WO2003080832A1 - Candida utilis contenant de la $g(g)-glutamylcysteine - Google Patents

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Hiroaki Nishiuchi
Yasushi Nishimura
Motonaka Kuroda
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Ajinomoto Co.,Inc.
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Definitions

  • the present invention relates to a Candida utilis that produces an amylglutamylcystine and a food using the same. Erglutamyl cystine and cysteine produced therefrom are useful in the food field. Background art
  • Cystein is used to improve the flavor of food.
  • Proteolytic and semi-synthetic methods are known for the production of cysteine, but currently the main methods used are proteolytic and semi-synthetic methods.
  • Natural food materials with a high cysteine content have been sought for the purpose of using cysteine to improve the flavor of foods, but such natural food materials have been hardly known.
  • a food material having a high content of cysteine can be obtained by heating or enzymatic treatment of a yeast extract containing fragile myristine (W00 / 30474).
  • Erglutamylcystine is synthesized in Saccharomyces cerevisiae using cystine and glutamic acid as substrates by the action of adartalmilcystine synthase.
  • Gluyuthione is synthesized by the action of dartathione synthase using r-Duyuyu milcystine and glycine as substrates.
  • Yeast containing high darumamilcystine is described in TO 00/30474; Otake et al., Agri. Biol. Chem., 54 (12), 3145-3150, 1990; Chris et al., Molecular Biology of the Cell.
  • Candida utilis was formerly classified as the genus Pichia or Hansenula, but is now classified as the genus Candida.
  • the genus Candida is sexual reproduction or sexual reproduction Is one of the 15 genera of incomplete fungal yeast that cannot be found, and from the phylogenetic point of view, it is a genus of collectives.
  • yeast belonging to the genus Candida often have unique properties compared to Saccharomyces cerevisiae. For example, Candida utilis obtains most of its energy through the pentose phosphate pathway that produces pyridine bases (Biot echno lgy, vo l.
  • Candida utilis has been reported to grow better per unit sugar than Saccharomyces cerevisiae (Bio techno lgy, vol. 3 p30, 1983). Moreover, since ethanol by-product does not occur under strict aerobic conditions (Kondo et al (JOURNAL OF BACTERIOLOGY, DEC. 1995, p7171-7177)), it is necessary to pay attention to ethanol by-product in culture. Low.
  • the present inventor has determined that the yeast extract produced using Candida utilis containing a high content of unidal milcystine is cheaper than the yeast extract produced using Saccharomyces cerevisiae, and is not suitable for industrial production. I thought it was desirable.
  • the present invention has been made from the above viewpoint. It is an object of the present invention to provide a candy dautilis containing, a yeast extract using the same, a dardal milcystine or cysteine-containing food using the same, and a method for producing the same.
  • the present inventors have found that a gene fragment that is predicted to encode daryuthion synthase from Candida utilis from the homology with other organisms. And by using this fragment to reduce glutathione synthetase activity, Candida utilis succeeded in producing dardarmyristine. Furthermore, the present inventors have succeeded in obtaining a gene fragment predicted to encode adartamylcystine synthase from Candida utilis, and completed the present invention.
  • the gist of the present invention is as follows.
  • Candida utilis according to any one of (1) to (5) is cultured under suitable conditions, The obtained culture or a fraction thereof, or the heat-treated culture or fraction, mixed with a raw material for food and drink, and processed into a food and drink, Production method of contained food. .
  • (B) A protein having an amino acid sequence including substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43, and having ⁇ -Dalyu Milcystine synthase activity .
  • FIG. 1 is a diagram showing the construction (first half) of the Candida utilis dartathione synthase gene disruption set.
  • FIG. 2 is a diagram showing the construction (second half) of the Candida utilis daryuthione synthase gene disruption set.
  • FIG. 3 is a diagram showing the construction of a Candida utilis aglutamylcystine synthase gene replacement cassette.
  • FIG. 4 is a diagram showing the construction of a C. dautilis r-glutamylcystine synthase gene replacement strain.
  • FIG. 5 is a diagram showing the construction of an expression vector for a glutamylcystine synthase homolog derived from Candida utilis. BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
  • the Candida utilis of the present invention is 1% by weight or more, preferably 1.5% by weight or more, more preferably 2.0% by weight or more per dry yeast cell in the logarithmic growth phase when cultured in a minimal medium.
  • dardarmilcystine is 1% by weight or more, preferably 1.5% by weight or more, more preferably 2.0% by weight or more per dry yeast cell in the logarithmic growth phase when cultured in a minimal medium.
  • Examples of the minimal medium include SD medium having the following composition.
  • Nitrogen Base is prepared by dissolving 1.7 g of Bacto Yeast Nitrogen Base w / o Amino Acids and Ammonium Sulfate (Difco) and 5 g of ammonium sulfate in 100 ml of sterilized water and adjusting the pH to 5.2. Adjusted to a certain degree, and filtered and sterilized by filtration)
  • the “logarithmic growth phase” refers to a time when the number of cells in culture increases logarithmically with respect to the culture time.
  • the culture may be shaking culture or stationary culture, but shaking culture is preferred.
  • the content of dardalamylcystine is the dry yeast cell, that is, the solid component of the cell, for example, the content (%) of dardalamylcystine relative to the cell weight after heating at 105 ° C for 4 hours.
  • the content of the above-mentioned dardarmilcystine does not have to be maintained throughout the logarithmic growth phase, and preferably at least at any point in the logarithmic growth phase, preferably after the logarithmic growth phase.
  • the above values can be shown in the state. That is, the state is a logarithmic growth phase having an absorbance of 12 or more of the absorbance of the culture medium when the logarithmic growth phase is changed to a steady state.
  • the Candida utilis of the present invention preferably has a daltathione synthase activity of 0.005 mol GSHZmg protein Z time or less, more preferably 0.001 mol 1 GSHZmg protein no time or less ( “GSH” stands for daryu thione). Furthermore, it is preferable that the activity of the dalubion thione synthase is below the detection limit. Daryuthion synthase is measured by the method of Gushima et al. (Gushima, T. et al., J. Appl. Biochem., 5, 210 (1983)). be able to.
  • a suitable bacterial strain of Candida utilis for example, a wild strain
  • a mutation treatment or gene recombination technique for example, the technique disclosed in the following literature, etc.
  • Microbiology Let tersl65 (1998) 3 35-340, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Dec. 1995, p7171-7177, Curr Genet 1986; 10 (8): 573-578, W0 98/14600) Can be obtained by modifying so that The decrease in the activity of the daryuthione synthetase includes the disappearance of the activity of the darthathione synthase.
  • Candidutilis containing dardarmilcystine can also be bred by modifying it so that the intracellular glutamylcystine synthase activity is increased.
  • the dardarmilcystine synthase activity can be measured by the method of Jackson (Jackson, R. C., Biochem. J., 111, 309 (1969)).
  • Mutation treatment can be performed by ultraviolet irradiation, or by MNNG, ethyl methane sulfonate (EMS), methyl methane sulfonate (MMS), etc.
  • MNNG ethyl methane sulfonate
  • EMS ethyl methane sulfonate
  • MMS methyl methane sulfonate
  • the strain of Candida utilis is not particularly limited, but examples thereof include ATCC15239 strain.
  • the strain is American ' Available from the American Type Culture Collection, address 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, United States of America.
  • Another example is a method of modifying the coding region so that the active dartathione synthase is not expressed.
  • Candida utilis is transformed with a recombinant DNA containing a mutant dartathione synthase gene lacking the 5 'end and 3' end, and the mutant gene and chromosome are on the chromosome. By causing recombination with a wild-type gene, the gene on the chromosome can be destroyed.
  • the recombinant DNA is linearized by cutting with a restriction enzyme or the like, a strain in which the recombinant DNA is incorporated into the chromosome can be efficiently obtained.
  • a recombinant DNA containing a mutant gene that has been deleted so that it does not produce a normal functioning glutathione synthase is introduced into Candida utilis.
  • the mutant gene and the normal gene on the chromosome can be destroyed.
  • a strain in which recombinant DNA is integrated into the chromosome as described above undergoes recombination with the original dartathione synthase gene sequence on the chromosome, resulting in the wild-type dulbuthione synthase gene and the mutant type.
  • Two fusion genes with the dartathione synthase gene are inserted into the chromosome with the other part of the recombinant DNA (the vector part and one marker gene) in between. Therefore, in this state, the wild-type daryuthione synthase gene functions.
  • the mutant daryuthione synthase gene is excised, and on the other hand, the mutated daryuthione synthase gene is left on chromosome DNA and the wild-type glutathione synthase gene is excised . In either case, since the marker gene is lost, the second recombination can be confirmed by the phenotype corresponding to the marker gene.
  • the target gene replacement strain can be selected by amplifying the dartathione synthase gene by PCR and examining its structure.
  • Examples of the dalubion thione synthase gene or a fragment thereof used for gene disruption include DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 17 and DNA that can hybridize with the base sequence under stringent conditions, or SEQ ID NO: Examples thereof include DNA having 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 99% or more homology with the base sequence shown in FIG.
  • stringent conditions it is equivalent to the usual Southern Eight Bridging Washing Conditions of 60 ° C, 1 XSSC, 0.1% SDS, preferably 0.1 XSSC, 0.1% SDS The conditions for hybridizing at a salt concentration are included.
  • Strains with reduced dartathione synthase activity can be selected using the sensitivity to methyldarioxal as an index (Ohtalie, Y. et al., Agri. Biol. Chem., 54 (12), 3145-3150, 1990). Strains that can biosynthesize a certain amount of dartathione (strains with dartathione synthase activity and? -GC synthase activity) are resistant to methyl darixol.
  • the decrease in dartathione synthase activity can be confirmed, for example, in the same manner as in the following example.
  • L strain was 2.3 cm, and the N ⁇ 3 strain was 1.8 cm.
  • ⁇ 3 is a strain obtained by modifying No. 1 as the parent strain and deleting the arginine residue after position 370 of Gluyuthion synthase. For this reason, glutathione synthase is weakened and has a characteristic that it contains only a small amount of daryuthione.
  • the Candida utilis of the present invention may have an enhanced Dardar milcystine synthase activity in addition to a decrease in Dardar thione synthase activity.
  • the activity of the 7-Daltamylcystine synthase can be enhanced by introducing it into the Candidutilis in an expressible form.
  • Examples of the Dardal evening myristine synthase gene include a gene derived from Saccharomyces cerevisiae and a gene derived from Candida utilis described later.
  • a method for introducing a single daltamylcystine synthase gene into Candida utilis is a recombinant DNA containing the same gene and a DNA sequence existing on the Candida utilis chromosome.
  • There is a method to transform Dirtyris and incorporate recombinant DNA into the chromosome (Kondo, K. et al., J. Bacteriol., 177, 7171-7177 (1995)). Specifically, it can be performed in the same manner as the gene replacement.
  • the target gene can be introduced into Candida utilis using a plasmid containing an autonomously replicating sequence (ARS) present in chromosomal DNA.
  • ARS autonomously replicating sequence
  • Candida utilis transformation methods include protoplast method, KU method (H. Ito et al., JBateriol., 153-163 (1983)), KUR method (fermentation and industrial vol.4). 3, p. 630-637 (1985)), and the method used for normal yeast transformation, such as the electoral position method, can be employed.
  • KU method H. Ito et al., JBateriol., 153-163 (1983)
  • KUR method fermentation and industrial vol.4
  • the method used for normal yeast transformation such as the electoral position method
  • the method used for normal yeast transformation such as the electoral position method, can be employed.
  • spore formation of yeast separation of haploid yeast, etc.
  • “Chemistry and Biology Experiment Line 31 Yeast Experiment Technique” First Edition, Yodogawa Shoten; Version, sheep soil company, etc.
  • Candida utilis aldarmilcystine synthase gene is a DNA encoding the following protein (A) or (B).
  • (B) A protein having an amino acid sequence containing one or several amino acid substitutions, deletions, insertions, or additions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43, and having the activity of dadalmicystine synthase.
  • the T-Dalyu milcystine synthase activity refers to the activity of catalyzing the reaction of producing dardar milcystine from cystine and daryuminic acid.
  • the dartalmilcystine synthase encoded by the DNA of the present invention has one or several amino acids at one or more positions in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 43 as long as the enzyme activity is not impaired.
  • ' May include amino acid substitutions, deletions, insertions, additions, or inversions.
