino acids whose properties are almost the same.
  • the peptide used in the present invention preferably contains 80 mol% or more of a hydrophobic amino acid on the hydrophobic surface. It is more preferable that the composition does not contain acidic hydrophilic amino acids (aspartic acid, glutamic acid). This is because the positively charged portion of the peptide and the negatively charged portion of the nucleic acid are electrostatically bound, and the acidic hydrophilic amino acid acts to inhibit the binding.
  • acidic hydrophilic amino acids aspartic acid, glutamic acid
  • the hydrophobic amino acid is preferably an amino acid selected from leucine, isoleucine, valine, tributofan, proline, tyrosine, alanine, fenylalanine, methionine, cysteine, and glycine.
  • One of the hydrophobic surfaces (side A) is preferably composed of 5 to 7 amino acids.
  • Another one of the hydrophobic surfaces (side surface C) is preferably composed of 2 to 4 amino acids. In particular, it is preferable that all of the side surfaces C are hydrophobic amino acids.
  • Figure 2 shows an example of a hydrophobic surface (Side A, Side C).
  • Hydrophilic surface is a surface that substantially contains a large amount of hydrophilic amino acids.
  • the hydrophilic amino acid is not limited as long as it is substantially hydrophilic. Also included are naturally occurring hydrophilic amino acids, modified amino acids having almost the same properties as those, and synthetic amino acids.
  • “Positively charged surface” is a “hydrophilic surface” and is a surface that is substantially rich in positively charged hydrophilic amino acids. Also included are naturally hydrophilic amino acids that are substantially positively charged, modified amino acids, and synthetic amino acids that have substantially the same properties.
  • the peptide used in the present invention preferably contains at least 80 mol% of a hydrophilic amino acid on the hydrophilic surface.
  • the hydrophilic amino acids are asparagine, glutamine, It is preferably an amino acid selected from nin, serine, arginine, histidine, lysine, aspartic acid, and glutamic acid.
  • hydrophilic amino acid other than an acidic hydrophilic amino acid that is, an amino acid selected from asparagine, glutamine, threonine, serine, arginine, histidine or lysine is preferred. This is because the positively charged portion of the peptide and the negatively charged portion of the nucleic acid are electrostatically bonded, and the acidic hydrophilic amino acid acts to inhibit the binding.
  • One of the hydrophilic surfaces (side surface B) is a positively charged surface and is preferably composed of 5 to 6 amino acids. Further, the composition ratio of amino acids selected from lysine and arginine is preferably 50 mol% or more.
  • the other hydrophilic surface (Side D) is preferably composed of 3-5 amino acids.
  • Figure 2 shows an example of the hydrophilic surface (side D) and the positively charged surface (side B).
  • the mole% is the ratio of the number of hydrophobic amino acids contained in the surface to the number of amino acids constituting the hydrophobic surface, the ratio of the number of hydrophilic amino acids contained in the surface to the number of amino acids constituting the hydrophilic surface. Alternatively, it is a ratio of the number of amino acids selected from lysine or arginine contained in the surface to the number of amino acids constituting the positively charged surface.
  • two hydrophobic surfaces (Side A and Side C) and two hydrophilic surfaces (Side B and Side D: at least Side B are positively charged surfaces) Is a structure in which four surfaces are alternately adjacent to each other.
  • the hydrophobic surfaces are directly adjacent to each other, they are not two hydrophobic surfaces but one as a whole, and when the hydrophilic surfaces are directly adjacent to each other, they are not two hydrophilic surfaces but the whole.
  • the positively charged surface and the positively charged surface are directly adjacent to each other, it is not two positively charged surfaces but one positively charged surface as a whole.
  • the hydrophobic surface and the hydrophobic surface, the hydrophilic surface and the hydrophilic surface, and the positively charged surface and the positively charged surface are not adjacent to each other.
  • the “structure consisting of four faces that are alternately adjacent to each other” means that in the ⁇ -helix structure model based on the Edmonson-Wheel-Plot method, the clockwise direction of the surface ⁇ ⁇ side ⁇ ⁇ side C ⁇ side D ( ⁇ Side A) Or clockwise, side A ⁇ Side D ⁇ Side C ⁇ Side B (—Side A), and any form may be used as long as the function is maintained.
  • the arrangement is such that side A ⁇ side B ⁇ side C ⁇ side D ( ⁇ side A) is turned clockwise.
  • the tetrahedral structure is not particularly limited in how to divide it, that is, how to allocate 18 amino acids to the four amino acids, as long as each surface maintains its properties.
  • side A be assigned 5 to 7 amino acids
  • side B be 5 to 6 amino acids
  • side C be 2 to 4 amino acids
  • side D be 3 to 5 amino acids.
  • a to C three sequences in which the assignment of the amino acid sequence to each surface is different are shown as A to C ( ⁇ 1 and ⁇ 2) in FIGS.
  • the amino acid sequences of C1 and C2 are completely the same, and both are examples included in the above definition when the allocation of the amino acid sequence to each surface is changed.
  • the amino acid assignments in A to C ( ⁇ 1 and ⁇ 2) are as follows. Hydrophobic surface Hydrophilic surface Hydrophobic surface Hydrophilic surface
  • the peptide used in the present invention contains a sequence consisting of 18 amino acids exhibiting the above-mentioned tetrahedral structure, the peptide itself has excellent water solubility, and when forming a complex with the peptide-binding substance. However, it has a feature that the complex does not substantially form an aggregate that causes a problem.
  • the peptide used in the present invention differs from the peptide vector having an ⁇ -helix structure described in “Prior Art” in that a plurality of hydrophobic surfaces are formed when the ⁇ _helix structure is formed, so that the ratio of the hydrophobic surface is reduced. Even if the water solubility is improved, the ability to introduce a peptide-binding substance into cells is high. On the other hand, since a plurality of hydrophilic surfaces are formed at the same time, the ratio of the hydrophilic surface is larger than in the case of the two-sided structure, and even if the peptide binding substance is electrostatically bonded to at least one positively charged surface.
  • a peptide Since the hydrophilicity of the peptide is not completely lost, the complex of the peptide and the peptide-binding substance remains water-soluble and does not result in the formation of aggregates that are substantially problematic. Therefore, in order for a peptide to have both a high peptide binding substance-introducing ability and excellent water solubility, a plurality of hydrophobic surfaces and hydrophilic surfaces (at least one positively charged surface) must be formed in a single helix structure. Need to be done.
  • the PEGylation of the present invention including the peptide used in the present invention having the above properties.
  • the chemically modified peptide is more excellent in the above properties and properties.
  • the number of surfaces is not limited as long as a plurality of hydrophobic surfaces and hydrophilic surfaces are formed and the function as a peptide vector is maintained.
  • each has two sides.
  • at least one of the plurality of hydrophilic surfaces is a surface rich in neutral hydrophilic amino acids (substantially not in a charged state)
  • the surface does not bind to the peptide binding substance, and as a result, This is more preferable because the water solubility of the surface is almost completely maintained.
  • the length of the amino acid sequence of the peptide used in the present invention is not limited at all, as long as its function is maintained.
  • it is a peptide having 20 or more amino acids, more preferably 25 or more, and still more preferably 30 or more.
  • the peptide preferably has a total amino acid number of 100 or less, more preferably 50 or less, and still more preferably 40 or less.
  • the peptide used in the present invention contains one or more continuous 18 amino acid sequences starting from an arbitrary amino acid.
  • two or more consecutive 18 amino acid sequences each starting from an arbitrary amino acid are present independently, and Z or a sequence having two or more amino acids is partially overlapped.
  • any continuous 18 amino acid sequence excluding the amino acids at both ends is a peptide having an 18 amino acid sequence showing the tetrahedral structure of the present invention. That is, it is a peptide in which any continuous 18 amino acid sequence excluding the amino acids at both ends overlaps and shows the tetrahedral structure of the present invention.
  • 18 amino acid sequence means that the side A, side B, side C, and side D are arranged clockwise in the helix model by the Edmonson-Wheel-Plot method.
  • a sequence consisting of 18 amino acids (abbreviated as “tetrahedral structure of the invention”) (in the present specification, “18 amino acids showing the tetrahedral structure of the present invention” Abbreviated as “acid sequence”).
  • the “arbitrary continuous 18 amino acid sequence excluding the amino acids at both ends” refers to, for example, a peptide consisting of N (where N is 20 or more) amino acids 2 to 19 and 3 to 20
  • “Overlapping and indicating all four-sided structures of the present invention” means “the 2nd to 19th, 3rd to 20th, 4th to 21st, and so on (N— 18) th to All the sequences up to the (N-1) -th sequence show the tetrahedral structure of the present invention.
  • FIG. 5 shows the sequence consisting of the 18th amino acid at the 2nd to 19th, the 3rd to 20th, the 4th to 21st, and the 19th to 36th amino acids of the peptide of SEQ ID NO: 16
  • FIG. 5 shows the sequence consisting of the 18th amino acid at the 2nd to 19th, the 3rd to 20th, the 4th to 21st, and the 19th to 36th amino acids of the peptide of SEQ ID NO: 16
  • FIG. 5 shows the sequence consisting of the 18th amino acid at the 2nd to 19th, the 3rd to 20th, the 4th to 21st, and the 19th to 36th amino acids of the peptide of SEQ ID NO: 16
  • FIG. 5 shows the sequence consisting of the 18th amino acid at the 2nd to 19th, the 3rd to 20th, the 4th to 21st, and the 19th to 36th amino acids of the peptide of SEQ ID NO: 16
  • FIG. 5 shows the sequence consisting of the
  • At least one end, preferably both ends, of the peptide used in the present invention is preferably a hydrophilic amino acid.
  • the peptide-binding substance referred to herein includes nucleic acids, acidic polymers such as acidic proteins, low molecular weight compounds having negatively charged side chains, and the like, which have physiological activity (details will be described later).
  • the hydrophilic amino acid is not limited as long as it is hydrophilic.
  • it is a hydrophilic amino acid other than an acidic hydrophilic amino acid, more preferably a neutral hydrophilic amino acid, and still more preferably threonine or serine.
  • the “18 amino acid sequence showing the tetrahedral structure of the present invention” contained in the peptide used in the present invention Preferable examples of the “row” include a sequence consisting of any continuous 18 amino acids in the following amino acid sequence.
  • X3, X10, X12, X21, X28, and X30 are each a hydrophobic amino acid, a neutral hydrophilic amino acid, or a basic hydrophilic amino acid,
  • X6, X17, X24, and X35 are each hydrophobic amino acids
  • X7, X14, X18, X25, X32, and X36 are neutral hydrophilic amino acids or basic hydrophilic amino acids, respectively.
  • X8 and X26 are each proline; X4, XI7, X22, and X35 are each leucine;
  • X6, XII, XI5, X24, X29, and X33 are each hydrophobic amino acids, and X12, X19, and X30 are each hydrophobic amino acids or neutral hydrophilic amino acids.
  • X2, X5, X9, X20, X23, and X27 are each a basic hydrophilic amino acid
  • XI3 and X31 are each a basic hydrophilic amino acid or a neutral hydrophilic amino acid.
  • X16 and X34 are hydrophobic amino acids or basic hydrophilic amino acids, respectively, ⁇ X2, X5, X9, X13, and X16 '', ⁇ X5, X9, X13, X16, and X20 '', ⁇ X9, X13, X16, X20, X23, X13, X16, X20, X23, and X27, XI6, X20, X23, X27, and X31, and X20, X23, X27, X31, and X34, respectively.
  • At least three amino acids are arginine or lysine,
  • X3, X10, X21, and X28 are each a hydrophobic amino acid, a neutral hydrophilic amino acid, or a basic hydrophilic amino acid,
  • X7, X14, X18, X25, X32, and X36 are each a neutral hydrophilic amino acid or a basic hydrophilic amino acid.
  • X2, X5, X9, X20, X23, and X27 are each arginine or lysine, and X3 and X21 are each one of tyrosine, phenylalanine, serine, or arginine;
  • X10 and X28 are either serine, arginine or leucine, respectively, XII and X29 are tryptophan or leucine, respectively;
  • X12 and X30 are each valine, leucine or serine;
  • X14 and X32 are each glutamine, asparagine or arginine;
  • X16 and X34 are alanine or arginine, respectively;
  • X18 is any of arginine, lysine or serine
  • X19 is leucine or threonine
  • X36 is arginine or serine.
  • amino acids from X2 to X36 may be deleted, added, inserted or substituted as long as at least 18 amino acids are conserved continuously.
  • the hydrophobic amino acid is an amino acid selected from leucine, isoleucine, norin, tritophan, proline, tyrosine, alanine, cystine, fenylalanine, methionine or glycine, and is a basic hydrophilic amino acid.
  • the neutral hydrophilic amino acid is an amino acid selected from any of asparagine, glutamine, threonine or serine.
  • peptide used in the present invention include a peptide having the following amino acid sequence.
  • X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xl 1-Xl 2-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20 -X21-X22-X23-X24- X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37 where
  • XI and X37 are hydrophilic amino acids
  • X3, X10, X12, X21, X28, and X30 are each a hydrophobic amino acid, a neutral hydrophilic amino acid or a basic hydrophilic amino acid,
  • An amino acid or a basic hydrophilic amino acid, and at least three amino acids thereof are arginine or lysine,
  • X6, X17, X24, and X35 are each hydrophobic amino acids
  • X7, X14, X18, X25, X32, and X36 are each a neutral hydrophilic amino acid or a basic hydrophilic amino acid.
  • amino acids from X2 to X36 may be deleted, added, inserted or substituted as long as at least 18 amino acids are conserved continuously.
  • amino acids from X2 to X36 may be deleted, added, inserted or substituted as long as at least 18 amino acids are conserved continuously.
  • XI and X37 are each threonine or serine
  • X8 and X26 are each proline
  • X4, X17, 111, and X35 are each leucine
  • X6, XII, X15, X24, X29, and X33 are each hydrophobic amino acids, and X12, X19, and X30 are each hydrophobic amino acids or neutral hydrophilic amino acids;
  • X2, X5, X9, X20, X23, and X27 are each a basic hydrophilic amino acid, and X13 and X31 are each a basic hydrophilic amino acid or a neutral hydrophilic amino acid,
  • X16 and X34 are each a hydrophobic amino acid or a basic hydrophilic amino acid
  • X3, X10, X21, and X28 are each a hydrophobic amino acid, a neutral hydrophilic amino acid, or a basic hydrophilic amino acid,
  • X7, X14, X18, X25, X32, and X36 are each a neutral hydrophilic amino acid or a basic hydrophilic amino acid.
  • amino acids from X2 to X36 may be deleted, added, inserted or substituted as long as at least 18 amino acids are conserved continuously. More preferably,
  • XI is threonine
  • X37 is serine
  • X5, X9, X20, X23, and X27 are each arginine or lysine, and X3 and X21 are each one of tyrosine, phenylalanine, serine, or arginine;
  • X4, X17, X22, and X35 are each leucine
  • X6, X15, X24, and X33 are each leucine or isoleucine; X7, X13, X25, and X31 are each histidine or arginine; X8 and X26 are each proline;
  • X10 and X28 are either serine, arginine or leucine, respectively.
  • XI I and X29 are each tryptophan or leucine
  • X12 and X30 are each valine, leucine or serine,
  • X14 and X32 are each glutamine, asparagine or arginine,
  • XI 6 and X34 are alanine or arginine, respectively;
  • X18 is any of arginine, lysine or serine
  • X19 is leucine or threonine
  • X36 is arginine or serine.
  • amino acids from X2 to X36 may be deleted, added, inserted or substituted as long as at least 18 amino acids are conserved continuously.
  • the hydrophobic amino acid, the basic hydrophilic amino acid, and the neutral hydrophilic amino acid are the same as those described in the aforementioned amino acid sequences X2 to X36.
  • the above-mentioned amino acid sequence is an example of the peptide used in the present invention, and the peptide used in the present invention contains the “18 amino acid sequence showing the tetrahedral structure of the present invention”, retains its functions, As long as the function and the like of the modified peptide are maintained, the above-mentioned amino acid sequence can be deleted, added, inserted or substituted as necessary.
  • modification with a molecule other than amino acid can be performed as necessary.
  • Modification with a molecular compound may be performed.
  • modification with mannose or cholesterol can be mentioned.
  • the preferred embodiment of the peptide used in the present invention does not contain an acidic hydrophilic amino acid, this property is particularly useful when making modifications.
  • this property is particularly useful when making modifications.
  • site-specific modification of the C-terminus is possible when modification is performed using a reaction depending on a carboxyl group. Is advantageous.
  • the peptide used in the present invention is preferably N-terminal or C-terminal so that only one cysteine is contained in the amino acid sequence.
  • modification with tylene glycol or the like selective modification can be advantageously performed.
  • amino acids are classified according to the type and properties of the side-chain molecule.
  • the classification that is an important index in considering the higher-order structure of is the classification based on the polarity of the side-chain molecule. Specifically, they are classified as follows.
  • Hydrophobic amino acids glycine, alanine, valine, leucine, isocyanate, methionine, fenylalanine, tyrosine, cystine, tryptophan, proline
  • Acidic hydrophilic amino acids aspartic acid, glutamic acid
  • Neutral hydrophilic amino acids serine, threonine, glutamine, asparagine
  • Basic hydrophilic amino acids arginine, lysine, histidine
  • amino acids belonging to the same classification described above can be mutually amino acid-substituted while satisfying the requirement of "18 amino acid sequences showing the tetrahedral structure of the present invention".
  • isoleucine and leucine, valine and leucine, tyrosine and phenylalanine, tryptophan and leucine, asparagine and glutamine, serine and threonine, arginine and lysine, and histidine and lysine can be substituted for each other.
  • Histidine is classified as a basic hydrophilic amino acid.However, under certain conditions, for example, physiological conditions, histidine has a small charge state, and therefore has a property close to that of a neutral hydrophilic amino acid. Histidine can be substituted not only with basic hydrophilic amino acids but also with neutral hydrophilic amino acids.
  • amino acids belonging to different classifications can be mutually substituted as long as the requirement of “18 amino acid sequences exhibiting the tetrahedral structure of the present invention” is satisfied.
  • An example is as follows.
  • the above-mentioned amino acid substitution can be performed in combination. That is, as an example of combining amino acid substitutions within the same genus, when simultaneous substitution of isoleucine for leucine and substitution of palin for leucine are performed, an example of combining amino acid substitutions of different genera is tyrosine to serine. Substitution of serine to leucine simultaneously, or as an example of a combination of amino acid substitution within the same genus and amino acid substitution of a different genus, substitution of isoleucine for oral isin and leucine for threonine And the replacement of the same can be performed at the same time.
  • the number of amino acid substitutions that can be combined is not particularly limited as long as the requirement of “18 amino acid sequences exhibiting the tetrahedral structure of the present invention” is satisfied. Like Or less than 3 per 18 amino acids.
  • Examples 12 and 13 show that the peptides used in the present invention can be substituted for each other as long as they satisfy the requirement of the above-mentioned “18 amino acid sequence showing the tetrahedral structure of the present invention”. I have.
  • Examples of the peptide used in the present invention include a peptide having any one of the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 24. Preferably, it is a peptide consisting of the amino acid sequence of either SEQ ID NO: 16 or 19.
  • the peptide used in the present invention is a peptide having a binding ability to a nucleic acid and an ability to introduce the nucleic acid into a cell, and having a specific affinity for phosphatidylserine.
  • the amino acids constituting the peptide may be either L-form or D-form amino acids, and may be amino acids other than ordinary amino acids having substantially the same properties as natural amino acids, or synthetic modified amino acids. These include, for example, hydroxyproline, homoserine, methylcysteine and the like.
  • the present invention relates to a peptide comprising the above-mentioned sequence of 18 amino acids (peptide used in the present invention) and a PEG chemically modified peptide obtained by modifying the peptide with PEG. And a substance that binds to a peptide (peptide-binding substance).
  • a second aspect of the present invention is a complex of the PEG chemically modified peptide and a substance that binds to the peptide (peptide binding substance).
  • the “complex” may be an aggregate, mixture, or composition of the peptide used in the present invention, PEG, and the peptide-binding substance.
  • PEG and / or peptide binding substance for the peptide used in the present invention Is not particularly limited as long as the function of the peptide is maintained.
  • Example 30 show that the peptide used in the present invention, PEG, and the peptide-binding substance form a complex (aggregate, mixture, composition, etc.).
  • the “peptide-binding substance” constituting the complex of the present invention includes, as described above, nucleic acids, acidic polymers such as acidic proteins, low-molecular compounds having negatively charged side chains (such as phosphate groups), and the like. It is a substance having a physiological activity.
  • the term “acidic polymer such as acidic protein” refers to a protein other than a protein (eg, albumin) containing a large amount of acidic amino acids and negatively charged as a whole molecule (eg, a protein).
  • a protein eg, albumin
  • heparin and hyaluronic acid are exemplified.
  • the “low-molecular compound having a negatively charged side chain” is a low-molecular compound having a phosphate group or the like in a side chain, and includes, for example, a phosphorylated acid mouth building.
  • nucleic acid includes nucleoside nucleotides, oligonucleotides or polynucleotides in which two or more nucleotides are linked, DNA, RNA, or derivatives, modified or modified forms thereof.
  • Derivatives of nucleic acids include those in which some of the atoms that constitute nucleic acids are replaced with other atoms.
  • a so-called PS form in which one of the oxygen atoms in the phosphodiester bond site is replaced with a sulfur atom is included.
  • modified nucleic acid includes those obtained by substituting and adding other atomic groups to some of the atoms constituting the nucleic acid. For example, a methoxy group (100-CH 3 ) is added to the carbon atom at the 2 'position of the pentose moiety of nucleic acid, or a sugar, phospholipid, or polyethylene daricol is added to a part of the nucleic acid sequence. .
  • a methoxy group 100-CH 3
  • a sugar, phospholipid, or polyethylene daricol is added to a part of the nucleic acid sequence.
  • a “nucleic acid variant” uses a completely different skeleton while maintaining the expected nucleic acid function.
  • Molecules For example, a peptide nucleic acid (PeptideNuc1eic Acid; PNA) is included.
  • Some nucleic acids include polynucleotides, such as DNA or RNA, which increase or decrease the expression level of a specific protein in a living body or regulate the functional expression of a specific factor, or derivatives, modified products, or modified products thereof. Or a combination of “induction”, “modification”, and “modification”, and a derivative or a mixture or chimera of these derivatives, modifications or modifications.
  • the nucleic acid may be composed of a single strand or two or more strands, and may be bound to a carrier.
  • DNA encoding a protein, a plasmid in which an expression control unit is connected to the DNA, an antisense oligonucleotide, a decoy-type double-stranded nucleic acid (hereinafter, referred to as decoy), an abdomer, a lipozyme, an siRNA, and the like.
  • Specific protein or “specific factor” is a protein or factor intended to increase or decrease the expression level or to regulate the expression of function. These may be substances that originally exist in the living body or substances that do not exist.
  • the "ability to bind to a peptide-binding substance" can be examined, for example, by detecting a stained image of a nucleic acid after electrophoresis of a mixture of the nucleic acid and the peptide used in the present invention, using a nucleic acid as an example. it can. For example, if the nucleic acid is not migrated and a stained image of the nucleic acid is not obtained, or if a stained image is obtained in a region where the mobility during electrophoresis is smaller than the stained image of the migration of the nucleic acid alone, It is assumed that the peptide has “the ability to bind to a peptide binding substance”. A more specific method is described in Example 8 described later.
  • “Ability to introduce peptide-binding substances into cells” explained using nucleic acids as an example Then, it can be measured by a method of observing cells under a fluorescence microscope using a fluorescently labeled nucleic acid, or a method of measuring a reporter protein expressed by cells using a plasmid expressing a reporter gene. In addition, the pharmacological action observed as a result of the expression of the repo overnight protein can be measured as an index.
  • the reporter include firefly luciferase,) 3-galactosidase and HSV-tk. A more specific method is described in Example 9 described later.
  • the number of fluorescence counts per second of 1 mg of the protein is measured. If the fluorescence count at this time is 100,000 or more, it is assumed that the reporter gene has been introduced into the cell, and the peptide has “the ability to introduce a peptide-binding substance into the cell”.
  • intracellular refers to a unit constituting a cell and the inside thereof.
  • the inside of the phospholipid bilayer constituting the outline of the cell, between the phospholipid bilayers, the cytoplasm, or the organelle (organelle) or nucleus or the inside thereof.
  • Specifically having an affinity refers to any specific interaction. For example, binding to each other, forming a complex, recognizing molecules with each other, trying to move or aggregate in a certain direction, changing the shape of molecules, reacting with each other, etc. . For example, if it has an affinity even in the presence of serum albumin, it will have a specific affinity.
  • a peptide that has an affinity for phosphatidylserine in the absence of serum albumin, but does not have an affinity for phosphatidylserine in the presence of serum albumin has a nonspecific interaction with phosphatidylserine. And has no affinity for phosphatidylserine in vivo.
  • the interaction of the peptide with a specific substance does not disappear even when other peptides coexist, the interaction is specific and ⁇ has a specific affinity '' .
  • carrier refers to a substance that binds to a drug or the like or includes a drug or the like and delivers them.
  • a carrier composed of a lipid, a polymer, or the like is preferable, and specific examples thereof include liposomes, dendrimers, and nanoparticles.
  • the combination of the carrier and the drug but in order to hold the drug, etc. more stably, it is preferable that they do not repel each other electrostatically.
  • a combination of doxorubicin with a neutral or negatively charged ribosome is exemplified.
  • Carriers modified with the chemically modified PEG peptide of the present invention are particularly useful because they have not only improved pharmacokinetics but also directivity to specific sites.
  • the activated PEG used for the PEG chemical modification is not limited, but if the carrier contains a phospholipid, the phospholipid may be used. Can use activated PEG with preferable.
  • the ratio of the number of PEG molecules not modified with a peptide to the number of PEG chemically modified peptide molecules of the present invention is not particularly limited as long as the pharmacokinetics of the PEG chemically modified peptide-modified carrier is improved.
  • the carrier is a ribosome, preferably 1 ::! To 1: 0.001, more preferably 1: 0.3 to 1: 0.01, and still more preferably 1: 0.2 to: L: 0.02.
  • the improved properties and characteristics of the chemically modified PEG peptide of the present invention include the properties and characteristics of the complex of the PEG chemically modified peptide of the present invention and a peptide binding substance, and the PEG chemically modified of the present invention. It includes the properties and characteristics of the carrier modified by the peptide.
  • the peptide used in the present invention refers to a peptide containing a sequence consisting of 18 amino acids without PEG modification
  • the chemically modified PEG peptide of the present invention are nucleic acids and nucleic acids.
  • a mode of binding of the peptide of the present invention to a nucleic acid there is no limitation on the mode of binding of the peptide of the present invention to a nucleic acid, and examples include an electrostatic bond, a hydrophobic bond, and a covalent bond.
  • the peptide of the present invention has the ability to form the above-described complex and introduce a nucleic acid bound to the peptide into a cell.
  • the nucleic acid is not subject to degradation and has a desired function of the nucleic acid. Has the ability to introduce nucleic acids into cells while maintaining the same.
  • the nucleic acid transfection ability of the peptide used in the present invention was measured in the measurement of the nucleic acid transfection ability of Example 9 when the fluorescence count number per second of 1 mg of the protein was 100,000 or more. is there. It is preferably at least 100,000, more preferably at least 1,000,000.
  • the peptide of the present invention has the above-mentioned characteristics, when a nucleic acid is introduced into a cell using the peptide, the desired function held by the nucleic acid can be exhibited in the cell as a result. is there.
  • the expression of a foreign gene inserted into a plasmid in a cell to produce a desired protein or the production of a specific physiologically active substance by an antisense oligonucleotide, decoy, abdominal or lipozyme, etc. Production is suppressed.
  • the “desired protein” includes not only the final active form but also the precursor.
  • Example 11 and 24 described below the firefly luciferase gene incorporated into the plasmid was introduced into the cell by the peptide used in the present invention, and then transfected into the cell through the process of transcription and translation. This is a specific example of the production and accumulation of firefly luciferase.
  • Example 16 and Example 25 show that the simple herpes virus-derived thymidine kinase (hereinafter referred to as HSV-tk) gene incorporated into a plasmid was introduced into tumor cells by the peptide used in the present invention. This is a specific example in which HSV-tk is produced and accumulated in tumor cells through the process of transcription and translation after introduction, and enhances the sensitivity of tumor cells to ganciclovir, thereby exhibiting a drug effect (anti-tumor effect).
  • HSV-tk simple herpes virus-derived thymidine kinase
  • peptide of the present invention include phospholipids other than phosphatidylserine, which have a specific affinity for phosphatidylserine in the presence of serum albumin.
  • a peptide having no affinity for phosphatidylcholine For example, a peptide having no affinity for phosphatidylcholine.
  • Example 20 This is shown, for example, in Example 20 or Example 21 for the peptide used in the present invention.
  • phosphatidylserine is a phospholipid contained in the constituent components of the lipid bilayer that forms the cell surface, and the ratio of the phospholipid contained in the outer layer and the inner layer of the lipid bilayer changes depending on the state of the cell.
  • phospholipids that are thought to have an increased proportion of the outer layer of the lipid bilayer in so-called abnormal cells such as cells at inflamed sites that have been damaged, denatured, or activated.
  • the peptides of the present invention selectively bind to abnormal cells, such as cells at sites of inflammation.
  • phosphatidylserine is a phospholipid that provides a ⁇ place '' for the blood coagulation reaction to progress even in vivo, and is a marker for macrophages to recognize and phagocytose apoptotic cells. is there. Therefore, the peptide of the present invention selectively binds to an abnormal cell, for example, a “field” where a blood coagulation reaction proceeds in a living body.
  • the peptide of the present invention has the ability to bind to a nucleic acid and the ability to introduce the nucleic acid into cells, and has an affinity for phosphatidylserine in the presence of serum albumin.
  • the peptide of the present invention has no content or is irregular in an aqueous solution containing only inorganic salts. However, it is preferable that the peptide has an ⁇ -helical structure in the presence of a specific substance.
  • a “specific substance” is a substance that interacts with the peptide of the present invention to induce the peptide to adopt an ⁇ -helix structure.
  • amphiphilic substances which include a surfactant such as sodium dodecyl sulfate (SDS) or a specific phospholipid such as phosphatidylserine.
  • the presence or absence of a single-helix structure in the higher-order structure of a peptide can generally be determined by CD vector measurement. That is, when the ⁇ -helix structure is included in the higher-order structure of the peptide, the average residue ellipticity curve in the CD spectrum measurement is a curve that is a characteristic of the single helix structure, ie, a wavelength of 205 to 210. A minimal value is observed at the two places in the nm region and in the wavelength region of 220 to 225 nm, which is a so-called W-shaped curve. ("Rotatory activity of proteins (Biochemical Experiment Method 6), Kozo Hamaguchi et al. Publishing Center, 197 9 ").
  • the ratio of the ⁇ -helix structure contained in the higher order structure of the peptide can be obtained by a predetermined calculation method from the measured average residue ellipticity curve.
  • Typical examples of the predetermined calculation method include a method of Chen et al. (YH China eta 1., Biochem stry Vol. 11, 4120 (1972)) and a method of Yang et al. (JT Yangetal , An al. Chem., Vol. 9 1, 13 (1 978)), Wo ody, etc. (RW Wo dy eta 1., J. Mo 1. Biol., Vol. 242) , 497 (1994)).
  • the calculated value differs depending on the method used. In both cases, it is preferable to specify the method used for the calculation.
  • the preferred peptide of the present invention has an ⁇ -helix structure in the presence of a specific substance.
  • the peptide may be a surfactant or a specific phospholipid such as phosphatidylserine on a cell membrane. Takes on a helix structure due to its interaction with amphiphiles. Thereby, the cell membrane permeability of the peptide and the substance containing the peptide is increased, and as a result, the peptide and the substance containing the peptide are rapidly transferred into cells.
  • a preferred example of the peptide of the present invention is that the ⁇ -helix structure is not observed in the CD spectrum measurement of an aqueous solution containing ⁇ 5 to 8 containing no or only an inorganic salt, but ⁇ 5 to 8
  • the average residue ellipticity curve showed local minimum values at two places in the wavelength region of 205 to 210 nm and in the wavelength region of 220 to 225 nm.
  • This peptide has an ⁇ -helical structure.
  • a peptide having a higher-order structure in which the content of a single-helix structure is 25% or more as calculated by the method of Chen or the like is preferable.
  • the peptide is more preferably 30% or more. More preferably, the peptide is 35% or more.
  • the peptide of the present invention has a single helix structure in an aqueous solution in the presence of an amphipathic substance. Also, because of its affinity for phosphatidylserine, it selectively accumulates on the surface of abnormal cells, for example, damaged, denatured or activated cells, and interacts with phosphatidylserine on the cell membrane. As a result, a helical structure is formed, and the helical structure is selectively taken into the cells. Further, the peptide of the present invention is preferably a peptide that does not substantially form an aggregate in the presence of a protein.
