WO2003052201A1 - Nuevo procedimiento para el blanqueo enzimático libre de cloro de pastas de alta calidad obtenidas de plantas herbáceas o arbustivas - Google Patents

Nuevo procedimiento para el blanqueo enzimático libre de cloro de pastas de alta calidad obtenidas de plantas herbáceas o arbustivas Download PDF

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WO2003052201A1
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bleaching
pulp
paper
laccase
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PCT/ES2002/000603
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Inventor
Susana CAMARERO FERÁNDEZ
Olga GARCÍA
Teresa Vidal
José F. COLOM
José C. del RÍO
Ana GUTIÉRREZ SUÁREZ
María Jesús MARTÍNEZ HERNÁNDEZ
Jean C. Sigoillot
Marcel Asther
Angel Tomas MARTÍNEZ FERRER
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Consejo Superior De Investigaciones Científicas
Universidad Politécnica De Cataluña
Institut National De La Recherche Agronomique-France
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0055—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10)
    • C12N9/0057—Oxidoreductases (1.) acting on diphenols and related substances as donors (1.10) with oxygen as acceptor (1.10.3)
    • C12N9/0061—Laccase (1.10.3.2)
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D21—PAPER-MAKING; PRODUCTION OF CELLULOSE
    • D21C—PRODUCTION OF CELLULOSE BY REMOVING NON-CELLULOSE SUBSTANCES FROM CELLULOSE-CONTAINING MATERIALS; REGENERATION OF PULPING LIQUORS; APPARATUS THEREFOR
    • D21C5/00—Other processes for obtaining cellulose, e.g. cooking cotton linters ; Processes characterised by the choice of cellulose-containing starting materials
    • D21C5/005—Treatment of cellulose-containing material with microorganisms or enzymes
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    • D21C9/00—After-treatment of cellulose pulp, e.g. of wood pulp, or cotton linters ; Treatment of dilute or dewatered pulp or process improvement taking place after obtaining the raw cellulosic material and not provided for elsewhere
    • D21C9/10—Bleaching ; Apparatus therefor

Definitions

  • the invention is directed to a sector of the paper industry dedicated to the production of high quality paper pulps for special uses (including different types of filters, tea bags, paper money, Bible type paper, dielectric papers, cigarette paper , etc.) and certain non-paper uses from herbaceous or shrub plants grown for fiber production (including textile fibers).
  • Its purpose is the application to these pulps of bleaching sequences based on the use of enzymes that degrade lignin (laccase) in the presence of compounds that enhance the activity of these enzymes acting as redox mediators, in combination with chemical reagents completely chlorine free In this way it is possible to eliminate the use of reagents containing chlorine in the bleaching process, with the consequent environmental advantages, simplify the bleaching process, improve product quality and save reagents.
  • the manufacture of paper pulp is the first non-food use of plant biomass.
  • the European Union is the second largest producer of paper pulp, after the United States of America. Said production includes paper pulps obtained by mechanical procedures (which give low-strength pulps such as those used for newspaper) and chemical ones (which allow to produce papers with greater resistance) from wood from deciduous trees (which provide short fibers) and conifers (which provide long fibers) but also high-quality chemical pastes obtained from different herbaceous or shrubby plants, frequently annual (10.15).
  • the latter are cultivated for fiber production and include both species of the dicot group, among others flax, hemp, kenaf, cotton and jute, as well as monocot, among others sisal, miscanthus, abaca and esparto.
  • the uses of the pulps produced may include special papers (whose properties are often related to the presence of very long fibers) for different types of filters, tea bags, paper money, Bible type paper, dielectric papers, cigarette paper, and non-paper uses such as the manufacture of "composite materials" (in English composites) that include lignocellulosic fibers and synthetic polymers (plastics).
  • composite materials in English composites
  • synthetic polymers plastics
  • Several agricultural residues of annual herbaceous plants are also used for the manufacture of paper pulp, such as cereal straw (wheat and rice) and sugarcane bagasse.
  • the pulp and paper industry is often considered a pollutant activity of the atmosphere (due to the production of odors in processes that include sulfur) but especially of the aquatic environment due to the discharge of polluting effluents despite current trends towards reduction of the volume and toxicity thereof.
  • the bleaching plant is the section of the pulp mill that has undergone the greatest number of changes in recent years, many of them to reduce the potential toxicity of the effluents generated.
  • Cl 2 has for many years been the most widely used chemical agent for bleaching chemical pulp in sequences that also include alkaline extractions (mechanical pulp is bleached with simpler processes compared to chemistry containing colored products derived from oxidation of lignin).
  • Lacases can use atmospheric O 2 as the final electron acceptor (compared to peroxidases that require an exogenous source of hydrogen peroxide) but have a lower redox potential that prevents them from directly oxidizing non-phenolic units of lignin, majority in this polymer, and related compounds.
  • the high quality pulps produced from herbaceous or shrubby plants grown for fiber production are often more difficult to bleach than hardwood or coniferous chemical wood pulps, as a result of differences in their anatomical structure and Chemical composition mentioned above.
  • the whiteness of the herbaceous and shrub plants grown for fiber production is usually lower than that of the wood pulp.
  • the laccator-mediator systems integrated in TCF sequences are especially suitable for bleaching this type of pastes since they allow to achieve high degrees of whiteness (greater than 80% ISO) and delignification (around index kappa 1).
  • the pastes to be treated are mainly high quality pastes obtained from plants grown for fiber production, such as hemp, flax or kenaf (not from wood fibers). These pastes are often especially difficult to bleach using conventional chemical sequences, especially those of the TCF type.
  • Lacases to be used are wild (non-recombinant) laccases produced by ligninolytic basidiomycetes, including species of Pycnoporus, Trametes, Funalia, Pleurotus, Coriolopsis and Cerrena and are part of the present invention.
  • these same enzymes produced in genetically modified organisms can also be used in which a DNA sequence (deoxyribonucleic acid) that encodes the laccase to be obtained has been introduced, as well as combinations of laccase and other enzymes so that the action of laccase in bleaching is enhanced by the presence of the other enzymes, and is part of the present invention.
  • Paste treatment is carried out using synthetic or natural redox mediators (or products structurally related to the latter).
  • a hydrogen peroxide bleaching stage is included and, if desired, a reducing stage that allows the cellulose viscosity to remain almost unchanged and forms part of the process of the present invention.
  • the product obtained may have whites greater than 80% ISO and very low lignin contents as estimated by the kappa index (values close to 1) or by analytical pyrolysis.
  • the mechanical properties of the resulting paper are similar or superior to those obtained by means of TCF chemical sequences that contain a high number of stages.
  • the integration of the treatment with the lacasa-mediator system in a chlorine-free sequence offers the possibility of improving product quality, reducing costs and the number of stages and limiting the environmental impact of the process by eliminating the use of chlorinated reagents.
  • Pastes obtained using non-recombinant lacquers are especially suitable for the manufacture of special papers and related products that have to be in contact with food or with the human body.
  • a chlorine-free process for bleaching high quality pulps, obtained from plants grown for fiber production, based on treatment with a laccase type enzyme (EC 1.10.3.2) in the presence of redox mediators is described.
  • the pastes to be treated can be pasta from different herbaceous or shrubby plants, such as hemp, flax, cotton, kenaf, jute, sisal, miscanto or abaca (wood fiber pastes are excluded) obtained by alkaline cooking (often in the presence of alkaline cooking). anthraquinone), which due to the length of its fibers and other characteristics thereof are used to make special papers.
  • the laccase to be used can be obtained from selected fungal strains, preserved in the crop collections of the Biological Research Center of the CSIC-Madrid (IJFM) and the National Institut de la Recherche Agronomique-Marseille (INRA) and also deposited in the Spanish Collection of Type-Valencia crops and the Pasteur-Paris Institute, belonging to different species of the Pycnoporus genus, including P. cinnabarinus (such as IJFM A720 CECT 24448) or INRA 1-937 and SS3) and nearby species and are part of the present invention. It can also be obtained from strains of other ligninolytic basidiomycetes belonging, for example, to Trametes genera, such as T.
  • strains are grown in liquid medium (based on, for example, starch hydrolyzate) in a bioreactor, under conditions that induce enzyme production including the addition of SO Cu in concentrations of 0.1 to 1 mM and / or different inducers aromatic such as ferulic (3-methoxy-4-hydroxycinnamic), vanillic (3-methoxy-4-hydroxybenzoic), verric (3,4-dimethoxybenzoic), or xylidine (all in concentrations of 0.02 to 1 mM) or extracted lignin of herbaceous plants in conditions alkaline (1 g / 1).
  • inducers aromatic such as ferulic (3-methoxy-4-hydroxycinnamic), vanillic (3-methoxy-4-hydroxybenzoic), verric (3,4-dimethoxybenzoic), or xylidine (all in concentrations of 0.02 to 1 mM) or extracted lignin of herbaceous plants in conditions alkaline (1 g / 1).