  • severe varies depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein. Specifically, it is 2 to 15, preferably 2 to 8, more preferably 2. ⁇ 5 pieces.
  • DNA encoding a protein that is substantially identical to the above-mentioned dardarmilcystine synthase is substituted, deleted, inserted, added, or deleted at a specific site by, for example, site-directed mutagenesis. Modify the base sequence to include the inversion JP03 / 03715
  • the modified DNA as described above can also be obtained by a conventionally known mutation treatment.
  • Mutation treatment includes a method of treating DNA encoding dardal myristine synthase in vitro with hydroxylamine or the like, and a microorganism retaining DNA encoding dardalamylcystine synthase, such as Escherichia
  • Examples of the method include treating the genus bacteria with ultraviolet rays or N-methyl-N′-nitro-N-nitrotroguanidine (NG) or a mutating agent usually used for mutagenesis, such as EMS.
  • NG N-methyl-N′-nitro-N-nitrotroguanidine
  • substitution, deletion, insertion, addition, or inversion of the amino acid residues as described above is based on the difference in the Candida tyris strain that holds the r-daltamylcystine synthase. Also included are mutations or variations.
  • r DNA encoding a protein having the activity of one dartamcystine synthase can also be obtained by encoding DNA encoding substantially the same protein as argamylamylcysteine synthase.
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed.
  • Such a probe can be prepared by PCR using an oligonucleotide prepared based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 42 as a primer and a DNA fragment containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 42 as a cage.
  • the conditions for washing the hypridase are 50, 2 X SSC, and 0.1% SDS.
  • Some of the genes that hybridize under the above conditions include those in which a stop codon has occurred in the middle and those that have lost activity due to mutations. These are selected by examining the enzyme activity of the expression product. can do.
  • DNA having the base sequence shown in SEQ ID NO: 42 was introduced into Saccharomyces cerevisiae, where dartamylcystine synthase was weakened, as shown in the examples below. It has been confirmed that it encodes the fragile milk system synthase.
  • a homology search of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 42 with a database revealed that the amino acid sequence of Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces bombardin alta cystisin synthase was 50.93% and 42.88%, respectively. The homology was confirmed.
  • the culture may be a culture solution containing yeast cells, or may be yeast cells, cell debris, or cell extract (yeast extract) collected therefrom.
  • a fraction containing dardalamylcystine may be obtained from the crushed cell or yeast extract.
  • the culture or a fraction thereof is acid to neutral in the presence of water, specifically 3 to 30 hours at 50 to 120 ° C at pH 1-7. By holding, you can generate cysteine. Yes.
  • dardal amyl peptide-degrading enzyme (ardal amyl transferase, dartal amyl cyclotransferase, dal Cysteine can also be produced by adding a minase or the like and allowing it to act at 15 to 70 ° C for 1 to 30 minutes.
  • the medium used for the culture is not particularly limited as long as the yeast of the present invention grows well and produces monoglutamyl cysteine efficiently. If necessary, add necessary nutrients to the medium according to the characteristics of the yeast to be used.
  • yeast extract may be one obtained by extracting yeast cells with hot water, or one obtained by digesting yeast cells.
  • yeast extract of the present invention may be one in which cysteine is generated by heat treatment or enzyme treatment, or when processed into food or drink together with other food or drink raw materials, or after heat processing. It's good.
  • the heat treatment of the yeast extract can be performed as follows. Add water to the yeast exhaled powder, adjust the pH to 5 with hydrochloric acid, make a 2% aqueous solution, and heat it at 98 ° C for 180 minutes.
  • the above-mentioned culture or the fraction containing cystine milcystine or cysteine can be used for the production of food and drink.
  • the food and drink include alcoholic beverages, bread foods, and fermented food seasonings.
  • the production of cysteine from T-daltamil cystine by heat treatment may be performed during or after the production of food and drink.
  • the yeast culture or a fraction thereof may be heat-treated.
  • the food or drink is produced by mixing a dardal evening milkcystine or a culture containing cysteine or a fraction thereof with a raw material for food or drink and processing the food or drink.
  • the food / beverage products of this invention can be manufactured by the same method using the raw material similar to normal food / beverage products except using the said culture or fraction.
  • raw materials include rice, barley, corn starch, etc. for alcoholic beverages, flour, sugar, salt, putter, yeast for fermentation, etc. for bread foods, and large amounts for fermented food seasonings.
  • examples include beans and wheat.
  • Yeast extract or a concentrate thereof, or a dried product thereof can be used as a fermented food seasoning by itself.
  • Candida utilis ATCC15239 strain was cultured with shaking in YPD test tube medium at 30 ° C, and chromosomes were recovered from the cells using Gentori-kun yeast (Takara Shuzo Co., Ltd., Code9084).
  • VLKPQREGGGNN (SEQ ID NO: 3)
  • GGVAAGF (SEQ ID NO: 5) Design degenerate primers from each amino acid sequence, 1 and 2, 1 and 3, 1 and 4, 1 and 5, 2 and 3, 2 and 4, 2 and 5, 3 and 4 , 3 and 5, and each combination of 4 and 5 Degenerated PCR was performed using the heavy duty primer corresponding to the combination. The PCR product was electrophoresed on an agarose gel, the region of the expected size was excised, and the DNA was collected. Furthermore, nested PCR was performed using this recovered DNA as a saddle shape, but the target fragment could not be obtained.
  • primers corresponding to the following amino acid sequences were set with reference to the codon usage frequency of the candy dusty.
  • the PCR product was electrophoresed on an agarose gel (Nusieve 3: lagarose 3%, 1XTAE solution (Takara Shuzo Co., Ltd., CodeF5180A)). After the gel was stained with ethidium bromide solution, a region corresponding to 100 bp to 300 bp was excised, and DNA was collected from the gel using MagExtractor (T0Y0B0, CodeNM_601).
  • 3 ′ RACE using 3 ′ RACE System for Raid Amplification of cDNA Ends (GIBCOBRL, Cat. O 18373-027) was performed.
  • a cDNA—next strand was prepared from mRNA prepared from Candida utilis using the Rneasy Mini Kit (QIAGEN, Cat. No. 74104), and then PCR was performed three times.
  • the primers used are as follows.
  • Second PCR TCA GAT CTT GGT AAA GAG GC (SEQ ID NO: 1 3) and AUAP primer with 3 'RACE kit
  • 3rd PCR AGA CTG GCA TTT GAG TCT CC (SEQ ID NO: 14) and AMP primer with 3 'RACE kit
  • PCR was performed using K0D dash (T0Y0B0 company code LDP-101) under the following conditions according to the manufacturer's instructions. 94 ° C 2 minutes 1 cycle ⁇ 94 ° C 1 minute, 50 ° C 30 seconds, 74 ° C 40 seconds 30 cycles.
  • the PCR product was ligated to pGEM-T Easy vector and transformed into E. coli.
  • the nucleotide sequence of the enzyme in the transformant obtained was analyzed, and gene fragment information predicted to contain Candida utilis glutathione synthase was obtained.
  • primers were designed (GGT TCT AAG AAG ATT CAG CA (SEQ ID NO: 15), CCC TCG GAA AAG GAG ACG AAG G (SEQ ID NO: 16)), and Candida utilis ATCC15239
  • the collected chromosomal DNA was used as a saddle and PCR was performed to determine the base sequence of the amplified product.
  • PCR was performed using Pyrobest (Takara Shuzo Co., Ltd., Code R0005A) according to the manufacturer's instructions under the following conditions.
  • 98 cycles at 98 ° C for 2 minutes ⁇ 98 ° C for 20 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C for 2 minutes.
  • the result is shown in SEQ ID NO: 17 c.
  • the amino acid sequence of dartathione synthase predicted to be encoded by this base sequence is shown in SEQ ID NO: 18.
  • PCR was performed using the chromosomal DNA recovered from Candida utilis ATCC15239 as a saddle and using the primers of SEQ ID NOs: 15 and 16 above. PCR was performed using Pyrobest (Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the manufacturer's instructions under the following conditions. 98 ° C2 minutes ⁇ 98 20 seconds, 55 ° C 30 seconds, 72 ° C 2 minutes 40 cycles.
  • the amplification product was purified using QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Cat. No 28106), adenine was added to the end of the purified product, and then ligated to the PGEM_T Easy vector. Addition of adenine was performed by using AmpliTaq (ABI, Code N808-0161) and using 2.5 mM dATP instead of dNTP and reacting at 72 for 10 minutes.
  • chromosomal DNA recovered from Candida utilis ATCC15239 is used as a saddle, and PCR is performed using the following primers to contain the URA3 gene The fragment was amplified. PCR was performed using K0D dash (T0Y0B0 company code LDP-101) according to the manufacturer's instructions under the following conditions. 94 ° C 2 minutes ⁇ 94 1 minute, 54:30 seconds, 74 40 seconds 30 cycles.
  • the amplification product was introduced into the pGEMT-Easy vector, and the CURA3 / pGEMT-Easy vector was obtained.
  • the CGSH2Ctermi / pGEMT-Easy vector and CURA3 / pGEMT-Easy vector were cut with HindlII and Kpnl, respectively.
  • a fragment containing CGSH2 and pGEM T-Easy main body was recovered from the CGSH2Ctermi / pGEMT-Easy vector, and a fragment containing CURA3 was recovered from the CURA3 / pGEMT-Easy vector. These recovered fragments were ligated and transformed into E. coli JM109. In this way, CURA3 A CGSH2 / pGEMT-Easy vector was prepared.
  • a CURA3 ⁇ CGSH2 / PGEMT-Easy vector cut with restriction enzyme No 11 was used as a cage and amplified by PCR using the primers shown in SEQ ID NOs: 15 and 16. In this way, a Candida utilis dartathione synthase gene disruption power set was produced (Figs. 1 and 2). 3> Acquisition of uracil-requiring Candida utilis ATCC15239ura- shares
  • ATCC15239-derived uracil auxotrophic strain ATCC15239ura- strain was obtained according to a conventional method (Luis et al., FEMS Microbiogy Letters 165 (1998) 335-340).
  • the ATCC15239ura-strain was presumed to be a ura3 mutant because it was complemented by the URA3 gene as described below.
  • ATCC15239ura-strain was cultured overnight at 30 ° C in YPD test tube medium.
  • the culture product was inoculated into YP D flask medium (500 ml Sakaguchi flask, 50 ml) and cultured with shaking at 30 ° C.
  • Cells were collected in the logarithmic growth phase, and the cells were washed 3 times with 1M sorbitol solution cooled to 4 ° C. The washed cells were suspended in a cooled 1M sorbitol solution.
  • ATCC 15239 A gsh2 strain was inoculated in SD medium and cultured with shaking at 30 ° C for 2 days.
  • the culture was inoculated with 2% in SD medium and cultured with shaking at 30 ° C.
  • the content of dartamil cystine after 7 hours and after 9 hours was 1.08% and 1.12%, respectively.
  • Dartathion was below the detection limit.
  • ATCC15239 A gsh2 strain was inoculated into YPD medium and cultured with shaking at 30 ° C. 2% of the culture was inoculated into SD medium (400 ml in a 2 L fin Erlenmeyer flask) and cultured at 30 ° C with shaking. The cells were collected in the logarithmic growth phase, and the cells were washed twice with 1 M Sorpitol cooled to 4 ° C. The washed cells were suspended in 0.5 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 0.1 mM PMSF (phenylmethanesulfonyl fluoride).
  • Tris-HCl buffer pH 7.5
  • PMSF phenylmethanesulfonyl fluoride
  • PEP Phosphoenoyl rubic acid (SIGMA, Code P-7127)
  • PK Pyruvate quinase (SIGMA, Code P-1903)
  • SIGMA Pyruvate quinase
  • the PCR product was electrophoresed on an agarose gel, a region corresponding to about 700 bp of the expected size was excised, and DNA was recovered from the gel using MagExtractor (T0Y0B0, CodeNPK-601).
  • nested PCR was performed using this recovered DNA as a cage. PCR was performed as described above.
  • the amplified product was electrophoresed on an agarose gel and then stained with ethimubu mouth amide solution to cut out a region corresponding to about 700 bp, and DNA was recovered from the gel using MagExtractor.
  • the recovered DNA was ligated to pGEM-T Easy vector using DNA ligation kit ver.2 (Takara Shuzo Co., Ltd.) to transform E. coli JM109 competent cells. From one of the transformants obtained, a transformant presumed to contain a gene fragment expected to encode Candida utilis dardarmilcysteine synthase was obtained.
