WO2003070940A1 - Gene d'enzyme de digestion de la cellulose et utilisation dudit gene - Google Patents

Gene d'enzyme de digestion de la cellulose et utilisation dudit gene Download PDF

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WO2003070940A1
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Akira Tsukamoto
Seiji Nakagame
Mari Kabuto
Jun Sugiura
Hisako Sakaguchi
Atsushi Furujyo
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Oji Paper Co., Ltd.
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    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes

Definitions

  • the present invention relates to a method for treating a wood chip using an antisense gene of a gene encoding a cellulolytic enzyme.
  • Pulp manufactured by the pulp and paper industry is classified into mechanical pulp and chemical pulp according to the manufacturing method.
  • Mechanical pulp is produced by physically grinding wood fibers using mechanical energy. Since it contains almost no wood components, it can be produced in high yields and can produce thin, highly opaque paper. However, there are drawbacks in that a large amount of power is required for grinding and paper strength is hardly obtained.
  • TMP thermomechanical pulp
  • Basidiomycete Phanerochaete chrysosporium in the presence of glucose and then subjected to secondary fibrillation, 25 to 30
  • the% defibrillation energy has decreased (Bar- Lev and TK Kirk, Tappi J., 65, 111, 1982).
  • Nishibe et al. 10 kinds of rotting fungi pre-selected from 61 species and 85 strains of rotting fungi Microbial decomposition of sag walnut wood chips and softwood secondary disintegration TMP, selective delignification, and little collapse of pulp fiber Coprinus cinereus (Coprinus cinereus) and Faneroquette chrysosporium were selected and showed that the reduction in paper strength was suppressed in the presence of glucose and urea. However, the decrease in pulp yield was 6.3% and 9.7% for 14 days at 30 ° C, respectively.
  • microorganisms obtained by screening do not always have high selectivity for lignin degradation, and not only lignin but also cellulose are degraded. Pulp yield and paper strength decrease. Therefore, there is a further need for obtaining and producing microorganisms having enhanced selectivity for lignin decomposition, that is, microorganisms having excellent lignin decomposition ability but suppressing cellulose decomposition.
  • Mutants with enhanced selectivity for lignin degradation have been created by Ander et al. They mutated Sporotrichum pulverulentum by UV irradiation, and are developing a strain of Cel44, a cellulase with low cellulase activity.
  • Cel44 a cellulase with low cellulase activity.
  • the former degraded lignin and xylan well, while the latter degraded lignin and xylan well, but glucan was degraded. Almost no decomposition (Ander and Eriksson, Svensk Papperstidning, 18, 643, 1975). After processing the birch wood with this Cel44 for 6 weeks, mechanical pulp was produced.
  • Mutants with weak cellulase activity have been produced as described above, and their use in mechanical pulp treatment has been studied.However, since these mutants have been mutagenized by irradiation with ultraviolet light, There is a problem that the speed is slow and the decomposition process takes a long time. For this reason, it is desired to produce a mutant strain that suppresses only the cellulolytic activity without affecting the growth rate.
  • chemical pulp is a manufacturing method in which lignin in wood is eluted using chemicals to extract cellulose and hemicellulose.
  • kraft pulp that performs delignification using sodium hydroxide and sodium sulfate is mainly used.
  • Microbial treatment is also performed on craft pulp in the same way as mechanical pulp, and delignified before cooking. Attempts have been made to reduce production energy and improve pulp quality by performing nin. For example, treating a red oak wood with a phaneroquette chrysosporium for 30 days improves yield at the same Ka value, reduces beating energy, and increases tensile strength and burst strength.
  • microbial treatment of kraft pulp improves digestibility and reduces energy consumption, but may reduce yield and paper strength. Although it has excellent ability to degrade lignin, its ability to degrade cellulose is suppressed, and it is necessary to obtain and produce microorganisms with enhanced selectivity for lignin decomposition.
  • Cellulase hydrolyzes the 1,1 and 4-dalcoviranosyl bond of the cellulose backbone into an endo-type, so-called endoglucanase (CMCase), and cuts off cellobiose residues mainly from the ends of the cellulose backbone, a so-called It is known to be roughly classified into exodalcanase (avicelase). Then, when these hydrolases act synergistically on cellulose, the cellulose substrate is reduced in molecular weight and cellobiose is produced. In addition, due to the involvement of 3-dalcosidase, it is degraded to glucose units.
  • CMCase endoglucanase
  • Cellobiose dehydrogenase is a oxidoreductase that oxidizes cellobiose dicellooligosaccharide to produce cellobionolactone, and at the same time reduces metal complexes such as quinone and iron, phenoxy radicals, and oxygen.
  • This enzyme is produced simultaneously with cellulase when microorganisms degrade cellulose (Eriksson et al., FEBS Lett., 49, 282-285, 1974).
  • Cellobiose's inhibition of cellulase activity, ie, product Since the inhibition is released (Igarashi et al., Eur. J.
  • Bok Rametesu - Benoreshikora Trametes versicolor
  • N Sukizofiramu * Commune Schollura commune
  • co-not Ofuofu-Puaana Coneophora coincidena
  • Sejiopu Bokure-Samofuira Mycel iophtore thermophi la, Fumiko one La * Inn Sorensu (Fumicola insolens), etc. of wood Decay fungi are mentioned.
  • cellobiose dehydrogenase gene As for the gene encoding cellobiose dehydrogenase (hereinafter referred to as cellobiose dehydrogenase gene), for example, in Faneroquette chrysosporium, cDNA of K3 strain (Raices et al., FEBS Letters, 69, 233-238, 1995), 0GC101 strain, cDNA (Li et al., Appl. Environ. Microbiol., 62 (4), 1329-1335, 1996) and chromosomal gene cloning have been performed (Li et al. Appl. Environ. Microbiol., 63 (2), 796-799, 1997).
  • cellulolytic enzymes there has been strong interest in the use of cellulolytic enzymes for some time. For example, it is being considered for use in a wide variety of fields, such as addition to household detergents, surface treatment of cellulosic polymer materials such as fibers, modification of used paper, deinking of waste paper, and food processing. . For this reason, there is a need for a method for producing cellulose degrading enzyme at a high level.As an attempt to produce cellobiose dehydrogenase at a high level, a promoter functioning constitutively upstream of the cellobiose dehydrogenase-1 gene of Phaneroquette 'tharisosporium.
  • An object of the present invention is to provide a method for treating a wood chip using an antisense gene of a gene encoding a cellulolytic enzyme.
  • the present inventors sought cellulolytic enzyme-producing bacteria such as cellobiose dehydrogenase, etc., conducted extensive screening and conducted intensive research. Has been found to produce. Furthermore, they succeeded in cloning the genes encoding those cellulolytic enzymes. In addition, a method for controlling the expression of the gene using the antisense gene of the gene has been developed, and when pulp is manufactured from wood chips using the method, it is possible to suppress a decrease in yield and paper strength. Succeeded and completed the present invention.
  • the present invention provides the following.
  • a recombinant DNA comprising the above 13 and a 13 fragment having a promoter activity, wherein the 0 is bound to the DNA fragment so that the antisense RNA of the cellulolytic enzyme gene is generated by transcription.
  • Cellulose degrading enzyme gene is cellobiose dehydrogenase gene, cellobiohydrolase I, cellohydrodolase II, endodulcanase gene belonging to glycolytic enzyme family 61, and endodalcanase gene belonging to glycolytic enzyme family 12
  • the method according to (1) which is at least one member selected from the group consisting of an endalcanase gene belonging to glycolytic enzyme family 5 and an endoglucanase gene belonging to glycolytic enzyme family 9.
  • the cellobiose dehydrogenase gene is an isolated cellobiose dehydrogenase gene having any one of the following nucleotide sequences (a) to (c):
  • nucleotide sequence which hybridizes with a nucleotide sequence having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a) under stringent conditions and encodes a protein having cellobiose dehydrogenase enzyme activity.
  • nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 1 or 3, and which encodes a protein having cellobiose dehydrogenase enzyme activity.
  • cellobiohydrolase I gene is an isolated cellobiohydrolase I gene comprising any one of the following nucleotide sequences (a) to (c).
  • nucleotide sequence which hybridizes with a nucleotide sequence having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a) under stringent conditions, and encodes a protein having an enzymatic activity of the lipase biohydrolase I gene.
  • nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 7, 9 or 11, and which codes for a protein having an enzymatic activity of a peptiohydrolase I gene;
  • cellobiohydrolase II gene is an isolated cellobiohydrolase II gene comprising any one of the following nucleotide sequences (a) to (c).
  • nucleotide sequence which hybridizes with a nucleotide sequence having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a) under stringent conditions, and which encodes a protein having an enzymatic activity of SEGA biohydrolase II gene .
  • SEQ ID NO: 14 comprises one or more bases in which one or more bases have been deleted, substituted or added, and has an enzyme activity of cellohydrohydrase II gene Nucleotide sequence that encodes a protein.
  • An endodalcanase gene belonging to the glycolytic enzyme family 61 is an endogenous gene belonging to the isolated glycolytic enzyme family 61 containing any one of the following nucleotide sequences (a) to (c): The method according to (2), which is a dalcanase gene.
  • a base consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 18, and which encodes a protein having an endodalase activity belonging to glycolytic enzyme family 61 Array.
  • An endalcanase gene belonging to the glycolytic enzyme family 12 comprising the nucleotide sequence of any of the following (a) to (c): The method according to (2), which is a canase gene.
  • nucleotide sequence comprising a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 20 and encoding a protein having an endoglucanase enzyme activity belonging to glycolytic enzyme family 12 .
  • the endoglucanase gene belonging to glycolytic enzyme family 5 is an isolated endoglucanase gene belonging to glycolytic enzyme family 5 containing any one of the following nucleotide sequences (a) to (c): , (2).
  • nucleotide sequence which hybridizes with a nucleotide sequence having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a) under stringent conditions, and encodes a protein having an endoglucanase enzyme activity belonging to glycolytic enzyme family 5 .
  • nucleotide sequence comprising an added nucleotide sequence and encoding a protein having an endoglucanase enzymatic activity belonging to glycolytic enzyme family 5.
  • (b) Encodes a protein that hybridizes with a nucleotide sequence having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a) under stringent conditions and has endoglucanase enzyme activity belonging to glycolytic enzyme family 19 Base sequence.
  • FIG. 1 is a view showing the analysis results of the reaction when the cellobiose dehydrogenase of the present invention was allowed to act on cellobiose.
  • FIG. 5 is a diagram showing the thermostability of the cellobiose dehydrogenase of the present invention.
  • SEQ ID NO: 5 is a probe for plaque hybridization.
  • SEQ ID NO: 6 is a probe for plaque hybridization.
  • SEQ ID NO: 13 is a probe used for plaque hybridization.
  • SEQ ID NO: 16 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 17 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 22 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 23 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 26 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 27 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 30 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 31 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 32 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 33 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 35 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 36 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 37 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 38 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 39 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 40 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 41 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 42 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 43 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 44 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 45 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 46 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 47 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 48 is a primer used in a PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 49 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 50 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 51 is a primer for PCR reaction.
  • SEQ ID NO: 52 is a primer for PCR reaction.
  • the present invention provides a step of preparing a DNA encoding an antisense RNA substantially complementary to all or a part of a transcription product of a basidiomycete-derived cellulolytic enzyme gene; Or (b) a recombinant DNA comprising the DNA and a DNA fragment having promoter activity, wherein the DNA is linked to the DNA fragment so that transcription produces antisense RNA of a cellulolytic enzyme gene.
  • the basidiomycete can be any bacterium as long as it is a genus having the ability to degrade cellulose.
  • Coriolus hirsutus whose Japanese name is called Aragage viper agaric, is preferable. .
  • the cellulose-degrading enzyme gene is not particularly limited as long as it is an enzyme capable of degrading cellulose.
  • a cellobiose dehydrogenase gene a cellopio
  • the hydrolase I gene a cellobiohydrolase II gene and endoglucanase gene are preferred.
  • various genes as shown in the following 1 to 7 can be used. Although these genes can be used alone, one or more of them may be used in combination.
  • An isolated cellobiose dehydrogenase gene comprising any one of the following nucleotide sequences (a) to (c):
  • nucleotide sequence which hybridizes with a nucleotide sequence having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a) under stringent conditions, and encodes a protein having cellobiose dehydrogenase enzyme activity.
  • nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 1 or 3, and which encodes a protein having an enzyme activity of Bacillus dehydrogenase;
  • An isolated cellobiohydrolase I gene comprising any one of the following nucleotide sequences (a) to (c):
  • nucleotide sequence which hybridizes with a nucleotide sequence having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a) under stringent conditions, and encodes a protein having an enzyme activity of a lipase piohydrolase I gene.
  • nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence in which one or more nucleotides have been deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 7, 9 or 11, and which encodes a protein having cellobiohydrolase I gene enzyme activity .
  • An isolated cellobiohydrolase II gene comprising any one of the following nucleotide sequences (a) to (c):
  • (b) A nucleotide sequence that hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a), and encodes a protein having cellobiohydrolase II gene enzyme activity.
  • An isolated endoglucanase gene belonging to the glycolytic enzyme fuamily 61 comprising any one of the following nucleotide sequences (a) to (c):
  • a base sequence consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 18, and which encodes a protein belonging to the enzyme-degrading enzyme family 61 and having an enzyme activity of endalcanase.
  • An isolated endoglucanase gene belonging to family 112 which comprises any one of the following nucleotide sequences (a) to (c):
  • a base sequence consisting of a base sequence in which one or more bases have been deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 20 and encoding a protein belonging to the enzyme degradative enzyme family 12 and having an endalcanase enzyme activity;
  • a base sequence comprising a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 24, and encoding a protein having endoglucanase enzymatic activity belonging to enzymatic enzyme family 5; 7.
  • nucleotide sequence which hybridizes under stringent conditions to a nucleotide sequence having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of (a), and which encodes a protein having endoglucanase enzymatic activity belonging to enzymatic enzyme family 9 .
  • a base sequence consisting of a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 28, and which encodes a protein having endoglucanase enzyme activity belonging to enzymatic enzyme family 9;
  • Bacillus biose dehydrogenase gene described in 1 above can be obtained by the following procedure.
  • Chromosome DNA is prepared from Choriolas hinorestas using a conventional method for extracting chromosomal DNA, such as the method of Yelton et al. (Proc. Natl. Acad. ScLUSA, 81, 1470 (1984)).
  • the obtained chromosomal DNA is treated with an appropriate restriction enzyme such as Sau3AI, partially digested, and fractionated by sucrose density gradient ultracentrifugation to obtain a DNA fragment of 10 kbp to 25 kbp.
  • the DNA fragment obtained above is ligated to phage DNA treated with a restriction enzyme that generates the same cohesive end.
  • phage DNA for example, EMBL3 (A-M, Frishauf et al., J. Mol. Biol.
  • ⁇ phage DNA is used.
  • the obtained DNA fragment-linked phage is packaged in vitro to obtain a chromosomal DNA library.
  • a conventional cloning vector preferably an Escherichia coli vector, such as pUC18 (C. Yanisch-Perron, et al., Gene, 33, 103 (1985)), etc. Can be used.
  • the clawing vector is not limited to the above examples, and any commercially available vector described in the literature can be used.
  • the purified celliobiose dehydrogenase of Coriolus hirstus was completely digested with lysyl endopeptidase and subjected to amino acid sequencing. Plaque hybridization using a synthetic DNA probe prepared based on the nucleotide sequence deduced from this amino acid sequence. A clone containing the cellobiose dehydrogenase gene is selected. A DNA fragment containing the cellobiose dehydrogenase gene is isolated from the selected clone, and a restriction map is created and sequenced.
  • a fragment containing the above cellobiose dehydrogenase gene was inserted into an appropriate cloning vector (for example, a pUC-based vector such as pUC19), and the method of Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)).
  • an appropriate cloning vector for example, a pUC-based vector such as pUC19
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOS: 1 and 3 encoding cellobiose dehydrogenase derived from Coriolus hirustus were determined.
  • the genes having SEQ ID NO: 1 consisting of the nucleotide sequence of 20 bp and SEQ ID NO: 3 consisting of the nucleotide sequence of 3480 bp were named Cellobiose dehydrogenase 1 gene and Cellobiose dehydrogenase 2 gene derived from Coriolus hirstus, respectively. It is a structural gene of cellobiose dehydrogenase genomic gene consisting of 720 7 bp and 5345 bp.
  • the structural gene portion of the cellobiose dehydrogenase 1 gene represented by SEQ ID NO: 1 is composed of 16 exons and 15 introns (intervening sequence).
  • exon 1 is 129 ⁇ : 177, intron 1 is 178 ⁇ 239, exon 2 is 240 ⁇ 498, intron 2 is 499 ⁇ 57, exon 3 is 558 ⁇ 66 7 , Intron 3 is 668 to 7 16, Exon 4 is 717 to 833, Intron 4 is 834 to 885, Exon 5 is 886 to 1028, Intron 5 is 129 to 1077, Exon 6 is 1 0 78 ⁇ 1242, Intron 6 1 2 4 3 ⁇ 1 30 1, Exon 7 1 302 ⁇ 1 3 74, Intron 7 1 3 7 5 ⁇ 142 5, Exon 8 1426 ⁇ 1480, Intron 8 148 1 to 15 3 4, exon 9 is 1 535 to 2 165, intron 9 is 2 166 to 2223, exon 10 is 2224 to 2351, intron 10 is 23 52 to 240 7, Exon 11 is 2408 to 2456, Intron 11 is 245 7 to 2509, Exon 12 is 25 10 to 2598,
  • amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence analysis was an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 consisting of 768 amino acid residues.
  • the structural gene portion of the cellobiose dehydrogenase 2 gene represented by SEQ ID NO: 3 is composed of 16 exons and 15 introns. Specifically, exon 1 is 159 to 207, intron 1 is 208 to 269, exon 2 is 270 to 528, intron 2 is 529 to 587, exon 3 is 588 to 697, intron.
  • amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence analysis was found to be the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 4 consisting of 768 amino acid residues.
  • cellobiose dehydrogenase 1 gene a cellobiose dehydrogenase gene comprising the 129th to 3274th bases in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 is useful, and the cellobiose dehydrogenase 1 gene is useful.
  • the hydrogenase 2 gene the 159th to 3325th nucleotides of the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3 Cellobiose dehydrogenase genes comprising bases are particularly useful.
  • the DNA fragment of the cellobiose dehydrogenase gene derived from C. hirstus can be obtained by PCR from the DNA fragment containing the chromosome gene of cellobiose dehydrogenase.
  • a PCR primer a sequence consisting of about 10 to 50 bases, preferably about 15 to 30 bases, based on the base sequences represented by SEQ ID NOs: 1 and 3 and its complementary sequence, is a sense primer. It can be used as an antisense primer.
  • a sense primer represented by SEQ ID NO: 31 and an antisense primer represented by SEQ ID NO: 32 can be used (see Example 12).
  • cell mouth biohydrolase I gene described in 2 above can be obtained by the following procedure.
  • a clone containing the cellohydrohydrase I gene is prepared.
  • the DNA fragment containing the cellobiohydrolase I gene is isolated from the selected clone, and a restriction enzyme map is prepared and sequenced. Sequencing can be carried out by inserting a DNA fragment containing the cellobiohydrolase I gene into an appropriate cloning vector (for example, a pUC vector such as pUC19) and performing the method described by Sanger et al.
  • an appropriate cloning vector for example, a pUC vector such as pUC19
  • the nucleotide sequences represented by SEQ ID NOs: 7, 9, and 11 encoding cellobio hydrolase I derived from Coriolus hirustas were determined, and the base sequences represented by cellobiohydrolase I-11 gene and cellobiohydrolase I-12 The gene was designated as Sguchi Biohydrolase I-13 gene.
  • amino acid sequence deduced from the analysis of each nucleotide sequence is 456 amino acids.
  • An amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8 consisting of acid residues; an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 10 consisting of 456 amino acid residues; and an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 consisting of 457 amino acid residues Amino acid sequence.
  • the DNA fragments of the above-mentioned cellobiohydrolase I-11 genes can be obtained by PCR from DNA fragments containing the chromosomal genes of the above-mentioned cellopiohydrolase I_1-3.
  • a primer for PCR about 10 to 50 bases, preferably about 15 to 30 bases, based on the base sequence (SEQ ID NO: 7, 9, 11) of each gene and its complementary sequence are used. Can be used as a sense primer and an antisense primer.
  • cellohydrohydrase II gene described in 3. above can be obtained by the following procedure.
  • a clone containing the cellohydrohydrase II gene Isolate the DNA fragment containing the cellobiohydrolase ⁇ gene from the selected clone, and create a restriction map and determine the sequence.
  • the sequencing can be performed by inserting a DNA fragment containing the cellobiohydrolase II gene into an appropriate cloning vector (for example, a pUC vector such as pUC19) and then performing the method of Sanger et al.
  • an appropriate cloning vector for example, a pUC vector such as pUC19
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 14 encoding cellobio hydrolase II derived from C. holistas was determined. Furthermore, the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence analysis was found to be the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 15 consisting of 453 amino acid residues.
  • the DNA fragment of the cellobiohydrolase II gene can be obtained by PCR from a DNA fragment containing the cellobiohydrolase I II chromosomal gene.
  • a PCR primer a sequence consisting of about 10 to 50 bases, preferably about 15 to 30 bases, based on the above-mentioned base sequence and its complementary sequence can be used as a sense primer or an antisense primer.
  • endalcanase gene belonging to glycolytic enzyme family 61 described in 4 above can be obtained by the following procedure.
  • cDNA library Collecting mRNA from cells grown on Coriolus hirustas on wood chips Then, prepare a cDNA library according to the usual method.
  • isolating the endorcanase gene belonging to glycolytic enzyme fuamily 61 from the obtained cDNA library plaques were formed on an appropriate agar medium, and plaques were isolated at random.
  • the DNA fragment containing the endoglucanase gene belonging to glycolytic enzyme fuamily 61 can be isolated by amplifying a cDNA portion derived from C. hirstus with the primers and analyzing the nucleotide sequence.
  • the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 18 encoding endoglucanase belonging to glycolytic enzyme familly 61 derived from Coriolus hirustas was determined. Furthermore, it was found that the amino acid sequence deduced from the analysis of the base sequence was the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 19 consisting of 374 amino acid residues.
  • the DNA fragment of the endoglucanase gene belonging to glycolytic enzyme family 161 can be obtained by PCR from the DNA fragment containing the endoglucanase gene belonging to glycolytic enzyme family 161.
  • PCR primer a sequence consisting of about 10 to 50 bases, preferably about 15 to 30 bases, based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 18 and its complementary sequence, is a sense primer, an antisense primer. Can be used as a primer.
  • endodulcanase gene belonging to glycolytic enzyme family 12 described in 5 above can be obtained by the following procedure.
  • Plaques are randomly isolated from the cDNA library by the same procedure as in the preparation of the gene described in 4. above, the cDNA portion derived from C. hirstus is amplified, and the nucleotide sequence is analyzed to determine the glycolytic enzyme family. Endoglucanase gene belonging to 12 can be isolated.
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 20 which encodes endoglucanase belonging to glycolytic enzyme family 12 derived from Coriolus hirustas, was determined. Furthermore, it has been shown that the amino acid sequence deduced from the analysis of the nucleotide sequence is the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 21 consisting of at least 2 15 amino acid residues.
  • a PCR primer a sequence consisting of about 10 to 50 bases, preferably about 15 to 30 bases, based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 20 and its complementary sequence, is a sense primer. It can be used as an antisense primer.
  • endodalcanase gene belonging to glycolytic enzyme family 5 described in 6 above can be obtained by the following procedure.
  • the basidiomycete Funeroquette thalisosporidium is cultured in an appropriate medium, and the chromosome DNA is recovered by the method of Yelton et al.
  • the chromosome DNA is recovered by the method of Yelton et al.
  • For the obtained chromosomal DNA prepare appropriate two PCR primers predicted from the chromosomal DNA database of Faneroquette and Chrysosporium, expand the target DNA fragment by a conventional method, and belong to glycolytic enzyme family 5 An endalcanase gene can be obtained.
  • the DNA fragment of the endoglucanase gene belonging to the degrading enzyme family 5 derived from Phaneroquette chrysosporium can be obtained by PCR from the DNA fragment containing the endoglucanase gene belonging to the glycolytic enzyme family 15 described above.
  • a PCR primer a sequence consisting of about 10 to 50 bases, preferably about 15 to 30 bases, based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 24 and its complementary sequence, is a sense primer, antisense It can be used as a primer.
  • endodalcanase gene belonging to glycolytic enzyme family 9 described in the above 7 can be obtained by the following procedure.
  • a clone containing the endoglucanase gene belonging to glycolytic enzyme family 9 is prepared using appropriate PCR primers in the same procedure as in the preparation of the gene described in 6. above. From the selected clone, a DNA fragment containing the endalcanase gene belonging to glycolytic enzyme family 9 was isolated, and a restriction map was created and sequenced. U. The sequencing is performed by inserting a DNA fragment containing the endoglucanase gene belonging to glycolytic enzyme family 9 into an appropriate cloning vector (for example, a pUC-based vector such as pUC19) and the method of Sanger et al. be able to.
  • an appropriate cloning vector for example, a pUC-based vector such as pUC19
  • nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 28 encoding endoglucanase belonging to the family 9 of glycolytic enzymes derived from Phaneroquette chrysosporium was determined. Furthermore, the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence analysis was found to be the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 29 consisting of 592 amino acid residues.
  • the DNA fragment of the endodalcanase gene belonging to glycolytic enzyme family 9 can be obtained by PCR from the DNA fragment containing the dongglucanase gene belonging to glycolytic enzyme family 9 described above.
  • a PCR primer a sequence consisting of about 10 to 50 bases, preferably about 15 to 30 bases, based on the base sequence represented by SEQ ID NO: 28 and its complementary sequence, is a sense primer. It can be used as an antisense primer.
  • DNA encoding an antisense RNA that is substantially complementary to all or a part of the transcript of the cellulolytic enzyme gene derived from the basidiomycete is prepared.
  • antisense RNA refers to a nucleotide sequence comprising a sequence substantially complementary to all or a part of mRNA that is a transcript of the cellulose degrading enzyme gene. However, it means a sequence that binds to mRNA of a cellulolytic enzyme gene that is complementary when present in a cell, thereby inhibiting the translation of the cellulolytic enzyme gene and suppressing its expression.
  • substantially means that this antisense RNA binds to the mRNA to form a double strand, and as long as it inhibits translation of the mRNA into a protein, a deletion, substitution or It means that there may be a change such as addition.
  • the length of the sequence can be appropriately set as long as it can suppress the expression of any of the cellulolytic enzyme genes of the present invention, and it is necessary that the length be equal to the entire nucleotide sequence of the cellulolytic enzyme gene. Is not necessarily required, and may be a length corresponding to a part of the sequence.
  • the nucleotide sequence encoding the 80th amino acid and the 128th amino acid at the heme binding site and the 236-24th amino acid at the flavin adenine dinucleotide (FAD) binding site at positions 2 and 4 preferable.
  • Preparation of antisense RNA and a method using the sequence can be carried out by a conventional method known to those skilled in the art. Specifically, the antisense RNA of the cellulolytic enzyme gene is subjected to a PCR method so that the exon portion of the base sequence of the cellulolytic enzyme gene is obtained, or the cellulolytic enzyme gene is treated with an appropriate restriction enzyme. Can be obtained by cutting. It can also be obtained from cDNA of the cellulolytic enzyme gene. Furthermore, the antisense RNA may be synthetic RNA artificially created based on the base sequence information of the cellulose degrading enzyme gene.
  • “so that the antisense RNA of the cellulolytic enzyme gene is produced by transcription” means that the transcription of the DNA encoding the antisense RNA into the mRNA under the action of a promoter in the host is performed. When it occurs, an antisense RNA capable of binding to mRNA from the cellulose degrading enzyme gene of the present invention to form a double strand and suppressing the expression of the cellulose degrading gene is produced. Means to be done.
  • DNA encoding antisense RNA is bound downstream of the DNA fragment having the promoter sequence in the antisense direction (reverse direction), and the promoter is activated. It may be transcribed into mRNA. The resulting mRNA is an antisense RNA of the base sequence of the cellulolytic enzyme gene.
  • a promoter gene may be a gene fragment having a promoter action. Any gene can be used without particular limitation. For example, a GPD promoter, a ras gene promoter and the like can be mentioned. These promoter genes can also be obtained by well-known genomic cloning or PCR based on sequences registered in gene banks, sequences described in literatures, and the like. Alternatively, for the deposited genes, those available upon request for distribution can be used.
  • the DNA containing the promoter sequence and the cellulase degrading enzyme gene or the DNA coding for the antisense RNA of the gene may be introduced with appropriate DNA ligase after introduction of a restriction site, blunt-end or cohesive end if necessary. Can be used for concatenation. Recombinant DNA techniques including cloning, ligation, PCR, etc. are described, for example, in J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, and Short Protocols In Molecular Biology, Third. Edition, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. can be used.