  • the peptide does not take a Q! -Helical structure and its solubility is maintained even in the presence of a protein. Therefore, even when the peptide is administered to humans, the peptide does not form aggregates that cause substantial problems in blood, does not cause vascular occlusion, and increases safety. For example, the high safety of the peptide used in the present invention
  • the chemically modified PEG peptide of the present invention has higher safety.
  • Whether or not the peptide of the present invention substantially forms an aggregate in the presence of a protein can be determined by optically measuring the turbidity of an aqueous serum albumin solution containing the peptide. For example, wavelength 340 ⁇ ! It can be determined by measuring the absorbance of a serum albumin aqueous solution containing the peptide at a wavelength of up to 600 nm, particularly at a wavelength of 600 nm.
  • the peptide of the present invention has a feature of easily binding to a nucleic acid, a feature of high solubility when forming a complex with a nucleic acid, a feature of a high ability to introduce a nucleic acid into a cell, a feature of high safety, and Since it has an affinity for phosphatidylserine in the presence of serum albumin, it has a characteristic of being selectively taken up into abnormal cells, and thus is useful as a peptide vector.
  • Protein vector-1 refers to a peptide capable of introducing a desired substance into cells, and derivatives, modifications and variants thereof.
  • nucleic acid and a complex of the peptide of the present invention are reacted in a solution containing the nuclease, and then the nucleic acid is extracted and electrophoresed to detect a stained image of the nucleic acid.
  • the nucleic acid will not be degraded, and a stained image of the nucleic acid will be obtained. The specific method is described in Examples 18 and 19 described later.
  • a substance that binds to the vector preferably a nucleic acid
  • the nucleic acid is introduced into the cell to express the function of the nucleic acid in the cell Can be done.
  • Examples 11 to 16 are examples in which a nucleic acid encoded by the nucleic acid is expressed in a cell by introducing a nucleic acid into the cell with the peptide in vitro used in the present invention
  • Example 24 and Example 25 are examples in which the peptide used in the present invention introduced a nucleic acid into cells in vivo, thereby expressing firefly luciferase and HSV_tk encoded by the nucleic acid in cells.
  • Example 25 shows that the HSV-tk gene introduced into tumor cells by the peptide used in the present invention is expressed in tumor cells and enhances the sensitivity of tumor cells to ganciclovir, thereby exhibiting a drug effect (anti-tumor effect).
  • the dose of the plasmid used in this example was 1 Og, and the amount used was the same as in the pharmacological experiment (Aoki, K. eta et al.) Performed using the previously reported ribosome vector. 1..Hum. Ge ne Th , Vol. 8, 1 105 (1997)), which is much lower than the dose used (150 g).
  • the peptide used in the present invention increases the stability of the nucleic acid more than the ribosome, and the conjugate of the peptide used in the present invention and the nucleic acid is more stable.
  • nucleic acid Since the nucleic acid has a higher activity than ribosomes, it is useful to use the peptide used in the present invention when introducing a nucleic acid into a cell, indicating that the peptide used in the present invention is excellent as a vector for introducing a nucleic acid into a cell. ing.
  • a plasmid that expresses a reporter protein green fluorescent protein (GFP) or; 3-galactosidase
  • Bioactive substances that induce apoptosis and exhibit cell killing effects Fas ligand, P53, Caspase 3, Caspase 8, Bax (Bcl-2-associated X protein)> FADD (Fasassociated death doma inprotein), etc.)
  • Soluble receptor for the ligand capable of suppressing the reaction induced by the ligand by competitively binding to the ligand such as TNF- ⁇ or interleukin 6 and improving the pathological condition such as rheumatoid arthritis.
  • a plasmid that expresses the body A plasmid expressing a peptide Z polypeptide which suppresses the allergic reaction or a protein which is a bovine protein such as, for example, a tick antigen, as a vaccine;
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • HGF hepatocyte growth factor
  • CDC2 is effective in suppressing restenosis after percutaneous coronary angioplasty (PTCA).
  • E2F a transcriptional regulator of cell cycle regulatory gene
  • NF ⁇ a transcriptional regulator of inflammatory cytokine
  • the peptide of the present invention has the ability to bind to a nucleic acid and the ability to introduce the nucleic acid into cells, and has an affinity for phosphatidylserine in the presence of serum albumin.
  • Nucleic acids can be introduced at a high rate into cells that are exposed on the cell surface. As a result, when a gene or nucleic acid such as antisense DNA is introduced into cells for the purpose of treating a disease, the amount of phosphatidylserine that is expressed on the cell surface is increased, resulting in damage, denaturation, or activity. As a result, more nucleic acids are selectively introduced into so-called abnormal cells, such as transformed inflammatory cells, and immunocompetent cells, that is, side effects can be reduced.
  • nucleic acids are specifically introduced into the cells in which the allergic reaction has been induced by the immunocompetent cells.
  • nucleic acid is introduced at a higher rate into cells that express more phosphatidylserine on the cell surface
  • phosphatidyl in a desired specific cell or organ is previously determined.
  • the nucleic acid can be introduced into a desired specific cell or organ at a high rate.
  • the cell or organ increases the amount of phosphatidylserine expressed by the pharmacological action of the drug, and then uses the peptide of the present invention as a vector.
  • Nucleic acids can be introduced into organs at a high rate.
  • the chemotherapeutic agent is taken and the pharmacological effect of the chemotherapy agent is taken.
  • a gene having high antitumor effect or a nucleic acid such as antisense DNA is introduced into tumor cells. Thereby, the therapeutic effect of the nucleic acid can be enhanced.
  • the peptide of the present invention easily binds to a nucleic acid and introduces the nucleic acid into a cell.
  • the peptide of the present invention can introduce not only nucleic acids but also peptide-binding substances into cells.
  • the form of binding between the peptide of the present invention and the nucleic acid is not particularly limited, the form of binding between the peptide of the present invention and the substance is not particularly limited. Good More preferably, when the substance is introduced into cells, the binding form between the peptide of the present invention and the substance is by non-covalent bonding, and more preferably by electrostatic bonding. It is particularly preferable that the positive charge of the peptide of the present invention and the negative charge of the substance cause electrostatic binding. That is, the present invention includes introducing a peptide-binding substance into cells by the above-mentioned binding form.
  • the chemically modified PEG peptide of the present invention is obtained by chemically modifying the peptide used in the present invention with PEG. Therefore, the peptide used in the present invention has excellent effects such as, for example, an improvement in the rate of incorporation of genes and drugs into target cells, an improvement in pharmacological activity, and a reduction in toxicity.
  • Example 28 Even if the peptide used in the present invention was modified with activated PEG, the specific activity was not reduced (Example 28).
  • the introduction rate of the peptide binding substance is improved about three times (Example 29), which is useful.
  • the carrier modified with the PEG chemically modified peptide of the present invention improved the introduction rate of the drug contained in the carrier by about 3 to 33 times. (Examples 35 and 36) and also have an effect of extending the survival period of tumor-bearing mice (Example 37), which is useful.
  • the peptides used in the present invention can be obtained by chemical synthesis.
  • the peptides used in the present invention can also be obtained by genetic engineering techniques. Wear. In the case of using a genetic engineering technique, a desired peptide can be obtained by performing the following steps.
  • the DNA encoding the peptide used in the present invention may be any DNA having a nucleotide sequence that substantially encodes the peptide used in the present invention.
  • the DNA may have a base sequence in which one or more bases have been substituted based on the degeneracy of the genetic code.
  • the peptide used in the present invention when produced using a genetic engineering technique, it may have a nucleotide sequence in which one or more bases have been substituted so as to be a codon frequently used in a specific host cell.
  • the DNA may be a recombinant DNA, for example, a plasmid or an expression vector.
  • Examples of the DNAs of SEQ ID NOs: 28 to 30 encoding the peptides of SEQ ID NOs: 1, 16, and 19 are shown.
  • the step of obtaining DNA having a base sequence encoding the amino acid sequence of the peptide can be obtained, for example, by synthesizing using an automatic nucleic acid synthesizer.
  • Step of incorporating the DNA into a vector to obtain a replicable recombinant DNA containing the DNA, and transforming a host cell with the recombinant DNA to obtain a transformant capable of expressing the peptide The process is described in a compendium (e.g., Molecular Cl in in, al abo ratory manu al, Sec ond editi on, T.
  • peptide used in the present invention can be designed so as not to contain methionine, a peptide in which a plurality of peptides of the present invention are linked through methionine is produced by genetic engineering, and then cut with bromocyan. It is also possible to obtain.
  • the chemically modified PEG peptide of the present invention can be obtained by chemically modifying the peptide used in the present invention obtained by the above method with the above PEG.
  • the conditions for chemical modification of PEG are not particularly limited, and a method known to those skilled in the art can be appropriately selected.
  • a peptide solution dissolved in an appropriate solvent and an activated PEG solution are mixed, and reacted at about 1 to about 40 ° C. for about 1 minute to about 24 hours.
  • the amount of the activated PEG used is 0.0001 to 10,000, preferably 0.01 to 100, particularly preferably 0.1 to 100, in terms of a molar ratio to the amount of the peptide used in the present invention. 1 to 10.
  • the chemically modified PEG peptide maintains the activity of the original peptide and further increases solubility, reduces antigenicity, reduces toxicity, etc. This is because more preferable properties can be provided.
  • the average molecular weight of the PEG moiety of the PEG chemically modified peptide is from about 200 Da to about 100,000 Da, preferably from about 1, OO ODa to about 50,000 Da, more preferably about 2, OO ODa. ⁇ 20, OO ODa.
  • the PEGylated modified peptide can maintain the activity of the original peptide and impart more desirable properties such as further increasing solubility, reducing antigenicity, and reducing toxicity. It is possible.
  • the method for producing the conjugate uses the above-described peptide for use in the present invention, activated PEG and a peptide-binding substance, I) a) reacting a peptide containing a sequence of 18 amino acids with activated polyethylene glycol (PEG),
  • Unnecessary PEG modification can be suppressed by forming a reactant of the peptide and the peptide binding substance in advance and modifying the reactant with PEG, so that the method II) is preferred.
  • the PEG modification covers the site necessary for the function of the peptide (active center of the peptide), or changes the structure of the peptide to prevent it from approaching the target. Unnecessary PEG modification that causes a reduction in the PEG can be suppressed, and the usefulness of PEG modification can be further improved.
  • reaction conditions in a) of the method I the production conditions of the PEG chemically modified peptide of the present invention described above can be selected, and the reaction conditions in the step) of the I) can be the same as those in the a) of the later described II).
  • the reaction conditions in step a) of method II) are not particularly limited, and conditions under which the reaction product can be formed can be arbitrarily selected. Specifically, a peptide solution dissolved in an appropriate solvent and a peptide binding substance, respectively, are dissolved. The conditions include mixing the solution at about 1 to about 40 ° C. for about 1 minute to about 24 hours.
  • reaction conditions in step b) of method II) are not particularly limited, and the conditions under which the complex can be formed can be arbitrarily selected. Specifically, the conditions for the PEG chemical modification of the peptide used in the present invention are described above. No.
  • Example 27 More specifically, it is described in Example 27.
  • the amount ratio of the peptide, the activated PEG and the peptide binding substance used in the present invention used in the production method depends on the use of the conjugate, the properties required for the conjugate, the characteristics, the pharmacological activity, and the safety.
  • the ratio can be set arbitrarily in consideration of properties and the like.
  • the peptide-binding substance used in step a) of Method II) is a ratio (+/ ⁇ ) of the number of positive charges (+) of the peptide to the number of negative charges (1) of the peptide-binding substance.
  • Ratio) is 2 or more, more preferably 3 or more. The ratio is preferably 100 or less, more preferably 50 or less. Within this range, the peptide and the peptide-binding substance can form a complex.
  • the activated PEG used in step b) of the method II) is in a molar ratio of 0.0001 to 10,000, preferably 0.01 to 100, particularly preferably 0.1 to 100, based on the amount of the peptide used in the present invention. 1 to 10. Within this range, activated PEG reacts with the peptide, but the modified PEGylated peptide retains the activity of the original peptide and further increases solubility, reduces antigenicity, and reduces toxicity And more This is because preferable properties can be imparted.
  • Example 30 shows that the peptide used in the present invention, PEG, and the peptide-binding substance form a complex (aggregate, mixture, composition, etc.).
  • Peptides having the amino acid sequences of SEQ ID NOs: 1 to 27 were subjected to solid-phase synthesis using an automatic peptide synthesizer (type 432A, manufactured by Applied Biosystems).
  • an automatic peptide synthesizer type 432A, manufactured by Applied Biosystems.
  • the synthesis was interrupted with the amino acid at the 25th residue not being deprotected, and an amino acid column at the 26th and subsequent residues was attached to the synthesizer. After reworking, the synthesis was resumed and the synthesis was performed. Other operation methods were in accordance with the attached operation manual unless otherwise specified.
  • the peptide was precipitated in ether, the ether was removed, dissolved in distilled water and lyophilized.
  • the peptides of SEQ ID NOs: 1-26 are 20% aqueous acetonitrile containing 1 OmM HC1, and the peptide of SEQ ID NO: 27 is 1 OmM H
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 to 26 was purified by a linear concentration gradient method using a 20% to 70% aqueous solution of acetonitrile containing 1 OmM HC1 to obtain a single peak, and the peptide of SEQ ID NO: 27 was purified to 1 OmM HC1
  • the mixture was purified with a 15% to 50% aqueous solution of acetonitrile Z containing 15% to 50% isopropanol to obtain a single peak by a linear concentration gradient method.
  • the purified peptide was lyophilized, dissolved in distilled water, and stored frozen.
  • the molecular weight of the synthetic peptide obtained by mass spectrometry was measured using a MALD I-TOFMS mass spectrometer (Voyage rDE-STR, manufactured by PE Biosystems) to verify that the peptide was the target compound.
  • the operating method was in accordance with the attached operation manual unless otherwise specified. The outline is as follows. In other words, "5, a—c yano— 4-hydroxyc inn ami stird (CHC A) is dissolved in 0.
  • Measurement mode Line ar, po sitive Calibration: External standard method (However, standard products are 1 An giotensinl, 2 ACTH (1-17 c 1 ip), 3 ACTH (18-39 c 1 ip), 4 ACTH (7-38 c 1 ip), 5Insulin (ovine)) As a result, it was confirmed that the molecular weight of each of the synthesized and purified peptides matched the theoretical molecular weight.
  • the concentration of the synthetic peptide solution obtained in Example 1 was determined by amino acid composition analysis. Amino acid composition analysis was performed by the ninhydrin method.
  • the sample was dried in a glass test tube, 100 L of 6N HC1 was added, and hydrolysis was performed at 110 ° C. for 22 hours in a vacuum sealed tube. After drying the sample, it was dissolved in pure water and analyzed using an amino acid analyzer (L-8500, manufactured by Hitachi, Ltd.). The concentration of the aqueous peptide solution was 7-1 OmgZm.
  • the cell length was lmm, 35 ° C, and the number of integration was 6 times.
  • FIGS. 7 to 9 are graphs showing average residue ellipticity curves of the peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 16, respectively, as measured by CD spectrum.
  • the average residue ellipticity curve of the lower one is a so-called W-shaped curve with a minimum value in the wavelength region of 205 to 2101111 and a wavelength region of 220 to 225 nm, confirming that it has a single helix structure. it can.
  • the peptides of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 16 which have been confirmed to have gene transfer ability do not adopt a «-helical structure in an aqueous solution containing only an inorganic salt, but have an ⁇ -helical structure in the presence of SDS. It was shown to take the structure.
  • the 21-mer unlabeled oligonucleotide was prepared by using a ⁇ ⁇ ⁇ PC column (manufactured by Applied Biosystems) and purified using FITC-labeled 2 lmer oligonucleotide by reverse phase chromatography. Each of the preparations purified by the HPLC method was commissioned to Sadei Technology Co., Ltd. to obtain and obtain them.
  • the expression plasmid using the firefly luciferase gene as a reporter gene is commercially available plasmid (pGL3-Contro 1 Vector, manufactured by Promega) in which the firefly luciferase gene is incorporated under the SV40 early promoter.
  • plasmid pGL3-Contro 1 Vector, manufactured by Promega
  • Expression plasmids with the HSV-tk gene as the repo overnight gene can be used as the plasmid (pEF-tk) with the HSV-tk gene integrated under the EF-1 promoter or the HSV-tk gene under the CMV initial promoter.
  • the plasmid (pCMV-tk) in which the gene was integrated was used.
  • These plasmids and the general-purpose plasmids pUC119 and PBR322 were amplified using Escherichia coli if necessary, and then purified and used according to a known method.
  • the gel was stained with an aqueous solution of 5% Stainsall (manufactured by Funakoshi) containing 50% formamide and washed with water to determine the presence or absence of binding between the oligonucleotide and the peptide.
  • Stainsall manufactured by Funakoshi
  • FIG. 10 shows an electrophoretogram when the peptide of SEQ ID NO: 1 is used.
  • the +/- ratio charge ratio
  • the amount of the oligonucleotide bound to the peptide increased as the charge ratio (+/ ⁇ ratio) increased, and was completely bound at a charge ratio (+/ ⁇ ratio) of 10.
  • binding was observed at a charge ratio (+ -ratio) of 10.
  • Each of the peptides prepared by the methods described in Examples 1 to 3 was mixed so that the charge ratio (+ _ ratio) was 0 to 3, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C for 30 minutes, followed by 1% agarose gel. was used to determine the presence or absence of binding between the plasmid and the peptide.
  • FIG. 11 shows an electrophoretogram when the peptide of SEQ ID NO: 1 is used.
  • the +-ratio charge ratio
  • the amount of the plasmid bound to the peptide increased as the charge ratio (+ Z- ratio) increased, and completely bound at a charge ratio (+ Z- ratio) of 3.
  • binding was observed at a charge ratio (+ -ratio) of 3.
  • Ame ric an Typ e Culture Collection (monkey kidney-derived cell lines (Vero cells) purchased from AT CO, human bladder cancer cells (T24 cells), and human lung cancer cells purchased from Dainippon Pharma (A 549 Cells) DMEM containing 10 x 10% fetal serum (hereinafter referred to as FBS: Nichirei) in a 24-well culture plate (Nalgenunc) at 1 x 10 5 cells / well, with Vero cells and A549 cells in (Lifetech manufactured Oriental Co.), T 24 cells cultured for 24 hours at 1 0% FB S-containing Mc C 0 y 's 5 a 5% C_ ⁇ 2 atmosphere at (Lifetech manufactured Oriental Co.), 37 ° C did.
  • FBS fetal serum
  • the concentration of the luciferase expression plasmid prepared in Example 7 will be 1 g / mL, and the concentration of the peptide prepared in Example 1 will be 1.25, 2.5, or 5 M. 0 pti-MEM (manufactured by Life Tech Oriental) prepared as described above was added and cultured for 5 hours. Subsequently, the culture medium was replaced with 10% FBS-containing DMEM for Ver0 cells and A549 cells, and the T24 cells were replaced with 10% FBS-containing McCoy's 5a in a 5% C ⁇ 2 atmosphere.
  • the luciferase activity expressed in the cells was measured according to the method of Luciferase Atsushi System (Promega). That is, the cells were washed with phosphate-buffered saline (hereinafter referred to as PBS: manufactured by SI GMA), and the cells were lysed with Passive Lysis Buffer included in the kit.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • the protein concentration in the cell lysate was determined by dissolving the cell lysate in 792 L of ultrapure water in a disposable cuvette (UV Keiko cuvette A204X: manufactured by Funakoshi). After mixing 8 L with Protein Atsushi solution (Bio-Rad) 200 ⁇ L, allow to stand at room temperature for 5 minutes, and measure with a spectrophotometer (DU640: Beckman) at an absorbance of 595 nm. did. Standard serum albumin (BSA) was used.
  • BSA Standard serum albumin
  • the number of counts per second per 1 mg of protein in the cell lysate was calculated as the luciferase activity, and the one that showed the highest value among the three conditions with different peptide concentrations was the gene transfer capability of that peptide.
  • Ve ro Cells chamber one with slides implantation at a ratio of 1 x 1 0 5 cells per Ueru of (L ab- T ek II ch amb er S lidesize 4 we 1 1 Narujenunku Co.), 1 0% FBS containing 5% C_ ⁇ 2 Kiri ⁇ care under DMEM, 37 ° ⁇ Among 24 hours, and cultured. After removing the medium, opti-MEM containing the FITC-labeled oligonucleotide at a concentration of 300 nM prepared in Example 6 and 2.5 M of the peptide of SEQ ID NO: 1 prepared in Example 1 was added and cultured for 4 hours.
  • FIG. 12 is a graph comparing the difference in the amount of plasmid introduced into cells depending on the presence or absence of the peptide of SEQ ID NO: 1 with luciferase activity. As shown in the figure, it was confirmed that the peptide of SEQ ID NO: 1 had an ability to introduce a nucleic acid into cells. On the other hand, in the absence of the peptide of SEQ ID NO: 1, the nucleic acid was not introduced into cells.
  • the ability of the peptides of SEQ ID NOs: 2 to 18 obtained by substituting one or two amino acids in the ⁇ 18 amino acid sequence exhibiting the tetrahedral structure of the present invention '' to introduce nucleic acid into cells was Evaluation was performed according to the method described in Example 9. As a result, it was found that each peptide had the ability to introduce nucleic acids into cells.
  • the nucleic acid transfection ability was classified as follows based on the number of fluorescence counts per second per 1 mg of protein (cpsZmgprotine), and the results are shown in Table 2.
  • SEQ ID NO: 1 corresponds to 3+ in the above classification.
  • Table 2 SEQ ID NO: nucleic acid ability to introduce SEQ ID NO: 2 3 + SEQ ID NO: 3 2 + Rooster P column J number pa r j 4 * 4 + t3 [L chestnut ⁇ 9 4- eye Tari 3 ⁇ 4F 0 4 ⁇ -? Ffi 7 i ⁇ ! JS. 1 0
  • Example 9 describes the ability of the peptides of SEQ ID NOs: 19 to 22 obtained by substituting three amino acids in the "18 amino acid sequence showing the tetrahedral structure of the present invention" with reference to the peptide of SEQ ID NO: 1 to introduce into a cell a nucleic acid.
  • This peptide had the ability to introduce nucleic acids into cells.
  • the nucleic acid introduction ability was classified according to the method described in Example 12 based on the number of fluorescence counts per second per mg of protein, and the results are shown in Table 2.
  • each peptide had the ability to introduce nucleic acids into cells.
  • the nucleic acid introduction ability was classified according to the method described in Example 12 based on the number of fluorescence counts per second per mg of protein, and the results are shown in Table 2.
  • Cancer cells include human uterine cancer cells MES—SAZDx5 (purchased from ATCC), human kidney-derived transformed cells 293 (purchased from ATCC), human hepatoma cells SK—HEP-1 (purchased from ATCC), human ovarian cancer Cell SK— OV— 3 (ATCC Rat brain tumor cells F 98 (purchased from AT CC), mouse melanoma cells 816 81 ⁇ 6 (transferred from Institute of Immunology, Hokkaido University), human uterine cancer cells MES-SA (purchased from AT CC) , Mouse lung cancer cells Lewis Lung Careinoma (transferred from the Cancer Research Foundation) mouse liver cancer cells MH134 (transferred from the Central Research Institute for Experimental Animals) human uterine cancer cells MES—SA / Mx2 ( Human medulloblastoma cells Daoy (purchased from ATCC), human cervical cancer cells HeLa (purchased from ATCC), human breast cancer cells MCF7 (purchased from ATCC), human glioblastoma cells
  • the growth medium used for culturing each cell is described in Table 5.
  • the additive NEAA product of ICN
  • Na ⁇ Pyr product of ICN
  • All FBS's were from Nichirei and the medium was from Lifetech Oriental, and penicillin'streptomycin (ICN) was added to all growth media.
  • Example 7 was adjusted to 1 xg / mL, and the concentration of the peptide prepared in Example 1 was adjusted to 2.5 ng / mL.
  • Opti-MEM prepared to be M was added and cultured for 5 hours.
  • the HSV-tk expression plasmid prepared in Example 7 was incorporated into Lewis Lung Carcoma cells (mouse lung cancer cells) using the peptide of SEQ ID NO: 16 prepared in Example 1, and ganciclovir (hereinafter referred to as GCV). Note) The effect of enhancing sensitivity was examined. That is, implantation at the rate of the cells 5 X 1 0 3 cells 96We 1 1 culture plate (Narujenunku Co.), 1 5% C_ ⁇ 2 atmosphere at 0% FBS-containing D MEM, were cultured for 24 hours at 37 ° C for .
  • a WST-1 solution (Takara Shuzo Co., Ltd.) was added to each well at 1 O ⁇ L, and after reacting for 1 hour, the absorbance was measured using a multilabel counter at a measurement wavelength of 620 nm and a reference wavelength of 450 nm.
  • the cell growth was suppressed depending on the dose of GCV.
  • cells into which the luciferase expression plasmid was introduced had no GCV sensitivity-enhancing effect.
  • the storage stability of the plasmid-peptide complex was evaluated.
  • the luciferase expression plasmid concentration prepared in Example 7 is 2 z / gZmL , And opti-MEM prepared so that the peptide concentration of SEQ ID NO: 4 prepared in Example 1 was 5 M, and one week (7 days) prepared immediately before gene introduction. Using each of the cells stored at 4 ° C., the luciferase expression plasmid was introduced into Vero cells according to the method described in Example 9, and the luciferase activity was measured.
  • Fig. 14 shows the relative value of the gene transfer activity of the peptide plasmid complex stored for one week at 4 assuming that the gene transfer activity of the peptide plasmid complex prepared immediately before gene transfer was 100%. . As shown in FIG. 14, the gene transfer activity of the peptide / plasmid complex stored at 4 t for one week was almost equivalent to the gene transfer activity of the complex prepared immediately before gene transfer.
  • Fig. 16 shows the electropherogram. As is clear from the figure, the peptide of SEQ ID NO: 16 was shown to have the ability to impart nuclease resistance to the plasmid.
  • Enzyme Immu no A ssay is performed according to the general method described in a compendium ("Enzyme Immunoassay (Third Edition)", Eiji Ishikawa et al., Medical School, 1987). Was used to measure human Factor VIII bound to phosphatidylserine.
  • an anti-human Factor VIII mouse monoclonal antibody (ESH8: American Diagnostica) as a primary antibody
  • a horseradish peroxidase-labeled anti-mouse IgG antibody (P0260, Dako) as a secondary antibody
  • the absorbance is measured at a measurement wavelength of 450 nm and a reference wavelength of 630 nm using a spectrophotometer (NJ- 2100 type, manufactured by Inuichi Med).
  • the intensity of the affinity of the peptide for phosphatidylserine is the control value (100%) obtained by subtracting the absorbance of the peptide without human Fact0 rVIII and the absorbance of the peptide without human Fact0 rVIII only. and then, IC 5 peptide concentration becomes 0.5 when divided by the control value a value obtained by subtracting the absorbance of Ueru added only various peptides from the absorbance Ueru added by mixing human Fa ctor VIII and peptides.
  • the IC 5 Q value was 1 or less, it was defined as +10, and when it was more than 1 M and 10 M or less, it was defined as 10. In the case of 10 / M or more, it was determined that there was no specific affinity. Table 4 shows the results.
  • the peptide of SEQ ID NO: 1 binds more strongly in the flow cell 2 in which 50% phosphatidylserine / 50% phosphatidylcholine is immobilized, compared to the flow cell 1 in which phosphatidylcholine is immobilized, and has a specific affinity for phosphatidylserine.
  • the peptide of SEQ ID NO: 25, in which the sequence of SEQ ID NO: 1 is randomly replaced binds to the flow cell 1 on which phosphatidylcholine is immobilized and the flow cell 2 on which phosphatidylserine 50% and nophosphatidylcholine 50% are immobilized. No affinity was shown ( Figure 18).
  • Example 22 Correlation between phosphatidylserine expression level and transfection efficiency (Selectivity)
  • the cell surface of phosphatidylserine was determined. The study was carried out using cells with different expression amounts to the cells. That is, the luciferase expression plasmid prepared in Example 7 using the peptide of SEQ ID NO: 1 prepared in Example 1 according to the description of Example 9 using the cells of Vero, A549, and T24. And luciferase activity was measured.
  • the amount of phosphatidylserine expressed outside the cell membrane of various cells Is labeled using FITC-labeled Annexin V (ANNEX I NV-F ITC: Pharmingen) according to the attached instructions, and measured by flow cytometry (FACSC alibur: Becton Dickinson) did. That is, various cultured cells cultured in a culture flask are detached, mixed with a FITC-labeled Annexin V solution, and the FITC fluorescence intensity of the cells is measured by flow cytometry, and the average fluorescence intensity of each cell is determined by the phosphatidyl of the cell line. Serine expression was used. As a result, as shown in Table 5, the amount of phosphatidylserine expressed (the amount of Annexin V binding) was correlated with the gene transfer activity of the peptide vector.
  • plasmid-introducing lipofectin Lipofectin: manufactured by Lifetech Oriental
  • the plasmid was equally introduced into all cells, and phosphatidylcholine was introduced. It was shown that it did not specifically recognize the gillserine.
  • RBL-2H3 rat basophil-derived cultured cells purchased from ATCC
  • sensitized with a DNP mouse monoclonal IgE antibody manufactured by SIGMA
  • DNP-BSA DNP-BSA
  • luciferase gene was introduced into the cells using the peptide of SEQ ID NO: 16 according to the method described in Example 9, and the luciferase activity was measured.
  • RBL-2H3 cells were inoculated into a 24-well plate at a ratio of 3 ⁇ 10 5 cells, and an anti-DNP mouse monoclonal IgE antibody was added to a concentration of 100 ng ZmL, followed by 24 hours. Cultured.
  • DNP-BSA was added to a concentration of 10 ng / mL to induce a degranulation reaction for 45 minutes. After further removing the medium, each well was washed with physiological saline, and the concentration of the luciferase expression plasmid prepared in Example 7 was adjusted to 1 g / mL, and the concentration of the peptide of SEQ ID NO: 16 prepared in Example 1 was adjusted to 2.5 M, and cultured for 5 hours.
  • the medium 15% inactivated FBS-containing MEM (NEAA, N a ⁇ P yr added) was replaced with, 5% C0 2 atmosphere, and cultured for 1 day at 37. Thereafter, the cells were detached, and the luciferase activity was measured by the method described in Example 9. On the other hand, the amount of phosphatidylserine expressed by the degranulation reaction of RBL-2H3 cells was measured by the method described below. That is, RBL was placed on a 6-well culture plate (Nalgenunc).
  • One 2H3 cells were inoculated at a ratio of 1.5 ⁇ 10 6 cells, and an anti-DNP mouse monoclonal IgE antibody was further added to a concentration of 10 OngZmL.MEM containing 15% inactivated FBS (NEAA, Na The cells were cultured at 37 ° C. for 24 hours in a 5% C 2 atmosphere. After washing each well twice with PBS, DNP-BSA was added to 1 OngZmL to induce a degranulation reaction for 45 minutes. After detaching the cells, the cells were labeled using FITC-labeled Annexin V (manufactured by MBL) according to the attached instructions, and the cells were measured by flow cytometry.
  • FITC-labeled Annexin V manufactured by MBL
  • the ability of the peptide to transfer nucleic acid to cells possessed by the peptide was examined using a Meth_A mouse sarcoma cell transplanted ascites tumor model. That is, Meth-A cells were transplanted into the abdominal cavity of BALB / c mice (purchased from Japan Charles River) at 4 ⁇ 10 6 cells, and 4 days later, 30 g of the luciferase expression plasmid prepared in Example 7 was used. The mixture of 113 nmol of the peptide of SEQ ID NO: 16 prepared in Example 1 was intraperitoneally administered. One day later, the mice were sacrificed, Meth-A cells in the peritoneal cavity were collected, and luciferase activity was measured.
  • L ew is Lung C arein oma cells C 57 BL / 6 mice 1 X 1 0 5 and cell transplantation intraperitoneally (Japan Chiya purchased from one Luz Lipa), prepared HSV tk expression in Example 7
  • a mixture of 10 g of the plasmid and the peptide of SEQ ID NO: 16 (40 nmo1) prepared in Example 1 was intraperitoneally administered after cell transplantation, and GCV was administered at a dose of 3 OmgZkgZday from day 1 to 8 after transplantation. It was administered to the eyes.
  • mice As a result, as shown in Figure 22, the average survival time of mice was 14 days in both the saline-administered group and the group administered with GCV alone at a dose of 3 OmgZkgZday, whereas the HSV_tk expression plasmid was In the group to which a mixture of 10 g and 40 nmo 1 of the peptide of SEQ ID NO: 16 was administered and then GCV was administered at a dose of 3 Omg / kgZday, all mice survived even on day 20 after cell transplantation.