  • lacquers can be obtained by genetic engineering techniques based on the cloning of a portion of DNA encoding the desired laccase (preferably a complementary DNA, cDNA, from a transcript of the corresponding gene) and its expression in a host system suitable for Overproduction of recombinant proteins and their use in this described procedure forms part of the present invention.
  • Enzymatic crude with high laccase activity (up to 63,000 U / L) is obtained by selective precipitation with ammonium sulfate and / or diafiltration, which can be followed by purification using chromatographic techniques. Finally, a dehydrated laccase preparation is obtained, e.g. ex.
  • the enzyme preparation to be used is dissolved in water (or in a buffer of the desired pH) and applied to the paste under an O atmosphere, which can be pressurized or not, and in the presence of compounds that act as redox mediators for the removal of residual lignin and is part of the process of the present invention.
  • the mediators to be used may be synthetic compounds described above for the bleaching of wood pulps with other lacquers such as ABTS, 4-hydroxybenzenesulfonic acid (PHBS), 1-hydroxybenzotriazole (HBT), violuric acid (2,4,5,6 (1H , 3H) -pyrimidine-tetrone 5-oxime) and other aromatic compounds with NOH groups, or natural mediators similar to those synthesized by these fungi such as 4-hydroxyantranilic acid produced by Pycnoporus cinnabarinus, or derivatives of fungal lignin attack ligninolytics, such as p-hydroxybenzoic acid, vanillin (3-methoxy-4-hydroxybenzaldehyde), acetosyringone or p-hydroquinone, and structurally related compounds.
  • lacquers such as ABTS, 4-hydroxybenzenesulfonic acid (PHBS), 1-hydroxybenzotriazole (HBT), violuric acid (2,4,5,
  • Laccase activity is measured using 2,2'-azinobis- (3-ethyl-benzothiazolin-6-sulfonate) (ABTS) as a substrate (buffer 100 mM sodium acetate at pH 5) and is expressed in international units (U), each of which corresponds to the amount of enzyme that oxidizes one micromol of substrate per min.
  • the dose of enzyme used in the delignification and bleaching of the paste can vary between 1 and 20 U per g of paste, depending on the amount of mediator used (which can range between 0.5 and 7.5%), the time reaction (between 1 and 24 h) and the temperature (between 30 and 50 ° C).
  • the bleaching sequence is continued with a treatment with hydrogen peroxide (eg 3% with respect to the dry weight of pulp) that does not need to be under pressurized O 2 , and can be applied without the need for prior alkaline extraction and is part of the process of the present invention.
  • the integrity of the cellulose can be effectively protected by including a reducing stage with sodium borohydride (eg 2% with respect to the dry weight of pulp) or other reducing agents such as sodium dithionite, which prevents its degradation in alkaline conditions from carbonyl groups formed in cellulose during the oxidation of lignin by laccase.
  • the cost of the enzyme and the mediator are economically acceptable due to the high price of this type of pastes used in the manufacture of special papers, including filters for coffee makers, tea bags, paper money, Bible type paper, dielectric papers, paper for cigarettes, etc., and in some non-paper uses such as the manufacture of composites.
  • the main advantages of the process are the improvement in the quality of the paste obtained, the saving of reagents for bleaching, and the advantages environmental results resulting from the complete elimination of chlorinated reagents from the bleaching sequence.
  • An additional advantage of the use of non-recombinant laccase (of Pycnoporus cinnabarinus and related species) is related to its use in the manufacture of products related to food or in contact with the human body (as described in the present invention). Note that most of the lacquers currently on the market are of the recombinant type, that is, obtained from genetically modified organisms called GMO (genetically-modified organisms), which are often not well accepted by public opinion. for food manufacturing and related
  • Example 1 Bleaching of alkaline flax paste with fungal cultures with high laccase activity and different mediators Flax paste was obtained by alkaline cooking in the presence of anthraquinone. The paste initially had a whiteness of 36% ISO, 11 kappa index and 880 mL / g viscosity. 20 g of paste were used for each treatment in 1 1 flasks, in 50 mM tartrate buffer pH 4 and at a paste consistency of 2% (w / v).
  • analyzes were performed by pyrolysis-gas chromatography-mass spectrometry (Py-GC-MS).
  • a Curie point pyrolizer was used (pyrolysis at 610 ° C for 3.5 seconds) and a 30 mx 0.25 mm DB-5 column, programmed 1 min at 40 ° C and up to 300 ° C at 6 ° C / min , maintaining the final temperature for 20 min.
  • the Py-GC-MS analyzes (Table 2) showed that the residual lignin of the alkaline flax pastes is formed by G and S units, with a predominance of the latter.
  • the analysis of the pastes treated with the different lacasa-mediator systems (and subsequent alkaline extraction) showed a selective elimination of lignin against cellulose.
  • a strong alteration of the residual lignin was observed with preferential elimination of the S units.
  • the Pycnoporus Laccase Cinnabarinus gave the best results in terms of lignin removal and modification of the residual lignin composition (in terms of S / G ratio).
  • the low lignin / cellulose ratio obtained after pyrolysis of the paste treated with the lacasa-HBT system coincides with the high increase in whiteness and reduction of the kappa index (Table 1).
  • Example 2 Bleaching with different preparations of Pycnoporus cinnabarinus laccase in the presence of HBT The alkaline flax paste used in this test had an initial whiteness of
  • Example 3 Bleaching of flax paste with lacasa-HBT: Enzyme production in bioreactor and effect of chemical stages after enzymatic treatment
  • Pycnoporus cinnabarinus laccase was produced in small (12 liters) to medium (75 liters) bioreactors using the INRA-Marseille SS3 strain or other equivalents.
  • the inoculum for bioreactors was prepared from cultures in Roux bottles with 200 ml of medium (2% maltose, 0.1% yeast extract, 0.23% »sodium tartrate, 0.18%) ammonium tartrate, 0.13% > monopotassium phosphate, 0.01 % calcium chloride, 0.05% or magnesium sulfate, 70 ppm ferrous sulfate, 46 ppm zinc sulfate, 35 ppm manganous sulfate, 7 ppm cupric sulfate, 0.1 ppm thiamine, 0.05 ppm riboflavin, 0.05 ppm pyridoxine, 0.5 ppm calcium pantothenate, 0.05 ppm jt?
  • the mycelium homogenate obtained was used to inoculate the different fermenters in the appropriate proportion (the content of 12 bottles of Roux, crushed and suspended in 500 ml of sterile water was used to inoculate 50 liters of medium).
  • the previous medium was slightly modified: the maltose was replaced by Glucidex 47 (a starch hydrolyzate marketed by Roquette) and the concentrations of yeast extract and ammonium tartrate increased to 0.30% and 0.37%) respectively.
  • 0.01% cupric sulfate and 0.5% or Tween 80 were added to the culture medium.
  • the bioreactor cultures were performed at 30 ° C and 90 rpm with aeration of 0.5 vvm (which allows to maintain the concentration of dissolved oxygen and limit the formation of foam).
  • 0.01% of ferulic acid was added as inducer. After 10 days, house levels of 63,000 U / liter are reached.
  • the laccase was selectively precipitated with ammonium sulfate, subjected to diafiltration, and lyophilized in the presence of 30%> lactose (m / m).
  • the preparation obtained maintained 60% of the initial activity and was used to treat 90 g of alkaline flax paste (the same as in Example 2) using a dose of 20 U / g of paste, and 4% HBT w / w Regarding pasta.
  • the assay was performed in flasks containing 3% paste consistency in 50 mM sodium tartrate pH 4, with Tween 80 as a surfactant (0.05% w / v).
  • the paste was incubated at 30 ° C, for 24 h and 160 rpm, with continuous flow of O 2 .
  • stage L After the enzymatic treatment (stage L), the paste was subjected to various treatments: alkaline extraction (stage E), alkaline extraction followed by hydrogen peroxide (EP) stage, hydrogen peroxide stage (stage P), reducing treatment with NaBH (stage R) and hydrogen peroxide stage with pressurized oxygen (stage Po).
  • alkaline extraction and hydrogen peroxide bleaching were performed under the same conditions as in Example 1.
  • the reducing step was carried out 5% consistency of the paste, with 2% NaBH, at room temperature and for 30 minutes.
  • the bleaching with pressurized hydrogen peroxide was carried out in a reactor with 5 kg / cm 2 of O 2 pressure, at 3% hydrogen peroxide, for 2 h at 90 ° C, in the presence of 1.5% NaOH, 1% DTPA and MgSO 4 0.2% and 10% consistency of the paste. After each treatment, the whiteness, kappa index and viscosity of the corresponding pastes and controls were determined (according to Example 1).