  • the base sequence of the insert possessed by the transformant was determined according to a conventional method.
  • 3 ′ RACE (3 ′ RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends (GIBCOBRL)) was performed. After synthesizing the cDNA-next strand from mRNA prepared from Candida utilis using the Rneasy Mini Kit, PCR was performed three times.
  • the primers used are as follows.
  • PCR was performed using KOD dash under the following conditions according to the manufacturer's instructions. 94 ° C 2 minutes 1 cycle — 94 ° C 1 minute, 50 seconds for 30 seconds, 74 ° C for 40 seconds for 30 cycles.
  • the PCR product was ligated to the pGEM-T Easy vector and transformed into E. coli. By analyzing the base sequence of the insula possessed by the obtained transformant, information on the gene fragment predicted to contain the Candida utilis aldarmilcystine synthase gene was obtained.
  • 5 'RACE was performed based on the nucleotide sequences that have been identified so far.
  • the kit was 5 'RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Reagent Assembly version 2.0 (GIBC0BRL).
  • PCR was performed 3 times using the following primers. PCR was performed under the following conditions using a KOD dash according to the manufacturer's instructions. 94 ° C 2 minutes 1 cycle — 94 ° C 1 minute, 50 ° C 30 seconds, 74 ° C 40 seconds 30 cycles.
  • the used primers are as follows.
  • Second PCR GTC AGC TAA GTG GCC TTT G (SEQ ID NO: 34) and the A UAP primer supplied with the kit
  • the PCR product was ligated to pGEM-T Easy vector, and E. coli was transformed.
  • the base sequence of the insert of the transformant obtained was analyzed and the Candida utilis key sequence was analyzed.
  • the primers used in RT for cDNA-next strand preparation are as follows.
  • PCR was performed 3 times using the following primers.
  • the primers used are as follows.
  • Second PCR CAG CGA ATC ACC GTT GTA CGG (SEQ ID NO: 3 8) and AUAP primer included in the kit
  • the PCR product was ligated to pGEM-T Easy vector and transformed into E. coli.
  • the nucleotide sequence of the enzyme in the transformant obtained was analyzed, and gene fragment information that was predicted to contain the Candida utilis-Daltamilcystine synthase gene was obtained.
  • PCR was performed, and the base sequence of the amplified product was determined.
  • PCR was performed using Pyrobest (Takara Shuzo) under the following conditions according to the manufacturer's instructions. 98 2 minutes ⁇ 98 ° C 20 seconds, 55 ° C 30 seconds, 72 ° C 2 minutes 40 cycles.
  • the primers used are as follows.
  • F2 GGG TTT GTT GTC TAT CGG CTT AAG (SEQ ID NO: 40)
  • R2 AGC TGT CTT GGT CGT CAT ATC CAT (SEQ ID NO: 4 1)
  • Saccharomyces cerevisiae No. 3 strain described in International Publication W0 2001/090310 Pamphlet was used as Saccharomyces cerevisiae with reduced activity of dartathione synthase.
  • the ⁇ 3 strain is a strain constructed as a weakened dartathione synthase gene substitution strain with the ⁇ strain (described in the pamphlet of WO0 2001/090310), which is a uracil-requiring yeast haploid of Saccharomyces cerevisiae, as the parent strain .
  • the chromosomal DNA of the ⁇ strain was used as a saddle type, and the region from the midstream region to the terminal region of the dardarmilcystine synthase gene (SEQ ID NO: 44) was amplified by PCR.
  • the PCR reaction was performed using KOD dash (T0Y0B0) according to the manufacturer's instructions under the following conditions. Using the reaction solution having the composition shown below, 94 1 minutes later, 94 ° C 30 seconds, 60 40 seconds, and 74 ° C 1 minute were repeated 30 cycles.
  • GF1 gt g gac gac cgt act ccg aag
  • GR1 acc caa ate gat aat gtc aac
  • the GSH1 gene fragment amplified as described above was ligated to Plasmid PGE-T Easy (Promega) according to the manufacturer's instructions to obtain GSHldash / pGEM.
  • QCF1 (ctt ttc ttg ggt ggg tag taa tt tc aat agg act) (SEQ ID NO: 48) and QCR1 (agt cct att gaa aaa tta cta c cc acc caa gaa aag) (SEQ ID NO: 49) were used as primers. In this way, plasmid GS HlMdash / pGEM was prepared. '
  • A-glutamylcystine synthase (a weakened dartathione synthase) into which a mutation has been introduced as described above retains a weak enzyme activity (International Publication W0 200 1/090310 pamphlet).
  • plasmid pYES2dash (plasmid obtained by removing 2 ⁇ ori from plasmid PYES2 (Invitrogen)) and GSHlMdash / pGEM described in International Publication No. WO2001 / 090310, and both GSHlMdash / pGEM, are digested with restriction enzymes Sacl and Sphl. From pYES2dash, a fragment containing the URA3 gene was cut out, and from GSHlMdash / pGEM, a region containing the partial gene sequence of dardarmilcystine synthase was cut out and ligated.
  • GSHlMdash / pYES2dash was prepared.
  • GSHlMdash / pYES2dash was cleaved with the restriction enzyme Bbel to obtain a gene replacement cassette (Fig. 3).
  • the gene replacement cassette prepared as described above the gene substitution of the myristine synthase gene was performed. ⁇ ⁇ ; After preculture of 1 strain, the culture was transferred to 50 ml of YPD medium and cultured until the logarithmic growth phase. The cultured cells were suspended in 1M sorbitol, the gene replacement cassette was mixed, and transformation was performed by electoral positioning. The transformed strain was cultured on an SD plate containing ImM Daryuthion, and the growing strain was selected. It was confirmed by PCR that the gene replacement cassette had been integrated at the desired position on the chromosome, and the resulting strain was designated as a ⁇ 4 intermediate.
  • the ⁇ 4 intermediate was cultured in YPD medium supplemented with ImM dalbutione, and the culture product was plated on SDF0A plates containing ImM daltathione. Determine the sequence of the glutathione synthase gene of the strain that has grown on the plate. Confirming the correct substitution, the ⁇ ⁇ ! 4 strain was obtained (Fig. 4).
  • transformants were obtained by introducing the CGSH1 / PYES2 vector into? (0; 3 strains and? ⁇ 0! 4 strains. After pre-culturing the ⁇ 3 strain or ⁇ ! 4 strain, the culture was treated with 50 ml of liquid. Transplanted into medium (YPD medium containing ImM glutathione) and cultured to logarithmic growth phase Suspended cultured cells in 1M sorbitol, mixed with CGSH1 / PYES2 vector, and transformed by electrovolume Transformants were cultured on SD pre-implant containing ImM dartathione and selected for growth strains ⁇ ! 3 and ⁇ ! 4 strains showed uracil requirement and contained CGSH1 / PYES2 vector It was possible to grow on SD medium only, and it was confirmed by a conventional method that the obtained transformant contained the CGSHl / pYES2 vector.
  • transformants No; 3 / CGSHl and Na4 / CGSH1 strains were obtained.
  • No; 3 / C GSH1 was sensitive to 2 mM methyldarixal, whereas the N 4 / CGSH1 strain was not sensitive to 2 mM methyldalixal.
  • the N3 / CGSH1 strain contained almost no daryuthione during its logarithmic growth phase, whereas the N4 / CGSH1 strain contained 0.4% of daltathione.
  • ⁇ 3 strain is mutated in glutathione synthase of Saccharomyces cerevisiae and its ability to synthesize glutathione is reduced. It was shown that CGSH1 complements Saccharomyces cerevisiae dartalmilcystine synthase from the decrease.
  • a Candida tyris containing a high content of dardarmilcystine is provided.
  • a yeast extract that can be used to improve the flavor of foods can be produced at low cost.

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Description

明細書 ァーダルタミルシスティンを含有するキャンディダ ·ュティリス 技術分野
本発明は、 ァ—グルタミルシスティンを産生するキャンディダ ·ュティリス、 及びそれを利用した食品に関するものである。 ァーグルタミルシスティン、 及び それから製造されるシスティンは、 食品分野で有用である。 背景技術
システィンは、 食品の風味改善などを目的に用いられている。 システィンの製 法については蛋白分解法や半合成法などが知られているが、 現在主に用いられて いる方法は蛋白分解法と半合成法である。 システィンを食品の風味改善に用いる ことを目的として、 システィン含量の高い天然食品素材が求められているが、 そ のような天然食品素材は従来ほとんど知られていなかった。 一方、 ァーグル夕ミ ルシスティンを含む酵母エキスを加熱または酵素処理すれば、 システィンを高含 有する食品素材を得ることが可能であると報告されている （W0 00/30474) 。
ァーグルタミルシスティンは、 サッカロマイセス ·セレピシェ (Saccharomyce s cerevisiae) では、 ァーダルタミルシスティン合成酵素の働きによりシスティ ンとグルタミン酸を基質にして合成される。 また、 グル夕チオンはダルタチオン 合成酵素の働きにより r一ダル夕ミルシスティンとグリシンを基質にして合成さ れる。 ァ—ダルタミルシスティンを高含有する酵母は、 TO 00/30474; Otake et al. , Agri. Biol. Chem. , 54 (12), 3145-3150, 1990; クリスら、 Molecular Bi ology of the Cell. , 8, 1699-1707, 1997; Inoue et al. , Biochimica et Biop hysica Acta, 1395 (1998) 315-320) などで報告されている。 しかし、 これらの 報告は全てサッカロマイセス ·セレピシェを用いてなされた検討であり、 キャン デイダ ·ュティリスを用いた報告例はない。
キャンディダ 'ュティリスは、 以前はピヒア （Pichia) 属、 又はハンゼニユラ (Hansenula) 属に分類されていたこともあるが、 現在はキャンディダ属として 分類されている。 このキャンディダ属とは、 有性生殖を行なわないか、 有性生殖 を行なうことが見つけられない不完全菌酵母 15の属の 1つで、 系統分類の見地か らみれば全く寄せ集めの属であり （酵母研究技法の新展開（I SBN番号： 4-7622-467 0-0) , P124-125) 、 キャンディダ属に属する酵母は、 サッカロマイセス 'セレビ シェと比較して特異な性質を有していることが多い。 例えば、 キャンディダ，ュ ティリスは、 ピリジン塩基を生産するペントース燐酸経路でエネルギーの大部分 を得るという特徴 (Bi o t echno lgy, vo l . 3 (ISBN番号： 3- 527- 25765- 9) p30, 198 3) や、 カタボライト制御が弱いという特徴 （Bi ot echno lgy, vol . 3 p30, 1983) 等を有している。 また、 研究用酵母としては、 通常サッカロマイセス ·セレビシ ェが用いられているため、 キャンディダ ·ュティリスに関する知見は数少ない。 そのような状況から、 キャンディダ ·ュティリスがどの様にしてダル夕チオンを 生合成しているか報告例がなく、 わずかに、 亜鉛耐性等を利用して取得された特 定のキャンディダ ·ュティリスにおいて、 グル夕チオンを高生産する温度が通常 の温度より 5^以上低いとの報告例 （特公平 03- 18872) などがあるのみである。 このように、 キャンディダ ·ュティリスにおいては、 グル夕チオン合成酵素活 性とァ一ダルタミルシスティンの蓄積との関係は知られておらず、 ダル夕チオン 合成酵素活性を低下させることによりァーダルタミルシスティンを蓄積させるこ とができるか否かは不明であった。 発明の開示 キャンディダ ·ュティリスは単位糖あたりの生育がサッカロマイセス ·セレビ シェよりよいと報告されている （Bi o techno lgy, vo l . 3 p30, 1983) 。 また、 厳 格な好気条件下ではエタノールの副生が生じない為 （Kondo et al ( JOURNAL OF BACTERIOLOGY, DEC. 1995, p7171-7177) ) 、 培養上エタノールの副生に注意す る必要性が低い。 そこで、 本発明者は、 r一ダル夕ミルシスティンを高含有する キャンディダ ·ュティリスを用いて製造した酵母エキスは、 サッカロマイセス · セレピシェを用いて製造した酵母エキスよりも安価になり、 工業生産には望まし いと考えた。
本発明は、 上記観点からなされたものであり、 ァ— 含有するキャンディダ 'ュティリス、 及びそれを用いた酵母エキス、 並びにそれ らを用いたァーダルタミルシスティン又はシスティン含有食品及びその製造法を 提供することを課題とする。
本発明者らは、 上記課題を解決するために鋭意検討を行なった結果、 他の生物 との相同性から、 キャンディダ ·ュティリスからダル夕チオン合成酵素をコード していると予測される遺伝子断片を取得し、 その断片を利用してグルタチオン合 成酵素活性を低下させることにより、 キャンディダ ·ュティリスにァーダルタミ ルシスティンを生産させることに成功した。 さらに、 キャンディダ 'ュティリス からァ一ダルタミルシスティン合成酵素をコードしていると予測される遺伝子断 片を取得することに成功し、 本発明を完成するに至った。
本発明の要旨は、 以下のとおりである。
(1) 最小培地で培養したとき、 対数増殖期に乾燥菌体当たり 1重量％以上の r 一ダルタミルシスティンを含有するキャンディダ ·ュティリス。
(2) 最小培地が S D培地である（1)のキャンディダ ·ュティリス。
(3) ダル夕チオン合成酵素活性が 0. 00 5 mo l GSHZmgタンパク 質 Z時間以下である（1)又は（2)のキャンディダ ·ュティリス。
(4) 細胞内のダルタチォン合成酵素活性が低下するようにダルタチォン合成酵 素をコードする遺伝子が改変された（1 )〜（3)のいずれかのキャンディダ 'ュティ リス。
(5) ァーダルタミルシスティン合成酵素をコードする遺伝子の発現量が上昇す るように改変された（1)〜（ のいずれかのキャンディダ ·ュティリス。
(6) (1)〜（5)のいずれかのキャンディダ ·ュティリスを好適な条件で培養して 得られる培養物、 もしくはァ—ダル夕ミルシスティンを含む前記培養物の分画物、 又は熱処理によってシスティンが生成したこれらの培養物もしくは分画物を含む 飲食品。
(7) 飲食品が発酵食品調味料である（6)の飲食品。
(8) (1)〜（5)のいずれかのキャンディダ ·ュティリスを好適な条件で培養して 得られる培養物を用いて製造された酵母エキス。
(9) (1)〜（5)のいずれかのキャンディダ 'ュティリスを好適な条件で培養し、 得られる培養物もしくはその分画物、 又は加熱処理した前記培養物叉は分画物を、 飲食品原料に混合し、 飲食品に加工することを特徴とする、 ァーダルタミルシス ティン又はシスティン含有食品の製造法。 .