  • the type of vector is not particularly limited, but is selected according to the type of host transformed with this vector.
  • a vector capable of autonomous replication in a prokaryotic or eukaryotic host cell or capable of homologous recombination in a chromosome can be used. Plasmids, viruses, including phages, and cosmids.
  • the vector may appropriately contain a selection marker, an origin of replication, a terminator, a polylinker, an enhancer, a ribosome binding site, and the like.
  • Various vectors for prokaryotic and eukaryotic organisms such as bacteria, fungi, yeasts, animals, and plants are commercially available, or described in the literature and the like.
  • DNA encoding the antisense RNA of the dehydrogenase gene or recombinant DNA can be introduced into the vector.
  • DNA transfer can be performed, for example, using the techniques described in J. Sambrook et al. (Supra). As described above, when a DNA encoding the antisense RNA of the cellobiose dehydrogenase gene of the present invention or a recombinant DNA is introduced into a vector, the cellobiose dehydrogenase gene of the cellobiose dehydrogenase gene is transcribed as described above. : Introduce to make it work.
  • transformation using the vector is performed to prepare a host cell having a suppressed cellulase-degrading enzyme activity.
  • host cells include not only fungi including basidiomycetes, fungi, and yeasts, but also other eukaryotic cells (animal cells, plant cells, insect cells, algae, etc.) and prokaryotic cells (bacterium, cyanobacteria, etc.). Any host cell can be used as long as it can exhibit promoter activity in the expression of a DNA encoding the antisense RNA of the cellobiose dehydrogenase gene of the present invention.
  • preferred host cells are basidiomycetes, and particularly preferred is Coriolus hirstas.
  • auxotrophic mutant 0JI-1078 (FERM BP-4210) deficient in the onorenitin-potency rubamoinoletranferase activity of Choriolas hirstus described in the Examples below can be used as a host. .
  • transformation method examples include the calcium chloride ZPEG method, the calcium phosphate method, the lithium acetate method, the electroporation method, the protoplast method, the spheroplast method, the riboboxyl method, and the aglobataterium method. Not limited.
  • the host cell in which the cellulolytic enzyme activity is suppressed is inoculated on a wood chip and treated.
  • wood chips refers to wood obtained by mechanically shredding wood to a size of 2 to 3 cras, and includes conifers such as pine, cedar, fir, spruce, Douglas fir, and radita tapaine and beech. Chips of any material type that can be obtained from wood including hardwood such as hippo, alder, alder, eucalyptus, eucalyptus, poplar, acacia, lauan, and rubber and that can be used as a raw material for pulp, etc. Can also be used. Wood chips are treated with cellulolytic enzyme activity-suppressing host cells.
  • Wood chips can be used as they are without pretreatment, provided that the host cells capable of suppressing the activity of cellulose degrading enzyme can grow sufficiently. However, it is better to perform pretreatment to kill other microorganisms. If cells can easily grow, it is preferable to perform a pretreatment for sterilization using an autoclave, steaming, or the like.
  • the temperature at which wood chips are treated with cellulolytic enzyme activity-suppressing host cells is 10 to 6
  • the temperature is preferably 0 ° C, more preferably 20 to 30 ° C.
  • the water content in the wood chips is preferably 20 to 80%, preferably 30 to 50%.
  • the amount of air supplied to the wood chip is not necessary if the host cells capable of inhibiting the activity of cellulolytic enzymes are sufficiently grown.1S Normally, the amount of air supplied per liter of chip volume per minute is 0.001 to 1 LZ ( 1 ⁇ rain) (hereinafter, the unit LZ (1-min) of the air supply amount is referred to as vvm), and preferably 0.01 vvra to 0. lvvm per chip volume.
  • the amount of inoculum of the cellulolytic enzyme activity-suppressed host cells into the wood chip can be appropriately set as long as the pulp yield and paper strength are not reduced.
  • Cellulolytic enzyme activity-suppressed host cells can be pulverized with sterile water, inoculated on a wood chip and cultured, or may be treated by adding a medium to the wood chip. Any medium can be used as long as host cells capable of suppressing the activity of cellulolytic enzyme can grow.
  • a medium can be used as long as host cells capable of suppressing the activity of cellulolytic enzyme can grow.
  • glucose, cellobiose, amorphous cellulose and the like can be used as the carbon source.
  • nitrogen compounds such as yeast extract, peptone, various amino acids, soybean, corn steep liquor, and various inorganic nitrogen can be used. Further, various salts, vitamins, minerals, etc. can be used as needed.
  • Wood chips treated with cellulolytic enzyme activity-suppressed host cells can be used to reduce the defibration energy and paper strength of mechanical pulp such as thermomechanical pulp (TMP), ground pulp (GP), and refiner ground pulp (RGP).
  • mechanical pulp such as thermomechanical pulp (TMP), ground pulp (GP), and refiner ground pulp (RGP).
  • RGP refiner ground pulp
  • chemical pulp such as kraft pulp and sulphite pulp, improved digestibility and increased paper strength can be obtained.
  • the cellulolytic enzyme activity-suppressing host cell used in the method of the present invention is also useful for producing a cellulolytic enzyme, which comprises culturing in a suitable medium and collecting the produced cellulolytic enzyme.
  • the cellulolytic enzyme is expressed in a fusion form with the signal peptide.When translated, it is produced in a secreted form and can be isolated directly from the medium.On the other hand, the cellulolytic enzyme is produced in a non-secreted form. In this case, the cells are separated, the cells are crushed by a treatment such as sonication or homogenizing to obtain an extract, from which the cellulolytic enzyme can be isolated.
  • solvent extraction Salting out, desalting, organic solvent precipitation, ultrafiltration, ion exchange, hydrophobic interaction, HPLC, gel filtration and affinity chromatography, electrophoresis, chromatofocusing, etc., alone or in combination. It can be carried out.
  • a GPD promoter and a ras promoter are linked upstream of the cellulolytic enzyme gene of the present invention, and a large amount of cellulolytic enzyme can be produced by recombinant DNA technology.
  • the promoter is, for example, E. coli JM109 / pCHGP (FERM P-15015), which is a recombinant E. coli containing the GPD promoter gene derived from Coriolus' Hilstas, and E. coli which is a recombinant E. coli containing the ras promoter gene derived from Coriolus Hirstas E It can be prepared from E. coli DH5a / pCHRAS (FERM P-17352).
  • the protein (cellobiose dehydrogenase) encoded by the cellobiose dehydrogenase gene used in the method of the present invention has the following physicochemical properties.
  • Cellobiose dehydrogenase activity was measured by the method described in Method m Enzyraology (Wood et al, Vol. 60, Academic press, INC. Calfornia. That is, dichlorophenol indofuninol (manufactured by Sigma), cellobiose (Kanto Chemical Co., Ltd.) Cellobiose dehydrogenase was added to an acetate buffer of pH 5 and 50 mM dissolved at 0.33 mM and 0.67 mM, respectively, and allowed to react at 37 ° C. When the absorbance (optical path length 1 cm) of the phenol indophenol was measured continuously at a maximum absorption wavelength of 550 nm, the results shown in FIG. 1 were obtained.
  • the measurement of the SEIC-Bios dehydrogenase activity was performed as follows. 0 ⁇ 67mM dichlorophenol indophenol (manufactured by Sigma), 3.3mM cellobiose (manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd.), pH 5, and 250mM acetate buffer were tested in a mixed solution of 250ul, 100ul, and 100ul, respectively. 50 ul of the solution was added and reacted at 37 ° C. After the start of the reaction, the absorbance (optical path length lcra) of dichlorophenol indophenol at a maximum absorption wavelength of 550 nm (molar extinction coefficient 3965 L / mol m) was continuously measured. Regarding the unit of cellobiose dehydrogenase activity, lunit (unit: U) was defined as the amount of an enzyme capable of reducing lumol of dicole in one minute under the above conditions.
  • the optimum pH for the enzyme reaction was 4-6.
  • the enzyme activity was measured after each sample was kept at 50 mM in a predetermined buffer at 4 for 24 hours. The results are shown in Figure 3. This enzyme was stable at pH 2-5.
  • the cellobiose dehydrogenase derived from Coriolus hirstas can be obtained, for example, by culturing Coriolus' hirstas, which produces cellulose biose dehydrogenase, in a medium, and collecting cellobiose dehydrogenase from the resulting culture.
  • a medium for cultivating the above Choriolas hirstus a medium having any composition can be used as long as the bacterium can grow.
  • the nutrient source of the medium those commonly used for cultivation of Coriolus hirstus can be widely used. Any carbon source can be used as long as it can be assimilated, and glucose, pulp, crystalline cellulose, and the like can be used.
  • Any available nitrogen compound may be used as the nitrogen source.
  • yeast extract, peptone, various amino acids, soybean, constellation Emplica and various inorganic nitrogens can be used.
  • various salts, such as vitamins and minerals, can be used as needed.
  • the culture temperature and pH can be appropriately set within a range where Coriolus hirstus can grow.
  • the culture temperature is 20-55 ° C, preferably 25-30 ° C
  • the pH is 3-9, preferably 4-6.
  • Cellobiose dehydrogenase derived from Coriolus hirstas is secreted and produced in the culture medium by culturing Coriolus hirstas under the above conditions. Therefore, the present enzyme is collected from the culture after culturing.
  • the solution collected from the culture can be used as it is as a crude cellobiose dehydrogenase enzyme solution, but cellobiose dehydrogenase can be concentrated or solidified by salting out, ultrafiltration, or lyophilization.
  • purification can be performed by performing ammonium sulfate fractionation, molecular weight fractionation by gel filtration, various ion exchange resins, hydroxyapatite, hydrophobic chromatogram, isoelectric point fractionation, etc., but these methods are repeated. It is also possible to use other purification means in combination, if necessary.
  • Example 1 Preparation of a chromosome DNA library derived from Coriolus hirustas Agar pieces with a diameter of 5 mm were cut out from a plate agar culture of Coriolus hirustas IF04917 with a cork boller, and glucose 'peptone medium (glucose 2%, polyptone) was cut out. 0.5%, yeast extract 0. 2%, K P0 4, MgS0 4 0. 05%, was inoculated in p H4. Ltd. 5 two tone) 200 ml with phosphate, was performed 7 days rotational shaking at 28 ° C . After culturing, the cells were collected, washed with 1 L of sterilized water, and frozen with liquid nitrogen.
  • TJP03 / 02058 ⁇ ⁇ g of the resulting chromosome was partially digested with the restriction enzyme Sau3AI, fractionated by 5-20% sucrose density gradient ultracentrifugation (30, OOOrpm, 18 hours), and 20-40 kbp fragment fractions were collected. .
  • This fragment was ligated to Toyobo's phage ⁇ EMBL3-Bam plasmid using T4 DNA ligase, and the resulting phage DNA was packaged using STRATAGENE's Gigapack Gold.
  • the DNA library was used.
  • a clone containing the mouth biose dehydrogenase gene was selected by plaque hybridization. This series of operations was performed according to the 'hanging' method of Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual / 2nd Edition (1989).
  • the probe used for plaque hybridization was obtained by labeling a synthetic oligomer having the following sequence at its 3 'end with fluorescein using an oligo DNA labeling kit manufactured by Amersham. As a result, four positive clones could be selected from about 40,000 plaques.
  • Recombinant phage DNA prepared from positive clones according to a conventional method was digested with various restriction enzymes, and Southern hybridization was performed using the above-mentioned synthetic DNA. As a result, in the fragment obtained by digestion with the restriction enzyme XhoI, different clones that hybridized to the probe as 5.3 kbp and 7.2 kbp DNA bands were observed.
  • the above 7.2 kbp and 5.3 kbp DNA fragments were excised by agarose gel electrophoresis, subcloned into the Xhol site of the E. coli vector pBluescriptll SK +, and transformed into E. coli JMl09.
  • a large amount of subcloned DNA was prepared, purified by ultracentrifugation (50,000 rpm, 16h, 15 ° C), and the nucleotide sequence was determined.
  • the nucleotide sequence was determined using a sequencing kit manufactured by United States Biochemical.
  • the nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 1 and 3.
  • the cellobiose dehydrogenase gene derived from C. Had been separated by introns.
  • amino acid sequences (SEQ ID NOs: 2 and 4) deduced from their nucleotide sequences, respectively, showed high similarity to the cellobiose dehydrogenase gene reported so far.
  • Plaque hybridization was carried out in the same manner as in Example 2, and the probe used was a synthetic oligomer having the following sequence, which was prepared based on the base sequence of the cellobiohydrolase I gene isolated from other species, and manufactured by Amersham. This was labeled with fluorescein at the 3 end using a DNA labeling kit.
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the cellobio hydrolase I-11 gene derived from C. hirstus was separated by two introns.
  • the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 8.
  • Plaque hybridization was performed in the same manner as in Example 2.
  • the probe used was the synthetic oligomer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 used in Example 3 using an oligo DNA labeling kit manufactured by Amersham, Inc., and the end was fluorescein. Marked with You.
  • Recombinant phage DNA prepared from positive clones according to a conventional method was digested with various restriction enzymes, and Southern hybridization was performed using the above-mentioned synthetic DNA. As a result, in the fragment obtained by digestion with the restriction enzyme Sail, a clone hybridizing to 4.2 kbp as a single DNA band was observed.
  • Plaque hybridization was performed in the same manner as in Example 2, and the probe used was the synthetic oligomer having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 used in Example 3 using an Amersham Oligo DNA Labeling Kit. It is labeled with.
  • Recombinant phage DNA prepared from a positive clone by a conventional method was digested with various restriction enzymes, and Southern hybridization was carried out using the above-mentioned synthetic DNA. As a result, in the fragment obtained by digestion with the restriction enzymes EcoRI and BaraHI, a clone hybridizing to 4.6 kb as a single DNA band was observed.
  • the above-mentioned DNA fragment 4.6 kbp was excised by agarose gel electrophoresis, subcloned into the EcoRI-BamHI site of the E. coli vector PUC19, transformed into the E. coli JM109 strain, and the celliobiohydrolase I-13 gene derived from Coriolus 'Hilstas' was isolated. The resulting plasmid pCHCBHI31 was obtained. The nucleotide sequence of the subcloned DNA fragment was determined.
  • the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 11.
  • the cellobio hydrolase I-13 gene derived from C. hirstus was separated by two introns.
  • the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 12.
  • Plaque hybridization was carried out in the same manner as in Example 2, and the probe used was a synthetic oligomer having the following sequence, which was prepared based on the base sequence of the cellobiohydrolase II gene isolated from other species, and manufactured by Amersham. This was labeled with fluorescein at the 3 end using an Oligo DNA Labeling Kit manufactured by Toshiba Corporation.
  • втори ⁇ clones could be selected from about 100,000 plaques.
  • Recombinant phage DNA prepared from positive clones according to a conventional method was digested with various restriction enzymes, and Southern hybridization was performed using the above-mentioned synthetic DNA. As a result, a clone hybridizing to 5.0 kbp as a single DNA band was found in the fragments obtained by digestion with the restriction enzymes EcoRV and Ncol.
  • the 5.0 kbp DNA fragment obtained was excised by agarose gel electrophoresis, and the E. coli vector pUC19 was excised.
  • the plasmid was subcloned into a Smal site to obtain a plasmid pCHCBHII containing a cellohydrohydrase ⁇ ⁇ ⁇ gene derived from Coriolus hirstas. This plasmid was transformed into E. coli strain JM109.
  • the nucleotide sequence of the subcloned DNA fragment was determined. The nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 14.
  • RNA was recovered using the frozen cells by the guanidine hydrochloride method, and then poly (A) + RNA was prepared using Oligotex-dT super> mRNA Purification kit manufactured by Takara Shuzo. Furthermore, cDNA was synthesized using a cDNA synthesis kit manufactured by STRATAGENE, and an EcoRI site was added to the 5 'side, and an Xhol site was added to the 3 side, and inserted into the EcoRI-Xhol site of the L ZAPII vector. A cDNA library was identified using an in vitro packaging kit.
  • Example 8 Isolation of a gene from endolycanase belonging to glycolytic enzyme family 61 from a Coriolus hirustus cDNA library
  • Plasmids were formed by appropriately diluting the cDNA library solution prepared in Example 7 so that plaques could be isolated on a Petri dish, infecting Escherichia coli XL1 Blue MRF strain, and culturing at 37 ° C for 1 ⁇ . I let it.
  • the obtained single plaque was suspended in SM buffer, and PCR was performed using the M13 (-20) primer (GTAAAACGACGGCGCCAGT: SEQ ID NO: 16), which is a universal primer for sequence, and the M13 Reverse primer (GGAAACAGCTATGACCATG: SEQ ID NO: 17).
  • M13 (-20) primer GTAAAACGACGGCGCCAGT: SEQ ID NO: 16
  • GGAAACAGCTATGACCATG SEQ ID NO: 17
  • the cDNA library solution prepared in Example 7 was diluted appropriately so that plaques could be isolated on a Petri dish, and infected to Eschericia coli XL1 Blue MRF 'strain. ⁇ Plaque was formed by culturing. The obtained single plaque was suspended in SM buffer, and PCR was performed using the M13 (-20) primer (GTAAAACGACGGCCAGT: SEQ ID NO: 16), which is a universal primer for sequence, and the M13 Reverse primer (GGAAACAGCTATGACCATG: SEQ ID NO: 17). Was performed to amplify the cDNA fragment. The nucleotide sequence of the cDNA fragment thus obtained was analyzed at random.
  • Glucose Peptone medium (2% glucose, polypeptone 0.5%, yeast E key scan 0. 2%, KH 2 P0 4 , MgS0 4 0. 05%, p H4 phosphate. 5 for preparation) medium 100 m 1
  • a 5 mm-diameter agar piece was punched out from a plate agar culture of Funeroquette chrysosporium ATCC 34541 strain with a cork borer, 5 pieces were inoculated, and cultured with shaking at 30 ° C. for 5 days. After the culture, the cells were collected and frozen with liquid nitrogen. 5 g of the frozen cells were powdered using a mortar.
  • the crushed cells were transferred to a centrifuge tube, and 10 ml of a lysis buffer (100 mM Tris (pH 8), lOOmM EDTA. LOOmM NaCl, and proteinase K added to 100; _ig / ml) were added. Incubated at 55 ° C for 3 hours. After the incubation, phenol treatment and black-mouthed form treatment were performed. Ethanol was gradually added to the aqueous layer, and when the DNA was precipitated, the chromosomal DNA was wound and suspended in a TE solution to obtain a phanerochete chrysosporium chromosome DNA solution.
  • a lysis buffer 100 mM Tris (pH 8), lOOmM EDTA. LOOmM NaCl, and proteinase K added to 100; _ig / ml
  • the obtained base sequence is shown in SEQ ID NO: 24.
  • the endodalcanase gene belonging to the glycolytic enzyme fuamily 5 derived from Faneroquette chrysosporium was separated by 15 introns.
  • the amino acid sequence deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 25.
  • the obtained nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 28.
  • the endorcanase gene belonging to the glycolytic enzyme family 9 derived from Faneroquette thalisosporum was separated by seven introns.
  • the amino acid sequence deduced from the base sequence is shown in SEQ ID NO: 29.
  • Example 1 2 Construction of an expression vector for the C. hirstus-derived cellobio-sydhydrogenase gene driven by Coriolus' Hilstas-derived daricellaldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene promoter
  • the structural gene region of the cellobiose dehydrogenase gene is ligated downstream of the Choriolas hirstas promoter, and the celloobiose dehydrogenase gene promoter region is replaced with the cellulose aldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene promoter region from the original cellobiose dehydrogenase gene. It was used as a dehydrogenase gene expression vector.
  • fragment 1 obtained by digestion of the chromosome gene of Daricelaldehyde 3-phosphate dehydrogenase EcoRI and BamHI was obtained.
  • the fragment 1 was ligated to the Eco RI, 8 & 111111 sites of the phage vector Ml 3 mp 18 using 4 DNA ligase, and the resulting fragment was transformed into E. coli J Ml 09 strain to obtain single-stranded phage. DNA was prepared.
  • the DNA primer shown in SEQ ID NO: 30 was synthesized, annealing was performed on the single-stranded phage DNA, and only one region of the promoter of the GPD gene was synthesized by the primer extension method, and the restriction enzyme Eco RI (Takara Shuzo) A 0.9 kbp DNA fragment (fragment 2) was prepared by digestion with. 5, -CATGGTGTGTGGTGGATG-3 '(SEQ ID NO: 30)
  • the plasmid pCHCDH1 was transformed into type I and extended by PCR with the primers shown in SEQ ID NOS: 31 and 32. A DNA fragment of about 3.5 kbp was obtained (fragment 3).
  • a 0.9 kb fragment 2 of the darisel aldehyde 3-phosphate dehydrogenase gene promoter region was obtained.
  • the obtained fragment 2 was ligated to the EcoRI-Small site of pUC18 using T4 DNA ligase, and the E. coli JMl09 strain was transformed.
  • a plasmid into which 2 of the above fragment was inserted was isolated and named pCHGP1.
  • This pCHGP1 was digested with a restriction enzyme NcoI-XbaI to prepare a vector portion (fragment 4).
  • a plasmid pBSMPOGl (FERMP-14933) containing a manganese peroxidase gene derived from Coriolus hirustas was purified by the PCR method using the following two primers (SEQ ID NOS: 35, 36).
  • SEQ ID NOS: 35, 36 The C-terminal untranslated region was amplified and digested with restriction enzymes XbaI and Hindill to obtain a DNA fragment of about 1 kb (fragment 7).
  • the E. coli JMl09 strain was transformed, and the DNA fragment of the above fragment 7 was forwardly transformed from the ampicillin-resistant transformant.
  • the plasmid introduced in step was isolated and named pGPCD HAM.
  • Plasmid pGPCDHAM obtained in Example 13 was digested with restriction enzymes NcoI and XbaI to prepare a DNA fragment of a vector portion (fragment 8).
  • a plasmid pCHCBHI26 containing the cellobio hydrolase I gene derived from C. cholerae Hilstas obtained in Example 3 was subjected to a PCR reaction using two primers to amplify a DNA fragment of about 75 bp. After that, a DNA fragment was obtained by digestion with restriction enzymes NcoI and XbaI (fragment 9).
  • the isolated plasmid is called pGPCBHI26. Named AM.
  • Example 15 Construction of a plasmid having an antisense sequence of cellobiohydrolase I gene derived from Coriolus hirustas
  • the plasmid pGPCDHAM obtained in Example 13 was digested with restriction enzymes NcoI and XbaI to prepare a DNA fragment of a vector portion (fragment 8).
  • a plasmid pCHCBHI27 containing the celliohydrolase I gene derived from Coriolus hirustas obtained in Example 4 was subjected to a PCR reaction using two primers, and a DNA fragment of about 750 bp was obtained. After amplification, a DNA fragment was obtained by digestion with restriction enzymes NcoI and XbaI (fragment 10).
  • E. coli JM109 strain After mixing fragment 8 and fragment 10 and ligating with T4DNA ligase, E. coli JM109 strain was transformed, and the DNA fragment of fragment 10 was inserted from the ampicillin-resistant transformant.
  • the isolated plasmid was named pGPCBHI27AM.
  • the plasmid pGPCDHAM obtained in Example 13 was digested with restriction enzymes NcoI and XbaI to prepare a DNA fragment of the vector portion (fragment 8).
  • a PCR reaction was performed on the plasmid pCHCBHI31 containing the cellobio hydrolase I gene derived from Coriolus hirstus obtained in Example 5 using two primers to amplify a DNA fragment of about 750 bp. After that, a DNA fragment was obtained by digestion with restriction enzymes NcoI and XbaI (fragment 11).
  • Plasmid pGPCDHAM obtained in Example 13 was digested with restriction enzymes NcoI and XbaI to prepare a DNA fragment of a vector portion (fragment 8).
  • a PCR reaction was performed using two primers on the plasmid pCHCBHII containing the cellobio hydrolase I gene derived from C. hirstus obtained in Example 6, and a DNA fragment of about 600 bp was amplified. Thereafter, a DNA fragment was obtained by digestion with restriction enzymes NcoI and XbaI (fragment 12).
  • the above fragment 8 and fragment 12 were mixed and ligated with T4 DNA ligase, followed by transformation of Escherichia coli JM109 strain. From the ampicillin-resistant transformant, the plasmid into which the DNA fragment of fragment 12 was inserted was inserted. Was isolated and named pGPCBHIIAM.
  • Plasmid pGPCDHAM obtained in Example 13 was digested with restriction enzymes NcoI and XbaI to prepare a DNA fragment of a vector portion (fragment 8).
  • a PCR reaction was performed using the following two primers on the endoglucanase cDNA gene belonging to the glycolytic enzyme family 61 derived from Coriolus hirstus obtained in Example 12, using the following two primers.
  • the DNA fragment was obtained by digestion with restriction enzymes Ncol and XbaI (fragment 13).
  • the above fragment 8 and fragment 13 were mixed and ligated with T4 DNA ligase, followed by transformation of Escherichia coli JMl09 strain. From the ampicillin-resistant transformant, the DNA fragment of fragment 13 was introduced. Was isolated and named pGPEG61AM.
  • Plasmid pGPCDHAM obtained in Example 13 was digested with restriction enzymes NcoI and XbaI to prepare a DNA fragment of a vector portion (fragment 8).
  • a PCR reaction was carried out on the endoglucanase cDNA gene belonging to the glycolytic enzyme family 11 derived from Coriolus hirustas obtained in Example 9 using the following two primers, and a PCR reaction of about 700 After amplifying the bp DNA fragment, the DNA fragment was obtained by digestion with restriction enzymes Ncol and XbaI (fragment 13).
  • the above fragment 8 and fragment 13 were mixed and ligated with T4 DNA ligase, followed by transformation of Escherichia coli JMl09 strain.
  • the DNA fragment of fragment 13 was inserted from the ampicillin-resistant transformant.
  • a plasmid was isolated and named pGPEG12AM.
  • Example 20 Construction of a plasmid having an antisense sequence of an endoglucanase gene belonging to family 5 derived from Pseudomonas chrysosporium.
  • Plasmid pGPCDHAM obtained in Example 13 was eliminated with restriction enzymes NcoI and XbaI to prepare a DNA fragment of a vector portion (fragment 8).
  • a PCR reaction was performed on the endoglucanase gene belonging to the glycolytic enzyme family 15 derived from Faneroquette chrysosporium obtained in Example 10 using the following two primers, and a DNA of about 600 bp was obtained.
  • a DNA fragment was obtained by digestion with restriction enzymes NcoI and XbaI (fragment 15).
  • the above fragment 8 and fragment 15 were mixed and ligated with T4 DNA ligase, followed by transformation of Escherichia coli JM109 strain. From the ampicillin-resistant transformant, the DNA fragment of fragment 14 was introduced. Was isolated and named pGPPCEG5AM.
  • Example 21 Construction of a plasmid having an antisense sequence of an endoglucanase gene belonging to family 9 derived from Phaneroquette 'chrysosporium Plasmid pGPCDHAM obtained in Example 13 was digested with restriction enzymes NcoI and XbaI to prepare a DNA fragment of a vector portion (fragment 8). Next, a PCR reaction was performed using the following two primers on the endoglucanase gene belonging to the glycolytic enzyme fuamily 9 derived from Faneroquette thalysosporium obtained in Example 11 to obtain a DNA fragment of about 500 bp. After amplification, the DNA fragment was obtained by digestion with restriction enzymes NcoI and XbaI (fragment 16).
  • the above fragment 8 and fragment 16 were mixed and ligated with T4 DNA ligase, followed by transformation of Escherichia coli JM109 strain. From the ampicillin-resistant transformant, the DNA fragment of fragment 15 was introduced.
  • the isolated plasmid was isolated and named pGPPCEG9AM.
  • SMY medium 1% sucrose, 1% malt extract, 0.4% yeast extract
  • SMY medium 1% sucrose, 1% malt extract, 0.4% yeast extract
  • a piece of agar with a diameter of 5 mm was punched out from a plate agar medium of Coriolus' Hilstas 0JI-1078 strain with a cork boller, inoculated into an SMY medium, and incubated at 28 ° C for 7 days (preculture). However, in order to subdivide the hypha, it was shaken once or twice a day.
  • SMY medium 200 ml of the SMY medium was dispensed into a 1-L Erlenmeyer flask, a rotor was further added, and after sterilization, the precultured hypha was collected by filtration with a nylon mesh (pore size: 30 Aim), and the entire volume was inoculated. And cultured at 28 ° C. The mycelium was fragmented by stirring with a stirrer for about 2 hours a day. This culture was performed for 4 days.
  • the liquid culture mycelium was collected by filtration with a nylon mesh (pore diameter: 30 m) and washed with an osmotic pressure adjusting solution (0.5 M Mg S04, 50 ml maleic acid buffer (pH 5.6)).
  • an osmotic pressure adjusting solution 0.5 M Mg S04, 50 ml maleic acid buffer (pH 5.6)
  • the cells were suspended in a cell wall-degrading enzyme solution of lm1 per 100 mg of wet cells, and incubated at 28 ° C for 3 hours with gentle shaking to release protoplasts.