  • Example 4 Bleaching of flax paste with the enzymatic sequence LPo: Evaluation of paper properties and comparison with a chemical sequence (WAOAZRP A)
  • the enzymatic treatment of the flax paste (the same as in Example 2) with lacasa-HBT and subsequent bleaching with hydrogen peroxide in an oxygen pressurized reactor (LPo sequence), were carried out under the conditions described in Example 3.
  • the control paste It was treated under analogous conditions but in the absence of enzyme and mediator.
  • the bleached pulp was refined at 20,000 revolutions in a PFI laboratory mill.
  • the physical-mechanical properties of the resulting paper were determined following the ISO standard: breaking length expressed in km (ISO 1924-1), the tensile index in Nm / g (ISO 1924-1), the burst index in kN / g (ISO 2758), the tear index in mN.m 2 / g (ISO 1974) and the folding resistance (ISO 5626).
  • the resulting pulp and paper properties were compared with those obtained after a sequence of chemical bleaching with oxygen (O), acid pH ozone (AZ) and hydrogen peroxide (P), which also included two acid washes (WA) and a reducing stage (R).
  • O oxygen
  • AZ acid pH ozone
  • P hydrogen peroxide
  • WA acid washes
  • R reducing stage
  • the enzymatically bleached pulp (L) was subjected to a subsequent stage of bleaching with hydrogen peroxide (under conditions identical to those of the first example, without prior alkaline extraction).
  • the properties of the pulp treated before and after bleaching with hydrogen peroxide were determined analogously to the previous tests.
  • the initial characteristics of the kenaf alkaline paste used in this test were the following: 32% whiteness ISO, 15.4 kappa index and 1068 mL / g viscosity.
  • the test was carried out in flasks with 10 g of paste, in 50 mM tartrate pH 4, at a paste consistency of 3%>.
  • the enzyme dose used was 20 U / g of pasta, and the dose of HBT was 4%>, by weight of pasta.
  • Tween 80 (0.05% op / v) was also used as a surfactant.
  • the test was maintained for 24 h at 35 ° C and 165 rpm, with continuous flow of O. A control without enzyme or mediator was included, under the same conditions.
  • the treated pulp was subjected to a stage with hydrogen peroxide under the following conditions: 3% hydrogen peroxide, 90 ° C, for 2 h, with 1.5% NaOH, 1% DTPA and 0.2 MgSO 4 %, at 5% consistency of pasta. Paste properties were determined after the LP sequence.

Abstract

Esta invención describe un procedimiento para el blanqueo de pastas de papel de alta calidad obtenidas a partir de plantas herbáceas o arbustivas (lino, cáñamo y kenaf, entre otras) utilizando una enzima ligninolítica de tipo lacasa en presencia de mediadores rédox. Estas pastas, utilizadas para papeles especiales (como bolsitas de té, filtros de cafetera, papel de cigarrillos o mascarillas, entre otros) y ciertos usos no papeleros son difíciles de blanquear mediante reactivos químicos incluyendo el ClO2, utilizado actualmente en sustitución del Cl2. Este procedimiento de blanqueo presenta ventajas medioambientales, al eliminar el vertido de productos clorados en los efluentes y permite obtener pastas de alta calidad y blancura, y bajo contenido en lignina con un ahorro en los reactivos químicos utilizados para el blanqueo y una mayor simplicidad en el proceso.

Description

NUEVO PROCEDIMIENTO PARA EL BLANQUEO ENZIMATICO LIBRE DE CLORO DE PASTAS DE ALTA CALIDAD OBTENIDAS DE PLANTAS HERBÁCEAS O ARBUSTIVAS
SECTOR DE LA TÉCNICA
La invención va dirigida a un sector de la industria papelera dedicado a la producción de pastas de papel de alta calidad para usos especiales (incluyendo diferentes tipos de filtros, bolsitas de té, papel moneda, papel de tipo Biblia, papeles dieléctricos, papel para cigarrillos, etc.) y ciertos usos no papeleros a partir de plantas herbáceas o arbustivas cultivadas para la producción de fibra (incluyendo fibras textiles). El objeto de la misma es la aplicación a estas pastas de secuencias de blanqueo basadas en la utilización de enzimas que degradan la lignina (lacasa) en presencia de compuestos que potencian la actividad de estas enzimas actuando como mediadores rédox, en combinación con reactivos químicos totalmente libres de cloro. De esta forma es posible eliminar el uso de reactivos que contienen cloro en el proceso de blanqueo, con las consiguientes ventajas medioambientales, simplificar el proceso de blanqueo, mejorar la calidad del producto y ahorrar reactivos.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La fabricación de pasta de papel es el primer uso no alimenticio de la biomasa vegetal. La Unión Europea es el segundo productor mundial de pasta de papel, después de los Estados Unidos de América. Dicha producción incluye pastas de papel obtenidas mediante procedimientos mecánicos (que dan pastas de baja resistencia como las utilizadas para papel de periódico) y químicos (que permiten producir papeles con mayor resistencia) a partir de maderas de árboles caducifolios (que aportan fibras cortas) y coniferas (que aportan fibras largas) pero también pastas químicas de alta calidad obtenidas a partir de diferentes plantas herbáceas o arbustivas, frecuentemente anuales (10,15). Estas últimas son cultivadas para la producción de fibra e incluyen tanto especies del grupo de las dicotiledóneas, entre otras lino, cáñamo, kenaf, algodón y yute, como de las monocotiledóneas, entre otras sisal, miscanto, abacá y esparto. Las pastas de papel obtenidas a partir de algunas de estas especies, principalmente dicotiledóneas, presentan propiedades muy particulares debidas a las características anatómicas (presencia de una fracción de fibras muy largas procedentes del floema) y químicas (composición de las fracciones de lignina y hemicelulosa) de las materias primas utilizadas y los usos a los que están destinadas. Entre las materias primas para estas pastas especiales se pueden citar cáñamo (Cannabis sativa), lino (Linum usitatissimum), algodón (Gossypium spp), kenaf (Hibiscus cannabinus), yute, abacá (Musa textilis), (Corchous spp) y sisal (Agave sisalana). Los usos de las pastas producidas pueden incluir papeles especiales (cuyas propiedades están a menudo relacionadas con la presencia de fibras muy largas) para diferentes tipos de filtros, bolsitas de té, papel moneda, papel de tipo Biblia, papeles dieléctricos, papel para cigarrillos, y usos no papeleros como la fabricación de "materiales compuestos" (en inglés composites) que incluyan fibras lignocelulósicas y polímeros sintéticos (plásticos). Varios residuos agrícolas de plantas herbáceas anuales son también utilizados para la fabricación de pasta de papel, como la paja de cereales (trigo y arroz) y el bagazo de caña de azúcar.
La industria de pasta y papel es a menudo considerada como una actividad contaminante de la atmósfera (por la producción de olores en los procesos que incluyen sulfuro) pero especialmente del medio acuático por el vertido de efluentes contaminantes a pesar de las tendencias actuales hacia la reducción del volumen y toxicidad de los mismos. La planta de blanqueo es la sección de la fábrica de pasta que ha experimentado mayor número de cambios durante los últimos años, buena parte de ellos para reducir la toxicidad potencial de los efluentes generados. El Cl2 ha sido durante muchos años el agente químico más ampliamente utilizado para el blanqueo de la pasta química en secuencias que también incluyen extracciones alcalinas (la pasta mecánica se blanquea con procesos más simples comparada con la química que contiene productos coloreados derivados de la oxidación de la lignina). Actualmente, el blanqueo con Cl2 se ha eliminado en la mayor parte de los países desarrollados ya que da lugar a clorofenoles y otros compuestos clorados fuertemente tóxicos y difícilmente eliminables de los efluentes. La sustitución del Cl2 por ClO2 en las denominadas secuencias ECF (del inglés elemental chlorine free) ampliamente utilizadas en la actualidad, ha reducido considerablemente la toxicidad de los efluentes de blanqueo pero no ha conseguido una eliminación completa de los compuestos clorados. Debido a esta situación, las tendencias más actuales en el blanqueo de pasta de papel apuntan a la completa eliminación de reactivos que contengan cloro en las denominadas secuencias TCF (del inglés totally chlorine free) que utilizan O (oxígeno molecular), H2O2 (peróxido de hidrógeno) y O3 (ozono) como principales agentes blanqueantes. Los organismos y enzimas que degradan la lignocelulosa en la naturaleza han sido considerados durante los últimos años como una atractiva alternativa biotecnológica en los procesos de fabricación y blanqueo de la pasta de papel (3,4,8,11). A pesar de que buena parte de los estudios en este campo se han centrado en la biodegradación de la lignina, ya que este polímero aromático debe ser eliminado para conseguir la separación de las fibras celulósicas y el posterior blanqueo de las mismas, las primeras enzimas aplicadas al blanqueo industrial de la pasta de papel fueron xilanasas (16). El efecto positivo de éstas se basa en la estrecha relación existente entre xilano y lignina en la pared celular vegetal y a que ambos polímeros reprecipitan juntos en la superficie de las fibras tras la cocción. Sin embargo estudios más recientes han confirmado el potencial de las enzimas producidas por los hongos ligninolíticos para el blanqueo de la pasta de papel. Estos organismos secretan varias enzimas extracelulares directamente implicadas en la degradación oxidativa de la lignina incluyendo tres tipos de peroxidasas denominadas lignina peroxidasa, manganeso peroxidasa y peroxidasa versátil (que engloba las propiedades catalíticas de las dos anteriores), y enzimas con actividad fenoloxidasa denominadas lacasas (6,7,12). Las lacasas (EC 1.10.3.2) pueden utilizar el O2 atmosférico como aceptor final de electrones (en comparación con las peroxidasas que requieren una fuente exógena de peróxido de hidrógeno) pero poseen un menor potencial rédox que les impide oxidar directamente las unidades no fenólicas de la lignina, mayoritarias en este polímero, y compuestos relacionados. Estudios realizados hace una década mostraron por primera vez que las lacasas en presencia de ciertos compuestos que actúan como mediadores rédox son capaces de degradar modelos no fenólicos de lignina. La existencia de mediadores rédox naturales para la degradación de la lignina por las lacasas fúngicas es un tema en debate, pero estudios en este campo han mostrado el gran potencial de los sistemas lacasa-mediador para el blanqueo de la pasta de papel. La primera patente sobre el blanqueo de pastas de papel utilizando estos sistemas se depositó en 1993 (2) y posteriormente se han depositado otras incluyendo nuevos mediadores y sistemas enzimáticos para el blanqueo de pastas de madera de frondosas o coniferas (1,13,14). Durante los últimos años el uso de técnicas de ingeniería genética ha permitido la producción de lacasas recombinantes a bajo precio, igual que ocurrió previamente con las xilanasas utilizadas en el blanqueo. Aunque se ha investigado una gran cantidad de mediadores químicos para el blanqueo con lacasas, el elevado coste de algunos de los más eficaces constituye uno de los principales factores limitantes para la aplicación industrial del blanqueo de diferentes tipos de pastas con los sistemas lacasa-mediador.