  • Toxicity was evaluated by administering the peptide used in the present invention from the tail vein of the mouse. Mice were 5 weeks old and female BALB / c was used. kg. As a result, administration of the peptide (SEQ ID NO: 16) used in the present invention did not affect mice. This indicates that the peptide used in the present invention does not form an aggregate in blood and is highly safe.
  • the complex of plasmid and peptide was modified with activated polyethylene glycol (PEG).
  • PEG polyethylene glycol
  • a PEG-modified plasmid Z peptide complex used for gene transfer with inVitro was prepared by the following method.
  • the luciferase activity of the Vero cells transfected with the PEG-modified complex was equivalent to the luciferase activity of the Vero cells transfected with the non-PEG-modified complex.
  • the gene transfer ability of the plasmid-peptide complex was not reduced even by the PEG modification.
  • mice were sensitized with oval bum in (hereinafter referred to as OVA) by the following method.
  • OVA oval bum in
  • OVA Egg A 1 ub urn in, 5 x Cryst, Seikagaku was prepared with 1.8% aqueous sodium salt solution to a concentration of 32 gZmL.
  • an aluminum hydroxide gel Alu-Ge1-S, manufactured by SERVA was prepared with ultrapure water to make SmgZmL, and the solution was cooled with ice and stirred as described above.
  • the OVA solution was mixed in equal volumes to prepare an OVA / aluminum hydroxide gel solution. Subsequently, OVA sensitization was performed by injecting 500 L of this OVAZ aluminum hydroxide gel solution into the abdominal cavity of a BALBZc mouse (male, 4w, Nippon Charles Riva). The sensitization was performed twice in 5 days.
  • PEG 2 PEG-modified pCMV-LucZ peptide conjugate
  • SEQ ID NO: 16 an unmodified PEG
  • the luciferase activity was clearly higher in the lungs of the mice administered with the PEG-modified conjugate than in the lungs of mice administered with the PEG-unmodified conjugate.
  • Example 30 Identification of PEG-modified PEG-modified peptide present in plasmid-peptide complex
  • the reaction solution (55 OL) of the pCMV-LucZ peptide complex (PEG1) prepared in Example 27 was transferred to a centrifugal ultrafilter Centric on YM-100 (manufactured by Amicon) and heated at 4 ° C. Centrifugation was performed at 100 Oxg for 10 minutes to separate and remove unreacted free peptide and free PEG. Add 500 / iL of physiological saline to the filter, repeat centrifugation at 1,000 xg for 10 minutes at 4 times, and wash three times. Then, add 50% of non-reduced SDS sample buffer (Daiichi Pure Chemicals). The mixture was allowed to stand at room temperature for 5 minutes, and the sample solution (M) containing the pCMV-Luc peptide complex (PEG1) remaining on the ultrafiltration membrane was recovered.
  • this sample solution (M) 25 was subjected to SDS polyacrylamide electrophoresis (20 mA constant current, 90 minutes) using a 5-20% gradient gel ( ⁇ 1 ⁇ 1).
  • the gel after electrophoresis was stained with a silver staining kit II (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • peptide 16 CC and peptide 16 NC were automatically converted to a peptide synthesizer (Applied Biosystems) , 433) according to the attached operation manual. Cleavage, perform deprotection reaction, precipitate peptide in ether, remove ether, dissolve in distilled water and freeze-dry did.
  • Synthetic phospholipid-conjugated PEG with peptide 16CC or peptide 16NC attached to the end of PEG of synthetic phospholipid (DSPE-20MA, manufactured by NOF CORPORATION) to which PEG having a maleimide group is added at the end (Hereinafter referred to as DSPE_16CC and DSPE-16NC, respectively) were prepared. That is, an aqueous solution of DSPE_20 MA was prepared to have a concentration of 6 mo 1 ZmL, and an aqueous solution of peptide 16 CC and an aqueous solution of peptide 16 NC were added at 150 nmo 1 mL, 300 nmo 1 / mL, 600 nmo, respectively.
  • a ribosome preparation modified with a PEG chemically modified peptide was prepared.
  • doxorubicin-containing ribosomes were prepared using negatively charged ribosomes (EL-A-01, manufactured by NOF Corporation) and doxorubicin hydrochloride (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.). That is, ELA-01 is suspended in a 5% glucose solution to 50 ⁇ mo 1 ZmL, and doxorubicin hydrochloride is dissolved in a 5% glucose solution to 5 xmo 1 mL, and EL-A-01 suspension is added. An equal amount of the suspension (30 ⁇ L) and the doxorubicin hydrochloride solution 30 were mixed and heated at 6 Ot: for 5 minutes.
  • DSPE-16 ( ⁇ or 03? £ -16NC prepared in Example 32 was fused to the surface of the liposome containing doxorubicin. That is, the liposome solution containing doxorubicin prepared as described above ( 60 L) was mixed with 75 L of the solution containing DSPE-16 CC or DSPE-16 NC prepared in Example 32, and heated at 60 for 5 minutes.
  • the reacted mixture was centrifuged (10,000 g, 20 minutes, 4), and the supernatant was removed to remove doxorubicin not included in the ribosome. This operation was repeated once more, and finally suspended in 12 O ⁇ L of a 5% glucose solution to obtain liposomes containing doxorubicin modified with PEG chemically modified peptides.
  • the concentration of doxorubicin in the ribosome prepared in Example 33 was quantified. sand That is, the ribosome solution prepared in Example 33 was mixed with 20% of the ribosome solution prepared in Example 3 and a 5% glucose solution 180, diluted 10-fold, and further mixed with 400 L of isopropyl alcohol to disintegrate the ribosome. The amount of doxorubicin released in was measured by absorbance at 470 nm. On the other hand, 5% glucose solutions containing 0, 12.5, 25, 50, and 100 g / mL doxorubicin were prepared as standard samples, and 200 L of each was mixed with 400 L of isopropyl alcohol to prepare a calibration curve. .
  • the cell growth inhibitory effect of doxorubicin-containing ribosomes modified with DSPE-16CC prepared by the method of Example 33 was evaluated in B16-BL6 mouse melanoma cells and Meth-A mouse sarcoma cells.
  • the amount of phosphatidylserine on the cell surface was measured according to the method described in Example 23.
  • B16—BL6 cells and Meth—A cells were treated with FITC-labeled Ann exinV and measured by flow cytometry.
  • the average fluorescence intensity of 816—86 was 735 and Meth_A cells were 114. Yes, B 16—BL 6 cells were higher.
  • B 16- BL6 cells and Me th- A cells each 96 ⁇ El plates implantation at a ratio of 1 x 10 3 cells were cultured 37 ° C, 5% C0 2 1 day under atmosphere.
  • the doxorubicin-containing ribosomes modified with DSPE-16CC were added to each cell at 0, 10, 30, 100, 300, 1000, was added at a dose of 3000 ng / mL, added further 37 ° C, 5% C0 2 2 days after culturing in an atmosphere, WST-1 solution (TAKARA Co.) to each Ueru by 10 L The color was developed.
  • WST-1 solution TAKARA Co.
  • the cell growth-suppressing effect of the doxorubicin-containing ribosome modified with DSPE-16 NC prepared by the method of Example 33 was evaluated in B16-BL6 mouse melanoma cells according to the method described in Example 35. As a result, 2.5%, 5%, and 10% of the total PEG molecules present on the ribosome surface correspond to PEG chemically modified peptides.
  • the cell growth inhibitory effect of ribosomes containing doxorubicin shows that doxorubicin does not contain PEG chemically modified peptides. in comparison with the inclusion ribosome, IC 5. A maximum of about 10-fold enhancement effect was observed (Table 7).
  • the effect of the doxorubicin-containing ribosome modified with DSPE-16NC prepared by the method of Example 33 on prolongation of the survival time of tumor-bearing mice was evaluated in B16-BL6 melanoma cell-bearing mice. That is, 1.0 x 10 6 B 16—BL 6 mouse melanoma cells were implanted intradermally into the flanks of C57 / BL 6 mice (7-week-old, female, Nippon Chillers River) and transplanted. On the 6th day, grouping was performed using the tumor volume as an index. Control (5% glucose only) and each ribosome preparation (dose of 5 mg / kg in terms of doxorubicin) were administered on days 6 and 9 after cell transplantation.
  • the average survival time of the mice receiving only 5% glucose was 30.4 days, and the average survival time of the mice receiving the doxorubicin-containing liposome containing no PEG chemically modified peptide was 39.2 days.
  • the average survival time of tumor-bearing mice treated with doxorubicin-containing ribosomes in which 6% of the total PEG molecules present on the surface correspond to PEG chemically modified peptides was 48.0 days.
  • the amino acid composition of the peptide of SEQ ID NO: 1 is the same as that of the peptide of SEQ ID NO: 25. Function was evaluated according to the method described in Example 9, and phosphatidylserine affinity was evaluated according to the method described in Example 20. As a result, neither nucleic acid introduction ability nor phosphatidylserine affinity was observed. The CD spectrum was measured according to the method described in Example 5. As a result, no single-helix structure was observed in the presence of SDS.
  • SEQ ID NO: 1 The peptide of SEQ ID NO: 1 was subjected to amino acid substitution, and SEQ ID NO: 26, which was a peptide not containing the ⁇ 18 amino acid sequence exhibiting the tetrahedral structure of the present invention '', was evaluated for its ability to introduce nucleic acids according to the method described in Example 9. . As a result, the fluorescence count was less than 10,000, and no nucleic acid introduction ability was observed.
  • the affinity of polylysine (average molecular weight: 11000) for phosphatidylserine was evaluated according to the method described in Example 20. As a result, no phosphatidylserine affinity was observed. Further, the absorbance in the BSA solution was measured according to the method described in Example 4. As a result, the measured value was 1 or more, and the formation of aggregates was confirmed.
  • the present invention it is possible to prepare a complex with a substance that binds to a peptide, which is highly safe (easy operability) and excellent in solubility of the complex. It is possible to provide a novel PEG chemically modified peptide which is excellent in transfer selectivity and has a high transfer efficiency, does not decrease in specific activity due to PEG chemical modification, and a method for producing the same.
  • a complex of a PEG chemically modified peptide and a substance that binds to the peptide and a method for producing the same can be provided.
  • a carrier modified with a PEG chemically modified peptide and a method for producing the same can be provided.
  • the peptide of the present invention has an ability to bind to a nucleic acid and an ability to introduce the nucleic acid into a cell, and thus is useful as a peptide vector.
  • the nucleic acid is given nuclease resistance. To be stable.
  • the peptide has affinity for phosphatidylserine.
  • the site where the so-called immune response reaction such as cell activation by inflammation or immunocompetent cells and Z or disorder or apoptosis is progressing the site where abnormal cell division progresses and the so-called cell becomes cancerous, Areas where blood coagulation reaction or arteriosclerosis progresses to damage the cells making up the blood vessels, areas where the damage reaction of cells by active oxygen progresses, or activation and / or damage reaction of cells by proteolytic enzymes Since the nucleic acid is selectively introduced into cells, tissues and organs at the site of progress, the dosage of the nucleic acid can be reduced, and side effects are reduced.
  • the PEG-modified peptide of the present invention retains the above-mentioned features and effects, and furthermore, by the activated PEG chemical modification, for example, improves the uptake rate of genes and drugs into target cells, improves pharmacological activity, reduces toxicity, etc. Excellent.

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Description

明 細 書 ポリエチレングリコール化学修飾べプチド 技術分野
本発明は、 ェドモンソン ·ホイール ·プロット法によるひ 一ヘリックス 構造モデルにおいて、 交互に配置された 2つの疎水面と 2つの親水面とで構成さ れ、 2つの親水面のうち少なくとも 1つの面が正荷電面である、 18アミノ酸か らなる配列を含む、 ポリエチレングリコール （以下 「PEG」 と略記する） によ り化学修飾されたペプチド （本明細書において、 「P EG化学修飾ペプチド」 と 略記する） 、 及び、 その製造方法に関する。
また、 本発明は、 PEG化学修飾ペプチドと、 ペプチドと結合する物質との複 合体、 及び、 その製造方法に関する。
また、 本発明は、 PEG化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアー、 及 び、 その製造方法に関する。
また、 本発明は、 PEG化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリア一に結 合もしくは包含された物質を細胞内へ送達する方法に関する。 背景技術
病原微生物、 病原性ウィルスやヒトの全遺伝子配列が解明されつつある今日、 得られた遺伝情報を基に疾患の治療を行う試みが盛んに為されるようになり、 そ のひとつとして、 DNAや RNA及びこれらの誘導体、 修飾体や改変体、 いわゆ る核酸を体内に投与する治療法が試みられている。 これは、 核酸を体内に投与す ることによって特定の遺伝子の発現量や特定の生理活性因子の機能発現を増減さ せたり、 あるいは、 導入した核酸がコードする生理活性物質を体内で産生させる ことにより疾患の治療を行うものであるが、 多くの場合、 核酸の細胞内への導入 効率を高める手段としてべクタ一 （導入剤） が用いられている。
これらベクターの代表例の一つは、 ウィルスベクターである。 ウィルスが元来 有する細胞への感染能力を利用するもので、 一例としてレトロウイルスベクター やアデノウイルスベクターを挙げることができ、 応用例として、 アデノシンデァ ミナ—ゼ欠損症の遺伝子治療を目的としたアデノシンデァミナーゼ遺伝子の導入 (B 1 a e s e R. M. e t a l . , S c i e n s e, Vo l. 270, 4 75 ( 1995) ) や癌の治療を目的とした p 53遺伝子の導入 （Sw i s h e r S . G. e t a l . , J . N a t l . C a n c e r I n s t . , Vo l. 91， 763 ( 1999) ) を挙げることができる。 しかしながら、 ゥ ィルスべクタ一は、 細胞への核酸の導入効率は高いものの野生型ウィルス （病原 性ウィルス） の出現や高い抗原性による重篤な免疫応答の誘導が知られており、 安全性の面で大きな不安材料を抱えている。 さらに、 ベクターの作製工程が極め て複雑であり一般的に工業化することが難しいという問題点がある。
もう一つのベクタ一の代表例は、 リポソ一ムベクターである。 荷電した リボソームが細胞に付着して取込まれる性質を利用したもので、 リボソームの中 に核酸が封入されたものや、 核酸の周囲にリボソームが付着塊を形成しているも のが知られている。 リボソームの中に核酸が封入されたものの応用例としては脳 腫瘍の治療を目的としたインターフェロン] 3遺伝子の導入 （M. M i z un o e t a 1. ， Can c e r Re s. , Vo l. 50， 7826 ( 1990)) を挙げることができ、 また、 核酸の周囲にリボソームが付着塊を形成させる方法 の応用例としては細胞工学実験で多用されている培養細胞への遺伝子導入 （F e l gne r P. L. e t a 1 - ， P r o c. Na t l . Ac ad. S c i . U. S. A. , Vo l . 84， 7413 (1987) ) を挙げることができる。 リボソームベクタ一は、 構成成分の主体が天然のリン脂質である場合には安全性 の面ではウィルスベクターよりもはるかに優れているものの、 ベクタ一の作成ェ 程及びベクターと核酸との複合体の作製工程が複雑、 細胞への核酸の導入効率が 低いという問題点がある。 また、 リボソームの構成成分が合成脂質である場合に は細胞への核酸の導入効率及び操作性は改善されるものの毒性が出現するという 問題点がある。 さらに、 いずれのリボソームも、 核酸との複合体形成後の保存性 が悪いために製剤化上の課題を抱えている。
この他のベクターの例としてはぺプチドベクターを挙げることができ、 その一 つとして、 ポリリジン及びその修飾体が研究されている。 このべクタ一は、 正に 荷電したペプチドが負に荷電した核酸と静電的に結合し、 かつ、 細胞にも付着し やすい性質を利用したものである。 しかし、 ポリリジンを単独でペプチド ベクターとして用いる場合、 共有結合したオリゴヌクレオチドは細胞へ導入され る (Lema i t r e M. e t a l . , P r o c. Na t l. Ac ad. S c i . U. S. A. ， Vo l . 84， 648 (1987))が、 静電的に結合した オリゴヌクレオチドやプラスミドを実質的に細胞へ導入するためにはポリリジン を糖や糖蛋白質あるいはリン脂質などで修飾する必要があることが多数の研究か ら明らかにされている （Wu， G. Y. e t a 1. , J . B i o l . C h em. , Vo l. 262, 4429 (1987) 、 Zhou, X. e t a 1., B i o c h i m. B i o p h y s . Ac t a, Vo l . 1065, 8 (1 9 91) 、 L i an , W. W. e t a 1. , B i o c h im. B i opy s. Ac t a, Vo l . 1 279, 227 (1 996) ) 。 また、 未修飾のポリ リジンは動物体内に投与した場合に著しい毒性を示す。
ペプチドベクタ一の他の例としては、 ペプチド単独で核酸のベクタ一となり得 るものが挙げられ、 α—ヘリックス構造を有する両親媒性塩基性ペプチドがその 構造上の特徴からペプチド単独で核酸のベクタ一として導入効率が高いことが示 されている （N i i dome T. e t a l . , J. B i o l . Chem. , Vo l. 272, 15307 ( 1997) ) 。
しかし、 このペプチドは、 エドモンソン ·ホイール ·プロット法による α—へ リックス構造モデルにおいて、 疎水面と荷電面 （親水面） とからなる典型的な二 面構造を示し、 核酸を細胞に導入する能力を維持するためには疎水面の割合を大 きくする必要があり、 その結果、 水溶性が悪いという欠点を有している。
この場合水溶性を改善するために疎水面の割合を小さくすると細胞への核酸導 入能が減少してしまう。 また、 該ペプチドの荷電面である親水面はその割合が小 さく核酸が静電的に結合するとべプチドの親水性が消失し、 ぺプチドと核酸との 複合体は極めて難溶性となり、 結果として実質的に問題となるような凝集体を形 成し易いという欠点をも有している。 さらに、 血清中で容易に凝集してしまうた め、 動物体内に投与した場合に著しい毒性を示す。
故に、 ペプチドベクタ一は、 一般的性状として、 核酸と単に混合するだけで複 合体が形成されるという優れた操作性を有しているが、 特に血液中では容易に凝 集塊を形成し易いという欠点があり、 さらに、 核酸との複合体も溶解性が悪く、 毒性も強く、 実用上の欠点がある。
また、 いずれのベクターであっても核酸を導入する細胞の選択性がなく、 核酸 の導入が希望される細胞と同様に核酸の導入が希望されない細胞にも核酸が導入 されてしまい、 副作用の出現に対する危惧が持たれている。
一方、 ホスファチジルセリンやホスファチジルエタノールアミンは、 細胞表層 を形成する脂質二重層の構成成分に含まれるァミノリン脂質であり、 脂質二重層 の外層と内層に含まれる比率が細胞の状態によって変化するリン脂質である。 例えば、 血液凝固反応が進展している部位が代表例として示されるように、 細 胞が何らかの刺激を受けたときに細胞膜の脂質二重層の外層に含まれる割合が増 加するリン脂質であり （A l an J. S c h r o i t e t a 1. , B i o c h im. B i ophy s. Ac t a, Vo l. 1071, 313 (1991) ) 、 炎症若しくは免疫担当細胞による細胞の活性化、 及び Z又は障 害若しくはアポトーシス等のいわゆる免疫応答反応が進展している部位、 異常な 細胞分裂が進展していわゆる細胞が癌化している部位、 血液凝固反応若しくは動 脈硬化が進展して血管を構成する細胞が障害されている部位、 活性酸素による細 胞の障害反応が進展している部位あるいは蛋白質分解酵素による細胞の活性化及 び Z又は障害反応が進展している部位、 等における細胞、 例えば、 損傷を受けた り変性したり活性化された、 いわゆる正常でない細胞において脂質二重層の外層 に含まれる割合が増加すると考えられるリン脂質である。 また、 ホスファチジル セリンは、 アレルゲンが細胞表面の I gE抗体に結合してアレルギー反応 （脱顆 粒反応） が惹起された細胞 （例えば肥満細胞や好塩基球） においても、 顆粒に含 まれる成分として脱顆粒の際に細胞表面に表出するリン脂質であることが知られ ている （Ma r t i n, S. e t a l . , I n t. Ar c h. A l l e r g y and Immuno l . ， Vo l . 123， 249 (2000) ) 。 なお、 最近の知見では、 アポトーシス誘導物質 （例えば抗癌剤） などを投与さ れた細胞や放射線照射を受けた細胞で p 53などのアポトーシス関連遺伝子が関 与したシグナルが伝達された細胞であっても、 薬剤耐性をもつ細胞 （抗癌剤耐性 癌細胞など） は、 アポトーシスを生じることなく DNA修復が行われて生存して おり、 その際、 細胞表層にホスファチジルセリンを表出していることが報告され ている （Ge s ke, FJ. e t a 1. , Ce l l De a t h D i f f e r . , Vo l. 8, 182 (2001) ) 。