(10) 下記 （A) 又は （B) に示すタンパク質をコードする DNA。
(A) 配列番号 43に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
(B) 配列番号 43に示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、 欠失、 挿入、 または付加を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 τ—ダル夕 ミルシスティン合成酵素活性を有するタンパク質。
(11) 下記 （a) 又は （b) に示す DNAである（10)の DNA。
(a) 配列番号 42の塩基番号 110〜2101の記載の塩基配列を含む D N
A。
(b) 配列番号 42の塩基番号 110〜2101の記載の塩基配列又は同塩基 配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダィズし、 かつ、 ァーダルタミルシスティン合成酵素活性を有するタンパク質。 図面の簡単な説明
- 図 1は、 キャンディダ ·ュティリスのダルタチオン合成酵素遺伝子破壊力セッ 卜の構築 （前半） を示す図である。
図 2は、 キャンディダ ·ュティリスのダル夕チオン合成酵素遺伝子破壊力セッ 卜の構築 （後半） を示す図である。
図 3は、 キャンディダ ·ュティリスのァ—グルタミルシスティン合成酵素遺伝 子置換カセットの構築を示す図である。
図 4は、 キャンディダ ·ュティリスの r—グルタミルシスティン合成酵素遺伝 子置換株の構築を示す図である。
図 5は、 キャンディダ ·ュティリス由来のァ—グルタミルシスティン合成酵素 ホモログの発現ベクターの構築を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を詳細に説明する。 5
< 1 >本発明のキヤンディダ ·ュティリス
本発明のキャンディダ ·ュティリスは、 最小培地で培養したとき、 対数増殖期 に乾燥酵母菌体当たり 1重量％以上、 好ましくは 1. 5重量％以上、 より好まし くは 2. 0重量％以上のァーダルタミルシスティンを含有する。
前記最小培地としては、 下記組成を有する SD培地が挙げられる。
〔SD培地組成〕
グルコース 2 % '
Nitrogen Base 1倍濃度
(10倍濃度 Nitrogen Baseは、 1.7gの Bacto Yeast Nitrogen Base w/o Amino Aci ds and Ammonium Sulfate (Difco社）と 5gの硫酸アンモニゥムを混合したものを 1 00mlの滅菌水に溶解し、 pHを 5.2程度に調整し、 フィルタ一濾過滅菌したもの）
「対数増殖期」 とは、 培養中における細胞数が培養時間に対して対数的に増加 する時期をいう。 培養は、 振盪培養でも静置培養でもよいが、 振とう培養が好ま しい。
ァ一ダルタミルシスティンの含有量は、 乾燥酵母菌体すなわち菌体の固形成分、 例えば、 105°Cで 4時間加熱した後の菌体重量に対するァーダルタミルシスティ ンの含有量 (%) をいう。
尚、 上記のァーダルタミルシスティンの含有量は、 対数増殖期のすべてにわた つて維持される必要はなく、 少なくとも対数増殖期の任意の時点において、 好ま しくは、 対数増殖期の次に述べる状態で、 上記の値を示せばよい。 即ち、 前記状 態とは、 対数増殖期から定常状態になったときの培養液の吸光度の 1 2以上の 吸光度を有する対数増殖期である。
本発明のキャンディダ ·ュティリスは、 ダルタチオン合成酵素活性が 0. 00 5 mo l GSHZmgタンパク質 Z時間以下であることが好ましく、 0. 0 0 1 mo 1 GSHZmgタンパク質ノ時間以下であることがより好ましい ( 「GSH」 はダル夕チオンを示す） 。 更には、 ダル夕チオン合成酵素活性が検出 限界以下であることが好ましい。 ダル夕チオン合成酵素性は、 Gushimaらの方法 (Gushima, T. et al.， J. Appl. Biochem. , 5, 210 (1983)) によって測定する ことができる。
本発明のキャンディダ ·ュティリスは、 キャンディダ ·ュティリスの適当な菌 株、 例えば野生株を、 突然変異処理又は遺伝子組換え技術 （例えば、 以下の文献 等に開示されている技術が利用できる。 FEMS Microbiology Let tersl65 (1998) 3 35-340、 JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Dec. 1995 ，p7171- 7177、 Curr Genet 1986; 10 (8) :573- 578、 W0 98/14600) により、 細胞内のダルタチオン合成酵素活性が低 下するように改変することにより、 取得することができる。 ダル夕チオン合成酵 素活性が低下するとは、 ダルタチオン合成酵素活性が消失することを含む。 また、 細胞内のァ -グルタミルシスティン合成酵素活性が上昇するように改変すること によっても、 ァーダルタミルシスティンを含有するキャンディダ ·ュティリスを 育種することができる。 ァーダルタミルシスティン合成酵素活性は、 Jacksonの 方法 （Jackson, R. C. , Biochem. J. , 111, 309 (1969)) によって測定すること ができる。
突然変異処理としては、 紫外線照射、 または、 MNNG、 ェチルメタンスルフォネ ート （EMS) 、 メチルメタンスルフォネ一卜 (MMS) 等の通常変異処理に用いられ ている変異剤によつて処理する方法が挙げられる。
また、 遺伝子組換え技術を利用してダル夕チオン合成酵素活性を低下させるに は、 グルタチオン合成酵素活性が低下するようにダルタチオン合成酵素をコ一ド する遺伝子を改変する方法が挙げられる。 キャンディダ ·ュティリス ATCC15239 株のダルタチオン合成酵素をコードする遺伝子の一部の塩基配列を、 配列番号 1 7に示す。 従来、 キャンディダ属酵母のダルタチオン合成酵素遺伝子は知られて いなかつたが、 本発明者は、 各種生物のダルタチオン合成酵素のアミノ酸配列か ら、 保存性の高い領域を検索し、 配列番号 1〜8の領域を見出した。 そして、 そ れらのうち、 配列番号 6〜8に示すアミノ酸配列に対応するプライマーを用いて P CRを行うことにより、 キャンディダ 'ュティリス染色体 DN Aから、 グルタ チオン合成酵素をコードすると予想される遺伝子断片を増幅することに成功した。 同遺伝子断片を取得するためのプライマ一としては、 配列番号 1 5及び 1 6に示 すプライマーが挙げられる。 また、 キャンディダ 'ュティリスの菌株としては特 に制限されないが、 例えば ATCC15239株が挙げられる。 同菌株は、 アメリカン ' タイプ ·カルチャー ·コレクション（American Type Culture Collection), 住所 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, United States of A merica) から入手することができる。
ダル夕チオン合成酵素をコードする遺伝子を改変してダル夕チオン合成酵素活 性を低下させるには、 例えば、 ダルタチオン合成酵素の発現量が低下するように 前記遺伝子の発現調節配列を改変するか、 または、 活性を有するダルタチオン合 成酵素が発現しないように、 コード領域を改変する方法が挙げられる。 具体的に は例えば、 5 ' 末端部及び 3 ' 末端部を欠失した変異型ダルタチオン合成酵素遺 伝子を含む組換え DNAでキャンディダ ·ュティリスを形質転換し、 変異型遺伝 子と染色体上の野生型遺伝子との間で組換えを起こさせることにより、 染色体上 の遺伝子を破壊することができる。 その際、 組換え DNAには、 宿主の栄養要求 性等の形質にしたがって、 マーカ一遺伝子を含ませておくと操作がしゃすい。 ま た、 前記組換え DN Aは、 制限酵素で切断する等により直鎖状にしておくと、 染 色体に組換え DN Aが組み込まれた株を効率よく取得することができる。
また、 ダル夕チオン合成酵素遺伝子の内部の配列を欠失し、 正常に機能するグ ル夕チオン合成酵素を産生しないように改変した変異型遺伝子を含む組換え DN Aをキャンディダ ·ュティリスに導入し、 変異型遺伝子と染色体上の正常な遺伝 子との間で組換えを起こさせることにより、 染色体上の遺伝子を破壊することが できる。
上記のようにして染色体に組換え DN Aが組み込まれた株は、 染色体上にもと もと存在するダルタチオン合成酵素遺伝子配列との組換えを起こし、 野生型ダル 夕チオン合成酵素遺伝子と変異型ダルタチオン合成酵素遺伝子との融合遺伝子 2 個が組換え DNAの他の部分 （ベクター部分及びマーカ一遺伝子） を挟んだ状態 で染色体に揷入されている。 したがって、 この状態では野生型ダル夕チオン合成 酵素遺伝子が機能する。
次に、 染色体 DN A上に変異型ダルタチオン合成酵素遺伝子のみを残すために、 2個のダル夕チオン合成酵素遺伝子の組換えにより 1コピーのダル夕チオン合成 酵素遺伝子を、 ベクター部分 （マーカ一遺伝子を含む） とともに染色体 DNAか 脱落させる。 その際、 野生型ダルタチオン合成酵素遺伝子が染色体 DNA上に 薦 715
8
残され、 変異型ダル夕チオン合成酵素遺伝子が切り出される場合と、 反対に変異 型ダル夕チオン合成酵素遺伝子が染色体 DN A上に残され、 野生型グル夕チオン 合成酵素遺伝子が切り出される場合がある。 いずれの場合もマーカー遺伝子が脱 落するので、 2回目の組換えが生じたことは、 マーカ一遺伝子に対応する表現形 質によって確認することができる。 また、 目的とする遺伝子置換株は、 PCRによ りダルタチオン合成酵素遺伝子を増幅し、 その構造を調べることによって、 選択 することができる。
遺伝子破壊に用いるダル夕チオン合成酵素遺伝子又はその断片としては、 配列 番号 1 7に示す塩基配列を有する DNAの他に、 同塩基配列とストリンジェン卜 な条件下でハイブリダィズし得る DNA、 又は配列番号 1 7に示す塩基配列と 9 0 %以上、 好ましくは 95 %以上、 より好ましくは 99%以上の相同性を有する DN Aが挙げられる。 ストリンジェントな条件としては、 通常のサザン八イブリ ダイゼ一シヨンの洗いの条件である 60°C、 1 X S S C, 0. 1 %SDS、 好ま しくは、 0. 1 X S S C、 0. 1 %SDSに相当する塩濃度でハイブリダィズす る条件が挙げられる。
尚、 サッカロマイセス ·セレピシェのダル夕チオン合成酵素遺伝子の破壊につ いては、 W0 00/30474に開示されている。 キャンディダ ·ュティリスに組換え D NAを導入する方法としては、 エレクト口ポレーシヨン法 （Luisら， FEMS Micro biology Letters 165 (1998) 335-340) が挙げられる。
ダルタチオン合成酵素活性が低下した菌株は、 メチルダリオキサールに対する 感受性を指標として選択することができる （Ohtalie, Y. et al.， Agri. Biol. C hem. , 54 (12), 3145-3150, 1990) 。 ダルタチオンを一定量生合成できる菌株 (ダルタチオン合成酵素活性及び？ "-GC合成酵素活性を有する菌株） は、 メチル ダリオキサールに耐性を示す。 また、 ダルタチオンを含有しない培地での生育を 調べることによつても、 ダル夕チォン合成酵素活性が低下していることを確認す ることができる。 更に、 ダルタチオン合成酵素活性が低下した菌株は、 MNNG (N - メチル- N' -二ト口- N-二トロソグァ二ジン） 濃度勾配プレ一トを利用することに より効率的に取得することができる。
ダルタチオン合成酵素活性の低下は、 例えば以下の例と同様にして確認するこ とができる。 YPD寒天プレートの中央にフィルターを置き、 lmgの MNNGを 30 1の D MS0に溶解させた溶液を全量、 そのフィル夕一に染み込ませ、 MNNG濃度が中心点 から遠ざかるにつれて薄くなる MNNG濃度勾配寒天培地を作製した。 この寒天培地 に、 YPD培地で培養したサッカロマイセス 'セレピシェ 1倍体 Ναΐ株及び Να3株を スプレッドした。 30°Cで 70時間培養後、 寒天培地の中心点から酵母がコロニーを 形成するまでの距離を測定した。 その結果、 No!l株は 2.3cm、 N α 3株は 1.8cmであ つた。 Να 3株は No; 1株を親株にしてグル夕チオン合成酵素の 370位のアルギニン 残基以降を欠失させるように改変して取得した株である。 その為、 グルタチオン 合成酵素が弱化しており、 ダル夕チオンを微量しか含有していないという特徴を 有している。