Algunas de las pastas de alta calidad producidas a partir de las plantas herbáceas o arbustivas cultivadas para la producción de fibra son a menudo más difíciles de blanquear que las pastas químicas de madera de frondosas o coniferas, como consecuencia de las diferencias en su estructura anatómica y composición química mencionadas anteriormente. De hecho, para contenidos en lignina equivalentes (estimados como índice kappa) las blancuras de las pastas de plantas herbáceas y arbustivas cultivadas para la producción de fibra suelen ser inferiores a las de las pastas de madera. Tal como se describe en la presente invención, los sistemas lacasa- mediador integrados en secuencias TCF resultan especialmente adecuados para el blanqueo de este tipo de pastas ya que permiten alcanzar elevados grados de blancura (superiores a 80% ISO) y deslignificación (alrededor de índice kappa 1). Estos resultados, que hasta la fecha sólo se obtienen utilizando reactivos con cloro (ya que las secuencias TCF convencionales no proporcionan elevadas blancuras a este tipo de pastas) permitirían la eliminación del uso de ClO2 (o de Cl en los casos en que aun se utilice), para el blanqueo de pastas de alta calidad elaboradas con fibras de plantas herbáceas o arbustivas cultivadas para la producción de fibra (no fibras de madera). El coste del blanqueo descrito en la presente invención (incluyendo los de la enzima y el mediador) resultan asumibles por el elevado precio de este tipo de pastas que son utilizadas en la fabricación de papeles especiales (y algunos usos no papeleros) y se ve justificado por la mejora de calidad obtenida, el ahorro de reactivos para el blanqueo, las ventajas medioambientales adicionales y la simplicidad del proceso de blanqueo debido a la reducción del número de etapas. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Breve descripción de la invención
La presente invención describe un procedimiento de blanqueo libre de cloro altamente eficaz para el blanqueo de pastas obtenidas a partir de fibras de plantas herbáceas o arbustivas, que se basa en la aplicación de una enzima ligninolítica de tipo lacasa producida por hongos (EC 1.10.3.2) en presencia de mediadores rédox, seguido o precedido de blanqueo químico con reactivos libres de cloro.
Las pastas a tratar son principalmente pastas de alta calidad obtenidas a partir de plantas cultivadas para la producción de fibra, como cáñamo, lino o kenaf (no a partir de fibras de madera). Estas pastas son a menudo especialmente difíciles de blanquear utilizando secuencias químicas convencionales, especialmente las de tipo TCF. Las lacasas a utilizar son lacasas salvajes (no recombinantes) producidas por basidiomicetos ligninolíticos, incluyendo especies de Pycnoporus, Trametes, Funalia, Pleurotus, Coriolopsis y Cerrena y forman parte de la presente invención. Por otro lado, con los conocimientos y capacidades existentes en el sector de la técnica, también se podrán utilizar estas mismas enzimas producidas en organismos modificados genéticamente en los que se ha introducido una secuencia de DNA (ácido desoxirribonucleico) que codifique la lacasa a obtener, así como combinaciones de lacasa y otras enzimas de forma que la acción de la lacasa en el blanqueo resulte potenciada por la presencia de las otras enzimas, y forma parte de la presente invención. El tratamiento de la pasta se lleva a cabo utilizando mediadores rédox sintéticos o naturales (o productos estructuralmente relacionados con estos últimos). Tras el tratamiento lacasa-mediador se incluye una etapa de blanqueo con peróxido de hidrógeno y, si se desea, una etapa reductora que permite mantener casi inalterada la viscosidad de la celulosa y forman parte del procedimiento de la presente invención. El producto obtenido puede presentar blancuras superiores a 80% ISO y contenidos en lignina muy bajos tal como se estima mediante índice kappa (valores próximos a 1) o mediante pirólisis analítica. Por otro lado las propiedades mecánicas del papel resultante son similares o superiores a las obtenidas mediante secuencias químicas TCF que contienen un elevado número de etapas. De esta forma, la integración del tratamiento con el sistema lacasa-mediador en una secuencia libre de cloro ofrece la posibilidad de mejorar la calidad del producto, reducir los costes y el número de etapas y limitar el impacto medioambiental del proceso al eliminarse el uso de reactivos clorados. Las pastas obtenidas utilizando lacasas no recombinantes son especialmente adecuadas para la fabricación de papeles especiales y productos relacionados que tengan que estar en contacto con alimentos o con el cuerpo humano.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Se describe un procedimiento libre de cloro para el blanqueo de pastas de alta calidad, obtenidas a partir de plantas cultivadas para la producción de fibra, basado en el tratamiento con una enzima de tipo lacasa (EC 1.10.3.2) en presencia de mediadores rédox. Las pastas a tratar pueden ser pastas de diferentes plantas herbáceas o arbustivas, como cáñamo, lino, algodón, kenaf, yute, sisal, miscanto o abacá (se excluyen las pastas de fibras de madera) obtenidas mediante cocción alcalina (a menudo en presencia de antraquinona), que por la longitud de sus fibras y otras características de las mismas se utilizan para fabricar papeles especiales. La lacasa a utilizar puede obtenerse de cepas fúngicas seleccionadas, conservadas en las colecciones de cultivos del Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC-Madrid (IJFM) y el Institut National de la Recherche Agronomique-Marseille (INRA) y depositadas también en la Colección Española de Cultivos Tipo-Valencia y en el Instituto Pasteur-Paris, pertenecientes a diferentes especies del género Pycnoporus, incluyendo P. cinnabarinus (como IJFM A720 CECT 24448) o INRA 1-937 y SS3) y especies próximas y forman parte de la presente invención. También puede obtenerse de cepas de otros basidiomicetos ligninolíticos pertenecientes, por ejemplo, a los géneros Trametes, como T. versicolor LTFM Al 36; Pleurotus, como P. eryngii IJFM Al 69 (= CBS 613.91), P. pulmonarius LTFM A578 (= CBS 507.85) o P. ostreatus LTFM A579 (= CBS 411.71); Coriolopsis, como C. rígida IJFM A765 (CECT 24449); o Cerrena, como C. unicolor IJFM Al 84 (CECT 24450) y forman parte de la presente invención. Estas cepas son cultivadas en medio líquido (a base p.ej. de hidrolizado de almidón) en un bioreactor, en condiciones que inducen la producción de la enzima incluyendo la adición de SO Cu en concentraciones de 0.1 a 1 mM y/o diferentes inductores aromáticos como ácidos ferúlico (3-metoxi-4-hidroxicinámico), vainíllico (3-metoxi-4- hidroxibenzoico), verátrico (3,4-dimetoxibenzoico), o xilidina (todos ellos en concentraciones de 0.02 a 1 mM) o lignina extraída de plantas herbáceas en condiciones alcalinas (1 g/1). Estas mismas lacasas se podrán obtener mediante técnicas de ingeniería genética basadas en la clonación de una porción de DNA que codifique la lacasa deseada (preferentemente un DNA complementario, cDNA, de un transcrito del correspondiente gen) y su expresión en un sistema hospedador adecuado para la superproducción de proteínas recombinantes y su utilización en este procedimiento descrito forma parte de la presente invención. El crudo enzimático con elevada actividad lacasa (hasta 63 000 U/L) se obtiene mediante precipitación selectiva con sulfato amónico y/o diafiltración, que pueden ser seguidas de purificación utilizando técnicas cromatográficas. Finalmente se obtiene una preparación de lacasa deshidratada, p. ej. por liofilización en presencia de compuestos que aumenten la estabilidad de la proteína (como 30% de lactosa o 20% glicerol). La lacasa puede también utilizarse en combinación con otras enzimas en forma de preparados independientes o conjuntos incluyendo, entre otras, oxidasas (como glucosa oxidasa y aril-alcohol oxidasa) producidas por hongos, con objeto de impedir la repolimerización de los productos de degradación de la lignina liberados por la lacasa; y xilanasa (incluyendo preparaciones actualmente comerciales), que puede actuar sinérgicamente con la lacasa para la deslignificación de la pasta al hidrolizar el xilano que co-precipita con la lignina tras la cocción.