ところで、 生理活性を有するぺプチドゃポリペプチドを P E Gで修飾すること は、 生体内でペプチドやポリペプチドの機能を発揮させる上で有用な手段である ことがこれまでの多数の研究から明らかにされている。 これは、 PEGで修飾す ることにより、 ペプチドやポリペプチドの親水性が上昇して生体内蛋白質との相 互作用が減弱することに加えて、 網内系に認識されにくくなるためにマクロ ファージ等に捕獲されにくくなる結果体内動態が改善され、 生体内での生理活性 の維持 ·持続がもたらされるためと推定されている。 具体的に PEG修飾の有用 性を例示すれば、 アデノシンデァミナ一ゼ （ADA) を P EGで修飾した PEG— ADAは ADA欠損症の治療において臨床的に有効であることが示され ている例 （He r s h f i e l d M. S. e t a 1 , N. Eng l . J . Me d. , 316, 589 (1987) ) や、 インターフェロン （ I FN) を P EGで修飾することにより生体内における抗ウィルス作用が増強される例 （P e r r y CM e t a 1 , D r ug s, 61, 2263 (2001) ) を 挙げることができる。
また、 生理活性を有するペプチドやポリペプチドのみならず、 ドラッグデリバ リーを目的として用いられる薬剤のキャリアーを PEGで修飾することも有用で あることが明らかにされつつある （丸山一雄， 日本臨床， 80, 632 (19 98) ) 。 例えば、 リボソームを PEGで修飾すると、 ペプチドやポリペプチド を PEGで修飾した場合と同様に、 生体内で保持される時間が延長されるばかり でなく、 網内系に認識されにくくなるために抗原性が減弱するという効果が現れ ることが明らかにされている。 具体的に薬剤のキヤリア一を P E Gで修飾するこ との有用性を例示すれば、 抗癌剤であるドキソルビシンを包含させたリボソーム を P E Gで修飾すると、 未修飾の場合に比して薬剤の効果が高まることが示 されている （S a k a k i b a r a T. e t a 1. , C a n c e r Re s. , 56, 3743 (1996) ) 。
一方、 副作用の軽減および薬効の上昇を目的として、 PEGで修飾された キャリア一に部位指向性を付与する試みがなされている。 この具体例としては、 P E Gで修飾されたキヤリア一を更に P E G修飾抗体で修飾する方法が例示され る (Ma r uyama K. e t a 1. , B i o c h im. B i o ph y s . Ac t a, 1234, 74 (1995) ) 。
リポソーム以外の例としては、 遺伝子の導入に用いられる P E G化ポリリジン が挙げられる （Le e M. e t a l . , Mo l . The r. , 4, 339 ( 2001) ) 。
ポリリジンはそのままでは毒性が極めて強いが PEG修飾を施すと毒性が減弱 することが知られている。
このように、 PEG修飾は有用性のある技術であるが、 修飾後のペプチドゃポ リペプチドの比活性が低下してしまうという課題を抱えている。 これは、 活性中 心も PEG化されてしまうことによるものである。 例えば、 アルギナーゼを PEG化すると比活性は 65 %にまで減少してしまうことが示されている （S a V o c a K. V. e t a 1 , B i o c h im. B i ophy s. Ac t a, 578, 47 (1979) ) 。
したがって、 比活性を低下させることなく PEG修飾することができれば有用 性がさらに高まることが期待される。
また、 PEGで修飾されたキャリアーに部位指向性を付与する手段として PEG修飾抗体を用いる場合、 抗体は PEG分子による立体障害を受け易く効果 が現れにくい、 という課題を抱えている。 したがって、 より有用な部位指向性を 付与する手段の開発が望まれている。
以上より、 本発明の課題は、 安全性が高く、 ペプチドと結合する物質との複合 体の作製が容易 （優れた操作性） であり、 複合体の溶解性に優れた、 細胞 へのペプチドと結合する物質の導入選択性が優れ、 導入効率が高いベクターとな る、 PEG化学修飾による比活性が低下しない新規 PEG化学修飾ペプチド、 及 び、 その製造方法を提供することである。
また、 本発明の課題は、 PEG化学修飾ペプチドと、 ペプチドと結合する物質 との複合体、 及び、 その製造方法を提供することである。
また、 本発明の課題は、 薬剤を結合もしくは包含するキャリアーに部位指向性 を付与するための P EG化学修飾べプチド、 該ぺプチドによって修飾された キャリアー、 及び、 その製造方法を提供することである。
また、 本発明の課題は、 P E G化学修飾ペプチドによって修飾されたキヤ リァ一に結合もしくは包含された物質を細胞内へ送達する方法を提供することで ある。 発明の開示
本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、
①ぺプチド （後述する本発明に用いるぺプチド及び本発明の P E G化学修 飾ペプチド） と結合する物質 （本明細書において、 「ペプチド結合物質」 と略記 する） と結合し、 特定のリン脂質に親和性を有するペプチドは、 細胞へのぺプチ ドと結合する物質の導入効率が高く、 毒性が低く、 溶解性にも優れた、 ペプチド 結合物質のベクターとなり得ること、
②アミノ酸配列から規定される構造上の特徴を有するぺプチドは、 特定のリン 脂質への集積性が高く、 特定の細胞へ、 ペプチド結合物質を導入する選択性に優 れること、
③また、 当該ペプチドを P E Gによって化学修飾することにより、 細胞への、 ペプチド結合物質の導入効率が、 より高くなること、
④また、 当該べプチドを P E Gによって化学修飾することにより得られる P E G化学修飾べプチドは、 薬剤を結合もしくは包含するキヤリァ一に部位指向 性を付与するための素子と成り得ること
⑤また、 当該 P E G化学修飾べプチドによって修飾されたキヤリァ一に結合も しくは包含された物質は特定の細胞へ効率よく送達されることを見出し、 本発明 を完成した。
すなわち、 本発明により、 下記 （1) 〜 （9) または （21) の PEG化学修 飾ペプチド、 （10) 〜 （19) または （24) の PEG化学修飾ペプチドとぺ プチド結合物質との複合体、 （20)、 (22) または （23) のそれらの製 造方法、 （25) または （27) の PEG化学修飾ペプチドによって修飾された キャリア一、 （26) のそれらの製造方法、 （28) の送達方法が提供される。
(1) 本発明の第 1態様は、
18アミノ酸からなる配列を含む、 ポリエチレングリコール （PEG) 化学修 飾ペプチドであって、
前記 18アミノ酸からなる配列が、 エドモンソン ·ホイール ·プロット法によ る α—ヘリックス構造モデルにおいて、 交互に配置された二つの疎水面と二つの 親水面の 4つの面から構成され、
前記疎水面の 1つが 5〜 7アミノ酸から構成され、 かつ疎水性アミノ酸の構成 比率が 80モル％以上であり、 . 前記親水面の 1つが 5〜6アミノ酸から構成され、 かつ親水性アミノ酸の構成 比率が 80モル％以上であって、 かつアルギニン又はリジンから選ばれるァミノ 酸の構成比率が 50モル％以上であり、
前記疎水面の別の 1つが 2〜 4疎水性ァミノ酸から構成され、
前記親水面の別の 1つが 3〜 5アミノ酸から構成され、 かつ親水性ァミノ酸の 構成比率が 80モル％以上である、 PEG化学修飾ペプチド。
(2) 全アミノ酸数が 20以上であって、 両端が N末端及び C末端であり、 両 端のアミノ酸を除いた任意の連続した 18アミノ酸が、 前記 18アミノ酸からな る配列を示す （1) に記載の PEG化学修飾ペプチド。
(3) N末端及び C末端のアミノ酸が親水性アミノ酸である （1) 又は （2) に記載の P E G化学修飾べプチド。
(4) 前記 18アミノ酸からなる配列が下記のアミノ酸配列の中の任意の連続 した 18アミノ酸配列である （1) 〜 （3) のいずれかに記載の PEG化学修飾 ペプチド。
X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X 10-X11-X12-X13-X14-X 15-X 16-X 17-X 18-X 19-X20- X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36
但し、
「X4、 X8、 XI 1 、 X15 、 及び X19 」 、 「X8、 XI 1 、 X15 、 X19 、 及び X22 J 、 「XII 、 X15 、 X19 、 X22 、 及び X26 」 、 「X15 、 X19 、 X22 、 X26 、 及び X29 」 、 並びに 「X19 、 X22 、 X26 、 X29 、 及び X33 」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
X3、 X10 、 X12 、 X21 、 X28 、 及び X30 はそれぞれ疎水性アミノ酸、 中性親水 性ァミノ酸又は塩基性親水性ァミノ酸のいずれかであり、
「X2、 X5、 X9、 X13 、 及び X16 」 、 「X5、 X9、 X13 、 X16 、 及び X20 」 、 「X9、 X13 、 X16 、 X20 、 及び X23 」 、 「X13 、 X16 、 X20 、 X23 、 及び X27 」 、 「XI 6 、 X20 、 X23 、 X27 、 及び X31 」 、 並びに 「X20 、 X23 、 X27 、 X31 、 及び X34 」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上は中性親水 性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、 かつそのうち少なくとも 3ァミノ 酸はアルギニン又はリジンであり、
X6、 X17 、 X24 、 及び X35 はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、 X7、 X14 、 X18 、 X25 、 X32 、 及び X36 はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩 基性親水性アミノ酸である。
( 5 ) 前記 1 8アミノ酸からなる配列を含む、 P E G化学修飾ペプチドの ペプチド部分が、 下記のアミノ酸配列からなる （1 ) 〜 （4 ) のいずれかに記載 の P E G化学修飾べプチド。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X1 1-X12-X13-X14-X15-X16-X17- XI 8- XI 9- X20 -X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37 但し、
XI及び X37 は親水性アミノ酸であり、
「X4、 X8、 Xl l 、 X15 、 及び X19 」 、 「X8、 Xl l 、 X15 、 X19 、 及び X22 」 、 「XI I 、 X1 5 、 X1 9 、 X22 、 及び X26 」 、 「X1 5 、 X19 、 X22 、 X26 、 及び X29 」 、 並びに 「X19 、 X22 、 X26 、 X29 、 及び X33 」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
X3、 X10 、 X12 、 X21 、 X28 及び X30 はそれぞれ疎水性アミノ酸、 中性親水性 アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
ΓΧ2, X5、 X9、 X13 、 及び X1 6 」 、 「X5、 X9、 X13 、 X1 6 、 及び X20 」 、 「X9、 X13 、 X1 6 、 X20 、 及び X23 」 、 「X 1 3 、 X1 6 、 X20 、 X23 、 及び X27 」 、 「XI 6 、 X20 、 X23 、 111 、 及び X31 」 、 並びに 「X20 、 X23 、 X27 、 X31 、 及び X34 」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上は中性親水 性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、 かつ、 そのうち少なくとも 3 アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
X6、 X17 、 X24 、 及び X35 はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、 X7、 X14 、 X18 、 X25 、 X32 、 及び X36 はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩 基性親水性アミノ酸である。
なお、 X2から X36 までのアミノ酸は少なくとも連続して 1 8アミノ酸が保存さ れる限りアミノ酸が欠失、 付加、 挿入又は置換されてもよい。
( 6 ) 前記 X1〜X37 が下記のアミノ酸である （5 ) に記載の P E G化学 修飾ペプチド。
XIはトレオニンであり、
X37 はセリンであり、
X2、 X5、 X9、 X20 、 X23 、 及び X27 はそれぞれアルギニン又はリジンであり、 X3及び X21 はそれぞれチロシン、 フエ二ルァラニン、 セリン又はアルギニンの いずれかであり、
X4、 X17 、 X22 、 及び X35 はそれぞれロイシンであり、
X6、 X15 、 X24 、 及び X33 はそれぞれロイシン又はイソロイシンであり、 X7、 X13 、 X25 、 及び X31 はそれぞれヒスチジン又はアルギニンであり、 X8及び X26 はそれぞれプロリンであり、
X10 及び X28 はそれぞれセリン、 アルギニン又はロイシンのいずれかであり、 XI I 及び X29 はそれぞれトリブトファン又はロイシンであり、
X12 及び X30 はそれぞれバリン、 ロイシン又はセリンのいずれかであり、 X14及び X32 はそれぞれグルタミン、 ァスパラギン又はアルギニンのいずれか であり、
X16 及び X34 はそれぞれァラニン又はアルギニンであり、
X18 はアルギニン、 リジン又はセリンのいずれかであり、 X19 はロイシン又はトレォニンであり、
X36 はアルギニン又はセリンである。
なお、 X2から X36 までのアミノ酸は少なくとも連続して 18アミノ酸が保存さ れる限りアミノ酸が欠失、 付加、 挿入又は置換されてもよい。
(7) 前記 18アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドのぺプ チド部分が、 配列番号 1〜24のいずれかのアミノ酸配列からなる、 （1) 〜 （ 6 ) のいずれかに記載の P E G化学修飾べプチド。
(8) 前記 18アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドのぺプ チド部分が、 配列番号 16又は 19のアミノ酸配列からなる、 （1) 〜 （6) の いずれかに記載の PEG化学修飾ペプチド。
(9) 前記 18アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドの PE G部分の分子量が、 約 20 ODa〜約 100， 000 Daである （1) 〜 （8) のいずれかに記載の P E G化学修飾べプチド。
(10) 本発明の第 2態様は、
以下の 18アミノ酸からなる配列を含む PEG化学修飾ペプチド、 及び、 ぺプ チドと結合する物質を含有する複合体であって、
前記 18アミノ酸からなる配列力 エドモンソン ·ホイール ·プロット法によ るひ一ヘリックス構造モデルにおいて、 交互に配置された二つの疎水面と二つの 親水面の 4つの面から構成され、
前記疎水面の 1つが 5〜 7アミノ酸から構成され、 かつ疎水性アミノ酸の構成 比率が 80モル％以上であり、
前記親水面の 1つが 5〜 6アミノ酸から構成され、 かつ親水性ァミノ酸の構成 比率が 80モル％以上であって、 かつアルギニン又はリジンから選ばれるァミノ 酸の構成比率が 50モル％以上であり、
前記疎水面の別の 1つが 2〜 4疎水性ァミノ酸から構成され、
前記親水面の別の 1つが 3〜 5アミノ酸から構成され、 かつ親水性ァミノ酸の 構成比率が 80モル％以上である、 複合体。
(1 1) 全アミノ酸数が 20以上であって、 両端が N末端及び C末端であり、 両端のアミノ酸を除いた任意の連続した 18アミノ酸が、 前記 18アミノ酸から なる配列を示す （10) に記載の複合体。
(12) N末端及び C末端のアミノ酸が親水性アミノ酸である （10) 又は （ 1 1) に記載の複合体。
(13) 前記 18アミノ酸からなる配列が下記のアミノ酸配列の中の任意の連 続した 18アミノ酸配列である （10) 〜 （12) のいずれかに記載の複合体。
X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 -XI 2- XI 3- XI 4-X15-X16-X17-X18-X19- X20 - X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36 但し、
「X4、 X8、 XI 1 、 X15 、 及び X19 」 、 「X8、 Xll 、 X15 、 X19 、 及び X22 」 、 「XII 、 X15 、 X19 、 X22 、 及び X26 」 、 「X15 、 X19 、 111 、 X26 、 及び X29 」 、 並びに 「X19 、 X22 、 X26 、 X29 、 及び X33 」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
X3、 X10 、 X12 、 X21 、 X28 、 及び X30 はそれぞれ疎水性アミノ酸、 中性親水 性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「X2、 X5、 X9、 X13 、 及び X16 」 、 「X5、 X9、 X13 、 X16 、 及び X20 」 、 「X9、 X13 、 X16 、 X20 、 及び X23 」 、 「X13 、 X16 、 X20 、 X23 、 及び X27 」 、 「XI 6 、 X20 、 X23 、 X27 、 及び X31 」 、 並びに 「X20 、 X23 、 X27 、 X31 、 及び X34」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上は中性親水 性ァミノ酸又は塩基性親水性ァミノ酸であり、 かつそのうち少なくとも 3ァミノ 酸はアルギニン又はリジンであり、
X6、 XI 7 、 X24 、 及び X35 はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
X7、 X14 、 X18 、 X25 、 X32 、 及び X36 はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩 基性親水性アミノ酸である。
(14) 前記 1 8アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドのぺ プチド部分が、 下記のアミノ酸配列からなる （1 0) 〜 （1 3) のいずれかに記 載の複合体。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20 -X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37 但し、
XI及び X37 は親水性アミノ酸であり、
「X4、 X8、 XI 1 、 X15 、 及び X19 」 、 「X8、 XI 1 、 X15 、 X19 、 及び X22 」 、 「XII 、 X15 、 X19 、 X22 、 及び X26 」 、 「X15 、 X19 、 121 、 X26 、 及び X29 」 、 並びに 「X19 、 X22 、 X26 、 X29 、 及び X33 」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
X3、 X10 、 X12 、 X21 、 X28 及び X30 はそれぞれ疎水性アミノ酸、 中性親水性 ァミノ酸又は塩基性親水性ァミノ酸のいずれかであり、
「Π、 X5、 X9、 X13 、 及び X16 」 、 「X5、 X9、 X13 、 X16 、 及び Χ20 」 、 「X9、 X13 、 X16 、 X20 、 及び X23 」 、 「X13 、 X1 6 、 X20 、 X23 、 及び X27 」 、 「XI 6 、 X20 、 X23 、 X27 、 及び X31 」 、 並びに 「X20 、 X23 、 X27 、 X31 、 及び X34 」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上は中性親水 性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、 かつ、 そのうち少なくとも 3 アミノ酸はアルギニン又はリジンであり、
X6、 X17 、 X24 、 及び X35 はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
X7、 X14 、 X18 、 X25 、 X32 、 及び X36 はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩 基性親水性アミノ酸である。
なお、 X2から X36 までのアミノ酸は少なくとも連続して 1 8アミノ酸が保存さ れる限りアミノ酸が欠失、 付加、 挿入又は置換されてもよい。
( 1 5 ) 前記 X1〜X37 が下記のアミノ酸である （1 4 ) に記載の複合体。
XIはトレオニンであり、
X37 はセリンであり、
X2、 X5, X9、 X20 、 X23 、 及び X27 はそれぞれアルギニン又はリジンであり、 X3及び X21 はそれぞれチロシン、 フエ二ルァラニン、 セリン又はアルギニンの いずれかであり、
X4、 X17 、 X22 、 及び X35 はそれぞれロイシンであり、
X6、 X15 、 X24 、 及び X33 はそれぞれロイシン又はイソロイシンであり、 X7、 X13 、 X25 、 及び X31 はそれぞれヒスチジン又はアルギニンであり、 X8及び X26 はそれぞれプロリンであり、
X10及び X28 はそれぞれセリン、 アルギニン又はロイシンのいずれかであり、 XI I 及び X29 はそれぞれトリブトファン又はロイシンであり、 X12 及び X30 はそれぞれバリン、 ロイシン又はセリンのいずれかであり、 X14 及び X32 はそれぞれグルタミン、 ァスパラギン又はアルギニンのいずれか であり、
X16 及び X34 はそれぞれァラニン又はアルギニンであり、
X18 はアルギニン、 リジン又はセリンのいずれかであり、
X19 はロイシン又はトレォニンであり、
X36 はアルギニン又はセリンである。
なお、 X2から X36 までのアミノ酸は少なくとも連続して 18アミノ酸が保存さ れる限りアミノ酸が欠失、 付加、 挿入又は置換されてもよい。
(16) 前記 18アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドのぺ プチド部分が、 配列番号 1〜 24のいずれかのアミノ酸配列を含む、 （ 10 ) 〜 (1 5) のいずれかに記載の複合体。
(17) 前記 18アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドのぺ プチド部分が、 配列番号 16又は 19のアミノ酸配列を含む （10) 〜 （1 5) のいずれかに記載の複合体。
(18) ペプチドと結合する物質が核酸である、 （10) 〜 （17) のいずれ かに記載の複合体。
(19) 前記 18アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドの P E G部分の分子量が、 約 200Da〜約 100, O O ODaである （10) 〜 （ 18) のいずれかに記載の複合体。
(20) 18アミノ酸からなる配列を含むペプチドと活性化ポリエチレンダリ コールとを反応させる、 （1) 〜 （9) のいずれかに記載の PEG化学修飾ぺプ チドの製造方法。
(21) (20) の方法により製造される、 ポリエチレングリコール （PEG) により化学修飾されたべプチド。
(22) a) 1 8アミノ酸からなる配列を含むペプチドと、 活性化ポリ エチレングリコール （PEG) とを反応させる工程、
b) 前記 a) により得られる PEG化学修飾ペプチドと、 ペプチドと結合する 物質とを反応させる工程、
よりなる、 （10) 〜 （19) のいずれかに記載の複合体の製造方法。
(23) a) 18アミノ酸からなる配列を含むペプチドと、 ペプチドと結合す る物質とを反応させる工程、
b) 前記ペプチドと前記ペプチドと結合する物質との反応物を、 活性化ポリエ チレングリコール （PEG) と反応させる工程、
よりなる、 （10) 〜 （19) のいずれかに記載の複合体の製造方法。
(24) (22) 又は （23) の方法により製造される、 ポリエチレングリコ一 ル （PEG) により化学修飾されている PEG化学修飾ペプチドとペプチドと結 合する物質との複合体。
(25) (1) 〜 （8) のいずれかに記載の PEG化学修飾ペプチドによって 修飾されたキャリアー。
(26) a) 18アミノ酸からなる配列を含むペプチド、 若しくは 18ァミノ 酸からなる配列を含むペプチドの N末端または C末端にシスティンが結合したぺ プチドと、 活性化 PEGとを反応させる工程、
b) 前記 a) により得られる反応物とキャリアーとを反応させる工程、 若しく は、 前記 a) により得られる反応物を構成要素としてキャリアーを構築する 工程、
よりなる、 （2 5) に記載の P E G化学修飾ペプチドによって修飾された キャリアーの製造方法。
(27) (26) の方法により製造される PEG化学修飾ペプチドによって修 飾されたキャリアー。
(28) (25) に記載の P E G化学修飾ペプチドによって修飾された キヤリァ一に結合もしくは包含された物質を細胞内へ送達する方法。 図面の簡単な説明
図 1の （A) ， （B) ， （C) は、 エドモンソン ·ホイール ·プロット法によ る α—へリックス構造モデルの概念図である （但し、 口で囲んだアミノ酸は疎水 性アミノ酸、 〇で囲んだアミノ酸は塩基性親水性アミノ酸、 囲みのないアミノ酸 は中性親水性アミノ酸である （以下の図面において同じ） ） 。
図 2は、 本発明に用いるペプチドの 1 8アミノ酸配列の四面構造の一例を示す 図である。
図 3の （A) , (Β) は、 各面への割り振りが異なる本発明に用いるペプチド の四面構造の例を示す図である。
図 4の （a) は （C 1) を表し、 （b) は （C2) を表す。 （C 1) 及び （C 2 ) は、 各面への割り振りが異なる本発明に用いるペプチドの四面構造の例を示 す図である。
図 5の （A) ， (B) は、 本発明の 18アミノ酸配列を含むペプチドの四面構 造の例を示す図である。
図 6の （a) は （C) を表し、 （b) は （D) を表す。 （C) 及び （D) は、 本発明の 18アミノ酸配列を含むぺプチドの四面構造の例を示す図である。 図 7の （a) は、 SDS (―) の CDスペクトル測定による平均残基楕円率曲 線を示した図であり、 （b) は、 SDS ( + ) の CDスペクトル測定による平均 残基楕円率曲線を示した図である。
図 8の （a) は、 SDS (-) の CDスペクトル測定による平均残基楕円率曲 線を示した図であり、 （b) は、 SDS ( + ) の CDスペクトル測定による平均 残基楕円率曲線を示した図である。
図 9の （a) は、 SDS (—） の CDスペクトル測定による平均残基楕円率曲 線を示した図であり、 （b) は、 SDS ( + ) の CDスペクトル測定による平均 残基楕円率曲線を示した図である。
図' 10は、 配列番号 1のぺプチドとオリゴヌクレオチドの混合物の電気泳動図 である。
図 11は、 配列番号 1のペプチドとプラスミドの混合物の電気泳動図である。 図 12は、 配列番号 1のペプチドの有無による、 細胞内へのプラスミドの導入 能を、 プラスミドが発現するルシフェラ一ゼ活性を指標として表した図である。 図 13は、 配列番号 16のペプチドを用いて HSV— t k遺伝子を含むプラス ミドを細胞内に導入すると G C V感受性が亢進することを示した図である。 図 14は、 配列番号 1のべプチドが有する細胞内へのプラスミドの導入能を、 プラスミドとの複合体を 4でで保存する前後において、 プラスミドが発現するル シフェラーゼ活性を指標として表した図である。 図 1 5は、 配列番号 1のペプチドとオリゴヌクレオチドの混合物をヌクレア一 ゼ処理した後のオリゴヌクレオチドの電気泳動図である。
図 1 6は、 配列番号 1 6のペプチドとプラスミドの混合物をヌクレアーゼ処理 した後のプラスミドの電気泳動図である。 コントロールはヌクレアーゼ未処理の プラスミドである。
図 1 7は、 配列番号 1のべプチドとホスファチジルセリンの特異的親和性をビ ァコア 2 0 0 0を用いて測定した図である。
図 1 8は、 配列番号 2 5のペプチドがホスファチジルセリンにもホスファチジ ルコリンにも親和性を示さないことをビアコア 2 0 0 0を用いて測定した図であ る。
図 1 9は、 細胞を脱顆粒刺激すると細胞表面にホスファチジルセリンが表出す ることをフローサイトメトリ一を用いて示した図である。
図 2 0は、 配列番号 1 6のペプチドは、 脱顆粒反応が起きて細胞表面に ホスファチジルセリンが表出した細胞により多く遺伝子導入することを示した図 である。
図 2 1は、 配列番号 1 6のペプチドが、 マウスへ移植した癌細胞内へプラスミ ドを導入する能力があることを、 プラスミドが発現するルシフェラーゼ活性を指 標として表した図である。
図 2 2は、 配列番号 1 6のペプチドを用いて H S V— t k遺伝子を含むプラス ミドをマウスに移植した癌細胞内に導入して G C V投与するとマウスの生存期間 が延長することを示した図である。
図 2 3は、 V e r o細胞を用いて、 P E G修飾したプラスミド Zペプチド複合 体と、 同 P E G未修飾体の遺伝子導入能を比較した図である。
図 24は、 アナフィラキシーショックマウスを用いて、 P EG修飾した プラスミド ペプチド複合体と、 同 PEG未修飾体の遺伝子導入能を比較した図 である。
図 25は、 SDS— PAGEによって、 P E G修飾したプラスミド ペプチド 複合体中に存在する P E G修飾ペプチドを同定した図である。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 より詳細に本発明を説明する。
本発明の PEG化学修飾ペプチド （本発明の第一の態様） は、 ェ
ホイール'プロット法 （Edmund s on, A. B. e t a 1. , B i op hy s . J . ， Vo l . 7, 121 (1967) ) による α—へリックス構造モ デルにおいて、 交互に配置された二つの疎水面 （側面 A、 側面 C) と二つの親水 面 （側面 B、 側面 D) の 4つの面から構成され、 二つの親水面 （側面 B、 側面 D) のうち少なくとも 1つ （側面 B) が正荷電面である 18アミノ酸からな る配列を含む、 PEGにより化学修飾されたペプチド （以下、 「P EG化学修飾 ペプチド」 と略記する） である。
本発明の PEG化学修飾ペプチドは、 後に詳述する、 上記 18アミノ酸からな る配列を含むペプチド （以下、 「本発明に用いるペプチド」 と略記する） を、 例 えば、 活性化 PEGで化学修飾して得られる。
PEGにより化学修飾する方法は、 特に限定されず、 例えば、 活性化 PEGを 用いる方法、 PEGと活性化剤等を用いる方法等が挙げられる。 化学修飾する方法に用いられる活性化 PEGは、 活性化 P EGであれば特に限 定されず、 直鎖構造又は分岐鎖構造のものであってもよく、 例えば、 mPEG— SPA (s uc c i n imi dy l e s t e r o f me t hoxy p o 1 y (e t hy l en e g l y c o l) r op i on i c c i d, S h e a r wa t e r社製） 、 や同社製の mP E G— S B A (s u c c i n i m i dy l e s t e r o f mPEG b u t a n o i c ac i d) , mP E G— SS (s u c c i n imi dy l e s t e r o f mP E G s u c c i n a t e) 、 mP E G— S CM (s uc c i n i m i d y 1 e s t e r o f c a r boxyme t hy l a t e d mPEG) , mPEG-BTC (b e n z o t r i a z o l e c a r bona t e d e r i va t i v e o f mP EG) 、 mP EG- e pox i de, mPEG— CD I (c a r bony l d i imi d a z o l e— ac t i v a t e d mPEG) 、 mPEG— NP C ( p— n i t r o p h e ny 1 m P E G c a r b o n a t e) 、 m P EG— a l d e hyd e, mPEG— I s o c y an a t e, mP E G— m a 1 e imi d e, mPEG-OPSS (mPEG o r t hopy r i dy l d i s u 1 f i d e) 等の活性化 P E G等が挙げられる。 また PEGは、 公知の方 法で合成したものを用いることもできる。
また、 化学修飾する方法に用いられる活性化 PEGは、 PEGにリン脂質が結 合したものでもよく、 例えば、 MAL— mPEG— DSPE (ma 1 e imi d e mod i f i e d and d i s t e a r oy l pho s ph a t i dy l e t h ano l ami n e mod i f i e d mP E G) 、 NH S— mP E G— DSPE (N-hyd r oxy s uc c i n im i dy l c a r bon a t e mo d i f i e d mP E G_D S P E) 等の活性化 P E G等が挙げら れる。
P E Gの重量平均分子量は、 約 200Da〜約 100, O O ODaであればよ く、 好ましくは約 1, O O OD a〜約 50， 000 D a、 さらに好ましくは 約 2， O O ODa〜約 20， O O ODaである。
この範囲であれば、 活性化 PEGはペプチドと反応しても、 PEG化修飾ぺプ チドは元のペプチドの活性を維持し、 かつ溶解性を更に上げる、 钪原性を減弱す る、 毒性を減弱するなど、 より好ましい性質を付与することが可能である。
PEGと活性化剤等により化学修飾する方法に用いられる PEG、 活性化剤は 通常用いられるものであれば、 任意に選択して用いることができる。
本発明の PEG化学修飾ペプチドにおける PEGの修飾 （結合） 位置は、 特に 限定されず、 何れであってもよいが、 本発明に用いるペプチドが核酸等のぺプチ ド結合物質及びホスファチジルセリン等と結合する位置以外の位置であるのが好 ましく、 その N末端、 C末端又は側鎖の位置がより好ましい。
ペプチドの所望する位置に PEGを導入する方法としては、 公知の方法を用い ることができる。
また、 本発明に用いるペプチドに対する、 PEGの修飾量 （結合量） も特に限 定されない。
本発明に用いるぺプチドを活性化 P E Gで修飾することにより、 本発明に用い るペプチドが本来有する特徴、 性質等 （詳細は後述する） をより優れたものとす ることができる。
