WO2003075956A2 - Utilisation de melanges de lipopeptides pour la fabrication de vaccins - Google Patents

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WO2003075956A2
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Jean-Gérard Guillet
Isabelle Bourgault-Villada
Marion Dupuis
Hélène GRAS MASSE
Line Bourel
Oleg Melnyk
Pascal Joly
Dominique Bonnet
Frédéric MALINGUE
Cyrille Grand Jean
Bertrand Georges
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Institut Pasteur De Lille
Centre National De La Recherche Scientifique (Cnrs)
Universite De Lille 2
Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm)
SEDAC-Thérapeutics (SOCIETE D'ETUDE ET DE DEVELOPPEMENT DES ANTIGENES COMBINATOIRES)
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Definitions

  • the present invention relates to the use for the manufacture of a vaccine of a mixture comprising at least lipopeptides, said lipopeptides consisting of a peptide compound having been linked in solution, by a hydrazone bond, to at least one lipophilic vector of non-peptide nature.
  • the use for the manufacture of lipopeptide vaccines has already been described: thus, patent application PCT / FR98 / 02605 describes mixed micelles of lipopeptides for the induction of an immune response.
  • helper T cells helper T lymphocytes, HTL
  • antibody-producing B cells cytotoxic T cells
  • lipopeptides have a lipophilic character, and therefore tend to aggregate in aqueous solution. Consequently, the major difficulty encountered during their production on an industrial scale is associated with the stages of purification by preparative RP-HPLC, the resolution of which is very limited. The separation of the desired products from the secondary products can only be achieved with a limited load on the column. Consequently, for the preparation of a vaccine on an industrial scale, and when considering the lipopeptides branched in the C-terminal position, a large part of the labor cost is devoted to the repetition of the chromatographic steps. Thus, the purification yields are relatively low, typically 10 at the laboratory level, and probably lower on an industrial scale (10-100 mg), from 1 to 2% or even less when the batch size is increased. factor 10 vaccine.
  • the purpose of preparing mixed micelles of lipopeptides is to ensure an equitable distribution of all the ingredients of the vaccine to each cell presenting the antigen, this in order to allow cellular cooperation between T-helper and T-cytotoxic lymphocytes by communication physical with; antigen presenting cell.
  • lymphocytes must simultaneously recognize on the surface of the same antigen presenting cell epitopes presented with major complexes type I and type II histocompatibility.
  • the results obtained in clinical trial confirm experimentally that an effective immune response can be obtained during which a T-helper epitope is identified in a lipopeptide antigen and a T-cytotoxic epitope located in another lipopeptide of the same composition (Gahéry- Ségard et al., 2000, J.
  • the process according to the prior art therefore involved a relatively prolonged stay of the lipopeptides in acetic acid at 80% in water, in order to dissolve each ingredient individually, prepare their mixture, homogenize then carry out the sterilizing filtration on a porosity filter. 0.22 ⁇ m, before dilution then lyophilization.
  • the duration of stay in such a solvent is not very compatible with certain peptide sequences or with certain lipophilic vectors sensitive to acids.
  • the Applicant has therefore set itself the goal of manufacturing vaccines on an industrial scale, the manufacture of which does not have the drawbacks of that of vaccines of the prior art.
  • a subject of the invention is therefore the use for the manufacture of a vaccine of a mixture comprising at least lipopeptides, said lipopeptides being preferably obtained by simultaneous lipidation of a homogeneous mixture of peptide compounds and consisting of a peptide compound linked by a hydrazone link, to at least one lipophilic vector of non-peptide nature, and are of general formula (I) below:
  • D represents a saturated, unsaturated or aromatic, mono- or polycyclic heterocycle
  • R 1 and R 2 which may be identical or different, each represent a group of formula LfEf where L represents a residue of a lipid, E represents a spacer arm, and f and f represent functions linking, respectively, L to E and E to D, and
  • H represents the hydrazone link formed by ligation in solution between an aldehyde function carried by the lipophilic vector and a hydrazine derivative function carried by the peptide compound
  • the mixture of lipopeptides must form a homogeneous solution or suspension in an aqueous medium and have a desired immunogenic character.
  • the use of at least one mixture of lipopeptides according to formula (I) is advantageously such that i is equal to 0, j is equal to 1 and in that the group L (in the formula LfEf defined in relation to R 1 and R 2 ) represents for example a sterol, a sterol derivative (such as a cholesterol derivative) or a saturated or unsaturated carbon chain, linear or branched, comprising between 4 and 30 carbon atoms .
  • the sterol derivative is a cholesterol derivative and the carbon chain corresponds to the formula CH 3 - (CH 2 ) 14 -.
  • E advantageously represents a linear, branched or cyclic carbon chain, saturated or unsaturated, containing from 1 to 18 carbon atoms and, optionally, 1 to 16 heteroatoms (for example nitrogen or oxygen) and / or 1 to 7 groups selected from carbonyl groups, heterocycles, heteroaryls, carbocycles and aryls. E can optionally be substituted by 1 to 8 hydroxyl or amino groups and / or 1 to 16 halogen atoms (such as chlorine or fluorine).
  • f advantageously represents a -CO-NH- or -CO-O- bond and f represents a - NH-CO- or -0-CO- bond.
  • Cycloalkyl a mono- or polycyclic carbon ring, comprising between 3 and 8 carbon atoms, such as cyclopentyl or cyclohexyl;
  • aryl an aromatic, mono- or polycyclic carbon ring, comprising between 5 and 14 carbon atoms, such as phenyl, naphthyl or cresyl;
  • heterocycle a carbocycle comprising one or more heteroatoms chosen from nitrogen, oxygen and sulfur, such as piperazine;
  • heteroaryl an aryl comprising one or more heteroatoms chosen from nitrogen, oxygen and sulfur, such as pyridine, pyrimidine or pyrazine.
  • heteroaryl an aryl comprising one or more heteroatoms chosen from nitrogen, oxygen and sulfur, such as pyridine, pyrimidine or pyrazine.
  • L is as defined above and represents, for example a carbon chain of formula CH3- (CH 2 ) ⁇ - (that is to say the lipophilic part of palmitic acid).
  • the peptide compound P in formula (I) can be selected from the group consisting of one or more peptide antigens and one or more dendrimeric glycomimetics of peptide nature.
  • the term “one or more” peptide antigens or dendrimeric glycomimetics the fact that the peptide compound P can consist of one or more dendrimeric peptide or glycomimetics antigens linked together, without the activity of the mixture of lipopeptides being modified.
  • the peptide antigen is advantageously chosen from the group consisting of peptides and derivatives of peptides comprising glycopeptides and pseudopeptides.
  • the term “peptide” is understood to mean any chain of several amino acids, whatever their nature and number; the term “peptide” therefore designates both oligopeptides (dipeptides or tripeptides) as well as polypeptides or proteins.
  • glycopeptides is understood to mean peptides associated, by covalent bond, with carbohydrates, whether they are monosaccharides (such as neutral oses) or polysaccharides.
  • peptides in which one or more peptide bonds (- CO-NH-) have been replaced by non-peptide bonds (such as the bonds -CO-NH-NH-, -CH 2 - NH- or -CO-NH-0-).
  • the term “dendrimeric glycomimetics of peptide nature” means glycomimetics whose structure is based on amino acids or their derivatives and is in a highly branched form, of tree type.
  • the dendrimeric glycomimetic of peptide nature corresponds to the general formula (IV) below: (B 2 M) m (XN) n A (IV) in which: BB 22 refers to one or more general formulas (a) or (b) below:
  • Ri, R 2 , R 3 and R 4 represent, independently of each other, a hydrogen atom or a protective group
  • W represents a bond or a linear, branched or cyclic, saturated or unsaturated carbon chain comprising: from 1 to 18 carbon atoms and optionally from 1 to 12 atoms chosen from oxygen, sulfur and nitrogen, said carbon chain being optionally substituted by 1 to 16 halogen atoms,
  • X represents the remainder of an oligopeptide X ′ comprising from 1 to 6 amino acids
  • - A represents the remainder of a compound A 'at least trifunctional comprising a chain of amino acids, identical or different, selected from the group consisting of lysine, hydroxylysine, serine, threonine, cysteine, ornithine, aspartic acid and glutamic acid - m is an integer between 1 and 32, - n is an integer between 0 and 32, and
  • protecting group means a group protecting a hydroxyl function or a diol (in which case two groups chosen from Ri, R 2 , R 3 and R 4 may be covalently linked together to form a cycle together), as defined in the book Protective Groups in Organic Synthesis, TW GREENE and PGM WUTS, Second Edition 1991, J. WILEY and Sons.
  • trimethylsilyl triethylsilyl, triisopropylsilyl, tertiobutyldimethylsilyl, tertiobutyldiphenylsilyl, trimethylsilylethylether, tert-butoxymethyl, methoxy-methyl, benzyloxymethyl,
  • - suitable halogen atoms are bromine, chlorine and fluorine; and - suitable carbon chains are alkyl groups (methyl, ethyl, propyl, isopropyl, tert-butyl, pentyl, ...),. alkenyl groups (vinyl, allyl, butenyl, pentenyl, ...), alkynyl groups (ethynyl, propynyl, butynyl, pentynyl, ...), cycloalkyl groups
  • Formulas (a) and (b) represent the residues of quinic and shikimic acids and of some of their derivatives, obtained by protection; hydroxyls carried to positions 1, 3, 4 and / or 5 of the cycle.
  • the compound of general formula (IV) is such that m is an integer between 4 and 16, n is an integer between 2 and 8, X represents the remainder of an oligopeptide comprising from 2 to 4 amino acid residues, while A represents the remainder of a chain comprising from 2 to 8 lysine residues and which is in the form of a dendrimer, and B 2 represents a residue of one or more compounds chosen from (-) -shikimic acid and (-) -quinic acid.
  • the presence of peptide compounds according to formula (IV) makes it possible to selectively vectorize the lipopeptides towards the cells possessing mannose receptors or receptors of the C- family. lectins related to the mannose receptor.
  • the mixture of lipopeptides comprising peptide compounds P consisting of a peptide antigen and a dendrimeric glycomimetic according to formula (IV) make it possible to target said mixture of lipopeptides towards cells expressing receptors of the family of C-lectins related to the receptor for the receptor mannose.
  • a mixture of lipopeptides according to the present invention advantageously comprises from 1 to 20 different lipopeptides, preferably from 1 to 10 different lipopeptides.
  • the use according to the present invention of a mixture of lipopeptides for the manufacture of vaccines is understood in the sense of the use for the manufacture of all types of vaccines, that is to say conventionally prophylactic vaccines, but also "vaccines for therapeutic use”. These vaccines can be directed against infectious diseases of bacterial, viral or parasitic origin or against different types of cancer.
  • the use according to the invention also allows the manufacture of polyvalent vaccines comprising the mixture of peptide antigens corresponding to different infectious diseases.
  • the vaccines according to the present invention are therefore not only active for preventive vaccination but also for therapeutic purposes, in particular the lipopeptide vaccines according to the present invention can be used to create a response against new epitopes as well as to polarize or reinforce the polarization of a established immune response.
  • the peptide compound advantageously consists of peptide antigens derived from an infectious agent of the viral type, such as HIV or HCV.
  • the use for the manufacture of a vaccine of a mixture comprising at least lipopeptides according to the invention is preferably formulated for administration by transmucosal or transcutaneous route, but also parenteral (intramuscular, subcutaneous, intradermal, intravenous).
  • Ucosal and transcutaneous vaccines represent an attractive alternative to vaccines administered parenterally.
  • Mucosal administration for example via the nasal route, makes it possible to induce immune responses at the level of sites which are the entry point for numerous pathogens, and constitutes an effective alternative to oral administration which remains associated with poor access to antigen presenting cells, proteolytic degradation located in the intestinal tract and therefore a low amplitude immune response.
  • the skin is also an immune barrier against the entry of many pathogens. It has specific immunocompetent cells such as keratinocytes and especially Langerhans cells, is equipped with lymphoid nodes, as well as T-cell subclasses, the whole constituting "the lymphoid tissue associated with the skin"
  • a vaccine of a mixture comprising • at least lipopeptides further comprises constituents of amphiphilic nature or excipients capable of ensuring good solvation in water by a polar part and a Van der Waals type interaction with lipopeptides of hydrophobic character.
  • amphiphilic excipients or constituents can consist, for the most part, of polar or charged amino acids.
  • the mixture of lipopeptides further comprises one or more clinically acceptable excipients.
  • the clinically acceptable excipient is mannitol or Polysorbate 80, or a mixture of the two.
  • the present invention relates in particular to vaccines, comprising as peptide antigens, at least two sequences originating from the Gag, Pol and Nef proteins of the HIV virus, in particular a mixture of the sequences Gag 17-35, Gag 253-284, Pol 325- 355, Nef 66-97, Nef 116-147 and more particularly the lipopeptides as described in Example 1.
  • an additional lysine is preferably introduced at the C-terminal end of each peptide, and the C-terminal carboxylic acid is amidated.
  • the amino function (e-NH2) of the side chain of this lysine is modified by a palmitoyl half attached via a spacer containing a hydrazone bond.
  • the use according to the invention comprises, as peptide antigens, the following peptide sequences:
  • the invention also relates to the native sequences:
  • NS3 1007-1037 H-KGREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2 NS3 1174-1195: H-KGHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2 NS3 1524-1553: H-KGAA YELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2, which therefore have an immunogenic character.
  • the invention also comprises other arrangements which will emerge from the description which follows, which refers to examples of implementation of the use for the manufacture of a vaccine of a mixture comprising at least lipopeptides according to the invention, as well as in FIG. 1 which illustrates the results of analysis of the immunogenicity in the macaque after the injection of vaccine doses (VIS) according to example 5.
  • VIS vaccine doses
  • Peptide synthesis Five peptides, derived from the Gag, Pol and Nef proteins of the HIV-1 virus, functionalized by ⁇ -hydrazinoacetic groups at the level of the side chain of a lysine introduced at the C-terminal, were prepared. These hydrazinopeptides were synthesized in solid phase in the form of trifluoroacetate salts. The Fmoc / tert-Butyl strategies (conventional), as well as the process which has been recently described (N, N ', N' -tri (tert-butyloxycarbonyl) -hydrazinoacetic acid) were used to introduce in a targeted manner a hydrazinoacetyl group.
  • the hydrazinopeptides are purified by RP-HPLC on a C3 preparative column (Zorbax column: 300 A, 5 ⁇ M, diameter of 12.5 mm and length of 250 mm with precolumn) on a Shimatzu 6A HPLC chain.
  • the analyzes by RP-HPLC are carried out on a preparative column C3 (Zorbax column: 300 A, 5 ⁇ M, diameter of 4.6 and length of 250 mm) on a HPLC chain Shimatzu 10A.