En el momento de su utilización, la preparación enzimática a utilizar se disuelve en agua (o en un tampón del pH deseado) y se aplica a la pasta bajo atmósfera de O , que puede ser presurizado o no, y en presencia de compuestos que actúen como mediadores rédox para la eliminación de la lignina residual y forma parte del procedimiento de la presente invención. Los mediadores a utilizar pueden ser compuestos sintéticos anteriormente descritos para el blanqueo de pastas de madera con otras lacasas como ABTS, ácido 4-hidroxibencensulfonico (PHBS), 1-hidroxibenzotriazol (HBT), ácido violúrico (2,4,5,6(1H, 3H)-pirimidina-tetrona 5-oxima) y otros compuestos aromáticos con grupos NOH, o mediadores naturales semejantes a los sintetizados por estos hongos como el ácido 4-hidroxiantranílico producido por Pycnoporus cinnabarinus, o derivados del ataque a la lignina por los hongos ligninolíticos, como ácido p- hidroxibenzoico, vainillina (3-metoxi-4-hidroxibenzaldehído), acetosiringona o p- hidroquinona, y compuestos estructuralmente relacionados. La actividad lacasa se mide usando 2,2'-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfonato) (ABTS) como sustrato (tampón acetato sódico 100 mM a pH 5) y se expresa en unidades internacionales (U), cada una de las cuales corresponde a la cantidad de enzima que oxida un micromol de sustrato por min. La dosis de enzima empleada en la deslignificación y blanqueo de la pasta puede variar entre 1 y 20 U por g de pasta, en función de la cantidad de mediador empleada (que puede oscilar entre 0,5 y 7,5%), el tiempo de reacción (entre 1 y 24 h) y la temperatura (entre 30 y 50°C). La secuencia de blanqueo se continúa con un tratamiento con peróxido de hidrógeno (p. ej. al 3% respecto al peso seco de pasta) que no necesita ser bajo O2 presurizado, y puede aplicarse sin necesidad de una extracción alcalina previa y forma parte del procedimiento de la presente invención. La integridad de la celulosa puede ser eficazmente protegida incluyendo una etapa reductora con borohidruro sódico (p. ej. al 2% respecto al peso seco de pasta) u otros agentes reductores como el ditionito sódico, que evite su degradación en condiciones alcalinas a partir de los grupos carbonilo formados en la celulosa durante la oxidación de la lignina por la lacasa. Utilizando este tipo de secuencia (que debe optimizarse en lo que se refiere a dosis de lacasa y mediador, consistencia de la pasta, duración del tratamiento enzimático, y características de las etapas posteriores incluyendo dosis de peróxido de hidrógeno) para cada tipo de pasta y calidad del producto a fabricar, es posible obtener pastas de alta blancura (entre 80 y 90%» ISO) y muy bajo contenido en lignina estimado mediante índice kappa (con valores próximos a 1) y pirólisis analítica (utilizando compuestos marcadores de la celulosa y las diferentes unidades de la lignina). Estos resultados superan los obtenidos con secuencias químicas TCF convencionales (incluso utilizando ozono y un número muy elevado de etapas). Dadas las características de la secuencia desarrollada, la eliminación de la lignina y el fuerte incremento de la blancura pueden alcanzarse sin una degradación significativa de la celulosa y manteniendo, o incluso mejorando, las propiedades mecánicas de las pastas.
El coste de la enzima y el mediador resultan económicamente asumibles por el elevado precio de este tipo de pastas utilizadas en la fabricación de papeles especiales, incluyendo filtros para cafetera, bolsitas de té, papel moneda, papel de tipo Biblia, papeles dieléctricos, papel para cigarrillos, etc., y en algunos usos no papeleros como la fabricación de composites. Las principales ventajas del proceso son la mejora en la calidad de la pasta obtenida, el ahorro de reactivos para el blanqueo, y las ventajas medioambientales resultantes de la completa eliminación de reactivos clorados de la secuencia de blanqueo. Una ventaja adicional de la utilización de lacasa no recombinante (de Pycnoporus cinnabarinus y especies relacionadas) está relacionada con su utilización en la fabricación de productos relacionados con la alimentación o en contacto con el cuerpo humano (tal como se describe en la presente invención). Téngase en cuenta que la mayor parte de las lacasas actualmente en el mercado son de tipo recombinante, es decir obtenidas a partir de organismos modificados genéticamente denominados GMO (del inglés genetically-modified organisms), que a menudo no son bien aceptados por la opinión pública para la fabricación de alimentos y usos relacionados.
EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN
Ejemplo 1: Blanqueo de pasta alcalina de lino con cultivos de hongos con alta actividad lacasa y diferentes mediadores La pasta de lino fue obtenida mediante cocción alcalina en presencia de antraquinona. La pasta tenía inicialmente una blancura de 36% ISO, 11 de índice kappa y 880 mL/g de viscosidad. Se utilizaron 20 g de pasta para cada tratamiento en matraces de 1 1, en tampón tartrato 50 mM pH 4 y a una consistencia de la pasta del 2% (p/v). Para el tratamiento de la pasta se cultivaron los hongos Trametes versicolor IJFM Al 36, Pycnoporus cinnabarinus IFJM A720, y Pleurotus eryngii IJFM A169 (= CBS 613.91) procedentes de la colección de cultivos de hongos del Centro de Investigaciones Biológicas del CSIC en Madrid (IJFM) en medios glucosa-tartrato amónico (5) y glucosa-peptona (9). En el momento de máxima producción de lacasa (estimada usando ABTS como sustrato en tampón acetato sódico 100 mM a pH 5) los cultivos líquidos de tres hongos basidiomicetos fueron añadidos a la pasta de forma que la actividad lacasa osciló entre 100 y 200 U por matraz (10-20 U/g de pasta). Como mediadores se utilizaron HBT) y ABTS al 2% (p/p) respecto a la pasta. Los matraces se mantuvieron a 30°C y 160 rpm de agitación, con una corriente húmeda continua de O2. Transcurridas 24 h de tratamiento lacasa-mediador (etapa L), se filtró la pasta a vacío y se sometió a extracción alcalina (etapa E) con NaOH al 1,5 % durante 1 h a 60°C y al 5% de consistencia de la pasta. Posteriormente, se realizó una etapa de blanqueo con peróxido de hidrógeno (etapa P) al 3%, durante 2 h a 90°C, en presencia de NaOH 1,5%, DTPA 1% y MgSO4 0,2 %, usando una consistencia de pasta del 5%. El índice kappa (ISO 302), la blancura (ISO 3688), y la viscosidad (ISO 5351/1) de las pastas tratadas después de la extracción alcalina (LE) y del blanqueo con peróxido de hidrógeno (LEP), fueron comparadas con los controles tratados en análogas condiciones pero sin enzima ni mediador. Para conocer en más detalle las modificaciones de la lignina se realizaron análisis mediante pirólisis-cromatografía de gases-espectrometría de masas (Py-GC- MS). Se utilizó un pirolizador de punto de Curie (pirólisis a 610°C durante 3,5 segundos) y una columna DB-5 de 30 m x 0.25 mm, programada 1 min a 40°C y hasta 300°C a 6°C/min, manteniéndose la temperatura final durante 20 min. Los cambios en la relación lignina/celulosa y entre las unidades de la lignina fueron calculados a partir de los picos de los compuestos: 4-hidroxi-5,6-dihidro (2H)-pirano-2-ona (m/z 114) como marcador de la celulosa; y 4-metilguayacol (m/z 138), 4-etilguayacol (m/z 152), 4- vinilguayacol (m/z 150) y trans-4-propenilsiringol (m/z 164) como marcadores de las unidades G; y 4-metilsiringol (m/z 168), 4-etilsiringol (m/z 182), 4-vinilsiringol (m/z 180) y trans-4-propenilsiríngol (m/z 194) como marcadores de las unidades S.