本発明のキャンディダ 'ュティリスは、 ダル夕チオン合成酵素活性が低下する ことに加えて、 ァーダル夕ミルシスティン合成酵素活性が増強されていてもよい。
7一ダルタミルシスティン合成酵素活性は、 了一ダルタミルシスティン合成酵素 遺伝子、 発現可能な形態でキャンディダ ·ュティリスに導入することによって、 増強することができる。 ァーダル夕ミルシスティン合成酵素遺伝子としては、 例 えば、 サッカロマイセス 'セレピシェ由来の遺伝子や、 後述するキャンディダ ' ュティリス由来の遺伝子が挙げられる。
キャンディダ ·ュティリスへの r一ダルタミルシスティン合成酵素遺伝子の導 入する方法としては、 例えば、 同遺伝子と、 キャンディダ 'ュティリス染色体上 に存在する DN A配列とを含む組換え DN Aで、 キャンディダ ·ュティリスを形 質転換し、 染色体中に組換え DN Aを組み込む方法がある （Kondo, K. et al.， J. Bacteriol., 177, 7171-7177 (1995)) 。 具体的には、 前記遺伝子置換と同様 にして行うことができる。
また、 キャンディダ.ュティリスへの目的遺伝子の導入は、 染色体 DNA中に 存在する自律複製配列 （ARS) を含むプラスミドを用いて行うこともできる。 キ ヤンディダ ·ュティリスの ARS、 及び、 それを用いた形質転換は、 国際公開 W095/ 32289号パンフレツ卜に記載されている。
キャンディダ 'ュティリスの形質転換法としては、 プロトプラスト法、 KU法 (H.Ito et al., J. B.ateriol. , 153-163 (1983)) 、 KUR法 （発酵と工業 vol.4 3, p. 630-637 (1985) ) 、 エレクト口ポレーシヨン法等、 通常酵母の形質転換に 用いられる方法を採用することができる。 また、 酵母の胞子形成、 1倍体酵母の 分離、 等の操作については、 「化学と生物 実験ライン 31 酵母の実験技術」 、 初版、 廣川書店； 「バイオマニュアルシリーズ 10 酵母による遺伝子実験法」 初 版、 羊土社等に記載されている。
また、 キャンディダ ·ュティリス細胞内のァーダルタミルシスティン合成酵素 活性を増強する方法として、 染色体上のァ—ダルタミルシスティン合成酵素遺伝 子のプロモーターを強転写プロモーターで置換する方法 （大竹康之ら、 パイォサ ィエンスとインダストリ一、 第 50巻第 10号、 第 989〜994頁、 1992年） が挙げられ る。
< 2 >キャンディダ ·ュティリスのァ一ダルタミルシスティン合成酵素遺伝子 本発明の D N Aは、 下記の （A) 又は （B ) のタンパク質をコードする D N A である。
(A) 配列番号 4 3に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
( B ) 配列番号 4 3に示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸の 置換、 欠失、 挿入、 または付加を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 ァーダルタミ ルシスティン合成酵素活性を有するタンパク質。
T一ダル夕ミルシスティン合成酵素活性とは、 システィンとダル夕ミン酸から ァーダル夕ミルシスティンを生成する反応を触媒する活性をいう。
本発明の D N Aがコ一ドするァーダルタミルシスティン合成酵素は、 同酵素活 性が損なわれない限り、 配列番号 4 3に示すアミノ酸配列において 1若しくは複 数の位置での 1若しくは数個の'アミノ酸の置換、 欠失、 挿入、 付加、 または逆位 を含んでもよい。 ここで、 「数個」 とは、 アミノ酸残基のタンパク質の立体構造 における位置や種類によっても異なるが、 具体的には、 2〜 1 5個、 好ましくは、 2〜 8個、 より好ましくは 2〜 5個である。
上記のようなァーダルタミルシスティン合成酵素と実質的に同一のタンパク質 をコードする D N Aは、 例えば部位特異的変異法によって、 特定の部位のァミノ 酸残基が置換、 欠失、 挿入、 付加、 または逆位を含むように塩基配列を改変する JP03/03715
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ことによって得られる。 また、 上記のような改変された DNAは、 従来知られて いる変異処理によっても取得され得る。 変異処理としては、 ァ—ダル夕ミルシス ティン合成酵素をコードする DN Aをヒドロキシルァミン等でインビトロ処理す る方法、 及びァーダルタミルシスティン合成酵素をコードする DN Aを保持する 微生物、 例えばェシエリヒア属細菌を、 紫外線照射または N—メチルー N' —二 トロー N—二トロソグァ二ジン （NG) もしくは EMS等の通常に変異処理に用いら れている変異剤によって処理する方法が挙げられる。
また、 上記のようなアミノ酸残基の置換、 欠失、 挿入、 付加、 または逆位等に は、 r一ダルタミルシスティン合成酵素を保持するキャンディダ ·ュティリスの 菌株の違いに基づく場合などの天然に生じる変異 （mutationまたは variation) も含まれる。
上記のような変異を有する DNAを、 サッカロマイセス ·セレピシェ等の適当 な細胞で発現させ、 その細胞のァーダルタミルシスティン合成酵素活性を調べる ことにより、 ァ—ダルタミルシスティン合成酵素と実質的に同一のタンパク質を コードする DNAが得られる。 また、 変異を有するァーダルタミルシスティン合 成酵素をコードする DNAまたはこれを保持する細胞から、 例えば配列番号 42 の塩基配列又はその一部を有するプローブとストリンジェントな条件下でハイブ リダィズし、 r一ダルタミルシスティン合成酵素活性を有するタンパク質質をコ 一ドする DN Aを単離することによつても、 ァーグルタミルシスティン合成酵素 と実質的に同一のタンパク質をコードする DNAが得られる。 ここでいう 「スト リンジェン卜な条件」 とは、 いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、 非特異 的なハイプリッドが形成されない条件をいう。 この条件を明確に数値化すること は困難であるが、 一例を示せば、，相同性が高い DNA同士、 例えば 75%以上、 好ましくは 85%以上、 より好ましくは 95 %以上の相同性を有する DN A同士 がハイブリダィズし、 それより相同性が低い D N A同士が八ィブリダイズしない 条件が挙げられる。 より具体的には、 通常のサザンハイブリダィゼーシヨンの洗 いの条件である 60°C、 1 X S S C, 0. 1%SDS、 好ましくは、 0. 1XS SC、 0. 1 %SDSに相当する塩濃度でハイブリダィズする条件が挙げられる。 プローブとして、 配列番号 42の塩基配列の一部の配列を用いることもできる。 03 03715
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そのようなプローブは、 配列番号 4 2の塩基配列に基づいて作製したオリゴヌク レオチドをプライマーとし、 配列番号 4 2の塩基配列を含む D N A断片を铸型と する P C Rによって作製することができる。 プローブとして、 3 0 0 b p程度の 長さの D N A断片を用いる場合には、 ハイプリダイゼ一シヨンの洗いの条件は、 5 0 、 2 X S S C、 0 . 1 % S D Sが挙げられる。
上記のような条件でハイブリダイズする遺伝子の中には途中にストツプコドン が発生したものや、 変異により活性を失ったものも含まれるが、 それらについて は、 発現産物の酵素活性をを調べることによって選択することができる。
配列番号 4 2に示す塩基配列を有する D N Aは、 後記実施例に示すように、 了 一ダルタミルシスティン合成酵素が弱化したサッカロマイセス ·セレピシェに導 入したところ、 ダル夕チオン合成が促進されたことから、 ァ—グル夕ミルシステ イン合成酵素をコードしていることが確認された。
配列番号 4 2のアミノ酸配列を、 データベースで相同性検索したところ、 サッ カロマイセス ·セレピシェ、 及びシゾサッカロマイセス ·ボンベのァ一ダルタミ ルシスティン合成酵素のアミノ酸配列と、 各々 50. 93%及び 42. 88%の相同性が認 められた。
< 3 >本発明の酵母エキス、 飲食品及びその製造法
上記のようにして得られるァーダルタミルシスティンを産生する酵母を好適な 条件で培養して得られた培養物又はその分画物は、 ァーダル夕ミルシスティンを 含有する。 培養物は、 酵母菌体を含む培養液であってもよいし、 それから採取さ れた酵母菌体、 菌体破碎物、 又は菌体抽出物 （酵母エキス） であってもよい。 菌 体破砕物又は酵母エキスから、 ァ—ダルタミルシスティンを含む画分を得てもよ い。
上記ァ―グルタミルシスティンを含む培養物又はその分画物を加熱することに より、 ァーダルタミルシスティンがシスティンとピロリドンカルボン酸に分解す るため、 システィンを遊離させることができる。 具体的には、 培養物又はその分 画物を、 水の存在下で、 酸性から中性、 具体的には p H 1〜 7において 5 0〜 1 2 0 °Cに 3〜 3 0 0時間保持することにより、 システィンを生成させることがで きる。
また、 r一ダルタミルシスティンを含む培養物又はその分画物を P H 3〜9に 調整した後、 ァーダル夕ミルペプチド分解酵素 （ァ—ダルタミルトランスフェラ ーゼ、 ァーダルタミルシクロトランスフェラーゼ、 ダル夕ミナーゼ等） を加え、 1 5〜 7 0 °Cで 1〜 3 0 0分作用させることによつても、 システィンを生成させ ることができる。
培養に用いる培地は、 本発明の酵母が良好に生育し、 かつ、 一グル夕ミルシ スティンを効率よく産生するものであれば特に制限されない。 尚、 必要に応じて、 用いる酵母の形質にしたがって必要な栄養素を培地に添加する。
培養条件及び酵母エキス等の調製は、 通常の酵母の培養、 及び酵母エキスの調 製と同様にして行えばよい。 酵母エキスは、 酵母菌体を熱水抽出したものでもよ いし、 酵母菌体を消化したものでもよい。 また、 本発明の酵母エキスは、 熱処理 又は酵素処理によりシスティンを生成させたものであってもよいし、 他の飲食品 原料とともに飲食品に加工する際、 又は加工後に熱処理されるものであってもよ い。
具体的には、 酵母エキスの熱処理は次のようにして行うことができる。 酵母ェ キス粉末に水を加え、 塩酸で p Hを 5に調整し、 濃度 2 %の水溶液を作製し、 こ れを 9 8 °Cで 1 8 0分間加熱する。
上記 r一ダル夕ミルシスティン又はシスティンを含む培養物又はその分画物は、 飲食品の製造に用いることができる。 飲食品としては、 アルコール飲料、 パン食 品、 又は発酵食品調味料が挙げられる。 熱処理による T一ダルタミルシスティン からシスティンの生成は、 飲食品の製造中、 又は製造の後に行われてもよい。 ま た、 飲食品の製造に先立って、 酵母の培養物又はその分画物を熱処理してもよい。 上記飲食品は、 ァーダル夕ミルシスティン又はシスティンを含む培養物又はそ の分画物を、 飲食品原料に混合し、 飲食品に加工することによって製造される。 本発明の飲食品は、 前記培養物又は分画物を使用すること以外は、 通常の飲食品 と同様の原料を用い、 同様の方法によって製造することができる。 このような原 料としては、 例えばアルコール飲料では、 米、 大麦、 コーンスターチ等、 パン食 品では小麦粉、 砂糖、 食塩、 パター、 発酵用酵母菌等が、 発酵食品調味料では大 豆、 小麦等が挙げられる。 また、 酵母エキスもしくはその濃縮物、 またはそれら を乾燥したものは、 それ自体で発酵食品調味料として用いることができる。 実施例