  • the following commercially available enzyme preparations were used in combination as cell wall lytic enzymes.
  • Cellulase 0N0ZUKA RS 5 mg, manufactured by Yakult Co., Ltd., and 10 mg of Yatalase (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) were dissolved in 1 mg of the above osmotic pressure adjusting solution and used as an enzyme solution.
  • the mycelial fragments and protoplasts remaining on the nylon mesh are removed using the osmotic pressure adjusting solution. Washed twice. The resulting protoplast suspension was centrifuged (l, 000kXg, 5 minutes), the supernatant was removed, and 4 ml of 1 M sucrose (20 mM MOPS buffer, pH 6. After resuspension in 3), centrifugation was repeated, and the cells were washed twice with the above 1 M sucrose solution.
  • the precipitate was suspended in 500 ⁇ l of a solution obtained by adding 40 mM calcium chloride to a 1 M sorbitol solution (20 mM MES, pH 6.4) to obtain a protoplast solution. This solution was stored at 4 ° C.
  • Protoplast concentrations were determined by direct microscopy using a hemocytometer. All centrifugation steps were performed at 1,000 X g for 5 minutes at room temperature in a swing rotor.
  • plasmid p GP CDH 1 prepared (2 mu g) in Example 1 2. Further, as a selection marker, plasmid p UCR1 (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 6-0504691; FERM BP-4201) carrying the onolenitin canolebamoinoretransferase gene derived from Coriolus hinorestas was 0.2. g was added and the mixture was ice-cooled for 30 minutes.
  • a PEG solution (50% PEG3400, 20 mM OPS (pH 6.4)) was added to the liquid volume, and the mixture was cooled on ice for 30 minutes.
  • the mixture was mixed with a minimal agar medium (agar 1%) containing 0.5 M sucrose and leucine and spread on a plate.
  • the plate was cultured at 28 ° C. for several days to obtain a transformant. Further, DNA was prepared from the transformant, and it was confirmed by Southern hybridization that the target cellobiose dehydrogenase gene expression plasmid pGPCDH1 was incorporated.
  • Example 23 Preparation of a Choriolas hirstus transformant that highly secretes and produces cellobiose dehydrogenase
  • Example 2 The transformant obtained in 2 glucose peptone medium (Darko one scan 30 g / l, polypeptone 10g / l, KH 2 P0 4 l. 5g / l, MgS0 4 0. 5g / l, hydrochloric acid Thiamine (2 mg / l, adjusted to ⁇ 4.5 with phosphoric acid) was inoculated into a 300 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml each, and cultured with shaking at 28 ° C. and 100 rpm.
  • the cellobiose dehydrogenase activity was measured over time using the cellobiose dehydrogenase activity measurement method described above. It was 0.02 U / ml in the control, but 0.2 U / ml in the transformant.
  • Example 24 Selection of a transformant in which cellobiose dehydrogenase activity was suppressed
  • the plasmid pGPCDHl shown in the transformation method shown in Example 22 was used to produce pGPCDH prepared in Example 13 Transformation was performed in place of AM.
  • the obtained transformants were bleached with oxygen after bleaching hardwood pulp (L0KP) and peptone medium (L0KPl ° /., Polypeptone 0.5%, yeast extract 0.2%, KH 2 P0 4 0.15 ° , MgS04.05 ° /., Adjusted to pH 4.5 with phosphoric acid) in a 300 ml Erlenmeyer flask containing 100 ml each, and cultured with shaking at 28 ° C and 100 rpm.
  • L0KP hardwood pulp
  • peptone medium L0KPl ° /., Polypeptone 0.5%, yeast extract 0.2%, KH 2 P0 4 0.15 ° , MgS04.05 ° /., Adjusted to pH 4.5 with phosphoric acid
  • Chip treatment was performed according to Example 25 using radita-tapain material.
  • the treated wood chips are beaten using a laboratory refiner (manufactured by Kumagai Riki Co., Ltd.) to a Canadian standard fineness of 200 ml, and hand-made sheets for pulp physics tests are prepared using the Tappi test method.
  • physical tests of pulp handmade sheets were performed in accordance with Tappi method T220 om-83.
  • a power meter (Hiokidenki raodel3133) and an integrator (model3141) were used for the power consumption.
  • In the chip yield measurement 1 kg of wood chips containing water was taken out into a container by absolute dry weight, the chip dry weight before and after the treatment was measured, and the chip yield was calculated using the following equation.
  • the pulp obtained above was subjected to a four-stage bleaching process of D—E—P—D as shown below.
  • D chlorine dioxide
  • the pulp concentration was adjusted to 10% by mass
  • 0.4% by mass of chlorine dioxide was added, and the treatment was performed at 70 ° C for 40 minutes.
  • the pulp concentration was adjusted to 10% by mass
  • caustic soda was added at 1% by mass B, and an alkali extraction treatment (E) was performed at 70 ° C for 90 minutes.
  • the pulp concentration is adjusted to 10% by mass, 0.5% by mass of hydrogen peroxide and 0.5% by mass of caustic soda are added in sequence, and the mixture is treated at 70 ° C for 120 minutes.
  • Hydrogen oxide treatment (P) was performed.
  • the pulp concentration was adjusted to 10%, 0.25% by mass of chlorine dioxide was added, and chlorine dioxide treatment (D) was performed at 70 ° C for 180 minutes.
  • a bleached pulp having a whiteness of 86.0% according to JIS P 8123 was obtained.
  • Controll is prepared by processing wood chips without microbial treatment.
  • Example 29 Selection of transformant in which cellobiohydrolase I activity was suppressed
  • the plasmid pGPCDHl shown in the transformation method shown in Example 22 was used to produce pGPCBHI 26 prepared in Example 14. Transformation was performed in place of AM.
  • the obtained transformant was cultured in the same manner as in Example 24, and subjected to cellobiohydrolase I assay using 4-methyl-0-umbellifferyl-cellobioside as a substrate. Cellobiohydrolase I activity was measured over time. As a result, transformants with up to 60% inhibition of cellobiohydrolase I activity are obtained. I was able to.
  • Eucalyptus wood was subjected to chip treatment in the same manner as in Example 25 using the transformant which had been selected in Example 29 and which had suppressed the S. biohydrolase I activity.
  • Chip treatment was carried out in accordance with Example 25 using radita-tapain material, and the same test as in Example 26 was performed. As shown in Table 6, the transformant in which cellohydrohydrase I activity was suppressed was able to suppress the decrease in yield and to reduce the fibrillation energy. In addition, both tear strength and burst strength increased. When treated with wild strains, the effect of reducing defibration energy was obtained, but paper strength was reduced. Table 6
  • Example 30 The chips treated in Example 30 were digested in the same manner as in Example 27.
  • Controll is a pulp sheet prepared by wood chip treatment without microbial treatment.
  • Example 34 Selection of a transformant in which cellobiohydrolase I activity was suppressed
  • the plasmid pGPCDHl shown in the transformation method shown in Example 22 was used to prepare pGPCBHI2 prepared in Example 15 Transformation was performed at 7 AM.
  • Get The transformed transformant was cultured in the same manner as in Example 26, and the cellobiohydrolase I activity was measured using the method for measuring cellobiohydrolase I activity using 4-methyl-0-umbel lifferyl-cellobioside as a substrate. was measured over time. As a result, it was possible to obtain a transformant in which the mouth biohydrolase I activity was suppressed by 70% at the maximum.
  • Example 34 Using the transformant obtained in Example 34, radiata pine was subjected to chip treatment according to Example 25, and the same test as in Example 26 was performed. As shown in Table 9, the transformant in which the S. lipobiohydrolase I activity was suppressed was able to suppress the decrease in yield and to reduce the fibrillation energy. In addition, both tear strength and burst strength increased. When treated with wild strains, the effect of reducing defibration energy was obtained, but paper strength was reduced. Table 9
  • Example 37 Digestion of chips treated with a transformant having suppressed cellobiohydrolase I activity After the eucalyptus chips were treated in accordance with Example 25, the treated chips were digested in the same manner as in Example 27.
  • Example 37 The pulp obtained in Example 37 was subjected to measurement of strength value and the like according to Example 28. As shown in Table 10, treatment of the wood chips with the transformants and wild strains reduced the Ka value after digestion, increased the selection yield, and decreased the cake fraction. In addition, as shown in Table 11, the transformant did not cause a decrease in paper strength when compared with the wild-type strain. Table 10
  • Example 39 Selection of a transformant in which cellobiohydrolase I activity was suppressed
  • the plasmid pGPCDHI shown in the transformation method shown in Example 22 was used to prepare pGPCBHI prepared in Example 16 Transformation was performed at 31 AM.
  • the obtained transformant was cultured in the same manner as in Example 24, and the cellobiohydrolase I activity was measured using the method for measuring cellobiohydrolase I activity using 4 methyl-0-umbellifferyl-cellobioside as a substrate. was measured over time. As a result, it was possible to obtain a transformant in which the mouth biohydrolase I activity was suppressed by 70% at the maximum.
  • Example 39 chip treatment was carried out on radita-tapain according to Example 25, and the same test as in Example 26 was performed.
  • Chip yield (%) 99. 8 98. 3 94. 7 Angular ⁇ energy (Kw h / ton) 2560 1820 1840 Ratio Tear (mN'm 2 / g) 7. 92 8. 35 6. 95 ratio burst strength (kPa 'm 2 / g) 1. 35 1 . 43 1. 21
  • the chips obtained from Example 39 were subjected to digestion of treated chips in the same manner as in Example 27.
  • Example 42 The pulp obtained in Example 42 was subjected to measurement of a power value according to Example 28. As shown in Table 13, treatment of wood chips with the transformants and wild strains reduced the Ka value after digestion, increased the selective yield, and decreased the cake fraction. In addition, as shown in Table 14, the transformant did not cause a decrease in paper strength when compared with the wild-type strain. Table 13
  • Control Transformant Wild strain PFI (rev) 2, 600 2, 200 2, 200 Specific tear strength (mN'mVg) 9.4 9.1 8.5 Break length (km) 8.62 8.61 '7.34 Non-rupture strength (kPa'mVg) 6.76 7.73 7.54 Folding strength (LogT) 2.31 2.35 2.19 Note) Control is a pulp sheet prepared by processing wood chips without microbial treatment.
  • Example 44 Selection of transformant with suppressed cellobiohydrolase II activity
  • the plasmid pGPCDHl shown in the transformation method shown in Example 22 was changed to pGPCBHIIAM prepared in Example 17 For transformation.
  • the obtained transformant was cultured in the same manner as in Example 23, and the cultured cells were sampled with time, the mRNA was recovered, and the abundance of the cellobiohydrolase II gene was measured. As a result, it was possible to obtain a transformant in which the cellobiohydrolase II activity was suppressed by about 50% as compared with the host cell.
  • Example 44 chip treatment was carried out on radia-tapain according to Example 25.
  • the wood chips after the treatment were examined for paper strength and the like by the method described in Example 26.
  • Table 15 the transformed strain in which the cellobiohydrolase II activity was suppressed was able to suppress the decrease in yield and was able to reduce the fibrillation energy.
  • both tear strength and burst strength increased.
  • Table 15 Influence of wood chip treatment using microbes with reduced activity on mechanical pulp
  • Example 45 The chips obtained in Example 45 were subjected to digestion of treated chips in the same manner as in Example 27.
  • Example 47 The pulp obtained in Example 47 was subjected to measurement of a power value according to Example 28. As shown in Table 16, when wood chips were treated with the transformants and wild strains, the Ka value after digestion decreased, the selection yield increased, and the cake ratio decreased. In addition, as shown in Table 17, the transformant did not cause a decrease in paper strength when compared with the wild type.
  • Controll is a pulp sheet prepared by wood chip treatment without microbial treatment.
  • Transformation was performed by replacing the plasmid pGPCDHl shown in the transformation method shown in Example 22 with pGPEG61AM prepared in Example 18.
  • the obtained transformant was cultured in the same manner as in Example 23, and the culture solution was sampled with time to measure carboxymethylcellulose (CMC) degrading activity.
  • CMC carboxymethylcellulose
  • Example 50 Chip treatment using a transformant in which endoglucanase activity belonging to glycolytic enzyme family 41 is suppressed
  • a transformant selected from Example 49 and having the suppressed endalcanase activity and belonging to glycolytic enzyme fuamily 61 was treated with a chip on Euryri wood according to the method described in Example 25.
  • Example 51 Production of mechanical pulp using a transformant in which the endalcanase activity belonging to glycolytic enzyme fuamily 61 was suppressed
  • Example 49 The transformant obtained in Example 49 was subjected to chip treatment on radiata pine according to Example 25.
  • the treated wood chips were prepared according to the method described in Example 26.
  • Table 18 the transformant which inhibited endoglucanase activity belonging to glycolytic enzyme fuamily 61 was able to suppress the decrease in yield and to reduce the fibrillation energy.
  • both tear strength and burst strength increased.
  • Treatment with a wild strain reduced the fibrillation energy but reduced paper strength.
  • Example 52 Digestion of a chip treated with a transformant that inhibits endoglucanase activity belonging to glycolytic enzyme family 41
  • Example 50 The chips obtained in Example 50 were subjected to digestion of treated chips by the method described in Example 27.
  • Example 52 The pulp obtained in Example 52 was subjected to measurement of monovalent kappa according to the method described in Example 28. As shown in Table 19, treatment of the wood chips with the transformants and wild strains reduced the Ka value after digestion, increased the selective yield, and decreased the lees rate. In addition, as shown in Table 20, the transformant did not cause a decrease in paper strength when compared with the wild-type strain. Table 19
  • Controll is a pulp sheet prepared by wood chip treatment without microbial treatment.
  • Transformation was performed by replacing the plasmid pGPCDH1 shown in the transformation method described in Example 22 with pGPEG12AM prepared in Example 19.
  • the obtained transformant was cultured in the same manner as in Example 23, and the culture solution was sampled with time to measure carboxymethylcellulose (CMC) degrading activity.
  • CMC carboxymethylcellulose
  • Example 55 Chip treatment using a transformant having suppressed endoglucanase activity belonging to glycolytic enzyme family 12
  • a transformant selected from Example 54 and belonging to glycolytic enzyme fuamily 12 and having suppressed endalcanase activity was subjected to chip treatment on Euryri wood by the method described in Example 25.
  • Example 54 The transformant obtained in Example 54 was subjected to chip treatment in accordance with Example 25 on radita-tapain material.
  • the wood chips after the treatment were examined for paper strength and the like by the method described in Example 26.
  • Table 21 the transformant which inhibited the endoglucanase activity belonging to glycolytic enzyme family 12 was able to suppress the decrease in yield and to reduce the fibrillation energy.
  • both tear strength and burst strength increased. Treatment with a wild strain reduced the fibrillation energy but reduced paper strength.
  • Table 2 1 The transformant obtained in Example 54 was subjected to chip treatment in accordance with Example 25 on radita-tapain material.
  • the wood chips after the treatment were examined for paper strength and the like by the method described in Example 26.
  • Table 21 the transformant which inhibited the endoglucanase activity belonging to glycolytic enzyme family 12 was able to suppress the decrease in yield and to reduce the fibrillation energy.
  • both tear strength and burst strength increased. Treatment with a wild strain
  • Example 55 The chips obtained in Example 55 were subjected to vaporization of the treated chips by the method described in Example 27.
  • Example 56 The pulp obtained in Example 56 was subjected to a measurement of a power value according to the method described in Example 28. As shown in Table 22, wood chips were treated with transformants and wild strains. After cooking, the Ka value after digestion decreased, the selective yield increased, and the cake fraction decreased. In addition, as shown in Table 23, when compared with the wild-type strain, the transformant did not cause a decrease in paper strength. Table 22
  • Controll is a pulp sheet prepared by wood chip treatment without microbial treatment.
  • Plasmid p GPCDHI shown in the transformation method described in Example 22 was used. Transformation was performed in place of pGPPCEG5AM prepared in Example 20. The obtained transformant was cultured by the method described in Example 23, the culture solution was collected over time, and the carboxymethylcellulose (CMC) degrading activity was measured. As a result, it was possible to obtain a transformant in which endoglucanase activity was suppressed by about 20% as compared with the host cells.
  • CMC carboxymethylcellulose
  • Example 60 Chip treatment using a transformant in which endoglucanase activity belonging to glycolytic enzyme family 5 was suppressed
  • a transformant strain which was selected in Example 9 and belongs to glycolytic enzyme family 5 and whose endalcanase activity was suppressed, was subjected to chip treatment on Euryri wood according to the method described in Example 25.
  • Example 59 Using the transformant obtained in Example 59, radiata pine was subjected to a chip treatment according to Example 25. The wood chips after the treatment were examined for paper strength and the like by the method described in Example 26.
  • Chip yield (%) 99. 8 98. 2 94. 7 Fibrillation energy (Kw 'h / ton) 2560 1910 1840 Specific tear strength (mN-m 2 / g) 7.92 8. 05 6.95 ratio Burst strength (kPa 'm 2 / g) 1.35 1.34 1.21 [Example 62] Digestion of chips treated with a transformant having suppressed endoglucanase activity belonging to glycolytic enzyme family 1-5
  • Example 60 The chips obtained in Example 60 were digested by the method described in Example 27.
  • Example 62 The pulp obtained in Example 62 was subjected to measurement such as strength value according to Example 28. As shown in Table 25, treatment of wood chips with transformants and wild strains reduced the Ka value after digestion, increased the selection yield, and reduced the cake fraction. In addition, as shown in Table 26, when compared with the wild-type strain, the transformant did not cause a decrease in paper strength. Table 25
  • Transformation was performed by changing the plasmid pGPCDH1 shown in the transformation method described in Example 22 to the pGPPCEG9AM prepared in Example 21.
  • the obtained transformant was cultured by the method described in Example 23, the culture solution was collected over time, and the carboxymethyl cellulose (CMC) degrading activity was measured.
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • Example 65 Chip treatment using a transformant having suppressed endoglucanase activity belonging to glycolytic enzyme family 1-9
  • the eucalyptus wood was subjected to chip treatment by the method described in Example 25 for the transformant selected from Example 64 and belonging to glycolytic enzyme family 9 and having suppressed endalcanase activity.
  • Example 64 chip treatment was carried out on radia-tapain according to Example 25.
  • the wood chips after the treatment were examined for paper strength and the like by the method described in Example 26.
  • Example 65 The chips obtained in Example 65 were subjected to digestion of treated chips in the same manner as in Example 27.
  • Controll is made by processing wood chips that have not been treated with microorganisms.
  • Ryo Biseru (manufactured by Funakoshi Pharmaceutical Co., Ltd.) 1 0% peptone 1. 0%, 0. 005%, KH 2 P0 4 0. 15%, a liquid medium containing thiamine hydrochloride 20 ppb (pH 5. 0) to 100ml It was taken in a 500 ml Erlenmeyer flask, stoppered with paper, and then steam sterilized at 121 ° C for 15 minutes. A platinum loop was inoculated with Coriolus hilutas IF04917, and the cells were cultured at 27 ° C. with rotary shaking (amplitude: 25 mm, 120 round trips / min).
  • the culture supernatant was separated by centrifugation (10,000 rpm ⁇ 10 minutes) to obtain a crude enzyme solution of cellobiose dehydrogenase.
  • the cellobiose dehydrogenase activity in the culture supernatant was 0.07 U / ml 72 hours after the start of the culture.
  • the adsorbed fraction was eluted with a 20 mM phosphate buffer (pH 6.0) with a concentration gradient of ammonium sulfate from 1 M to 0 M, and fractionated in 9 ml portions to obtain an active fraction.
  • This fraction was further subjected to gel filtration by means of HiLoad 26/60 Superdex200 (diameter 2.6 x 60 cm, manufactured by Amasham) equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 6.0) containing 100 mM sodium chloride. Was done. The flow was performed at a flow rate of 1.5 ml / min, and fractionation was performed in 3 ml portions to obtain an active fraction.
  • the fractions were collected and subjected to ion exchange chromatography using P0R0S HQ (diameter 4.6 ⁇ 10 cm, manufactured by ABI) equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 6.0).
  • the adsorbed fraction was eluted with a buffer containing sodium chloride at a concentration gradient from 0 M to LM, and fractionated in 9 ml portions to obtain an active fraction.
  • Glucan-like substances precipitated by freezing and thawing the crude enzyme solution obtained in Example 1 or 2 are removed by centrifugation (20,000 rpm x 10 minutes), and the ammonium sulfate concentration is adjusted to 1 M. Ammonium sulfate was added.
  • the obtained crude enzyme solution was subjected to hydrophobic chromatography using Resource 15PHE (diameter 1.6 ⁇ 3 cm, manufactured by Amasham) equilibrated with 20 mM phosphate buffer ( ⁇ 6.0) containing 1 M ammonium sulfate. .
  • the adsorbed fraction was eluted with a 20 mM phosphate buffer (pH 6.0) with a concentration gradient of ammonium sulfate from 1 M to 0 M, and fractionated in 9 ml portions to obtain an active fraction.
  • This fraction was further subjected to gel permeation chromatography using HiLoad26 / 60 Superdex200 (diameter 2.6 x 60 cm, manufactured by Amasham) equilibrated with 20 mM phosphate buffer ( ⁇ 600) containing 100 mM sodium chloride. Was done. The flow was performed at a flow rate of 1.5 ml / min, and fractionation was performed in 3 ml portions to obtain an active fraction.
  • the fractions were collected and subjected to ion exchange chromatography using monoQ HR 5/5 (diameter 0.5 ⁇ 5 cm, manufactured by Amersham) equilibrated with 20 mM phosphate buffer (pH 6.0).
  • the adsorbed fraction was eluted with a buffer containing sodium chloride at a concentration gradient from 0 M to 0.4 M, and fractionated by lral to obtain an active fraction.