Los resultados obtenidos (Tabla 1) muestran importantes incrementos de la blancura tras el tratamiento lacasa-mediador. De esta forma, las blancuras pasaron de 36% ISO en el material inicial a valores superiores a 75% ISO cuando se incluyó una etapa de peróxido de hidrógeno tras el tratamiento enzimático, pasando por 60% ISO cuando sólo se aplicó el tratamiento lacasa-mediador seguido de extracción alcalina (sin peróxido de hidrógeno). De una forma paralela el contenido en lignina de la pasta (estimado mediante el índice kappa) pasó de 11 en el material inicial a valores inferiores a 2 tras el tratamiento lacasa-mediador seguido de peróxido de hidrógeno, pasando por valores próximos a 3 cuando sólo se aplicó el tratamiento lacasa-mediador seguido de extracción alcalina (sin peróxido de hidrógeno). Por otro lado, la comparación de las diferentes enzimas y mediadores mostró los mejores resultados en términos de incremento de blancura, descenso del índice kappa y mantenimiento de la viscosidad de la pasta (que indica el mantenimiento del grado de polimerización de la celulosa), cuando se utilizó lacasa de P. cinnabarinus en presencia de HBT. Tabla 1. Blanqueo de pasta de lino con lacasas de tres hongos en presencia de dos mediadores*
LE LEP
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y peróxido de hidrógeno; medias y límites de confianza del 95%
Por otro lado, los análisis de Py-GC-MS (Tabla 2) mostraron que la lignina residual de las pastas alcalinas de lino está formada por unidades G y S, con un predominio de estas últimas. El análisis de las pastas tratadas con los diferentes sistemas lacasa- mediador (y posterior extracción alcalina) mostró una eliminación selectiva de la lignina frente a la celulosa. Además, se observó una fuerte alteración de la lignina residual con eliminación preferente de las unidades S. Los rangos de deslignificación obtenidos con las lacasas de T. versicolor y P. cinnabarinus utilizando HBT como mediador, fueron superiores a los obtenidos cuando se empleó ABTS. La lacasa de Pycnoporus cinnabarinus dio los mejores resultados en términos de eliminación de la lignina y modificación de la composición de la lignina residual (en términos de relación S/G). La baja relación lignina/celulosa obtenida tras pirólisis de la pasta tratada con el sistema lacasa-HBT coincide con el elevado incremento de blancura y reducción de índice kappa (Tabla 1).
Tabla 2. Pirólisis analítica (Py-GC-MS) de pastas de lino tratadas con lacasas de tres hongos en presencia de dos mediadores*
Disminución (%)
S/G lignina/celulosa
Pasta inicial 0 0.23
Control 0 0.17
T. versicolor + ABTS 15 0.07
T. versicolor + HBT 56 0.03
P. cinnabarinus +ABTS 0 0.12
P. cinnabarinus + HBT 69 0.02
P. eryngii + ABTS 18 0.11
P. eryngii + HBT 30 0.11
*S/G: relación entre unidades guayacil y siringil de la lignina
Ejemplo 2: Blanqueo con diferentes preparaciones de lacasa de Pycnoporus cinnabarinus en presencia de HBT La pasta alcalina de lino utilizada en este ensayo poseía una blancura inicial de
36,2%o ISO, 11,1 de índice kappa y 950 ml/g de viscosidad. La deslignificación y blanqueo de la pasta se llevó a cabo con un cultivo líquido de Pycnoporus cinnabarinus IJFM A720 obtenido tal como se describe en el Ejemplo 1, y con crudos de lacasa obtenidos de dicho hongo. Los crudos se obtuvieron mediante filtración de los cultivos de Pycnoporus cinnabarinus en el momento de máxima actividad lacasa, desechando el micelio. Estos filtrados se concentraron mediante dos técnicas diferentes: a) ultrafiltración tangencial por membranas de 3 kDa, donde el flujo tangencial concentra todos los compuestos mayores de 3 kDa mientras que los compuestos de bajo peso molecular (inferior al poro de la membrana) son eliminados junto con el agua; y b) concentración en rotavapor que únicamente evapora el agua y retiene todos los compuestos de bajo peso molecular que hay en el líquido de cultivo. El ensayo se llevó a cabo en condiciones análogas al Ejemplo 1, pero al 3%> de consistencia de la pasta y con una concentración de HBT del 3% p/p y 20 U de enzima por g de pasta. Igual que en el Ejemplo 1, la pasta tratada con lacasa y HBT fue extraída con NaOH y blanqueada con peróxido de hidrógeno y las propiedades de la pasta fueron determinadas según normativa ISO.
Los resultados obtenidos (Tabla 3) mostraron que el micelio del hongo presente en el cultivo y los compuestos de bajo molecular eliminados por ultrafiltración no son necesarios para la deslignificación y blanqueo de la pasta. Los resultados obtenidos con el ultrafiltrado de los cultivos (o el concentrado en rotavapor), incluyendo una blancura superior del 80%» ISO y un índice kappa de 1,3, fueron mejores que los obtenidos en el Ejemplo 1.
Tabla 3. Blanqueo de pasta de lino con lacasa de P. cinnabarinus y HBT: Comparación de cultivo completo y dos crudos enzimáticos (para abreviaturas ver Tabla 1)
LE LEP
Blancura índice Viscosidad Blancura índice Viscosidad
(% ISO) kappa (ml/g) (% ISO) kappa (ml/g)
Cultivo 46,8 ± 1,5 6,4 ± 1,3 670 ± 55,4 78 ± 1,2 2,5 ± 0,2 530 ± 6,9
Rotavapor 59,0 + 0,8 2,7 ± 0,1 630 ± 6,9 79,7 ± 0,9 1,3±0,05 478 ± 3,5
Ultrafiltrado 59,3 ± 0,5 2,8 ± 0,1 612 + 3,46 80,6 ± 0,3 1,3+0,01 470 ± 6,9
Control 41,7 ± 0,2 8,9 ± 0,5 920 ± 13,8 61,2 ±0,5 5,5 ± 0,3 683 ± 10,4
Ejemplo 3: Blanqueo de pasta de lino con lacasa-HBT: Producción de la enzima en biorreactor y efecto de las etapas químicas posteriores al tratamiento enzimático
La lacasa de Pycnoporus cinnabarinus se produjo en biorreactores de tamaño pequeño (12 litros) a mediano (75 litros) utilizando la cepa INRA-Marsella SS3 u otras equivalentes. El inoculo para los biorreactores se preparó a partir de cultivos en frascos de Roux con 200 mi de medio (2% maltosa, 0.1% extracto de levadura, 0.23%» tartrato sódico, 0.18%) tartrato amónico, 0.13%> fosfato monopotásico, 0.01% cloruro calcico, 0.05%o sulfato magnésico, 70 ppm sulfato ferroso, 46 ppm sulfato de zinc, 35 ppm sulfato manganoso, 7 ppm sulfato cúprico, 0.1 ppm tiamina, 0.05 ppm riboflavina, 0.05 ppm piridoxina, 0.5 ppm pantotenato calcico, 0.05 ppm ácido jt?-aminobenzoico, 0.5 ppm nicotinamida, 0.001 ppm colina, 0.01 ppm ácido fólico y 0.01 ppm inositol) cada uno de los cuales fue inoculado con 5 porciones obtenidas a partir de cultivos recientes en MYA2 (2%ι extracto de malta, 0.1%» extracto de levadura y 1.6% agar) e incubados a 30°C sin agitación. Tras 10 días de incubación, se separó el micelio estérilmente por filtración en papel Miracloth (Calbiochem) y se trituró en Ultraturax durante 1 min a 9000 rpm. El homogeneizado de micelio obtenido se utilizó para inocular los diferentes fermentadores en la proporción adecuada (el contenido de 12 frascos de Roux, triturado y suspendido en 500 mi de agua estéril se utilizó para inocular 50 litros de medio). Para los cultivos en biorreactor se modificó ligeramente el medio anterior: la maltosa se reemplazó por Glucidex 47 (un hidrolizado de almidón comercializado por Roquette) y las concentraciones de extracto de levadura y tartrato amónico se incrementaron hasta 0.30% y 0.37%) respectivamente. Al medio de cultivo se añadió 0.01% sulfato cúprico y 0.5%o Tween 80. Los cultivos en biorreactor se realizaron a 30°C y 90 rpm con una aireación de 0.5 vvm (que permite mantener la concentración de oxígeno disuelto y limitar la formación de espuma). Al tercer día de cultivo se añadió 0.01% de ácido ferúlico como inductor. A los 10 días se alcanzan niveles de lacasa de 63 000 U/litro. La lacasa se precipitó selectivamente con sulfato amónico, se sometió a diafiltración, y se liofilizó en presencia de 30%> lactosa (m/m).
