JPH11127863A - 新規ベクター - Google Patents
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- JPH11127863A JPH11127863A JP9301078A JP30107897A JPH11127863A JP H11127863 A JPH11127863 A JP H11127863A JP 9301078 A JP9301078 A JP 9301078A JP 30107897 A JP30107897 A JP 30107897A JP H11127863 A JPH11127863 A JP H11127863A
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- JP
- Japan
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- dna
- gene
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- vector
- shimeji
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 プロモーター活性を有するＤＮＡ及びタ
ーミネーター活性を有するＤＮＡ、上記ＤＮＡを含むベ
クター、並びに上記ベクターによって形質転換された形
質転換体である。 【効果】 木材腐朽菌及び菌根菌のいずれの担子菌をも
形質転換することができる。
ーミネーター活性を有するＤＮＡ、上記ＤＮＡを含むベ
クター、並びに上記ベクターによって形質転換された形
質転換体である。 【効果】 木材腐朽菌及び菌根菌のいずれの担子菌をも
形質転換することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、プロモーター活性
を有するＤＮＡ、ターミネーター活性を有するＤＮＡ、
並びにそれらを利用したベクター及び形質転換体に関す
る。
を有するＤＮＡ、ターミネーター活性を有するＤＮＡ、
並びにそれらを利用したベクター及び形質転換体に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】ホンシメジ（Lyophyllum shimeji ）は
担子菌に属し、従来、菌根菌として扱われてきた。しか
し、最近、腐生菌や木材腐朽菌と同様に穀物や木粉など
を用いた人工の培地で生育し，子実体を形成することの
できる品種が発見された（Ohta, A. Mycoscience 35, 1
47-151 (1994)参照）。また、ハタケシメジ（Lyophyllu
m decastes) は地中に埋もれた木材などに生育する木
材腐朽菌であるが、このハタケシメジは形態的にはホン
シメジに非常に近く、ホンシメジと同種ではないかとも
考えられている。以上のことを考慮すれば、ホンシメジ
は木材腐朽菌と菌根菌の両方の性質を有している可能性
が大きい。
担子菌に属し、従来、菌根菌として扱われてきた。しか
し、最近、腐生菌や木材腐朽菌と同様に穀物や木粉など
を用いた人工の培地で生育し，子実体を形成することの
できる品種が発見された（Ohta, A. Mycoscience 35, 1
47-151 (1994)参照）。また、ハタケシメジ（Lyophyllu
m decastes) は地中に埋もれた木材などに生育する木
材腐朽菌であるが、このハタケシメジは形態的にはホン
シメジに非常に近く、ホンシメジと同種ではないかとも
考えられている。以上のことを考慮すれば、ホンシメジ
は木材腐朽菌と菌根菌の両方の性質を有している可能性
が大きい。
【０００３】一方、これまで担子菌を形質転換した例は
世界的にも少なく、担子菌を形質転換するために開発さ
れた担子菌用ベクターも非常に少なかった。しかも、こ
れらの担子菌用ベクターに用いられたプロモーター及び
ターミネーターは木材腐朽菌由来のものであったので、
このベクターを用いて菌根菌を形質転換することはでき
なかった。このため、菌根菌を形質転換することができ
るベクターの開発が望まれている。
世界的にも少なく、担子菌を形質転換するために開発さ
れた担子菌用ベクターも非常に少なかった。しかも、こ
れらの担子菌用ベクターに用いられたプロモーター及び
ターミネーターは木材腐朽菌由来のものであったので、
このベクターを用いて菌根菌を形質転換することはでき
なかった。このため、菌根菌を形質転換することができ
るベクターの開発が望まれている。
【０００４】
【発明の解決しようとする課題】本発明は、木材腐朽菌
及び菌根菌のいずれをも形質転換することができるベク
ターを提供することを目的とする。
及び菌根菌のいずれをも形質転換することができるベク
ターを提供することを目的とする。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究した結果、ホンシメジのグリ
セルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
（以下、「ＧＰＤ遺伝子」という）の全領域の塩基配列
を決定するとともに、ＧＰＤ遺伝子のプロモーター領域
及びターミネーター領域を特定することにより、ホンシ
メジ由来のプロモーター活性を有するＤＮＡ及びターミ
ネーター活性を有するＤＮＡを含むベクターを用いれ
ば、菌根菌及び木材腐朽菌のいずれの担子菌をも形質転
換できることを発見し、本発明を完成するに至った。
を解決するために鋭意研究した結果、ホンシメジのグリ
セルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子