以下、 本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 実施例 1 ァ—ダルタミルシスティンを産生するキャンディダ ·ュティリスの構 築
く 1>キャンディダ ·ュティリスのグルタチオン合成酵素をコードすると予測さ れる遺伝子断片の取得
キャンディダ ·ュティリス ATCC15239株を YPD試験管培地で 30°Cで振とう培養し、 Genとるくん酵母用 （宝酒造（株）、 Code9084) を用いて、 菌体から染色体を回収 した。
〔YPD培地組成〕
グルコース 2 %
ペプトン 2 %
酵母エキス 1 %
(PH5.0) サッカロマイセス ·セレピシェ、 シゾサッカロマイセス ·ボンべ、 及びラット のダルタチオン合成酵素のアミノ酸配列 （以上、 クリスら、 Molecular Biology of the Cell., 8, 1699-1707, 1997) から、 以下の相同性が高い配列を選定した。
① QEVAVVYYR (配列番号 1 )
② GSKKIQQ (配列番号 2)
③ VLKPQREGGGNN (配列番号 3 )
④ ISELGIYG (配列番号 4)
⑤ GGVAAGF (配列番号 5) 各々のアミノ酸配列から縮重プライマーを設計し、 ①と②、 ①と③、 ①と④、 ①と⑤、 ②と③、 ②と④、 ②と⑤、 ③と④、 ③と⑤、 及び④と⑤の各々の組み合 わせに対応する宿重プライマーを用いて、 degenerated PCRを行なった。 PCR産物 をァガロースゲルで電気泳動し、 予想される大きさの領域を切り出し、 DNAを回 収した。 さらに、 この回収 DNAを铸型として nested PCRを行なったが、 目的の断 片を取得することはできなかった。
次に、 以下のアミノ酸配列に対応するプライマーを、 キャンディダ 'ュティリ スのコドン使用頻度を参考に設定した。
©GSKKIQQ (配列番号 6)
⑦ EGGGNN (配列番号 7)
(DPQREGGG (配列番号 8) 上記⑥のアミノ酸配列に対応するプライマー （GGT TCY AAG AAG ATY CAR CA (配列番号 9) ) と、 ⑦のアミノ酸配列に対応するプライマ一 （CCA CCA CCY TC T CTY TGT GG (配列番号 1 0) ) を用いて PCRを行った。 PCRは、 KOD dash (T0Y0 BO社 コード LDP- 101) を使用して、 製造者の指示に従い、 次の条件で行った。 94 2分 94°C1分、 55°C (1サイクル毎に 0.5°Cづっ温度減少） 1分、 74 40秒 を 22サイクル→ 94 1分、 50°C1分、 74°C40秒を 15サイクル。
PCR産物をァガロースゲル （Nusieve3:lァガロース 3%、 1XTAE溶液 （宝酒造 (株） 、 CodeF5180A) ) にて電気泳動を行なった。 ゲルをェチジゥムブロマイド 溶液で染色後、 100bp〜300bpに相当する領域を切り出し、 MagExtractor (T0Y0B0 社、 CodeNM_601) を用いてゲルから DNAを回収した。
この回収 DNAを铸型として、 ⑥の領域に対応するプライマー （配列番号 9) と
⑧の領域に対応するように設定したプライマー （GTT GTT ACC ACC ACC YTC (配 列番号 1 1) ) を用いて nested PCRを行なったところ、 100bp〜300bpに相当する 領域に、 3本のパンドが検出された。 PCRは、 前記と同様の条件で行った。 これ らの 3本のパンドを各々切り出し、 ゲルから DNAを回収した。 各々のパンドを、 p GEM- T Easy vector (Promega社） に、 DNA ligation Kit ver.2 (宝酒造（株）） を用いて連結し、 大腸菌 JM109コンビテントセル （宝酒造（株）、 Code9052) を形 質転換した。 得られた形質転換体の一つからキャンディダ 'ュティリスのグルタ チオン合成酵素をコードしていると予測される遺伝子断片を含んでいると予測さ れる形質転換体を取得した。 形質転換体が持つィンサートの塩基配列を常法に従 い、 決定した。
上記のようにして決定した塩基配列をもとに 3' RACE (3' RACE System for Ra id Amplification of cDNA Ends (GIBCOBRL社、 Cat. o 18373-027) を使用） を 行なった。 キャンディダ ·ュティリスから、 Rneasy Mini Kit (QIAGEN社、 Cat. No.74104) を用いて調製した mRNAから、 cDNA—次鎖を調製した後、 3回の PCRを行 つた。 用いたプライマ一は以下のとおりである。
1回目 PCR： AAG ATA TAC CCA TTG GAT GG (配列番号 1 2) 及び 3' RACEキット付 属の AUAPプライマ一
2回目 PCR： TCA GAT CTT GGT AAA GAG GC (配列番号 1 3) 及び 3' RACEキット付 属の AUAPプライマー
3回目 PCR： AGA CTG GCA TTT GAG TCT CC (配列番号 14) 及び 3' RACEキット付 属の AMPプライマー
PCRは、 K0D dash (T0Y0B0社 コード LDP- 101) を使用し、 製造者の指示に従い、 次の条件で行った。 94°C2分 1サイクル→ 94°C1分、 50°C30秒、 74°C40秒を 30サ ィクル。
PCR産物を pGEM- T Easy vectorに連結し、 大腸菌を形質転換した。 得られた形 質転換体が持つィンサ一トの塩基配列を解析し、 キャンディダ 'ュティリスのグ ル夕チオン合成酵素を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。
以上の操作により判明した情報から、 プライマーを設計し （GGT TCT AAG AAG ATT CAG CA (配列番号 1 5) 、 CCC TCG GAA AAG GAG ACG AAG G (配列番号 1 6) ) 、 キャンディダ 'ュティリス ATCC15239より回収した染色体 DNAを錡型とし て、 PCRを行い、 増幅産物の塩基配列を決定した。 PCRは、 Pyrobest (宝酒造（株）、 Code R0005A)を使用して、 製造者の指示にしたがい、 次の条件で行った。 98°C2 分→ 98°C20秒、 55°C30秒、 72°C2分を 40サイクル。 結果を配列番号 1 7に示す c この塩基配列によりコードされると予測されるダルタチオン合成酵素のアミノ酸 配列を配列番号 18に示す。 3715
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ュティリスのダルタチオン合成酵素遺伝子破壊力セットの 作製
キャンディダ ·ュティリス ATCC15239より回収した染色体 DNAを铸型として、 前 記配列番号 1 5及び 1 6のプライマ一を用いて PCRを行った。 PCRは、 Pyrobest (宝酒造（株）） を用いて、 製造者の指示にしたがい、 次の条件で行った。 98°C2 分→ 98 20秒、 55°C30秒、 72°C2分を 40サイクル。
増幅産物を QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN社、 Cat. No 28106)を用い 精製し、 精製産物の末端にアデニンを付加した後、 PGEM_T Easyベクタ一に連結 した。 アデニンの付加は、 AmpliTaq (ABI社、 Code N808-0161) を用い、 dNTPの 代わりに 2.5mMの dATPを使用し、 72 で 10分間反応させることにより行った。 続 いて、 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE社、 Catalog#20 0518) を用いて、 部位特異的組換えによりクローニング断片の 2箇所の塩基配列 を置換し、 Hindlll及び Kpnl切断部位を導入し、 CGSH2Ctermi/pGEMT- Easyベクタ —を得た。 部位特異的組換えに使用したプライマ一は以下のとおりである。
〔1度目の変異導入 （Hindlll切断部位の導入） 〕
GAA GCC TCA GCA TGA AGC TTG TGG TAA TAA CAT TTA C (配列番号 1 9 )
G TAA ATG TTA TTA CCA CAA GCT TCA TGC TGA GGC TTC (配列番号 20)
〔2度目の変異導入 （Kpnl切断部位の導入） 〕
CGA CCA ATC GAC TGG TAG CGT TAT CAA AAA CTC TG (配列番号 21 )
CA GAG TTT TTG ATA ACG GTA CCA GTC GAT TGG TCG (配列番号 22 ) 一方、 キャンディダ ·ュティリス ATCC15239より回収した染色体 DNAを铸型とし て、 以下のプライマ一を用いて PCRを行い、 URA3遺伝子を含む断片を増幅した。 P CRは、 K0D dash (T0Y0B0社 コード LDP- 101) を使用して、 製造者の指示に従い、 次の条件で行った。 94°C 2分→ 94 1分、 54 : 30秒、 74 40秒を 30サイクル。
CCC AAG CTT CTC TAC TTG CTT CTG CTC AAC (配列番号 23 )
GCA GGT ACC AAC TTC CGA AAA CAG TAA TGA AC (配列番号 24 ) 増幅産物を pGEMT- Easyベクタ一に導入し、 CURA3/pGEMT- Easyベクタ一を得た。 CGSH2Ct ermi/pGEMT-Easyベクター及び CURA3/pGEMT- Easyベクタ一を、 各々 Hindl l I及び Kpnlにて切断した。 CGSH2Ctermi/pGEMT-Easyベクターからは CGSH2及び pGEM T - Easy本体を含む断片を回収し、 CURA3/pGEMT- Easyベクターからは CURA3を含む 断片を回収した。 これらの回収断片を連結し、 大腸菌 JM109を形質転換した。 こ のようにして、 CURA3 A CGSH2/pGEMT- Easyベクターを作製した。
CURA3 Δ CGSH2/PGEMT- Easyベク夕一を制限酵素 No 11で切断したものを铸型とし、 配列番号 1 5及び 1 6に示すプライマ一を用いて PCRにより増幅した。 こうして、 キャンディダ 'ュティリスのダルタチオン合成酵素遺伝子破壊力セットを作製し た （図 1、 2 ) 。 く 3 >ゥラシル要求性キャンディダ ·ュティリス ATCC15239ura-株の取得
常法 （Lui sらの手法、 FEMS Microb i o l ogy Let ters 165 (1998) 335-340) に従い、 ATCC15239由来のゥラシル要求性株 ATCC15239ura-株を取得した。 ATCC15239ura - 株は、 後述するように URA3遺伝子によって相補されたことから、 ura3変異株であ ると推定される。 く 4 >キャンディダ ·ュティリス由来のァ—ダルタミルシスティン産生酵母 （AT CC15239 A gsh2株） の取得
まず、 ATCC15239ura-株を YPD試験管培地で一晩 30°Cで培養した。 培養産物を YP Dフラスコ培地 （坂口フラスコ 500ml容、 50ml張り込み） に植菌し、 30°Cで振とう 培養した。 対数増殖期に集菌し、 4 °Cに冷やした 1Mソルビトール溶液で、 菌体を 3回洗浄した。 洗浄菌体を冷やした 1Mソルビトール溶液に懸濁した。 懸濁液に、 50 1 (2 ^ ) のダルタチオン合成酵素遺伝子破壊力セットを加え、 0, 2cmキュべ ット中でよく混合し、 エレクト口ポレーシヨン （Gene Pul s er sys t em (Bi oRad 社） を使用、 インピーダンス 200 Ω、 キャパシタンス 125 F、 設定電圧 1. 5kVに設 定） を行なった。 キュベットに、 1mlの冷やした 1Mソルピトールを注ぎ、 キュべ ットを 10分間氷上で冷却した。 菌体懸濁液を SDプレートにスプレッドし、 30°Cで 静地培養した。
プレートに生育してきた株を、 SDプレ一ト及ぴ 10mMのメチルダリオキサールを 含む SDプレートにレプリカし、 30でで静地培養した。 メチルダリオキサールに感 細 15
19