具体的には、 本発明に用いるペプチドに対して、 例えば、 標的細胞への遺伝子 や薬剤の取り込み率の向上、 薬理活性の向上、 毒性の低減等の優れた効果を有す る。
次に、 本発明に用いるペプチドである、 1 8アミノ酸からなる配列を含むぺプ チドの必須構造である 「1 8アミノ酸からなる配列」 について図を用いて説明す る。
エドモンソン ·ホイール ·プロット法は α—ヘリックスの中心線を基点とした アミノ酸の相対位置を示すモデルであって、 1 8アミノ酸で一巡し、 1 9番目の アミノ酸が 1番目のアミノ酸と同位置に来るように表記する。
この表記法によって描かれるモデルでは、 通常、 基点となる第一番目のァミノ 酸が時計の 1 2時の位置に来るよう記載されるが、 アミノ酸配列が同一である限 り表記上の起点が異なっても図上の各アミノ酸の相対的位置は変わらず、 例えば 図 1において、 （A) 、 (Β ) 、 ( C) はいずれも本質的に同一である。
以下、 本明細書において、 「面」 とは、 モデルで互いに連続して隣接するアミ ノ酸から構成される領域を言う。 面は、 構成アミノ酸数が 1以上であればよく、 好ましくは、 構成アミノ酸数が 2以上である。
「互いに連続して隣接する」 とは、 例えば図 1において、 1番目と 1 2番目の アミノ酸の位置関係や、 1 5番目、 8番目、 1番目及び 1 2番目の 4アミノ酸の 位置関係を指す。 一方、 1番目と 1 0番目のアミノ酸の位置関係は互いに連続し ていない。 また、 1番目と 5番目のアミノ酸の位置関係は 「互いに連続して隣接 する」 位置関係ではないが、 1 2番目のアミノ酸を含むことにより同一の面を形 成してもよい。
「疎水面」 とは、 実質的に疎水性アミノ酸を多く含む面である。 疎水性ァミノ 酸は、 実質的に疎水性であれば限定されない。 天然の疎水性アミノ酸、 それと性 質がほぼ同等の修飾されたアミノ酸や合成アミノ酸なども含まれる。
本発明に用いるペプチドは、 疎水面に疎水性アミノ酸を 8 0モル％以上含むこ とが好ましい。 また、 酸性親水性アミノ酸 （ァスパラギン酸、 グルタミン酸） を 含まないことがより好ましい。 これはペプチドの正荷電部分と核酸の陰荷電部分 とが静電的に結合するので、 酸性親水性アミノ酸が該結合に対して阻害的に作用 するからである。
また、 疎水性アミノ酸はロイシン、 イソロイシン、 バリン、 トリブトファン、 プロリン、 チロシン、 ァラニン、 フエ二ルァラニン、 メチォニン、 システィン、 グリシンから選ばれるアミノ酸であることが好ましい。 また、 疎水面のうちの一 つ （側面 A) は 5〜7アミノ酸から構成されていることが好ましい。 疎水面の別 の一つ （側面 C ) は 2〜4アミノ酸から構成されていることが好ましい。 特に側 面 Cはすべて疎水性ァミノ酸であることが好ましい。
疎水面 （側面 A、 側面 C ) の一例を図 2に示す。
「親水面」 とは、 実質的に親水性アミノ酸を多く含む面である。 親水性アミノ 酸は、 実質的に親水性であれば限定されない。 天然の親水性アミノ酸、 それと性 質がほぼ同等の修飾されたアミノ酸や合成アミノ酸なども含まれる。
「正荷電面」 とは、 「親水面」 であって、 かつ、 実質的に正に荷電した親水性 アミノ酸を多く含む面である。 実質的に正に荷電した天然の親水性アミノ酸、 そ れと性質がほぼ同等の修飾されたアミノ酸や合成アミノ酸なども含まれる。 本発明に用いるペプチドは、 親水面に親水性アミノ酸を 8 0モル％以上含むこ とが好ましい。 また、 親水性アミノ酸はァスパラギン、 グルタミン、 トレォ ニン、 セリン、 アルギニン、 ヒスチジン、 リジン、 ァスパラギン酸、 グルタミン 酸から選ばれるアミノ酸であることが好ましい。 さらに、 酸性親水性アミノ酸以 外の親水性アミノ酸、 すなわちァスパラギン、 グルタミン、 トレォニン、 セリン、 アルギニン、 ヒスチジン又はリジンから選ばれるアミノ酸であることが 好ましい。 これはペプチドの正荷電部分と核酸の陰荷電部分とが静電的に結合す るので、 酸性親水性アミノ酸が該結合に対して阻害的に作用するからである。 親水面のうちの一つ （側面 B ) は正荷電面であり、 5〜6アミノ酸から構成さ れていることが好ましい。 さらにリジン又はアルギニンから選ばれるアミノ酸の 構成比率が 5 0モル％以上であることが好ましい。
親水面の別の一つ （側面 D) は 3〜 5アミノ酸から構成されていることが好ま しい。
親水面 （側面 D) 及び正荷電面 （側面 B ) の一例を図 2に示す。
なお、 モル％とは、 疎水面を構成するアミノ酸の数に対する該面に含まれる疎 水性アミノ酸の数の比、 親水面を構成するアミノ酸の数に対する該面に含まれる 親水性アミノ酸の数の比又は正荷電面を構成するアミノ酸の数に対する該面に含 まれるリジン又はアルギニンから選ばれるアミノ酸の数の比である。
本発明に用いるペプチドの特徴である交互に配置された二つの疎水面と二つの 親水面 （ただし、 少なくとも一面は正荷電面） から構成される四面構造は、 モデ ル上に図示された 1 8アミノ酸を前述の定義にしたがって面に分割した場合に、 二つの疎水面 （側面 A、 側面 C ) と二つの親水面 （側面 B、 側面 D :但し、 少な くとも側面 Bは正荷電面） とが互いに交互に隣接して 4つの面を構成する構造で ある。 なお、 疎水面と疎水面とが直接隣接する場合は 2つの疎水面ではなく全体とし て 1つの疎水面であり、 親水面と親水面とが直接隣接する場合は 2つの親水面で はなく全体として 1つの親水面であり、 正荷電面と正荷電面とが直接隣接する場 合は 2つの正荷電面ではなく全体として 1つの正荷電面である。
すなわち、 該四面構造において、 疎水面と疎水面、 親水面と親水面、 及び正荷 電面と正荷電面とは互いに隣接しない。
「交互に隣接して 4つの面を構成する構造」 は、 エドモンソン ·ホイール ·プ ロット法による α—ヘリックス構造モデルにおいて、 向かって右廻りに、 側 面 Α→側面 Β→側面 C→側面 D (→側面 A) 又は、 向かって右廻りに、 側面 A→ 側面 D→側面 C→側面 B (—側面 A) となるよう配置され、 機能が保持される限 りいずれの形態であっても良い。 好ましくは、 向かって右廻りに、 側面 A→側面 B→側面 C→側面 D (→側面 A) になるよう配置される配列である。 なお、 該四 面構造は、 各々の面がその性質を維持する限り、 分割方法、 すなわち、 1 8アミ ノ酸の個々のアミノ酸の 4つの面への割り振り方は特に制限されない。
アミノ酸配列に基づき、 側面 Aは 5〜 7アミノ酸、 側面 Bは 5〜6アミノ酸、 側面 Cは 2〜4アミノ酸、 側面 Dは 3〜 5アミノ酸となるよう割り振られること が好ましい。
一例として、 ァミノ酸配列の各面への割り振りが異なる 3つの配列を図 3及び 図 4に A〜C (〇 1及び〇2 ) として示す。 なお、 C 1と C 2のアミノ酸配列は 全く同一であり、 アミノ酸配列の各面への割り振りを変化させた場合にどちらで も前述の定義に含まれる例である。 A〜C (〇 1及び〇2 ) におけるアミノ酸の 割り振りは下記のとおりである。 疎水面 親水面 疎水面 親水面
(側面 A) (側面 B ) (側面 C ) (側面 D)
A 5 6 2 5
B 6 5 4 3
C 1 6 5 3 4
C 2 7 5 3 3
本発明に用いるペプチドは、 上記した特徴である四面構造を示す 1 8アミノ酸 からなる配列を含むことにより、 ペプチド自身の水溶性が優れている、 及び、 ぺ プチド結合物質と複合体を形成するとき、 その複合体が実質的に問題となる凝集 体を形成しないという特徴を有する。
本発明に用いるペプチドは、 「従来技術」 に記載した α—ヘリックス構造を有 するペプチドベクターと異なり、 α _ヘリックス構造をとる際に疎水面が複数形 成されるため、 疎水面の割合を小さくして水溶性を向上させても、 ペプチド結合 物質を細胞に導入する能力が高い。 一方、 同時に親水面が複数形成されるため、 親水面の割合が二面構造の場合に比べて大きくなり、 少なくとも一つ存在する正 荷電面にぺプチド結合物質が静電的に結合してもぺプチドの親水性は完全には消 失しないので、 ペプチドとペプチド結合物質との複合体は水溶性を維持し、 結果 として実質的に問題となるような凝集塊を形成することがない。 したがって、 ぺ プチドが高いぺプチド結合物質導入能と優れた水溶性を併せ持つためには、 ひ一 ヘリックス構造をとる際に疎水面と親水面 （少なくとも一面は正荷電面） とが各 々複数形成されることが必要である。
そして、 上記性質を有する本発明に用いるペプチドを含む、 本発明の P E G化 学修飾ペプチドは、 上記性質、 特性に対して、 より優れる。
なお、 疎水面と親水面が複数形成され、 かつペプチドベクターとしての機能が 維持される限り、 面の数に制限はない。 好ましくは各々二面である。 特に、 複数 の親水面のうち少なくとも一面が中性親水性アミノ酸に富んだ面 （実質的に荷電 状態にない） であれば、 該面がペプチド結合物質と結合することはなく、 その結 果、 該面の水溶性がほぼ完全に維持されるので、 より好ましい。
本発明に用いるペプチドは、 その機能が保持される限り、 アミノ酸配列の長さ は何ら制限されない。 好ましくは全アミノ酸残基数が 2 0以上、 より好ましくは 2 5以上、 更に好ましくは 3 0以上のペプチドである。 また、 好ましくは全アミ ノ酸数が 1 0 0以下、 より好ましくは 5 0以下、 さらに好ましくは 4 0以下のぺ プチドである。
本発明に用いるペプチドは、 任意のアミノ酸を起点とした連続する 1 8ァミノ 酸配列を一つ以上含む。 好ましくは、 任意のアミノ酸を起点とした連続する 1 8 アミノ酸配列が各々独立して二つ以上存在する、 及び Z又は二つ以上存在する配 列が部分的に重複して存在する。 より好ましくは、 両端のアミノ酸を除く任意の 連続した 1 8アミノ酸配列が、 本発明の四面構造を示す 1 8アミノ酸配列を示す ペプチドである。 すなわち両端のアミノ酸を除いた任意の連続した 1 8アミノ酸 配列が重複してすべて本発明の四面構造を示すペプチドである。
ここで言う 「1 8アミノ酸配列」 は、 エドモンソン ·ホイ一ル ·プロット法に よるひ—ヘリックスモデルにおいて側面 A、 側面 B、 側面 C、 側面 Dが右回りに 配置 （本明細書において、 「本発明の四面構造」 と略記する） されている 1 8ァ ミノ酸からなる配列 （本明細書において、 「本発明の四面構造を示す 1 8ァミノ 酸配列」 と略記する） である。
「両端のアミノ酸を除く任意の連続した 1 8アミノ酸配列」 とは、 例えば、 N (但し、 Nは 2 0以上） 個のアミノ酸からなるペプチドにおいて 2番目〜 1 9番 目、 3番目〜 2 0番目、 4番目〜 2 1番目、 以下同様に （N— 1 8 ) 番目〜 (N - 1 ) 番目までの任意の配列である。 「重複してすべて本発明の四面構造を 示す」 とは、 前述の 2番目〜 1 9番目、 3番目〜 2 0番目、 4番目〜 2 1番目、 以下同様に （N— 1 8 ) 番目〜 （N— 1 ) 番目までのすべての配列が本発明の四 面構造を示すことである。 一例として配列番号 1 6のペプチドの 2番目〜 1 9番 目、 3番目〜 2 0番目、 4番目〜 2 1番目、 1 9〜3 6番目の 1 8アミノ酸から なる配列を、 図 5及び図 6に A〜Dとしてエドモンソン 'ホイール'プロット法 による α—へリックスモデルで示した。 これらの配列は、 いずれも本発明の四面 構造を示す。
本発明に用いるペプチドは、 該ペプチドと、 ペプチド結合物質との複合体の溶 解性を更に改善するという観点から、 少なくとも一端が、 好ましくは両端が親水 性アミノ酸であることが好ましい。
ここでいうペプチド結合物質には、 核酸、 酸性蛋白質等の酸性高分子、 負に荷 電した側鎖を有する低分子化合物等で生理活性を有する物質等が含まれる （詳し くは後述する） 。
親水性ァミノ酸は親水性である限り限定されない。 好ましくは酸性親水性ァミ ノ酸以外の親水性アミノ酸、 より好ましくは中性親水性アミノ酸、 さらに好まし くはトレオニン又はセリンである。
本発明に用いるペプチドに含まれる 「本発明の四面構造を示す 1 8アミノ酸配 列」 の好適例として、 下記のアミノ酸配列の中の任意の連続した 1 8アミノ酸か らなる配列が挙げられる。
X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X1 1 - XI 2- XI 3- XI 4 - XI 5-X1 6-X17-X18-X19-X20- X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36 但し、
「X4、 X8、 Xl l 、 X15 、 及び X19 」 、 「X8、 XI 1 、 X15 、 X19 、 及び X22 」 、 ΓΧΙ Ι 、 X15 、 X19 、 X22 、 及び X26 」 、 「X1 5 、 X19 、 X22 、 X26 、 及び X29 」 並びに 「X1 9 、 X22 、 X26 、 X29 、 及び X33 」 において、 それぞれ 5 アミノ酸中、 4アミノ酸以上が疎水性アミノ酸であり、
X3、 X10 、 X12 、 X21 、 X28 、 及び X30 は、 それぞれ疎水性アミノ酸、 中性親 水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「X2、 X5、 X9、 X1 3 、 及び X1 6 」 、 「X5、 X9、 X1 3 、 X1 6 、 及び X20 」 、 「X9、 X13 、 X1 6 、 X20 、 及び X23 」 、 「X 1 3 、 X1 6 、 X20 、 X23 、 及び X27 」 、 「XI 6 、 X20 、 X23 、 X27 、 及び X31 」 、 並びに 「X20 、 X23 、 X27 、 X31 、 及び X34 」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上が中性親水 性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、 かつ、 そのうち少なくとも 3アミ ノ酸はアルギニン又はリジンであり、
X6、 X17 、 X24 、 及び X35 はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
X7, X14 、 X18 、 X25 、 X32 、 及び X36 はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩 基性親水性アミノ酸である。
好ましくは、
X8及び X26 はそれぞれプロリンであり、 X4、 XI 7 、 X22 、 及び X35 はそれぞれロイシンであり、
X6, XI I 、 XI 5 、 X24 、 X29 、 及び X33 はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、 X12 、 X19 、 及び X30 はそれぞれ疎水性アミノ酸又は中性親水性アミノ酸であ Ό ,
X2, X5、 X9、 X20 、 X23 、 及び X27 はそれぞれ塩基性親水性アミノ酸であり、 XI 3 及び X31 はそれぞれ塩基性親水性アミノ酸又は中性親水性アミノ酸で あり、
X16及び X34 はそれぞれ疎水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、 「X2、 X5、 X9、 X13 、 及び X16 」 、 「X5、 X9、 X13 、 X16 、 及び X20 」 、 「X9、 X13 、 X16 、 X20 、 及び X23 」 、 「X13 、 X16 、 X20 、 X23 、 及び X27 」 、 「XI 6 、 X20 、 X23 、 X27 、 及び X31 」 、 並びに 「X20 、 X23 、 X27 、 X31 、 及び X34」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 少なくとも 3アミノ酸はァ ルギニン又はリジンであり、
X3、 X10 、 X21 、 及び X28 はそれぞれ疎水性アミノ酸、 中性親水性アミノ酸又 は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
X7、 X14 、 X18 、 X25 、 X32 、 及び X36 はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩 基性親水性アミノ酸である。
より好ましくは
X2、 X5、 X9、 X20 、 X23 、 及び X27 はそれぞれアルギニン又はリジンであり、 X3及び X21 はそれぞれチロシン、 フエ二ルァラニン、 セリン又はアルギニンの いずれかであり、
X4、 X17 、 X22 、 及び X35 はそれぞれロイシンであり、 X6、 X15 、 X24 、 及び X33 はそれぞれロイシン又はイソロイシンであり、 X7、 X13 、 X25 、 及び X31 はそれぞれヒスチジン又はアルギニンであり、 X8及び X26 はそれぞれプロリンであり、
X10 及び X28 はそれぞれセリン、 アルギニン又はロイシンのいずれかであり、 XI I 及び X29 はそれぞれトリプトファン又はロイシンであり、
X12 及び X30 はそれぞれバリン、 ロイシン又はセリンのいずれかであり、 X14及び X32 はそれぞれグルタミン、 ァスパラギン又はアルギニンのいずれか であり、
X16 及び X34 はそれぞれァラニン又はアルギニンであり、
X18 はアルギニン、 リジン又はセリンのいずれかであり、
X19 はロイシン又は卜レオニンであり、
X36 はアルギニン又はセリンである。
なお、 X2から X36 までのアミノ酸は少なくとも連続して 1 8アミノ酸が保存さ れる限りアミノ酸が欠失、 付加、 挿入又は置換されてもよい。
なお、 前記において、 疎水性アミノ酸はロイシン、 イソロイシン、 ノ リン、 ト リブトフアン、 プロリン、 チロシン、 ァラニン、 システィン、 フエ二ルァラ ニン、 メチォニン又はグリシンのいずれかから選ばれるアミノ酸であり、 塩基性 親水性アミノ酸はアルギニン、 ヒスチジン又はリジンのいずれかから選ばれるァ ミノ酸であり、 中性親水性アミノ酸はァスパラギン、 グルタミン、 トレオニン又 はセリンのいずれかから選ばれるアミノ酸である。
また、 本発明に用いるペプチドの好適例として、 下記のアミノ酸配列からなる ペプチドが挙げられる。 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-Xl 1-Xl 2-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20 -X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37 但し、
XI及び X37 は親水性アミノ酸であり、
「X4、 X8、 Xl l 、 X15 、 及び X19 」 、 「X8、 XI 1 、 X1 5 、 X19 、 及び X22 」 、 「XI I 、 X1 5 、 X19 、 X22 、 及び X26 」 、 「X1 5 、 X1 9 、 111 、 X26 、 及び X29 」 、 並びに 「X19 、 X22 、 X26 、 X29 、 及び X33 」 において、 それぞれ 5ァ ミノ酸中、 4アミノ酸以上が疎水性アミノ酸であり、
X3、 X10 、 X12 、 X21 、 X28 、 及び X30 はそれぞれ疎水性アミノ酸、 中性親水 性ァミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「X2、 X5、 X9、 X1 3 、 及び X1 6 」 、 「X5、 X9、 X13 、 X1 6 、 及び X20 」 、 「X9、 X1 3 、 X1 6 、 X20 、 及び X23 」 、 「X1 3 、 X1 6 、 X20 、 X23 、 及び X27 」 、 「XI 6 、 X20 、 X23 、 111 、 及び X31 」 、 並びに 「X20 、 X23 、 X27 、 X31 、 及び X34」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上が中性親水 性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、 かつ、 そのうち少なくとも 3アミ ノ酸はアルギニン又はリジンであり、
X6、 X17 、 X24 、 及び X35 はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
X7、 X14 、 X18 、 X25 、 X32 、 及び X36 はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩 基性親水性アミノ酸である。
なお、 上記アミノ酸配列において、 X2から X36 までのアミノ酸は少なくとも連 続して 1 8アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、 付加、 挿入又は置換され てもよい。 好ましくは
XI及び X37 はそれぞれトレォニン又はセリンであり、
X8及び X26 はそれぞれプロリンであり、
X4、 X17 、 111 、 及び X35 はそれぞれロイシンであり、
X6、 XI I 、 X15 、 X24 、 X29 、 及び X33 はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、 X12 、 X19 、 及び X30 はそれぞれ疎水性アミノ酸又は中性親水性アミノ酸であ り、
X2、 X5、 X9、 X20 、 X23 、 及び X27 はそれぞれ塩基性親水性アミノ酸であり、 X13 及び X31 はそれぞれ塩基性親水性アミノ酸又は中性親水性アミノ酸で あり、
X16 及び X34 はそれぞれ疎水性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、
「X2、 X5、 X9、 X1 3 、 及び X16 」 、 「X5、 X9、 X13 、 X16 、 及び X20 」 、 「X9、 X 1 3 、 X1 6 、 X20 、 及び X23 」 、 「X 1 3 、 X1 6 、 X20 、 X23 、 及び X27 」 、 「XI 6 、 X20 、 X23 、 X27 、 及び X31 」 、 並びに 「X20 、 X23 、 X27 、 X31 、 及び X34」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 少なくとも 3アミノ酸はァ ルギニン又はリジンであり、
X3、 X10 、 X21 、 及び X28 はそれぞれ疎水性アミノ酸、 中性親水性アミノ酸又 は塩基性親水性ァミノ酸のいずれかであり、
X7、 X14 、 X18 、 X25 、 X32 、 及び X36 はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩 基性親水性アミノ酸である。
なお、 X2から X36 までのアミノ酸は少なくとも連続して 1 8アミノ酸が保存さ れる限りアミノ酸が欠失、 付加、 挿入又は置換されてもよい。 より好ましくは、
XIは卜レオニンであり、
X37 はセリンであり、
11、 X5、 X9、 X20 、 X23 、 及び X27 はそれぞれアルギニン又はリジンであり、 X3及び X21 はそれぞれチロシン、 フエ二ルァラニン、 セリン又はアルギニンの いずれかであり、
X4、 X17 、 X22 、 及び X35 はそれぞれロイシンであり、
X6、 X15 、 X24 、 及び X33 はそれぞれロイシン又はイソロイシンであり、 X7、 X13 、 X25 、 及び X31 はそれぞれヒスチジン又はアルギニンであり、 X8及び X26 はそれぞれプロリンであり、
X10及び X28 はそれぞれセリン、 アルギニン又はロイシンのいずれかであり、
XI I 及び X29 はそれぞれトリプトファン又はロイシンであり、
X12 及び X30 はそれぞれバリン、 ロイシン又はセリンのいずれかであり、
X14及び X32 はそれぞれグルタミン、 ァスパラギン又はアルギニンのいずれか であり、
XI 6及び X34 はそれぞれァラニン又はアルギニンであり、
X18 はアルギニン、 リジン又はセリンのいずれかであり、
X19 はロイシン又はトレォニンであり、
X36 はアルギニン又はセリンである。
なお、 上記アミノ酸配列中、 X2から X36 までのアミノ酸は少なくとも連続して 1 8アミノ酸が保存される限りアミノ酸が欠失、 付加、 挿入又は置換されてもよ い。 なお、 前記において、 疎水性アミノ酸、 塩基性親水性アミノ酸、 中性親水性ァ ミノ酸は、 前述のアミノ酸配列 X2〜X36 で説明したのと同じである。
ただし、 前述のアミノ酸配列は本発明に用いるペプチドの一例であり、 本発明 に用いるペプチドは、 「本発明の四面構造を示す 1 8アミノ酸配列」 を含み、 か つその機能を保持し、 P E G化学修飾ペプチドの機能等を保持する限り、 必要に 応じて前述のアミノ酸配列に欠失、 付加、 挿入又は置換などを施すことが可能で ある。
また、 P E G化学修飾ペプチドの機能等を保持する限り、 必要に応じて、 アミ ノ酸以外の分子による修飾を施すことも可能である。 例えば、 生体内における安 定性をより上昇させるための糖鎖や脂質若しくは高分子化合物による修飾、 及び /又は、 抗原提示細胞による該ぺプチドの認識をより低く抑えるための糖鎖や脂 質若しくは高分子化合物による修飾を施してもよい。 例えば、 マンノース、 コレ ステロールによる修飾が挙げられる。 これらのペプチドも本発明に用いるぺプチ ドに含まれる。
本発明に用いるペプチドの好ましい態様は酸性親水性アミノ酸を含まないが、 この性質は特に修飾を施す場合有用である。 すなわち、 酸性アミノ酸が含まれず C末端にのみカルボキシル基が存在するよう設計することが可能なので、 カルボ キシル基に依存した反応を利用して修飾を施す場合、 部位特異的な C末端の修飾 が可能となり有利である。
また、 システィン残基のチオール基を利用した部位特異的な修飾を実施する場 合、 アミノ酸配列中にシスティンが一つだけ含まれるように、 好ましくは本発明 に用いるぺプチドの N末端若しくは C末端に付加すれば、 例えば本発明のポリェ チレングリコール修飾等する場合に選択的な修飾が可能となり有利である。 ところで、 アミノ酸は側鎖分子の種類、 性質によって分類されるが、 の高次構造を考察する上で重要な指標となる分類は、 側鎖分子の極性による分類 である。 具体的には、 以下のように分類される。
( 1 ) 疎水性アミノ酸…グリシン、 ァラニン、 バリン、 ロイシン、 イソ口イシ ン、 メチォニン、 フエ二ルァラニン、 チロシン、 システィン、 トリプトファン、 プロリン
( 2 ) 酸性親水性アミノ酸…ァスパラギン酸、 グルタミン酸
( 3 ) 中性親水性アミノ酸…セリン、 トレオニン、 グルタミン、 ァスパラギン ( 4 ) 塩基性親水性アミノ酸…アルギニン、 リジン、 ヒスチジン
したがって、 本発明に用いるペプチドにおいては、 上記同じ分類に属するアミ ノ酸であれば、 「本発明の四面構造を示す 1 8アミノ酸配列」 という要件を満た しつつ、 相互にアミノ酸置換が可能である。 例えば、 イソロイシンとロイシン、 バリンとロイシン、 チロシンとフエ二ルァラニン、 トリプトファンとロイシン、 ァスパラギンとグルタミン、 セリンとトレォニン、 アルギニンとリジン、 ヒスチ ジンとリジンとは互いに置換が可能である。
なお、 ヒスチジンは塩基性親水性アミノ酸に分類されるが、 特定の条件下、 例 えば生理的条件下では荷電状態が小さく、 したがって、 中性親水性アミノ酸に近 い性質をも併せ持っているので、 ヒスチジンは塩基性親水性アミノ酸のみ ならず、 中性親水性アミノ酸との置換も可能である。
一方、 異なる分類に属するアミノ酸であっても、 「本発明の四面構造を示す 1 8アミノ酸配列」 という要件を満足する限り相互置換することが可能である。 一例を挙げれば下記の通りである。
( 1 ) 疎水性アミノ酸 （中性） と中性親水性アミノ酸との置換 （中性の任意の アミノ酸との置換と同義）
例： ロイシンとトレォニン、 ロイシンとセリン、 ノ リンとセリン、 チロシンと セリン
( 2 ) 疎水性アミノ酸 （中性） と塩基性親水性アミノ酸との置換 （疎水 親水、 中性/塩基性という互いに相反する置換であり、 酸性親水性アミノ酸以外 の任意のァミノ酸との置換と同義）
例：ァラニンとアルギニン、 チロシンとアルギニン
( 3 ) 中性親水性アミノ酸と塩基性親水性アミノ酸との置換 （酸性親水性アミ ノ酸以外の任意の親水性ァミノ酸との置換と同義）
例：セリンとアルギニン、 グルタミンとアルギニン
さらに、 「本発明の四面構造を示す 1 8アミノ酸配列」 という要件を満足する 限り、 前述のアミノ酸置換を組み合せて実施することも可能である。 すなわち、 同属内でのアミノ酸置換を組み合せた一例として、 イソロイシンからロイシンへ の置換とパリンからロイシンへの置換とを同時に実施する場合、 互いに属が異な るアミノ酸置換を組み合せた一例として、 チロシンからセリンへの置換とセリン からロイシンへの置換とを同時に実施する場合、 あるいは、 同属内でのアミノ酸 置換と属が異なるアミノ酸置換とを組み合せた一例として、 イソロイシンから口 イシンへの置換とロイシンからトレォニンへの置換とを同時に実施する場合を挙 げることができる。 組み合せることが可能なアミノ酸置換数は、 「本発明の四面 構造を示す 1 8アミノ酸配列」 という要件を満足する限り特に制限はない。 好ま しくは 1 8アミノ酸当り 3以下である。
例えば、 実施例 1 2及び 1 3は、 本発明に用いるペプチドが前述の 「本発明の 四面構造を示す 1 8アミノ酸配列」 という要件を満足する限り相互置換すること が可能であることを示している。
本発明に用いるペプチドとして、 配列番号 1〜2 4のいずれかのアミノ酸配列 からなるペプチドを例示する。 好ましくは、 配列番号 1 6又は 1 9のいずれかの アミノ酸配列からからなるペプチドである。
本発明に用いるペプチドは、 核酸との結合能と、 核酸を細胞へ導入する能力を 有し、 力、っホスファチジルセリンに特異的に親和性を有するペプチドである。 また、 ペプチドを構成するアミノ酸は、 L体及び D体のアミノ酸いずれでもよ く、 かつ天然型アミノ酸と性質がほぼ同等の通常のアミノ酸以外のアミノ酸や合 成修飾アミノ酸であってもよい。 この中には例えばヒドロキシプロリン、 ホモセ リン、 メチルシスティンなどが含まれる。
本発明は、 上記 1 8アミノ酸からなる配列を含むペプチド （本発明に用いるぺ プチド） と、 該ペプチドを P E Gで修飾して得られる、 P E G化学修飾ペプチド であるが、 また、 該 P E G化学修飾ペプチドとペプチドと結合する物質 （ぺプチ ド結合物質） との複合体も含む。
本発明の第 2態様は、 該 P E G化学修飾ペプチドとペプチドと結合する物質 （ ペプチド結合物質） との複合体である。
ここで、 「複合体」 とは、 本発明に用いるペプチドと P E Gとペプチド結合物 質との凝集体、 混合物、 組成物であってもよい。
また、 本発明に用いるペプチドに対する、 P E G及び 又はペプチド結合物質 の結合位置もべプチドの機能を保持する限り特に限定されない。
実施例 3 0の結果から、 本発明に用いるペプチドと、 P E Gと、 ペプチド結合 物質とが複合体 （凝集体、 混合物、 組成物等） を形成していることが分かる。 本発明の複合体を構成する 「ペプチド結合物質」 とは、 上記したように、 核酸、 酸性蛋白質等の酸性高分子、 負に荷電した側鎖 （リン酸基等） を有する低 分子化合物等で生理活性を有する物質等である。
ここで、 「酸性蛋白質等の酸性高分子」 とは、 酸性アミノ酸を多く含み負に荷 電している蛋白質 （例えばアルブミン） や分子全体として負に荷電した状態にあ る蛋白質以外の高分子 （例えばへパリンやヒアルロン酸等） が例示される。
「負に荷電した側鎖を有する低分子化合物」 とは、 リン酸基等を側鎖に有する 低分子化合物で、 リン酸化されたァシク口ビル等が例示される。
「核酸」 とは、 ヌクレオシドゃヌクレオチド、 ヌクレオチドが 2個以上 つながったオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド、 D N A、 R N Aあるいは これらの誘導体、 修飾体若しくは改変体などが含まれる。
「核酸の誘導体」 には核酸を構成する原子の一部が他の原子に置換したものが 含まれる。 例えば、 ホスホジエステル結合部位の酸素原子の一つを硫黄原子に置 換したいわゆる P S体が含まれる。
「核酸の修飾体」 には核酸を構成する原子の一部に他の原子団が置換 ·付加し たものが含まれる。 例えば、 核酸の五炭糖部位の 2 ' 部位にある炭素原子にメト キシ基 （一〇— C H 3 ) や、 核酸配列の一部に糖、 リン脂質やポリエチレンダリ コールが付加したものが含まれる。
「核酸の改変体」 には期待される核酸の機能を維持しながら全く異なる骨格を 有する分子が含まれる。 例えば、 ペプチド核酸 （P e p t i d e N u c 1 e i c Ac i d ; PNA) が含まれる。 また、 核酸の中には、 生体内におけ る特定の蛋白質の発現量を増減する、 若しくは特定の因子の機能発現を調節する ポリヌクレオチドである DNAや RNA、 又はこれらの誘導体、 修飾体若しくは 改変体、 あるいは 「誘導」 「修飾」 「改変」 が組合わさったもの、 及びこれらの 誘導体、 修飾体若しくは改変体の混合物若しくはキメラ体などが含まれる。 また、 前記核酸は一本鎖でも二本以上の鎖から構成されていてもよく、 担体に 結合していてもよい。 例えば、 蛋白質をコードする DNAゃ該 DNAに発現調節 ユニットが接続されたプラスミド、 アンチセンスオリゴヌクレオチド、 おとり型 二本鎖核酸 （以降デコイと記す） 、 アブ夕マー、 リポザィム、 s i RNAなどが 挙げられる。
「特定の蛋白質」 又は 「特定の因子」 とは、 発現量を増減する、 若しくは機能 発現の調節を意図する蛋白質又は因子である。 これらは、 元来生体内に存在する 物質であっても、 存在しない物質であってもよい。
「ペプチド結合物質と結合する能力」 は、 核酸を例にとって説明すれば、 核酸 と本発明に用いるぺプチドのとの混合液を電気泳動した後、 核酸の染色像を検出 することにより調べることができる。 例えば、 核酸が泳動されず、 核酸の染色像 が得られない場合、 若しくは、 核酸のみの泳動の染色像と比較して、 電気泳動時 の移動度が小さい領域に染色像が得られる場合は、 ペプチドが 「ペプチド結合物 質と結合する能力」 を有しているとする。 さらに具体的な方法として、 後述する 実施例 8が例示される。
「ペプチド結合物質を細胞へ導入する能力」 は、 核酸を例にとって説明 すれば、 蛍光標識した核酸を用いて蛍光顕微鏡下で細胞を観察する方法若しくは レポーター遺伝子を発現するプラスミドを用いて細胞が発現するレポーター蛋白 質を測定する方法等により測定することができる。 また、 レポ一夕一蛋白質が発 現した結果として認められる薬理作用を指標として測定することもできる。 レポ一タ一としては蛍ルシフェラ一ゼ、 ）3—ガラクトシダーゼ若しくは H S V— t k等が挙げられる。 さらに具体的な方法として， 後述する実施例 9が例示され る。 この方法を用いて細胞が発現する蛍ルシフェラーゼの量を測定する場合、 蛋 白質 l m gの 1秒当たりの蛍光カウント数を測定する。 このときの蛍光カウント 数が 1 0， 0 0 0以上の場合、 レポーター遺伝子が細胞に導入されたとし、 ぺプ チドは 「ペプチド結合物質を細胞へ導入する能力」 を有するとする。
なお、 本明細書において、 「細胞へ導入する」 と 「細胞内へ導入する」 は同義 語として記載する。
以下、 本明細書において、 「細胞内」 とは、 細胞を構成するュニット及びその 内部を言う。 例えば、 細胞の輪郭を構成するリン脂質二重層内、 リン脂質二重層 間、 細胞質、 あるいはオルガネラ （細胞小器官） 若しくは核又はそれらの内部が 挙げられる。
「特異的に親和性を有する」 とは、 いずれかの特異的な相互作用をすることを いう。 例えば、 互いに結合すること、 複合体を形成すること、 互いに分子を認識 すること、 一定の方向へ移動若しくは集合しょうとすること、 分子の形状が変化 すること、 又は互いに反応すること等が挙げられる。 例えば、 血清アルブミン存 在下であっても親和性を有すれば、 特異的に親和性を有することになる。