  • the elution solvents are the following: solvent A: deionized water comprising 0.05% of TFA, solvent B (purification): 0.05% of TFA in a propan-2-ol / H mixture 2 0 (40:60). solvent B (reaction monitoring, Analyzes): 0.05% TFA in an acetonitrile / H 2 0 mixture (80:20).
  • the elution rate is lml / min using a linear gradient of 10 to 100% of buffer 'B in 30 minutes, 100% of buffer B for 10 minutes, 10% of buffer B for 10 minutes (detection at 215 nm , temperature: 50 ° C).
  • Gag 17 - HIV 1 HzAc EKIRLRPGGKKKYKLKHIV K (COCH 2 NHNH 2 ) -NH 2 35
  • succinimidyl palmitoate are then added to the solution which is stirred overnight at room temperature.
  • the pH is then adjusted to 3.5 with 7.11 g of citric acid.
  • the medium is diluted with 40 ml of a saturated NaCl solution and extracted with 140 ml of dichloromethane, then 100 ml of chloroform.
  • the organic phase is washed with twice 100 ml of a saturated solution of KH 2 P0 4 , twice 100 ml of a saturated solution of NaCl, then dried over Na 2 S0, filtered and concentrated under reduced pressure.
  • the residual solid compound is purified on silica using a CH 2 Cl 2 / AcOEt / EtOH mixture (70/22/5) as eluent. 951.4 mg of the lipophilic vector (Illa), ie a yield of 42.3%, are thus obtained.
  • a homogeneous mixture of hydrazinopeptides is obtained by individual dilution of each ingredient in water or diluted acetic acid, mixing of the solutions and then lyophilization.
  • a first synthesis was carried out using 9.6 mg of an equimassic mixture of each of the 5 HIV peptides (HIV 1 HzAc; HIV 2 HzAc; HIV 3 HzAc; HIV 4 HzAc and HIV 5 HzAc), corresponding to a value of 2.22 micromoles of peptides (taking into account the counterions and the peptide content of the lyophilisates).
  • This mixture is impregnated with 85 ⁇ l of water, which leads to the formation of a gel.
  • the lipophilic vector Illa is then added (977 ⁇ g, 2.52 ⁇ mol) with magnetic stirring with glass beads 5 mm in diameter, or 1.14 equivalent relative to the peptides, in solution in 714 ml of 2-methyl- propan-2-ol.
  • the total volume of reaction medium (1.7 ml) is reached by adding 2-methyl-propan-2-ol.
  • a micropreparative experiment is carried out to allow product identification: a sample is taken to separate the constituents by RP-HPLC on a C3 column (Zorbax, 4.6 mm x 250 mm), with collection of the main peaks in order identify them by mass spectrometry with MALDI-TOF (MALDI-TOF Voyager ABI 4192, positive mode, reflector 25 kV, extraction delay 300 ms, ⁇ -cyano cinnmic acid matrix)
  • the lipopeptides obtained are in the form of a white powder.
  • the lipopeptides in the form of TFA salts are dissolved in a solution of aqueous acetic acid at pH 3, loaded on a RP-HPLC column (Nucleoprep C4 column, 25 mm ⁇ 100 mm) and then washed with the same solvent (washings carried out with a volume equivalent to that of 5 columns) before being eluted by a passage without transition to an acetic acid solvent at pH 3 in water / propan-2-ol (60:40).
  • the mixture of lyophilized lipopeptides is dissolved in a 10% acetic acid solution before being subjected to sterilizing filtration on a 0.22 micron membrane (SLGV, Millipore).
  • the unit doses of vaccine recommended for a phase I clinical trial in humans are 2.5 mg of lipopeptide cocktail.
  • peptides derived from the NS3 protein of the HCV-1 virus, functionalized by ⁇ -hydrazinoacetic groups at their N-terminal end were prepared. These hydrazinopeptides have been synthesized in the solid phase in the form of trifluoroacetate salts. Fmoc / tert-Butyl strategies (conventional), as well as the recently described process
  • N, N ', N' -tri (tert-butyloxycarbonyl) -hydrazinoacetic acid) were used to introduce in a targeted manner a hydrazinoacetyl group on a deprotected ⁇ -amino group of a lysylamide residue in the N-terminal position as in l 'example 1.
  • the synthesis yields are between 10 and 50%.
  • the identity of the peptides has been verified by ES.MS.
  • the hydrazinopeptides are subjected to an analysis of the amino acid composition after total acid hydrolysis with 6N hydrochloric acid HCl: phenol, 10: 1 at 110 ° C for 24 hours.
  • HPLC on a preparative column C3 (Zorbax column: 300 A, 5 ⁇ M, diameter of 12.5 mm and length of 250 mm with precolumn) on a HPLC chain Shimatzu 6A.
  • the analyzes by RP-HPLC are carried out on a preparative column C3 (Zorbax column: 300 ⁇ , 5 ⁇ M, diameter of 4.6 and length of 250 mm) on a HPLC chain Shimatzu 10A.
  • the elution solvents are the following: - solvent A: deionized water comprising 0.05% of TFA, solvent B (purification): 0.05% of TFA in a propan-2-ol mixture / H 2 0 (40:60). solvent B (reaction monitoring): 0.05% TFA in an N propanol / H 2 0 mixture (40:60).
  • the elution rate is lml / min èri using a linear gradient from 0 to 100% of buffer B in 30 minutes, 100% of buffer B for 5 minutes, 0% of buffer B for 10 minutes (detection at 215 nm, temperature: 50 ° C).
  • the lipophilic vector Illa is then added (4757 ⁇ g, 12.28 ⁇ moles, representing 1.14 equivalent relative to the peptides) with magnetic stirring with a few 5 mm glass beads of diameter, dissolved in 950 ⁇ l of 2-methyl-propan-2- ol.
  • the total volume of reaction medium (8,290 ml) is reached by adding 2-methyl-propan-2-ol.
  • a micropreparative experiment is carried out to allow product identification: a sample is taken to separate the constituents by RP-HPLC on a C3 column (Zorbax, 4.6 mm x 250 mm), with collection of the main peaks in order identify them by mass spectrometry with MALDI-TOF
  • the lipopeptides obtained are in the form of a white powder.
  • the lipopeptides obtained have a retention time presented in Table VI below.
  • This synthesis is carried out from the mixture of the HCV hydrazinopeptides obtained previously with a glycomimetic connected to four valences (tetraquinoylated tree) produced from a lysine tree synthesized in Fmoc / tert Butyl strategy on which a hydrazinoacetyl group has been introduced on the deprotected ⁇ -amino group of the C-terminal lysylamide residue, according to formula (IV) of the invention.
  • the lipophilic vector Illa (1640 micrograms, or 1.14 peptide equivalent) dissolved in 2-methyl-propan-2-ol (410 ⁇ l), with magnetic stirring with a few glass beads 5 mm in diameter, the final volume is 2.7 ml.
  • the disappearance of the hydrazinopeptides over time is followed in parallel with the appearance of the corresponding lipopeptides. After 3 hours, the mixture is diluted in water, frozen and lyophilized. The lipopeptides obtained are in the form of a white powder.
  • the mixtures of lyophilized lipopeptides obtained in 3) and 3 ') are dissolved in a 10% acetic acid solution before being subjected to sterilizing filtration on a membrane 0 , 22 micron (SLGV, Millipore).
  • the lyophilized mixture of lipopeptides and glycomimetic lipid [(Qui) 4 AKHdz)] is dissolved in a 10% acetic acid solution before being subjected to sterilizing filtration on a 0.22 micron membrane (SLGV, Millipore). After the introduction of clinically acceptable excipients (mannitol / lipopeptides 10/1 (w / w)), the solution is diluted in water in a sterile bottle before final lyophilization.
  • the unit doses of vaccine recommended for a phase I clinical trial in humans are 2.5 mg of lipopeptide cocktail.
  • the hydrazinopeptides are purified by RP-HPLC on a preparative column C3 (Zorbax column: 300 ⁇ , 5 ⁇ M, diameter 12.5 mm and length of 250 mm with precolumn) on a HPLC Shimatzu 6A chain.
  • the analyzes by RP-HPLC are carried out on a preparative column C3 (Zorbax column: 300 ⁇ , 5 ⁇ M, diameter of 4.6 and length of 250 mm) on a HPLC chain Shimatzu 10A.
  • the elution solvents are the following: - solvent A: deionized water comprising 0.05% of TFA, solvent B: 0.05% of TFA in a propan-2- ol / H 2 0 mixture (40:60).
  • the elution rate is lml / min using a linear gradient from 0 to 100% of buffer B in 30 minutes, 100% of buffer B for 5 minutes, 0% of buffer B for 10 minutes (detection at 215 nm, temperature: 50 ° C).
  • the lipophilic vector II is then added (1926 ⁇ g, 3.374 ⁇ moles, representing 1.14 equivalent with respect to peptides) with magnetic stirring with a few glass beads of 5 mm in diameter, dissolved in 292 ⁇ l of 2-methyl-propan-2-ol.
  • the total volume of reaction medium (2.3 ml) is reached by adding 2-methyl-propan-2-ol.
  • a micropreparative experiment is carried out to allow product identification: a sample is taken to separate the constituents by RP-HPLC on a C3 column (Zorbax, 4.6 mm x 250 mm), with collection of the main peaks in order identify them by mass spectrometry with MALDI-TOF (MALDI-TOF Voyager ABI 4192, positive mode, reflector, 25 kV, extraction time 300 ms, a-cyano cinnamic acid matrix)
  • the lipopeptides obtained are in the form of a white powder.
  • a homogeneous mixture of hydrazinopeptides is obtained by individual dilution of each ingredient in water or diluted acetic acid, mixing of the solutions and then lyophilization. This synthesis is carried out from the mixture of hydrazinopeptides with the glycomimetic connected to four valences [(Qui) AKHdz)]. 12 mg of an equimassic mixture of each of the 3 hydrazinopeptides (seen in 3)), corresponding to 2.9 micromoles of hydrazinopeptides are added to 3.3 mg (or 2.2 ⁇ moles) of the glycomimetic hydrazine.
  • the lipopeptides obtained are in the form of a white powder.
  • CChol lipopeptides (with or without glycomimetic) according to 3) and 3 ')
  • an additional purification step is necessary in order to remove a non-negligible amount of unreacted hydrazine precursors.
  • This purification of the reaction medium is carried out by RP-HPLC on a Shimadzu 6A system, with a C4 column Deltapak WATERS 15 ⁇ M 300 ⁇ , 8 mm in diameter and length 100 mm.
  • solvent A deionized water comprising 0.05% TFA
  • solvent B purification: 0.05% TFA in a propan-2-ol / H 2 0 mixture (40:60).
  • the elution rate is 2 ml / min using a linear gradient from 0 to 80% of buffer B in 12 minutes, then 100% of buffer B.
  • the fraction of lipopeptide eluted is frozen and lyophilized.
  • mannitol - Tween [3 lipopeptides, vector CChol] After the introduction of clinically acceptable excipients (mannitol / lipopeptides 10/1 (w / w) and Polysorbate 80 / lipopeptides 2/7 (w / w)) the lipopetide solution is diluted in water in a sterile bottle before final lyophilization.
  • the unit doses of vaccine recommended for a phase I clinical trial in humans are 2.5 mg of lipopeptide cocktail.
  • Three peptides derived from the NS3 protein of the HCV-1 virus, functionalized by ⁇ -hydrazinoacetic groups at their N-terminal end (see example 2) or at their C-terminal end (see synthesis protocol in the example 1), were lipidized by the vector Pam.
  • the immunogenicity of these lipopeptides was analyzed on syngeneic Balb / c and C57bl / 6 mice after subcutaneous injection of the 3 N-terminal or C-terminal vector Pam lipopeptides (1.2 mg of the mixture per mouse, equivalent to 100 ⁇ g of lipopeptides), or 3 native peptides (100 ⁇ g per mouse) + montanide ISA 720, or 3 native peptides alone (100 ⁇ g per mouse).
  • the measurement of the lymphoproliferation is carried out after the cultivation of the murine spleen cells, as indicated below:
  • the spleens are recovered and incubated at 4 ° C. in RPMI 1640 medium (GIBCO BRL).
  • the cells are then crushed on a nylon membrane.
  • the cells are centrifuged at 1500 rpm for 10 min at 4 ° C.
  • the lysis of the red cells is carried out in the presence of lysis buffer for 10 minutes at 4 ° C.
  • the cells are then centrifuged and taken up in HL-1 medium (Biowhittaker) containing 4% of serum of autologous mice.
  • the cells are then distributed in 96-well culture plates in U-bottom polystyrene (Costar) at a rate of 100 ⁇ l per well.
  • the native synthetic peptides (Neosystem) are diluted in HL-1 medium (Biowhittaker) then added at the rate of 100 ⁇ l per well for a final concentration of 25 ⁇ g / ml. Culture plates are incubated 72 hours at 37 ° C in a humid atmosphere and 5% C02. The tritiated methylthymidine (Amersham) is diluted in HL-1 medium (Amersham) and is then added to each well at the rate of 1 ⁇ Curie in 25 ⁇ l. After 16 hours of incubation, the cells are collected on a fiberglass filter (Wallac) with the TOMTEC system. The incorporation of tritiated thymidine is then measured using a beta counter (Wallac 140 microbeta). ,
  • mice were immunized by subcutaneous administration of 1.2 mg (equivalent to 100 ⁇ g of vector lipopeptides Pam + mannitol + Tween or 100 ⁇ g of a mixture of native peptides in the presence of montanide). Immunization followed by a reminder on D15 and D29 were carried out. The sera were taken on D14, D28 and D42 after the first administration of the antigens
  • the peptide antigens are dissolved in 0.1 M phosphate buffer pH 8.2 at a concentration of 10 ' ⁇ g / l. 100 ⁇ l of this solution are added per well, in a 96-well Maxisorb plate (NUNC). After an overnight incubation at 4 ° C. and two washes in 0.01% PBS-tween buffer, the wells are saturated in the presence of a PBS buffer containing 3% bovine serum albumin (BSA). After 2 hours of incubation at room temperature, 2 washings of the wells are carried out in PBS-tween buffer. 100 ⁇ l of serum, diluted to 1/100, are then added in incubation overnight at 4 ° C.
  • NUNC 96-well Maxisorb plate
  • Table IX Determination of total antibodies on immunized Balb / c mice (results expressed in optical density).
  • mice are immunized sublingually with 480 ⁇ g of each lipopeptide mixture dissolved in 5 ⁇ l of water for injection (H 2 0 ppi).