受性を示す株を 7株選択した。 これら 7株を各々 YPD試験管培地で 30°Cで一晩振 とう培養した。 培養液を SD培地 （坂口フラスコ 500ml容、 50ml張り込み） に 2%植 菌し、 30°Cで振とう培養した。 対数増殖期に集菌し、 滅菌水で 2回菌体を洗浄し た。 洗浄菌体を 70 10分の熱水抽出を行い、 酵母菌体内の r一ダルタミルシステ インを抽出し、 HPLCにより分離定量した。 一方、 酵母の乾燥菌体量は、 一定培地 中に含まれる洗浄酵母菌体を濾紙上に取り、 105°Cで 4時間加熱後に残つた菌体重 量として測定した。 このようにして、 乾燥酵母菌体あたり 1%以上のァ—ダルタミ ルシスティンを含有するキャンディダ ·ュティリス菌株として、 ATCC15239 A gsh 2株を取得した。
ATCC 15239 A gsh2株を SD培地に植菌し、 30°Cで 2日振とう培養した。 培養物を S D培地に 2%植菌し、 30°Cで振とう培養した。 7時間後、 及び 9時間後のァ ーダル タミルシスティン含有量を測定したところ、 それぞれ 1. 08%、 及び 1. 12%であった。 ダルタチオンは検出限界以下であった。
< 5 >ATCC15239 A gsh2株のダルタチオン合成酵素活性の測定
ATCC15239 A gsh2株を YPD培地に植菌し、 30°Cで振とう培養した。 培養物を SD培 地 （2L容フィン付三角フラスコに 400ml張り込み） に 2%植菌し、 30°Cで振とう培 養した。 対数増殖期に菌体を集菌し、 4°Cに冷やした 1Mソルピトールで菌体を 2 回洗浄した。 洗浄菌体を 0. I mMの PMSF (フエニルメタンスルフォニルフルオリ ド） を含む 10mM Tr i s-HC lバッファー （pH7. 5) 0. 5mlに懸濁した。 懸濁液にガラ スビーズ （GLASS BEADS 425-600m i c rons Ac i d-washed (S IGMA社、 コード G- 877 2) ) を加え、 BEAD- BEATER (和研藥株式会社） を用いて細胞を破砕した。 細胞の 破碎は顕微鏡で確認した。 その後、 1mlの前記バッファーを加え、 遠心操作によ り、 ガラスピーズ及び細胞デブリを取り除いた。 このようにして、 細胞粗抽出液 を得た。 細胞粗抽出液を ULTRAFREE - 15 Bi omaxl O (MILLIP0RE社、 Cat . No UFV2BGC 40) を用いて精製し、 酵素液を得た。 酵素液の蛋白量は、 Brad f ord法により定量 した。 発色はプロテインアツセィ CBB溶液 （ナカライ社、 Code29449- 15) を用い て行い、 595nmの吸収を測定した。 標準曲線は Al bumin s t andard (PIERCE社、 No. 23210) を用いて作成した。 このようにして得た、 酵素液中のダルタチオン合成酵素活性を、 Gushimaらの 方法 (Gushima, T. et aし， J. Appl. Biochem. , 5， 210 (1983)) にしたがって、 以下のようにして測定した。
〔反応液〕
lOOmM ァ—ダルタミルシスティン IOO I
lOOmM MgC 100 1
50mM ATP 100 z 1
lOOmM Gly 100^1
1M Tris-HCl(pH8.0) 85.5^1
160mM PEP 12.5 1
lmg/ml PK 2 1
酵素液 （l〜10mg蛋白）
精製水
合計 2ml
PEP：ホスホエノ一ルビルビン酸 （SIGMA社、 Code P - 7127)
PK ： ピルビン酸キナ一ゼ （SIGMA社、 Code P-1903) 上記組成の反応液を、 酵素量 l〜10mg蛋白の範囲で 30°Cで 0〜2時間反応させた。 メタクリル酸を 1/5当量加えて反応を停止させた後、 反応液の pHを 8.0に調整し、 生成した GSH量を定量した。 この時の酵素活性は検出限界以下であり、 検出され なかった。
次に、 ATCC15239 Agsh2株の親株である ATCC15239株のダルタチオン合成酵素活 性を同様にして測定した。 その結果、 ATCC15239株のダルタチオン合成酵素活性 は 0.383 mo 1 -GSH/mg蛋白/時間であった。 実施例 2 ァ—ダルタミルシスティン合成酵素遺伝子の取得
< 1 > r _ダル夕ミルシスティン合成酵素遺伝子ホモ口グの取得
サッカロマイセス .セレピシェ、 シゾサッカロマイセス ·ボンベのァーグルタ ミルシスティン合成酵素のアミノ酸配列 （Ohtake et al (Yeast 1991 Dec ;7 (9)： PC漏蘭 15
21
953 - 961)、 utoh et al (J Biochem(Tokyo) 1995 Feb ; 117 (2) : 283- 288) から、 以下の相同性が高い配列を選定した。
©MGFGMG (配列番号 25 )
② GWRVEFR (配列番号 26 ) 各々のアミノ酸配列から縮重プライマーを設計し、 degenerated PCRを行なつ た。 ①の領域に相当するプライマーとして、 プライマ一 Fl (ATG GGN TTY GGN AT G GG) (配列番号 27) を、 ②の領域に相当するプライマ一としてプライマ一 R 1 (RAA YTC NAC NCK CCA) (配列番号 28) を設計した。 DNA po meraseとして KOD dash TOYOBO社）を用いて製造者の指示に従って PCRを行なった。 PCRの条件は 94°C3分を 1サイクル→94°C1分， 52°C1分， 74°C1分を 30サイクルで行なった。
PCR産物をァガロースゲルで電気泳動し、 予想される大きさの約 700bpに相当す る領域を切り出し、 MagExtractor (T0Y0B0社、 CodeNPK-601) を用いてゲルから D NAを回収した。
さらに、 この回収 DNAを錡型として nested PCRを行なった。 PCRは前述と同様に して行った。 増幅産物をァガロースゲルにて電気泳動後ェチジゥムブ口マイド溶 液で染色し、 約 700bpに相当する領域を切り出し、 MagExtractorを用いてゲルか ら DNAを回収した。 回収した DNAを DNA ligation kit ver.2 (宝酒造（株）） を用い て pGEM- T Easy vectorに連結し、 大腸菌 JM109コンビテントセルを形質転換した。 得られた形質転換体の一つから、 キャンディダ ·ュティリスのァーダルタミルシ スティン合成酵素をコードすると予想される遺伝子断片を含んでいると推測され る形質転換体を取得した。 形質転換体が持つインサートの塩基配列を常法に従い、 決定した。
上記のようにして決定した塩基配列をもとに 3' RACE (3' RACE System for Ra pid Amplification of cDNA Ends (GIBCOBRL社）） を行なった。 キャンディダ ' ュティリスから、 Rneasy Mini Kitを使用して調製した mRNAから、 cDNA—次鎖を 合成した後、 3回の PCRを行なった。
用いたプライマーは以下の通りである。
1回目の PCR： TGA ACA GAG CTC GTT ACC TC (配列番号 29) 0303715
22
及び 3' RACEキット付属の AMPプライマー
2回目の PCR： TCA TGG GCT AAT TTT GCA CC (配列番号 30)
及び 3' RACEキット付属の AUAPプライマー
3回目の PCR： TTC CTA GCA TTG ACG GCA GC (配列番号 3 1)
及び 3' RACEキット付属の AUAPプライマ一
PCRは、 KOD dashを使用し、 製造者の指示に従い、 次の条件で行なった。 94°C2 分 1サイクル— 94°C1分、 50で 30秒、 74°C40秒を 30サイクル。 PCR産物を pGEM- T Ea sy vectorに連結し、 大腸菌を形質転換した。 得られた形質転換体がもつインサ —卜の塩基配列を解析し、 キャンディダ ·ュティリスのァ—ダルタミルシスティ ン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情報を取得した。
次に、 これまでに判明している塩基配列を元に、 5' RACEを行った。 キットは 5 ' RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends Reagent Assembly vers ion 2.0 (GIBC0BRL社） を用いた。
cDNA—次鎖調製のための RT (逆転写） に用いたプライマ一は以下の通りである。 AGC ACC AGA AAT GAC GTT C (配列番号 32 )
製造者の指示に従って作製した cDNAライブラリ一より、 以下のプライマーを用 いて 3回の PCRを行なった。 PCRは、 KOD dashを使用し、 製造者の指示に従い、 次 の条件で行なった。 94°C2分 1サイクル— 94°C1分、 50°C30秒、 74°C40秒を 30サイ クル。
用いたプライマ一は以下の通りである。
1回目の PCR： CCA TCT GAC GAC ATC CTG CTG (配列番号 33) 及びキットに付属 の AUAPプライマ一
2回目の PCR： GTC AGC TAA GTG GCC TTT G (配列番号 34) 及びキットに付属の A UAPプライマ一
3回目の PCR： CAC TGG CGC TGC TGC CGT C (配列番号 35) 及びキットに付属の A UAPプライマー
PCR産物を pGEM-T Easy vectorに連結し、 大腸菌を形質転換した。 得られた形 質転換体がもつインサートの塩基配列を解析し、 キャンディダ ·ュティリスのァ 一ダルタミルシスティン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情 報を取得した。 他の生物の相同性より全長をクローニングしていないと考え、 更 に 5 ' RACEを行なった。
cDNA—次鎖調製のための RTに用いたプライマーは以下の通りである。
TGA TCT TCT GCT GTT CAT GTT (配列番号 3 6 )
製造者の指示に従って作製した cDNAライブラリーより、 以下のプライマーを用 いて 3回の PCRを行なった。
用いたプライマーは以下の通りである。
1回目の PCR : CTC CAC GTA CAA GTA GTT CTC (配列番号 3 7 ) 及びキットに付属 の AMPプライマ一
2回目の PCR： CAG CGA ATC ACC GTT GTA CGG (配列番号 3 8 ) 及びキットに付属 の AUAPプライマー
3回目の PCR： AGC CAG CGG TGT CGC CTC (配列番号 3 9 ) 及びキットに付属の AUA Pプライマー
PCR産物を pGEM- T Easy vec t orに連結し、 大腸菌を形質転換した。 得られた形 質転換体がもつィンサ一トの塩基配列を解析し、 キャンディダ 'ュティリスのァ —ダルタミルシスティン合成酵素遺伝子を含んでいると予測される遺伝子断片情 報を取得した。
以上のようにして判明した情報から、 プライマーを設計し、 PCRを行い、 増幅 産物の塩基配列を決定した。 PCRは Pyrobes t (宝酒造） を使用して、 製造者の指 示に従い、 次の条件で行なった。 98 2分→98°C 20秒、 55°C 30秒、 72°C 2分を 40サ ィクル。
用いたプライマーは以下のとおりである。
一 F2： GGG TTT GTT GTC TAT CGG CTT AAG (配列番号 4 0 )
一 R2： AGC TGT CTT GGT CGT CAT ATC CAT (配列番号 4 1 )
のようにして増幅した PCR産物の塩基配列を常法に従って決定した。 結果を P0303715
24
配列番号 42に示す。 また、 この塩基配列によりコードされると予測される r一 ダルタミルシスティン合成酵素のアミノ酸配列を配列番号 43に示す。 このよう にして、 キャンディダ ·ュティリスの r一ダルタミルシスティン合成酵素遺伝子 ホモログを取得した。 実施例 3 サッカロマイセス ·セレピシェにおけるァーグルタミルシスティン合 成酵素遺伝子の発現
< 1 >ダルタチオン合成酵素活性が低下したサッカロマイセス 'セレピシェ グル夕チオン合成酵素活性が低下したサッカロマイセス ·セレピシェとして、 国際公開 W0 2001/090310号パンフレツ卜に記載のサッカロマイセス ·セレピシェ No; 3株を用いた。