通常、 ペプチドがある物質と相互作用をする場合でも、 他のペプチドや蛋白質 が共存することによってその相互作用が消失する場合は、 その相互作用は非特異 的である。 すなわち、 アルブミン等の蛋白質が多量に存在すると、 非特異的な相 互作用は消失する。 したがって、 例えば、 血清アルブミン非存在下でホスファチ ジルセリンに親和性を有していても、 血清アルブミン存在下ではホスファチジル セリンに親和性を有していないペプチドは、 ホスファチジルセリンとの相互作用 は非特異的であり、 生体内ではホスファチジルセリンに親和性を有していない。 一方、 他のぺプチドゃ蛋白質が共存しても当該べプチドの特定の物質に対する 相互作用が消失しない場合は、 相互作用は特異的であり、 「特異的に親和性を有 する」 ことになる。
「キャリア一」 とは、 薬剤などと結合または薬剤などを包含し、 それらを送達 する物質をいう。 そのような性質を有するものであれば特に制限はないが、 脂質 や高分子などで構成されたキャリアーが好ましく、 好ましい具体例としては、 リ ポソーム、 デンドリマー、 ナノパーティクル等が挙げられる。 また、 キャリア一 と薬剤などとの組合せに特に制限はないが、 より安定して薬剤などを保持するた めには互いに静電的に反発しないことが好ましく、 その好適例として、 正荷電を 有するドキソルビシンと中性もしくは陰荷電リボソームとの組合せが例示 される。
また、 本発明の P E G化学修飾ペプチドで修飾したキヤリア一は体内動態が改 善されるばかりでなく特定の部位への指向性も有するので特に有用である。 ここ で、 P E G化学修飾ペプチドはキャリアーと複合体を形成することができる限り P E G化学修飾に用いる活性化 P E Gに制限はないが、 キヤリァ一の構成成分に リン脂質が含まれる場合には、 リン脂質が結合した活性化 P E Gを用いることが 好ましい。 また、 ペプチドで修飾されていない PEG分子数と本発明の PEG化 学修飾べプチド分子数との比は、 P E G化学修飾べプチドで修飾したキヤリァー の体内動態が改善される限り特段の制限はないが、 キャリア一がリボソームの場 合には好ましくは 1 ： ：!〜 1 ： 0. 00 1、 より好ましくは 1 ： 0. 3〜 1 : 0. 01、 さらに好ましくは 1 : 0. 2〜： L ： 0. 02である。
以下、 本発明に用いるペプチドの性質、 特徴等、 及び、 本発明の PEG化学修 飾ペプチドの改良された性質、 特徴等について、 実施例等を参照して説明する。 なお、 本発明の PEG化学修飾ペプチドの改良された性質、 特徴等には、 本発 明の PEG化学修飾ペプチドとペプチド結合物質との複合体の性質、 特徴等、 お よび本発明の PEG化学修飾ペプチドによって修飾されたキャリアーの性質、 特 徵等を含む。
本発明に用いるペプチド （PEG修飾していない 18アミノ酸からなる配列を 含むペプチドをさす） 及び本発明の PEG化学修飾ペプチド （以下、 両者を併せ て 「本発明のペプチド」 と略記する） は核酸との結合能を有する。 好ましくは、 ぺプチドの有する別の機能である核酸を細胞へ導入する能力及び血清アルブミン 存在下でのホスファチジルセリンとの親和性、 並びに核酸の保持する機能のいず れもが完全には損なわれることなく、 該ぺプチドと核酸とが実質的に一体となつ て複合体を形成する能力を有するぺプチドである。
本発明のペプチドの核酸との結合における結合様式には何ら制限はなく、 静電 的な結合や疎水結合、 及び共有結合が含まれる。
本発明のペプチドは、 上記複合体を形成し、 該ペプチドと結合した核酸を細胞 へ導入する能力を有し、 好ましくは、 核酸が分解を受けずに、 核酸の所望の機能 を保持した状態で核酸を細胞内へ導入する能力を有する。
本発明に用いるペプチドの核酸導入能は、 具体的には、 実施例 9の核酸導入能 の測定において、 測定値は蛋白質 1 m gの 1秒当たりの蛍光カウント数が 1 0， 0 0 0以上である。 好ましくは 1 0 0， 0 0 0以上であり、 より好ましく は 1 , 0 0 0 , 0 0 0以上である。
本発明のペプチドが前記特徴を有することにより、 該ペプチドを使用して、 核 酸を細胞内へ導入したときに、 結果として、 核酸が保持する所望の機能を細胞内 で発揮することが可能である。 例えば、 プラスミドに挿入された外来遺伝子が細 胞内で発現して所望の蛋白質が産生されること、 又は、 アンチセンスオリゴヌク レオチド、 デコイ、 アブ夕マー若しくはリポザィム等によって特定の生理活性物 質の産生が抑制されること等が挙げられる。 なお、 「所望の蛋白質」 には最終的 な活性体のみならず前駆体も含まれる。
後述する実施例 1 1及び実施例 2 4はプラスミ ドに組み込まれた蛍ルシ フェラ一ゼ遺伝子が、 本発明に用いるペプチドにより、 細胞内に導入された後、 転写 ·翻訳の過程を経て細胞内に蛍ルシフェラ一ゼが産生 ·蓄積している具体例 である。 また、 実施例 1 6及び実施例 2 5は、 プラスミドに組み込まれた単純へ ルぺスウィルス由来のチミジンキナーゼ （以降 H S V— t kと記す） 遺伝子が、 本発明に用いるペプチドにより、 腫瘍細胞内に導入された後、 転写 ·翻訳の過程 を経て腫瘍細胞内に H S V— t kが産生 ·蓄積し、 腫瘍細胞のガンシクロビル感 受性を亢進して薬効 （抗腫瘍効果） を示した具体例である。
さらに本発明のペプチドの好ましい例は、 血清アルブミン存在下でホスファチ ジルセリンに特異的に親和性を有し、 ホスファチジルセリン以外のリン脂質、 例 えばホスファチジルコリン、 に親和性を有しないペプチドである。
ホスファチジルセリン以外のリン脂質とは親和性を有しない、 好ましい本発明 のペプチドとホスファチジルセリンとの相互作用、 すなわち結合は、 電荷による 結合又は非特異的結合による結合のみではなく、 該ぺプチドがホスファチジルセ リンの分子構造を認識する結合である。
このことは、 例えば、 本発明に用いるペプチドについて、 実施例 2 0又は実施 例 2 1に示されている。
ホスファチジルセリンは、 前述の通り、 細胞表層を形成する脂質二重層の構成 成分に含まれるリン脂質であり、 脂質二重層の外層と内層に含まれる比率が細胞 の状態によって変化するリン脂質であるので、 例えば、 損傷を受けたり変性した り活性化された、 炎症部位の細胞等のいわゆる正常でない細胞において脂質二重 層の外層に含まれる割合が増加すると考えられるリン脂質である。 したがって、 本発明のぺプチドは選択的に炎症部位の細胞等の正常でない細胞に結合する。 さ らにホスファチジルセリンは、 生体内においても、 血液凝固反応が進行する 「場」 を提供したり、 マクロファージがアポトーシスに陥った細胞を認識して貪 食する際の目印となっているリン脂質である。 したがって、 本発明のペプチドは 選択的に正常でない細胞、 例えば生体内において血液凝固反応が進行する 「場」 に結合する。
このように、 本発明のペプチドは、 核酸との結合能と、 該核酸を細胞へ導入す る能力を有し、 かっ血清アルブミン存在下でホスファチジルセリンに親和性を有 することを特徴とする。
本発明のペプチドは、 含有物なし、 又は無機塩のみを含む水溶液中では不規則 な構造を示すが、 特定の物質の共存下では、 α—ヘリックス構造が認められるぺ プチドであるのが好ましい。
「特定の物質」 とは本発明のペプチドと相互作用して該ペプチドが α—ヘリッ クス構造を取ることを誘起する物質である。 例えば、 両親媒性物質であり、 この 中にはドデシル硫酸ナトリウム （SDS) 等の界面活性剤又はホスファチジルセ リン等の特定のリン脂質が含まれる。
ペプチドの高次構造中におけるひ一ヘリックス構造の有無は、 一般的に CDス ベクトル測定によって知ることができる。 すなわち、 ペプチドの高次構造 中に α—へリックス構造が含まれる場合、 CDスぺクトル測定の平均残基楕円率 曲線が、 ひ一へリックス構造の特徴である曲線、 すなわち、 波長 205〜210 nmの領域及び波長 220〜225 nmの領域のニケ所に極小値が認められるい わゆる W字型の曲線となる （ 「タンパク質の旋光性 （生物化学実験法 6) 、 浜口 浩三ら著、 学会出版センター、 1 97 9」 ） 。 なお、 ペプチドの高次構造 中に α—ヘリックス構造が含まれる割合は、 測定された平均残基楕円率曲線から 所定の計算方法によって得ることができる。 所定の計算方法としては、 代表的な ものとして、 Che n等の方法 （Y. H. Ch en e t a 1. , B i o c h emi s t r y Vo l . 1 1， 4120 (1972) ) 、 Yang等の方法 （ J. T. Ya n g e t a l . , An a l . Ch em. , Vo l . 9 1, 1 3 ( 1 978) ) 、 Wo o d y等の方法 （R. W. Wo o dy e t a 1. ， J . Mo 1. B i o l . ， Vo l. 242, 497 (1994) ) などを 挙げることができる。
ただし、 用いる方法によって算出される数値が異なるので、 算出された数値と 共に、 算出に用いた方法を明記することが好ましい。
上述したように、 本発明の好ましいペプチドは、 特定の物質の共存下で は、 α—へリックス構造を取り、 例えば、 該ペプチドは界面活性剤又は細胞膜上 のホスファチジルセリン等の特定のリン脂質等の両親媒性物質との相互作用 によってひ—ヘリックス構造を取る。 それにより該ペプチド及び該ペプチドを含 む物質の細胞膜透過性が上昇し、 結果的に該ぺプチド及び該ぺプチドを含む物質 が速やかに細胞内に移行する。
要するに、 本発明のペプチドの好ましい例は、 ρΗ5〜8の、 含有物なし、 又 は無機塩のみを含む水溶液中での CDスぺクトル測定では α—ヘリックス構造が 認められないが、 ρΗ5〜8の 5mM S D S含有水溶液中での C Dスペクトル 測定では、 平均残基楕円率曲線の波長 2 05〜2 1 0 nmの領域及び波長 220〜225 nmの領域のニケ所に極小値を示し、 それにより、 α—ヘリック ス構造が認められるペプチドである。
また、 高次構造中のひ一^ ^リックス構造の含有割合が、 Ch e n等の方法 によって計算した場合に 25%以上であるペプチドが好ましい。 より好ましくは 30 %以上であるペプチドである。 さらに好ましくは 35%以上であるペプチド である。
上記本発明のぺプチドは両親媒性物質存在下の水溶液中でひ一へリックス構造 が認められる。 またホスファチジルセリンに親和性を有することから、 正常でな い細胞、 例えば損傷を受けたり変性したり活性化された細胞の表面に選択的に集 積し、 該細胞膜上のホスファチジルセリンとの相互作用によりひ—ヘリックス構 造をとり、 該細胞内に選択的に取り込まれる。 また、 本発明のペプチドは、 蛋白質共存下で実質的に凝集体を形成しないぺプ チドが好ましい。
例えば、 上記の好ましいペプチドの例においては、 両親媒性物質が存在しなけ れば Q!—ヘリックス構造を取らず、 蛋白質共存下においても溶解性が保持さ れる。 そのため、 該ペプチドをヒトに投与しても、 該ペプチドは実質的に問題と なるような凝集体を血液中で形成せず、 血管閉塞を起こすことがなく、 安全性が 高まる。 例えば、 本発明に用いるペプチドについて、 安全性が高いことは実施例
2 6に示されている。
また、 本発明の P E G化学修飾ペプチドは、 さらに安全性が高い。
本発明のペプチドが蛋白質共存下で実質的に凝集体を形成するか否かは、 該ぺ プチドを含む血清アルブミン水溶液の濁度を光学的に測定することで判定するこ とができる。 例えば、 波長 3 4 0 η π！〜 6 6 0 n m、 特に波長 6 0 0 n mでの該 ぺプチドを含む血清アルブミン水溶液の吸光度を測定することにより判定 できる。
本発明のペプチドは、 核酸と容易に結合するという特徴、 核酸との複合体形成 時に溶解性が高いという特徴、 核酸を細胞内に導入する能力が高いという特徴、 安全性が高いという特徴、 及び、 血清アルブミン存在下でホスファチジルセリン に親和性を有するので、 正常でない細胞内へ選択的に取り込まれるという特徴を 有するのでペプチドベクターとして有用である。
「ペプチドベクタ一」 とは、 所望の物質を細胞内へ導入することができるぺプ チドならびにその誘導体、 修飾体及び改変体である。
さらに本発明のぺプチドは、 核酸のヌクレア一ゼによる分解を防ぐことができ るという特徴を有する。 このため、 天然型 （P=O体） のオリゴヌク」レオチドゃ ポリヌクレオチドは、 血液中及び細胞中に存在するヌクレアーゼによって容易に 分解されるが、 本発明のペプチドが結合すればヌクレアーゼによる分解を受けな い。
核酸にヌクレアーゼ耐性を付与するか否かは、 ヌクレアーゼが存在する溶液中 で核酸と本発明のペプチドとの複合体を反応させた後、 核酸を抽出して電気泳動 し、 核酸の染色像を検出することにより調べることができる。 例えば、 ペプチド が核酸にヌクレアーゼ耐性を付与すれば、 核酸は分解されないので核酸の染色像 が得られる。 具体的な方法は後述する実施例 18及び実施例 19に記載した。 本発明のペプチドをペプチドベクターとして使用することにより、 該ベクター と結合する物質、 好ましくは核酸を細胞内へ導入すること、 及び核酸を細胞内へ 導入して該核酸が有する機能を細胞内で発現させることができる。
実施例 11から実施例 16は本発明に用いるぺプチドカ i n v i t r oで核 酸を細胞内へ導入することにより該核酸がコードする蛍ルシフェラ一ゼ及び HS V_ t kを細胞内で発現させた例であり、 実施例 24及び実施例 25は本発明に 用いるペプチドが i n v i v oで核酸を細胞内へ導入することにより該核酸が コードする蛍ルシフェラ一ゼ及び HSV_ t kを細胞内で発現させた例である。 特に実施例 25は、 本発明に用いるペプチドによって腫瘍細胞内に導入された H S V- t k遺伝子が腫瘍細胞内で発現し、 腫瘍細胞のガンシクロビル感受性を亢 進して薬効 （抗腫瘍効果） を示した具体例であるが、 本実施例で使用したプラス ミドの用量は 1 O gであり、 該使用量は既報のリボソームベクターを利用して 行われた同様の薬理実験 （Ao k i， K. e t a 1..Hum. Ge ne Th e r . , Vo l . 8, 1 105 ( 1997) ) で使用された用量 （150 g) よりも遥かに低用量である。 これは、 実施例 17及び実施例 18に例示されるよ うに、 本発明に用いるペプチドは核酸の安定性をリボソームよりも上昇させ、 か つ、 本発明に用いるペプチドと核酸との結合体は安定性がリボソームよりも高い ので、 核酸を細胞内へ導入する際に本発明に用いるペプチドを用いることが有用 で、 核酸を細胞内へ導入するベクターとして本発明に用いるペプチドが優れてい ることを示している。
そして、 上記の優れた性質を有するペプチドを含む、 本発明の PEG化学修飾 ペプチドは、 さらに優れた上記性質を示す。
本発明のペプチドをベクターとして使用する他の例を挙げれば、
レポーター蛋白質 （緑色蛍光蛋白質 （GFP) や ;3—ガラクトシダ一ゼ） を発 現するプラスミド、
抗腫瘍効果を示すサイ ト力イン （インターロイキン 2、 インターフェロン β等) を発現するプラスミド、
アポトーシスを誘導して細胞殺傷効果を示す生理活性物質 （F a sリガンド、 P 53、 カスパーゼ 3、 カスパーゼ 8、 B a X (Bc l -2-a s s o c i a t e d X p r o t e i n) > FADD (F a s a s s o c i a t e d d e a t h doma i n p r o t e i n) 等） を発現するプラスミド、
TNF—α若しくはインターロイキン 6等のリガンドに競争的に結合すること により該リガンドが誘起する反応を抑制して、 例えば慢性関節リウマチ等の病態 を改善することができる該リガンドに対する可溶型の受容体を発現するプラスミ ド、、 ワクチンとしてァレルギ一反応を抑制するべプチド Zポリペプチド若しくは例 えばダニ抗原等の坊原蛋白である蛋白質を発現するプラスミド、
循環器疾患である閉塞性動脈硬化症の病態の改善あるいは損傷部位の回復 （リ モデリング） を推進する効果がある血管内皮細胞増殖因子 （V E G F ) 若しくは 肝細胞増殖因子 （H G F ) を発現するプラスミド、
経皮的冠動脈形成術 （P T C A) 後の再狭窄を抑制する効果がある C D C 2キ 細胞周期調節遺伝子の転写調節因子である E 2 Fや炎症性サイトカインの転写 調節因子である N F κ Βが結合する核酸配列に対するデコイ、 ならびに、 抗ウィルス効果を示すリン酸化された核酸アナログの活性化体など
を細胞内へ導入すること、 及び、 それらの機能を細胞内で発現させることが可能 となる。
本発明のペプチドは、 核酸との結合能と、 該核酸を細胞へ導入する能力を 有し、 かっ血清アルブミン存在下でホスファチジルセリンに親和性を有すること を特徴とするので、 ホスファチジルセリンをより多く細胞表層へ表出させている 細胞により高率に核酸を導入できる。 このことにより、 疾病の治療を目的として 遺伝子若しくはアンチセンス D NA等の核酸を細胞へ導入しょうとする場合に、 ホスファチジルセリンの細胞表層への表出量が増加した損傷を受けたり変性した り活性化された炎症細胞等の、 いわゆる正常でない細胞、 免疫担当細胞に、 より 多くの該核酸が選択的に導入されることになり、 すなわち副作用を低減すること ができる。
具体的な例を挙げれば、 本発明のペプチドをベクターとして用レ て腫瘍細胞に 核酸を導入して癌治療を行う場合、 正常細胞には核酸はほとんど導入されず、 腫 瘍細胞に高率に核酸が導入される。 また、 アレルギーの治療を目的として核酸を 細胞へ導入しょうとする場合、 免疫担当細胞によりアレルギー反応が惹起された 細胞に特異的に核酸が導入される。
さらに、 本発明のペプチドが有する 「ホスファチジルセリンをより多く細胞表 層へ表出させている細胞により高率に核酸を導入する」 という性質を利用して、 あらかじめ所望の特定の細胞や臓器におけるホスファチジルセリンの表出量を増 加させておくことにより、 所望の特定の細胞や臓器により高率に核酸を導入する ことができる。 例えば、 特定の細胞 ·臓器に薬剤を作用させることにより 該細胞 ·臓器は薬剤の薬理作用によりホスファチジルセリンの表出量を増加させ た上で、 本発明のペプチドをベクターとして用いることにより該細胞 ·臓器へ高 率に核酸を導入することができる。
具体的な例を挙げれば、 化学療法による癌治療において抗癌剤の服用のみでは 十分に治療効果が表われない場合であっても、 該化学療法剤を服用させて、 該化 学療法剤の薬理効果により腫瘍細胞をホスファチジルセリンの表出量を増加させ た上で、 本発明のペプチドをベクターとして用いて高率に抗腫瘍効果を示す遺伝 子若しくはァンチセンス D N A等の核酸を腫癟細胞に導入することにより、 該核 酸の治療効果を上げることができる。
本発明のペプチドは核酸と容易に結合し、 該核酸を細胞内へ導入する。 また、 本発明のペプチドは、 核酸のみならずペプチド結合物質を細胞内へ導入すること が可能である。 本発明のぺプチドと核酸との結合の形態が特に限定されないこと と同様に、 本発明のペプチドと該物質との結合の形態もとくに限定されない。 好 ましくは、 該物質を細胞内へ導入する時の本発明のぺプチドと該物質の結合形態 が非共有結合によることであり、 さらに好ましくは静電的結合によることで ある。 特に好ましくは、 本発明のペプチドが有する正電荷と、 該物質が有する負 電荷による静電的結合によることである。 すなわち、 本発明には上記の結合形態 によりぺプチド結合物質を細胞内に導入することが含まれる。
なお、 本発明に用いるペプチドと本発明の P E G化学修飾ペプチドの性質、 特 徴について併せて説明したが、 本発明の P E G化学修飾ペプチドは、 本発明に用 いるペプチドを P E Gで化学修飾しているため、 本発明に用いるペプチドに対し て、 例えば、 標的細胞への遺伝子や薬剤の取り込み率の向上、 薬理活性の向上、 毒性の低減等の優れた効果を有する。
具体的には、 後述する実施例 2 8及び 2 9の結果から、 本発明に用いるぺプチ ドを活性化 P E Gで修飾しても、 比活性が低下せず （実施例 2 8 ) 、 また、 ぺプ チド結合物質の導入率が、 約 3倍程度向上 （実施例 2 9 ) し、 有用である。 また、 後述する実施例 3 5〜3 7の結果から、 本発明の P E G化学修飾べプチ ドによって修飾されたキャリア一は、 キャリアーに包含された薬剤の導入率 を 3〜3 3倍程度向上し （実施例 3 5および 3 6 ) 、 また、 担癌マウスの生存期 間の延長効果を有し （実施例 3 7 ) 、 有用である。
本発明の P E G化学修飾べプチドの製法について、 以下述べる。
本発明に用いるぺプチドは、 化学合成によって得ることができる。
例えば、 自動ペプチド合成機 （4 3 2 A型、 アプライドバイオシステムズ 社製） を用いて合成することにより得ることができる。，
また、 本発明に用いるぺプチドは遺伝子工学的手法によって得ることもで きる。 遺伝子工学的手法による場合、 以下の工程を行うことにより、 所望のぺプ チドを得ることができる。
( 1 ) 当該べプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する DNAを得る 工程、
(2) ベクタ一に当該 DN Aを組み入れて、 当該 DN Aを含む複製可能な組換え DNAを得る工程、
(3) 当該組換え DN Aで宿主細胞を形質転換させて、 当該ペプチドを発現し得 る形質転換体を得る工程、
(4) 該形質転換体を培養して、 当該ペプチドを産生せしめ、 培養混合物から当 該ペプチドを回収する工程、
本発明に用いるペプチドをコードする D N Aは、 実質的に本発明に用いるぺプ チドをコ一ドする塩基配列を有するものであればいずれでもよい。 公知の ように、 遺伝暗号の縮重に従い、 遺伝子からコードされるペプチドのアミノ酸配 列を変えることなくその遺伝子配列の少なくとも一つの塩基を他の塩基に置換す ることができる。 したがって、 該 DNAは、 遺伝子コードの縮重に基づき、 塩基 配列の一個以上の塩基が置換された塩基配列を有していてもよい。 特に、 本発明 に用いるペプチドを遺伝子工学の手法を用いて製造する際に、 特定の宿主細胞で 使用頻度の高いコドンとなるように一個以上の塩基を置換した塩基配列を有して いてもよい。 また該 DNAは組換え DNA、 例えばプラスミド、 発現ベクターで もよい。
配列番号 1、 16、 19のペプチドをコードする配列番号 28〜30の DNA を例示する。 当該ペプチドのアミノ酸配列をコードする塩基配列を有する DNAを得る工程 は例えば、 自動核酸合成機を用いて合成することにより得ることができる。 ベクターに当該 DNAを組み入れて、 当該 D N Aを含む複製可能な組換え D N Aを得る工程、 及び、 当該組換え DNAで宿主細胞を形質転換させて、 当該ぺプ チドを発現し得る形質転換体を得る工程は成書 （例えば、 Mo l e c u l a r C l on i n , a l abo r a t o r y manu a l, S e c ond e d i t i on, T. M a n i a t i s e t a 1. , Co l d S p r i n g Ha r bo r Labo r a t o r y P r e s s (1989) ) に記 載された一般的な遺伝子工学の手法に基づいて実施することが可能である。 なお、 本発明に用いるペプチドは、 メチォニンを含まないよう設計することが可 能なので、 メチォニンを介在させて複数の本発明のぺプチドが連結したぺプチド を遺伝子工学的に産生した後ブロムシアンで切断して得ることも可能である。 生産される当該ペプチドは、 多くの文献や成書 （例えば、 「新生化学実験講座 1 ：タンパク質 I」 （日本生化学会編、 東京化学同人、 1990年） 、 「化学増 刊 102 ：タンパク質 ·ペプチドの高速液体クロマトグラフィー」 （宇井信生ら 編、 化学同人、 1985年） ） に記載された方法を参考にして、 精製、 単離及び 回収することができる。 すなわち、 脱塩、 濃縮、 塩析、 限外ろ過、 イオン交換ク 口マトグラフィ一、 逆相クロマトグラフィー、 等電点クロマトグラフィー、 ァフィ二ティーク口マトグラフィ一及びゲルろ過のうちから選ばれる少なくとも 一つの方法を用いて当該べプチドを純粋な形で得ることができる。
本発明の PEG化学修飾ペプチドは、 上記方法により得られる本発明に用いる ペプチドを上記の P E Gで化学修飾して得られる。 P EG化学修飾条件は特に限定されず、 当業者に公知の方法を適宜選択で さる。
具体的には、 それぞれ適当な溶媒に溶解したぺプチド溶液と活性化 P EG溶液 とを混合し、 約 1〜約 40°Cで、 約 1分〜約 24時間程度反応させる。
なお、 PEG化学修飾後、 通常用いられる方法、 条件で、 精製することもでき る。
上記製造方法において、 活性化 PEGの使用量は、 本発明に用いるペプチドの 量に対してモル比で 0. 000 1〜 10000であり好ましくは 0. 0 1〜 100であり、 特に好ましくは 0. 1〜10である。 この範囲であれば、 活性化 PEGはペプチドと反応しても、 PEG化学修飾ペプチドは元のペプチドの活性 を維持し、 かつ溶解性を更に上げる、 抗原性を減弱する、 毒性を減弱するなど、 より好ましい性質を付与することが可能だからである。
P E G化学修飾ペプチドの P E G部分の平均分子量は、 約 20 0 D a〜 約 100, 000D aであり、 好ましくは、 約 1， O O ODa〜約 50, 000 Da、 さらに好ましくは、 約 2， O O ODa〜約 20, O O ODaである。 この範囲であれば、 P E G化修飾べプチドは元のぺプチドの活性を維持し、 か つ溶解性を更に上げる、 抗原性を減弱する、 毒性を減弱するなど、 より好ましい 性質を付与することが可能である。
本発明の P E G化学修飾べプチドとぺプチド結合物質との複合体の製造法につ いて、 以下述べる。
該複合体の製造方法は、 上記した、 本発明に用いるペプチド、 活性化 PEG及 びペプチド結合物質を用いて、 I) a) 18アミノ酸からなる配列を含むペプチドと、 活性化ポリエチレング リコール （PEG) とを反応させる工程、
b) 前記 a) により得られる PEG化学修飾ペプチドと、 ペプチドと結合する 物質とを反応させる工程、
よりなる製造方法、
又は、
I I) a) 18アミノ酸からなる配列を含むペプチドと、 ペプチド結合物質と 反応させる工程、
b) 該ペプチドと該ペプチド結合物質との反応物を、 活性化 PEGと反応させ る工程、
よりなる製造方法である。
ぺプチドと該ぺプチド結合物質との反応物を予め形成し、 反応物を P E G修飾 することにより不必要な PEG修飾を抑制することができるため、 I I) の方法 が好ましい。
この I I) の方法を用いれば、 PEG修飾によってペプチドの機能が発揮され るために必要な部位 （ペプチドの活性中心） が覆われてしまったり、 ペプチドの 構造が変化し標的に近づけないなど比活性の低下をもたらす不必要な PEG修飾 を抑制することが可能であり、 P E G修飾の有用性を更に向上させることができ る。
方法 I) の a) における反応条件は、 上記本発明の PEG化学修飾ペプチドの 製造条件を選択でき、 I) の ） における反応条件は、 後述する I I) の a) と 同様の条件を選択できる。 方法 I I) の工程 a) の反応条件は特に限定されず、 該反応物が形成できる条 件を任意に選択でき、 具体的には、 それぞれ適当な溶媒に溶解したペプチド溶液 と該ペプチド結合物質の溶液とを約 1〜約 40°Cで、 約 1分〜約 24時間程度混 合させる条件が挙げられる。
方法 I I) の工程 b) の反応条件は特に限定されず、 該複合体が形成できる条 件を任意に選択でき、 具体的には、 上記した、 本発明に用いるペプチドの PEG 化学修飾の条件が挙げられる。
より具体的には、 実施例 27に記載されている。
該製造方法に用いられる、 本発明に用いるペプチド、 活性化 PEG及びべプチ ド結合物質の量比は、 該複合体が用いられる用途、 該複合体に要求される性質、 特徴、 薬理活性、 安全性等を考慮して任意の比率とすることができる。
具体的には、 方法 I I) の工程 a) で用いるペプチド結合物質は、 該ペプチド が有する正電荷 （+ ) の個数とペプチド結合物質が有する負電荷 （一） の個数と の比 （ + /—比） が 2以上となるよう、 より好ましくは 3以上となるよう使用す る。 また、 該比は好ましくは 100以下であり、 より好ましくは 50以下で ある。 その範囲であれば、 ペプチドとペプチド結合物質が複合体を形成すること ができる。
方法 I I) の工程 b) で用いる活性化 PEGは、 本発明に用いるペプチドの量 に対してモル比で 0. 0001〜10000であり好ましくは 0. 01〜： 100 であり、 特に好ましくは 0. 1〜10である。 この範囲であれば、 活性化 PEG はペプチドと反応しても、 PEG化修飾べプチドは元のペプチドの活性を維 持し、 かつ溶解性を更に上げる、 抗原性を減弱する、 毒性を減弱するなど、 より 好ましい性質を付与することが可能だからである。
また、 当該方法により製造される、 本発明の P E G化学修飾ペプチドと、 ペプチド結合物質との複合体、 上記 3成分の混合物、 組成物、 凝集体等も本発明 に含まれるのはいうまでもない。 実施例 3 0の結果から、 本発明に用いる ペプチドと、 P E Gと、 ペプチド結合物質とが複合体 （凝集体、 混合物、 組成物 等） を形成していることが分かる。 実施例
以下、 実施例を用いて、 本発明をさらに具体的に説明するが、 これらは実施の 一例として示すものであり、 本発明はこれらにより何ら限定されるものでは ない。 また、 以下の記載において用いる略号は当該分野における慣例略号に基づ くものである。
<実施例 1 >ペプチドの化学合成
配列番号 1〜 2 7のアミノ酸配列を有するペプチドを、 自動ペプチド合成 機 （4 3 2 A型、 アプライドバイオシステムズ社製） を用いて固相合成した。 な お、 3 0残基以上の長さを有するペプチドの合成は、 2 5残基目のアミノ酸が脱 保護されない状態で合成を中断し、 2 6残基目以降のアミノ酸カラムを合成機に 装着し直した後合成を再開させて合成を遂行した。 他の操作方法については、 特 に明記しない限り添付の操作マニュアルに従った。 切り出し、 脱保護反応を 行い、 エーテル中でペプチドを沈殿させた後、 エーテルを除去し、 蒸留水に溶解 させて凍結乾燥した。 続いて、 配列番号 1〜2 6のペプチドは 1 O mM H C 1 を含む 2 0 %ァセトニトリル水溶液で、 配列番号 2 7のペプチドは 1 O mM H C 1を含む 1 5 %ァセトニトリル ^ 15 %イソプロパノール水溶液で各々溶 解し、 C 18カラム （CAPCELLPAK C 1 8 AG 1 20 , 資生堂社 製） 、 高速液体クロマトグラフィー （625 LCシステム、 ウォーターズ社製） を用いて、 配列番号 1〜26のペプチドは 1 OmM HC 1を含む 20 %〜 70%ァセトニトリル水溶液で直線濃度勾配法により単一ピークが得られるよう 精製し、 配列番号 27のペプチドは 1 OmM HC 1を含む 15%〜50%ァセ トニトリル Z15%〜50%イソプロパノール水溶液で直線濃度勾配法により単 一ピークが得られるよう精製した。 精製べプチドは凍結乾燥した後蒸留水に溶解 させ、 凍結保存した。
収量は、 それぞれ 3 Omg〜4 Omgであった。
<実施例 2〉ぺプチドの検定 （ 1 )
MALD I—TOFMS型質量分析計 （Voyage rDE— STR、 PEバ ィォシステムズ社製） を用いて、 質量分析により得られた合成ペプチドの分子量 を測定し、 ペプチドが目的物であることを検証した。 操作方法については、 特に 明記しない限り添付の操作マニュアルに従った。 概略は以下のとおりである。 すなわち、 ま" 5、 a— c yano— 4— hyd r oxyc i nn ami c a c i d (CHC A) を 0. l v o l % TF A/50 v o 1 % ァセトニト リル/純水で溶解し、 1 OmgZmLのマトリックス溶液を調製した。 つぎに、 サンプルプレート上で、 実施例 1に記載の方法で取得したぺプチド水溶液 (10 pmo 1 ah) 0. 5 Lとマトリックス溶液 0. 5 Lとを混合し、 乾燥させて試料を結晶化したのち、 以下の条件で分析を行った。
測定モ—ド ： L i ne a r、 po s i t i v e キヤリブレーション：外部標準法 （ただし、 標準品は① An g i o t e n s i n l、 ② ACTH (1 - 17 c 1 i p) 、 ③ ACTH (18— 39 c 1 i p) 、 ④ ACTH (7 - 38 c 1 i p) 、 ⑤ I n s u l i n ( ov i ne) ) その結果、 合成及び精製したいずれのペプチドの分子量も理論分子量と一致す ることが確認できた。
<実施例 3 >ペプチドの検定 （2)
アミノ酸組成分析により、 実施例 1で得られた合成べプチド溶液の濃度を決定 した。 アミノ酸組成分析はニンヒドリン法により行った。
すなわち、 試料をガラス試験管中で乾固し、 6N HC 1 100 Lを添加、 真空封管下、 1 10°Cで 22時間加水分解を行った。 試料を乾固後、 純水に溶解 しアミノ酸分析計 （L— 8500型、 日立社製） を用いて分析を行った。 ぺプチ ド水溶液の濃度は 7〜1 OmgZm であった。
<実施例 4 > B S A中での濁度測定
牛血清アルブミン （BSA) 濃度 1%、 ペプチド濃度が 50 Mとなるよう水 溶液を調製し、 分光光度計 （DU640型、 ベックマン社製） を用いて波長 60 0 nmにおける吸光度を測定した。 その結果を表 1に示したが、 いずれも 0. 1 以下であった。 表 1 配列番号 OD 600
Bしグリ フ 丄 0 03 目 [タリ ¾F 乙 0. 01 > 配列畨 3 0. 01 > 酉己歹 ϋ··^· 5 0. 01 > 列畨 6 0. 01 >
Θεタリ ( 0. 01 > 目 Cタリ舊 ο 0. 01 > 西？^ | 1 0 0. 01 > 配列番号 1 1 0. 01 > 配列番号 1 5 0. 01 > 配列番号 16 0. 01 > 配列番号 1 7 0. 0 1 > 配列番号 1 9 0. 01 > 配列番号 23 0. 01 > <実施例 5〉 CDスぺクトルの測定
5 OmM NaC 1を含む 1 OmMリン酸緩衝液 （pH=7) 中に溶解させた ペプチドの CDスペクトルを、 5mM SDS存在下、 非存在下で円二色性分散 計 （J一 5 00 A型、 日本分光社製） を用いて測定した。 なお、 セル長は lmm、 35°C、 積算回数 6回で行った。
図 7〜図 9は、 各々配列番号 1、 配列番号 4及び配列番号 16のべプチドの C Dスぺクトル測定による平均残基楕円率曲線を示す図であり、 図から明らかなよ うに、 SDS存在下のものの平均残基楕円率曲線では、 波長205〜2101111 の領域と、 波長 220〜225 nmの領域に極小値を認められるいわゆる W型の 曲線となり、 ひ一ヘリックス構造を取っていることが確認できる。
すなわち、 遺伝子導入能が認められた配列番号 1、 配列番号 4及び配列番号 1 6のペプチドでは、 無機塩のみを含む水溶液中では《—ヘリックス構造をとらな いが、 SDS存在下では α—ヘリックス構造をとることが示された。
<実施例 6 >ォリゴヌクレオチドの合成
21 me r長の未標識オリゴヌクレオチドは、 〇 PCカラム （アプライドバイ ォシステムズ社製） を用いて精製した調製物を、 F I TC標識した 2 lme rの ォリゴヌクレオチドは、 逆相クロマトグラフィ一を用いた H P L C法により精製 した調製物を、 各々 （株） サヮデ一 'テクノロジ一社に合成委託し入手した。 <実施例 7 > P 1 a s m i dの調製
蛍ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子とした発現プラスミ ドは、 SV40初期プロモータ一下に蛍ルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれた市販のプ ラスミド （pGL 3— Con t r o 1 Ve c t o r, プロメガ社製） 又は CM V初期プロモータ一下に蛍ルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれたプラスミド （P CMV-Lu c (F) ) 若しくは EF— 1 αプロモーター下に蛍ルシフェラ一ゼ 遺伝子が組み込まれたプラスミド （pEF— Lu c) を使用した。 HSV— t k 遺伝子をレポ一夕一遺伝子とした発現プラスミドは、 EF— 1ひプロモ一夕一下 に HSV— t k遺伝子が組み込まれたプラスミド （pEF— t k) 又は CMV初 期プロモー夕一下に HSV— t k遺伝子が組み込まれたプラスミド （pCMV— t k) を使用した。 これらのプラスミド及び汎用プラスミドである pUC 1 19 及び PBR 322は、 必要に応じて大腸菌を用いて増幅させたのち、 公知の方法 に従って精製して使用した。