El preparado obtenido mantuvo el 60%» de la actividad inicial y se usó para tratar 90 g de pasta alcalina de lino (la misma del Ejemplo 2) utilizando una dosis de 20 U/g de pasta, y HBT al 4% p/p con respecto a la pasta. El ensayo se realizó en matraces conteniendo pasta al 3% de consistencia en tartrato sódico 50 mM pH 4, con Tween 80 como surfactante (0.05% p/v). La pasta se incubó a 30°C, durante 24 h y 160 rpm, con flujo continuo de O2. Finalizado el tratamiento enzimático (etapa L), la pasta fue sometida a diversos tratamientos: extracción alcalina (etapa E), extracción alcalina seguida de etapa de peróxido de hidrógeno (EP), etapa de peróxido de hidrógeno (etapa P), tratamiento reductor con NaBH (etapa R) y etapa de peróxido de hidrógeno con oxígeno presurizado (etapa Po). La extracción alcalina y el blanqueo con peróxido de hidrógeno se realizaron en las mismas condiciones del Ejemplo 1. La etapa reductora se llevó a cabo al 5% de consistencia de la pasta, con 2% de NaBH , a temperatura ambiente y durante 30 minutos. El blanqueo con peróxido de hidrógeno presurizado se realizó en reactor con 5 kg/cm2 de presión de O2, al 3% de peróxido de hidrógeno, durante 2h a 90°C, en presencia de NaOH 1,5%, DTPA 1% y MgSO4 0,2 % y al 10% de consistencia de la pasta. Después de cada tratamiento, se determinaron la blancura, índice kappa y viscosidad de las pastas y controles correspondientes (según Ejemplo 1).
Tabla 4. Blanqueo de pasta de lino con lacasa y HBT: Efecto de diferentes etapas químicas posteriores al tratamiento enzimático
Blancura índice
Viscosidad (ml/g) (% ISO) Kappa
Pasta inicial 37,3 10,11 1025
L 41,6 9,5 835 Control 38,0 13,7 1065
LE 49,3 5,0 780 Control E 39,1 9,4 1000
LEP 76,4 1,4 465 Control EP 62,0 5,5 530
LP 79,8 1,6 725 Control P 63,2 5,4 685
LR 50,7 6,5 1010
Control R 42,5 9,1 , 1070
LPo 81,5 1,3 640 Control Po 65,4 4,6 610
*L: lacasa-mediador; E: extracción alcalina; P: blanqueo con peróxido de hidrógeno; R: reducción con boroliidruro sódico; y Po: blanqueo con peróxido de hidrógeno bajo oxígeno presurizado Los resultados obtenidos (Tabla 4) mostraron que es posible suprimir la extracción alcalina antes del blanqueo con peróxido de hidrógeno, ya que los resultados alcanzados (LP) fueron similares o incluso superiores a los obtenidos mediante la secuencia de blanqueo (LEP) utilizada en los ejemplos anteriores. Los resultados tras el tratamiento reductor (etapa R) mostraron que de esta forma es posible evitar la caída en la viscosidad de la pasta que se produce al aplicar tratamientos alcalinos - etapa E o las mismas condiciones alcalinas utilizadas para disolver la celulosa en el ensayo de medida de viscosidad - después del tratamiento lacasa-mediador. Este comportamiento se explica por la formación de grupos carbonilo en la celulosa en condiciones fuertemente oxidantes (como las que se producen en el tratamiento enzimático, o durante el blanqueo con ozono) que en medio alcalino dan lugar a la rotura de las cadenas de celulosa por β-eliminación. Por otro lado, la aplicación del peróxido de hidrógeno bajo oxígeno presurizado (secuencia LPo) permitió aumentar algo más de un 1% ISO la blancura obtenida con respecto a la secuencia LP.
Ejemplo 4: Blanqueo de pasta de lino con la secuencia enzimática LPo: Evaluación de propiedades papeleras y comparación con una secuencia química (WAOAZRP A)
El tratamiento enzimático de la pasta de lino (la misma del Ejemplo 2) con lacasa- HBT y posterior blanqueo con peróxido de hidrógeno en reactor presurizado con oxígeno (secuencia LPo), se realizaron en las condiciones descritas en el Ejemplo 3. La pasta control fue tratada en análogas condiciones pero en ausencia de enzima y mediador. La pasta blanqueada fue refinada a 20000 revoluciones en un molino PFI de laboratorio. Las propiedades físico-mecánicas del papel resultante fueron determinadas siguiendo la normativa ISO: longitud de rotura expresada en km (ISO 1924-1), el índice de tracción en N.m/g (ISO 1924-1), el índice de estallido en kN/g (ISO 2758), el índice de desgarro en mN.m2/g (ISO 1974) y la resistencia al plegado (ISO 5626). Las propiedades de la pasta y el papel resultantes fueron comparadas con las obtenidas tras una secuencia de blanqueo químico con oxígeno (O), ozono a pH ácido (AZ) y peróxido de hidrógeno (P), que incluía también dos lavados ácidos (WA) y una etapa reductora (R). Para blancura y grado de refino similares, los resultados obtenidos con la secuencia LPo mostraron menor índice kappa y mayor viscosidad de la pasta que los obtenidos con la secuencia química (Tabla 5). El papel procedente del blanqueo enzimático mostró también mejores propiedades mecánicas, en particular en los índices de tracción y desgarro.
Tabla 5. Propiedades de pasta y papel tras la secuencia enzimática LPo comparada con una secuencia química con ozono
Control Po LPo WAOAZRPWA
Propiedades de la pasta
Grado de refino (°SR) 92 91 92
Energía consumida (Wh) 255 249 254 índice kappa 4,55 1,27 2,99
Blancura (% ISO) 65,4 81,5 82,5
Viscosidad (ml/g) 610 640 565
Propiedades del papel
Longitud de rotura (km) 6,5 6 5,7 índice de tracción (N.m/g) 63,8 59 56,2 índice de estallido (kN/g) 2,99 3,52 3,2 índice de desgarro (mN.m2/g) 6,1 7,6 5,1
Resistencia al plegado 2,7 3,1 2,9
* Po: peróxido de hidrógeno bajo oxígeno presurizado; L: lacasa-mediador; WA: lavado ácido; O: oxígeno; AZ: ozono a pH ácido; R: etapa reductora; y P: peróxido de hidrógeno
Ejemplo 5: Blanqueo de pasta de lino con lacasa-HBT en reactor presurizado
Se realizaron dos ensayos de blanqueo de pasta de lino (la misma del Ejemplo 2) con el sistema lacasa-HBT, en reactor presurizado con 6 bares de presión de O2. En ambos casos se trataron 40 g de pasta (p.s.) con 20 U/g de lacasa de Pycnoporus cinnabarinus
(Ejemplo 3) en tartrato sódico 50 mM a pH 4 y en presencia de Tween 80 al 0,05 %
(p/v). Un ensayo se realizó en condiciones análogas a las utilizadas en los ensayos de blanqueo en matraz: con HBT al 3% (p/p) respecto a la pasta, a una consistencia de la pasta del 3% (p/v), incubándose durante 24 h a 30°C. La agitación en el reactor fue de 60 rpm las primeras 4 h y de 40 rpm las restantes. El otro ensayo se llevó a cabo con las mismas dosis de enzima y mediador pero con un 8% (p/v) de consistencia de la pasta, durante 4 h y a 40°C. La agitación en el reactor fue de 60 rpm las 4 h. La pasta blanqueada enzimaticamente (L) fue sometida a una etapa posterior de blanqueo con peróxido de hidrógeno (en condiciones idénticas a las del primer ejemplo, sin una extracción alcalina previa). Las propiedades de la pasta tratada antes y después de blanqueo con peróxido de hidrógeno fueron determinadas análogamente a los ensayos anteriores.
Los resultados obtenidos (Tabla 6) mostraron que el blanqueo y la deslignificación más eficaces antes del peróxido de hidrógeno se obtuvieron con el tratamiento más largo. Sin embargo, al incluir el peróxido de hidrógeno tras el tratamiento corto se consiguieron mejoras significativas en blancura e índice kappa. Este hecho, unido a la menor caída de viscosidad tras sólo 4 h de tratamiento, sugieren que el tratamiento corto puede ser superior cuando se desea mantener la integridad de la celulosa en la pasta.