  • a booster is given 14 days after the first immunization under the same conditions as above. 14 days later, the animals are sacrificed, the spleens are removed and the spleen cells are cultured in the presence of the various native peptides, alone or as a mixture, at a concentration of 10 ⁇ g / ml
  • the primary antibodies specific for murine IL-2 (anti-mouse rat IL-2, Pharmingen 18161D) are incubated in 0.1M phosphate buffer, pH 8.2 at a concentration of 2 ⁇ g / ml. 50 ⁇ l per well of this solution are added to a 96-well Maxisorb plate
  • NUNC UniNC
  • PBS-Tween buffer After an overnight incubation at 4 ° C. and two washes in 0.01% PBS-Tween buffer, the wells are saturated in the presence of a PBS buffer containing 3% serum bovine albumin (BSA). After 2 hours of incubation at room temperature, 2 washes are carried out in PBS-Tween buffer. 100 ⁇ l of culture supernatant are then added and incubated overnight at 4 ° C. A dilution range of recombinant murine IL-2 is prepared in 1% PBS-BSA (from 20 ng to 0.3 pg) and 100 ⁇ l of this preparation are deposited per well. 3 washes in PBS-Tween are then carried out.
  • BSA serum bovine albumin
  • biotinylated secondary antibody specific for murine IL-2 (anti-mouse rat biotin IL-2, Pharmingen 18172D) is incubated in 1% PBS-BSA buffer at a rate of 100 ⁇ l per well for one hour at room temperature. After 3 washes in PBS-Tween, streptavidin-peroxidase (Jackson Immunoresearch), diluted in PBS-Tween to Img / l, is added to each well in a volume of 100 ⁇ l, for 30 minutes at room temperature.
  • mice (Balb / c) were immunized by sublingual administration of 5 ⁇ l of mixture of lipopeptides (480 ⁇ g of powder equivalent to approximately 40 ⁇ g of lipopeptides). A booster was given 14 days after this first immunization, with the same amounts of mixture of lipopeptides.
  • Batches of 5 Balb / c mice (IFFA-CREDO) were formed for each of the four formulations: [3 lipopeptides + glycomimetic, vector CChol]; [3 lipopeptides, vector CChol]; [3 lipopeptides + glycomimetic, vector Pam]; [3 lipopeptides + glycomimetic, vector Pam].
  • mice are sacrificed 7 days after the booster, the spleens are removed and grouped by batch of animals.
  • the cells of each batch of mice are restimulated by the different native peptides, either individually or as a mixture (concentration: 10 ⁇ g / ml). 24 hours after culturing the cells, the supernatants are removed in order to carry out the assay of their IL-2 content. The results are expressed in picograms of IL-2 per ml of supernatant.
  • Table X presents the results of analysis of the immunogenicity of the various lipopeptide mixtures in mice.
  • Table X Production of IL2 after sublingual immunization (expressed in pg / ml).
  • CChol lipopeptides are particularly immunogenic when they are administered via the mucosa and more particularly via the sublingual route.
  • Example 5 Evaluation in the Macaque of the capacity of lipopeptide vaccines to induce a CTL-type response against the simian immunodeficiency virus (VIS).
  • VIS simian immunodeficiency virus
  • PCT / FR01 / 02787 describes the synthesis of peptides functionalized by ⁇ -hydrazinoacetic groups, from peptide sequences derived from the Nef and Gag proteins of the virus of
  • the VIS 1 'sequence presented here comprises two mutations in positions 110 and 112)
  • the lipophilic vector used is the Illa vector described in Example 1.
  • the lyophilized lipopeptide mixtures obtained in 3) are dissolved in a 5% acetic acid solution before being subjected to a sterilizing filtration on 0.22 micron membrane (SLGV, Millipore).
  • mannitol was introduced as well as Tween 80 in sufficient quantity for the preparation of 10 unit doses, the composition per dose of which is as follows:
  • the mixture was prepared by simultaneous lipidation (as in Example 3, part 3 ')) of a mixture of hydrazinopeptides (trifluoroacetate) (5.8 mg per hydrazinopeptide) to which is added a branched glycomimetic ([(Who) 4 AKHdz)], 12.9 mg).
  • One unit dose is used per animal and per injection.
  • the dose is diluted in water for injection (1 ml per dose): an opalescent solution is obtained.
  • the product (without adjuvant) was administered intra-dermally at 10 injection points (100 ⁇ l per point) (4 macaques), intramuscularly (4 macaques). The 3 injections were given 3 weeks apart and a booster was given 2 months after the last injection. The immune response was tested on blood samples taken pre- immunization, 15 days after the 3rd immunization and 14 days after the recall.
  • the effectiveness of the immunization was tested by evaluation of the number of circulating effectors and of their precursors secreting gamma Interferon (IFN- ⁇ ) by an ELISPOT test following a prior restimulation in cells.
  • PBMC blood mononuclear total
  • PBMCs are isolated by gradient centrifugation on a lymphocyte separation medium (Flow Laboratories, Glasgow, UK or Pharmacia, Uppsala, Sweden) and are used immediately.
  • lymphocyte separation medium Flow Laboratories, Glasgow, UK or Pharmacia, Uppsala, Sweden
  • the PBMCs (16.10 6 cells) are placed in complete RPMI 1640 medium at 5 million / ml; and aliquoted into 4 tubes of 4 million cells which will be incubated overnight at 37 ° C with lipopeptides (10 ⁇ g / ml).
  • line 0 without peptides
  • - line 1 with VIS1 HzPam (LP1) and VIS2 HzPam (LP2)
  • - line 2 with VIS3 HzPam (LP3), VIS4 HzPam (LP4) and VIS5 HzPam (LP5);
  • ELISPOT-IFN- test After 1 wash the following day, the lines are placed in a 24-well plate, at 2 million cells per ml and at a rate of 2 ml per well. On days 3 and 7, Interleukin 2 (IL-2, 10 IU / mL) is added with change of medium on day 7. These effectors were tested after 12 days of culture and washed twice just before the test.
  • ELISPOT-IFN- test ' .
  • the plates are then washed several times with PBS and then 0.05% PBS-Tween. After these washes, the plates are incubated overnight at 4 ° C or 2 hours at 37 ° C with a biotinylated anti anti IFN- ⁇ simian mouse monoclonal antibody diluted 1/1000 in PBS Tween 0.05% ; BSA 1% (clone 7-B6-1 mabtech, 1 microgram / ml final).
  • L7P1 250-257; 255-263;
  • the 1st group (macaques 1053, 1059, 1060, 1066) received the mixture of 7 lipopeptides administered intradermally.
  • the results show positive responses in 2 macaques (1053 and 1066) which recognize 1 pool of small peptides each. These responses are visible 15 days after the last immunization.
  • the 2nd group (monkeys 1051, 1062, 1068, 1077) received a mixture of 7 lipopeptides administered intramuscularly.

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Abstract

L’invention se rapporte à l’utilisation pour la fabrication d’un vaccin d’un mélange comprenant au moins des lipopeptides, lesdits lipopeptides étant constitués d’un composé peptidique ayant été lié en solution, par un lien hydrazone, à au moins un vecteur lipophile de nature non peptidique. L’invention concerne également des séquences natives NS3 du VHC.

Description

Utilisation de mélanges de lipopeptides pour la fabrication de vaccins
La présente invention se rapporte à l'utilisation pour la fabrication d'un vaccin d'un mélange comprenant au moins des lipopeptides, lesdits lipopeptides étant constitués d'un composé peptidique ayant été lié en solution, par un lien hydrazone, à au moins un vecteur lipophile de nature non peptidique. L'utilisation pour la fabrication de vaccins de lipopeptides a déjà été décrite : ainsi, la demande de brevet PCT/FR98/02605 décrit des micelles mixtes de lipopeptides pour l'induction d'une réponse immunitaire. Cette utilisation permet, à partir d'un produit de composition chimique déterminée, de délivrer au système immunitaire une collection diversifiée d' antigènes peptidiques qui seront présentés simultanément par les cellules présentatrices d'antigènes (CPA) en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe I et de classe II. Il est ainsi possible d'activer des cellules spécifiques des antigènes présentés : cellules T auxiliaires (Lymphocytes T « helper », HTL) , cellules B productrices d'anticorps, ou cellules T cytotoxiques (Lymphocytes T cytotoxiques, CTL) .
Pour induire dans chaque individu vacciné une réponse immunitaire polyclonale protectrice, l'augmentation de la diversité épitopique de la composition vaccinale représente une des stratégies les plus prometteuses. Plusieurs expériences ont montré que des réponses cellulaires multiples peuvent être induites de manière assez efficace à la suite d'une immunisation avec plusieurs peptides présentant de multiples épitopes modifiés au niveau de leur position C-terminale par une N-ε-palmitoyl lysine.
Ainsi, par exemple, certains cocktails de lipopeptides comprenant de 7 à 8 constituants différents ont été utilisés pour induire des réponses de cellules T spécifiques à un virus chez les primates (Bourgault- Villada et collaborateurs, 1997, FEMS Immunol . Med. Microbiol . , 1_9, 81-87 ; Mortara et collaborateurs, 1999, J. Virol, 13.' 4447-4451 ; Mortara et collaborateurs, 2000, Virology, 278, 551-561) et chez l'homme (Gahéry- Ségard et collaborateurs, 2000, J. Virol . , 1_ _, 1694- 1703 ; Pialoux et collaborateurs, 2001, AIDS, 15 1239 - 1249) .
L'étude de Pialoux et collaborateurs a montré qu'il était possible d'induire des réponses HTL et CTL chez une large majorité de volontaires sains ayant reçu une dose de 600 μg à 3 mg d'un mélange de 6 lipopeptides longs de 24 à 33 résidus (100 μg à 500 μg par peptide) dans le modèle d' infection par le Virus de 1' Immunodéficience Humaine (Virus de type 1, VIH-1) . La tolérance et l' immunogénicité du cocktail des 6 lipopeptides utilisés dans des essais de phase clinique de type I a confirmé que de telles formulations synthétiques représentent une approche alternative prometteuse aux vaccins conventionnels et recombinants. Les lipopeptides connus dans l'art antérieur sont assemblés par synthèse peptidique en phase solide au niveau de l'extrémité C-terminale ou N-terminale des peptides. Ces lipopeptides présentent un caractère lipophile, et de ce fait tendent à s'agréger en solution aqueuse. Par conséquent, la difficulté majeure rencontrée au cours de leur production à l'échelle industrielle est associée aux étapes de purification par RP-HPLC préparative, dont la résolution est très limitée. La séparation des produits souhaités à partir des produits secondaires peut être atteinte seulement avec une charge limitée sur la colonne. Par conséquent, pour la préparation d'un vaccin à l'échelle industrielle, et lorsqu'on considère les lipopeptides branchés en position C-terminale, une grande partie du coût du travail est consacrée à la répétition des étapes chromatographiques . Ainsi, les rendements de purification sont relativement faibles, typiquement de 10 au niveau du laboratoire, et vraisemblablement plus faible à l'échelle industrielle (10-100 mg) , de 1 à 2% ou même moins lorsqu'on augmente la taille du lot de vaccin par un facteur 10.
La préparation de micelles mixtes de lipopeptides a pour but d'assurer une distribution équitable de tous les ingrédients du vaccin auprès de chaque cellule présentatrice de l'antigène, ceci afin de permettre une coopération cellulaire entre lymphocytes T-auxiliaires et T-cytotoxiques par communication physique avec la; cellule présentatrice de l'antigène. Pour atteindre une coopération cellulaire efficace, les lymphocytes doivent reconnaître simultanément à la surface d'une même cellule présentatrice de l'antigène des épitopes présentés avec des complexes majeurs d'histocompatibilité de type I et de type II. Les résultats obtenus en essai clinique confirment expérimentalement qu'une réponse immune efficace peut être obtenue au cours de laquelle un épitope T- auxiliaire est identifié dans un antigène lipopeptidique et un épitope T-cytotoxique situé dans un autre lipopeptide de la même composition (Gahéry-Ségard et collaborateurs, 2000, J. Virol . , 74, 1694-1703 ; Pialoux et collaborateurs, 2001, AIDS, 15 1239 - 1249) . Pour obtenir les micelles mixtes de lipopeptides selon l'art antérieur, il faut purifier et caractériser individuellement chaque lipopeptide avant de réaliser leur mélange. Pour réaliser le mélange selon l'art antérieur il faut dissoudre individuellement chaque lipopeptide dans des conditions permettant d' obtenir une solvatation complète de chaque lipopeptide ingrédient du vaccin (PCT /FR98/02605) . Des études par résonance magnétique nucléaire des solutions ont montré que cet état de dissolution n'était obtenu que dans des concentrations élevées d'acide acétique dans l'eau
(80%). Le procédé selon l'art antérieur impliquait par conséquent un séjour relativement prolongé des lipopeptides dans l'acide acétique à 80% dans l'eau, afin de dissoudre individuellement chaque ingrédient, préparer leur mélange, homogénéiser puis réaliser la filtration stérilisante sur filtre de porosité 0,22 μm, avant dilution puis lyophilisation. La durée de séjour dans un tel solvant est peu compatible avec certains enchaînements peptidiques ou avec certains vecteurs lipophiles sensibles aux acides. La demanderesse s'est donc fixée comme but de fabriquer des vaccins à l'échelle industrielle dont la fabrication ne présente pas les inconvénients de celle des vaccins de l'art antérieur. L'invention a donc pour objet l'utilisation pour la fabrication d' un vaccin d' un mélange comprenant au moins des lipopeptides, lesdits lipopeptides étant obtenus de préférence par lipidation simultanée d'un mélange homogène de composés peptidiques et étant constitués d'un composé peptidique lié par un lien hydrazone, à au moins un vecteur lipophile de nature non peptidique, et sont de formule générale (I) suivante :
[( (R1) (R2)i ) D -H]j - P
(D
dans laquelle (R1) (R2)i D représente le vecteur lipophile, dans lequel: - i représente 0 ou 1,
- dans le cas où i est égal à 0, D représente une liaison,
- dans le cas où i est égal à 1, D représente un hétérocycle saturé, insaturé ou aromatique, mono- ou polycyclique,
- R1 et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent chacun un groupement de formule L-f-E-f où L représente un résidu d'un lipide, E représente un bras espaceur, et f et f représentent des fonctions liant, respectivement, L à E et E à D, et
- P représente le composé peptidique, ;
- H représente le lien hydrazone formé par la ligation en solution entre une fonction aldéhyde portée par le vecteur lipophile et une fonction dérivé d'hydrazine portée par le composé peptidique,
- j représente 1 à 3.
Lorsque j représente 2 ou 3, le mélange de lipopeptides doit former une solution ou suspension homogène en milieu aqueux et présenter un caractère immunogène souhaité.
Dans un mode de réalisation préféré, l'utilisation d'au moins un mélange de lipopeptides selon la formule (I) est avantageusement tel que i est égal à 0, j est égal à 1 et en ce que le groupement L (dans la formule L-f-E-f définie en rapport avec R1 et R2) représente par exemple un stérol, un dérivé de stérol (tel qu'un dérivé du cholestérol) ou une chaîne carbonée saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, comprenant entre 4 et 30 atomes de carbone. Une telle chaîne carbonée constitue la partie lipophile d'un acide gras, tel que l'acide palmitique (lorsque L répond à la formule CH3- (CH2) ι4-) ou l'acide oléique (lorsque L répond à la formule CH3- (CH2) 7-CH=CH- (CH2) -) .