<実施例 8 >核酸との結合能の評価
(1) オリゴヌクレオチドとの結合能の評価
1 5 OmM N a C 1を含む 2 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH= 7. 2) 中で、 実施例 6に記載の方法によって調製した 2 lme rからなるオリゴヌクレ ォチド （終濃度 6. 7 M) と、 実施例 1〜3に記載の方法によって調製した各 ペプチドを電荷比 （ + Z—比） が 0〜10となるよう混合し、 37 ：、 30分静 置した。 続いて、 この溶液 7. 5 Lと等量の 80%ホルムアミド含有トリス— ホウ酸緩衝液 （PH=8. 2) とを混合して、 7 M尿素を含有する 25%ポリア クリルアミドゲルにて電気泳動を行った。 泳動後、 ゲルを、 50%ホルムアミド を含む 5%S t a i n s a l l (フナコシ社製） 水溶液で染色，水洗してオリ ゴヌクレオチドとぺプチドとの結合の有無を判定した。
図 1 0に配列番号 1のペプチドを用いた場合の電気泳動図を示す。 図 1 0 で + /—比 （電荷比） は、 ペプチドの正電荷を有する基の個数 （+ ) と、 核酸の 有する負電荷の基の個数 （一） を比で表したものである。 図から明らかな ように、 電荷比 （+ /—比） が増加するにしたがってオリゴヌクレオチドのぺプ チドへの結合量は増加し、 電荷比 （+ノ—比） 10で完全に結合した。 同様に、 配列番号 2〜 24のペプチドにおいても電荷比 （+ ー比） 10において結合が 認められた。
(2) プラスミドとの結合能の評価
1 5 OmM N a C 1を含む 2 OmMトリス塩酸緩衝液 （pH= 7. 2) 中で、 実施例 7に記載の方法によって調製したプラスミド （pUC 1 19 ：終濃 度 =20 ^gZmL) と、 実施例 1〜3に記載の方法によって調製した各べプチ ドを電荷比 （+ _比） が 0〜3となるよう混合し、 37°C、 30分静置したの ち、 1 %ァガロースゲルを用いて電気泳動を行ってプラスミドとペプチドとの結 合の有無を判定した。
図 1 1に配列番号 1のペプチドを用いた場合の電気泳動図を示す。 図 1 1 で + —比 （電荷比） は、 ペプチドの正電荷を有する基の個数 （+ ) とプラスミ ドの負電荷を有する基の個数 （一） を比で表したものである。 図から明らかなよ うに、 電荷比 （+ Z—比） が増加するにしたがってプラスミドのペプチドへの結 合量は増加し、 電荷比 （+ Z—比） 3で完全に結合した。 同様に、 配列番号 2〜 24のペプチドにおいても電荷比 （+ ー比） 3において結合が認められた。 ぐ実施例 9 >核酸導入能の評価 （1)
Ame r i c an Typ e Cu l t u r e Co l l e c t i on (AT CO より購入したサル腎臓由来株化細胞 （Ve r o細胞） 、 ヒト膀胱癌細胞 (T24細胞） 、 及び大日本製薬より購入したヒト肺癌細胞 （A 549細胞） を 24ゥエル培養プレート （ナルジェヌンク社製） に 1ゥエルあたり 1 X 105 細 胞の割合で植え込み、 Ve r o細胞と A549細胞は 10%ゥシ胎児血清 （以降 FB Sと記す：ニチレイ社製） 含有 DMEM (ライフテックオリエンタル社製） で、 T 24細胞は 1 0 %FB S含有 Mc C 0 y' s 5 a (ライフテック オリエンタル社製） で 5%C〇2 雰囲気下、 37 °Cで 24時間培養した。 培地を 除去した後、 実施例 7で調製したルシフェラーゼ発現プラスミ ド濃度が 1 g/ mLになるよう、 及び、 実施例 1で調製したペプチド濃度が 1. 25、 2. 5、 又は 5 Mとなるように調製した 0 p t i -MEM (ライフテックオリエンタル 社製） を添加して 5時間培養した。 続いて、 Ve r 0細胞と A549細胞は、 培 地を 1 0 % F B S含有 DMEMに、 また T 24細胞は 10 % F B S含有 M c Coy' s 5 aに置換して 5% C〇2 雰囲気下 37°Cでさらに 24時間培養 した後、 ルシフェラーゼアツセィシステム （プロメガ社製） の方法に準じて細胞 内で発現しているルシフェラーゼ活性を測定した。 すなわち、 細胞をリン酸緩衝 生理食塩水 （以降 PBSと記す： S I GMA社製） で洗浄し、 キットに付属して いる P a s s i ve Ly s i s B u f f e rで細胞を溶解した。
この細胞溶解液 20 Lとキッ卜に付属の L u c i f e r a s e As s ay Re ag e n t I I 100 Lとを蛍光測定用プレート （M i c r o 1 i t e™l l a t e : ダイナテック社製） に添加して混和後、 マルチラベル カウンター （ARV〇TM S Y 142 OMULT I LABEL COUNTE R： ヮラックベルトールド社製） を用いて蛍光を 1秒間測定した。
細胞溶解液中のタンパク質濃度は、 デイスポーザブルキュベット （UVケィコ ゥキュベット A204X：フナコシ社製） 中で、 超純水 792 Lに細胞溶解液 8 Lとプロテインアツセィ溶液 （バイオラッド社製） 2 0 0 ^Lを混和後、 5 分間、 室温で静置し、 分光光度計 （DU640 ：ベックマン社製） で 5 9 5 nm の吸光度で測定した。 スタンダードタンパク質はゥシ血清アルブミン （BSA) を用いた。 以上の結果から細胞溶解液中のタンパク質 lmgあたり、 1秒あたり のカウント数を算出してルシフェラーゼ活性とし、 ペプチド濃度が異なる 3条件 の中で最も高い値を示したものをそのペプチドの遺伝子導入能とした。
<実施例 1 0 >核酸導入能の評価 （ 2 )
Ve r o細胞をチャンバ一付スライドガラス （L a b— T e k I I c h amb e r S l i d e s i z e 4 we 1 1 ：ナルジェヌンク社製） の各ゥエルに 1 x 1 05 細胞の割合で植え込み、 1 0 %F B S含有 DMEMで 5 %C〇2 雰囲 気下、 37°〇で24時間、 培養した。 培地を除去後、 実施例 6で調製した F I T C標識オリゴヌクレオチド濃度 30 0 nM、 実施例 1で調製した配列番号 1のべ プチド 2. 5 Mを含有する o p t i—MEMを添加し 4時間培養した。 1 0 % FB S含有 DMEMに置換して 5%C〇2 雰囲気下、 3 7 °Cでさらに 24時間、 培養した後、 細胞を PBSで洗浄後、 4%パラホルムアルデヒド含有 PB Sで固 定し、 蛍光顕微鏡 （AH— 3 ：ォリンパス社製） で細胞核に F I TC標識オリゴ ヌクレオチドが集積しているか否かを確認した。 その結果、 細胞核に F I TC標 識ォリゴヌクレオチドが集積していることを確認した。 一方、 配列番号 1のぺプ チド非存在下では、 細胞内に F I TC標識オリゴヌクレオチドは認められなかつ た。
<実施例 1 1 >ぺプチドが有する細胞への核酸導入能の評価 （ 1 )
実施例 9に記載の方法にしたがって、 配列番号 1のべプチドの細胞への核酸導 入能を検証した。 図 12は、 配列番号 1のペプチドの有無による、 細胞内へ導入 されるプラスミド量の差をルシフェラーゼ活性により比較した図である。 図に示 したように、 配列番号 1のべプチドは核酸を細胞内へ導入する能力を有すること が認められた。 一方、 配列番号 1のペプチド非存在下では核酸は細胞内へ導入さ れなかった。
<実施例 12 >ペプチドが有する細胞への核酸導入能の評価 （2)
配列番号 1のペプチドを基準として、 「本発明の四面構造を示す 18アミノ酸 配列」 中の 1箇所若しくは 2箇所をアミノ酸置換した配列番号 2〜18のべプチ ドの、 細胞への核酸導入能を実施例 9に記載の方法にしたがって評価した。 その 結果、 いずれのペプチドも細胞への核酸導入能を有していることがわかった。 なお、 核酸導入能は、 たんぱく質 lmgあたり、 1秒あたりの蛍光カウント数 (c p sZmg p r o t e i n) により以下のように分類し、 結果の一覧 を表 2に示した。
10, 000以上 100, 000未満 … 1+
100， 000以上 1， 000, 000未満 … 2 +
1, 000, 000以上 10， 000， 000未満 … 3 +
10， 000， 000以上 100， 000, 000未満
… 4 +
100, 000, 000以上 1， 000， 000, 000未満
… 5 +
1, 000, 000, 000以上 … 6 +
なお、 配列番号 1は、 上記分類では 3+に相当する。 表 2 配列番号 核酸導入能 配列番号 2 3 + 配列番号 3 2 + 酉 P列 J番 pa rj 4 * 4 + t3[Lクリ ώ 9 4- 目 タリ ¾F 0 4卞- ffi 7?i! Φ JS. 1 0
Heタリ / 十
Θ己歹リ ¾ 8 0 + 酉己歹1 J 9 3 + 酉己歹1 1 0 d 卞
Θ己歹1 1 1 3 + 酉己歹1 J "^ 1 2 2 +
Beタリ番7^ 1 十 rll 5ft* ^r3 Ί A
目 Cタリ 丄 4 十
[ グリ 丄 0 乙 9 4 \- t3 "J w
配歹1 J番号 J 1 7 2 + 配列番号 1 8 4 + 配列番号 1 9 4 + 配列番号 2 0 4 + 配列番号 2 1 2 + 配列番号 2 2 3 + 配列番号 2 3 2 + 配列番号 2 4 1 + <実施例 13 >ペプチドが有する細胞への核酸導入能の評価 （3)
配列番号 1のペプチドを基準として、 「本発明の四面構造を示す 18アミノ酸 配列」 中の 3箇所をアミノ酸置換した配列番号 19〜22のペプチドの、 細胞へ の核酸導入能を実施例 9の記載の方法にしたがって評価した。 その結果、 このべ プチドは細胞への核酸導入能を有していることがわかった。
なお、 核酸導入能は、 たんぱく質 lmgあたり、 1秒あたりの蛍光カウント数 により実施例 1 2に記載の方法にしたがって分類し、 結果の一覧を表 2に 示した。
<実施例 14 >ぺプチドが有する細胞への核酸導入能の評価 （4)
配列番号 1及び配列番号 4のペプチドを基準として、 各々の欠失体である配列 番号 23、 24のペプチドを作成し、 細胞への核酸導入能を実施例 9の記載の方 法にしたがって評価した。 その結果、 いずれのペプチドも細胞への核酸導入能を 有していることがわかった。
なお、 核酸導入能は、 たんぱく質 lmgあたり、 1秒あたりの蛍光カウント数 により実施例 1 2に記載の方法にしたがって分類し、 結果の一覧を表 2に 示した。
<実施例 15 >ぺプチドが有する細胞への核酸導入能の評価 （ 5 )
実施例 9の方法にしたがって、 配列番号 16のペプチドの各種株化癌細胞への 核酸導入能を検証した。
癌細胞は、 ヒト子宮癌細胞 MES— S AZDx 5 (AT CCより購入） 、 ヒト腎由来形質転換細胞 293 (ATCCより購入） 、 ヒト肝癌細胞 SK— HEP— 1 (ATCCより購入） 、 ヒト卵巣癌細胞 SK— OV— 3 (ATCCよ り購入） 、 ラット脳腫瘍細胞 F 98 (AT CCより購入） 、 マウスメラノーマ細 胞816 81^6 (北海道大学免疫科学研究所化学部門より譲渡） 、 ヒト子宮癌 細胞 MES— SA (AT CCより購入） 、 マウス肺癌細胞 Lewi s Lung C a r e i noma (財団法人 癌研究会より譲渡） 、 マウス肝癌細胞 MH 1 34 (財団法人 実験動物中央研究所より譲渡） 、 ヒト子宮癌細胞 ME S— SA/Mx 2 (AT CCより購入） 、 ヒト髄芽腫細胞 Da oy (ATCCより購 入） 、 ヒト子宮頸癌細胞 HeL a (ATCCより購入） 、 ヒト乳癌細胞 MCF7 (ATCCより購入） 、 ヒト膠芽腫細胞 U— 87 MG (ATCCより購入） 、 ヒト乳癌細胞 MDA— MB— 468 (ATCCより購入） 、 ヒト腎癌細胞 A— 4 98 (ATCCより購入） 、 マウスメラノーマ細胞 B 16 F 10 (ATCCよ り購入） 、 ヒト前立腺癌細胞 DU 145 (ATCCより購入） 、 ヒト脳腫瘍細 胞 U— 138 MG (ATCCより購入） 、 マウス肉腫細胞 M e t h— A (国立 がんセンターより讓渡） を用いた。 各細胞の培養に用いた増殖培地は、 表 5中に 記載した。 なお、 添加物 NEAA ( I CN社製） は非必須アミノ酸であり、 Na · Py r (I CN社製） はピルビン酸ナトリウムを示す。 また、 F B Sは全 てニチレイ社製のものを、 培地はライフテックオリエンタル社製のものを 使用し、 全ての増殖培地にペニシリン 'ストレプトマイシン （I CN社製） を添 加した。
継代維持した細胞を 24ゥエル培養プレートに 1ゥエルあたり 1 X 105 細胞 の割合で植え込み、 各増殖培地で 5 %C02 雰囲気下、 37 :で 24時間培養し た。 培地を除去した後、 実施例 7で調製したルシフェラーゼ発現プラスミド濃度 が 1 x g/ mLになるよう、 及び、 実施例 1で調製したペプチド濃度が 2. 5 n Mとなるように調製した o p t i一 MEMを添加して 5時間培養した。 続いて、 培地を各増殖培地に置換して 5 %C02 雰囲気下 37°Cでさらに 24時間培養し た後、 実施例 9に記載の方法にしたがって細胞内で発現しているルシフェラーゼ 活性を測定し、 実施例 12に記載の基準にしたがってペプチドの遺伝子導入能を 表 3に示した。
表 3
細胞株 組織 増殖培地 核酸導入能
ME S— S A/D X 5 ヒト子宮癌 10XFBS含有 McCoy' s 5A 6 +
2 9 3 ヒト腎 10%FBS含有 DMEM 6 +
S K— HE P— 1 ヒト肝癌 10%非働化 FBS含有 MEM(NEAA、 Na、 Pyr 添加） 5 + IS.― V― ヒ 卜卵果燈 1 brBoa KrM 11 D4U
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IV ϋ ― / / IVl - 'Ττ 10%FDC 有
(1 1 Waymouth' s MB752/and McCoy' s 5 A)
D a o y ヒト髄芽腫 10¾FBS含有 iMEM 4 +
H e L a ヒ卜子宮頸癌 10¾FBS含有 DMEM 4 +
MC F 7 ヒ卜乳癌 10%非働化 FBS含有 RPMI1640 4 +
U- 8 7 MG ヒト膠芽腫 10%非働化 FBS含有 MEM(NEAA、 Na、 Pyr 添加） 4 +
MDA-MB- 4 6 8 ヒ卜孚 us 10%非働化 FBS含有 RPMI1640 4 +
A- 4 9 8 ヒト腎癌 10¾FBS含有 DMEM 4 +
B 1 6/F 1 0 マウスメラノ一マ 10¾FBS含有 DMEM 4 +
DU 1 4 5 ヒト前立腺癌 10%非働化 FBS含有 MEM(NEAA、 Na, Pyr 添加） 4 +
U— 1 3 8 MG ヒト脳腫瘍 10 FBS含有 D聽 4 +
M e t h— A マウス肉腫 105KFBS含有 DMEM 4 · +-
く実施例 16〉ペプチドが有する細胞への核酸導入能の評価 （6)
実施例 7で調製した HSV— t k発現プラスミドを実施例 1で調製した配列番 号 16のペプチドを用いて L ew i s Lung C a r c i n om a細胞 （マ ウス肺癌細胞） に組み込み、 ガンシクロビル （以降 GCVと記す） 感受性亢進効 果を検討した。 すなわち、 96we 1 1培養プレート （ナルジェヌンク社製） に 細胞を 5 X 1 03 細胞の割合で植え込み、 1 0 % F B S含有 D MEMで 5 % C〇2 雰囲気下、 37°Cで 24時間培養した。 培地を除去後、 HSV— t k発現 プラスミド濃度が 1 g ZmLになるよう、 及び配列番号 16のべプチド濃度が 2. 5 Mとなるように調製した o p t i— MEMを 10 O Lずつゥエルに添 加して 5時間培養した。 続いて GCV (デノシン： 田辺製薬株式会社製） を 0、 2、 20、 200 M含有した 20%F B S含有 DMEMを 1 0 O Lずつゥェ ルに添加して 5%C〇2 雰囲気下、 37°Cで 3日間培養した。 細胞の増殖抑制効 果は WST— 1アツセィで測定した。 すなわち、 WST— 1溶液 （宝酒造社製） を 1 O ^Lずつ各ゥエルに添加し、 1時間反応後、 マルチラベルカウンターを用 いて測定波長 620 nm、 リファレンス波長 450 nmで吸光度を測定した。 そ の結果、 図 1 3に示すように HSV— t k発現プラスミドが細胞内へ導入された L ew i s Lung C a r c i n oma細胞は GC Vの用量に依存して細胞 増殖が抑制されたのに対し、 対照としてルシフェラーゼ発現プラスミドが細胞内 へ導入された細胞は G C V感受性亢進効果が認められなかった。
<実施例 17〉核酸との複合体の保存安定性の評価
プラスミドとペプチドの複合体の保存安定性を評価した。
実施例 7で調製したルシフェラーゼ発現プラスミド濃度が 2 z/gZmLになる よう、 及び、 実施例 1で調製した配列番号 4のペプチド濃度が 5 Mとなるよう に調製した op t i— MEMにおいて、 遺伝子導入時直前に調製したものと 1週 間 （7日） 前に調製して 4°Cで保存したものを各々用いて、 実施例 9に記載の方 法にしたがって Ve r o細胞にルシフェラ一ゼ発現プラスミドを導入しルシフエ ラーゼ活性を測定した。
図 14は、 遺伝子導入直前に調製したペプチドノプラスミド複合体の遺伝子導 入活性を 100%とし、 4 で一週間保存したペプチド プラスミド複合体の遺 伝子導入活性の相対値を示したものである。 図 14に示したとおり、 4tで一週 間保存したぺプチド/プラスミド複合体の遺伝子導入活性は遺伝子導入直前に調 製した該複合体の遺伝子導入活性とほぼ同等であった。
なお参考までに、 市販のプラスミド導入剤であるリポフエクチンあるいはリポ フエクトァミン 2000 (L i p o f e c t AM I NE 2000 :ライフテツ クオリエンタル社製） を添付のプロトコールにしたがってルシフェラーゼ発現プ ラスミドと混合し、 同様に、 4°Cで一週間保存した後の遺伝子導入活性を評価し た結果、 いずれも著しい活性の低下が認められた。 図 14に結果を示す。
<実施例 18 >ヌクレア一ゼ耐性付与能の評価 （ 1 )
天然型 （P = 0体） オリゴヌクレオチドへのヌクレアーゼ耐性付与能を評価し た。 すなわち、 実施例 1で調製した配列番号 1のべプチドを 50 M、 実施例 6 で調製した P =〇体オリゴヌクレオチドを 3 M、 及び 150mM NaC l、 12mM MgC l 2 、 12 mM C a C 12 をそれぞれ含む 20 mMトリス— 塩酸緩衝液 （pH=8) にヌクレアーゼ B a 1 31 (宝酒造社製） 2 Uを加えて 30 、 60分反応させた。 続いて、 フエノール/クロ口ホルムで未分解オリゴ ヌクレオチドを抽出した後、 実施例 8に記載の方法にしたがって電気泳動を 行い、 オリゴヌクレオチドを染色した。
図 1 5に電気泳動図を示す。 図から明らかなように、 配列番号 1のぺプ チドは、 天然型 （P = 0体） オリゴヌクレオチドへのヌクレアーゼ耐性付与能が あることが示された。
なお参考までに、 市販のプラスミド導入剤であるリポフエクチンあるいはリポ フエクトァミン 2000を用いて同様にヌクレア一ゼ耐性付与能を評価したとこ ろ、 いずれもオリゴヌクレオチドの泳動染色像は得られず、 オリゴヌクレオチド が分解されていることが示された。 図 15に結果を示す。
<実施例 19 >ヌクレアーゼ耐性付与能の評価 （ 2 )
15 OmM NaC 1. 7mM M g C 12 を含む 20 mMトリスー塩酸 緩衝液 （pH=8) 中で、 実施例 7に記載の方法で調製した pBR 322 (終濃 度 S O/ gZmL) と、 実施例 1で調製した配列番号 16のペプチドを電荷比 （ +ノ一比） が 0〜10となるよう混合し、 DNa s e l (宝酒造社製） 5Uを加 えて 30°C、 60分反応させた。 続いて、 フエノール Zクロ口ホルムで未分解の プラスミドを抽出した後、 実施例 8に記載の方法にしたがって電気泳動を行い、 プラスミドを染色した。
図 16に電気泳動図を示す。 図から明らかなように、 配列番号 16のペプチド は、 プラスミドへのヌクレアーゼ耐性付与能があることが示された。
<実施例 20 >ペプチドのホスファチジルセリン親和性の評価 (E I A)
ペプチドのホスファチジルセリンとの特異的な親和性は、 血清アルブミン存在 下でホスファチジルセリンには結合するがホスファチジルコリンには結合しない ことが知られているヒ卜 F a c t o r V I I Iを用いてヒト F a c t o r V I I Iのホスファチジルセリン結合に対する阻害活性で測定した。 すなわち、 ホスファチジルセリン （S I GMA社製） ：ホスファチジルコリン （S I GMA 社製） =3 ： 7となるよう混和したリン脂質を 1 O^gZmL含有したエタノー ル溶液を 96ゥエルプレート （ィムロン I ： ダイナテック社製） に各ゥエル に 100 //Lずつ添加して、 濃縮遠心機 （EC—95C、 佐久間製作所製） を用 いて 40°Cで 40分間乾固した。 1 %ゥシ血清アルブミン （B S A, F r a c t i onV 以降 BS Aと記す：生化学工業製） 含有 TBS (10mMトリス—塩 酸 （pH7. 4) ， 0. 9 % (WZV) N a C 1 ) 溶液を 200 Lずつを 各ゥエルに添加して 37 °Cで 2. 5時間静置し、 ブロッキングしたのち、 プレー トを水洗し、 終濃度 1 gZmLのヒト F a c t o r V I I I (アメリカンダイ ァグノスティ力社製） と各用量の実施例 1で調製したぺプチドを混和した 5 % B 3八含有丁83溶液を100 Lずつ各ゥエルに添加して 4 X：で 24時間反応さ せた。
反応終了後は、 成書 （ 「酵素免疫測定法 （第三版） 」 、 石川栄治ら著、 医学書 院、 1987) に記載の一般的方法に従って、 Enz yme I mmu n o A s s ay (E I A) によりホスファチジルセリンに結合したヒト F a c t o r V I I Iを測定した。 すなわち、 1次抗体として抗ヒト F a c t o r V I I Iマウ スモノクローナル抗体 （ESH8 ：アメリカンダイァグノスティカ社製） 、 2次 抗体として西洋わさびパーォキシダーゼ標識抗マウス I gG抗体 （P 0260、 ダコ社製） を用い、 テトラメチルベンジジンを発色基質としてその吸光度 を測定波長 450 nm、 リファレンス波長 630 nmで分光光度計 （N J— 2 100型、 イン夕一メッド社製） により測定した。
ペプチドのホスファチジルセリンとの親和性の強度は、 ヒト F ac t o rV I I Iのみ添加したゥエルの吸光度からヒト F a c t 0 r V I I Iを添加しなかつ たゥエルの吸光度を引いた値をコントロール値 （100%) とし、 ヒト Fa c t o r V I I Iとペプチドを混和して添加したゥエルの吸光度から各種ペプチドの みを添加したゥエルの吸光度を引いた値をコントロール値で除した時に 0. 5と なるペプチド濃度を I C5。値と定め、 I C5Q値が 1 以下の場合を +十、 1 Mより大きく 10 M以下の場合を十、 と定めて評価した。 なお、 10/ M以上 の場合は特異的な親和性はないと判定した。 結果を表 4に示す。
P T/JP03/04614
8 3
表 4 配列番号 ホスファチジルセリン親和性
配列番号 1 + +
配列番号 2 + +
配列番号 3 + +
配列番号 5 + +
配列番号 6 + +
配列番号 Ί +
配列番号 8 +
配列番号 1 0 +
配列番号 1 1 +
配列番号 1 5 + +
配列番号 1 6 + +
配列番号 1 7 + +
配列番号 1 9 + +
配列番号 2 3 + + く実施例 21 > ペプチドのホスファチジルセリン親和性の評価 （ 2 ) ぺプチドのホスファチジルセリン特異的親和性を、 表面プラズモン共鳴 (S u r f a c e P 1 a smonRe s on an c e = S PR) によりビアコア 2 000 (ビアコア社製） を用いて測定した。 すなわち、 HP A c h i p (ビアコア社製） のフローセル 1にホスファチジルコリンを、 フローセル 2 にホスファチジルセリン 50 % ホスファチジルコリン 50 %を固相化し、 0. lmgZmL B S A存在下でペプチドの各脂質に対する結合能を測定し親 和性を評価した。 その結果、 配列番号 1のペプチドはホスファチジルコリンを固 相化したフローセル 1と比較して、 ホスファチジルセリン 50%/ホスファチジ ルコリン 50%を固相化したフローセル 2において強く結合し、 ホスファチジル セリンに特異的な親和性を示した （図 17) 。 それに対して、 配列番号 1の配列 をランダムに入れ替えた配列番号 25のぺプチドはホスファチジルコリンを固相 化したフローセル 1にも、 ホスファチジルセリン 50%ノホスファチジルコリン 50%を固相化したフローセル 2においても結合せず、 親和性を示さなかった （ 図 18) 。
<実施例 22〉ホスファチジルセリン表出量と導入効率との相関 （選択性） ぺプチドの遺伝子導入能の強さとホスファチジルセリン親和性との相関を明ら かにするために、 ホスファチジルセリンの細胞表層への表出量が異なる細胞を用 いて検討を行った。 すなわち、 Ve r o、 A549、 T 24の各細胞を用いて実 施例 9の記載にしたがって実施例 1で調製した配列番号 1のべプチドを用いて実 施例 7で調製したルシフェラ一ゼ発現プラスミドを導入し、 ルシフェラーゼ活性 を測定した。 一方、 各種細胞の細胞膜外に表出しているホスファチジルセリン量 は F I TC標識したァネキシン V (ANNEX I NV-F I T C ： ファー ミンジェン社製） を用いて添付の説明書に従って細胞を標識し、 フローサイトメ トリー （FACSC a l i b u r ： べクトン 'ディッキンソン社製） で測定 した。 すなわち、 培養フラスコで培養した各種培養細胞を剥離し、 F I TC標識 ァネキシン V溶液と混和後、 フローサイトメトリ一で細胞の F I TC蛍光強度を 測定し、 各細胞の平均蛍光強度を細胞株のホスファチジルセリン表出量とした。 その結果、 表 5に示した通り、 ホスファチジルセリン表出量 （ァネキシン V結 合量） とべプチドベクターの遺伝子導入活性とが相関した。
なお、 参考までに、 市販のプラスミド導入剤であるリポフエクチン （L i po f e c t i n ： ライフテックオリエンタル社製） を添付のプロトコールに したがって用いたところ、 いずれの細胞にも同等にプラスミドが導入され、 ホス ファチジルセリンを特異的には認識しないことが示された。
表 5 ルシフェラーゼ活性 （c p sZmg蛋白） 細胞名 Annex in-V結合量 ペプチド （配列番号 1) リポフエクチン
Vero 165 2. 5 X 106 1. 1 X 106
A549 82 8. 7 X 104 8. 4 X 105
T24 32 7. 8 X 103 1. 1 X 106 <実施例 23 >ホスファチジルセリン表出量と導入効率との相関 （2) ぺプチドの遺伝子導入能の強さとホスファチジルセリン親和性との相関を明ら かにするために、 ホスファチジルセリンを表出していない状態の細胞と、 該細胞 を刺激してホスファチジルセリンを表出した細胞とを用いてペプチドの核酸導入 能の検討を行った。 細胞は、 RBL— 2H 3ラット好塩基球由来培養細胞 （AT CCより購入） を使用し、 坊 DNPマウスモノクローナル I gE抗体 (S I GM A社製） で感作し、 DNP— BSA (Ca l b i o c h em社製） で脱顆粒反応 を惹起し、 この細胞に配列番号 16のペプチドを用いて実施例 9に記載の方法に 準じてルシフェラーゼ遺伝子を導入し、 ルシフェラ一ゼ活性を測定した。 すなわ ち、 24ゥエルプレートに RBL— 2 H3細胞を 3 X 105 細胞の割合で植え込 み、 更に 100 n gZmLの濃度になるように抗 DNPマウスモノクローナル I gE抗体を添加し、 24時間培養した。 そして各ゥエルを PBSで 2回洗浄後、 DNP— B S Aを 10 n g/mLになるように添加し、 脱顆粒反応を 45分間惹 起した。 更に培地を除去後、 生理食塩水で各ゥエルを洗浄し、 実施例 7で調製し たルシフェラーゼ発現プラスミド濃度が 1 g/ mLになるよう、 及び、 実施例 1で調製した配列番号 16のペプチド濃度が 2. 5 Mとなるように調製した o t i—MEMを添加して 5時間培養した。
続いて培地を 15%非働化 FBS含有 MEM (NEAA、 N a · P y r添加） に交換し、 5%C02 雰囲気下、 37 で 1日間培養した。 その後、 細胞を剥離 し、 実施例 9に記載の方法でルシフェラーゼ活性を測定した。 一方、 RBL— 2 H 3細胞の脱顆粒反応によるホスファチジルセリン表出量は、 以下に記載の方法 で測定した。 すなわち、 6ゥエル培養プレート （ナルジェヌンク社製） に RBL 一 2H3細胞を 1. 5 X 106 細胞の割合で植え込み、 更に 10 OngZmLの 濃度になるように抗 DNPマウスモノクローナル I gE抗体を添加し、 15%非 働化 FBS含有 MEM (NEAA、 Na · Py r添加） で 5%C〇2 雰囲気下、 37 °Cで 24時間培養した。 そして各ゥエルを PBSで 2回洗浄後、 DNP— B SAを 1 OngZmLになるように添加し、 脱顆粒反応を 45分間惹起した。 細 胞を剥離後、 F I TC標識ァネキシン V (MBL社製） を用いて添付の説明書に したがって細胞を標識し、 フローサイトメトリーで測定した。
その結果、 脱顆粒刺激した細胞の表面にはホスファチジルセリンが表出し （図 19) 、 更にペプチドの脱顆粒刺激した RBL— 2 H 3細胞への遺伝子導入 能は、 脱顆粒反応していない細胞と比較して著しく上昇した （図 20) 。
なお、 市販の遺伝子導入剤リポフエクトァミン 2000の遺伝子導入能は、 脱 顆粒反応した細胞では脱顆粒前と同等か、 やや減少した。
<実施例 24 >ペプチドが有する細胞への核酸導入能の評価 （7)
i n V i v oでペプチドが遺伝子導入能を示すことを証明するため、 Me t h_ Aマウス肉腫細胞移植腹水癌モデルを用いてペプチドが有する細胞への核酸 導入能の検討を行った。 すなわち、 Me t h— A細胞を BALB/cマウス （日 本チヤ一ルス · リバ一より購入） の腹腔に 4 X 106 細胞移植し、 4日後に実施 例 7で調製したルシフェラーゼ発現プラスミド 30 gと実施例 1で調製した配 列番号 16のペプチド 113nmo 1の混和物を腹腔内投与した。 更に 1日後に マウスを屠殺し、 腹腔内の Me t h— A細胞を回収して、 ルシフェラ一ゼ活性を 測定した。
その結果、 図 21に示すように対照として生理食塩水のみを投与したマウス及 びルシフェラーゼ発現プラスミ ド 3 0 gのみを投与したマウスでは全く ルシフエラーゼの発現が認められなかったのに対し、 ルシフエラ一ゼ発現プラス ミド 30 gと配列番号 16のべプチド 1 13 nmo 1の混和物を腹腔内投与し たマウスではルシフェラーゼの発現が認められた。
<実施例 25 >ぺプチドが有する細胞への核酸導入能の評価 （ 8 )
i n V i v oでのペプチドの遺伝子導入により薬理効果を示すことを証明す るため、 HS V- t k遺伝子導入による GCV感受性の亢進を利用した抗腫瘍効 果を Lew i s Lung C a r c i n om a細胞 （マウス肺癌細胞） 腹腔内 播種モデルを用いて検討した。 すなわち、 L ew i s Lung C a r e i n oma細胞を C 57 BL/6マウス （日本チヤ一ルス · リパーより購入） の腹腔 内に 1 X 1 05 細胞移植し、 実施例 7で調製した HSV— t k発現プラス ミド 10 gと実施例 1で調製した配列番号 16のべプチド 40 nm o 1の混和 物を細胞移植後に腹腔内投与し、 更に GCVを 3 OmgZkgZd ayの用量で 移植後 1日目から 8日目まで投与した。 その結果、 図 22に示すようにマウスの 平均生存期間は生理食塩水投与群と GCVを 3 OmgZkgZd ayの用量で単 独投与した群はいずれも 14日であったのに対し、 HSV_ t k発現プラスミド 10 gと配列番号 16のペプチド 40 nmo 1の混和物を投与後、 GCVを 3 Omg/k gZd ayの用量で投与した群は細胞移植後 20日目でも全マウス が生存していた。
<実施例 2 6 >ペプチドの毒性の評価
マウスの尾静脈より本発明に用いるぺプチドを投与して毒性を評価した。 マウスは 5週齢、 メスの BALB/cを用いて、 ペプチドの投与用量は 5mg/ kgとした。 その結果、 本発明に用いるペプチド （配列番号 16) を投与しても マウスになんら影響が認められなかった。 これにより、 本発明に用いるペプチド が血液中で凝集塊を形成せず、 安全性が高いことがわかる。
<実施例 27 >プラスミド Zぺプチド複合体の P E G修飾
プラスミドとペプチドの複合体の活性化ポリエチレングリコール （PEG) に よる修飾を行った。
まず、 i n V i t r oで遺伝子導入に用いる P E G修飾したプラスミド Zぺ プチド複合体を以下の方法で調製した。
すなわち、 あらかじめ、 ルシフェラーゼ遺伝子を含むプラスミド （pCMV— L u c ) を 16 gZmLの濃度で含む生理食塩水 100 Lと配列番号 16の ぺプチドを 48 Mの濃度で含む生理食塩水 100 Lとを室温で混合した。 そこへ、 mPEG— SPA5000 (s u c c i n im i dy l e s t e r o f me t h o x y po l y (e t hy l e ne g l yc o l) p r o p i o n i c a c i d, Ave r age M. W. 5000、 S h e a r w a t e r社製） を 23 mgZmLの濃度で含む生理食塩水 10 Lを添加し、 室 温で 1時間反応させて PEG修飾した pCMV_Lu ペプチド複合体 （PE G1) を得た。
次に、 i n V i v oで遺伝子導入に用いる PEG修飾したプラスミドノぺプ チド複合体を以下の方法で調製した。
すなわち、 あらかじめ、 前述のプラスミ ド （p CMV_Lu c) を 268 n gZmLの濃度で含む 5 %グルコース水溶液 1050 Lと配列番号 16のべ プチドを 804 Mの濃度で含む 5 %グルコース溶液 1050 L とを室温で混 合し複合体を形成させた。
そこへ、 前述の mPEG_SPA5000を 263. 8mgZmLの濃度で含 む 5 %グルコース溶液 1 50 Lを添加し、 室温で 1時間反応させて PEG修飾 した pCMV_Lu cZペプチド複合体 （PEG 2) を得た。
<実施例 28 >P EG修飾した、 プラスミド ペプチド複合体の遺伝子導入能の 評価 （i n v i t r o)
実施例 27に記載した方法にしたがって調製した p CM V— L u c ぺプチド 複合体 （PEG1) 、 若しくは、 pCMV— Lu cと配列番号 16のペプチドの 複合体 （PEG未修飾物） を、 1 w gZmLのプラスミド濃度で実施例 9に記載 した方法にしたがって Ve r o細胞へ導入し、 発現したルシフェラ一ゼの活性を 測定した。
その結果、 図 23に示すように、 PEG修飾した複合体を導入した Ve r o細 胞のルシフェラーゼ活性は、 PEG修飾していない複合体を導入した Ve r o細 胞のルシフェラ一ゼ活性と同等であり、 PEG修飾によってもプラスミド ぺプ チド複合体の遺伝子導入能が低下しないことが確認された。
<実施例 29 >P EG修飾した、 プラスミド Zペプチド複合体の遺伝子導入能の 評価 （i n v i vo)
アナフィラキシーショックマウスを用いて、 PEG修飾したプラスミド Zぺプ チド複合体の遺伝子導入能を i n V i v oで評価した。