  • the present invention provides a gene encoding a basidiomycete-derived cellulose-degrading enzyme, a transformant transformed with a recombinant vector containing the gene and an antisense gene of the gene, and uses thereof. Pulp production with excellent yield and paper strength by using the antisense gene of the gene encoding the cellulose-degrading enzyme and using the host cell that suppresses the activity of the cellulose-degrading enzyme by genetic recombination for wood chip treatment. It is possible to implement the law. All publications, patents and patent applications cited in this specification are used as Shall be incorporated in the description,

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Description

明 細 書 セルロース分解酵素遺伝子及ぴ該遺伝子の利用 技術分野
本発明は、 セルロース分解酵素をコードする遺伝子のアンチセンス遺伝子を利 用した木材チップの処理方法に関する。 背景技術
紙パルプ工業で製造されているパルプは、 その製造方法により機械パルプと化 学パルプに分けられる。
機械パルプは機械的ェネルギーを用いて木材繊維を物理的に摩砕して製造する。 木材成分をほとんどそのまま含んでいるため、 高い収率で製造することができ、 薄く不透明度の高い紙を作ることができる。 しかしながら、 摩砕のために大きな 電力を必要とすると共に、 紙力強度が出にくいという欠点がある。
前記のような問題を解決し、 かつパルプ収率を低下させない微生物のスクリ一 ニングが広く行われている。 例えば、 ハンノキの一次解繊サーモメカニカルパル プ （TMP) を担子菌であるファネロケェテ ' クリ ソスポリゥム（Phanerochaete chrysosporiura)によりグルコース存在下で処理した後、 二次解繊を行った場合、 2 5から 3 0 %解繊エネルギーが減少したという報告がある（Bar- Lev and T. K. Kirk, Tappi J. , 65， 111, 1982)。 また、 ファネロケェテ 'クリソスポリウ ムとディコミタス ·スクアレンス (Di chomitus squalens)を用レヽ、 アスペン材を処 理した際には、コントロールと比べて紙力強度が増加している（Myers. , Tappi J.， 105， 1988)。 Akamathu らは、 コリオラス · ヒノレスタス（Coriolus hirsutus)を含 む白色腐朽菌 10株を用いポプラ材上に培養し、 パルプ収率、解繊エネルギー、 パ ルプ強度について調べている。 その結果、 コリオラス ' ヒルスタスでは解繊エネ ルギ一が減少し、 結晶化度が増加するなど、 用いた菌株の中ではチップの前処理 菌として好ましいことが示されたが、 同時に収率が約 7 %であった（Akamathu et al. , Mokuzai gakkai shi, 30 (8) 697 - 702， 1984)。 また、 Nishibeらは、 白色腐 朽菌 61種、 85株から予備選抜した 10種類の腐朽菌を使って、 サヮグルミ木片と 針葉樹 2次離解 TMPを微生物分解し、 選択的に脱リグニンを行い、 パルプ繊維の 崩壊が少ないコプリナス · シネレウス（Coprinus cinereus)、 ファネロケェテ · ク リソスポリゥムを選抜し、 グルコースと尿素の存在下では紙力強度の低下が抑え られることを示した。 しかし、 パルプ収率の低下が、 14日間、 30°Cの処理でそれ ぞれ 6. 3%、9. 7%であった。コリオラス'ヒルスタスを用いた場合、収率減は 7. 5% であった（Nishibe et al. , Japan Tappi, 42 (2)， 1988)。 Kashinoらは、 白色腐 朽菌 IZU- 154を自然界からスクリ一二ングし、 ファネロケェテ ' クリソスポリウ ムゃトラメテス 'ベルシカラ（Trametes versicolor)より選択的にリグニンを分角军 し、広葉樹を Ί日間処理した場合、解繊エネルギーが 1/2〜2/3減少することを確 認した。 また、 パルプ強度は約 2倍増加した。 針葉樹を 10〜14 日間処理した場合 では解繊エネルギーが 1/3減少し、 強度増加も得られた。 培地を加えた場合には 7日間で同等の結果を得ることができた（Kashino et al. , Tappi J. , 76 (12)， 167， 1993) o さらに、 米国では最近、 USDA Forest Products Laboratoryのグループを 中心に研究機関、 紙パルプ産業数社から成るリグニンコンソーシアムを形成し、 リグニン分解力が高く、 セルロース分解力の低い菌株のスクリ一二ングを行い、 セリポリォプシス ·サフノ一ミスポラ (Ceriporiops is subvermispora)を自然界カ ¾ ら新たに単離した。 この株を用いて機械パルプの動力削減を検討し、例えば、 TMP の製造エネルギーの 40%近くを削減でき、 このときの収率の低下が 3〜 5 %程度 であり、 心配される紙の強度への悪影響はなく、 むしろ強度が上がっていると報 告してレヽる。 USDA Forest Products Laboratory で ¾既こノ イロ： 卜プラン卜を 建設し、 単離したセリポリオプシス ·サブバーミスボラの実証試験を行っている が、 米国内の工場を想定し、 工場のチップヤードで微生物処理を行うことを考え ている（Scott et al. , Tappi J. , 81. 12. 153, 1998)。 しかし、 チップを保存し ているパイル内部が高温となるため、 高温で効果の得られる菌株が必要とされて いるが、 この単離したセリポリオプシス ·サブバーミスポラは 32°Cまでの温度で しか効果が得られず、 実用面での使用には不適切である。
また、 これまでスクリーニングで得られてきた微生物はリグニン分解の選択性 が必ずしも高くなく、リグニンのみでなく、セルロースも分解されてしまうため、 パルプ収率や紙力低下を生じる。従って、リグニン分解の選択性を高めた微生物、 すなわち、 リグニン分解能力には優れるが、 セルロース分解は抑制する微生物の 取得 ·作製がさらに求められている。
リグニン分解の選択性を高めた変異体は Anderらにより作製されている。 彼ら は、 U V照射によ り スポロ ト リ チュム · プルベルレンタム（Sporotrichum pulverulentum)に変異処理を行い、 セルラーゼ活性が弱い株である Cel44の菌株 の開発している。 野生株とこのセルラーゼ欠損株 Cel44とを用いてカバ材木片の 分解を行ったところ、 前者がリグニン及びキシランをよく分解するのに対し、 後 者はリグニン及ぴキシランをよく分解するが、 グルカンをほとんど分解しなかつ 7こ (Ander and Eriksson, Svensk Papperstidning, 18, 643, 1975)。 この Cel44 を用いてバーチ材を 6週間処理した後、 機械パルプの製造を行ったところ、 紙力 弓虽度の i曽カロカ S見られた（Ander and Eriksson, Svensk Papperetidning, 18, 641, 1975)。 また、 バーチ材とパイン材を用いて実験を行い、 処理時間を増加させるこ とによって、繊維のフィブリル化とリファイニングのエネルギーが 30%減少した と報告している（Erikkson and Vallander.， Svensk Papperstid, 85, R33， 1982)。 彼らはフィレビア♦ラヂァータ（Phlebia radiata)においても同様にセルラーゼ活 性の弱い株 Cel26を作製した。 この Cel26でパイン材のチップとパルプを処理し た後、 機械パルプを製造した際、 いずれの場合も紙力の改善は見られなかったも のの、 解繊エネルギーの低下が見られた。 また、 重量減少は 2 %以下であった (Samuelsson et al. , Svensk Pappersti d, 8， 221, 1980)。
上記のようにセルラーゼ活性の弱い変異株の作製が行われ、 機械パルプ処理へ の利用の検討が行われているが、 これらの変異株は紫外線照射により変異処理し ているため、 変異株の成長速度が遅く、 分解処理に長時間かかってしまうという 問題がある。 このため、 成長速度には影響せずセルロース分解活性のみを抑える 変異株の作製が望まれている。
一方、 化学パルプは、 化学薬品を用いて木材中のリグニンを溶出させセルロー ス、 へミセルロースを取り出す製造方法である。 現在では水酸化ナトリ ウムと硫 化ナトリゥムを用いて脱リグニンを行うクラフトパルプが主流となっている。 ク ラフトパルプにおいても機械パルプと同様に微生物処理を行い、 蒸解前に脱リグ ニンを行うことでの製造エネルギーの削減、パルプ品質の向上が試みられている。 例えばファネロケェテ ·クリソスポリゥムを用いて、 レツドオーク材ゃァスぺ ン材を 30日間処理すると、 同一 Ka価における収率が向上し、 叩解エネルギーが 削減すること、また、引張り強度と破裂強度が増加するという報告がある（Oriaran et al. , Tappi, 73, 147, 1990)。 同じく、 ファネロケェテ . タリソスポリゥムを 用いた実験において、破裂強度、引裂き強度の増加が報告されている（Chen et al. , Wood Fiber Sci. , 27. 198, 1995)。 Molinaらはラジア一タパインをトラメタス . ベノレシコラとフノレオロータス ·ォス トリ一タス（Pleurotus ostreatus)で処理した 際には、 11〜14%の製造エネルギーが削減できると報告している。しかしながら、 トラメテス 'ペルシコラの場合にはパルプ強度の減少が見られる（Mol ina, 50th Appita Annual general Conference, pp. 57 - 63， 1996； Mol ina, 51th Annual General Conference, pp. 199-206) 0 Bajpai らは、 セジポジ才プシス ·サブノ ー ミスボラを用いた実験において活性アル力リを 18%削減し、蒸解時間を 33%削減 し、 白液中の硫化度を 30%削減することができることを報告している（P. Bajpai et al. J. Pulp and Paper Science : 27 (7) , 235 - 239， 2001)。
上記のように、 クラフトパルプにおける微生物処理は蒸解性を向上させエネル ギ一の削減をもたらすが、 収率や紙力強度を低下させる場合があり、 機械パルプ と同様に微生物処理を実用化するには、 リグニンを分解する能力には優れるが、 セルロースを分解する能力は抑制されている、 リグニン分解の選択性を高めた微 生物の取得 ·作製が必要となっている。
そのセルロースを分解する酵素 （セルロース分解酵素） の中で、 セルラーゼと 総称される酵素は i3— 1 ， 4ーグルカン（セルロース）又はその誘導体の i3— 1 ， 4一ダルコビラノシル結合を加水分解する酵素であり、 高等植物、 菌類、 細菌な どの微生物、 軟体動物などに広く分布している。 セルラーゼは、 セルロース主鎖 の 一 1 ， 4一ダルコビラノシル結合をエンド型に加水分解する、 いわゆるェン ドグルカナーゼ （C M Cァーゼ） と、 セルロース主鎖のうち末端から主にセロビ オース残基を切り取る、 いわゆるェキソダルカナーゼ （アビセラーゼ） とに大別 されることが知られている。 そして、 これらの加水分解酵素がセルロースに相乗 的に作用することによりセルロース基質が低分子化してセロビオースを生じ、 さ らに 3—ダルコシダーゼが関与することにより、グルコース単位まで分解される。 また、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼは、 セロビオースゃセロオリゴ糖を酸化 してセロビオノラク トンを生成すると同時にキノン、 鉄などの金属錯体、 フエノ キシラジカル、 酸素などを還元する酸化還元酵素である。 この酵素は、 微生物が セルロースを分解するときにセルラーゼと同時に産生される（Erikssonet al.， FEBS Lett. , 49， 282-285, 1974)こと、 セロビオースによるセルラーゼ活十生の阻 害、すなわち生成物阻害を解除する（Igarashi et al.， Eur. J. Biochera. , 253， 101, 1998)ことから、セルラーゼとの共役でセルロース分解を促進すると考えられてい る。 また、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼは強力にセルロースを分解するハイ ド ロキシラジカルを発生する Fenton反応を引き起こすため、セルロース分解に深く 関与していると考えられている。このことは Dumonceauxらによるセロビオースデ ヒ ドロゲナーゼ活性を抑制した変異株の作製ならびにその諸性質の検討結果によ つても示唆されている。 彼らは、 抗生物質であるフエロマイシンを指標にした相 同組換え法によるセロビオースデヒ ドロゲナーゼ欠損株の作製を行い、 セロピオ 一スデヒ ドロゲナーゼ欠損株では非晶性セルロースを炭素源とした場合には野生 株と成長速度が変わらないが、 結晶性セルロース上で培養した際には生育速度が 著しく遅くなること、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼ欠損株においても広葉樹未 漂白パルプのリグニンや合成リグニンである1 4 C - DHPを野生株と同等に分解する ことを報告してレヽる（Dumonceaux, Enzyme and Microb. 29, 478-489， 2001) 0 セロビオースデヒ ドロゲナーゼの総説 (G. Henriksson et al. , J. Biotechnol. 78 (2000) 93-113) 等によれば、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼを生産する微生 物としてはファネロケェテ -クジソスポジゥム (Phanerochaete chrysosporium)、 卜ラメテス - ベノレシコラ (Trametes versicolor) N スキゾフィラム * コミュネ (Schizophyllura commune) コ不オフオフ ·プアアナ (Coneophora puteana) ^ セジォプ卜レ ·サーモフイラ (Mycel iophtore thermophi la 、 フミコ一ラ *イン ソレンス （Fumicola insolens) 等の木材腐朽菌が挙げられている。
また、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼをコードする遺伝子 （以下、 セロビオー スデヒ ドロゲナーゼ遺伝子と称する） については、 例えば、 ファネロケェテ · ク リソスポリゥムでは、 K3株の cDNA (Raices et al. , FEBS Letters, 69， 233 - 238, 1995)、 0GC101 株では cDNA (Li et al.， Appl. Environ. Microbiol. , 62 (4)， 1329-1335, 1996)、 染色体遺伝子のクローニングが行われている（Li et al. Appl. Environ. Microbiol. , 63 (2)， 796 - 799, 1997)。 また、 トラメテス 'べノレシカラ (T. J. Dumonceaux et al . , Gene. 210. 211 - 219 (1998) ) や、 ピクノポラス ' シ ンナバリナス （S. M. Moukha et al.， Gene, 234, 23-33, 1999) においてもセロビ オースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子が報告されている。
しかしながら、 上記のようにセロビオースデヒ ドロゲナーゼやそれをコードす る遺伝子の開示はあるが、 機械パルプや化学パルプ製造における微生物処理にあ たって、 リグニン分解の選択性を高めた微生物の取得 '作製に必要なコリオラス - ヒルスタス由来のセロビオースデヒ ドロゲナーゼをはじめとするセルロース分解 酵素やセルロース分解酵素遺伝子の解明、 並びに該遺伝子を用いた遺伝子組換え 技術は報告されていない。 また、 そのような技術によって得られる形質転換体を 用レ、ての効果的なパルプ処理方法についても開示はされていない。
一方、 セルロース分解酵素の利用に対しても、 以前から強い関心が持たれてい る。 例えば、 家庭用洗剤への添加、 繊維などのセルロース系高分子材料の表面処 理による改質、 古紙からの脱インク処理、 食品の加工処理など、 極めて多方面で の利用が検討されてきている。 このため、 セルロース分解酵素を高生産する方法 が求められており、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼの高生産に関する試みとして は、 ファネロケェテ ' タリソスポリゥムのセロビオースデヒ ドロゲナーゼー 1遺 伝子の上流に構成的に働くプロモーターである D—ダリセルアルデヒ ドー 3—ホ スフエートデヒ ドロゲナーゼを連結させた報告がある （Li.， Biochem. Biophys. Res. Commun. , 270, 141-146, 2000)。 しかしながら、 ファネロケェテ · クリ ソス ポリゥムは日本では有害菌に指定されているため利用することはできない。 従つ て、 有害でない微生物を用いたセロビオースデヒ ドロゲナーゼをはじめとするセ ルロース分解酵素を高生産し得る技術の開発が求められているが、 これまで、 コ リオラス ' ヒルスタス由来のセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子等のセルロー ス分解酵素遺伝子を用いたそのような技術の報告はなされていない。 発明の開示 本発明は、 セルロース分解酵素をコードする遺伝子のアンチセンス遺伝子を利 用した木材チップの処理方法を提供することを目的とする。
本発明者らは上記課題を解決するために、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼ等を はじめとするセルロース分解酵素生産菌を求め、 広範なスクリーニングを行い鋭 意研究を行った結果、 コリオラス ' ヒルスタスがセルロース分解酵素を生産する ことを見い出した。 更に、 それらのセルロース分解酵素をコードする遺伝子をク ローニングすることに成功した。 また、 該遺伝子のアンチセンス遺伝子を利用し た該遺伝子の発現を制御する方法を開発し、 該方法を用いて木材チップでパルプ を製造した際、 収率や紙力強度低下を抑制することに成功し、 本発明を完成する に至った。
すなわち、 本発明は以下を提供する。
( 1 ) 担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子の転写産物の全部又はその一部 に対して実質的に相捕的なアンチセンス R N Aをコードする D N Aを調製するェ 程と、
( a ) 前記 D N A、 又は
( 13 )前記13 とプロモーター活性を有する13 断片とを含み、該0 が、 転写によりセルロース分解酵素遺伝子のアンチセンス R N Aが生成するように該 D N A断片に結合されている、 組換え D N A、
を含むベクターを作製する工程と、
該ベクターを用いた形質転換を行い、 セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を 調製する工程と、
該セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程 とを含む、 木材チップの処理方法。
( 2 ) セルロース分解酵素遺伝子が、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子、 セロビォヒ ドロラーゼ I、 セロビォヒ ドロラーゼ II、 糖分解酵素ファミリ一 6 1 に属するエンドダルカナーゼ遺伝子、 糖分解酵素ファミ リー 1 2に属するエンド ダルカナーゼ遺伝子、 糖分解酵素フアミリー 5に属するエンドダルカナーゼ遺伝 子、 及ぴ糖分解酵素フアミリー 9に属するェンドグルカナーゼ遺伝子からなる群 から選択される 1種以上である、 （1 ) に記載の方法。 (3) セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子が、 以下の （a) 〜 （c) のいず れかの塩基配列を含む単離されたセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子である、
(2) に記載の方法。
( a ) 配列番号 1又は 3で表される塩基配列。
(b) (a) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とス トリンジェン トな条件下でハイブリダィズし、 かつセロビオースデヒドロゲナーゼ酵素活性を 有するタンパク質をコードする塩基配列。
(c) 配列番号 1又は 3において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しく は付加された塩基配列からなり、 かつセロビオースデヒ ドロゲナーゼ酵素活性を 有するタンパク質をコードする塩基配列。
(4) セロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子が、 以下の （a) 〜 （c) のいずれかの 塩基配列を含む単離されたセロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子である、 （2) に記載の 方法。
(a) 配列番号 7、 9又は 1 1で表される塩基配列。
(b) (a) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とス トリンジニン トな条件下でハイブリダイズし、 かつセ口ビォヒ ドロラーゼ I遺伝子酵素活性を 有するタンパク質をコードする塩基配列。
(c) 配列番号 7、 9又は 1 1において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換 若しくは付加された塩基配列からなり、 かつセ口ピオヒ ドロラーゼ I遺伝子酵素 活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
(5) セロビォヒドロラーゼ II遺伝子が、 以下の （a) 〜 （c) のいずれかの 塩基配列を含む単離されたセロビォヒ ドロラーゼ II遺伝子である、 （2) に記載 の方法。
( a ) 配列番号 14で表される塩基配列。
(b) (a) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とス トリンジ工ン トな条件下でハイブリダイズし、かつセ口ビォヒ ドロラーゼ II遺伝子酵素活性を 有するタンパク質をコードする塩基配列。
(c) 配列番号 14において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付 加された塩基配列からなり、かつセロビォヒ ドロラーゼ II遺伝子酵素活性を有す るタンパク質をコードする塩基配列。
(6) 糖分解酵素ファミ リー 6 1に属するエンドダルカナーゼ遺伝子が、 以下 の （a ) 〜 （ c) のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミ リー 6 1に属するエンドダルカナーゼ遺伝子である、 （2) に記載の方法。
( a ) 配列番号 1 8で表される塩基配列。
(b) (a ) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェン トな条件下でハイブリダィズし、 かつ糖分解酵素フアミリー 6 1に属するエンド ダルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
( c ) 配列番号 1 8において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付 加された塩基配列からなり、 かつ糖分解酵素ファミリー 6 1に属するエンドダル 力ナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
(7) 糖分解酵素ファミリー 1 2に属するエンドダルカナーゼ遺伝子が、 以下 の （a) 〜 （c) のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミ リー 1 2に属するエンドダルカナーゼ遺伝子である、 （2) に記載の方法。
(a ) 配列番号 2 0で表される塩基配列。
(b) (a) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジ ン トな条件下でハイブリダィズし、 かつ糖素分解酵素フアミリー 1 2に属するェン ドグルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
( c ) 配列番号 2 0において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付 加された塩基配列からなり、 かつ糖分解酵素フアミリー 1 2に属するエンドグル カナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
(8) 糖分解酵素ファミ リー 5に属するエンドグルカナーゼ遺伝子が、 以下の (a) 〜 （ c) のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミ リー 5 に属するエンドグルカナーゼ遺伝子である、 （2) に記載の方法。
(a) 配列番号 2 4で表される塩基配列。
(b) (a ) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリ ンジェン トな条件下でハイブリダィズし、 かつ糖分解酵素フアミリー 5に属するエンドグ ルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
( c) 配列番号 24において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付 加された塩基配列からなり、 かつ糖分解酵素フアミリー 5に属するエンドグルカ ナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
(9) 糖分解酵素ファミリー 9に属するエンドダルカナーゼ遺伝子が、 以下の (a ) 〜 （c ) のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミ リー 9 に属するエンドダルカナーゼ遺伝子である、 （2) に記載の方法。
(a) 配列番号 2 8で表される塩基配列。
(b) (a) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とス トリ ンジェン トな条件下でハイブリダイズし、 かつ糖分解酵素ファミリ一 9に属するェンドグ ルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
( c ) 配列番号 2 8において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付 加された塩基配列からなり、 かつ糖分解酵素フアミリー 9に属するエンドグルカ ナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
( 1 0) 担子菌が、 コリオラス ' ヒルスタス (Coriolus hirsutus) 又はファネ ロケ工テ ·クリソスホリウム (Phanerochaete chrysosporium) である、 、1ノ 〜
(9) のいずれかに記載の方法。
( 1 1 ) 宿主細胞がコリオラス ' ヒルスタスである、 （ 1 ) 〜 （1 0) のいずれ かに記載の方法。
( 1 2) ( 1 ) 〜 （1 1) のいずれかに記載の方法によって得られる木材チッ プ。
( 1 3) ( 1 2) に記載の木材チップを用いたパルプの製造法。
( 1 4) ( 1 3) に記載の方法によって得られるパルプ。 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2002-48675 号の明細書 及ぴ Z又は図面に記載される内容を包含する。 図面の簡単な説明
図 1は、 セロビオースに本発明のセロビオースデヒドロゲナーゼを作用させた ときの反応の分析結果を示す図である。
図 2は、 本発明のセロビオースデヒ ドロゲナーゼの至適 p Hを示す図である。 図中、 ♦はグリシン一 HC1を示し、 驪は酢酸を示し、 ▲はリン酸を示す。
図 3は、本発明のセロビオースデヒ ドロゲナーゼの p H安定性を示す図である。 図中、 ♦はグリシン一 HC1を示し、 國は酢酸を示し、 ▲はリン酸を示す。
図 4は、 本発明のセロビオースデヒ ドロゲナーゼの反応至適温度を示す図であ る。
図 5は、 本発明のセロビオースデヒ ドロゲナーゼの熱安定性を示す図である。
配列表の説明
配列番号 5はプラークハイブリダイシヨーン用プローブである。
配列番号 6はプラークハイブリダイシヨーン用プローブである。
配列番号 1 3はプラークハイブリダィシヨーンに用いたプローブである。
配列番号 1 6は P CR反応用プライマーである。
配列番号 1 7は P CR反応用プライマーである。
配列番号 22は P CR反応用プライマーである。
配列番号 23は PC R反応用プライマーである。
配列番号 26は P CR反応用プライマーである。
配列番号 27は P CR反応用プライマーである。
配列番号 30は P CR反応用プライマーである。
配列番号 3 1は P CR反応用プライマーである。
配列番号 32は P CR反応用プライマーである。
配列番号 33は P CR反応用プライマーである。
配列番号 34は P CR反応用プライマーである。
配列番号 35は P CR反応用プライマーである。
配列番号 36は PC R反応用プライマーである。
配列番号 37は P CR反応用プライマーである。
配列番号 38は P CR反応用プライマーである。
配列番号 39は P CR反応用プライマーである。
配列番号 40は PC R反応用プライマーである。
配列番号 41は P CR反応用プライマーである。 配列番号 42は PC R反応用プライマーである。
配列番号 43は P CR反応用プライマーである。
配列番号 44は P CR反応用プライマーである。
配列番号 4 5は P CR反応用プライマーである。
配列番号 46は P CR反応用プライマーである。
配列番号 4 7は PC R反応用プライマーである。
配列番号 48は PCR反応用プライマーである。
配列番号 49は PC R反応用プライマーである。
配列番号 50は P CR反応用プライマーである。
配列番号 5 1は P CR反応用プライマーである。
配列番号 5 2は P CR反応用プライマーである。 発明を実施するための形態
以下、 本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、 担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子の転写産物の全部又はその 一部に対して実質的に相補的なアンチセンス RNAをコードする DNAを調製す る工程と、 （a) 前記 DNA、 又は （b) 前記 DNAとプロモーター活性を有する DNA断片とを含み、 該 DNAが、 転写によりセルロース分解酵素遺伝子のアン チセンス RN Aが生成するように該 DNA断片に結合されている、組換え DNA、 を含むベクターを作製する工程と、 該ベクターを用いた形質転換を行い、 セル口 ース分解酵素活性抑制宿主細胞を調製する工程と、 該セル口ース分解酵素活性抑 制宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程とを含む、 木材チップの処理方 法、 を提供する。 本明細書において、 担子菌とは、 セルロース分解能を有する属種であればいか なる菌も利用可能であるが、特に、和名をァラゲ力ワラタケと称するコリォラス · ヒルスタス （Coriolus hirsutus) が好適である。
また、 セルロース分解酵素遺伝子とは、 セルロースを分解し得る酵素であれば 特に限定されないが、 例えば、 セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子、 セロピオ ヒドロラーゼ I遺伝子、セロビォヒ ドロラーゼ II遺伝子、及ぴエンドグルカナー ゼ遺伝子が好ましい。 具体的には、 以下の 1. 〜 7. に示すような各種遺伝子を 使用することができる。なお、これらの遺伝子は単独で使用することもできるが、 1種以上を組み合わせて使用してもよい。
1. 以下の （a ) 〜 （c ) のいずれかの塩基配列を含む、 単離されたセロビ オースデヒドロゲナーゼ遺伝子。
( a ) 配列番号 1又は 3で表される塩基配列。
(b) (a) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジニント な条件下でハイブリダィズし、 かつセロビオースデヒ ドロゲナーゼ酵素活性を有 するタンパク質をコードする塩基配列。
( c ) 配列番号 1又は 3において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは 付加された塩基配列からなり、 かつセ口ビオースデヒ ドロゲナーゼ酵素活性を有 するタンパク質をコードする塩基配列。
2. 以下の （a ) 〜 （c ) のいずれかの塩基配列を含む、 単離されたセロビ ォヒ ドロラーゼ I遺伝子。
(a) 配列番号 7、 9又は 1 1で表される塩基配列。
(b) (a) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェント な条件下でハイブリダイズし、 かつセ口ピオヒ ドロラーゼ I遺伝子酵素活性を有 するタンパク質をコードする塩基配列。