Dans un mode de réalisation très préféré selon l'invention, le dérivé de stérol est un dérivé du cholestérol et la chaîne carbonée répond à la formule CH3- (CH2) 14- . Par ailleurs, E représente avantageusement une chaîne carbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, comportant de 1 à 18 atomes de carbone et, éventuellement, 1 à 16 heteroatomes (par exemple de l'azote ou de l'oxygène) et/ou 1 à 7 groupements sélectionnés parmi les groupements carbonyles, les hétérocycles, les hétéroaryles, les carbocycles et les aryles. E peut éventuellement être substitué par 1 à 8 groupements hydroxyles ou amino et/ou 1 à 16 atomes d'halogène (tels que le chlore ou lé fluor) . De même, f représente avantageusement une liaison -CO-NH- ou -CO-O- et f représente une liaison - NH-CO- ou -0-CO-.
Au sens de la présente invention, on entend par : - « carbocycle » (aussi appelé
« cycloalkyle ») un cycle carboné mono- ou polycyclique, comprenant entre 3 et 8 atomes de carbone, tel que le cyclopentyle ou le cyclohexyle ;
- « aryle » un cycle carboné aromatique, mono- ou polycyclique, comprenant entre 5 et 14 atomes de carbone, tel que le phényle, le naphtyle ou le crésyle ;
- « hétérocycle » un carbocycle comprenant un ou plusieurs heteroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre, tel que la pipérazine ;
- « hétéroaryle » un aryle comprenant un ou plusieurs heteroatomes choisis parmi l'azote, l'oxygène et le soufre, tel que la pyridine, la pyrimidine ou la pyrazine. Des exemples de vecteurs lipophiles préférés conformes à l'invention répondent aux formules (II) et (III) ci-après
Figure imgf000009_0001
(II),
Figure imgf000009_0002
dans laquelle L est tel que défini précédemment et représente, par exemple une chaîne carbonée de formule CH3-(CH2)ι- (c'est-à-dire la partie lipophile de l'acide palmitique) .
Le composé peptidique P dans la formule (I) peut être sélectionné dans le groupe constitué par un ou plusieurs antigènes peptidiques et un ou plusieurs glycomimétiques dendrimériques de nature peptidique.
Au sens de la présente invention, on entend par « un ou plusieurs » antigènes peptidiques ou glycomimétiques dendrimériques, le fait que le composé peptidique P puisse être constitué d'un seul ou de plusieurs antigènes peptidiques ou glycomimétiques dendrimériques liés entre eux, sans que l'activité du mélange de lipopeptides n'en soit modifiée.
L' antigène peptidique est avantageusement choisi parmi le groupe constitué par les peptides et les dérivés de peptides comprenant les glycopeptides et les pseudopeptides . Au sens de la présente invention, on entend par « peptide » tout enchaînement de plusieurs acides aminés, quels que soient leur nature et leur nombre ; le terme « peptide » désigne donc aussi bien des oligopeptides (dipeptides ou tripeptides) que des polypeptides ou des protéines. On entend par « glycopeptides » des peptides associés, par liaison covalente, avec des glucides, qu'il s'agisse de monosaccharides (tels que des oses neutres) ou de polysaccharides. Par « pseudopeptides », on entend des peptides dont une ou plusieurs liaisons peptidiques (- CO-NH-) ont été remplacées par des liaisons non peptidiques (telles que les liaisons -CO-NH-NH-, -CH2- NH- ou -CO-NH-0-) .
Au sens de la présente invention, on entend par « glycomimétiques dendrimériques de nature peptidique », des glycomimétiques dont la structure est à base d' acides aminés ou de leurs dérivés et se présente sous une forme hautement ramifiée, de type arborescente. Le glycomimétique dendrimérique de nature peptidique répond à la formule générale (IV) ci-après : (B2M)m(XN)nA (IV) dans laquelle : B B22 rrééppoonndd àà une ou plusieurs formules générales (a) ou (b) ci-après :
Figure imgf000011_0001
(a) (b)
où Ri, R2, R3 et R4 représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur, et où W représente une liaison ou une chaîne carbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, comprenant de 1 à 18 atomes de carbone et éventuellement de 1 à 12 atomes choisis parmi l'oxygène, le soufre et l'azote, ladite chaîne carbonée étant éventuellement substituée par 1 à 16 atomes d'halogène,
- X représente le reste d'un oligopeptide X' comprenant de 1 à 6 acides aminés,
- A représente le reste d'un composé A' au moins trifonctionnel comprenant un enchaînement d' acides aminés, identiques ou différents, sélectionnés dans le groupe constitué par la lysine, l'hydroxylysine, la serine, la thréonine, la cystéine, l'ornithine, l'acide aspartique et l'acide glutamique - m est un nombre entier compris entre 1 et 32, - n est un nombre entier compris entre 0 et 32, et
- M et N représentent chacun un groupe de liaison, respectivement entre B2 et A quand n = 0 ou B2 et X quand n est différent de 0, et entre X et A quand n est différent de 0, et comprennent, indépendamment l'un de l'autre, une fonction choisie parmi les fonctions oxi e, hydrazone, amide, ester, thioester, hydrazide, hydroxamate, éther, thioéther, aminé, carbonate, carbamate, thiocarbonate, thiocarbamate, urée, thiourée et thiazolidine.
Le composé de formule (IV) est décrit dans la demande de brevet internationale PCT/FR00/02194.
Au sens de la présente invention, on entend par groupe « protecteur » un groupe protecteur d' une fonction hydroxyle ou d'un diol (auquel cas deux groupes choisis parmi Ri, R2, R3 et R4 peuvent être reliés de façon covalente l'un à l'autre pour former ensemble un cycle), tel que défini dans l'ouvrage Protective Groups in Organic Synthesis, T.W. GREENE et P. G. M. WUTS, Seconde Edition 1991, J. WILEY and Sons. A titre d'exemples et de façon non-limitative, on peut citer les groupes triméthylsilyle, triéthylsilyle, triisopropylsilyle, tertiobutyldiméthylsilyle,, tertiobutyldiphénylsilyle, triméthylsilyléthyléther, tert-butoxyméthyle, méthoxy-méthyle, benzyloxyméthyle,
2-méthoxyéthoxyméthyle, méthylthiométhyle, acétyle, ou
2' , 3' -diméthoxybutane-2 ' , 3' -diyle .
A titre d'exemples et de façon non- limitative, dans les formules générales (a) et (b) : - des atomes d'halogène convenables sont le brome, le chlore et le fluor ; et - des chaînes carbonées convenables sont des groupes alkyles (méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, tertiobutyle, pentyle, ... ) , . des groupes alkényles (vinyle, allyle, butényle, pentényle, ... ) , des groupes alkynyles (éthynyle, propynyle, butynyle, pentynyle, ... ) , des groupes cycloalkyles
(cyclopentyle, cyclohexyle, ...), des hétérocycles
(pipérazine, ... ) , des groupes aryles (phényle, crésyle, ... ) , des groupes hétéroaryles (pyridine, pyrimidine, pyrazine, •••), des groupes polyéthylèneglycols ou encore des polyamines .
Les formules (a) et (b) représentent les restes des acides quinique et shikimique et de certains de leurs dérivés, obtenus par protection ; des hydroxyles portés aux positions 1, 3, 4 et/ou 5 du cycle.
Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le composé de formule générale (IV) est tel que m est un nombre entier compris entre 4 et 16, n est un nombre entier compris entre 2 et 8, X représente le reste d'un oligopeptide comprenant de 2 à 4 résidus d'acides aminés, tandis que A représente le reste d'un enchaînement comprenant de 2 à 8 résidus de lysine et se présentant sous la forme d'un dendrimère, et B2 représente un reste d'un ou plusieurs composés choisis parmi l'acide (-) -shikimique et l'acide (-) -quinique .
Dans le mélange de lipopeptides selon la formule (I), la présence de composés peptidiques selon la formule (IV) permet de vectoriser sélectivement les lipopeptides vers les cellules possédant des récepteurs du mannose ou des récepteurs de la famille des C- lectines apparentés au récepteur du mannose. Ainsi, le mélange de lipopeptides comprenant des composés peptidiques P constitués par un antigène peptidique et un glycomimétique dendrimérique selon la formule (IV) permettent de cibler ledit mélange de lipopeptides vers les cellules exprimant les récepteurs de la famille des C-lectines apparentés au récepteur du mannose.
L'utilisation d'un mélange de lipopeptides selon la présente invention comprend avantageusement dé 1 à 20 lipopeptides différents, de préférence de 1 à 10 lipopeptides différents.
L'utilisation selon la présente invention de mélange de lipopeptides pour la fabrication de vaccins s'entend dans le sens de l'utilisation pour la fabrication de tous les types de vaccins, c'est à dire de manière classique les vaccins prophylactiques, mais également les « vaccins à usage thérapeutique ». Ces vaccins peuvent être dirigés contre les maladies infectieuses d'origine bactérienne, virale ou parasitaire ou contre différents types de cancers. L'utilisation selon l'invention permet aussi la fabrication de vaccins polyvalents comprenant le mélange d'antigènes peptidiques correspondant à différentes maladies infectieuses. Les vaccins selon la présente invention sont donc non seulement actifs dans une optique de vaccination préventive mais également dans une optique thérapeutique en particulier les vaccins lipopeptidiques selon la présente invention peuvent être utilisés pour créer une réponse contre de nouveaux épitopes ainsi que pour polariser ou renforcer la polarisation d'une réponse immunitaire établie. Les résultats observés indiquent en effet que des lipopeptides sont capables d' induire de nouvelles réponses immunitaires anti VIH, CD4, CD8 chez les patients infectés. Le composé peptidique est avantageusement constitué par des antigènes peptidiques dérivés d'un agent infectieux de type viral, tel que le VIH ou le VHC.
L'utilisation pour la fabrication d'un vaccin d'un mélange comprenant au moins des lipopeptides selon l'invention est formulée de manière préférentielle pour l'administration par voie transmucosale ou transcutanée, mais également parentérale (intramusculaire, sous-cutanée, intradermique, intra- veineuse) .
La plupart des vaccins actuellement disponibles sont administrés par voie parentérale, ce qui implique un personnel médical formé, des coûts élevés, peut provoquer des réactions au site d'injection, et dans certaines circonstances est à l'origine d'infections suite à l'utilisation de seringues contaminées (ex : transmission VIH, virus des hépatites). L'OMS a ainsi estimé que, dans les pays en voie de développement, 50% des injections effectuées dans une optique de vaccination ne sont pas sécurisées en raison d'une large réutilisation de seryngues non stériles (Jodar L. et al., Vaccine, 19 (2001), 1594- 1605 ; Kane A. et al., Bull WHO 11 (1999) 801-807). De plus, l'utilisation d'aiguilles est en général, pour les enfants, synonyme de souffrance. Il apparaît donc nécessaire de développer une nouvelle génération de vaccins, faciles à administrés, économiques, avec des protocoles d'immunisation aisés à mettre en œuvre.
Les vaccins ucosaux et transcutanés représentent une alternative attractive aux vaccins administrés par voie parentérale. L'administration mucosale, par exemple par la voie nasale, permet d' induire des réponses immunes au niveau de sites qui sont la porte d'entrée de nombreux pathogènes, et constitue une alternative efficace à l'administration par voie orale laquelle reste associée à un faible accès aux cellules présentatrices d'antigènes, la dégradation protéolytique siégeant au niveau du tractus intestinal et donc une réponse immunitaire de faible amplitude.
La peau, principale interface avec l'environnement externe, est aussi une barrière immunitaire contre l'entrée de nombreux pathogènes. Elle présente des cellules immunocompétentes spécifiques que sont les kératinocytes et surtout les cellules de Langerhans, est équipée de ganglions lymphoides, ainsi que de sous-classes de lymphocytes T, l'ensemble constituant « le tissue lymphoïde associé à la peau >
(Skin-associated lymphoid tissue, SALT) (Bos J.D., et al., Immunol . Today, 14, (1993), 75-78).
Leur capacité à franchir les membranes cellulaires permet aux lipopeptides de véhiculer des épitopes à travers les surfaces muqueuses, permettant ainsi leur délivrance non seulement au niveau du système immunitaire local, mais également au niveau systémique (Demande Internationale N°WO 0141797) . L'utilisation pour la fabrication d'un vaccin d'un mélange comprenant • au moins des lipopeptides, selon la présente invention, comprend en outre des constituants à caractère amphiphile ou excipients capables d'assurer une bonne solvatation dans l'eau par une partie polaire et une interaction de type Van der Waals avec les lipopeptides à caractère hydrophobe .
Ces excipients ou constituants amphiphiles peuvent être constitués, pour une majeure partie, d'acides aminés polaires ou chargés. Dans un mode de réalisation préféré selon l'invention, le mélange de lipopeptides comprend en outre un ou plusieurs excipients cliniquement acceptables.
D'une manière particulièrement avantageuse, l'excipient cliniquement acceptable est le mannitol ou le Polysorbate 80, ou un mélange des deux.
La présente invention concerne notamment les vaccins, comportant en tant qu'antigènes peptidiques, au moins deux séquences provenant des protéines Gag, Pol et Nef du virus HIV, notamment un mélange des séquences Gag 17-35, Gag 253-284, Pol 325-355, Nef 66-97, Nef 116-147 et plus particulièrement les lipopeptides tels que décrits dans l'exemple 1.
Dans les lipopeptides utilisés, on introduit de préférence une lysine supplémentaire à l'extrémité C- terminale de chaque peptide, et l'acide carboxylique en C-terminale est amidé. La fonction aminé (e-NH2) de la chaîne latérale de cette lysine est modifiée par une moitié palmitoyl attachée via un espaceur contenant une liaison hydrazone. Dans encore un autre mode de réalisation préféré, l'utilisation selon l'invention comprend en tant qu'antigènes peptidiques, les séquences peptidiques suivantes :
- VHC 1 HzAc : H-K(COCH2NHNH2)GREILLGPADG VSKG RLLAPITAYAQQTR-NH2
- VHC 2 HzAc : H-K(COCH2NHNH2) GHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2
- VHC 3 HzAc : H-K(COCH2NHNH2) GAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2.
L' invention concerne également les séquences natives :
NS3 1007-1037 : H-KGREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2 NS3 1174-1195 : H-KGHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2 NS3 1524-1553 : H-KGAA YELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2 , lesquelles présentent donc un caractère immunogène .