はじめに、 アナフィラキシーショックマウスを得るために、 マウスの ov a l bum i n (以下 OVAと記載する） 感作を以下の方法で実施した。 すなわち、 まず、 OVA (E g g A 1 u b urn i n, 5 x C r y s t、 生化学工業 社製） を 1. 8%塩ィヒナトリウム水溶液で 32 gZmLとなるよう調製した。 次に、 水酸化アルミニウムゲル （A l u— Ge 1— S、 SERVA社製） を超 純水で SmgZmLとなるよう調製し、 この溶液を氷冷し、 攪拌しながら前述の
OVA溶液を等容混和して OVA/水酸化アルミニウムゲル溶液を調製した。 続いて、 この OVAZ水酸化アルミニウムゲル溶液を BALBZcマウス （ォ ス、 4w、 日本チヤ一ルス · リバ一社） の腹腔に 500 L投与して OVA感作 を行った。 感作は、 5日間おいて 2回行った。
遺伝子導入は、 感作開始後 13日目に実施した。
すなわち、 実施例 27に記載した方法にしたがって調製した PEG修飾した p CMV— Lu cZペプチド複合体 （PEG 2) 、 若しくは、 pCMV— Lu cと 配列番号 16のべプチドの複合体 （ P E G未修飾物） を、 pCMV— Luc換算 で 50 gの用量で、 OVA 50 gと同時に前述の OVA感作マウスに尾静 脈から全身投与した。
翌日、 右肺を摘出し、 Ly s i s Bu f f e r (プロメガ社製） 500 w L 中で、 Handy Pe s t l e (東洋紡社製） を用いて磨砕した。 磨砕液を小 型遠心分離機 （トミー社製） で 12000回転で 1 5分間遠心分離し、 上清 20 Lを実施例 9の方法にしたがってルシフェラーゼ活性を測定した。
その結果、 図 24に示すように PEG修飾していない複合体を投与したマウス の肺よりも、 P E G修飾した複合体を投与したマウスの肺の方が明らかに ルシフェラーゼ活性が高かった。
<実施例 30 >P EG修飾した、 プラスミド ペプチド複合体中に存在する PE G修飾ペプチドの同定 実施例 27で調製した pCMV— Lu cZペプチド複合体 （PEG1) の反応 液 5 5 O Lを、 遠心限外ろ過器 C en t r i c on YM— 1 0 0 (アミコン 社製） に移し、 4°Cで 1, 00 Oxg 10分間の遠心分離を行い、 未反応の遊 離ペプチド及び遊離 PEGを分離 ·除去した。 ろ過器に生理食塩水 500 /iLを 添加し、 再度 4 で 1， 000 xg 10分間遠心分離する操作を 3回繰り返し て洗浄した後、 非還元 SDSサンプルバッファー （第一化学薬品） 50 しを添 加して室温で 5分間静置し、 限外ろ過膜上に残留した p C M V— L u c ぺプチ ド複合体 （PEG1) を含む試料液 （M) を回収した。
次に、 この試料液 （M) 25 を 5— 20%グラジェントゲル （ァ 1 ^一 ) を 用いた SDSポリアクリルアミド電気泳動 （20mA定電流、 90分間） に供し た。 電気泳動後のゲルは、 銀染色キット I I (和光純薬社製） を用いて染色 した。
その結果、 図 25に示したとおり、 分子量 10， 000Da〜20， 000D a付近にブロードな染色像が認められ、 ペプチド部分の分子量、 及び、 1分子あ たりの P E G部分の分子量がそれぞれ約 5 , 000 D aであるから、 ペプチド 1 分子あたりの P E G結合数は 1〜 3分子と推定された。
<実施例 31 >修飾用ペプチドの化学合成および検定
配列番号 1 6のべプチドの C末端側若しくは N末端側にシスティンを付加したぺ プチド （以下、 各々、 ペプチド 1 6 CC、 ペプチド 1 6NCと記載する） を自動 ペプチド合成機 （アプライドバイオシステムズ社製、 43 3型） を用いて添付の 操作マニュアルに従って固相合成した。 切り出し、 脱保護反応を行い、 エーテル 中でペプチドを沈殿させた後、 エーテルを除去し、 蒸留水に溶解させて凍結乾燥 した。 続いて、 1 OmM HC 1を含む 20%ァセトニトリル水溶液で溶解し、 C 18カラム （CAPCELLPAK C 18 AG 120, 資生堂社製） 、 高速 液体クロマトグラフィー （625 LCシステム、 ウォーターズ社製） を用いて、 1 OmM HC 1を含む 20%〜 70%ァセトニトリル水溶液で直線濃度勾配法 により単一ピークが得られるよう精製した。 精製ペプチドは凍結乾燥した後蒸留 水に溶解させ、 凍結保存した。 収量は、 それぞれ 40mg〜5 Omgであった。 続いて、 実施例 2に記載の方法にしたがって、 得られたペプチドが目的物であ ることを確認し、 実施例 3に記載の方法にしたがって、 ペプチド濃度を決定 した。
<実施例 32 >リン脂質が結合した PEG化学修飾ペプチドの調製
マレイミド基を末端に持つ PEGが付加した合成リン脂質 （DSPE— 20M A, 日本油脂社製） の PEGの末端部位に、 ペプチド 16CC若しくはペプチド 16NCを結合させた 「リン脂質が結合した PEG化学修飾ペプチド」 （以下、 各々 DSPE_ 16CC、 DSPE— 16 NCと記載する） を調製した。 すなわ ち、 D S P E _ 20 MA水溶液を 6 mo 1 ZmLとなるよう調製し、 ぺプ チド 16 C C水溶液およびべプチド 1 6 NC水溶液を各々 1 50 nmo 1ノ mL、 300 nmo 1 /mL, 600 nmo 1 ZmLとなるよう調製した。 続い て、 30 の DSPE— 20MA溶液と、 30 Lの各濃度のペプチド溶液を それぞれ等量混和し、 DS PE— 20MAの 2. 5%、 5 %、 1 0%が03 PE— 16CCもしくは DSPE— 16 N Cに転化するよう室温で 2時間反応さ せた後、 1 8 xmo 1 ZmLのシスティン水溶液を 30 L添加して反応を 停止させた。 なお、 ペプチド溶液の代わりに 30 Lの水を混和したものを コントロールとして調製した。
<実施例 33〉 P E G化学修飾べプチドで修飾したドキソルビシン含有リポソ一 ムの作成
PEG化学修飾ペプチドで修飾したリボソーム製剤を作成した。 まず初めに、 陰荷電リボソーム （EL— A— 01， 日本油脂社製） と塩酸ドキソルビシン （和 光純薬社製） を用いてドキソルビシン包含リボソームを調製した。 すなわち、 E L-A-01を 50 ^mo 1 ZmLになるように 5 %グルコース溶液に懸濁し、 塩酸ドキソルビシンを 5 xmo 1 mLになるように 5%グルコース溶液に溶解 して、 EL—A— 01懸濁液 30 xLと塩酸ドキソルビシン溶液 30 とを等 量混和し、 6 Ot:で 5分間加熱した。 次に、 このドキソルビシンが包含されたリ ポソームの表面に実施例 32で調製した DSPE— 16( 〇または03?£— 1 6NCを融合させた。 すなわち、 前述のとおり調製したドキソルビシン包含リポ ソーム溶液 （60 L ) と、 実施例 32で調製した DSPE— 16 CCを含む溶 液または DS PE— 16 NCを含む溶液 75 Lとを混和し、 60 で 5分間加 熱した。
反応させた混和液は遠心分離し （10000 g、 20分間、 4 ） 、 上清を除 いてリボソームに包含されていないドキソルビシンを除いた。 この操作を更に 1 回繰り返して、 最後に 5%グルコース溶液 12 O^Lに懸濁して、 PEG化学修 飾べプチドで修飾されたドキソルビシン包含リポソームを得た。
<実施例 34 >P E G化学修飾べプチドで修飾されたドキソルビシン包含 リボソーム中のドキソルビシンの定量
実施例 33で作成したリボソーム中のドキソルビシンの濃度を定量した。 すな わち、 実施例 3 3で作成したリボソーム溶液 20 / しと、 5 %グルコース 溶液 180 を混和して 10倍に希釈し、 更に 400 Lのイソプロピルアル コールと混和してリボソームを崩壊させ、 溶液中に放出されたドキソルビシン量 を 470 nmの吸光度により測定した。 一方、 0、 1 2. 5、 25、 50、 100 g/mLのドキソルビシンを含む 5 %グルコース溶液を標準サンプルと して調製し、 それぞれ 200 Lにイソプロピルアルコール 400 Lを混和し 検量線を作成した。
<実施例 35 >P E G化学修飾べプチドで修飾されたドキソルビシン包含 リボソームの細胞増殖抑制効果の評価 （1)
実施例 33の方法で作成した DS PE— 16 CCで修飾したドキソルビシン包 含リボソームの細胞増殖抑制効果を、 B 16— BL 6マウスメラノ一マ細胞 と Me t h— Aマウス肉腫細胞で評価した。
まず、 実施例 23に記載の方法にしたがって細胞表面のホスファチジルセリン の量を測定した。 B 16— BL 6細胞と Me t h— A細胞を F I TC標識 Ann e x i nVで処理し、 フローサイトメトリーで測定した結果、 816—8 6の 平均蛍光強度は 735で M e t h _ A細胞は 114であり、 B 16— B L 6細胞 の方が高かった。
次に P E G化学修飾べプチドで修飾されたドキソルビシン包含リボソームの細 胞増殖抑制効果を評価した。 すなわち、 B 16— BL6細胞と Me t h— A細胞 を各々 96ゥエルプレートに 1 x 103 細胞の割合で植込み、 37°C、 5 % C02 雰囲気下で 1日間培養した。 翌日、 各細胞に DSPE— 16CCで修飾し たドキソルビシン包含リボソームをドキソルビシン濃度換算で 0、 10、 30、 100, 300、 1000、 3000 n g/mLの用量で添加し、 更に 37°C、 5 %C02 雰囲気下で 2日間培養後、 WST— 1溶液 （TAKARA社製） を 10 Lずつ各ゥエルに添加し発色させた。 細胞増殖抑制効果はサンプル非添 加群の吸光度を 1 0 0 %として各サンプルの活性を評価した。 その結果、 リボソーム表面に存在する総 PEG分子の 2. 5%、 5%、 10%が PEG化学 修飾ペプチドに該当するドキソルビシン包含リボソームの細胞増殖抑制効果は、 P E G化学修飾ペプチドを含まないドキソルビシン包含リボソームと比較して、 I C 5。値でホスファチジルセリンの表出量の低い Me t h— A細胞では最大で約 3倍の増強効果が認められ、 ホスファチジルセリンの表出量の高い B 16-BL 6細胞では最大で約 33倍の増強効果が認められた （表 6) 。
表 6 配列番号 16のペプチドが結合した PEG 1C50 [ ng / mL ]
X100「％]
PEG分子総数 B16-BL6 Meth-A
0 10000 2500
2.5 1500 2500 5 300 1500
10 350 900 <実施例 36 >P E G化学修飾べプチドで修飾されたドキソルビシン包含 リボソームの細胞増殖抑制効果の評価 （ 2 )
実施例 33の方法で作成した DSPE— 16 NCで修飾したドキソルビシン包 含リボソームの細胞増殖抑制効果を、 実施例 3 5に記載の方法にしたがって B 16—BL 6マウスメラノーマ細胞で評価した。 その結果、 リボソーム表面に 存在する総 PEG分子の 2. 5%、 5%、 10 %が PEG化学修飾ペプチドに該 当するドキソルビシン包含リボソームの細胞増殖抑制効果は、 PEG化学修飾べ プチドを含まないドキソルビシン包含リボソームと比較して、 I C5。値で最大で 約 10倍の増強効果が認められた （表 7) 。
配列番号 16のペプチドが結合した PEG χ 1nn ro/nl
50 [ng/mL]
PEG分子総数 X 100 [ o]
0 2000
2.5 800 5 250
10 200 <実施例 37 >P E G化学修飾べプチドで修飾されたドキソルビシン包含 リポソ一ムの担癌マウス生存期間延長効果
実施例 33の方法で作成した DS PE— 16 NCで修飾したドキソルビシン包 含リボソームの担癌マウス生存期間延長効果を、 B 16— BL 6マウスメラノ一 マ細胞担癌マウスで評価した。 すなわち、 1. 0 X 106 細胞の B 16— BL 6 マウスメラノ一マ細胞を C 57/BL 6マウス （7週令、 メス、 日本チヤ一ルス リバ一） の脇腹に皮内移植し、 移植後 6日目に腫瘍体積を指標に群れ分けを行つ た。 コントロール （5%グルコースのみ） および各リボソーム製剤 （ドキソルビ シン換算量として 5mg/kgの用量） の投与は、 細胞移植後、 6日目および 9 日目に行った。 その結果、 5%グルコースのみ投与したマウスの平均生存期間は 30. 4日であり、 PEG化学修飾ペプチドを含まないドキソルビシン包含リポ ソームを投与したマウスの平均生存期間は 39. 2日であり、 リボソーム表面に 存在する総 P E G分子の 6 %が P E G化学修飾べプチドに該当するドキソル ビシン包含リボソームを投与した担癌マウスの平均生存期間は 48. 0日で あった。
<比較例 1 >
配列番号 1のペプチドとァミノ酸組成は同じであるが、 ァミノ酸配列がまつた く不規則で 「本発明の四面構造を示す 18アミノ酸配列」 を含まないペプチド （ 配列番号 25) について、 核酸導入能を実施例 9に記載の方法にしたがって、 ま た、 ホスファチジルセリン親和性を実施例 20に記載の方法にしたがって評価し た。 その結果、 核酸導入能、 ホスファチジルセリン親和性いずれも認められ なかった。 また、 実施例 5に記載の方法にしたがって CDスペクトルを測定した。 その結 果、 SDS存在下においてもひ一ヘリックス構造は認められなかった。
<比較例 2 >
配列番号 1のペプチドにアミノ酸置換を施し、 「本発明の四面構造を示す 18 アミノ酸配列」 を含まないペプチドとなった配列番号 26について、 実施例 9に 記載の方法にしたがって核酸導入能を評価した。 その結果、 蛍光カウント数 は 10000未満であり、 核酸導入能は認められなかった。
<比較例 3 >
ポリリジン （平均分子量： 11000) のホスファチジルセリン親和性を実施 例 20に記載の方法にしたがって評価した。 その結果、 ホスファチジルセリン親 和性は認められなかった。 また、 実施例 4に記載の方法にしたがって BS A溶液 中での吸光度を測定した。 その結果、 測定値は 1以上であり、 凝集体の形成が認 められた。
<比較例 4 >
α—へリックス構造を有する両親媒性塩基性ペプチドである 4 fi ( (N i i d ome T e t a l . , J. B i o l. Chem. , Vo l . 272, 15 307 ( 1997) ) ) (配列番号 27のペプチド） のホスファチジルセリン親 和性を実施例 20に記載の方法にしたがって評価した。 その結果、 ホスファチジ ルセリン親和性は認められなかった。 また、 実施例 4に記載の方法にしたがって BS A溶液中での吸光度を測定した。 その結果、 測定値は 1以上であり、 凝集体 の形成が認められた。
<比較例 5 > 比較例 4に記載した 4 6 (配列番号 2 7のべプチド） を実施例 2 6に記載した 方法にしたがってマウスに投与したところ、 マウスは投与直後に死亡した。 これは、 該ペプチドが α—ヘリックス構造を有する両親媒性塩基性ペプチドで あるため血液中で凝集塊を形成し易く、 動物体内に投与した場合に著しい 性を 示す結果を反映しているものと考えられた。 産業上の利用可能性
本発明により、 安全性が高く、 ペプチドと結合する物質との複合体の作製が容 易 （優れた操作性） であり、 複合体の溶解性に優れた、 細胞へのペプチドと結合 する物質の導入選択性が優れ、 導入効率が高いベクターとなる、 P E G化学修飾 による比活性が低下しない新規 P E G化学修飾ペプチド、 及び、 その製造方法を 提供できる。
また、 本発明により、 P E G化学修飾ペプチドと、 ペプチドと結合する物質と の複合体、 及び、 その製造方法を提供できる。
また、 本発明により、 P E G化学修飾ペプチドによって修飾されたキヤリ ァー、 及び、 その製造方法を提供できる。
具体的な、 本発明の効果を以下に述べる。
本発明のペプチドは、 核酸と結合能を有し、 該核酸を細胞へ導入する能力を有 するため、 ペプチドベクターとして有用である。
特定の物質の共存下でのみひ一へリックス構造を取るため、 血清中で実質的な 凝集体を形成せず、 溶解性が高い。
また、 該ペプチドと核酸が結合した場合、 該核酸にヌクレアーゼ耐性能を付与 するため、 安定である。
さらに該ペプチドがホスファチジルセリンに親和性を有する。 このため、 炎症 若しくは免疫担当細胞による細胞の活性化及び Z若しくは障害若しくはアポトー シス等のいわゆる免疫応答反応が進展している部位、 異常な細胞分裂が進展して いわゆる細胞が癌化している部位、 血液凝固反応や動脈硬化が進展して血管を構 成する細胞が障害されている部位、 活性酸素による細胞の障害反応が進展してい る部位若しくは蛋白質分解酵素による細胞の活性化及び 若しくは障害反応が進 展している部位等における細胞、 組織及び臓器に核酸を選択的に導入するため、 核酸の投与量も少なくてすみ， 副作用も軽減する。
本発明の P E G修飾ペプチドは、 上記の特徴、 効果を保持し、 かつ、 活性化 P E G化学修飾により、 例えば、 標的細胞への遺伝子や薬剤の取り込み率の向上、 薬理活性の向上、 毒性の低減等に優れる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 1 8アミノ酸からなる配列を含む、 ポリエチレングリコール （P E G) 化学 修飾ペプチドであって、
前記 1 8アミノ酸からなる配列が、 エドモンソン ·ホイ一ル ·プロット法によ る α—ヘリックス構造モデルにおいて、 交互に配置された二つの疎水面と二つの 親水面の 4つの面から構成され、
前記疎水面の 1つが 5〜 7アミノ酸から構成され、 かつ疎水性アミノ酸の構成 比率が 8 0モル％以上であり、
前記親水面の 1つが 5〜 6アミノ酸から構成され、 かつ親水性アミノ酸の構成 比率が 8 0モル％以上であって、 かつアルギニン又はリジンから選ばれるァミノ 酸の構成比率が 5 0モル％以上であり、
前記疎水面の別の 1つが 2〜 4疎水性ァミノ酸から構成され、
前記親水面の別の 1つが 3〜 5アミノ酸から構成され、 かつ親水性アミノ酸の 構成比率が 8 0モル％以上である、 P E G化学修飾ペプチド。
2 . 全アミノ酸数が 2 0以上であって、 両端が N末端及び C末端であり、 両端の アミノ酸を除いた任意の連続した 1 8アミノ酸が、 前記 1 8アミノ酸からなる配 列を示す請求項 1に記載の P E G化学修飾べプチド。
3 . N末端及び C末端のアミノ酸が親水性アミノ酸である請求項 1又は 2に記載 の P E G化学修飾べプチド。
4. 前記 1 8アミノ酸からなる配列が下記のアミノ酸配列の中の任意の連続した 1 8アミノ酸配列である請求項 1〜 3のいずれかに記載の P E G化学修飾べプチ ド。
X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X1卜 XI 2- XI 3- XI 4- XI 5- XI 6-X17-X18-X19- X20 - X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36 但し、
「X4、 X8、 Xl l 、 X15 、 及び X19 」 、 「X8、 Xl l 、 X15 、 X19 、 及び X22 」 、 「XI I 、 X1 5 、 X19 、 111 、 及び X26 」 、 「X1 5 、 X1 9 、 X22 、 X26 、 及び X29 」 、 並びに 「X19 、 X22 、 X26 、 X29 、 及び X33 」 において、 それぞれ 5ァ ミノ酸中、 4アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
X3、 X10 、 X12 、 X21 、 X28 、 及び X30 はそれぞれ疎水性アミノ酸、 中性親水 性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「X2、 X5、 X9、 X13 、 及び X1 6 」 、 「X5、 X9、 X1 3 、 X1 6 、 及び X20 」 、 「X9、 X 1 3 、 X1 6 、 X20 、 及び X23 」 、 「X13 、 X1 6 、 X20 、 X23 、 及び X27 」 、 「XI 6 、 X20 、 X23 、 X27 、 及び X31 」 、 並びに 「X20 、 X23 、 111 、 X31 、 及び X34 」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上は中性親水 性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、 かつそのうち少なくとも 3ァミノ 酸はアルギニン又はリジンであり、
X6、 X17 、 X24 、 及び X35 はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
X7、 X14 、 X18 、 X25 、 X32 、 及び X36 はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩 基性親水性アミノ酸である。
5 . 前記 1 8アミノ酸からなる配列を含む、 P E G化学修飾ペプチドのペプチド 部分が、 下記のアミノ酸配列からなる請求項 1〜4のいずれかに記載の P E G化 学修飾ペプチド。 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16- XI 7- XI 8 - XI 9-X20 -X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37 但し、
XI及び X37 は親水性アミノ酸であり、
「X4、 X8、 Xl l 、 X15 、 及び X19 」 、 「X8、 Xl l 、 X15 、 X19 、 及び X22 」 、 「XI I 、 X15 、 X19 、 X22 、 及び X26 」 、 「X15 、 X19 、 X22 、 X26 、 及び X29 」 、 並びに 「X19 、 X22 、 X26 、 X29 、 及び X33 」 において、 それぞれ 5ァ ミノ酸中、 4アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
X3、 X10 、 X12 、 X21 、 X28 及び X30 はそれぞれ疎水性アミノ酸、 中性親水性 アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「X2、 X5、 X9、 X13 、 及び X16 」 、 「X5、 X9、 X13 、 X16 、 及び X20 」 、 「X9、 X13 、 X16 、 X20 、 及び X23 」 、 「X13 、 X16 、 X20 、 X23 、 及び X27 」 、 「XI 6 、 X20 、 X23 、 X27 、 及び X31 」 、 並びに 「X20 、 X23 、 X27 、 X31 、 及び X34 」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上は中性親水 性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、 かつ、 そのうち少なくとも 3アミ ノ酸はアルギニン又はリジンであり、
X6、 X17 、 X24 、 及び X35 はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、
X7、 X14 、 X18 、 X25 、 X32 、 及び X36 はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩 基性親水性アミノ酸である。
なお、 X2から X36 までのアミノ酸は少なくとも連続して 1 8アミノ酸が保存さ れる限りアミノ酸が欠失、 付加、 挿入又は置換されてもよい。
6 . 前記 X1 ~X37 が下記のアミノ酸である請求項 5に記載の P E G化学修飾ぺプ チド。
XIはトレオニンであり、
X37 はセリンであり、
X2、 X5、 X9、 X20 、 X23 、 及び X27 はそれぞれアルギニン又はリジンであり、 X3及び X21 はそれぞれチロシン、 フエ二ルァラニン、 セリン又はアルギニンの いずれかであり、
X4、 X17 、 X22 、 及び X35 はそれぞれロイシンであり、
X6、 X15 、 X24 、 及び X33 はそれぞれロイシン又はイソロイシンであり、 X7、 X13 、 X25 、 及び X31 はそれぞれヒスチジン又はアルギニンであり、 X8及び X26 はそれぞれプロリンであり、
X10及び X28 はそれぞれセリン、 アルギニン又はロイシンのいずれかであり、
XI I 及び X29 はそれぞれトリブトファン又はロイシンであり、
X1 及び X30 はそれぞれバリン、 ロイシン又はセリンのいずれかであり、
X14及び X32 はそれぞれグルタミン、 ァスパラギン又はアルギニンのいずれか であり、
X16 及び X34 はそれぞれァラニン又はアルギニンであり、
X18 はアルギニン、 リジン又はセリンのいずれかであり、
X19 はロイシン又は卜レオニンであり、
X36 はアルギニン又はセリンである。
なお、 X2から X36 までのアミノ酸は少なくとも連続して 1 8アミノ酸が保存さ れる限りアミノ酸が欠失、 付加、 挿入又は置換されてもよい。
7 . 前記 1 8アミノ酸からなる配列を含む、 P E G化学修飾ペプチドのペプチド 部分が、 配列番号 1〜24のいずれかのアミノ酸配列からなる、 請求項 1〜6の いずれかに記載の P E G化学修飾べプチド。
8. 前記 18アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドのペプチド 部分が、 配列番号 16又は 19のアミノ酸配列からなる請求項 1〜6のいずれか に記載の PEG化学修飾ペプチド。
9. 前記 18アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドの PEG部 分の分子量が、 約 200Da〜約 100， 000 D aである請求項 1〜 8のいず れかに記載の P E G化学修飾べプチド。
10. 以下の 18アミノ酸からなる配列を含む PEG化学修飾ペプチド、 及び、 ペプチドと結合する物質を含有する複合体であって、
前記 18アミノ酸からなる配列が、 エドモンソン ·ホイール ·プロット法によ るひ—ヘリックス構造モデルにおいて、 交互に配置された二つの疎水面と二つの 親水面の 4つの面から構成され、
前記疎水面の 1つが 5〜 7アミノ酸から構成され、 かつ疎水性アミノ酸の構成 比率が 80モル％以上であり、
前記親水面の 1つが 5〜 6アミノ酸から構成され、 かつ親水性アミノ酸の構成 比率が 80モル％以上であって、 かつアルギニン又はリジンから選ばれるァミノ 酸の構成比率が 50モル％以上であり、
前記疎水面の別の 1つが 2〜 4疎水性ァミノ酸から構成され、
前記親水面の別の 1つが 3〜5アミノ酸から構成され、 かつ親水性アミノ酸の 構成比率が 80モル％以上である複合体。
11. 全アミノ酸数が 20以上であって、 両端が N末端及び C末端であり、 両端 のアミノ酸を除いた任意の連続した 1 8アミノ酸が、 前記 1 8アミノ酸からなる 配列を示す請求項 1 0に記載の複合体。
1 2. N末端及び C末端のアミノ酸が親水性アミノ酸である請求項 1 0又は 1 1 に記載の複合体。
1 3. 前記 1 8アミノ酸からなる配列が下記のアミノ酸配列の中の任意の連続し た 1 8アミノ酸配列である請求項 1 0〜： L 2のいずれかに記載の複合体。
X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11 - XI 2-X13- XI 4- XI 5-X16-X17-X18-X19-X20- X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36 但し、
「X4、 X8、 XI 1 、 X15 、 及び X19 」 、 「X8、 XI 1 、 X15 、 X19 、 及び X22 」 、 「XII 、 X15 、 X19 、 X22 、 及び X26 」 、 「X15 、 X19 、 X22 、 X26 、 及び X29 」 、 並びに 「X19 、 X22 、 X26 、 X29 、 及び X33 」 において、 それぞれ 5ァ ミノ酸中、 4アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
X3、 X10 、 X12 、 X21 、 X28 、 及び X30 はそれぞれ疎水性アミノ酸、 中性親水 性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「X2、 X5、 X9、 X13 、 及び X16 」 、 「X5、 X9、 X13 、 X16 、 及び X20 」 、 「X9、 X13 、 X16 、 X20 、 及び X23 」 、 「X13 、 X16 、 X20 、 X23 、 及び X27 」 、 「XI 6 、 X20 、 X23 、 X27 、 及び X31 」 、 並びに 「X20 、 X23 、 121 、 X31 、 及び X34 」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上は中性親水 性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、 かつそのうち少なくとも 3ァミノ 酸はアルギニン又はリジンであり、
X6、 X17 、 X24 、 及び X35 はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、 X7、 X14 、 X18 、 X25 、 X32 、 及び X36 はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩 基性親水性アミノ酸である。
14. 前記 18アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドのぺプチ ド部分が、 下記のアミノ酸配列からなる請求項 10〜13のいずれかに記載の複 合体。
X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X1卜 XI 2- XI 3— XI 4- XI 5- XI 6— XI 7 - XI 8- XI 9-X20 -X21-X22-X23-X24-X25-X26-X27-X28-X29-X30-X31-X32-X33-X34-X35-X36-X37 但し、
XI及び X37 は親水性アミノ酸であり、
「X4、 X8、 Xll 、 X15 、 及び X19 」 、 「X8、 XI 1 、 X15 、 X19 、 及び X22 」 、 「XII 、 X15 、 X19 、 X22 、 及び X26 」 、 「X15 、 X19 、 X22 、 X26 、 及び X29 」 、 並びに 「X19 、 X22 、 X26 、 X29 、 及び X33 」 において、 それぞれ 5ァ ミノ酸中、 4アミノ酸以上は疎水性アミノ酸であり、
X3、 X10 、 X12 、 X21 、 X28 及び X30 はそれぞれ疎水性アミノ酸、 中性親水性 アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸のいずれかであり、
「X2、 X5、 X9、 X13 、 及び X16 」 、 「X5、 X9、 X13 、 X16 、 及び X20 」 、 「X9、 X13 、 X16 、 X20 、 及び X23 」 、 「X13 、 X16 、 X20 、 X23 、 及び X27 」 、 「XI 6 、 X20 、 X23 、 X27 、 及び X31 」 、 並びに 「X20 、 X23 、 X27 、 X31 、 及び X34 」 において、 それぞれ 5アミノ酸中、 4アミノ酸以上は中性親水 性アミノ酸又は塩基性親水性アミノ酸であり、 かつ、 そのうち少なくとも 3アミ ノ酸はアルギニン又はリジンであり、
X6、 XI 7 、 X24 、 及び X35 はそれぞれ疎水性アミノ酸であり、 X7、 X14 、 X18 、 X25 、 X32 、 及び X36 はそれぞれ中性親水性アミノ酸又は塩 基性親水性アミノ酸である。
なお、 X2から X36 までのアミノ酸は少なくとも連続して 1 8アミノ酸が保存さ れる限りアミノ酸が欠失、 付加、 挿入又は置換されてもよい。
1 5 . 前記 X1〜X37 が下記のアミノ酸である請求項 1 4に記載の複合体。
XIはトレオニンであり、
X37 はセリンであり、
X2、 X5、 X9、 X20 、 X23 、 及び X27 はそれぞれアルギニン又はリジンであり、 X3及び X21 はそれぞれチロシン、 フエ二ルァラニン、 セリン又はアルギニンの いずれかであり、
X4、 XI 7 、 X22 、 及び X35 はそれぞれロイシンであり、
X6、 XI 5 、 X24 、 及び X33 はそれぞれロイシン又はイソロイシンであり、 X7、 X13 、 X25 、 及び X31 はそれぞれヒスチジン又はアルギニンであり、 X8及び X26 はそれぞれプロリンであり、
X10及び X28 はそれぞれセリン、 アルギニン又はロイシンのいずれかであり、 XI I 及び X29 はそれぞれトリブトファン又はロイシンであり、
X12 及び X30 はそれぞれパリン、 ロイシン又はセリンのいずれかであり、 X14及び X32 はそれぞれグルタミン、 ァスパラギン又はアルギニンのいずれか であり、
XI 6 及び X34 はそれぞれァラニン又はアルギニンであり、
X18 はアルギニン、 リジン又はセリンのいずれかであり、
X19 はロイシン又はトレォニンであり、 X36 はアルギニン又はセリンである。
なお、 X2から X36 までのアミノ酸は少なくとも連続して 18アミノ酸が保存さ れる限りアミノ酸が欠失、 付加、 挿入又は置換されてもよい。
16. 前記 18アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドのぺプチ ド部分が、 配列番号 1〜24のいずれかのアミノ酸配列を含む、 請求項 10〜1
5のいずれかに記載の複合体。
17. 前記 18アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドのぺプチ ド部分が、 配列番号 16又は 19のアミノ酸配列を含む請求項 10〜 15のいず れかに記載の複合体。
18. ペプチドと結合する物質が核酸である、 請求項 10〜17のいずれかに記 載の複合体。
19. 前記 18アミノ酸からなる配列を含む、 PEG化学修飾ペプチドの PEG 部分の分子量が、 約 200Da〜約 100, O O ODaである請求項 10〜 18 のいずれかに記載の複合体。
20. 18アミノ酸からなる配列を含むペプチドと活性化ポリエチレングリコ一 ルとを反応させる、 請求項 1〜9のいずれかに記載の P EG化学修飾べプチドの 製造方法。
21. 請求項 20の方法により製造される、 ポリエチレングリコール （PEG) により化学修飾されたぺプチド。
22. a) 18アミノ酸からなる配列を含むペプチドと、 活性化ポリエチレング リコール （PEG) とを反応させる工程、
b) 前記 a) により得られる PEG化学修飾ペプチドと、 ペプチドと結合する 物質とを反応させる工程、
よりなる、 請求項 10〜19のいずれかに記載の複合体の製造方法。
23. a) 18アミノ酸からなる配列を含むペプチドと、 ペプチドと結合する物 質とを反応させる工程、
b) 前記ペプチドと前記ペプチドと結合する物質との反応物を、 活性化ポリエ チレングリコール （PEG) と反応させる工程、
よりなる、 請求項 10〜19のいずれかに記載の複合体の製造方法。
24. 請求項 22又は 23の方法により製造される、 ポリエチレングリコール （ PEG) により化学修飾されている P E G化学修飾べプチドとぺプチドと結合す る物質との複合体。
25. 請求項 1〜8のいずれかに記載の PEG化学修飾ペプチドによって修飾さ れたキャリアー。
26. a) 18アミノ酸からなる配列を含むペプチド、 若しくは 18アミノ酸か らなる配列を含むぺプチドの N末端または C末端にシスティンが結合したぺプチ ドと、 活性化 PEGとを反応させる工程、
b) 前記 a) により得られる反応物とキャリアーとを反応させる工程、 若しく は、 前記 a) により得られる反応物を構成要素としてキャリアーを構築する 工程、
よりなる、 請求項 25に記載の PEG化学修飾ペプチドによって修飾されたキヤ リァ一の製造方法。
27. 請求項 26の方法により製造される PEG化学修飾ペプチドによって修飾 されたキヤリア一。
2 8 . 請求項 2 5に記載の P E G化学修飾ペプチドによって修飾された キヤリア一に結合もしくは包含された物質を細胞内へ送達する方法。
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