(c) 配列番号 7、 9又は 1 1において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若 しくは付加された塩基配列からなり、 かつセロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子酵素活 性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
3. 以下の （a) 〜 （c) のいずれかの塩基配列を含む、 単離されたセロビ ォヒ ドロラーゼ II遺伝子。
(a ) 配列番号 1 4で表される塩基配列。
(b) (a ) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とス トリンジェント な条件下でハイプリダイズし、かつセロビォヒドロラーゼ II遺伝子酵素活性を有 するタンパク質をコードする塩基配列。
( c ) 配列番号 1 4において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、かつセロビォヒ ドロラーゼ II遺伝子酵素活性を有する タンパク質をコードする塩基配列。
4. 以下の （a ) 〜 （ c ) のいずれかの塩基配列を含む、 単離された糖分解 酵素フアミリー 6 1に属するェンドグルカナーゼ遺伝子。
( a ) 配列番号 1 8で表される塩基配列。
(b) (a) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とス トリンジェント な条件下でハイブリダィズし、 かつ酵素分解酵素フアミリー 6 1に属するエンド グルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
(c ) 配列番号 1 8において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 かつ酵素分解酵素ファミリー 6 1に属するエンドダル カナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
5. 以下の （a ) 〜 （c ) のいずれかの塩基配列を含む、 単離された糖分解 酵素ファミリ一 1 2に属するェンドグルカナーゼ遺伝子。
(a) 配列番号 2 0で表される塩基配列。
(b) (a ) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とス トリンジェント な条件下でハイブリダィズし、 かつ酵素分解酵素ファミリー 1 2に属するエンド グルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
(c ) 配列番号 2 0において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 かつ酵素分解酵素フアミリー 1 2に属するエンドダル カナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
6. 以下の （a) 〜 （c) のいずれかの塩基配列を含む、 単離された糖分解 酵素フアミリー 5に属するェンドグルカナーゼ遺伝子。
( a ) 配列番号 24で表される塩基配列。
(b) (a) の塩基配列と相捕的な塩基配列を有する塩基配列とス トリンジェント な条件下でハイブリダィズし、 かつ酵素分解酵素フアミリー 5に属するエンドグ ルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
( c ) 配列番号 2 4において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 かつ酵素分解酵素フアミリー 5に属するエンドグルカ ナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。 7. 以下の （a ) 〜 （c) のいずれかの塩基配列を含む、 単離された糖分解 酵素ファミリー 9に属するェンドグルカナーゼ遺伝子。
( a ) 配列番号 2 8で表される塩基配列。
(b) (a ) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とス トリンジ ント な条件下でハイブリダィズし、 かつ酵素分解酵素フアミリー 9に属するェンドグ ルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
( c) 配列番号 2 8において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 かつ酵素分解酵素フアミリー 9に属するエンドグルカ ナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
上記 1. に記載のセ口ビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子は以下のような手順で 得ることができる。
コリオラス · ヒノレスタスから、 Yeltonらの方法（Proc. Natl. Acad. ScLUSA, 81， 1470 (1984))等の通常の染色体 DN Aの抽出法を用いて染色体 DN Aを調製する。 次に、得られた染色体 DNAを Sau3AI等の適当な制限酵素で処理し、部分分解を 行った後ショ糖密度勾配超遠心法で分画して 10kbp〜25kbpの DNA断片を得る。 同じ付着末端を生じさせる制限酵素で処理したファージ D N Aに、 上記で得られ た DNA断片を連結する。ファージ DNAとしては、例えば、 EMBL3 (A-M, Frishauf et al. , J. Mol.Biol. 170， 827 (1983) ) λファージ D N Aが用いられる。 得られ た DNA断片連結ファージについて in vitroでパッケージングを行い、染色体 D NAライブラリーとする。 また、 サブクローニングには、 常用のクローニングべ ク タ一、 好ま し く は大腸菌ベク ター、 例えば、 pUC 系である pUC18 (C. Yanisch-Perron, et al. , Gene, 33, 103 (1985) )等のプラスミ ドを用いること ができる。 クローユングベクターは、 上記例示のものに制限されず、 市販される 力 \ 文献記載の公知のものが使用できる。
上記で得られた染色体遺伝子ライブラリ一からのセロビオースデヒ ドロゲナー ゼ遺伝子の単離にあたっては、 精製後のコリオラス · ヒルスタスのセロビオース デヒ ドロゲナーゼをリジルエンドぺプチダーゼを用いて完全消化し、 アミノ酸シ ークエンスを行い、 このアミノ酸配列から推定されるヌクレオチド配列に基づい て作製した合成 DN Aプローブを用い、 プラークハイブリダィゼーションにより セロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子を含むクローンを選択する。 選択したクロ ーンからセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子を含む DNA断片を単離し、 制限 酵素地図の作成および配列決定を行う。 配列決定は、 上記のセロビオースデヒ ド ロゲナーゼ遺伝子を含む断片を適当なクローニングベクター （例えば pUC19等の pUC系ベクター） に挿入し、 Sangerらの方法（Proc. Natl. Acad. Sci.USA， 74， 5463 (1977))によって行うことができる。
上記の手順により、 コリオラス · ヒルスタス由来のセロビオースデヒ ドロゲナ ーゼをコードする配列番号 1及び 3で表される塩基配列が決定された。 34 20 b pの塩基配列からなる配列番号 1及び 3480 b pの塩基配列からなる配列番 号 3を有する遺伝子は、 それぞれコリオラス · ヒルスタス由来のセロビオースデ ヒ ドロゲナーゼ 1遺伝子とセロビオースデヒ ドロゲナーゼ 2遺伝子と命名した 7 20 7 b pと 5345 b pからなるセロビオースデヒ ドロゲナーゼゲノム遺伝子 の構造遺伝子である。
配列番号 1で表されるセロビオースデヒ ドロゲナーゼ 1遺伝子の構造遺伝子部 分は、 1 6個のェキソンと 1 5個のイントロンに （介在配列） によって構成され ている。
具体的には、 ェキソン 1は 1 29〜： 1 7 7、 イントロン 1は 1 78〜 23 9、 ェキソン 2は 240〜498、 イントロン 2は 49 9〜5 5 7、 ェキソン 3は 5 58〜 66 7、 イントロン 3は 668〜 7 1 6、 ェキソン 4は 7 17〜8 3 3、 イントロン 4は 834〜 88 5、 ェキソン 5は 886〜 1 028、 イントロン 5 は 1 02 9〜 1 077、 ェキソン 6は 1 0 78〜 1 242、 イントロン 6は 1 2 4 3〜 1 30 1、 ェキソン 7は 1 302〜 1 3 74、 イントロン 7は 1 3 7 5〜 142 5、 ェキソン 8は 1426〜 1 480、 イントロン 8は 148 1〜1 5 3 4、 ェキソン 9は 1 535〜 2 1 65、 イントロン 9は 2 1 6 6〜 2223、 ェ キソン 1 0は 2224〜 23 5 1、 イントロン 1 0は 23 52〜 240 7、 ェキ ソン 1 1は 2408〜2456、 イントロン 1 1は 245 7〜2 509、 ェキソ ン 1 2は 25 1 0〜 2598、 イントロン 1 2は 25 99〜 26 53、 ェキソン 1 3は 2654〜 2799、 イントロン 1 3は 2800〜 285 9、 ェキソン 1 4は 2860〜 2930、 イントロン 14は 2 93 1〜 29 95、 ェキソン 1 5 は 2996〜 3 1 00、 イントロン 1 5は 3 1 0 ：！〜 3 1 5 7、 ェキソン 1 6は 3 1 58〜 32 74にそれぞれ存在している。 さらにヌクレオチド番号 32 7 5 〜はターミネータ一を含む 3 '非翻訳領域である。
さらに、 塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、 76 8アミノ酸残基 からなる配列番号 2で表されるァミノ酸配列であることがわかつた。
また、 配列番号 3で表されるセロビオースデヒ ドロゲナーゼ 2遺伝子の構造遺 伝子部分は、 1 6個のェキソンと 1 5個のイントロンによって構成されている。 具体的には、 ェキソン 1は 1 5 9〜 207、 イントロン 1は 208〜 26 9、 ェキソン 2は 270〜 5 28、 イントロン 2は 52 9〜 58 7、 ェキソン 3は 5 8 8〜 6 97、 イントロン 3は 6 9 8〜 746、 ェキソン 4は 747〜 86 3、 イントロン 4は 8 64〜 9 1 5、 ェキソン 5は 9 1 6〜： 1 0 58、 イントロン 5 は 1 05 9〜： 1 1 07、 ェキソン 6は 1 1 08〜 1 27 2、 イントロン 6は 1 2 7 3〜： 1 33 1、 ェキソン 7は 1 33 2〜 1404、 イントロン 7は 140 5〜 1 455、 ェキソン 8は 1456〜： 1 5 1 0、 イントロン 8は 1 5 1 1〜 1 5 6 4、 ェキソン 9は 1 56 5〜 21 9 5、 イントロン 9は 2 1 96〜 225 3、 ェ キソン 1 0は 22 54〜 238 1、 イントロン 1 0は 2382〜 24 3 7、 ェキ ソン 1 1は 243 8〜 2486、 イントロン 1 1は 248 7〜 253 9、 ェキソ ン 1 2は 2540〜 26 28、 イントロン 1 2は 2629〜 26 83、 ェキソン 1 3は 2684〜 2829、 イントロン 1 3は 2 8 30〜 288 7、 ェキソン 1 4は 28 88〜 2 9 58、 イントロン 1 5は 2 9 5 9〜 3025、 ェキソン 1 5 は 3026〜 3 1 30、 イントロン 1 5は 3 1 3 1〜 3208、 ェキソン 1 6は 3 2 09〜 3 3 2 5、 ヌクレオチド番号 3 3 2 6〜はターミネーターを含む 3， 非翻訳領域である。
さらに、 塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、 76 8アミノ酸残基 からなる配列番号 4で表されるアミノ酸配列であることがわかった。
また、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼ 1遺伝子では、 配列番号 1で表される塩 基配列のうちの第 1 29番目〜第 3 274番目の塩基を含んでなるセロビオース デヒ ドロゲナーゼ遺伝子が有用であり、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼ 2遺伝子 では、 配列番号 3で表される塩基配列のうちの第 1 5 9番目〜第 33 25番目の 塩基を含んでなるセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子が特に有用である。
コリォラス · ヒルスタス由来のセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子の D N A 断片は、 上記セロビオースデヒ ドロゲナーゼ染色体遺伝子を含む D N A断片から P C Rによって得ることができる。 P C Rのプライマーとしては、 配列番号 1、 3で表される塩基配列及びその相補的配列に基づく、 約 1 0〜 5 0塩基、 好まし くは約 1 5〜3 0塩基からなる配列をセンスプライマー、 アンチセンスプライマ 一として用いることができる。 例えば、 配列番号 3 1で表されるセンスプライマ 一、配列番号 3 2で表されるアンチセンスプライマーを使用することができる（実 施例 1 2参照）。
なお、 コリオラス · ヒルスタス由来のセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子配 列を含むゲノム D N Aを保有する大腸菌形質転換株、 Escherichia col i JM109/pCHCDHl及び Escherichia coli JM109/pCHCDH2は、 2002年 2月 8 日付けで 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市 東 1丁目 1番地 1 中央第 6 )に寄託され、それぞれ受託番号 FERM BP- 8278、 FERM B-8279が付与されている。 これらの寄託株に含まれる配列番号 1又は 3で表され る塩基配列を有する D N Aも、 本発明に包含される。
また、 上記 2 . に記载のセ口ビォヒ ドロラーゼ I遺伝子は以下のような手順で 得ることができる。
上記 1 . に記載の遺伝子の調製と同様の手順でプラークハリブリダィゼーショ ンを行い、 セロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子を含むクローンを調製する。 選択した クローンからセロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子を含む D N A断片を単離し、 制限酵 素地図の作成および配列決定を行う。 配列決定は、 セロビォヒ ドロラーゼ I遺伝 子を含む D N A断片を適当なクローニングベクター （例えば pUC19等の pUC系べ クタ一） に挿入し、 Sangerらの方法（前述）によって行うことができる。
上記の手順により、 コリォラス · ヒルスタス由来のセロビォヒ ドロラーゼ Iを コードする配列番号 7、 9、 1 1で表される塩基配列が決定され、 各々をセロビ ォヒ ドロラーゼ I一 1遺伝子とセロビォヒ ドロラーゼ I一 2遺伝子、 セ口ビォヒ ドロラーゼ I一 3遺伝子と命名した。
さらに、 各々の塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、 4 5 6ァミノ 酸残基からなる配列番号 8で表されるアミノ酸配列、 456アミノ酸残基からな る配列番号 1 0で表されるアミノ酸配列、 また、 45 7アミノ酸残基からなる配 列番号 1 2で表されるアミノ酸配列であることがわかった。
上記のセロビォヒ ドロラーゼ I一 1〜 3遺伝子の DN A断片は、 上記セロピオ ヒ ドロラーゼ I _ 1〜 3の各染色体遺伝子を含む DNA断片から P CRによって 得ることができる。 P CRのプライマーとしては、 各遺伝子の前記塩基配列 （配 列番号 7、 9、 1 1) 及びその相補的配列に基づく、 約 1 0〜50塩基、 好まし くは約 1 5〜30塩基からなる配列をセンスプライマー、 アンチセンスプライマ 一として用いることができる。
また、上記 3. に記載のセロビォヒ ドロラーゼ II遺伝子は以下のような手順で 得ることができる。
上記 1. に記載の遺伝子の調製と同様の手順でプラークハリブリダィゼーショ ンを行い、セロビォヒ ドロラーゼ II遺伝子を含むクローンを調製する。選択した クローンからセロビォヒ ドロラーゼ Π遺伝子を含む DNA断片を単離し、制限酵 素地図の作成および配列決定を行う。配列決定は、セロビォヒ ドロラーゼ II遺伝 子を含む DNA断片を適当なクロー-ングベクター （例えば pUC19等の pUC系べ クタ一） に揷入し、 Sangerらの方法（前述）によって行うことができる。
上記の手順により、 コリォラス · ヒルスタス由来のセロビォヒ ドロラーゼ II をコードする配列番号 1 4で表される塩基配列が決定された。 さらに、 塩基配列 の解析から推定されるアミノ酸配列は、 4 5 3アミノ酸残基からなる配列番号 1 5で表されるアミノ酸配列であることがわかった。
セロビォヒ ドロラーゼ II 遺伝子の DNA断片は、 セロビォヒ ドロラーゼ I II 染色体遺伝子を含む D N A断片から P C Rによつて得ることができる。 P C Rの プライマーとしては、 前記塩基配列及ぴその相補的配列に基づく、 約 1 0〜50 塩基、 好ましくは約 1 5〜30塩基からなる配列をセンスプライマー、 アンチセ ンスプライマーとして用いることができる。
また、 上記 4. に記載の糖分解酵素ファミリー 6 1に属するエンドダルカナー ゼ遺伝子は以下のような手順で得ることができる。
コリオラス . ヒルスタスを木材チップ上で生育させた菌体から mRNAを回収 し、 通常の方法に準じて c D N Aライブラリーを作製する。 得られた c D N Aラ イブラリーからの糖分解酵素フアミリー 6 1に属するエンドダルカナーゼ遺伝子 の単離にあたっては適切な寒天培地上でプラークを形成させ、 無作為にプラーク を単離し、 適切な 2種類のプライマーによりコリォラス · ヒルスタス由来の c D N A部分を増幅させ、 塩基配列を解析することにより糖分解酵素フアミリー 6 1 に属するェンドグルカナーゼ遺伝子を含む D N A断片を単離することができる。 上記の手順により、 コリオラス ' ヒルスタス由来の糖分解酵素フアミリー 6 1 に属するェンドグルカナーゼをコードする配列番号 1 8で表される塩基配列が決 定された。 さらに、 塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、 3 7 4アミ ノ酸残基からなる配列番号 1 9で表されるァミノ酸配列であることがわかつた。 糖分解酵素ファミリ一 6 1に属するェンドグルカナーゼ遺伝子の D N A断片は、 上記糖分解酵素ファミリ一 6 1に属するェンドグルカナーゼ遺伝子を含む D N A 断片から P C Rによって得ることができる。 P C Rのプライマーとしては、 配列 番号 1 8で表される塩基配列及びその相補的配列に基づく、 約 1 0〜5 0塩基、 好ましくは約 1 5〜3 0塩基からなる配列をセンスプライマー、 アンチセンスプ ライマーとして用いることができる。
また、 上記 5 . に記載の糖分解酵素ファミリー 1 2に属するエンドダルカナー ゼ遺伝子は以下のような手順で得ることができる。
上記 4 . に記載の遺伝子の調製と同様の手順で無作為に c D N Aライブラリー からプラークを単離し、 コリォラス · ヒルスタス由来の c D N A部分を増幅後、 塩基配列を解析することにより糖分解酵素フアミリー 1 2に属するエンドグルカ ナーゼ遺伝子を単離することができる。
上記の手順により、 コリオラス ' ヒルスタス由来の糖分解酵素フアミリー 1 2 に属するェンドグルカナーゼをコ一ドする配列番号 2 0で表される塩基配列が決 定された。 さらに、 塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、 少なくとも 2 1 5アミノ酸残基からなる配列番号 2 1で表されるアミノ酸配列であることが わ力つた。
コリォラス . ヒルスタス由来の糖分解酵素フアミリー 1 2に属するェンドグル カナーゼ遺伝子の D N A断片は、 上記糖分解酵素ファミ リー 1 2に属するエンド ダルカナーゼ遺伝子を含む D N A断片から P C Rによって得ることができる。 P C Rのプライマーとしては、 配列番号 2 0で表される塩基配列及びその相補的配 列に基づく、 約 1 0〜 5 0塩基、 好ましくは約 1 5〜 3 0塩基からなる配列をセ ンスプライマー、 アンチセンスプライマーとして用いることができる。
また、 上記 6 . に記載の糖分解酵素ファミリー 5に属するエンドダルカナーゼ 遺伝子は以下のような手順で得ることができる。
担子菌ファネロケェテ ' タリソスポリゥムを適切な培地で培養し、 上記 1 . に 記載の Yeltonらの方法により染色体 D N Aを回収する。得られた染色体 D N Aに 対し、 ファネロケェテ ·クリソスポリゥムの染色体 D N Aデータ ·ベースから予 想される適切な 2つの P C R用プライマーを作製し、 常法により目的 D N A断片 を增幅し、 糖分解酵素フアミリー 5に属するエンドダルカナーゼ遺伝子を得るこ とができる。
上記の手順により、 ファネロケェテ ·クリ ソスポリゥム由来の糖分解酵素ファ ミリー 5に属するェンドグルカナーゼをコ一ドする配列番号 2 4で表される塩基 配列が決定された。 さらに、 塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、 3 8 6アミノ酸残基からなる配列番号 2 5で表されるアミノ酸配列であることがわ かった。
ファネロケェテ .クリソスポリゥム由来の分解酵素ファミリー 5に属するェン ドグルカナーゼ遺伝子の D N A断片は、 上記糖分解酵素ファミリ一 5に属するェ ンドグルカナーゼ遺伝子を含む D N A断片から P C Rによって得ることができる。 P C Rのプライマーとしては、 配列番号 2 4で表される塩基配列及びその相補的 配列に基づく、 約 1 0〜 5 0塩基、 好ましくは約 1 5〜 3 0塩基からなる配列を センスプライマー、 アンチセンスプライマーとして用いることができる。
また、 上記 7 . に記載の糖分解酵素ファミリー 9に属するエンドダルカナーゼ 遺伝子は以下のような手順で得ることができる。
上記 6 . に記載の遺伝子の調製と同様の手順で適切な P C Rプライマーにより 糖分解酵素フアミリー 9に属するェンドグルカナーゼ遺伝子を含むクローンを調 製する。 選択したクローンから糖分解酵素フアミリー 9に属するエンドダルカナ ーゼ遺伝子を含む D N A断片を単離し、 制限酵素地図の作成およぴ配列決定を行 う。 配列決定は、 糖分解酵素ファミ リー 9に属するエンドグルカナーゼ遺伝子を 含む D N A断片を適当なクロー-ングベクター （例えば pUC19等の pUC系べクタ 一） に挿入し、 Sangerらの方法（前述）によって行うことができる。
上記の手順により、 ファネロケェテ ·クリ ソスポリゥム由来の糖分解酵素ファ ミリー 9に属するェンドグルカナーゼをコードする配列番号 2 8で表される塩基 配列が決定された。 さらに、 塩基配列の解析から推定されるアミノ酸配列は、 5 9 2アミノ酸残基からなる配列番号 2 9で表されるアミノ酸配列であることがわ かった。
糖分解酵素ファミリー 9に属するエンドダルカナーゼ遺伝子の D N A断片は、 上記糖分解酵素フアミリー 9に属するヱンドグルカナーゼ遺伝子を含む D N A断 片から P C Rによって得ることができる。 P C Rのプライマーとしては、 配列番 号 2 8で表される塩基配列及びその相補的配列に基づく、 約 1 0〜 5 0塩基、 好 ましくは約 1 5〜3 0塩基からなる配列をセンスプライマー、 アンチセンスプラ イマ一として用いることができる。
本方法の第 1の工程においては、 上記の担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝 子の転写産物の全部又はその一部に対して実質的に相補的なアンチセンス R N A をコードする D N Aを調製する。
本明細書において 「アンチセンス R N A」 とは、 上記セルロース分解酵素遺伝 子の転写産物である m R N Aの全部又はその一部に対して実質的に相補的な配列 を含んでなる塩基配列であって、 細胞内に存在した場合に、 相補的となるセル口 一ス分解酵素遺伝子の m R N Aと結合し、 それによつてセルロース分解酵素遺伝 子の翻訳を阻害し、 発現を抑制する配列を意味する。
また、 「実質的に」 とは、 このアンチセンス R N Aが m R N Aと結合して二本鎖 を形成し、 それが m R N Aのタンパク質への翻訳を阻害する限り、 この配列に欠 失、 置換又は付加等の変化があってもよいことを意味する。
該配列の長さは、 本発明のいずれかのセルロース分解酵素遺伝子の発現を抑制 し得る長さであれば適宜設定可能であり、 セルロース分解酵素遺伝子の塩基配列 の全部と等しい長さである必要は必ずしもなく、 該配列の一部に該当する長さで あってよい。 例えば、 セルロース分解酵素遺伝子の発現を抑制する場合、 配列番 号 2及ぴ 4のヘム結合部位である 80番目、 1 28番目のアミノ酸、 フラビンァ デニンジヌクレオチド （FAD) 結合部位である 2 36から 24 1番目のァミノ 酸をコードする塩基配列が含まれることが好ましい。
アンチセンス RN Aの調製及び該配列を利用する方法については、 当業者に公 知の常法によって実施することができる。 具体的には、 セルロース分解酵素遺伝 子のアンチセンス RN Aは、 セルロース分解酵素遺伝子の塩基配列のェキソン部 分が得られるように P C R法を行ったり、 セルロース分解酵素遺伝子を適当な制 限酵素で切断して得ることができる。 また、 セルロース分解酵素遺伝子の c DN Aからも取得可能である。 さらには、 このアンチセンス RNAは、 セルロース分 解酵素遺伝子の塩基配列情報をもとに人工的に作られた合成 RN Aであっても良 レ、。
本方法の第 2の工程においては、 （a)前記のようにして得られたアンチセンス RNAをコードする DNA、 または （b) 前記のようにして得られたアンチセン ス RNAをコードする DN Aと、プロモーター活性を有する DN A断片とを含み、 該 DNAが、 転写によりセルロース分解酵素遺伝子のアンチセンス RNAが生成 するように該 DNA断片に結合されている、 組換え DNA、 を含むベクターを作 製する。
本明細書において、「転写によりセルロース分解酵素遺伝子のアンチセンス RN Aが生成するように」 とは、 宿主内でプロモーターの作用下でアンチセンス RN Aをコードする DN Aの mRN Aへの転写が生じた際に、 本発明のセルロース分 解酵素遺伝子からの mRN Aに対して結合して二本鎖を形成し、 該セルロース分 解酵素遺伝子の発現を抑制させることができるアンチセンス RN Aが生成される ことを意味する。
アンチセンス RN Aが生成され得るように結合するには、 プロモーター配列を 有する DNA断片の下流にアンチセンスの方向 （逆向き方向） にアンチセンス R NAをコードする DNAを結合し、 プロモーターの作動により mRNAに転写さ せればよい。 得られる mRNAは、 セルロース分解酵素遺伝子の塩基配列のアン チセンス RNAである。
プロモーター遺伝子としては、 プロモーターの作用を有する遺伝子断片であれ ば特に限定されることなく、 あらゆる遺伝子を使用することができる。 例えば G P Dプロモーター、 r a s遺伝子プロモーターなどが挙げられる。 これらのプロ モーター遺伝子は、 ジーンバンクに登録される配列、 文献記載の配列等に基づい て周知のゲノムクローニングまたは P C R法によっても取得可能である。 あるい は、 寄託されている遺伝子については、 分譲請求により入手可能なものを利用す ることができる。
プロモータ一配列を含む遺伝子とセル口ース分解酵素遺伝子又は該遺伝子の アンチセンス R N Aをコードする D N Aは、 必要に応じて制限部位の導入、 平滑 末端化または付着末端化後、 適当な D N Aリガーゼを用いて連結することができ る。 クローニング、 連結反応、 P C R等を含む組換え D N A技術は、 例えば、 J. Sambrook et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、 及び Short Protocols In Molecular Biology, Third Edit ion, A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wi ley & Sons, Inc.に記載されるものを利用すること ができる。
ベクターの種類は特に限定されないが、 このベクターによって形質転換される 宿主の種類に応じて選択される。 ベクターとしては、 原核または真核生物宿主細 胞において自律複製可能または染色体中に相同組換え可能なベクターを使用する ことができる。 プラスミ ド、 ファージを含むウィルス、 コスミ ドなどである。 ベ クタ一は、 選択マーカー、 複製開始点、 ターミネータ一、 ポリ リンカ一、 ェンハ ンサ一、 リボゾーム結合部位などを適宜含むことができる。 細菌、 真菌、 酵母、 動物、 植物などの原核およぴ真核生物用の種々のべクターが巿販されているか、 あるいは、 文献等に記載されており、 これらを利用して本発明のセロビオースデ ヒ ドロゲナーゼ遺伝子のアンチセンス R N Aをコードする D N A又は組換え D N Aをベクターに導入することができる。
D N A導入は、 例えば、 J. Sambrookら （上記） に記載される技術を使用して実 施することができる。 なお、 本発明のセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子のァ ンチセンス R N Aをコードする D N A又は組換え D N Aをベクターに導入するに あたっては、 上述のように、 転写によりセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子の ：成するように導入する。
本方法の第 3の工程においては、 前記ベクターを用いた形質転換を行い、 セル ロース分解酵素活性抑制宿主細胞を調製する。 '
ここで宿主細胞は、 担子菌、 真菌類、 酵母類を含む菌類だけではなく、 他の真 核細胞 （動物細胞、 植物細胞、 昆虫細胞、 藻類など） や原核細胞 （細菌、 藍藻な ど） であっても、 本発明のセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子のアンチセンス R N Aをコードする D N Aの発現においてプロモーター活性を発揮できるならば、 いずれの宿主細胞も使用可能である。 このうち、 好ましい宿主細胞は担子菌であ り、 特に好ましくはコリオラス · ヒルスタスである。 例えば、 具体的には、 後述 の実施例に記載されているコリオラス · ヒルスタスのオノレニチン力ルバモイノレト ランスフェラーゼ活性を欠損している栄養要求性変異株 0JI- 1078 (FERM BP-4210) を宿主として使用できる。
形質転換法としては、 塩化カルシウム Z P E G法、 リン酸カルシウム法、 酢酸 リチウム法、 エレク トロポーレション法、 プロ トプラスト法、 スフエロプラスト 法、 リボフヱクシヨン法、 ァグロバタテリゥム法などを例示できるが、 これらに 限定されない。
本方法の第 4の工程においては、 前記セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を 木材チップに接種して処理する。
本明細書において 「木材チップ」 とは、 木材を機械的に 2〜3craの大きさに小片 化したものであり、 マツ、 スギ、 モミ、 トウヒ、 ダグラスファー、 ラジア一タパ イン等の針葉樹及びブナ、 カバ、 ハンノキ、 力ェデ、 ユーカリ、 ポプラ、 ァカシ ァ、 ラワン、 ゴム等の広葉樹を含む木材から得られ、 パルプ等の原料として用い ることができるものであればいずれの材種のチップをも用いることができる。 木材チップはセルロース分解酵素活性抑制宿主細胞で処理する。 セルロース分 解酵素活性抑制宿主細胞が十分に生育するのであれば、 木材チップは前処理なく そのまま用いることができるが、 他の微生物を殺菌する前処理を実施した方がセ ルロース分解酵素活性抑制宿主細胞が生育しやすいのであれば、 オートクレーブ やスチーミング等を用いて殺菌の前処理を行うのが好ましい。
木材チップをセルロース分解酵素活性抑制宿主細胞で処理する温度は 1 0〜 6 0 °Cが好ましく、 さらに好ましくは 2 0〜3 0 °Cである。 木材チップ中の水分は 2 0〜8 0 %、 好ましくは 3 0〜5 0 %とするのが良い。 木材チップへの空気供 給量はセルロース分解酵素活性抑制宿主細胞が十分に生育可能であれば必要ない 1S 通常、対チップ容積 1 L当たりに供給する空気量が毎分 0. 001〜1 L Z ( 1 · rain) (以下、空気供給量の単位 L Z ( 1 - min) を vvmと称する） とするのが良く、 好ましくは、 対チップ容積当たり 0. 01vvra〜0. lvvmである。
セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞の木材チップへの接種量は、 パルプ収率 や紙力を軽減することがない限り、 適宜設定することができる。
セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞は、 滅菌水とともに粉砕し、 木材チップ に対して植菌して培養することができるが、 木材チップに培地を添加して処理し てもよい。 培地は、 セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞が生育できるのであれ ばいずれの培地をも用いることができる。例えば、炭素源としては、グルコース、 セロビオース、 非晶性セルロース等を使用することができる。 また、 窒素源とし ては、 酵母エキス、 ペプトン、 各種アミノ酸、 大豆、 コーンスティープリカ一、 各種無機窒素などの窒素化合物を用いることができる。 さらに、 必要に応じて、 各種塩類ゃビタミン、 ミネラル等を適宜用いることができる。
セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞によつて処理した木材チップは、 サーモ メカニカルパルプ （TMP)、 グラウンドパルプ （GP)、 リファイナーグラウンドパル プ（RGP)などの機械パルプにおいては解繊エネルギーの減少や紙力の増加が認め られ、 クラフトパルプやサルフアイ トパルプなどの化学パルプの製造においては 蒸解性の向上や紙力の増加が得られる。
さらに、 本発明の方法において利用するセルロース分解酵素活性抑制宿主細胞 は、 適当な培地で培養し、 生成したセルロース分解酵素を回収することを含んで 成るセルロース分解酵素の製造においても有用である。
この場合、 セルロース分解酵素は、 シグナルペプチドとの融合形態で発現 ·翻 訳されるときには分泌形態で産生され、 培地から直接単離することができるが、 一方、 セルロース分解酵素が非分泌形態で産生されるときには、 細胞を分離し、 超音波処理、 ホモゲナイジング等の処理により細胞を破壌して抽出液を得、 この 抽出液からセルロース分解酵素を単離することができる。 単離 ·精製は、 溶媒抽 出、 塩析、 脱塩、 有機溶媒沈殿、 限外濾過、 イオン交換、 疎水性相互作用、 H P L C、 ゲル濾過およびァフィ二ティークロマトグラフィー、 .電気泳動、 クロマト フォーカシングなどの方法を単独にまたは組み合わせて行うことができる。
例えば、 本発明のセルロース分解酵素遺伝子の上流に GPD プロモーター、 ras プロモーターを連結し、 組換え D N A技術により、 セルロース分解酵素を大量に 生産することができる。 前記プロモーターは、 例えば、 コリオラス ' ヒルスタス 由来 GPDプロモーター遺伝子を含む大腸菌組換え体である E. coli JM109/pCHGP (FERM P— 15015)、 コリォラス · ヒルスタス由来 rasプロモーター遺伝子を含む 大腸菌組換え体である E. coli DH5a/pCHRAS (FERM P- 17352) から調製すること が可能である。
本発明の方法において用いられるセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子によつ てコードされるタンパク質 （セロビオースデヒ ドロゲナーゼ） は、 以下の理化学 的性質を有する。
①作用
Method m Enzyraology (Wood et al, Voll60, Academic press, INC. Calf ornia に記載の方法により、セロビオースデヒ ドロゲナーゼ活性を測定した。すなわち、 ジクロロフェノールインドフニノール （シグマ社製）、 セロビオース （関東化学株 式会社製） を、 それぞれ 0. 33mM、 0. 67mMとなるように溶解した pH 5、 50mMの 酢酸緩衝液にセロビオースデヒ ドロゲナーゼを添加し、 3 7 °Cにて反応させた。 反応開始後、 ジク口口フエノールインドフエノールの極大吸収波長 550nmにおけ る吸光度 （光路長 1cm) を連続的に測定したところ、 図 1に示すような結果を得 た。
図 1に示されるようにセロビオースデヒ ドロゲナーゼの還元反応によりジク口 ロフエノ一ルインドフエノールの減少が観察された。 反応系からセロビオース、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼのいずれかが欠如してもジクロロインドフエノー ルの減少が観察されないこと、 ジクロロインドフエノールの代替品としてシトク ロム Cや Mn (III)マロン酸錯体を用いても同様に還元反応が観察されることから、 本酵素はセ口ビオースデヒ ドロゲナーゼであることは明らかである。
②カ価の測定方法 セ口ビオースデヒ ドロゲナーゼ活性測定は次のように行った。 0· 67mMジクロロ フヱノールインドフエノール （シグマ社製）、 3. 33mMセロビオース （関東化学株 式会社製）、 pH 5、 250mMの酢酸緩衝液をそれぞれ 250ul、 100ul、 lOOul を混合 した溶液に被検液 50ulを添加し、 3 7 °Cにて反応させた。反応開始後、 ジクロロ フエノールインドフエノールの極大吸収波長 550nm (モル吸光係数 3965L/molん m) における吸光度 （光路長 lcra) を連続的に測定した。 セロビオースデヒ ドロゲナ ーゼの活性単位については上記の条件で 1分間に lumolのジク口口フエノールェ ンドフヱノールを減少させる酵素量を lunit (ユニット ： U) とした。
③基質特異性
セロビオース、 セロオリゴ糖の他、 セルロースを含有するアビセル、 広葉樹ク ラフトパルプに作用する。
④至適 pH及び安定 pH範囲
反応至適 pH及ぴ pH安定性を、 グリシン一 HC1緩衝液 （pH 2〜 4 )、 酢酸緩衝液 (pH 4〜6 )、 リン酸緩衝液 （pH 6〜8 ) を用いて測定した。 それぞれの pHで酵 素活性を測定した。 結果を図 2に示す。
図 2により、 酵素反応の至適 pHは 4〜 6であった。 また、 それぞれ 50mMの所 定緩衝液中に 4でで 2 4時間保持した後に酵素活性を測定した。 結果を図 3に示 す。 本酵素は pH 2〜 5で安定であった。
⑤作用適温の範囲
反応温度を変えて各酵素の酵素活性を測定した。 結果を図 4に示す。 本酵素は
2 0〜4 0 °Cにおいて高い活性を示した。また、所定の温度で 50mM酢酸緩衝液（pH 5 ) 中に各酵素を 3 0分放置した後に酵素活性を測定した。 結果、を図 5に示す。 図 5より 4 0 °C、 3 0分の処理で約 8、0 %以上の酵素活性を保持し、 5 0 °C、
3 0分の処理でも約 3 0 %以上の残存活性を示す。
SERVA社製 PRECOAT PH 3〜10による等電点電気泳動を行つた結果、等電点は 4 . 2であった。
⑦分子量
S D Sポリアクリルアミ ドゲル電気泳動により測定し、 約 91, 700であつた。 ⑧金属イオン、 阻害剤の影響
種々の金属塩、 阻害剤など種々の物質を ImMになるように酵素液に添加して、 4 °Cで一晩保持した後、 反応液中にも同種の金属塩を ImMになるように添加して 酵素活性を測定した。 結果を表 1に示す。 表 1よりアジ化ナトリゥム、 E D T A により弱く阻害を受け、 Hg2+、SDSにより強く阻害された。 表 1
Figure imgf000031_0001
.れに対し、 従来公知のセロビオースデヒ ドロゲナーゼとしては以下の報告が ある。
Henrikssonらはファネロケェテ · クリソスポリゥム由来の反応至適 pHが 5. 0、 等電点が 4. 2付近、分子量が 89， 000であるセロビオースデヒ ドロゲナーゼを報告 しているが （Eur. J. Biochem. , 196 (1991) 101-106)、 該セロビオースデヒ ドロ ゲナーゼの反応至適温度は 50°Cである。
Royらはトラメテス 'ペルシコラ由来の反応至適 pHが 5. 0、等電点が 4. 2付近、 分子量が 97, 000であるセロビオースデヒ ドロゲナーゼを報告しているが （Appl. Environ. Microbiol. , 62 (1996) 4417-4427)、 該セロビオースデヒ ドロゲナーゼ の反応至適温度は 50°Cである。
Fangらはスキゾフィラム 'コミュネ由来のセロビオースデヒ ドロゲナーゼを報 告しているが （Arch. Biochem. Biophys. , 353-1 (1998) 37-46)、 該セロビオース デヒ ドロゲナーゼの反応至適 pHは 4. 5、 分子量は 102， 000であり、 至適温度、 等 電点の記載はない。
Schmidhalter、 Canevascini らはコネオフオラ · プテアナ由来の等電点が 3. 9 付近であるセロビオースデヒ ドロゲナーゼを報告しているが （Arch. Biochem. Biophys. , 300-2 (1993) 559-563)、 該セロビオースデヒ ドロゲナーゼの反応至適 pHは 4. 0、 分子量は 111, 000であり、 反応至適温度の記載はない。
Canevascini らはミセリォプトレ ·サーモフイラ由来の等電点が 4. 1付近、 分 子量が 91, 000であるセロビオースデヒ ドロゲナーゼを報告しているが （Eur. J. Biochem. , 198 (1991) 43-52)、 該セロビオースデヒ ドロゲナーゼの反応至適 pH は 7. 0であり、 反応至適温度の記載はない。
Shouらはフミコーラ 'インソレンス由来の等電点が 4. 0付近、分子量が 92, 000 であるセロビオースデヒ ドロゲナーゼを報告しているが（Biochem. J. , 330 (1991) 565-571)、 該セロビオースデヒ ドロゲナーゼの反応至適 pHは 7. 0、 反応至適温度 65°Cである。
上記のように、 本発明の方法において用いられるセロビオースデヒ ドロゲナー ゼ遺伝子がコードするセロビオースデヒ ドロゲナーゼは、 至適温度、 至適 pH、 分 子量、等電点において公知のセロビオースデヒ ドロゲナーゼとは異なることから、 新規なセロビオースデヒ ドロゲナーゼであると認定した。 なお、 公知のセロビォ 一スデヒ ドロゲナーゼの理化学的性質を表 2に示す c 表 2 分子量 (kD) 等電点 至適 PH 至適温度 (°C)
Eur. J. Biochem. , 196 (1991)
Phan ero cha e te chrysosponum 89 4.2 5.0 50 101-106
Ap l. Environ. Microbiol.，
Trametes versicolor 97 4.2 5.0 50 62 (1996) 4417-4427
Arch. Biochem. Biophys.，
Schizophyllum commune 102 fi載無し 4.5 記載無し 353-1 (1998) 37-46
Arch. Biochem. Biophys. ,
Conephora puteana 111 3.9 4.0 記載無し 300-2 (1993) 559-563
Eur. J. Biochem. , 198 (1991)
Myc elioph tore thermophila 91 4.1 記載無し 43 - 52
Hum ola ins of ens 92 4.0 65 Biochem. J.， 330 (1991) 565-571 セロビオースデヒ ドロゲナーゼの生産能を有するコリォラス · ヒルスタスは特 に限定されないが、 例えば、 コリオラス · ヒルスタス IF0 4917 株を利用するこ とができる。
コリオラス · ヒルスタス由来のセロビオースデヒ ドロゲナーゼは、 例えば、 セ 口ビオースデヒ ドロゲナーゼを生産するコリオラス'ヒルスタスを培地に培養し、 得られる培養物からセロビオースデヒ ドロゲナーゼを採取することによって得ら れる。 上記のコリオラス · ヒルスタスを培養する培地としては、 該菌が増殖可能 な培地であればいずれの組成の培地をも利用可能である。培地の栄養源としては、 コリオラス · ヒルスタスの培養に通常用いられているものを広く用いることがで きる。 炭素源としては同化可能なものであれば良く、 グルコース、 パルプ、 結晶 性セルロース等を使用することができる。 窒素源としては利用可能な窒素化合物 であれば良く、 例えば、 酵母エキス、 ペプトン、 各種アミノ酸、 大豆、 コンステ ィープリカ一、各種無機窒素などを用いることができる。その他、必要に応じて、 各種の塩類ゃビタミン、 ミネラル等を適宜用いることができる。
培養温度及ぴ p Hは、 コリオラス · ヒルスタスが增殖可能な範囲において適宜 設定可能である。 例えば、 培養温度は 20〜55°C、 好ましくは 25〜30°Cであり、 p Hは 3〜9、 好ましくは 4〜 6である。
コリオラス · ヒルスタス由来のセロビオースデヒ ドロゲナーゼは、 上記条件に おけるコリオラス · ヒルスタスの培養によって培養液中に分泌生産されるので、 培養後の培養物から本酵素を採取する。 培養物から採取した溶液をそのままセロ ビオースデヒ ドロゲナーゼ粗酵素液として使用することができるが、 塩析、 限外 濾過、 凍結乾燥により、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼを濃縮又は固体化するこ ともできる。 さらに、 硫安分画、 ゲル濾過による分子量分画や各種イオン交換樹 脂、 ハイ ドロキシァパタイ ト、 疎水クロマトグラム、 等電点分画等を行うことに よって精製することができるが、 これらの方法は繰り返すことも可能であり、 さ らに必要に応じて他の精製手段を組み合わせて用いることもできる。
【実施例】
以下、 実施例により本発明を更に具体的に説明する。 但し、 本発明はこれら実 施例に限定されない。
[実施例 1 ] コリオラス · ヒルスタス由来染色体 D N Aライブラリーの作製 コリオラス · ヒルスタス IF0 4917株の平板寒天培養から直径 5 mmの寒天片を コルクボーラ一で打ち抜き、 グルコース 'ペプトン培地 （グルコース 2 %、 ポリ ぺプトン 0. 5%、 酵母エキス 0. 2%、 K P04、MgS04 0. 05%、 リン酸で p H4. 5に調 製） 200ml に植菌し、 28°Cで 7日間回転震盪行った。 培養後菌体を集菌後、 1 L の滅菌水で菌体を洗浄し、 液体窒素で凍結した。
この凍結菌体 5 gを乳鉢を用いて粉砕した。 粉砕した菌体を遠心管に移し、 溶菌 緩衝液 （lOOmM トリス （ p H 8 )、 100m MEDTA、 lOOmM NaCl、さらにプロティナーゼ Kを 100 g/ml となるように添加） 10mlを加え、 5 5 °Cで 3時間インキュベート した。 インキュベート後、 フエノール処理、 クロ口ホルム処理を行い、 水層部分 にェタノ一ル徐々に添加し D N Aが析出したところで染色体 D N Aを卷取り、 T E溶液に懸濁した。 TJP03/02058 得られた染色体 ϋΝΑΙΟΟμ gを制限酵素 Sau3AIで部分分解し、 5〜20%ショ 糖密度勾配超遠心分離 （30, OOOrpm, 18時間） により分画し、 20〜40kbp断片区分 を集めた。 この断片区分を東洋紡社製ファージ λ EMBL3- Bam 了ームに T4DNA リガーゼを用いて連結し、得られたファージ DNAを STRATAGENE社製ギガパック ゴールドを用いてパッケージング後、大腸菌 P 2329株に感染せしめ染色体 D N A ライブラリーとした。
[実施例 2] 染色体 DNAライブラリーからのセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺 伝子の単離
上記染色体 DNAライブラリ一からプラークハイプリダイゼーションによりセ 口ビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子を含むクローンの選抜を行った。 この一連の 操作は'吊'法 Sambrook り奢、 Molecular Cloning A Laboratory Manual/2nd Edition (1989)) によった。 プラークハイブリダイシヨーンに用いたプローブは次 の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴ DNA標識キットを用い 3' 末端をフルォレセインで標識したものである。 その結果、 約 40,000 個のプラークの中から 4個の陽性クローンを選抜するこ とができた。 陽性クローンから常法に従つて調製した組換え体ファージ D N Aを 各種制限酵素で消化し、 上記の合成 D N Aを用いてサザンハイブリダィゼーショ ンを行った。 その結果、 制限酵素 Xh o Iで消化して得られた断片中に 5.3kbp、 7.2kbp の DNAバンドとしてプローブにハイプリダイズするそれぞれ異なるク ローンが認められた。
上記 DNA断片 7.2kbp、5.3kbp をァガロースゲル電気泳動法により切り出し、 大腸菌ベクター pBluescriptll SK+ の Xholサイ トにサブクローニング化し、大腸 菌 J Ml 09株へ形質転換した。サブクローニング化した DNAを大量に調製し、 超遠心操作 （50，000rpm、 16h、 15°C) で精製し、 塩基配列を決定した。 塩基配列 の決定は United States Biochemical社製のシーケンシングキットを用いて行つ た。
塩基配列を配列番号 1及び 3に示す。 その結果、 上記塩基配列範囲内において コリォラス · ヒルスタス由来のセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子は 1 5個の イントロンにより分断されていた。 また、 それらの塩基配列から各々推定される アミノ酸配列 （配列番号 2及び 4 ) は、 これまで報告されているセロビオースデ ヒ ドロゲナーゼ遺伝子と高い類似性が認められた。
[実施例 3 ] 染色体 D N Aライブラリ一からのセロビォヒ ドロラーゼ I 一 1遺伝 子の単離
実施例 2と同様にプラークハイブリダイゼーションを行い、 用いたプローブは 他生物種から単離されているセロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子の塩基配列の基づい て作製した次の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴ D N A標識 キットを用い 3， 末端をフルォレセィンで標識したものである。
5 ' -GA (T/C) ATCAAGTT (T/C) ATC (A/G) ATGG- 3 ' (配列番号 6 )
その結果、約 40， 000個のプラークの中から 2個の陽性クローンを選抜すること ができた。 陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージ D N Aを各 種制限酵素で消化し、 上記の合成 D N Aを用いてサザンハイブリダィゼーション を行った。 その結果、 制限酵素 Pstlならびに Nhelで消化して得られた断片中に 単一の D N Aパンドとして 3. 9 kbpにハイブリダイズするクローンが認められた。 上記 D N A断片 3. 9 kbpをァガロースゲル電気泳動法により切り出し、 大腸菌 ベクター pBluescriptsII SK -の Pstl- Spel サイ トにサブクローン化し、 大腸菌 JM109株へ形質転換し、 コリォラス ·ヒルスタス由来のセロピオハイ ドロラーゼ I 遺伝子一 1を含むプラスミ ド pCHCBHI26を得た。 サブクローン化した D N A断片 の塩基配列を決定した。
塩基配列を配列番号 7に示す。 その結果、 上記塩基配列の範囲内においてコリ ォラス · ヒルスタス由来セロビォヒ ドロラーゼ I 一 1遺伝子は 2つのィントロン により分断されていた。 また、 塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号 8に示す。
[実施例 4 ] 染色体 D N Aライブラリーからのセロビォヒ ドロラーゼ I — 2遺伝 子の単離
実施例 2と同様にプラークハイブリダィゼーションを行い、 用いたプローブは 実施例 3で用いた配列番号 6の塩基配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製 のオリゴ D N A標識キットを用い 3， 末端をフルォレセインで標識したものであ る。
その結果、約 40， 000個のプラークの中から 3個の陽性クローンを選抜すること ができた。 陽性クローンから常法に従って調製した組換え体ファージ D N Aを各 種制限酵素で消化し、 上記の合成 D N Aを用いてサザンハイブリダィゼーション を行った。その結果、制限酵素 Sailで消化して得られた断片中に単一の D N Aバ ンドとして 4. 2 kbpにハイブリダィズするクローンが認められた。
上記 D N A断片 4. 2 kbpをァガロースゲル電気泳動法により切り出し、 大腸菌 ベクター pUC19の Sailサイ トにサブクローン化し、大腸菌 JM109株へ形質転換し、 コリォラス · ヒルスタス由来のセロピオハイ ドロラーゼ I— 2遺伝子を含むプラ スミ ド pCHCBHI27を得た。サブクローン化した D N A断片の塩基配列を決定した。 塩基配列を配列番号 9に示す。 その結果、 上記塩基配列の範囲内においてコリ ォラス · ヒノレスタス由来セロビォヒ ドロラーゼ I― 2遺伝子は 2つのィントロン により分断されていた。 また、 塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号 1 0に示す。
[実施例 5 ] 染色体 D N Aライブラリ一からのセロビォヒ ドロラーゼ I一 3遺伝 子の単離
実施例 2と同様にプラークハイブリダィゼーションを行い、 用いたプローブは 実施例 3で用いた配列番号 6の塩基配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製 のオリゴ D N A標識キットを用い 3 ' 末端をフルォレセインで標識したものであ る。
その結果、約 40, 000個のプラークの中から 2個の陽性クローンを選抜すること ができた。 陽性クローンから常法に従つて調製した組換え体ファージ D N Aを各 種制限酵素で消化し、 上記の合成 D N Aを用いてサザンハイブリダィゼーション を行った。 その結果、 制限酵素 EcoRIならびに BaraHIで消化して得られた断片中 に単一の D N Aバンドとして 4. 6 kb にハイブリダイズするクローンが認められ た。
上記 D N A断片 4. 6 kbpをァガロースゲル電気泳動法により切り出し、 大腸菌 ベクター PUC19の EcoRI - BamHIサイ トにサブクローン化し、 大腸菌 JM109株へ形 質転換し、 コリオラス ' ヒルスタス由来のセロビォヒ ドロラーゼ I一 3遺伝子を 含むプラスミ ド pCHCBHI31を得た。 サブクローン化した D N A断片の塩基配列を 決定した。
塩基配列を配列番号 1 1に示す。 その結果、 上記塩基配列の範囲内においてコ リォラス . ヒルスタス由来セロビォヒ ドロラ一ゼ I 一 3遺伝子は 2つのィントロ ンにより分断されていた。 また、 塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番 号 1 2に示す。
[実施例 6 ]染色体 D N Aライブラリーからのセロビォヒ ドロラーゼ II遺伝子の 単離
実施例 2と同様にプラークハイブリダィゼーションを行い、 用いたプローブは 他生物種から単離されているセロビォヒ ドロラーゼ II 遺伝子の塩基配列の基づ いて作製した次の配列を持つ合成オリゴマーをアマシャム社製のオリゴ D N A標 識キットを用い 3， 末端をフルォレセィンで標識したものである。
5 , -CAGTGGGGIGACTGGTGCAAC-3 ' (配列番号 1 3 )
その結果、 約 100, 000個のプラークの中から 8個の陽性クローンを選抜するこ とができた。 陽性クローンから常法に従つて調製した組換え体ファージ D N Aを 各種制限酵素で消化し、 上記の合成 D N Aを用いてサザンハイブリダィゼーショ ンを行った。 その結果、制限酵素 EcoRVならびに Ncolで消化して得られた断片中 に単一の D N Aバンドとして 5. O kbpにハイブリダイズするクローンが認められ た。
上記 D N A断片を回収するため、制限酵素 Ncolで消化後 Klenow fragmentによ り平滑化し、 さらに EcoRVで消化することにより得られる 5. 0 kbpの D N A断片 をァガロースゲル電気泳動法により切り出し、大腸菌ベクター pUC19の Smalサイ トにサブクローン化し、 コリォラス · ヒルスタス由来のセロビォヒ ドロラーゼ Π 遺伝子を含むプラスミ ド pCHCBHIIを得た。このプラスミ ドを大腸菌 JM109株へ形 質転換した。また、前記のサブクローン化した D N A断片の塩基配列を決定した。 塩基配列を配列番号 1 4に示す。 その結果、 上記塩基配列の範囲内においてコ リオラス'ヒルスタス由来セロビォヒ ドロラーゼ II遺伝子は 6つのイントロンに より分断されていた。 また、 塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号 1 5に示す。 [実施例 7 ] コリオラス · ヒルスタス c D N Aライブラリーの作製
乾燥重量 6gを直径 9. 5cmのガラスシャーレに入れ 121°C、15分で滅菌したユー 力リ 'グロブラスのチップにぺプトン培地（ポリぺプトン 1. 0%、酵母エキス 0. 2%、 KH2P04、MgS040. 05%、 リン酸で p H4. 5に調製） 20m 1添加した培地へ、 コリオラ ス · ヒルスタス IF0 4917株の平板寒天培養から直径 5 mmの寒天片をコルクボー ラーで打ち抜き、 3片を植菌し、 3 0 °Cで 1 0日間静置培養を行った。 培養後菌 体を集菌後、 液体窒素で凍結した。
この凍結菌体を用いてグァニジン塩酸法による全 R N Aの回収を行い、 次いで 宝酒造製の Oligotex - dTく super> mRNA Purification kitを用いて、 poly (A) +RNA を調製した。 さらに STRATAGENE社製の cDNA Synthesis kitを用いて cDNAを合成 し、 5 ' 側に EcoRIサイ ト、 また 3， 側に Xholサイ トを付加し、 L ZAPIIベクター の EcoRI— Xholサイ トへ揷入し、 in vitro packaging kitにより cDNAライブラリ 一とした。
[実施例 8 ] コリオラス · ヒルスタス c D N Aライブラリ一からの糖分解酵素フ アミリー 6 1に属するエンドダルカナーゼ遺伝子の単離
実施例 7で作製した cDNA ライプラリー液をシャーレ上でプラークが単離でき るように適当に希釈し Eschericia coli XL1 Blue MRF， 株へ感染させ、 37°Cで 1 晚培養することにより、 プラークを形成させた。 得られたシングルプラークを S Mバッファーに懸濁し、シークェンス用ユニバーサルプライマーである M13 (- 20) プライマー （GTAAAACGACGGCCAGT：配列番号 1 6 ) 並びに M13 Reverse プライマ 一 (GGAAACAGCTATGACCATG：配列番号 1 7 ) を用いて PCR反応を行い、 cDNA断片 を増幅した。このようにして得られた cDNA断片をランダムに塩基配列の解析を行 つた。 その結果、 糖分解酵素ファミリー 6 1に属するエンドダルカナーゼをコ一 ドする cDNA遺伝子を見出した。塩基配列を配列番号 1 8に、また推定されるアミ ノ酸配列を配列番号 1 9に示す。
[実施例 9 ] コリオラス · ヒルスタス c D N Aライブラリーからの糖分解酵素フ アミリー 1 2に属するェンドグルカナーゼ遺伝子の単離
実施例 7で作製した cDNA ライブラリー液をシャーレ上でプラークが単離でき るように適当に希釈し Eschericia coli XL1 Blue MRF' 株へ感染させ、 37°Cで 1 晚培養することにより、 プラークを形成させた。 得られたシングルプラークを S Mバッファーに懸濁し、シークェンス用ユニバーサルプライマーである M13 (-20) プライマー （GTAAAACGACGGCCAGT：配列番号 1 6 ) 並びに M13 Reverse プライマ 一 (GGAAACAGCTATGACCATG：配列番号 1 7 ) を用いて PCR反応を行い、 cDNA断片 を増幅した。このようにして得られた cDNA断片をランダムに塩基配列の解析を行 つた。 その結果、 糖分解酵素ファミ リー 1 2に属するエンドダルカナーゼをコ一 ドする cDNA遺伝子を見出した。塩基配列を配列番号 2 0、また推定されるァミノ 酸配列を配列番号 2 1に示す。
[実施例 1 0 ] 担子菌ファネロケェテ ·クリソスポリゥム染色体 D N Aからの糖 分解酵素ファミリ一 5に属するェンドグルカナーゼ遺伝子の単離
グルコース .ペプトン培地 （グルコース 2 %、 ポリペプトン 0. 5%、 酵母ェキ ス 0. 2%、 KH2P04、MgS040. 05%、 リン酸で p H4. 5に調製） 100m 1 の培地へ、 ファ ネロケェテ .クリ ソスポリゥム ATCC 34541株の平板寒天培養から直径 5 mmの寒 天片をコルクボーラ一で打ち抜き、 5片を植菌し、 30°Cで 5日間振盪培養を行つ た。 培養後菌体を集菌し、 液体窒素で凍結した。 この凍結菌体 5 gを乳鉢を用い て粉枠した。粉砕した菌体を遠心管に移し、溶菌緩衝液（100 mM トリス（ p H 8 )、 lOOmM EDTA. lOOmM NaCl,さらにプロティナーゼ Kを 100 ;_i g/mlとなるように添加） 10m lを加え、 55°Cで 3時間インキュベートした。 インキュベート後、 フエノー ル処理、 クロ口ホルム処理を行い、 水層部分にエタノール徐々に添加し D N Aが 析出したところで染色体 D N Aを卷取り、 T E溶液に懸濁し、 ファネロケェテ クリ ソスポリゥム染色体 D N A溶液とした。
次に以下に示す 2つの D N Aプライマーを用いて、 上記ファネロケェテクリソ スポリゥム染色体 D N A溶液に対し、 P C R反応を行い、 糖分解酵素ファミリー 5に属するェンドグルカナーゼ染色体遺伝子を得た。
5， -ATGAAGTTACTTCTTGCTCTC-3 ' (配列番号 2 2 )
5， -TCACAGGAAGGGTTCGAGTGC-3 ' (配列番号 2 3 )
得られた塩基配列を配列番号 2 4に示す。 その結果、 上記塩基配列の範囲内に おいてファネロケェテ ·クリソスポリゥム由来糖分解酵素フアミリー 5に属する エンドダルカナーゼ遺伝子は 1 5個のイントロンにより分断されていた。 また、 塩基配列から推定されるァミノ酸配列を配列番号 25に示す。
[実施例 1 1] 担子菌ファネロケェテ · クリソスポリゥム染色体 DNAからの糖 分解酵素ファミリ一 9に属するェンドグルカナーゼ遺伝子の単離
実施例 1 0で調製したファネロケェテ · クリソスポリゥム由来の染色体 DNA 溶液に対して、 以下に示す 2つの DNAプライマーを用いて、 上記ファネロケェ テ . クリソスポリゥム染色体 DNA溶液に対し、 P CR反応を行い、 糖分解酵素 ファミ リー 9に属するエンドダルカナーゼ染色体遺伝子を得た。
5' -ATGATACCTCTCCGCTCTGC-3 ' (配列番号 26)
5， - TATCTTCCTGATGCGATTCC- 3， （酉己歹 'J番号 2 7 )
得られた塩基配列を配列番号 28に示す。 その結果、 上記塩基配列の範囲内に おいてファネロケェテ · タリソスポリ ゥム由来糖分解酵素フアミ リー 9に属する エンドダルカナーゼ遺伝子は 7個のイントロンにより分断されていた。 また、 塩 基配列から推定されるアミノ酸配列を配列番号 2 9に示す。
[実施例 1 2] コリオラス ' ヒルスタス由来ダリセルアルデヒ ドー 3—リン酸デ ヒ ドロゲナーゼ遺伝子プロモーターによるコリォラス . ヒルスタス由来セロビォ 一スデヒ ドロゲナーゼ遺伝子の発現ベクターの構築
コリオラス · ヒルスタスのプロモーターの下流にセロビオースデヒ ドロゲナー ゼ遺伝子の構造遺伝子領域を連結し、 本来のセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝 子からダリセルアルデヒ ドー 3—リン酸デヒ ドロゲナーゼ遺伝子プロモーター領 域に置換しセロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子発現ベクターとした。
具体的にはダリセルアルデヒ ドー 3—リン酸デヒ ドロゲナーゼ染色体遺伝子 E c o R I及ぴ B a mH I消化により得られる 3. 8 k b の DNA断片 （断片 1 ) を得た。 ファージベクター Ml 3 mp 1 8の E c o R I、 8 &111111サィ トに丁 4 DN Aリガーゼを用いて前記断片 1を連結し、 これを大腸菌 J Ml 0 9株に形 質転換し、 一本鎖ファージ DN Aを調製した。
次に、 配列番号 30に示す DNAプライマーを合成し、 上記一本鎖ファージ D N Aにァニーリングを行い、 プライマー伸長法により GPD遺伝子のプロモータ 一領域だけを合成し、 制限酵素 E c o R I (宝酒造社製） で切断することにより 0. 9 k b pのDNA断片 （断片 2) を調製した。 5， -CATGGTGTGTGGTGGATG-3 ' (配列番号 30 )
一方、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼの成熟型酵素をコードしている遺伝子領 域だけを取り出すため、 プラスミ ド p CHCDH 1を铸型にし、 配列番号 3 1、 3 2に示すプライマーで P CR反応により伸長させ約 3. 5 k b pの DNA断片 を得た （断片 3)。
5 ' -AAGTTCAAGAGTCTCCTGT- 3， （配列番号 3 1 )
5， -GGTACAGTACTTATCTGTAT- 3 ' (配列番号 3 2)
大腸菌ベクターの p UC 1 8を制限酵素 E c o R I と Sma I (宝酒造社製） で切断し、 上記 2種類の DN A断片を混合して、 T 4 DN Aリガーゼで連結した 後、大腸菌 JM1 09株の形質転換を行い、アンピシリン耐性の形質転換株から、 上記断片の 2及び 3の 2種類の DNA断片が同時に挿入されているプラスミ ドを 単離し、 これを p G P CDH 1と命名した。
[実施例 1 3] セロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子のアンチセンス配列を有す るプラスミ ドの構築
実施例 1 2と同様の方法を用いダリセルアルデヒ ドー 3—リン酸デヒ ドロゲナ ーゼ遺伝子プロモーター領域 0. 9 k b断片 2を得た。 得られた断片 2を pUC 1 8の E c o R I— Sma lサイ トへ T 4 DNAリガーゼにより連結した後、 大 腸菌 J Ml 09株の形質転換を行い、 アンピシリ ン耐性の形質転換株から、 上記 断片の 2が挿入されているプラスミ ドを単離し、これを p CHGP 1と命名した。 この p CHGP 1を制限酵素 N c o I -X b a Iで消化し、 ベクター部分を調製 した （断片 4)。
また、 コリォラス · ヒルスタス由来セロビオースデヒ ドロゲナーゼ 1遺伝子を 含むプラスミ ド p CHCDH 1から以下に示す 2つのプライマー（配列番号 3 3、 34) を用いて PCR法により、 コリオラス · ヒルスタス由来セロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子の 8番目のエタソンを含む約 6 50 b pの DNA断片を P C R法により増幅し、制限酵素 Xb a I と Nc o Iで消化した DNA断片を得た（断 片 5)。