Outre les dispositions qui précèdent , l' invention comprend encore d' autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre de l' utilisation pour la fabrication d' un vaccin d' un mélange comprenant au moins des lipopeptides selon l' invention, ainsi qu' à la figure 1 qui illustre les résultats d' analyse de 1' immunogénicité chez le macaque après l' inj ection de doses de vaccin (VIS ) selon l' exemple 5 . Dans les exemples qui suivent , les abréviations suivantes sont utilisées : eq . : équivalents ; Boc : tert-butyloxycarbonyle ; Fmoc : 9-fluorènyl-méthoxycarbonyle ; Mtt : 4-méthyl-trityle ; DMF : diméthylformamide ; TFA : acide trifluoroacétique ; CH2C12 : dichlorométhane ; MeOH : méthanol ; EtOH : éthanol ; THF : tétrahydrofurane ; AcOH : acide acétique ; AcOEt : acétate d' éthyle ; H20 :; eau ; AcO~NH4 + : acétate d' ammonium ; CDC13 : chloroforme deutéré ; EDT : éthanedithiol ; TIS : triisopropylsilane ; DMSO- 6 : diméthylsulfoxyde- d6 (entièrement deutéré) ; NaI04 : periodate de sodium ; NaCl : chlorure de sodium ; Na2S0 : sulfate de sodium ; MgS04 : sulfate de magnésium ; KH2P04 : dihydrogénophosphate de potassium ; PAL : « peptide- amide linker » ; BOP : benzotriazole-1-yl-oxy- tris (diméthylamino) phosphoniumhexafluorophosphate ; HOBt : N-hydroxybenzotriazole ; HBTU : N-oxyde d'hexafluorophosphate dé
N-[ (lH-benzotriazol-1-yl) (diméthylamino) méthylène]-N~ méthylméthanaminium ; DIEA : diisopropyléthylamine ; TEAP : phosphate de triéthylamine ; HPLC : chromatographie liquide haute performance ; RP-HPLC : chromatographie liquide haute performance en phase inverse ; ES-MS : spectrométrie de masse par électronébulisation ; TOF-PDMS : spectrométrie de masse à désorption par plasma ; LC-MS : spectrométrie de masse couplée à une analyse par chromatographie liquide ; RMN 1H : résonance magnétique nucléaire du proton ; RMN 13C : résonance magnétique nucléaire du carbone.
Exemple 1 : Préparation de doses de vaccin (lipopeptides HIV-HzPAM) utilisables chez l'Homme, Modèle du Virus de 1' Immunodéficience Humaine (VIH-1)
1) Synthèse des hydrazinopeptides
Synthèse peptidique : Cinq peptides, dérivés des protéines Gag, Pol et Nef du virus HIV-1, fonctionnalisés par des groupes α-hydrazinoacétiques au niveau de la chaîne latérale d'une lysine introduite en C-terminal, ont été préparés. Ces hydrazinopeptides ont été synthétisés en phase solide sous forme de sels de trifluoroacétate. Les stratégies Fmoc/tert-Butyl (conventionnelle) , ainsi que le procédé qui a été récemment décrit (N,N' ,N' -tri (tert- butyloxycarbonyl) -hydrazinoacetic acid) ont été employés pour introduire de manière ciblée un groupement hydrazinoacétyl sur un groupement ε-amino déprotégé d'un résidu lysylamide en position C-terminale (BONNET D. et coll., J. Org. Chem, 2001 et demande de brevet PCT/FR00/02336) . Selon les séquences, les rendements de synthèse sont compris entre 10 et 50 %. L'identité des peptides a été vérifiée, après clivage et déprotection par ES.MS. Les hydrazinopeptides sont soumis à une analyse de la composition en acides aminés après hydrolyse acide totale avec de l'acide chlorhydrique 6N HC1: phénol, 10:1 à 110°C pendant 24h.
Chroma tographi e
Les hydrazinopeptides sont purifiés par RP- HPLC sur une colonne préparâtive C3 (colonne Zorbax : 300 A, 5 μM, diamètre de 12,5 mm et longueur de 250 mm avec précolonne) sur une chaîne HPLC Shimatzu 6A. Les analyses par RP-HPLC sont réalisées sur une colonne préparative C3 (colonne Zorbax : 300 A, 5 μM, diamètre de 4.6 et longueur de 250 mm) sur une chaîne HPLC Shimatzu 10A. Les solvants d' élution (solvants A et B) sont les suivants : solvant A : eau désionisée comprenant 0,05% de TFA, solvant B (purification) : 0,05% de TFA dans un mélange propan-2-ol / H20 (40:60). solvant B (suivi de réaction, Analyses) : 0,05% de TFA dans un mélange acétonitrile / H20 (80:20).
Le débit d' élution est de lml /min en utilisant un gradient linéaire de 10 à 100 % de tampon' B en 30 minutes, 100 % de tampon B pendant 10 minutes, 10 % de tampon B pendant 10 minutes (détection à 215 nm, température : 50 °C) .
Les peptides obtenus, sous forme de sels de trifluoroacetate, sont représentés dans le Tableau I ci- après .
Tableau I : Hydrazinopeptides dérivés de protéines du virus VIH-1
Peptides Hydrazinopeptides natifs
Gag 17 - VIH 1 HzAc : EKIRLRPGGKKKYKLKHIV K (COCH2NHNH2) -NH2 35
Gag 253 VIH 2 HzAc NPPIPVGEIYKR IILGLNKIVRMYSPTSILD - 284 K(COCH2NHNH2)-NH2
Pol 325 VIH 3 HzAc AIFQSSMT ILEPFRKQNPDIVIYQYMDDLY - 355 K(COCH2NHNH2)-NH2
Nef 66 VIH 4 HzAc VGFPVTPQVPLRPMTYKAAVDLSHFLKEKGGL 97 K(COCH2NHNH2)-NH2
Nef 116 VIH 5 HzAc HTQGYFPD QNYTPGPGVRYPLTFG LYKLVP - 147 K(COCH2NHNH2)-NH2 Les temps d' élution des hydrazinopeptides obtenus sont représentés dans le Tableau II suivant.
Tableau II
Figure imgf000022_0001
2) Synthèse du vecteur lipophile Pam (acide [3-(2-oxo- acetylamino) -propyl] -amide Hexadecanoique, présent également sous forme "Vecteur Pam hydraté" : acide [3- (2, 2-dihydroxy-acetylamino) -propyl] -amide Hexadecanoiue :
La synthèse de ce vecteur, composé d'un groupement palmitoyl et d'un groupement glyoxylyl, a été décrite par MELNYK et collaborateurs dans la demande de brevet N° PCT/FR01/02787 (exemple 4 : synthèse du vecteur lipophile « Illa ») et par Bonnet et collaborateurs (BONNET D et coll., Tetrahedron Letters, 2000) .
Dans un ballon de 500 ml, 10 g (66,6 mmoles) d'acide tartrique 1 sont dissous dans 200 ml d' éthanol absolu, en présence de 1% en masse de résine Amberlyst 15. Le ballon est muni d'un montage soxhlet contenant du tamis moléculaire activé 4 A. L' éthanol est porté à reflux durant 48h. Le milieu réactionnel est ensuite filtré sur verre fritte n°4 pour éliminer la résine. Le filtrat est concentré sous pression réduite et conduit à une huile jaune-clair. Le résidu 2 est séché une nuit sur P205 et utilisé sans autre forme de purification (m = 13,46 g, rendement = 98,0 %). L'analyse du composé 2_, représenté ci- dessous, par chromatographie sur couche mince donne un indice de migration Rf = 0,76 dans l'éluant CH2Cl2/MeOH/H20/AcOH (90/10/0,1/0,05) .
RMN XH (CDC13) : 1,33 (t, 6H, H5,5-, J5-4=7,2 Hz), 3,28 (s, 2H, Hι,ι , 4,33 (q, 4H, H4,4-, J4_5=7,l Hz), 4,54 (s, 2H, H2,2') . RMN 13C : 14,14 (C5,5 , 62,48 (C4/4 , 72,08 (C2,2'), 171,62 (C3,3') .
Figure imgf000023_0001
5 4 4 5' 13,46 mg (65,26 mmoles) du composé 2 sont dissous dans 155 ml d' éthanol absolu et ajoutés goutte à goutte à 56 ml (665,26 mmoles) de 1, 3-diamino-propane . Le milieu réactionnel est ensuite agité 3h à température ambiante. L'excès de 1, 3-diaminopropane est alors éliminé par évaporation sous pression réduite et entraînement azéotropique en présence d' éthanol (3 x 200 ml). L'huile jaune obtenue est séchée sur P205 pendant une nuit, puis reprise dans un mélange éthanol/toluène (1/1) et concentrée sous pression réduite (3 x 200 ml) . Un composé jaune, sous une forme pâteuse, est ainsi obtenu. Ce composé est précipité dans 50 ml d'un mélange éther éthylique/éthanol (5/1) , puis filtré, et le précipité blanchâtre est agité pendant lh.30 à 0°C en présence d' éther éthylique. Il est alors filtré sur fritte et lavé 2 fois avec le minimum d' éther éthylique à froid. Le solide résiduel 3^ est séché pendant une nuit sur P205 (m = 13,92 g, rendement = 81,3%) .
L'analyse du composé _3_, représenté ci- dessous, est la suivante : Rf = 0,34 dans THF/AcOH/H20/AcO"NH4 + (35/20/10/1% massique) . RMN 1H (DMSO-d6) : 1,48 (q, 4H, H6 et 6', Je-5,6,7 et 6'-5',6',7'=6, 65 Hz), 2,51 (m, 4H, H7-7' ) , 3,14 et 3,16 (t, 4H, H5 et5-, Js- 6 et 5'-6'=6,3 Hz), 4,19 (s, 2H, H2,2'), 7,75 (t, 2H, H4, ', J4,4'= 5,97 Hz). RMN 13C : 33,51 (C6f6')# 36,98 (C7f7') , 40,06 (C5,5'), 73,43 (C2,2 , 172,87 (C5,5<).
Figure imgf000024_0001
996,9 mg (3,8 mmoles) du composé _3 sont dissous dans 15 ml d'eau. Le pH de la solution, égal à 8,5, est ramené à 3,25 à l'aide de 1,46 g d'acide citrique. 1,06 g (4,9 mmoles) de NaI04 solide sont alors ajoutés en quatre fois, pendant 5 minutes, au milieu réactionnel maintenu à température ambiante à l'aide d'un bain d'eau. Après 10 minutes d'agitation, 570 mg d'acide tartrique (3,8 mmoles) sont ajoutés pour neutraliser l'excès de NaI04 n'ayant pas réagi. Après 10 minutes d'agitation à température ambiante, le pH est ajusté à 8,6 avec 24 ml de N-méthyl-morpholine . Le milieu réactionnel est dilué avec 70 ml de 2-méthyl- propan-2-ol et 20 ml d'eau. 2,16 g (1,6 eq.) de palmitoate de succinimidyle sont alors ajoutés à la solution qui est agitée une nuit à température ambiante. Le pH est ensuite ajusté à 3,5 avec 7,11 g d'acide citrique. Le milieu est dilué avec 40 ml d'une solution saturée en NaCl et extrait avec 140 ml de dichlorométhane, puis 100 ml de chloroforme. La phase organique est lavée avec deux fois 100 ml d'une solution saturée en KH2P04, deux fois 100 ml d'une solution saturée en NaCl, puis séchée sur Na2S0 , filtrée et concentrée sous pression réduite. Le composé solide résiduel est purifié sur silice en utilisant comme éluant un mélange CH2Cl2/AcOEt/EtOH (70/22/5). 951,4 mg du vecteur lipophile (Illa) , soit un rendement de 42,3%, sont ainsi obtenus.
L'analyse du composé (Illa), représenté ci- dessous sous sa forme d'hydrate, est la suivante : RMN XH (DMSO- 6) : 0,87 (t, 3H, Hi, J!,2=5,31 Hz), 1,25 (m, 24H, H2) , 1,83 (m, 4H, H3, H8) , 2,39 (m, 2H, H4) , 3,57 (m, 4H, H7, H9) , 4,41 (s, 2H, Hι4,ιs) , 5,50 (m, 1H, H12j -: RMN 13C : 14,31 (Ci), 22,96 (C2) , 26,35 (C8) , 29,99 (C3) , 36,79 (C4), 37,14 (C7) , 92,18 (Cι2) , 173,42 (C5) , 175,22 (On). ES-MS : [M+H]+ calculé 387,5 ; trouvé 387,2.
Figure imgf000026_0001
3) Synthèse des lipopeptides
Un mélange homogène d' hydrazinopeptides est obtenu par dilution individuelle de chaque ingrédient dans l'eau ou l'acide acétique dilué, mélange des solutions puis lyophilisation. Une première synthèse a été réalisée en utilisant 9,6 mg d'un mélange équimassique de chacun des 5 peptides VIH (VIH 1 HzAc; VIH 2 HzAc; VIH 3 HzAc; VIH 4 HzAc et VIH 5 HzAc) , correspondant à une valeur de 2,22 micromoles de peptides (en tenant compte des contre-ions et de la teneur en peptides des lyophilisats) . Ce mélange est imprégné de 85 μl d'eau, ce qui conduit à la formation d'un gel. Le vecteur lipophile Illa est alors ajouté (977 μg, 2,52 μmoles) sous agitation magnétique avec des billes de verre de 5 mm de diamètre, soit 1,14 équivalent par rapport aux peptides, en solution dans 714 ml de 2-méthyl-propan-2-ol. Le volume total de milieu réactionnel (1,7 ml) est atteint par addition de 2-méthyl-propan-2-ol .
La disparition des hydrazinopeptides au cours du temps est suivie parallèlement à l'apparition des lipopeptides correspondants.
Une expérience micropréparative est réalisée afin de permettre l'identification des produits : un échantillon est prélevé pour réaliser une séparation des constituants par RP-HPLC sur une colonne C3 (Zorbax, 4,6 mm x 250 mm) , avec collecte des pics principaux afin de les identifier par spectrométrie de masse par MALDI-TOF (MALDI-TOF Voyager ABI 4192, mode positif, réflecteur 25 kV, délai d'extraction 300 ms, matrice acide α-cyano cinnmique)
Après 4 heures la réaction est complète et le mélange est alors dilué dans l'eau, congelé et lyophilisé. Les lipopeptides obtenus se présentent sous forme de poudre blanche.
Les temps de rétention (rét.) des lipopeptides obtenus sont donnés dans le Tableau III suivant .
TABLEAU III
Figure imgf000027_0001
4°) Préparation des mélanges de lipopeptides Echange d' ions :
Les lipopeptides sous forme de sels de TFA sont dissous dans une solution d' acide acétique aqueux à pH3, chargés sur colonne de RP-HPLC (colonne Nucleoprep C4, 25 mm x 100 mm) puis lavés par le même solvant (lavages effectués avec un volume équivalent à celui de 5 colonnes) avant d'être élues par un passage sans transition vers un solvant acide acétique à pH3 dans l'eau / propan-2-ol (60:40). Préparation finale:
Le mélange de lipopeptides lyophilisés est dissous dans une solution d'acide acétique à 10 % avant d' être soumis à une filtration stérilisante sur membrane 0,22 micron (SLGV, Millipore) .