Να3株は、 サッカロマイセス 'セレピシェのゥラシル要求性酵母一倍体である Ναΐ株 （国際公開 W0 2001/090310号パンフレットに記載） を親株として、 弱化型 ダルタチオン合成酵素遺伝子置換株として構築された菌株である。
< 2 >ァーダルタミルシスティン合成酵素活性が低下したサッカロマイセス 'セ レピシェの取得
( 1 ) GSH1遺伝子置換カセットの作製
まず、 前記 Ναΐ株の染色体 DNAを铸型として、 ァーダルタミルシスティン合成 酵素遺伝子 （配列番号 44) の中流領域から末端領域までを PCR法により増幅し た。 PCR反応は、 KOD dash (T0Y0B0社） を使用して、 製造者の指示に従い、 次の 条件で行った。 下記に示す組成の反応液を用いて、 94 1分の後、 94°C30秒、 60 40秒、 74°C1分を 30サイクル繰り返すことにより行った。 プライマ一は GF1 (gt g gac gac cgt act ccg aag) (配列番号 4 6) 及び GR1 (acc caa ate gat aat gtc aac) (配列番号 47) を用いた。
上記のようにして増幅した GSH1遺伝子断片を、 製造者の指示に従ってプラスミ PGE -T Easy (Promega社) に連結し、 GSHldash/pGEMを得た。
次に、 部位特異的変異法により、 GSHldash/pGEMに含まれるァ—ダルタミルシ スティン合成酵素遺伝子 （配列番号 44) の、 同遺伝子がコードするァーグルタ ミルシスティン合成酵素 （配列番号 4 5) の 372番目、 373番目に対応するァミノ 酸セリン及びリジンに対応するコドンを終止コドンに置換した。 この操作は、 Qu ickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (STRATAGENE社）を用い、 製造者のプ ロトコルに従って行った。 プライマーは QCF1 (ctt ttc ttg ggt ggg tag taa tt t ttc aat agg act) (配列番号 48) 、 QCR1 (agt cct att gaa aaa tta cta c cc acc caa gaa aag) (配列番号 49) を用いた。 このようにしてプラスミド GS HlMdash/pGEMを作製した。 '
上記のようにして変異が導入されたァ一グルタミルシスティン合成酵素 （弱化 型ダルタチオン合成酵素） は、 微弱な酵素活性を保持している （国際公開 W0 200 1/090310号パンフレツト） 。
次に、 国際公開 WO2001/090310号パンフレツトに記載のプラスミド pYES2dash (プラスミド PYES2 (Invitrogen社） から 2 ^oriを除去したプラスミド） 、 及び 前記 GSHlMdash/pGEMを、 いずれも制限酵素 Sacl及び Sphlで切断し、 pYES2dashか らは URA3遺伝子を含む断片を、 GSHlMdash/pGEMからはァーダルタミルシスティン 合成酵素の部分遺伝子配列を含む領域を切り出し、 これらを連結した。 このよう にしてプラスミド GSHlMdash/pYES2dashを作製した。 GSHlMdash/pYES2dashを制限 酵素 Bbelで切断し、 遺伝子置換カセットを得た（図 3)。
(2) r-グルタミルシスティン合成酵素遺伝子置換株の構築
上記のようにして作製した遺伝子置換カセットを用いて、 Να 1株の下一ダル夕 ミルシスティン合成酵素遺伝子の遺伝子置換を行った。 Νο;1株を前培養した後に、 培養物を 50mlの YPD培地に植え継ぎ、 対数増殖期まで培養した。 培養菌体を 1Mソ ルビトールに懸濁し、 遺伝子置換カセットを混和して、 エレクト口ポレーシヨン により形質転換を行った。 形質転換株を ImMのダル夕チオンを含む SDプレー卜で 培養し、 生育する株を選択した。 遺伝子置換カセットが染色体上の目的の位置に 組み込まれたことを PCRによって確認し、 得られた株を Να4中間体とした。 次に、 変異型ァ -グル夕ミルシスティン合成酵素遺伝子のみを染色体上に残す為、 以下 の操作を行った。 Να4中間体を ImMのダル夕チオンを添加した YPD培地で培養し、 培養産物を ImMのダルタチオンを含む SDF0Aプレートに蒔いた。 プレート上に生育 してきた株のグルタチオン合成酵素遺伝子の配列を決定し、 目的の部位の配列が 正しく置換されていることを確認し、 Νθ!4株を得た （図 4) 。
(3) Νθ!4株のァーダルタミルシスティン合成酵素活性弱化の確認
次に、 上記のように取得した No; 4株の r—ダルタミルシスティン合成酵素活性 が弱化しているか否か調べた。 大竹らは、 サッカロマイセス 'セレピシェ Y腿 27 株より変異処理により取得した YH1株の了一ダルタミルシスティン合成酵素活性 を測定しており（Agric.Biol.Chem54(12) 3145-3150, 1990), その方法に準じて活 性を測定した。 その結果、 Να4株のァ—ダルタミルシスティン合成酵素活性は検 出限界以下であった。 次に、 Να4株を SD培地で培養し、 対数増殖期の細胞内のァ 一ダルタミルシスティン及びグル夕チオン含有量を測定したが、 ァ一ダルタミル システィンは検出されず、 ダルタチオンは 0.01 であった。 また、 Ν«4株は 2mMの メチルグリォキサールに感受性を示したことから、 YH1株と同様にァーダルタミ ルシスティン合成酵素遺伝子が置換されていることが確認された。
< 2〉キャンディダ ·ュティリス由来の r一ダル夕ミルシスティン合成酵素ホモ ログの発現べクタ一の構築
キャンディダ ·ュティリスの染色体 DNAを铸型として PCRを行い、 キャンディダ
•ュティリスのァ—ダルタミルシスティン合成酵素遺伝子ホモログの 0RF領域を 増幅した。 PCRは、 Pyrobest (宝酒造）を用いて製造者の指示に従って次の条件 で行った。 98°C2分— 98°C20秒、 55°C30秒、 72°C2分を 40サイクル。 N末端側には 制限酵素 Kpnl切断部位を付加したプライマー CGSH1F1 (GAG TAG GGT ACC ATG GGG
CTG CTA TCA TTA GGG AC) (配列番号 5 0) を、 C末端側には Xbal切断部位 CGSH 1R1 (CCC TTA TCT AGA TTA AGC CTT TGG GTT GTT TAT 0 (配列番号 5 1) を それぞれ用いて前記の条件で PCRを行い、 増幅産物を QIAquick PCR purification
Kitを用いて精製した。 精製した PCR産物及び PAUR123ベクター （宝酒造） を、 各 々制限酵素 Kpnl、 Xbalで切断した後連結し、 大腸菌 JM109コンビテントセルを形 質転換した。 このようにして CGSH1/PAUR123ベクターを作製した。 次に、 CGSHl/p AUR123ベクター及び pYES2ベクタ一を制限酵素 BamHIで切断した。 CGSHl/pAURl 23 ベクターからは CGSH1の 0RFと PAUR123ベクター由来のプロモータ一を含む領域を 回収し、 切断末端を脱リン酸化した PYES2ベクターと連結し、 大腸菌 109コンビ TJP03/03715
27
テントセルを形質転換した。 このようにして、 キャンディダ 'ュティリスのァー ダルタミルシスティン合成酵素ホモログの発現ベクター CGSHl/pYES2ベクターを 作製した （図 5) 。
<3>相補実験
次に、 CGSH1/PYES2ベクターを ?(0；3株及び?^0!4株に導入した形質転換体を取得 した。 Να3株又は Νθ!4株を前培養した後に、 培養物を 50mlの液体培地 （ImMのグ ルタチオンを含有する YPD培地） に植え継ぎ、 対数増殖期まで培養した。 培養菌 体を 1Mソルビトールに懸濁し、 CGSH1/PYES2ベクタ一を混和して、 エレクトロボ レーシヨンにより形質転換した。 形質転換株を ImMのダルタチオンを含む SDプレ —卜で培養し、 生育する株を選択した。 Νθ!3株及び Νθ!4株はゥラシル要求性を示 し、 CGSH1/PYES2ベクターを含有する場合のみ SD培地で生育することができる。 得られた形質転換体が CGSHl/pYES2ベクターを含有することを常法により確認し た。
このようにして、 形質転換体 No;3/CGSHl及び Na4/CGSH1株を取得した。 No;3/C GSH1は 2mMのメチルダリォキサールに感受性を示したが、 N 4/CGSH1株は 2mMのメ チルダリオキサールに感受性を示さなかった。 また、 SD培地で培養したとき、 そ の対数増殖期に N 3/CGSH1株はダル夕チオンをほとんど含有しなかったが、 Nひ 4 /CGSH1株はダルタチオンを 0.4%含有していた。 Να3株はサッカロマイセス ·セレ ピシェのグルタチオン合成酵素に変異が生じグルタチオン合成力が低下している が、 Νο;4株はサッカロマイセス ·セレピシェのァーダルタミルシスティン合成酵 素に変異が生じグルタチオン合成力が低下していることから、 CGSH1はサッカロ マイセス ·セレピシェのァ—ダルタミルシスティン合成酵素を相補することが示 された。 産業上の利用の可能性
本発明により、 ァーダルタミルシスティンを高含有するキャンディダ ·ュティ リスが提供される。 本発明のキャンディダ 'ュティリスを用いることにより、 食 品の風味改善等の用いることのできる酵母エキスを、 安価に製造することができ る。

Claims

請求の範囲
1 . 最小培地で培養したとき、 対数増殖期に乾燥菌体当たり 1重量％以上の ァ—グルタミルシスティンを含有するキャンディダ ·ュティリス。
2 . 最小培地が S D培地である請求項 1記載のキャンディダ ·ュティリス。
3 . ダルタチオン合成酵素活性が 0 . 0 0 5 i m o l G S H/m gタンパ ク質 Z時間以下である請求項 1又は 2に記載のキャンディダ ·ュティリス。
4 . 細胞内のダル夕チオン合成酵素活性が低下するようにダルタチオン合成 酵素をコードする遺伝子が改変された請求項 1〜 3のいずれか一項に記載のキヤ ンディダ ·ュティリス。
5 . r一ダルタミルシスティン合成酵素をコードする遺伝子の発現量が上昇 するように改変された請求項 1〜4のいずれか一項に記載のキャンディダ ·ュテ ィリス。
6 . 請求項 1〜 5のいずれか一項に記載のキヤンディダ ·ュティリスを好適 な条件で培養して得られる培養物、 もしくはァーダル夕ミルシスティンを含む前 記培養物の分画物、 又は熱処理によってシスティンが生成したこれらの培養物も しくは分画物を含む飲食品。
7 . 飲食品が発酵食品調味料である請求項 6記載の飲食品。
8 . 請求項 1〜 5のいずれか一項に記載のキャンディダ ·ュティリスを好適 な条件で培養して得られる培養物を用いて製造された酵母エキス。
9 . 請求項 1〜 5のいずれか一項に記載のキャンディダ ·ュティリスを好適 な条件で培養し、 得られる培養物もしくはその分画物、 又は加熱処理した前記培 養物又は分画物を、 飲食品原料に混合し、 飲食品に加工することを特徴とする、 T—ダルタミルシスティン又はシスティン含有食品の製造法。
1 0 . 下記 （A) 又は （B ) に示すタンパク質をコードする D N A。
(A) 配列番号 4 3に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
( B ) 配列番号 4 3に示すアミノ酸配列において、 1若しくは数個のアミノ酸 の置換、 欠失、 挿入、 または付加を含むアミノ酸配列を有し、 かつ、 r一グルタ ミルシスティン合成酵素活性を有するタンパク質。
1 1. 下記 （a) 又は （b) に示す DNAである請求項 10に記載の DNA。
(a) 配列番号 42の塩基番号 1 1 0〜2 1 0 1の塩基配列を含む DNA。
(b) 配列番号 42の塩基番号 1 1 0〜2 1 0 1の塩基配列又は同塩基配列か ら調製され得るプローブとストリンジェン卜な条件下でハイブリダィズし、 かつ、 7一ダル夕ミルシスティン合成酵素活性を有する夕ンパク質。
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