5， -TCTAGATTTACTGGTACCCCAACAACAATG-3' (配列番号 33 )
5' -CCATGGGTTGATCGACGGGTTGTCAGACACG-3' (配列番号 34 ) 上記断片 4と断片 5を混合して、 T 4 DN Aリガーゼで連結した後、 大腸菌 J Ml 09株の形質転換を行い、 アンピシリン耐性の形質転換株から、 上記断片 5 の DNA断片が揷入されているプラスミ ドを単離し、 これを p GPantiCDH 1 と命名した。 この p GPantiCDH 1を制限酵素 Xb a I と H i n dill で消化 し、 ベクター部分とした （断片 6)。
次に、 コリオラス ' ヒルスタス由来マンガンパーォキシダーゼ遺伝子を含むプ ラスミ ド pBSMPOGl(FERMP- 14933)を以下に示す 2つのプライマー（配列番号 3 5、 3 6) を用いて P CR法によりマンガンパーォキシダーゼの C末側非翻訳領域の 増幅を行い、 制限酵素 Xb a I と H i n dill で消化し、 約 1 k bの DNA断片 を得た （断片 7)。
5， -TCTAGAGTCACCTCCGT-3 ' (配列番号 3 5 )
5' -AAGCTTGGGTACTGTG-3 (配列番号 3 6 )
上記断片 6と断片 7を混合して、 T 4 DN Aリガーゼで連結した後、 大腸菌 J Ml 0 9株の形質転換を行い、 アンピシリン耐性の形質転換株から、 上記断片 7 の DNA断片が順方向で揷入されているプラスミ ドを単離し、 これを p GPCD HAMと命名した。
[実施例 14] コリオラス ' ヒルスタス由来セロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子のァ ンチセンス配列を有するプラスミ ドの構築
実施例 1 3で得られたプラスミ ド p GP CDHAMを制限酵素 N c o I と Xb a Iで消ィ匕し、 ベクター部分の DNA断片を調製した （断片 8)。 次に、 実施例 3 で得られたコリォラス · ヒルスタス由来のセロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子を含む プラスミ ド pCHCBHI26に対し、次に 2つのプライマーを用いて P CR反応を行い、 約 75◦ b pの DNA断片を増幅した後、 制限酵素 N c o I と X b a Iで消化す ることにより DNA断片を得た （断片 9)。
5 ' -TCTAGAGCC AACCTCGAGGGGTGG-3 ' (配列番号 3 7)
5'-CCATGGGAACGTCGAGCCGATGGG-3' (配列番号 38)
上記断片 8と断片 9を混合して、 T4DNAリガーゼで連結した後、 大腸菌 J Ml 0 9株の形質転換を行い、 アンピシリン耐性の形質転換株から、 上記断片 9 の DN A断片が揷入されているプラスミ ドを単離し、 これを p GPCBH I 2 6 AMと命名した。
[実施例 1 5] コリォラス · ヒルスタス由来セロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子のァ ンチセンス配列を有するプラスミ ドの構築
実施例 1 3で得られたプラスミ ド p GP CDHAMを制限酵素 N c o I と X b a Iで消ィ匕し、 ベクター部分の DNA断片を調製した （断片 8)。 次に、 実施例 4 で得られたコリオラス . ヒルスタス由来のセロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子を含む プラスミ ド pCHCBHI27に対し、次に 2つのプライマーを用いて P C R反応を行レ、、 約 7 50 b pの DNA断片を増幅した後、 制限酵素 N c o Iと X b a Iで消化す ることにより DNA断片を得た （断片 1 0)。
5 ' -TCTAGAGCCAACGTCCTCGGCTGG-3 ' (配列番号 3 9)
5，- CCATGGGTAGGTCGAGCCGATGGG- 3， （配列番号 40)
上記断片 8と断片 1 0を混合して、 T 4 DN Aリガーゼで連結した後、 大腸菌 JM1 09株の形質転換を行い、 アンピシリン耐性の形質転換株から、 上記断片 1 0の DNA断片が挿入されているプラスミ ドを単離し、 これを p GPCBH I 27 AMと命名した。
[実施例 1 6] コリオラス ' ヒルスタス由来セロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子のァ ンチセンス配列を有するプラスミ ドの構築
実施例 1 3で得られたプラスミ ド p G P CDHAMを制限酵素 N c o I と X b a Iで消ィヒし、 ベクター部分の DNA断片を調製した （断片 8)。 次に、 実施例 5 で得られたコリオラス · ヒルスタス由来のセロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子を含む プラスミ ド pCHCBHI31に対し、次に 2つのプライマーを用いて P CR反応を行い、 約 7 50 b pの DNA断片を増幅した後、 制限酵素 N c o I と X b a Iで消化す ることにより DNA断片を得た （断片 1 1)。
5， - TCTAGAGCCAACGTCCTCGGCTGG- 3， （配列番号 41)
5'-CCATGGAGCGTAGGTCGAGCCAATG-3' (配列番号 42 )
上記断片 8と断片 1 1を混合して、 T 4 DN Aリガーゼで連結した後、 大腸菌 JM1 09株の形質転換を行い、 アンピシリン耐性の形質転換株から、 上記断片 1 1の DNA断片が挿入されているプラスミ ドを単離し、 これを pGPCBH I 3 1 AMと命名した。 [実施例 1 7] コリオラス 'ヒルスタス由来セロビォヒ ドロラーゼ Π遺伝子のァ ンチセンス配列を有するプラスミ ドの構築
実施例 1 3で得られたプラスミ ド p GP CDHAMを制限酵素 N c o I と X b a Iで消化し、 ベクター部分の DNA断片を調製した （断片 8)。 次に、 実施例 6 で得られたコリォラス · ヒルスタス由来のセロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子を含む プラスミ ド pCHCBHIIに対し、 次に 2つのプライマーを用いて P CR反応を行い、 約 600 b pの DNA断片を増幅した後、 制限酵素 N c o I と X b a Iで消化す ることにより DNA断片を得た （断片 1 2)。
5'-TCTAGAATCTACCTGAGCCCTTAC-3' (配列番号 43)
5 ' -CCATGGCTCACTAGTGGCGAGACC-3 ' (配列番号 44)
上記断片 8と断片 1 2を混合して、 T4DNAリガーゼで連結した後、 大腸菌 JM1 09株の形質転換を行い、 アンピシリン耐性の形質転換株から、 上記断片 1 2の DNA断片が挿入されているプラスミ ドを単離し、 これを p GP CBHII AMと命名した。
[実施例 1 8] コリオラス ' ヒルスタス由来ファミリ一 6 1に属するェンドグル カナーゼ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミ ドの構築
実施例 1 3で得られたプラスミ ド p G P CDHAMを制限酵素 N c o I と X b a Iで消ィ匕し、 ベクター部分の DNA断片を調製した （断片 8)。 次に、 実施例 1 2で得られたコリォラス · ヒルスタス由来の糖分解酵素ファミリ一 6 1に属する ェンドグルカナーゼ c DNA遺伝子に対し、 次の 2つのプライマーを用いて P C R反応を行い、 約 6 00 b pの DNA断片を増幅した後、 制限酵素 N c o l と X b a Iで消化することにより DNA断片を得た （断片 1 3)。
5 ' -TCTAGAGCTCACGGTTTCATTCATG-3 ' (配列番号 4 5)
5 ' -CCATGGGGTGTAGAGCCCCGGAATG-3 ' (配列番号 46 )
上記断片 8と断片 1 3を混合して、 T4DNAリガーゼで連結した後、 大腸菌 J Ml 09株の形質転換を行い、 アンピシリン耐性の形質転換株から、 上記断片 1 3の DNA断片が揷入されているプラスミ ドを単離し、 これを p GPEG 6 1 AMと命名した。
[実施例 1 9] コリォラス · ヒルスタス由来フアミリー 1 2に属するェンドグル カナーゼ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミ ドの構築
実施例 1 3で得られたプラスミ ド p GP CDHAMを制限酵素 N c o I と X b a Iで消化し、 ベクター部分の DN A断片を調製した （断片 8)。 次に、 実施例 9 で得られたコリオラス ' ヒルスタス由来の糖分解酵素ファミ リ一 1 2に属するェ ンドグルカナーゼ c DN A遺伝子に対し、 次の 2つのプライマーを用いて P C R 反応を行い、 約 700 b pの DNA断片を増幅した後、 制限酵素 N c o l と Xb a Iで消化することにより DNA断片を得た （断片 1 3)。
5， - TCTAGAGCGGGCCCGTACTCGCTC - 3' (配列番号 4 7)
5，-CCATGGGTAATGTGATTCCTGTCG- 3， （配列番号 48)
上記断片 8と断片 1 3を混合して、 T4DNAリガーゼで連結した後、 大腸菌 J Ml 09株の形質転換を行い、 アンピシリ ン耐性の形質転換株から、 上記断片 1 3の DNA断片が挿入されているプラスミ ドを単離し、 これを p GPEG l 2 AMと命名した。
[実施例 20] ファネロケェテ . クリソスポリゥム由来フアミ リー 5に属するェ ンドグルカナーゼ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミ ドの構築
実施例 1 3で得られたプラスミ ド p GP CDHAMを制限酵素 N c o I と X b a Iで消ィヒし、 ベクター部分の DNA断片を調製した （断片 8)。 次に、 実施例 1 0で得られたファネロケェテ · クリソスポリゥム由来の糖分解酵素ファミリ一 5 に属するェンドグルカナーゼ遺伝子に対し、 次の 2つのプライマーを用いて P C R反応を行い、 約 6 00 b pの DNA断片を増幅した後、 制限酵素 N c o I と X b a Iで消化することにより DNA断片を得た （断片 1 5)。
5，- TCTAGAATGAAGTACTTCTTGCTC- 3， （配列番号 49)
5 ' -CCATGGCGTTTGGCGTACCGTCTG-3 ' (配列番号 50)
上記断片 8と断片 1 5を混合して、 T4DNAリガーゼで連結した後、 大腸菌 JM1 0 9株の形質転換を行い、 アンピシリン耐性の形質転換株から、 上記断片 14の DN A断片が揷入されているプラスミ ドを単離し、 これを p GPPCEG 5 AMと命名した。
[実施例 2 1] ファネロケェテ ' クリ ソスポリゥム由来フアミ リー 9に属するェ ンドグルカナーゼ遺伝子のアンチセンス配列を有するプラスミ ドの構築 実施例 1 3で得られたプラスミ ド p G P CDHAMを制限酵素 N c o Iと X b a Iで消化し、 ベクター部分の DNA断片を調製した （断片 8)。 次に、 実施例 1 1で得られたファネロケェテ 'タリソスポリゥム由来の糖分解酵素フアミリー 9 に属するェンドグルカナーゼ遺伝子に対し、 次の 2つのプライマーを用いて P C R反応を行い、 約 500 b pの DNA断片を増幅した後、 制限酵素 N c o I と X b a Iで消化することにより DN A断片を得た （断片 1 6)。
5 ' -TCTAGACCCCGGTACAGACGCCGC-3 ' (配列番号 5 1 )
5，_CCATGGGATGTTAGGAATGATCTG- 3' (配列番号 5 2 )
上記断片 8と断片 1 6を混合して、 T 4 DN Aリガーゼで連結した後、 大腸菌 JM1 09株の形質転換を行い、 アンピシリン耐性の形質転換株から、 上記断片 1 5の DNA断片が揷入されているプラスミ ドを単離し、 これを p GP P CEG 9 AMと命名した。
[実施例 22] コリオラス . ヒルスタス形質転換方法
a. 一核菌糸体培養
直径 6 mm前後のガラスビーズを約 30個入れた 500m l容三角フラスコに SMY培地 （シユークロース 1 %、 麦芽エキス 1 %、 酵母エキス 0. 4%) 1 0 0 m 1を分注して滅菌後、 コリオラス 'ヒルスタス 0JI - 1078株の平板寒天培地か ら直径 5mmの寒天片をコルクボーラ一で打ち抜き SMY培地に植菌し、 28 °C で 7日間静置培養した （前培養）。 ただし、 菌糸を細分化するために、 1日に 1〜 2回振り混ぜた。次に、 1 L容の三角フラスコに SMY培地 200m lを分注し、 さらに回転子を入れ、 滅菌後、 前培養菌糸をナイロンメ ッシュ （孔径 30 Ai m) で濾集し、 全量を植菌し、 28°Cで培養した。 なお、 スターラーで 1日 2時間程 度撹拌することにより菌糸を細分化した。 この培養を 4日間行った。
b. プロ トプラス トの調製
上記液体培養菌糸をナイロンメ ッシュ （孔径 30 m) で濾集し、 浸透圧調節溶 液 （0. 5M Mg S04、 50m lマレイン酸バッファー （pH5. 6 )) で洗 浄した。 次に、 湿菌体 1 0 Omgあたり lm 1の細胞壁分解酵素液に懸濁し、 緩 やかに震盪しながら 28 °Cで 3時間インキュベートしてプロトプラストを遊離さ せた。細胞壁溶解酵素として、次の市販酵素製剤を組み合わせて使用した。即ち、 セルラーゼ 'オノズカ （cellulase 0N0ZUKA RS) ヤクルト社製 5 m g、 ャタラー ゼ （Yatalase) (宝酒造社製） 1 0 m gを上記浸透圧調節溶液 1 m gに溶解して酵 素液として用いた。
c . プロ トプラス トの精製
上記酵素反応液からナイロンメッシュ （孔径 3 0 μ πι) で菌糸断片を除いた後、 プロ トプラストの回収率を高めるため、 ナイロンメッシュ上に残存する菌糸断片 とプロ トプラストを上記浸透圧調節溶液で 1回洗浄した。 得られたプロ トプラス ト懸濁液を遠心分離 （l, 000kX g、 5分間） し、 上静を除去し、 4 m l の 1 Mシ ユークロース （ 2 0 mM MO P S緩衝液、 p H 6. 3 ) で再懸濁後、 遠心操作 を繰り返し、 上記 1 Mシユークロース溶液で 2回洗浄した。 沈殿物に 1 Mソルビ トール溶液 （2 0mMME S、 p H 6. 4) に 4 0 mM塩化カルシウムを加えた 溶液 5 0 0 μ Iに懸濁し、 プロ トプラスト溶液とした。 この溶液を 4 °Cで保存し た。
プロ トプラス ト濃度は血球計算盤を用いて、 直接検鏡により求めた。 すべての 遠心操作はスウィングローターで 1， 000X g、 5分間、 室温下で行った。
d . 形質転換
106個/ ΙΟΟμ Ι濃度のプロ トプラスト溶液 ΙΟΟμ Ι に対して、 実施例 1 2で作製 したプラスミ ド p G P CDH 1 ( 2 μ g) を添加した。 さらに選択マーカーとし て、 コリオラス · ヒノレスタス由来のオノレニチンカノレバモイノレトランスフェラーゼ 遺伝子を保持するプラスミ ド p UCR 1 (特開平 6— 0 5 4 6 9 1号公報； FERM BP - 4201) を 0. 2 g添加し 3 0分間氷冷した。 次に、 液量に対して等量の P E G溶液 （50%PEG3400、20mMM0PS(pH6.4)) を加え、 3 0分間氷冷した。 次に、 0. 5 Mシュークロースおよびロイシンを含む最少寒天培地 （寒天 1 %) に混合して プレートに撒いた。上記プレートを 28°Cで数日間培養を行い、形質転換体を得た。 さらに形質転換体から DN Aを調製し、 目的とするセロビオースデヒ ドロゲナー ゼ遺伝子発現プラスミ ド p G P CDH lが組み込まれていることをサザンハイブ リダイゼーシヨンにより確認した。
[実施例 2 3] セロビオースデヒ ドロゲナーゼを高分泌生産するコリオラス · ヒ ルスタス形質転換体の作製 前記実施例 2 2で得られた形質転換株をグルコース ·ぺプトン培地 （ダルコ一 ス 30g/l、ポリペプトン 10g/l、KH2P04 l. 5g/l、MgS04 0. 5g/l、塩酸チアミン 2 mg/l、 リン酸で ρ Η4· 5 に調製） を 100m 1ずつ含む 300m 1容三角フラスコに植菌し、 28°C、 lOOrpmで震盪培養した。 上記に示すセロビオースデヒ ドロゲナーゼ活性測 定方法を用いて、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼ活性を経時的に測定した。 コン ト口ールでは 0. 02U/mlであったが、 形質転換体では 0. 2U/mlであった。
[実施例 2 4 ] セロビオースデヒ ドロゲナーゼ活性を抑制した形質転換体の選抜 前記実施例 2 2に示した形質転換法の中で示したプラスミ ド p G P C D H lを 実施例 1 3で作製した p G P C D H AMに変えて形質転換を行った。 得られた形 質転換体は酸素漂白後広葉樹パルプ（L0KP) ·ぺプトン培地 （L0KPl°/。、 ポリぺプト ン 0. 5%、 酵母エキス 0. 2%、 KH2P04 0. 15°/。、MgS04 0. 05°/。、 リン酸で p H4. 5に調製） を 100m 1ずつ含む 300m 1容三角フラスコに植菌し、 28°C、 lOOrpmで震盪培養 した。 上記したセロビオースデヒ ドロゲナーゼ活性測定方法を用いて、 セロピオ 一スデヒ ドロゲナーゼ活性を経時的に測定した。 その結果、 セロビオースデヒ ド 口ゲナーゼ活性を最大で 70%抑制された形質転換体を得ることができた。
[実施例 2 5 ] セロビオースデヒ ドロゲナーゼを抑制した形質転換体を用いたチ ップ処理
実施例 2 4により選抜したセロビオースデヒ ドロゲナーゼ活性を抑制した形質 転換株をポテトデキス トロース寒天培地上で 2 8 °Cにて培養した後、 4 °Cで保存 した。 このプレートから直径 5 mmのコルクボーラ一で打ち抜いた切片を 5つずつ、 グルコース .ペプトン培地 （グルコース 2 %、 ポリペプトン 0. 5%、 酵母エキス 0. 2%、 KH2P04、MgS04 0. 05%、 リン酸で p H4. 5に調製） を 100mlずつ含む 300ml 容三角フラスコに植菌し、 28°C、 lOOrpmで 1週間震盪培養した。 培養後、 菌体を ろ別し、 菌体に残存した培地を滅菌水で洗浄した。 菌体は滅菌水と共に、 ヮーリ ングブレンダ一で 15sec粉砕し、 絶乾重量 1 k gのユーカリ材に対し、 菌体の乾 燥重量が l O m gになるように植菌した。 植菌後は菌が全体に行き渡るようによ く撹拌した。 培養は 2 8 °Cで通気をしながら 1週間静置培養を行った。 チップ含 水率が 40〜65%になるように随時飽和水蒸気を通気させた。通気する際の通気量 は対チップ当り、 0. Olvvmになるように行った。 [実施例 2 6 ] セロビオースデヒ ドロゲナーゼ活性を抑制した形質転換体による 機械パルプの製造
ラジア一タパイン材を用い実施例 2 5に準じてチップ処理を行った。 処理後の 木材チップをラボ用リファイナー （熊谷理機社製） を用いて叩解して、 カナディ アンスタンダードフリネスを 200ml とした後、 パルプ物理用試験用手抄きシート の調製は Tappi試験法 Τ205ΟΠ1-81に準拠して、 パルプ手抄きシートの物理試験は Tappi法 T220 om- 83に準拠して行った。使用電力量はヮットメーター（Hiokidenki raodel3133) と積分計 （model3141) を用いた。 チップ収率測定は水分を含んだ木 材チップを容器に絶乾重量で 1 k g分取し、処理前後のチップ絶乾重量を測定し、 以下の式を用いてチップ収率を算出した。
(処理後の絶乾重量） Z (処理前の絶乾重量） X 1 0 0
表 3に示すようにセ口ビオースデヒ ドロゲナーゼを抑制した形質転換株は収率 減を抑制することができ、 解繊エネルギーを削減できた。 また、 引裂き強さ、 破 裂強さ共に増加した。 野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られた ものの、 紙力は低下した。 表 3
セロビオースデヒ ドロゲナーゼ活性を抑制した微生物を用いた木材チップ処理が 機械パルプへ与える影響
Figure imgf000050_0001
[実施例 2 7 ] セロビオースデヒ ドロゲナーゼ活性を抑制した形質転換体により 処理したチップの蒸解
実施例 2 5に準じてユーカリ材のチップ処理を行った後、 絶乾重量 400 gのチ ップを測りとりォートクレープ内で液比 5、硫化度 30%、有効アル力リ 17% (Na2 0 として） となるように蒸解白液を加え、 蒸解温度を 150°Cにてクラフト蒸解を行 つた。 クラフト蒸解終了後、 黒液を分離し、 得られたチップを高濃度離解機によ つて解繊後、 濾布で遠心脱水と水洗浄を 3回繰り返した。 次いでスクリーンによ り、 未蒸解物を除き、 遠心脱水し蒸解未漂白パルプを得た。
上記のクラフト蒸解して得られたパルプに対して、 NaOHを 2. 0質量。 /0添加し、 酸素ガスを注入し、 100°C、 酸素ゲージ圧 0. 49MPa (5kgん m2 )で 60分間処理を行 つた。
上記で得たパルプを下記に示すように、 D— E— P— Dの 4段漂白処理を行つ た。最初の二酸化塩素処理（D )は、パルプ濃度が 10質量％となるように調製し、 二酸化塩素を 0. 4質量％添加し、 70°C、 40分間処理を行った。 次いで、 イオン交 換水にて洗浄、 脱水後、 パルプ濃度を 10質量％に調製し、 苛性ソーダを 1質量％ 添力 Bし、 70°C、 90分間のアルカリ抽出処理 （E ) を行った。 次いで、 イオン交換 水にて洗浄、 脱水後、 パルプ濃度を 10質量％に調製し、 過酸化水素 0. 5質量％、 苛性ソーダ 0. 5質量％を順次添加し、 70°C、 120分間の過酸化水素処理 （P ) を 行った。 次いで、 イオン交換水にて洗浄、 脱水後、 パルプ濃度を 10%に調製し、 二酸化塩素 0. 25質量％を添加し、 70°C、 180分間二酸化塩素処理（D )を行った。 最後にイオン交換水にて洗浄、脱水後、 JIS P 8123に準じた白色度 86. 0%の漂 白パルプを得た。
上記で得たパルプ濃度が 4質量％のパルプスラリーをリファイナ一によりフリ 一ネスが 410ml (CSF)となるように叩解した。
[実施例 2 8 ] K a価の測定、 パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、 パルプ 手抄きシートの物理試験
カッパ一価の測定は、 JIS P 8211に準じて行った。 パルプ物理用試験用手抄き シートの調製は Tappi試験法 T205- om81に準拠して、 パルプ手抄きシートの物理 試験は Tappi法 T220om- 83に準拠して行った。 表 4に示すように、 形質転換体、 野生株で木材チップを処理すると蒸解後の K a価は減少し、 精選収率は増加し、 粕率は減少した。 また、 表 5に示すように野生株と比較すると、 形質転換体は紙 力低下を引き起こさなかった。 表 4
セロビオースデヒ ドロゲナーゼ活性を抑制した微生物を用いたチップ処理が蒸解 性に与える影響
Figure imgf000052_0001
表 5
セ口ビオースデヒ ドロゲナーゼ活性を抑制した微生物を用いた木材チップ処理が 紙力強度に与える影響
白色度 86、 C S F (カナディアンショッパーフリーネス） =41 Om l
Figure imgf000052_0002
注） C o n t r o lは微生物処理を行わなかった木材チップ処理により/ ートを作製したもの
[実施例 29] セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体の選抜 前記実施例 2 2に示した形質転換法の中で示したプラスミ ド p GP CDH lを 実施例 14で作製した p GPCBH I 26 AMに変えて形質転換を行った。 得ら れ た 形 質 転 換 体 は 実 施 例 2 4 と 同 様 の 方 法 で 培 養 し 、 4-methyl-0-umbellifferyl-cellobioside を基質としたセロビォヒドロラーゼ I 活性測定方法を用いて、 セロビォヒドロラーゼ I活性を経時的に測定した。 その 結果、 セロビォヒ ドロラーゼ I活性を最大で 60 %抑制された形質転換体を得る ことができた。
[実施例 3 0 ] セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体を用いたチッ プ処理
実施例 2 9により選抜したセ口ビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した形質転換株 を用い実施例 2 5と同様の方法によりユーカリ材に対しチップ処理を行った。
[実施例 3 1 ] セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体による機械パ ルプの製造
ラジア一タパイン材を用い実施例 2 5に準じてチップ処理を行い、 実施例 2 6 同様の試験を行った。 表 6に示すようにセロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した 形質転換株は収率減を抑制することができ、解繊エネルギーを削減できた。また、 引裂き強さ、 破裂強さ共に増加した。 野生株で処理すると解繊エネルギーの削減 効果は得られたものの、 紙力は低下した。 表 6
セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した微生物を用いた木材チップ処理が機械パ ルプへ与える影響
Figure imgf000053_0001
[実施例 3 2 ] セロビォヒドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体により処理し たチップの蒸解
実施例 3 0で処理したチップに対して実施例 2 7と同様の方法にて蒸解を行つ た。
[実施例 3 3 ] K a価の測定、 パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、 パルプ 手抄きシートの物理試験
実施例 3 2で得られたパルプを実施例 2 8に準じて力ッパー価の測定等を行つ た。 表 7に示すように、 形質転換体、 野生株で木材チップを処理すると蒸解後の K a価は減少し、 精選収率は増加し、 粕率は減少した。 また、 表 8に示すように 野生株と比較すると、 形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。 ' 表 7
セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した微生物を用いたチップ処理が蒸解性に与 える影響
Figure imgf000054_0001
表 8
セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した微生物を用いた木材チップ処理が紙力強 度に与える影響
白色度 86、 C S F (カナディアンショッパーフリーネス） =4 1 0m l
Figure imgf000054_0002
注） C o n t r o lは微生物処理を行わなかった木材チップ処理によりパルプシ ートを作製したもの
[実施例 34] セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体の選抜 前記実施例 2 2に示した形質転換法の中で示したプラスミド p GP CDH lを 実施例 1 5で作製した p GPCBH I 2 7 AMに変えて形質転換を行った。 得ら れた形質転換体は実施例 2 6 と 同様の方法にて培養を行い、 4-methyl-0-umbel l ifferyl-cellobios ide を基質としたセロビォヒ ドロラーゼ I 活性測定方法を用いて、 セロビォヒ ドロラーゼ I活性を経時的に測定した。 その 結果、 セ口ビォヒ ドロラーゼ I活性を最大で 7 0 %抑制された形質転換体を得る ことができた。
[実施例 3 5 ] セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体を用いたチッ プ処理
実施例 3 4により選抜したセロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体 を実施例 2 5と同様の方法によりユーカリ材に対し、 チップ処理を行った。
[実施例 3 6 ] セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体による機械パ ルプの製造
実施例 3 4で得られた形質転換体を用いてラジアータパイン材に対し実施例 2 5に準じてチップ処理を行い、 実施例 2 6と同様の試験を行った。 表 9に示すよ うにセ口ビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した形質転換株は収率減を抑制すること ができ、 解繊エネルギーを削減できた。 また、 引裂き強さ、 破裂強さ共に増加し た。 野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、 紙力は低 下した。 表 9
セロビォヒドロラーゼ I活性を抑制した微生物を用いた木材チップ処理が機械パ ルプへ与える影響
Figure imgf000055_0001
[実施例 3 7 ] セロビォヒドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体により処理し たチップの蒸解 実施例 25に準じてユーカリ材のチップ処理を行った後、 実施例 2 7と同様の 方法にて処理チップの蒸解を行った。
[実施例 38] K a価の測定、 パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、 パルプ 手抄きシートの物理試験
実施例 37で得られたパルプを実施例 28に準じて力ッパー価の測定等を行つ た。 表 1 0に示すように、 形質転換体、 野生株で木材チップを処理すると蒸解後 の K a価は減少し、 精選収率は増加し、 粕率は減少した。 また、 表 1 1に示すよ うに野生株と比較すると、 形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。 表 1 0
セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した微生物を用いたチップ処理が蒸解性に与 える影響
Figure imgf000056_0001
セロビォヒドロラーゼ I活性を抑制した微生物を用いた木材チップ処理が紙力強 度に与える影響
白色度 86、 C S F (カナディアンショッパーフリーネス） =4 1 0m l
Figure imgf000056_0002
注） C o n t r o lは微生物処理を行わなかった木材チップ処理によりパルプシ 一トを作製したもの
[実施例 3 9〕 セロビォヒドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体の選抜 前記実施例 2 2に示した形質転換法の中で示したブラスミ ド p G P C D H lを 実施例 1 6で作製した p G P C B H I 3 1 AMに変えて形質転換を行った。 得ら れた形質転換体は実施例 2 4 と 同様の方法にて培養 を行い、 4 methyl-0- umbellifferyl - cellobioside を基質としたセロビォヒドロラーゼ I 活性測定方法を用いて、 セロビォヒドロラーゼ I活性を経時的に測定した。 その 結果、 セ口ビォヒ ドロラーゼ I活性を最大で 7 0 %抑制された形質転換体を得る ことができた。
[実施例 4 0 ] セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体を用いたチッ プ処理
実施例 3 9により選抜したセ口ビォヒドロラーゼ I活性を抑制した形質転換株 を用い実施例 2 5と同様の方法によりユー力リ材に対し、 チップ処理を行った。
[実施例 4 1 ] セロビォヒドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体による機械パ ルプの製造
実施例 3 9で得られた形質転換体を用い、 ラジア一タパイン材に対し、 実施例 2 5に準じてチップ処理を行い、 実施例 2 6と同様の試験を行った。
表 1 2に示すようにセロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した形質転換株は収率 減を抑制することができ、 解繊エネルギーを削減できた。 また、 引裂き強さ、 破 裂強さ共に増加した。 野生株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られた ものの、 ，紙力は低下した。 表 1 2
セロビォヒドロラーゼ I活性を抑制した微生物を用いた木材チップ処理が機械パ ルプへ与える影響
Control 形質転換体 野性株
チップ収率 （％) 99. 8 98. 3 94. 7 角军繊エネルギー（Kw h/ton) 2560 1820 1840 比引裂強さ（mN'm2/g) 7. 92 8. 35 6. 95 比破裂強さ（kPa 'm 2/g) 1. 35 1. 43 1. 21
[実施例 4 2 ] セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した形質転換体により処理し たチップの蒸解
実施例 3 9より得られたチップを実施例 2 7と同様の方法にて処理チップの蒸 解を行った。
[実施例 4 3 ] K a価の測定、 パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、 パルプ 手抄きシートの物理試験
実施例 4 2より得られたパルプを実施例 2 8に準じて力ッパー価の測定等を行 つた。 表 1 3に示すように、 形質転換体、 野生株で木材チップを処理すると蒸解 後の K a価は減少し、 精選収率は増加し、 粕率は減少した。 また、 表 1 4に示す ように野生株と比較すると、 形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。 表 1 3
セロビォヒドロラーゼ I活性を抑制した微生物を用いたチップ処理が蒸解性に与 える影響
Control 形質転換体 野性株