5) Préparation des doses de vaccin:
Après l'introduction d'excipients cliniquement acceptables (mannitol / lipopeptides 10/1
( / ) . et Polysorbate 80 / lipopeptides 2/7 ( / ) ) la solution est diluée dans l'eau et aliquotée dans des ampoules de verre stériles avant lyophilisation finale.
Les doses unitaires de vaccin préconisées pour un essai clinique de phase I chez l'homme sont de 2,5 mg de coktail lipopeptidique.
Exemple 2 : Préparation de doses de vaccin (lipopeptides VHC HzPam) utilisables chez l'homme, Modèle du Virus de l'Hépatite C (VHC)
1) Synthèse des hydrazinopeptides
Synthèse peptidique :
Trois peptides, dérivés de la protéine NS3 du virus VHC-1, fonctionnalisés par des groupes α- hydrazinoacétiques au niveau de leur extrémité N- terminale ont été préparés. Ces hydrazinopeptides ont été synthétisés en phase solide sous forme de sels de trifluoroacetate. Les stratégies Fmoc/tert-Butyl (conventionnelle) , ainsi que le procédé récemment décrit
(N,N' ,N' -tri (tert-butyloxycarbonyl) -hydrazinoacetic acid) ont été employés pour introduire de manière ciblée un groupement hydrazinoacétyl sur un groupement ε-amino déprotégé d'un résidu lysylamide en position N-terminale comme dans l'exemple 1. Selon les séquences, les rendements de synthèse sont compris entre 10 et 50 %.
L'identité des peptides a été vérifiée par ES.MS. Les hydrazinopeptides sont soumis à une analyse de la composition en acides, aminés après hydrolyse acide totale avec de l'acide chlorhydrique 6N HCl :phénol, 10:1 à 110°C pendant 24h.
Chromato graph i e Les hydrazinopeptides sont purifiés par RP-
HPLC sur une colonne préparative C3 (colonne Zorbax : 300 A, 5 μM, diamètre de 12,5 mm et longueur de 250 mm avec précolonne) sur une chaîne HPLC Shimatzu 6A. Les analyses par RP-HPLC sont réalisées sur une colonne préparative C3 (colonne Zorbax : 300 Â, 5 μM, diamètre de 4.6 et longueur de 250 mm) sur une chaîne HPLC Shimatzu 10A.
Les solvants d' élution (solvants A et B) sont les suivants : - solvant A : eau désionisée comprenant 0,05% de TFA, solvant B (purification) : 0,05% de TFA dans un mélange propan-2-ol / H20 (40:60). solvant B (suivi de réaction) : 0,05% de TFA dans un mélange N propanol / H20 (40:60) . Le débit d' élution est de lml/min èri utilisant un gradient linéaire de 0 à 100 % de tampon B en 30 minutes, 100 % de tampon B pendant 5 minutes, 0 % de tampon B pendant 10 minutes (détection à 215 nm, température : 50 °C) .
Les hydrazinopeptides obtenus sont représentés dans le tableau IV ci-après.
TABLEAU IV : Hydrazinopeptides dérivés de la protéine NS3 du virus VHC-1
Figure imgf000030_0001
Les temps de rétention des hydrazinopeptides sont indiqués dans le Tableau V ci-après. Tableau V
Figure imgf000031_0001
2) Synthèse du vecteur Pam :
La synthèse de ce vecteur Illa, composé d'un groupement palmitoyl et d'un groupement glyoxylyl, est décrite dans l'exemple 1.
3) Synthèse des lipopeptides Un mélange homogène d' hydrazinopeptides est obtenu par dilution individuelle de chaque ingrédient dans l'eau ou l'acide acétique dilué, mélange des solutions puis lyophilisation. Une première synthèse a été réalisée en utilisant 41,8 mg d'un mélange équimassique de chacun des 3 hydrazinopeptides, correspondant à une valeur de 10,77 micromoles d' hydrazinopeptides (en tenant compte des contre-ions et de la teneur en peptides des lyophilisats) . Ce mélange est imprégné de 415 μl d'eau, ce qui conduit à la formation d'un gel. Le vecteur lipophile Illa est alors ajouté (4757 μg, 12,28 μmoles, représentant 1,14 équivalent par rapport aux peptides) sous agitation magnétique avec quelques billes de verre de 5 mm de diamètre, solubilisé dans 950 μl de 2-méthyl-propan-2- ol. Le volume total de milieu réactionnel (8.290 ml) est atteint par addition de 2-méthyl-propan-2-ol.
La disparition des hydrazinopeptides au cours du temps est suivie parallèlement à l'apparition des lipopeptides correspondants.
Une expérience micropréparative est réalisée afin de permettre l'identification des produits : un échantillon est prélevé pour réaliser une séparation des constituants par RP-HPLC sur une colonne C3 (Zorbax, 4,6 mm x 250 mm) , avec collecte des pics principaux afin de les identifier par spectrométrie de masse par MALDI-TOF
(MALDI-TOF Voyager ABI 4192, mode positif, réflecteur/
25 kV, délai d'extraction 300 ms, matrice acide a-cyano cinnamique)
Après 4 heures la réaction est complète et le mélange est alors dilué dans l'eau, congelé et lyophilisé. Les lipopeptides obtenus se présentent sous forme de poudre blanche. Les lipopeptides obtenus ont un temps de rétention présentés dans le Tableau VI ci-après.
TABLEAU VI
Figure imgf000032_0001
Figure imgf000033_0001
3' ) Synthèse des lipopeptides avec un glycomimétique branché : '
Cette synthèse est réalisée à partir du mélange des hydrazinopeptides VHC obtenus précédemment avec un glycomimétique branché à quatre valences (arbre tetraquinoylé) réalisé à partir d'un arbre de lysine synthétisé en stratégie Fmoc/tert Butyl sur lequel a été introduit un groupement hydrazinoacetyl sur le groupement ε-amino déprotégé du résidu lysylamide C- terminale, selon la formule (IV) de l'invention.
La synthèse de ce glycomimétique, appelé [ (Qui) 4AKHdz) ] , est décrite dans l'exemple 2 de la demande de brevet N° PCT/FR01/02787) . Un mélange homogène d' hydrazinopeptides est obtenu par dilution individuelle de chaque ingrédient dans l'eau ou l'acide acétique dilué, mélange des solutions puis lyophilisation. 8,9 mg d'un mélange équimassique de chacun des 3 hydrazinopeptides, correspondant à 2,14 micromoles d' hydrazinopeptides sont ajoutés à 2,3 mg (soit 1.6 μmoles) du glycomimétique hydrazine. Au gel formé après humidification par 140 μl d'eau est ajouté le vecteur lipophile Illa (1640 microgrammes, soit 1,14 équivalent peptide) mis en solution dans le 2-méthyl-propan-2-ol (410 μl) , sous agitation magnétique avec quelques billes de verre de 5 mm de diamètre, le volume final est de 2,7 ml.
La disparition des hydrazinopeptides au cours du temps est suivie parallèlement à l' apparition des lipopeptides correspondants. Après 3 heures, le mélange est dilué dans l'eau, congelé et lyophilisé. Les lipopeptides obtenus se présentent sous forme de poudre blanche.
4) et 4') Préparation des mélanges de lipopeptides
Après échange d' ions comme décrit dans l'exemple 1, les mélanges de lipopeptides lyophilisés obtenus en 3) et 3' ) sont dissous dans une solution d'acide acétique à 10 % avant d'être soumis à une filtration stérilisante sur membrane 0,22 micron (SLGV, Millipore) .
5) et 5' ) Préparation des doses de vaccin
5) Formula tion mannitol - Tween : [3 lipopeptides, vecteur Pam]
Après l'introduction d'excipients cliniquement acceptables (mannitol / lipopeptides 10/1 (w/w) et Polysorbate 80 / lipopeptides 2/7 (w/w) ) la solution est diluée dans l'eau et aliquotée dans des ampoules de verre stériles avant lyophilisation finale.
5 ') Formulation mannitol - glycomimétique lipide : [3 lipopeptides + glycomimétique, vecteur Pam]
Le mélange lyophilisé de lipopeptides et glycomimétique lipide [ (Qui) 4AKHdz) ] est dissous dans une solution d'acide acétique à 10 % avant d'être soumis à une filtration stérilisante sur membrane 0,22 micron (SLGV, Millipore). Après l'introduction d'excipients cliniquement acceptables (mannitol / lipopeptides 10/1 (w/w)), la solution est diluée dans l'eau dans un flacon stérile avant lyophilisation finale. Les doses unitaires de vaccin préconisées pour un essai clinique de phase I chez l'homme sont de 2,5 mg de cocktail lipopeptidique.
Exemple 3 : Préparation de doses de vaccin (lipopeptides VHC HzCChol) utilisables chez l'homme, Modèle du Virus de l'Hépatite C (VHC)
1) Synthèse des hydrazinopeptides
Synthèse peptidique
La synthèse est la même que celle de l'exemple 2. Chromatographie
Les hydrazinopeptides sont purifiés par RP- HPLC sur une colonne préparative C3 (colonne Zorbax : 300 Â, 5 μM, diamètre 12,5 mm et longueur de 250 mm avec précolonne) sur une chaîne HPLC Shimatzu 6A. Les analyses par RP-HPLC sont réalisées sur une colonne préparative C3 (colonne Zorbax : 300 Â, 5 μM, diamètre de 4.6 et longueur de 250 mm) sur une chaîne HPLC Shimatzu 10A. Les solvants d' élution (solvants A et B) sont les suivants : - solvant A : eau désionisée comprenant 0,05% de TFA, solvant B : 0,05% de TFA dans un mélange propan-2- ol / H20 (40:60) .
Le débit d' élution est de lml/min en utilisant un gradient linéaire de 0 à 100 % de tampon B en 30 minutes, 100 % de tampon B pendant 5 minutes, 0 % de tampon B pendant 10 minutes (détection à 215 nm, température : 50 °C) .
2) Synthèse du vecteur CChol (acide [3- (2, 2-Dihydroxy- acetylamino) -propyl] -carbamique 17- (1, 5-dimethyl-hexyl) -
10,13-dimethyl-2,3,4,7, 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17- tetradecahydro-lH-cyclopenta [a]phenanthren-3-yl ester, également sous forme "Vecteur Cchol hydraté" acide [3- (2-0xo-acetylamino) -propyl] -carbamique 17- (1, 5-dimethyl- hexyl) -10, 13-dimethyl-2, 3, 4, 7, 8,
9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17-tetradecahydro-lH- cyclopenta [a] phenan- thren-3-yl ester)
La synthèse de ce vecteur a été décrite par MELNYK et collaborateurs dans la demande de brevet N° PCT/FR01/02787, exemple 4 : synthèse du vecteur lipophile « IIIc », correspondant dans la présente invention à la formule (II) .
3) Synthèse des lipopeptides Un mélange homogène d' hydrazinopeptides est obtenu par dilution individuelle de chaque ingrédient dans l'eau ou l'acide acétique dilué, mélange des solutions puis lyophilisation. Une première synthèse a été réalisée en utilisant 12,2 mg d'un mélange équimassique de chacun des 3 peptides VHC (VHC 1 HzAc ; VHC 2 HzAc et VHC 3 HzAc ), correspondant à 2,96 micromoles de peptides (en tenant compte des contre-ions et de la teneur en peptides des lyophilisats) . Ce' mélange est imprégné de 115 μl d'eau, ce qui conduit à la formation d'un gel. Le vecteur lipophile II est alors ajouté (1926 μg, 3.374 μmoles, représentant 1,14 équivalent par rapport aux peptides) sous agitation magnétique avec quelques billes de verre de 5 mm de diamètre, solubilisé dans 292 μl de 2-méthyl-propan-2- ol. Le volume total de milieu réactionnel (2.3 ml) est atteint par addition de 2-méthyl-propan-2-ol .
La disparition des hydrazinopeptides au cours du temps est suivie parallèlement à l'apparition des lipopeptides correspondants.
Une expérience micropréparative est réalisée afin de permettre l'identification des produits : un échantillon est prélevé pour réaliser une séparation des constituants par RP-HPLC sur une colonne C3 (Zorbax, 4,6 mm x 250 mm) , avec collecte des pics principaux afin de les identifier par spectrométrie de masse par MALDI-TOF (MALDI-TOF Voyager ABI 4192, mode positif, réflecteur, 25 kV, délai d'extraction 300 ms, matrice acide a-cyano cinnamique)
Après 4 heures la réaction est complète et le mélange est alors dilué dans l'eau, congelé et lyophilisé. Les lipopeptides obtenus se présentent sous forme de poudre blanche .
Le temps de rétention des lipopeptides obtenus sont représentés dans le Tableau VII ci-après.
TABLEAU VII
Figure imgf000038_0001
3' ) Synthèse des lipopeptides CChol avec un glycomimétique branché :
Un mélange homogène d' hydrazinopeptides est obtenu par dilution individuelle de chaque ingrédient dans l'eau ou l'acide acétique dilué, mélange des solutions puis lyophilisation. Cette synthèse est réalisée à partir du mélange des hydrazinopeptides avec le glycomimétique branché à quatre valences [ (Qui) AKHdz) ] . 12 mg d'un mélange équimassique de chacun des 3 hydrazinopeptides (vus en 3)), correspondant à 2,9 micromoles d' hydrazinopeptides sont ajoutés à 3,3 mg (soit 2,2 μmoles) du glycomimétique hydrazine. Au gel formé après humidification par 200 μL d'eau est ajouté le vecteur lipophile (II) (3360 microgrammes, soit 1,14 équivalent peptide) mis en solution dans le 2-méthyl-propan-2-ol (510 μl) , sous agitation magnétique avec quelques billes de verre de 5 mm de diamètre. Le volume réactionnel final est de 3.8 ml .
La disparition des hydrazinopeptides au cours du temps est suivie parallèlement à l'apparition des lipopeptides correspondants.
Après 4 heures, le mélange est dilué dans l'eau, congelé et lyophilisé. Les lipopeptides obtenus se présentent sous forme de poudre blanche.
Pour les lipopeptides CChol (avec ou sans glycomimétique) selon 3) et 3'), une étape supplémentaire de purification est nécessaire afin d'éliminer une quantité non négligeable de précurseurs hydrazine n'ayant pas réagis. Cette purification du milieu réactionnel est réalisée par RP-HPLC sur un système Shimadzu 6A, avec une colonne C4 Deltapak WATERS 15μM 300 Â, 8 mm de diamètre et longueur 100 mm.
Les solvants d' élution (solvants A et B) sont le? suivants : solvant A : eau désionisée comprenant 0,05% de TFA, solvant B (purification) : 0,05% de TFA dans un mélange propan-2-ol / H20 (40:60).
Le débit d' élution est de 2ml/min en utilisant un gradient linéaire de 0 à 80 % de tampon B en 12 minutes, puis 100 % de tampon B. La fraction de lipopeptide éluée est congelée et lyophilisée.