（以下、「ＧＰＤ遺伝子」という）の全領域の塩基配列
を決定するとともに、ＧＰＤ遺伝子のプロモーター領域
及びターミネーター領域を特定することにより、ホンシ
メジ由来のプロモーター活性を有するＤＮＡ及びターミ
ネーター活性を有するＤＮＡを含むベクターを用いれ
ば、菌根菌及び木材腐朽菌のいずれの担子菌をも形質転
換できることを発見し、本発明を完成するに至った。
【０００６】すなわち、本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）の塩基配列により表され、かつプロモーター活性
を有するＤＮＡである。 （ａ） 配列番号１に記載の塩基配列。 （ｂ） 配列番号１に記載の塩基配列において、１若し
くは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基
配列。
（ｂ）の塩基配列により表され、かつプロモーター活性
を有するＤＮＡである。 （ａ） 配列番号１に記載の塩基配列。 （ｂ） 配列番号１に記載の塩基配列において、１若し
くは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基
配列。
【０００７】また、本発明は、以下の（ａ）または
（ｂ）の塩基配列により表され、かつターミネーター活
性を有するＤＮＡである。 （ａ） 配列番号２に記載の塩基配列。 （ｂ） 配列番号２に記載の塩基配列において、１若し
くは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基
配列。 さらに、本発明は、上記ＤＮＡを含むベクターである。
さらに、本発明は、上記ベクターによって形質転換され
た形質転換体である。
（ｂ）の塩基配列により表され、かつターミネーター活
性を有するＤＮＡである。 （ａ） 配列番号２に記載の塩基配列。 （ｂ） 配列番号２に記載の塩基配列において、１若し
くは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基
配列。 さらに、本発明は、上記ＤＮＡを含むベクターである。
さらに、本発明は、上記ベクターによって形質転換され
た形質転換体である。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＤＮＡは、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配
列により表される。 （ａ） 配列番号１に記載の塩基配列。 （ｂ） 配列番号１に記載の塩基配列において１若しく
は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配
列。 ここで、「１若しくは複数個の塩基」とは、本願の出願
時に常用される技術により欠失、置換若しくは付加する
ことができ、かつプロモーター活性を喪失させない限
り、その個数は特に限定されないが、通常は、部位特異
的変異誘発法 (Zollerら., Nucleic Acids Res.10, 64
87−6500, 1982 )により欠失、置換若しくは付加するこ
とができる個数、即ち、１若しくは数個を意味する。
本発明のＤＮＡは、以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配
列により表される。 （ａ） 配列番号１に記載の塩基配列。 （ｂ） 配列番号１に記載の塩基配列において１若しく
は複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配
列。 ここで、「１若しくは複数個の塩基」とは、本願の出願
時に常用される技術により欠失、置換若しくは付加する
ことができ、かつプロモーター活性を喪失させない限
り、その個数は特に限定されないが、通常は、部位特異
的変異誘発法 (Zollerら., Nucleic Acids Res.10, 64
87−6500, 1982 )により欠失、置換若しくは付加するこ
とができる個数、即ち、１若しくは数個を意味する。
【０００９】また、本発明のＤＮＡは、以下の（ａ）ま
たは（ｂ）の塩基配列により表される。 （ａ） 配列番号２に記載の塩基配列。 （ｂ） 配列番号２に記載の塩基配列において、１若し
くは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基
配列。 ここで、「１若しくは複数個の塩基」とは、上記と同様
の意味である。本発明のＤＮＡは、例えば、以下の工程
により得ることができる。 （１）ＧＰＤ遺伝子の単離・同定 （２）プロモーター領域及びターミネーター領域の特定 （３）プロモーター活性を有するＤＮＡ及びターミネー
ター活性を有するＤＮＡの単離
たは（ｂ）の塩基配列により表される。 （ａ） 配列番号２に記載の塩基配列。 （ｂ） 配列番号２に記載の塩基配列において、１若し
くは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基
配列。 ここで、「１若しくは複数個の塩基」とは、上記と同様
の意味である。本発明のＤＮＡは、例えば、以下の工程
により得ることができる。 （１）ＧＰＤ遺伝子の単離・同定 （２）プロモーター領域及びターミネーター領域の特定 （３）プロモーター活性を有するＤＮＡ及びターミネー
ター活性を有するＤＮＡの単離
【００１０】以下、各工程を説明する。 （１）ＧＰＤ遺伝子の単離・同定 ＧＰＤ遺伝子の単離・同定は、公知の方法に従って行な
うことができる。ＧＰＤ遺伝子の単離は、例えば、次の
方法によって行なうことができる。すなわち、ホンシメ
ジから抽出したホンシメジの全ＤＮＡを鋳型とし、既知