蒸解後 Ka価 20. 1 17. 8 17. 7 精選収率（％) 45. 7 47. 4 47. 3 粕率（％) 1. 20 0. 63 0. 84 表 1 4
セロビォヒ ドロラーゼ I活性を抑制した微生物を用いた木材チップ処理が紙力強 度に与える影響
白色度 8 6、 C S F (カナディアンショッノ、 'ーフリ一ネス） = = 4 1 0 m 1
Control 形質転換体 野性株 P F I (r e v) 2， 600 2, 200 2, 200 比引裂強さ（mN'mVg) 9.4 9.1 8.5 裂断長 （km) 8.62 8.61 ' 7.34 非破裂強さ（kPa'mVg) 6.76 7.73 7.54 耐折強さ (logT) 2.31 2.35 2.19 注） C o n t r o lは微生物処理を行わなかった木材チップ処理によりパルプシ 一トを作製したもの
[実施例 44] セロビォヒ ドロラーゼ II活性を抑制した形質転換体の選抜 前記実施例 22に示した形質転換法の中で示したプラスミ ド p GPCDH lを 実施例 1 7で作製した p G P C B H I I AMに変えて形質転換を行つた。 得られ た形質転換体を実施例 23と同様の培養を行い、 培養菌体を経時的にサンプリン グし、 mRNAを回収し、 セロビォヒ ドロラーゼ II遺伝子の存在量を測定した。 その結果、宿主細胞と比較してセロビォヒドロラーゼ II活性が約 50%抑制され ている形質転換体を得ることができた。
[実施例 45]セロビォヒ ドロラーゼ II活性を抑制した形質転換体を用いたチッ プ処理
実施例 44により選抜したセロビォヒドロラーゼ II 活性を抑制した形質転換 株を実施例 25記載の方法によりユー力リ材に対しチップ処理をした。
[実施例 46 ]セロビォヒ ドロラーゼ II活性を抑制した形質転換体による機械パ ルプの製造
実施例 44で得られた形質転換体を用いラジア一タパイン材に対し、 実施例 2 5に準じてチップ処理を行った。 処理後の木材チップを実施例 26記載の方法に より紙力などの検討を行った。表 1 5に示すようにセロビォヒ ドロラーゼ II活性 を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、 解繊エネルギーを削減で きた。 また、 引裂き強さ、 破裂強さ共に増加した。 野生株で処理すると解繊エネ ルギ一の削減効果は得られたものの、 紙力は低下した。 表 1 5 セ口ピオヒドロラーゼ Π活性を抑制した微生物を用いた木材チップ処理が機械パ ルプへ与える影響
Figure imgf000060_0001
[実施例 4 7 ]セロビォヒ ドロラーゼ II活性を抑制した形質転換体により処理し たチップの蒸解
実施例 4 5で得られたチップを、 実施例 2 7と同様の方法にて処理チップの蒸 解を行った。
[実施例 4 8 ] K a価の測定、 パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、 パルプ 手抄きシートの物理試験
実施例 4 7で得られたパルプを、 実施例 2 8に準じて力ッパー価の測定等を行 つた。 表 1 6に示すように、 形質転換体、 野生株で木材チップを処理すると蒸解 後の K a価は減少し、 精選収率は増加し、 粕率は減少した。 また、 表 1 7に示す ように野生株と比較すると、 形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった„ 表 1 6
セロビォヒドロラーゼ Π活性を抑制した微生物を用いたチップ処理が蒸解性に与 える影響
Figure imgf000060_0002
表 1 7 セロビォヒ ドロラーゼ Π活性を抑制した微生物を用いた木材チップ処理が紙力強 度に与える影響
白色度 8 6、 C S F (カナディアンショ ッパーフリーネス） =41 0m l
Figure imgf000061_0001
注） C o n t r o lは微生物処理を行わなかった木材チップ処理によりパルプシ ートを作製したもの
[実施例 49] 糖分解酵素フアミ リー 6 1に属するェンドグルカナーゼ活性を抑 制した形質転換体の選抜
前記実施例 22に示した形質転換法の中で示したプラスミ ド p GPCDH lを 実施例 1 8で作製した p GPEG 6 1 AMに変えて形質転換を行った。 得られた 形質転換体を実施例 23と同様の培養を行い培養液を経時的にサンプリングし、 カルボキシメチルセルロース （CMC) 分解活性を測定した。 その結果、 宿主細 胞と比較してェンドグルカナーゼ活性が約 50 %抑制されている形質転換体を得 ることができた。
[実施例 50] 糖分解酵素フアミリー 6 1に属するェンドグルカナーゼ活性を抑 制した形質転換体を用いたチップ処理
実施例 49により選抜した糖分解酵素フアミリー 6 1に属するエンドダルカナ ーゼ活性を抑制した形質転換株を実施例 2 5に記載の方法によりユー力リ材に対 しチップ処理をした。
[実施例 5 1 ] 糖分解酵素フアミリー 6 1に属するエンドダルカナーゼ活性を抑 制した形質転換体による機械パルプの製造
実施例 49で得られた形質転換体をラジァータパイン材に対し、 実施例 2 5に 準じてチップ処理を行った。 処理後の木材チップを実施例 26記載の方法により 紙力などの検討を行った。 表 1 8に示すように糖分解酵素フアミリー 6 1に属す るェンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、 解繊エネルギーを削減できた。 また、 引裂き強さ、 破裂強さ共に増加した。 野生 株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、 紙力は低下した。 表 1 8
糖分解酵素フアミリー 6 1に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制した微生物を 用いた木材チップ処理が機械パルプへ与える影響
Figure imgf000062_0001
[実施例 5 2 ] 糖分解酵素フアミリー 6 1に属するェンドグルカナーゼ活性を抑 制した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例 5 0で得られたチップを、 実施例 2 7記載の方法により処理チップの蒸 解を行った。
[実施例 5 3 ] K a価の測定、 パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、 パルプ 手抄きシートの物理試験
実施例 5 2で得られたパルプを、 実施例 2 8記載の方法に準じてカッパ一価の 測定などを行った。 表 1 9に示すように、 形質転換体、 野生株で木材チップを処 理すると蒸解後の K a価は減少し、 精選収率は増加し、 粕率は減少した。 また、 表 2 0に示すように野生株と比較すると、 形質転換体は紙力低下を引き起こさな かった。 表 1 9
糖分解酵素フアミリー 6 1に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制した微生物を 用いたチップ処理が蒸解性に与える影響 し ontrol 形質転換体 野性株
蒸解後 Ka価 20.1 17.7 17.7 精選収率（％) 45.7 47.6 47.3 粕率（％) 1.20 0.73 0.84 表 20
糖分解酵素ファミリ一 6 1に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制した微生物を 用いた木材チップ処理が紙力強度に与える影響
白色度 8 6、 C S F (カナディアンショッパーフリーネス） =41 Om l
Figure imgf000063_0001
注） C o n t r o lは微生物処理を行わなかった木材チップ処理によりパルプシ 一トを作製したもの
[実施例 54] 糖分解酵素フアミリー 1 2に属するェンドグルカナーゼ活性を抑 制した形質転換体の選抜
前記実施例 22に示した形質転換法の中で示したプラスミ ド p GP CDH lを 実施例 1 9で作製した p GPEG l 2 AMに変えて形質転換を行った。 得られた 形質転換体を実施例 2 3と同様の培養を行い培養液を経時的にサンプリングし、 カルボキシメチルセルロース （CMC) 分解活性を測定した。 その結果、 宿主細 胞と比較してエンドグルカナーゼ活性が約 50 %抑制されている形質転換体を得 ることができた。
[実施例 55 ] 糖分解酵素フアミリー 1 2に属するェンドグルカナーゼ活性を抑 制した形質転換体を用いたチップ処理 実施例 5 4により選抜した糖分解酵素フアミリー 1 2に属するエンドダルカナ ーゼ活性を抑制した形質転換株を実施例 2 5に記載の方法によりユー力リ材に対 しチップ処理をした。
[実施例 5 6 ] 糖分解酵素フアミリー 1 2に属するェンドグルカナーゼ活性を抑 制した形質転換体による機械パルプの製造
実施例 5 4で得られた形質転換体をラジア一タパイン材に対し、 実施例 2 5に 準じてチップ処理を行った。 処理後の木材チップを実施例 2 6記載の方法により 紙力などの検討を行った。 表 2 1に示すように糖分解酵素フアミリー 1 2に属す るェンドグルカナーゼ活性を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、 解繊エネルギーを削減できた。 また、 引裂き強さ、 破裂強さ共に増加した。 野生 株で処理すると解繊エネルギーの削減効果は得られたものの、 紙力は低下した。 表 2 1
糖分解酵素フアミリー 1 2に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制した微生物を 用いた木材チップ処理が機械パルプへ与える影響
Figure imgf000064_0001
[実施例 5 7 ] 糖分解酵素フアミリー 1 2に属するエンドダルカナーゼ活性を抑 制した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例 5 5で得られたチップを、 実施例 2 7記載の方法により処理チップの蒸 角 を行った。
[実施例 5 8 ] K a価の測定、 パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、 パルプ 手抄きシートの物理試験
実施例 5 6で得られたパルプを、 実施例 2 8記載の方法に準じて力ッパー価の 測定などを行った。 表 2 2に示すように、 形質転換体、 野生株で木材チップを処 理すると蒸解後の K a価は減少し、 精選収率は増加し、 粕率は減少した。 また、 表 23に示すように野生株と比較すると、 形質転換体は紙力低下を引き起こさな かった。 表 22
糖分解酵素フアミリー 1 2に属するェン ーゼ活性を抑制した微生物を 用いたチップ処理が蒸解性に与える影響
Figure imgf000065_0001
表 23
糖分解酵素ファミリ一 1 2に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制した微生物を 用いた木材チップ処理が紙力強度に与える影響
白色度 8 6、 C S F (カナディアンショ ッパーフリーネス） =41 0m l
Figure imgf000065_0002
注） C o n t r o lは微生物処理を行わなかった木材チップ処理によりパルプシ ートを作製したもの
[実施例 5 9 ] 糖分解酵素ファミリ一 5に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制 した形質転換体の選抜
前記実施例 22に示した形質転換法の中で示したプラスミ ド p GPCDH lを 実施例 2 0で作製した p G P P C E G 5 AMに変えて形質転換を行つた。 得られ た形質転換体を実施例 2 3に記載の方法で培養を行い、培養液を経時的に回収し、 カルボキシメチルセルロース （C M C ) 分解活性を測定した。 その結果、 宿主細 胞と比較してエンドグルカナーゼ活性が約 2 0 %抑制されている形質転換体を得 ることができた。
[実施例 6 0 ] 糖分解酵素フアミリー 5に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制 した形質転換体を用いたチップ処理
実施例 5 9により選抜した糖分解酵素フアミリー 5に属するエンドダルカナー ゼ活性を抑制した形質転換株を実施例 2 5記載の方法によりユー力リ材に対しチ ップ処理をした。
[実施例 6 1 ] 糖分解酵素ファミリ一 5に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制 した形質転換体による機械パルプの製造
実施例 5 9で得られた形質転換体を用いてラジアータパイン材に対し実施例 2 5に準じてチップ処理を行った。 処理後の木材チップを実施例 2 6記載の方法に より紙力などの検討を行った。
表 2 4に示すように糖分解酵素フアミリー 5に属するェンドグルカナーゼ活性 を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、 解繊エネルギーを削減で きた。 また、 引裂き強さ、 破裂強さ共に増加した。 野生株で処理すると解繊エネ ルギ一の削減効果は得られたものの、 紙力は低下した。 表 2 4
糖分解酵素フアミリー 5に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制した微生物を用 V、た木材チップ処理が機械パルプへ与える影響
Control 形質転換体 野性株
チップ収率 （％) 99. 8 98. 2 94. 7 解繊エネルギー（Kw' h/ton) 2560 1910 1840 比引裂強さ (mN-m2/g) 7. 92 8. 05 6. 95 比破裂強さ（kPa 'm2/g) 1. 35 1. 34 1. 21 [実施例 6 2 ] 糖分解酵素ファミリ一 5に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制 した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例 6 0で得られたチップを実施例 2 7記載の方法により処理チップの蒸解 を行った。
[実施例 6 3 ] K a価の測定、 パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、 パルプ 手抄きシートの物理試験
実施例 6 2で得られたパルプを実施例 2 8に準じて力ッパー価などの測定を行 つた。 表 2 5に示すように、 形質転換体、 野生株で木材チップを処理すると蒸解 後の K a価は減少し、 精選収率は増加し、 粕率は減少した。 また、 表 2 6に示す ように野生株と比較すると、 形質転換体は紙力低下を引き起こさなかった。 表 2 5
糖分解酵素フアミリー 5に属するェン ーゼ活性を抑制した微生物を用 いたチップ処理が蒸解性に与える影響
Figure imgf000067_0001
表 2 6
糖分解酵素ファミリー 5に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制した微生物を用 いた木材チップ処理が紙力強度に与える影響
白色度 8 6 、 C S F (カナディアンショッパーフリ一ネス） = 4 1 0 m 1 し ontrol 形質転換体 野性株
P F I ( r e v ) 2, 600 2， 300 2, 200 比引裂強さ（mN'm2/g) 9. 4 9. 4 8. 5 裂断長 （k m) 8. 62 8. 55 7. 34 非破裂強さ（kPa 'm2/g) 6. 76 7. 36 7. 54 耐折強さ (logT) 2.31 2.26 2.19 注） C o n t r o lは微生物処理を行わなかつた木材チップ処理によりパルプシ ートを作製したもの
[実施例 64] 糖分解酵素フアミリー 9に属するエンドグルカナーゼ活性を抑制 した形質転換体の選抜
前記実施例 2 2に示した形質転換法の中で示したプラスミ ド p GPCDH lを 実施例 2 lで作製したp GP P CEG 9AMに変ぇて形質転換を行った。 得られ た形質転換体を実施例 23記載の方法により培養し、 培養液を経時的に回収し、 カルボキシメチルセルロース （CMC) 分解活性を測定した。 その結果、 宿主細 胞と比較してェンドグルカナーゼ活性が約 30 %抑制されている形質転換体を得 ることができた。
[実施例 65 ] 糖分解酵素ファミリ一 9に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制 した形質転換体を用いたチップ処理
実施例 64により選抜した糖分解酵素フアミリー 9に属するエンドダルカナー ゼ活性を抑制した形質転換株を実施例 25記載の方法によりユーカリ材に対しチ ップ処理をした。
[実施例 66 ] 糖分解酵素ファミリ一 9に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制 した形質転換体による機械パルプの製造
実施例 64で得られた形質転換体を用いラジア一タパイン材に対し実施例 2 5 に準じてチップ処理を行った。 処理後の木材チップを実施例 26記載の方法によ り紙力などの検討を行った。
表 2 7に示すように糖分解酵素フアミリー 9に属するエンドダルカナーゼ活性 を抑制した形質転換株は収率減を抑制することができ、 解繊エネルギーを削減で きた。 また、 引裂き強さ、 破裂強さ共に増加した。 野生株で処理すると解繊エネ ルギ一の削減効果は得られたものの、 紙力は低下した。 表 27
糖分解酵素フアミリー 9に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制した微生物を用 いた木材チップ処理が機械パルプへ与える影響
Figure imgf000069_0001
[実施例 6 7 ] 糖分解酵素ファミリ一 9に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制 した形質転換体により処理したチップの蒸解
実施例 6 5で得られたチップを、 実施例 2 7と同様の方法にて処理チップの蒸 解を行った。
[実施例 6 8 ] K a価の測定、 パルプ物理用試験用手抄きシートの調製、 パルプ 手抄きシートの物理試験
実施例 6 7で得られたパルプを、 実施例 2 8記載の方法に準じてカッパ一価な どの測定を行った。 表 2 8に示すように、 形質転換体、 野生株で木材チップを処 理すると蒸解後の K a価は減少し、 精選収率は増加し、 粕率は減少した。 また、 表 2 9に示すように野生株と比較すると、 形質転換体は紙力低下を引き起こさな かった。
¾ 2 8
糖分解酵素フアミ リー 9に属するェン ーゼ活性を抑制した微生物を用 いたチップ処理が蒸解性に与える影響
Figure imgf000069_0002
表 2 9 糖分解酵素フアミリー 9に属するェンドグルカナーゼ活性を抑制した微生物を用 レ、た木材チップ処理が紙力強度に与える影響
白色度 86、 C S F (カナディアンショ ッパーフリーネス） =41 0m l
Figure imgf000070_0001
注） C o n t r o lは微生物処理を行わなかった木材チップ処理によりノ ートを作製したもの
[実施例 6 9] セロビオースデヒ ドロゲナーゼ活性
1. 測定法の概要
セロビオースデヒ ドロゲナーゼ活' ]·生の測定は次のように行った。 0.67mMジク口 口フエノールインドフエノール （シグマ社製）、 3.33raM セロビオース （関東化学 株式会社製）、 pH5、 250mMの酢酸緩衝液をそれぞれ 250ul、 100ul、 lOOul を混 合した溶液に被検液 50ulを添加し、 3 7°Cにて反応させた。 反応開始後、 ジクロ 口 フエ ノ ールイ ン ドフ ノ ールの極大吸収波長 550nm (モル吸光係数 3965L/mol/cm) における吸光度 （光路長 1 c m) を連続的に測定した。 セロビォ 一スデヒ ドロゲナーゼの活性単位については上記の条件で 1分間に lumolのジク ロロフエノールェンドフエノールを減少させる酵素量を lunit (ュニッ ト ： U) と した。
2. 粗酵素液の調製 （1)
酸素漂白後広葉樹クラフトパルプ （カッパ一価 8.5、 白色度 46.0%) 1.0%、 ぺプ トン 1.0%、 MgS04-7H20 0.005%、 KH2P04 0.15%、 チアミン塩酸塩 20ppb を含む液 体培地 （pH5.0) 100ml を 500ml容三角フラスコに採り、 紙栓をした後、 121°Cで 15分間蒸気滅菌した。 これにコリオラス · ヒルスタス I F049 1 7株を白金耳 植菌し、 27°Cで回転振盪培養した （振幅 25賺、 120往復 Z分）。 培養終了後、 遠心 分離 （10，000rpm X 10 分） して培養上清を分離し、 セロビオースデヒ ドロゲナー ゼの粗酵素液を得た。 上記の条件で活性を測定した結果、 培養上清中のセロビォ 一スデヒ ドロゲナーゼ活性は、 培養開始後 72時間後で 0. 06 U/mlであった。
3 . 粗酵素液の調製 （2 )
了ビセル（フナコシ薬品株式会社製） 1. 0%、ぺプトン 1. 0%、 0. 005%、KH2P04 0. 15%、 チアミン塩酸塩 20ppbを含む液体培地（pH5. 0) 100mlを 500ml容三角フラスコに 採り、 紙栓をした後、 121°Cで 15分間蒸気滅菌した。 これにコリオラス · ヒルス タス IF04917株を白金耳植菌し、 27°Cで回転振盪培養した （振幅 25mm、 120往復 /分）。 培養終了後、 遠心分離 （10, 000rpm X 10分） して培養上清を分離し、 セロ ビオースデヒドロゲナーゼの粗酵素液を得た。上記の条件で活性を測定した結果、 培養上清中のセロビオースデヒ ドロゲナーゼ活性は、培養開始後 72時間後で 0. 07 U/mlであった。
4 . セロビオースデヒ ドロゲナーゼの精製 （ 1 )
実施例 1又は実施例 2で得た粗酵素液を硫安分画し、 80%沈殿画分を遠心分離 (20， OOOrpm X lO分） にて回収した後、 20mMリン酸緩衝液 （pH6. 0) に溶解した。 得られた粗酵素液について、 1 M硫安を含む 20mM リン酸緩衝液 （pH6. 0) で平衡 化した Resource 15PHE (直径 1. 6 X 3cm、 Amasham社製） を用いて疎水クロマトグ ラフィーを行った。
吸着画分を硫安濃度 1 M〜0 Mまでの濃度勾配で 20mMリン酸緩衝液 （pH6. 0) に て溶出し、 9mlずつ分画し、 活性画分を得た。 この画分をさらに lOOmM塩化ナト リゥムを含む 20mMリン酸緩衝液（pH6. 0)で平衡化した HiLoad26/60 Superdex200 (直径 2. 6 X 60cm、Amasham社製）を用いてゲル濾過ク口マトグラフィーを行った。 流速 1. 5ml/minで行い、 3mlずつ分画し活性画分を得た。
この画分を集め、 20mMリン酸緩衝液 （pH6. 0) で平衡化した P0R0S HQ (直径 4. 6 X 10cm、 ABI 社製） を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。 吸着画分 を 0 M〜： LMまでの濃度勾配で塩化ナトリゥムを含む該緩衝液にて溶出し、 9mlずつ 分画し活性画分を得た。
活性画分に対し、 SDS ポリアクリルアミ ド電気泳動を行ったところ、 均一に精 製されていることが確認できた'。 培養液に対する精製酵素の収率は 4. 9%、 比活性 は 10. 5U/mgであった。
5 . セロビオースデヒ ドロゲナーゼの精製 （2 )
実施例 1又は実施例 2で得た粗酵素液を凍結 ·融解を行うことにより析出する グルカン状物質を遠心分離 （20，000rpm X 10 分） で除去した後、 硫安濃度が 1 M になるように硫安を添加した。 得られた粗酵素液について、 1 M硫安を含む 20mM リン酸緩衝液 （ρΗ6· 0) で平衡化した Resource 15PHE (直径 1. 6 X 3cm、 Amasham 社製） を用いて疎水クロマトグラフィーを行った。
吸着画分を硫安濃度 1 M〜 0 Mまでの濃度勾配で 20mMリン酸緩衝液 （pH6. 0) に て溶出し、 9mlずつ分画し、 活性画分を得た。 この画分をさらに 100mM塩化ナト リゥムを含む 20mMリン酸緩衝液（ρΗ6· 0)で平衡化した HiLoad26/60 Superdex200 (直径 2. 6 X 60cm、Amasham社製）を用いてゲル濾過ク口マトグラフィーを行った。 流速 1. 5ml/minで行い、 3mlずつ分画し活性画分を得た。 この画分を集め、 20mM リン酸緩衝液 （pH6. 0) で平衡化した monoQ HR 5/5 (直径 0. 5 X 5cm、 A m a s y a m社製） を用いてイオン交換クロマトグラフィーを行った。 吸着画分を 0 M〜 0. 4Mまでの濃度勾配で塩化ナトリゥムを含む該緩衝液にて溶出し、 lralずつ分画 し活性画分を得た。
活性画分に対し、 SDS ポリアクリルアミ ド電気泳動を行ったところ、 均一に精 製されていることが確認できた。 培養液に対する精製酵素の収率は 16. 6%、 比活 性は 10. 5U/mgであった。 産業上の利用性
本発明は、 担子菌由来のセルロース分解酵素酵素をコードする遺伝子、 該遺伝 子及び該遺伝子のアンチセンス遺伝子を含む組換えベクターで形質転換された形 質転換体及ぴその用途を提供するものであり、 該セルロース分解酵素をコードす る遺伝子のアンチセンス遺伝子を用レ、た遺伝子組換えによるセルロース分解酵素 活性抑制宿主細胞を木材チップ処理に用いることによって、 収率や紙力に優れた パルプ製造法を実施することが可能となるものである。 本明細書で引用した全ての刊行物、 特許及び特許出願をそのまま参考として本 明細書にとり入れるものとする,

Claims

請 求 の 範 囲
1. 担子菌由来のセルロース分解酵素遺伝子の転写産物の全部又はその一部に 対して実質的に相補的なアンチセンス R N Aをコードする D N Aを調製する工程 と、
(a) 前記 DNA、 又は
(b)前記 DN Aとプロモーター活性を有する DNA断片とを含み、該 DN Aが、 転写によりセルロース分解酵素遺伝子のアンチセンス RN Aが生成するように該 DNA断片に結合されている、 組換え DNA、
を含むベクターを作製する工程と、
該ベクターを用いた形質転換を行い、 セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を 調製する工程と、
該セルロース分解酵素活性抑制宿主細胞を木材チップに接種して処理する工程 とを含む、 木材チップの処理方法。
2. セルロース分解酵素遺伝子が、 セロビオースデヒ ドロゲナーゼ遺伝子、 セ 口ビォヒ ドロラーゼ I、 セロビォヒ ドロラーゼ II、 糖分解酵素ファミ リ一 6 1に 属するエンドダルカナーゼ遺伝子、 糖分解酵素ファミリー 1 2に属するエンドグ ルカナーゼ遺伝子、糖分解酵素ファミリー 5に属するェンドグルカナーゼ遺伝子、 及ぴ糖分解酵素ファミリ一 9に属するェンドグルカナーゼ遺伝子からなる群から 選択される 1種以上である、 請求項 1に記載の方法。
3. セロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子が、 以下の （a) 〜 （c) のいずれ かの塩基配列を含む単離されたセロビオースデヒドロゲナーゼ遺伝子である、 請 求項 2に記載の方法。
(a) 配列番号 1又は 3で表される塩基配列。
(b) (a) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とス トリンジェント な条件下でハイブリダィズし、 かつセロビオースデヒドロゲナーゼ酵素活性を有 するタンパク質をコードする塩基配列。 ( c) 配列番号 1又は 3において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは 付加された塩基配列からなり、 かつセロビオースデヒ ドロゲナーゼ酵素活性を有 するタンパク質をコードする塩基配列。
4. セロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子が、 以下の （a ) 〜 （c) のいずれかの塩 基配列を含む単離されたセロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子である、 請求項 2に記載 の方法。
( a) 配列番号 7、 9又は 1 1で表される塩基配列。
(b) (a) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジ ント な条件下でハイプリダイズし、 かつセ口ピオヒ ドロラーゼ I遺伝子酵素活性を有 するタンパク質をコードする塩基配列。
( c) 配列番号 7、 9又は 1 1において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若 しくは付加された塩基配列からなり、 かつセロビォヒ ドロラーゼ I遺伝子酵素活 性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
5. セロビォヒ ドロラーゼ II遺伝子が、 以下の （a ) 〜 （c ) のいずれかの塩 基配列を含む単離されたセロビォヒ ドロラーゼ II遺伝子である、請求項 2に記載 の方法。 ·
( a ) 配列番号 1 4で表される塩基配列。
(b) (a ) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェント な条件下でハイブリダィズし、かつセロビォヒ ドロラーゼ II遺伝子酵素活性を有 するタンパク質をコードする塩基配列。
( c ) 配列番号 1 4において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、かつセ口ビォヒ ドロラーゼ II遺伝子酵素活性を有する タンパク質をコードする塩基配列。
6. 糖分解酵素ファミリー 6 1に属するエンドグルカナーゼ遺伝子が、 以下の ( a) 〜 （c) のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミリー 6
1に属するェンドグルカナーゼ遺伝子である、 請求項 2に記載の方法。 (a) 配列番号 1 8で表される塩基配列。
(b) (a) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とストリンジェント な条件下でハイブリダィズし、 かつ糖分解酵素フアミリー 6 1に属するエンドグ ルカナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
( c ) 配列番号 1 8において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 かつ糖分解酵素フアミリー 6 1に属するエンドグルカ ナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
7. 糖分解酵素ファミリー 1 2に属するエンドダルカナーゼ遺伝子が、 以下の
(a ) 〜 （c) のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミ リー 1 2に属するェンドグルカナーゼ遺伝子である、 請求項 2に記載の方法。
( a ) 配列番号 2 0で表される塩基配列。
( b ) ( a ) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とス トリンジェント な条件下でハイブリダィズし、 かつ糠素分解酵素ファミ リー 1 2に属するエンド ダル力ナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
( c ) 配列番号 2 0において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 かつ糖分解酵素フアミリー 1 2に属するエンドグルカ ナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
8. 糖分解酵素フアミリー 5に属するェンドグルカナーゼ遺伝子が、以下の（a) 〜 （c) のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミ リー 5に属す るェンドグルカナーゼ遺伝子である、 請求項 2に記載の方法。
( a ) 配列番号 24で表される塩基配列。
(b) (a ) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とス トリンジェント な条件下でハイブリダィズし、 かつ糖分解酵素フアミリー 5に属するエンドダル 力ナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
(c) 配列番号 24において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 かつ糖分解酵素ファミリー 5に属するェンドグルカナ ーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
9 . 糖分解酵素フアミリー 9に属するエンドダルカナーゼ遺伝子が、以下の（a ) 〜 （c ) のいずれかの塩基配列を含む単離された糖分解酵素ファミ リー 9に属す るェンドグルカナーゼ遺伝子である、 請求項 2に記載の方法。
( a ) 配列番号 2 8で表される塩基配列。
( b ) ( a ) の塩基配列と相補的な塩基配列を有する塩基配列とス トリンジ ント な条件下でハイブリダィズし、 かつ糖分解酵素フアミリー 9に属するエンドダル カナーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
( c ) 配列番号 2 8において 1若しくは複数個の塩基が欠失、 置換若しくは付加 された塩基配列からなり、 かつ糖分解酵素フアミリー 9に属するエンドグルカナ ーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列。
1 0 . 担子菌が、 コリオラス · ヒノレスタス (Coriolus hirsutus) 又はファネロ ケェテ · クリ ソスホリ ウム (Phanerochaete chrysosporium) である、 肓求 1〜 9のいずれか 1項に記載の方法。
1 1 . 宿主細胞がコリオラス · ヒルスタスである、 請求項 1〜1 0のいずれか
1項に記載の方法。
1 2 . 請求項 1〜1 1のいずれか 1項に記載の方法によって得られる木材チッ プ。
1 3 . 請求項 1 2に記載の木材チップを用いたパルプの製造法。
1 4 . 請求項 1 3に記載の方法によって得られるパルプ。
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