4) et 4') Préparation des mélanges de lipopeptides Après échange d' ions comme décrit dans l'exemple 1, les mélanges de lipopeptides lyophilisés obtenus en 3) et 3' ) sont dissous dans une solution d'acide acétique à 10 % avant d'être soumis à une filtration stérilisante sur membrane 0,22 micron (SLGV, Millipore) .
5) et 5' ) Préparation des doses de vaccin
5) Formula tion mannitol - Tween : [3 lipopeptides, vecteur CChol] Après l'introduction d'excipients cliniquement acceptables (mannitol / lipopeptides 10/1 (w/w) et Polysorbate 80 / lipopeptides 2/7 (w/w) ) la solution de lipopetides est diluée dans l'eau dans un flacon stérile avant lyophilisation finale.
5 ') Formulation mannitol - glycomimétique lipide : [3 lipopeptides + glycomimétique, vecteur CChol]
Après l'introduction d'excipients cliniquement acceptables (mannitol / lipopeptides 10/1 (w/w) ) la solution de lipopeptides et glycomimétique lipide est diluée dans l'eau dans un flacon stérile avant lyophilisation finale.
Les doses unitaires de vaccin préconisées pour un essai clinique de phase I chez l'homme sont de 2,5 mg de cocktail lipopeptidique.
Exemple 4 : Evaluation chez la souris de la capacité des lipopeptides à potentialité vaccinale à induire une réponse immunitaire contre le virus de l'Hépatite C (VHC) (essais pré-cliniques) A/ Réponse lympho-proliférative spécifique
Trois peptides, dérivés de la protéine NS3 du virus VHC-1, fonctionnalisés par des groupes α- hydrazinoacétiques au niveau de leur extrémité N- terminale (voir exemple 2) ou de leur extrémité C- terminale (voir protocole de synthèse dans l'exemple 1), ont été lipides par le vecteur Pam.
L' immunogénicité de ces lipopeptides a été analysée sur des souris syngéniques Balb/c et C57bl/6 après injection sous-cutanée des 3 lipopeptides N- terminal ou C-terminal vecteur Pam (1,2 mg du mélange par souris, équivalent à 100 μg de lipopeptides) , soit 3 peptides natifs (100 μg par souris) + montanide ISA 720, soit 3 peptides natifs seuls (100 μg par souris) . La mesure de la lymphoprolifération est effectuée après la mise en culture des cellules de rate murine, comme indiqué ci-dessous :
Les rates sont récupérées et incubées à 4°C en milieu RPMI 1640 (GIBCO BRL) . Les cellules sont ensuite écrasées sur membrane de nylon. Les cellules sont centrifugées à 1500 t/min durant 10 min à 4°C. La lyse des hématies est effectuée en présence de tampon de lyse durant 10 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite centrifugées et reprises en milieu HL-1 (Biowhittaker) contenant 4% de sérum de souris autologues. Les cellules sont ensuite réparties en plaques de cultures 96 puits en polystyrène fond U (Costar) à raison de 100 μl par puits. Les peptides synthétiques natifs (Néosystem) sont dilués en milieu HL-1 (Biowhittaker) ensuite ajoutés à raison de 100 μl par puits pour une concentration finale de 25 μg/ml. Les plaques de culture sont incubées 72 heures à 37 °C en atmosphère humide et 5% de C02. La méthyl-thymidine tritiee (Amersham) est diluée en milieu HL-1 (Amersham) et est ensuite ajoutée dans chaque puits à raison de 1 μCurie dans 25 μl . Après 16 heures d'incubation, les cellules sont collectées sur filtre en fibre de verre (Wallac) avec le système TOMTEC. L'incorporation de thymidine tritiee est ensuite mesurée à l'aide d'un compteur béta (Wallac 140 microbeta) . ,
Les résultats de cette analyse sont exprimés dans le Tableau VIII ci-après.
Tableau Villa et VlIIb : Mesure de lymphoprolifération (exprimé en index de stimulation)
Tableau Villa : Lipopeptide N terminal
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000043_0001
Tableau VlIIb : Lipopeptide C-terminal
Figure imgf000043_0002
Les résultats de ces analyses indiquent que les deux types de constructions (position N-terminale et position C-terminale) injectées par voie sous-cutanée à des souris syngéniques Balb/c et C57bl/6 sont capables d' induire une réponse lympho-proliférative spécifique des séquences peptidiques du VHC.
B/ Réponse humorale Les 3 lipopeptides en position N-terminale! utilisés en A/ ont été testés pour induire une réponse humorale chez la souris. Les 3 peptides natifs et du montanide ISA 720 ont également été testés en témoin.
Les souris ont été immunisées par administration sous-cutanée d'1,2 mg (équivalent à 100 μg de lipopeptides vecteur Pam + mannitol + Tween ou 100 μg d'un mélange de peptides natifs en présence de montanide). Une immunisation suivie d'un rappel à J15 et à J29 ont été réalisé. Les sera ont été prélevés à J14, J28 et J42 après la première administration des antigènes
Le dosage des immunoglobulines spécifiques d' antigènes a été effectué comme suit : ' •
Les antigènes peptidiques sont solubilisés en tampon phosphate 0,1 M pH 8,2 à la concentration de 10' μg/ l. 100 μl de cette solution sont ajoutés par puits, dans une plaque 96 puits Maxisorb (NUNC) . Après un nuit d'incubation à 4°C et deux lavages en tampon PBS-tween 0,01%, les puits sont saturés en présence d'un tampon PBS contenant 3% d' albumine bovine sérique (BSA) . Après 2 heures d'incubation à température ambiante, 2 lavages des puits sont réalisés en tampon PBS-tween. 100 μl de sérum, dilué au 1/100, sont ensuite ajoutés en incubés une nuit à 4°C. 3 lavages en PBS-tween sont ensuite effectués. L'anticorps secondaire marqué à la péroxidase (anti-IgG (H+L) de souris, Sanofi Pasteur) sont incubés, en tampon PBS-BSA 1% à raison de 100 μl par puits durant une heure à température ambiante. Après 4 lavages en PBS-tween, la révélation est effectuée en présence d' orthophényldiamine dihydrochloride (OPD, SIGMA) dilué en tampon de révélation (tampon phosphate-citrate avec perborate de sodium, SIGMA) . Après 30 minutes d'incubation à l'abri de la lumière, la réaction est stoppée en présence d' HCL 1M à raison de 50 μl par puits. La lecture est réalisée à une longueur d'onde de 492 nm.
Les résultats sont représentés dans le Tableau IX ci-après.
Tableau IX : Dosage des anticorps totaux sur souris Balb/c immunisées (résultats exprimés en densité optique) .
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
Les résultats montrent que les lipopeptides utilisés sont incapables d' induire une réponse humorale caractérisée par la production d' anticorps spécifiques chez ces mêmes modèles murins consécutivement à une immunisation suivie de deux rappels. Ce résultat est d'autant plus original que ces mêmes séquences, lorsqu'elles sont administrées en présence d'un adjuvant huileux comme le Montanide ISA 72On induisent une réponse anticorps très importante, détectable dès la première immunisation. Ce résultat indique que les lipopeptides orientent très fortement l'immunité vers une réponse de type cellulaire.
C/ Comparaison des vecteurs Pam et CChol
L' immunogénicité de mélanges de lipopeptides a été évaluée chez la souris. Les différentes formulations indiquées dans les exemples 2 et 3 précédant (3 lipopeptides, vecteur Pam; 3 lipopeptides + glycomimétique, vecteur Pam; 31ipopeptides, vecteur CChol; 3 lipopeptides + glycomimétique, vecteur CChol) ont été testées.
1) Protocole d' immunisation sublinguale Les souris sont immunisées par voie sublinguale avec 480 μg de chaque mélange lipopeptidique dissous dans 5 μl d'eau pour préparation injectable (H20 ppi) . Un rappel est effectué 14 jours après la première immunisation dans les mêmes conditions que précédemment. 14 jours après, les animaux sont sacrifiés, les rates sont prélevées et les cellules spléniques sont mises en culture en présence des différents peptides natifs, seuls ou en mélange, à la concentration de 10 μg/ml
2) Dosage de l XInterleukine-2 (IL-2) produite dans les surnageants de culture.
Les anticorps primaires spécifiques de l'IL-2 murine (rat anti-mouse IL-2, Pharmingen 18161D) sont incubés en tampon phosphate 0,1M, pH 8,2 à la concentration de 2 μg/ml. 50 μl par puits de cette solution sont ajoutés dans une plaque 96 puits Maxisorb
(NUNC) . Après un nuit d'incubation à 4°C et deux lavages en tampon PBS-Tween 0,01%, les puits sont saturés en présence d'un tampon PBS contenant 3% d'albumine bovine sérique (BSA). Après 2 heures d'incubation à température ambiante, 2 lavages sont réalisés en tampon PBS-Tween. 100 μl de surnageant de culture sont ensuite ajoutés et incubés une nuit à 4°C. Une gamme de dilution d' IL-2 murine recombinante est préparée en PBS-BSA 1% (de 20 ng à 0,3 pg) et lOOμl de cette préparation sont déposés par puits. 3 lavages en PBS-Tween sont ensuite effectués. L'anticorps secondaire biotinylé spécifique de l'IL-2 murines (biotin rat anti-mouse IL-2, Pharmingen 18172D) est incubé en tampon PBS-BSA 1% à raison de 100 μl par puits durant une heure à température ambiante. Après 3 lavages en PBS-Tween, la streptavidine-péroxidase (Jackson Immunoresearch) , diluée en PBS-Tween à Img/ l, est ajoutée à chaque puits dans un volume de 100 μl, durant 30 minutes à température ambiante. Après 4 lavages en PBS-Tween, la révélation est effectuée en présence d' orthophényldiamine dihydrochloride (OPD, SIGMA) dilué en tampon de révélation (tampon phosphate-citrate avec perborate de sodium, SIGMA) . Après 30 minutes d'incubation à l'abri de la lumière, la réaction est stoppée en présence d'HCL 1M à raison de 50μl par puits. La lecture est réalisée à une longueur d'onde de 492 nm.
3) Autre protocole d' immunisation sublinguale
Les souris (Balb/c) ont été immunisées par administration sublinguale de 5 μl de mélange de lipopeptides (480 μg de poudre équivalent à 40 μg environ de lipopeptides) . Un rappel a été effectué 14 jours après cette première immunisation, avec les mêmes quantités de mélange de lipopeptides. Des lots de 5 souris Balb/c (IFFA-CREDO) ont été constitués pour chacune des quatre formulations : [3 lipopeptides + glycomimétique, vecteur CChol] ; [3 lipopeptides, vecteur CChol] ; [3 lipopeptides + glycomimétique, vecteur Pam] ; [3 lipopeptides + glycomimétique, vecteur Pam] . Les souris sont sacrifiées 7 jours après le rappel, les rates sont prélevées et regroupées par lot d'animaux. Les cellules de chaque lot de souris sont restimulées par les différents peptides natifs, soit individuellement soit en mélange (concentration : lOμg/ml) . 24 heures après la mise en culture des cellules, les surnageants sont prélevés pour effectuer le dosage de leur contenu en IL-2. Les résultats sont exprimés en picogrammes d' IL-2 par ml de surnageant. • •
Le Tableau X ci-après présente les résultats d'analyse de l' immunogénicité des différents mélanges lipopeptidiques chez la souris.
Tableau X : Production d' IL2 après immunisation sublinguale (exprimée en pg/ml) .
Figure imgf000049_0001
Les résultats obtenus révèlent que les lipopeptides, résultant de la lipidation par le vecteur CChol, induisent une meilleure réponse que les lipopeptides résultant de la lipidation par le vecteur Pam.
Ces lipopeptides CChol s'avère particulièrement immunogènes quand ils sont administrés par voie muqueuse et plus particulièrement par la voie sublinguale.
Exemple 5 : Evaluation chez le Macaque de la capacité de vaccins lipopeptidiques à induire une réponse de type CTL contre le virus de l' immunodéficience simienne (VIS) .
1) Synthèse des hydrazinopeptides
L' exemple 1 de la demande de brevet
PCT/FR01/02787 décrit la synthèse de peptides fonctionnalisés par des groupements α- hydrazinoacétiques, à partir de séquences peptidiques dérivées des protéines Nef et Gag du virus de
1' Immunodéficience Simienne (SIV) .
Les séquences peptidiques utilisées ici sont les mêmes que celles décrites dans la demande de brevet PCT/FR01/02787, à l'exception de la séquence SIVl (voir nouvelle séquence dans le Tableau XI ci-après) . Tableau XI :
Figure imgf000051_0001
* Compara tivement à la séquence VIS 1 décrite dans la demande de brevet N° PCT/FR01/02787, la séquence VIS 1 ' présentée ici comporte deux muta tions en posi tion 110 et 112)
2) Synthèse du vecteur lipophile
Le vecteur lipophile utilisé est le vecteur Illa décrit dans l'exemple 1.
3) Synthèse des lipopeptides L'exemple 8 de la demande de brevet PCT/FR01/02787 décrit la méthode de couplage entre les hydrazinopeptides et le vecteur lipophile.
Les appellations et les poids moléculaires des lipopeptides ainsi synthétisés sont donnés dans le Tableau XII ci-après :
Tableau XII :
Figure imgf000052_0001
4) Préparation des mélanges de lipopetides
Après échange d' ions comme décrit dans l'exemple 1 par RP-HPLC, en utilisant un gradient court, les mélanges de lipopeptides lyophilisés obtenus en 3) sont dissous dans une solution d'acide acétique à 5 % avant d' être soumis à une filtration stérilisante sur membrane 0,22 micron (SLGV, Millipore).
5) Préparation des doses de vaccin Formulation mannitol - Tween :
Après l'étape 4), du mannitol a été introduit ainsi que du Tween 80 en quantité suffisante pour la préparation de 10 doses unitaires dont la composition par dose est la suivante :
• 1 Dose représentant 3,5 mg équivalent peptide (0,5 mg ' par peptide), soit environ 4,2 mg de lipopeptide
• Mannitol apyrogène : environ 42 mg par dose.
• Polysorbate 80 : environ 1 mg par dose.
• Quantité totale de poudre par dose : environ 47 mg
• Conserver à -20 °C La remise en solution des doses obtenues selon cette formulation fournit une solution légèrement opalescente.
Formulation mannitol-glycomimétique lipide
Le mélange a été préparé par lipidation simultanée (comme dans l'exemple 3, partie 3')) d'un mélange d' hydrazinopeptides (trifluoroacetate) (5,8 mg par hydrazinopeptide) auquel est ajouté un glycomimétique branché ( [ (Qui) 4AKHdz) ] , 12,9 mg) .
Après lipidation, le mélange a été dilué puis lyophilisé. Le contre-ion trifluroracétate a été remplacé par un contre-ion acétate par RP-HPLC, en utilisant un gradient court. Après lyophilisation, la poudre est dissoute dans de l'eau et de l'acide acétique 5% ; avant de soumettre la préparation à la filtration stérilisante sur membrane 0,22 micron SLGV Millipore. Du mannitol a été introduit en quantité suffisante pour la préparation de 11 doses unitaires dont la composition par dose est la suivante : • 1 Dose représentant 3,4 mg équivalent peptide + glycomimétique (0,5 mg par peptide) soit environ 4,2 mg de lipopeptide • Mannitol apyrogène : environ 42 mg par dose.