Tabla 6. Blanqueo de pasta de lino con lacasa-HBT en reactor presurizado
S tratar con peróxido Tratada con peróxido
Blancura índice Viscosidad Blancura índice Viscosidad
(% ISO) kappa (ml/g) (% ISO) kappa (ml/g)
24 horas
L 53,4 3,89 760 78,4 1,18 640
Control 39,5 9,4 1060 61,3 5,7 810
Control HBT 39,7 9,31 975 63,5 5,47 810
4 horas
L 41,4 7,28 930 72,4 3,22 815
Control 38,9 10,27 1035 61,1 5,07 910
Control HBT 39,3 9,31 990 62,5 5,56 835
*L: lacasa-mediador Ejemplo 6: Blanqueo de pasta alcalina de kenaf con lacasa-HBT
Las características iniciales de la pasta alcalina de kenaf utilizada en este ensayo fueron las siguientes: 32% ISO de blancura, 15,4 de índice kappa y 1068 mL/g de viscosidad. El ensayo se realizó en matraces con 10 g de pasta, en tartrato 50 mM pH 4, a una consistencia de la pasta del 3%>. La dosis de enzima empleada fue de 20 U/g de pasta, y la dosis de HBT fue del 4%>, en peso de pasta. Se utilizó también Tween 80 (0,05%o p/v) como surfactante. El ensayo se mantuvo durante 24 h a 35°C y 165 rpm, con flujo continuo de O . Se incluyó un control sin enzima ni mediador, en las mismas condiciones. Posteriormente, la pasta tratada fue sometida a una etapa con peróxido de hidrógeno en las siguientes condiciones: 3% de peróxido de hidrógeno, 90°C, durante 2 h, con NaOH 1,5%, DTPA 1% y MgSO4 0,2 %, al 5% de consistencia de la pasta. Las propiedades de la pasta fueron determinadas tras la secuencia LP.
Los resultados obtenidos (Tabla 7) mostraron un incremento significativo de la blancura de la pasta de kenaf al ser tratada con lacasa-HBT, sin necesidad de un descenso pronunciado del índice kappa y con una buena conservación de la viscosidad de la celulosa. El presente ejemplo confirma que el blanqueo TCF con lacasa-mediador seguidos de peróxido de hidrógeno no solo pueden ser aplicados a las pastas de lino (Ejemplos 1 a 5) sino también a las pastas obtenidas a partir de otras plantas cultivadas para la producción de fibra, como el kenaf.
Tabla 7. Blanqueo de pasta de kenaf con lacasa-HBT seguido de peróxido de hidrógeno
Blancura (% ISO) índice Kappa Viscosidad (ml/g)
~LP 6 8^3 879
Control P 49,7 9,3 972 REFERENCIAS CITADAS
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Claims

REIVINDICACIONES
1. Proceso para el blanqueo de pastas de papel obtenidas utilizando como materia prima plantas herbáceas o arbustivas cultivadas para la producción de fibra (no fibras de madera) caracterizado por el tratamiento con una enzima de tipo lacasa, en presencia de mediadores rédox, seguido o precedido de un blanqueo químico de la pasta de papel utilizando reactivos libres de cloro.
2. El proceso de la reivindicación 1 caracterizado porque la materia prima procede tanto de plantas del grupo de las dicotiledóneas (incluyendo, entre otras, lino, cáñamo, kenaf, algodón y yute) como de las monocotiledóneas (incluyendo, entre otras, sisal, miscanto, abacá, esparto y trigo).
3. Proceso de la reivindicación 2 caracterizado porque se usan fibras largas (floema) de plantas dicotiledóneas, como Linum usitatissimum (lino), Hibiscus cannabinus (kenaf), Cannabis sativa (cáñamo) y Corchorus spp (yute), para la producción de pastas de alta calidad.
4. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 3 caracterizado porque la pasta de papel se obtiene mediante cocción alcalina.
5. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4 cuando la lacasa que se utiliza para el tratamiento de la pasta es una enzima salvaje (no recombinante) obtenida a partir de cultivos de hongos del grupo de los basidiomicetos ligninolíticos.
6. Proceso según la reivindicación 5 caracterizado porque la lacasa se obtiene a partir de cepas de Pycnoporus cinnabarinus, Trametes versicolor, Pleurotus eryngii, Pleurotus pulmonarius, Pleurotus ostreatus, Coriolopsis rígida (entre otras, CECT 24449) Cerrena unicolor (entre otras, CECT 24450) u otras especies de los mismos géneros o géneros próximos.
7. Proceso según la reivindicación 6 caracterizado porque la lacasa se obtiene a partir de cepas monocarióticas o dicarióticas de Pycnoporus cinnabarinus y especies próximas seleccionadas por su elevada capacidad para secretar lacasa, incluyendo Pycnoporus cinnabarinus CECT 24448 entre otras.
8. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 7 caracterizado porque la lacasa se produce en bioneactores (fermentadores) utilizando un medio a base de hidrolizado de almidón, maltosa u otras fuentes adecuadas de carbono, y condiciones de agitación y aireación que penniten el mantenimiento de la presión de oxígeno y limitan la producción de espuma.
9. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 8 caracterizado porque la lacasa se separa del cultivo mediante precipitación y/o ultrafiltración obteniéndose una preparación con alta actividad que puede deshidratarse mediante liofilización en presencia de agentes protectores.
10. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 9 caracterizado porque la lacasa se obtiene en cultivos líquidos de los hongos mencionados utilizando inductores como Cu2+ o diferentes compuestos aromáticos incluyendo ácidos ferúlico (3-metoxi-4-hidroxicinámico), vainíllico (3-metoxi-4-hidroxibenzoico) o verátrico (3,4-dimetoxibenzoico), xilidina o lignina.
11. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4 caracterizado porque las lacasas según las reivindicaciones 5 a 7 se producen mediante técnicas de ingeniería genética, que consisten en la expresión de una porción de DNA que codifica la enzima deseada en un hospedador adecuado (seleccionado para la superproducción de proteínas recombinantes).
12. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 11 caracterizado porque las lacasas se utilizan en combinación con otras enzimas que potencian el blanqueo de la pasta de papel, incluyendo oxidasas y xilanasas.
13. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12 caracterizado porque los mediadores utilizados durante el tratamiento enzimático de las pastas son compuestos sintéticos como 2,2'-azinobis-(3-etil-benzotiazolin-6-sulfonato)
(ABTS), ácido 4-hidroxibencensulfonico (PHBS), 1-hidroxibenzotriazol (HBT), ácido violúrico (2,4,5,6(1H, 3H)-pirimidina-tetrona 5-oxima) u otros compuestos conteniendo un grupo NOH.
14. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12 caracterizado porque los mediadores utilizados durante el tratamiento enzimático de las pastas son compuestos naturales sintetizados por los hongos, como el ácido 4- hidroxiantranílico entre otros, o especies químicas estructuralmente relacionados.
15. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 12 cuando los mediadores utilizados son compuestos naturales formados durante la biodegradación de la lignina, como ácido 4-hidroxibenzoico, acetosiringona, vainillina (3-metoxi-4- l idroxibenzaldehído) o diferentes hidroquinonas, y especies químicas estructuralmente relacionados.
16. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 15 caracterizado porque la dosis de enzima es de 0.1 a 100 U por kg de peso seco de pasta de papel, y más preferentemente de 1 a 20 U por kg de peso seco de pasta de papel.
17. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 16 caracterizado porque las dosis de mediador son de 0.5 a 200 g por kg de peso seco de pasta de papel, y más preferentemente de 5 a 50 g por kg de peso seco pasta de papel.
18. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 17 caracterizado porque el tratamiento de la pasta de papel con enzima y mediador se lleva a cabo durante un tiempo de 0.1 a 48 h, y más preferentemente de 1 a 8 h, a una temperatura de 30 a 50°C.
19. Proceso según la reivindicación 18 caracterizado porque el tratamiento de la pasta de papel con enzima y mediador se lleva a cabo a una temperatura de 10 a 80°C, y más preferentemente de 30 a 50°C.
20. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 19 caracterizado porque el tratamiento de la pasta de papel con enzima y mediador se aplica bajo oxígeno presurizado o a presión atmosférica.
21. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 20 caracterizado porque el blanqueo de la pasta de papel se completa utilizando reactivos totalmente libres de cloro, como peróxido de hidrógeno, oxígeno u ozono, entre otros, aplicados después o antes del tratamiento de la pasta con lacasa y mediador (en secuencias denominadas TCF).
22. Proceso según la reivindicación 21 caracterizado porque la secuencia de blanqueo utilizada (de tipo TCF) incluye un tratamiento con borohidruro sódico y otro agente reductor que penmte un alto mantenimiento de la viscosidad de la pasta en condiciones alcalinas.
23. Proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 22 caracterizado porque las pastas blanqueadas utilizando lacasa-mediador y reactivos químicos se utilizan para la fabricación de papeles especiales y productos relacionados con diferentes usos.
24. Los procesos de las reivindicaciones 1 a 10 y 12 a 23 cuando las pastas de papel blanqueadas utilizando lacasas no recombinantes se utilizan para la fabricación de productos que estarán en contacto con alimentos (como bolsitas de té o filtros de cafetera) o con el cuerpo humano (como papel de cigarrillos o mascarillas).
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