• Quantité totale de poudre par dose : environ 47 mg
• Conserver à -20 °C
La remise en solution des doses obtenues selon celle formulation fournit une solution légèrement opalescente.
7) Etudes chez le Macaque de la Formulation mannitol-
Tween :
Une dose unitaire est utilisée par animal et par injection. La dose est diluée dans de l'eau pour préparation injectable (1 ml par dose) : on obtient une solution opalescente.
Le produit (sans adjuvant) a été administré par voie intra-dermique en 10 points d'injection (lOOμl par point) (4 macaques), par voie intra-musculaire (4 macaques) . Les 3 injections ont été effectuées à 3 semaines d' intervalle et un rappel a été pratiqué 2 mois après la dernière injection. La réponse immune a été testée sur des prélèvements de sang effectués en pré- immunisation, 15 jours après la 3eme immunisation et 14 jours après le rappel.
L'efficacité de l'immunisation a été testée par évaluation du nombre d'effecteurs circulants et de leurs précurseurs sécrétant de l'Interféron gamma (IFN- γ) par un test ELISPOT à la suite d'une restimulation préalable in vi tro des cellules mononuclées de sang total (PBMC, Peripheral Blood Mononuclear Cells) par les peptides .
Préparation des PBMC : Les PBMC sont isolés par centrifugation en gradient sur un milieu de séparation des lymphocytes (Flow Laboratories, Glasgow, UK ou Pharmacia, Uppsala, Suéde) et sont utilisés immédiatement.
Restimulation in vitro :
Les PBMC (16.106 cellules) sont mises en milieu RPMI 1640 complet à 5 millions/ml; et aliquotés en 4 tubes de 4 millions de cellules qui seront incubées pendant une nuit à 37 °C avec les lipopeptides (10 μg/ml) .
Plusieurs lignées sont établies : lignée 0 : sans peptides ;
- lignée 1 : avec VIS1 HzPam (LP1) et VIS2 HzPam (LP2) ; - lignée 2 : avec VIS3 HzPam (LP3) , VIS4 HzPam (LP4) et VIS5 HzPam (LP5) ;
- lignée 3 : avec VIS6 HzPam (LP6) et VIS7HzPam (LP7) .
Après 1 lavage le lendemain, les lignées sont placées en plaque 24 puits, à 2 millions de cellules par ml et à raison de 2 ml par puits. Aux jours 3 et 7, de l' Interleukine 2 (IL-2, 10 UI/ mL) est ajoutée avec changement de milieu au jour 7. Ces effecteurs ont été testés après 12 jours de culture et lavés 2 fois juste avant le test. Test ELISPOT-IFN- : '.
Des plaques 96 puits de nitrocellulosé
(Millipore) sont d'abord sensibilisées une nuit à 4°C avec un anticorps monoclonal de souris anti-IFN-γ simien (clone GZ-4 mabtech) (dilution 1/1000 en tampon phosphate (PBS) : concentration 1 microgramme /ml en final) . Après lavages avec du tampon PBS stérile et saturation par du milieu complet pendant 2 heures à 37 °C en atmosphère C02, les cellules effectrices sont disposées en duplicate (100000 cellules par puits) avec les différents peptides (voir paragraphe suivant) , sans IL-2, à la concentration finale de 5 microgrammes par ml, (ou sans peptide pour les contrôles négatifs) . L'incubation est maintenue pendant 24 heures à 37 °C. Les plaques sont alors lavées plusieurs fois avec du PBS puis du PBS-Tween 0,05 %. Après ces lavages, les plaques sont incubées, durant une nuit à 4°C ou 2 heures à 37 °C, avec un anticorps monoclonal de souris anti anti-IFN-γ simien biotinylé dilué à 1/1000 en PBS Tween 0,05% ;BSA 1% (clone 7-B6-1 mabtech, 1 microgramme/ml final) .
Après plusieurs lavages la révélation est réalisée au moyen d'Extravidine-phosphatase alcaline (SIGMA) à raison de 2,5 microgramme par ml (incubation Ih à température ambiante) . Après des lavages supplémentaires, on développe une coloration mesurable avec un substrat nitro-bleu tétrazolium (BioRad) pendant 15 à 30 minutes. Les plaques sont alors rincées à l'eau et séchées. La lecture du test est réalisée par comptage des spots (centre contrasté et contour diffus) par un stéréomicroscope x 40 (Leica MZ6) . Chaque spot violet correspond à une cellule sécrétant de l'IFN-γ, c'est à dire une SFC (Spot Forming Cell) .
Mélanges de peti ts peptides utilisés pour le test ELISPOT : (Mélanges de 9-15-mers) : ;
L3.P1 (épitopes de nef 155-178) = 156-165 ; 168-177 ;
165-174
L3.P2 (épitopes de nef 155-178) = 157-165 ; 169-178 ;
166-174 L3.P3 (épitopes de nef 155-178) = 158-167 ; 162-171 ;
167-175
L4. PI (épitopes de nef 201-225) = 201-211 ; 205-213 ;
211-219 ; 215-225
L4.P2 (épitopes de nef 201-225) = 201-210 ; 205-212 ; 214-223 ; 210-219
L4.P3 (épitopes de nef 201-225) = 203-211 ; 206-215 ;
215-223 ; 204-212
L5. PI (épitopes de nef 221-247) = 222-229 ; 236-244.;!
225-233 L5.P2 (épitopes de nef 221-247) = 224-233 ; 239-247.
Mix6 (épitopes de nef 201-225) = 201-211 ; 205-213 ;
211-219 ; 215-225 ; 201-210 ; 205-212
L7P1 (épitopes de gag 246-281) = 250-257 ; 255-263 ;
261-269 ; 268-276 ; 253-262
8) Résultats
Pour chaque animal sont indiqués dans le
Tableau XIII ci-après les mélanges de peptides qui ont permis de détecter des SFC de manière significative 15 jours après la 3eπιe immunisation ou 14 jours après le rappel : TABLEAU XIII
Figure imgf000058_0001
Le 1er groupe (macaques 1053, 1059, 1060, 1066) a reçu le mélange des 7 lipopeptides administré par voie intradermique. Les résultats montrent des réponses positives chez 2 macaques (1053 et 1066) qui reconnaissent 1 pool de petits peptides chacun. Ces réponses sont visibles 15 jours après la dernière immunisation.
Le 2ème groupe (macaques 1051, 1062, 1068, 1077) a reçu le mélange des 7 lipopeptides administré par voie intramusculaire. Trois des 4 macaques ont présenté des réponses CD8 contre 1 pool de petits peptides (2 macaques 1051 et 1062) , le 3eme ayant des réponses dirigées contre 3 pools (macaque 1077). Ces réponses étaient visibles 15 jours après la dernière immunisation pour les macaques 1051 et 1062 et 15 jours après le rappel pour les macaques 1051, 1062 et 1077.
Les résultats détaillés obtenus avec la lignée 2 issue de l'animal 1051 sont représentés à la figure 1.

Claims

REVENDICATIONS
1°) Utilisation pour la fabrication d'un vaccin d'un mélange comprenant au moins des lipopeptides, caractérisée en ce que lesdits lipopeptides sont constitués d'un composé peptidique lié par un lien hydrazone à au moins un vecteur lipophile de nature non peptidique, et sont de formule générale (I) suivante :
[((R1) (R2)i ) D -H]j - P (D
dans laquelle (R1) (R2)± D représente le vecteur lipophile, dans lequel:
- i représente 0 ou 1,
- dans le cas où i est égal à 0, D représente une liaison, '.
- dans le cas où i est égal à 1, D représente un hétérocycle saturé, insaturé ou aromatique, mono- ou polycyclique,
R1 et R2, qui peuvent être identiques ou différents, représentent chacun un groupement de formule L-f-E-f où L représente un résidu d'un lipide, E représente un bras espaceur, et f et f représentent des fonctions liant, respectivement,
L à E et E à D, et - P représente le composé peptidique,
- H représente le lien hydrazone formé par la ligation en solution entre une fonction aldéhyde portée par le vecteur lipophile et une fonction dérivé d' hydrazine portée par le composé peptidique,
- j représente 1 à 3.
2°) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que i est égal à 0, j est égal à 1 et en ce que L représente un stérol, un dérivé de stérol ou une chaîne carbonée saturée ou insaturée, linéaire ou ramifiée, comprenant entre 4 et 30 atomes de carbone.
3°) Utilisation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ledit dérivé de stérol est un dérivé du cholestérol et en ce que ladite chaîne carbonée répond à la formule CH3- (CH2) 14-.
4°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que E représente une chaîne carbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, comportant de 1 à 18 atomes de carbone et, éventuellement, 1 à 16 heteroatomes et/ou 1 à 7 groupements sélectionnés parmi; les groupements carbonyles, les hétérocycles, les hétéroaryles, les carbocycles et les aryles.
5°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications " 1 à 4, caractérisée en ce que f représente une liaison -CO-NH- ou -CO-O- et f représente une liaison -NH-CO- ou -O-CO- . 6°) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le vecteur lipophile répond à la formule ( II )
Figure imgf000062_0001
( II )
7°) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le vecteur lipophile répond à la formule (III) :
Figure imgf000062_0002
dans laquelle L est tel que défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 3.
8°) Utilisation selon la revendication 7,. caractérisée en ce que L représente une chaîne carbonée' de formule CH3-(CH2)ι4- dans la formule (III). 9°) Utilisation selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce que le composé peptidique P est sélectionné dans le groupe constitué par un ou plusieurs antigènes peptidiques et un ou plusieurs glycomimétiques dendrimériques de nature peptidique .
10°) Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'antigène peptidique est choisi parmi le groupe constitué par les peptides et lés! dérivés de peptides comprenant les glycopeptides et les. pseudopeptides .
11°) Utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que le glycomimétique dendrimérique de nature peptidique répond à la formule générale (IV) ci-après :
(B2M) (XN)nA (IV) dans laquelle :
- BB22 rrééppoonndd àà une ou plusieurs formules générales (a) ou (b) ci-après
Figure imgf000063_0001
(a) (b)
où Ri, R2, R3 et R représentent, indépendamment les uns des autres, un atome d'hydrogène ou un groupe protecteur, et où W représente une liaison ou une chaîne carbonée linéaire, ramifiée ou cyclique, saturée ou insaturée, comprenant de 1 à 18 atomes de carbone et éventuellement de 1 à 12 atomes choisis parmi l'oxygène, le soufre et l'azote, ladite chaîne carbonée étant éventuellement substituée par 1 à 16 atomes d'halogène,
- X représente le reste d'un oligopeptide X' comprenant de 1 à 6 acides aminés,
- A représente le reste d'un composé A' au moins trifonctionnel comprenant un enchaînement d'acides aminés, identiques ou différents, sélectionnés dans le groupe constitué par la lysine, l'hydroxylysine, la serine, la thréonine, la cystéine, l'ornithine, l'acide aspartique et l'acide glutamique ' ;
- m est un nombre entier compris entre 1 et 32, - n est un nombre entier compris entre 0 et 32, et
- M et N représentent chacun un groupe de liaison, respectivement entre B2 et A quand n = 0 ou B2 et X quand n est différent de 0, et entre X et A quand n est différent de 0, et comprennent, indépendamment l'un de l'autre, une fonction choisie parmi les fonctions oxime, hydrazone, amide, ester, thioester, hydrazide, hydroxamate, éther, thioéther, aminé, carbonate, carbamate, thiocarbonate, thiocarbamate, urée, thiourée et thiazolidine. 12°) Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce que le composé de formule générale
(IV) est tel que m est un nombre entier compris entre ' 4! et 16, n est un nombre entier compris entre 2 et 8, X représente le reste d'un oligopeptide comprenant de 2 à 4 résidus d'acides aminés, tandis que A représente le reste d'un enchaînement comprenant de 2 à 8 résidus de lysine et se présentant sous la forme d'un dendrimère, et B2 représente un reste d'un ou plusieurs composés choisis parmi l'acide (-) -shikimique et l'acide (-)- quinique. 13°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 12, caractérisée en ce que le mélange de lipopeptides comprend de 1 à 20 lipopeptides différents, de préférence de 1 à 10 lipopeptides différents. 14*) Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que les lipopeptides sont sous forme de micelles mixtes.
15°) Utilisation selon l'une des revendications 1 à 14, caractérisée en ce que le composé peptidique est constitué par un antigène dérivé d'un agent infectieux ou d'un cancer.
16°) Utilisation selon la revendication 15, caractérisée en ce que l'agent infectieux est de type bactérien, parasitaire ou viral. 17°) Utilisation selon la revendication 16, caractérisée en ce que l'agent infectieux de type viral est le VIH ou le VHC.
18°) Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que le composé peptidique est une séquence provenant des protéines Gag, Pol ou Nef du virus HIV.
19°) Utilisation selon la revendication 18, caractérisée en ce que le mélange de lipopeptides contient au moins deux séquences provenant des protéines Gag, Pol et Nef du virus HIV.
20°) Utilisation selon la revendication 19,. caractérisée en ce que le mélange de lipopeptides comprend un mélange de lipopeptides dans lequel les peptides ont les séquences :
- Gag 17-35 - Gag 253-284
- Pol 325-355
- Nef 66-97 et
- Nef 116-147.
21°) Utilisation selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le vaccin est formulé pour l'administration par voie transmucosale, transdermique ou par voie intramusculaire.
22°) Utilisation selon la revendication 21, caractérisée en ce que le mélange comprend en outre un ou plusieurs excipients cliniquement acceptables.
23°) Utilisation selon la revendication 22, caractérisée en ce que l'excipient est le mannitol ou le Polysorbate 80 ou un mélange des deux. 24°) Utilisation selon la revendication 17, caractérisée en ce que les composés peptidiques P de l'agent infectieux VHC sont constitués par les séquences peptidiques suivantes :
- VHC 1 HzAc : H- K(COCH2NHNH2)GREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2
- VHC 2 HzAc :
H-K ( COCH2NHNH2 ) GHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2
- VHC 3 HzAc :
H-K (COCH2NHNH2) GAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2 25°) Séquence peptidique native du VHC comprenant la séquence nommée NS3 1007-1037 suivante : H-KGREILLGPADGMVSKGWRLLAPITAYAQQTR-NH2
26°) Séquence peptidique native du VHC comprenant la séquence nommée NS3 1174-1195 suivante : H-KGHAVGIFRAAVCTRGVAKAVDF-NH2.
27°) Séquence peptidique native du VHC comprenant la séquence nommée NS3 1524-1553 suivante : H-KGAAWYELTPAETTVRLRAYMNTPGLPVAQD-NH2
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