のＧＰＤ遺伝子間でよく保存されている部分の塩基配列
に従って作製したプライマーを用いてＰＣＲ法を行な
い、目的のＧＰＤ遺伝子の一部を単離する。そして、こ
れをプローブとし、ホンシメジの全ＤＮＡに対してサザ
ンハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的の
ＧＰＤ遺伝子を単離することができる。また、ＧＰＤ遺
伝子の同定は、例えば、マクサム・ギルバート法、サン
ガー法、又はこれらの自動化された変法等を用いて行な
うことができる。
うことができる。ＧＰＤ遺伝子の単離は、例えば、次の
方法によって行なうことができる。すなわち、ホンシメ
ジから抽出したホンシメジの全ＤＮＡを鋳型とし、既知
のＧＰＤ遺伝子間でよく保存されている部分の塩基配列
に従って作製したプライマーを用いてＰＣＲ法を行な
い、目的のＧＰＤ遺伝子の一部を単離する。そして、こ
れをプローブとし、ホンシメジの全ＤＮＡに対してサザ
ンハイブリダイゼーションを行なうことにより、目的の
ＧＰＤ遺伝子を単離することができる。また、ＧＰＤ遺
伝子の同定は、例えば、マクサム・ギルバート法、サン
ガー法、又はこれらの自動化された変法等を用いて行な
うことができる。
【００１１】（２）プロモーター領域及びターミネータ
ー領域の特定 プロモーター領域及びターミネーター領域の特定は、公
知の方法に従って行なうことができる。例えば、ＤＮＡ
−ｍＲＮＡのヘテロデュプレックスを電子顕微鏡で観察
する方法、Ｓ１マッピングを行なう方法、ｃＤＮＡライ
ブラリーから得られた遺伝子の塩基配列と染色体ＤＮＡ
ライブラリーから得られた遺伝子の塩基配列とを比較す
る方法等を用いて、プロモーター領域及びターミネータ
ー領域を特定することができる。また、ＧＰＤ遺伝子の
塩基配列から開始コドン及び終始コドンを特定すること
により、プロモーター領域及びターミネーター領域を特
定することもできる。
ー領域の特定 プロモーター領域及びターミネーター領域の特定は、公
知の方法に従って行なうことができる。例えば、ＤＮＡ
−ｍＲＮＡのヘテロデュプレックスを電子顕微鏡で観察
する方法、Ｓ１マッピングを行なう方法、ｃＤＮＡライ
ブラリーから得られた遺伝子の塩基配列と染色体ＤＮＡ
ライブラリーから得られた遺伝子の塩基配列とを比較す
る方法等を用いて、プロモーター領域及びターミネータ
ー領域を特定することができる。また、ＧＰＤ遺伝子の
塩基配列から開始コドン及び終始コドンを特定すること
により、プロモーター領域及びターミネーター領域を特
定することもできる。
【００１２】（３）プロモーター活性を有するＤＮＡ及
びターミネーター活性を有するＤＮＡの単離 プロモーター活性を有するＤＮＡ及びターミネーター活
性を有するＤＮＡの単離は、適当な制限酵素を用いるこ
とによって行なうことができる。例えば、ＧＰＤ遺伝子
を制限酵素NcoIで切断することによりプロモーター活性
を有するＤＮＡを単離することができる。また、ＧＰＤ
遺伝子を制限酵素XhoIで切断することによりターミネー
ター活性を有するＤＮＡを単離することができる。
びターミネーター活性を有するＤＮＡの単離 プロモーター活性を有するＤＮＡ及びターミネーター活
性を有するＤＮＡの単離は、適当な制限酵素を用いるこ
とによって行なうことができる。例えば、ＧＰＤ遺伝子
を制限酵素NcoIで切断することによりプロモーター活性
を有するＤＮＡを単離することができる。また、ＧＰＤ
遺伝子を制限酵素XhoIで切断することによりターミネー
ター活性を有するＤＮＡを単離することができる。
【００１３】また、本発明のＤＮＡは、化学合成により
得ることもできる。さらに、本発明のＤＮＡは、その両
端に相補的なプライマーを用いたＰＣＲ法により得るこ
ともできる。本発明のベクターは、上記プロモーター活
性を有するＤＮＡ及び／又はターミネーター活性を有す
るＤＮＡを含む。これらのＤＮＡの間に、目的の遺伝子
を配置しておく。ここで、目的の遺伝子とは、それにコ
ードされている遺伝子産物（例えば、タンパク質、ｒＲ
ＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等）の発現を目的とする遺伝
子を意味する。
得ることもできる。さらに、本発明のＤＮＡは、その両
端に相補的なプライマーを用いたＰＣＲ法により得るこ
ともできる。本発明のベクターは、上記プロモーター活
性を有するＤＮＡ及び／又はターミネーター活性を有す
るＤＮＡを含む。これらのＤＮＡの間に、目的の遺伝子
を配置しておく。ここで、目的の遺伝子とは、それにコ
ードされている遺伝子産物（例えば、タンパク質、ｒＲ
ＮＡ、アンチセンスＲＮＡ等）の発現を目的とする遺伝
子を意味する。
【００１４】本発明のベクターにより形質転換した形質
転換体の検出を容易にするために、上記ＤＮＡの間にマ
ーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子を挿入しても
よい。このようなマーカー遺伝子及びレポーター遺伝子
としては、特に限定されず公知のいかなるマーカー遺伝
子及びレポーター遺伝子をも用いることができる。例え
ば、マーカー遺伝子としては、ハイグロマイシンＢホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカル
ボキシラーゼ遺伝子等を用いることができ、レポーター
遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子等を
用いることができる。
転換体の検出を容易にするために、上記ＤＮＡの間にマ
ーカー遺伝子及び／又はレポーター遺伝子を挿入しても
よい。このようなマーカー遺伝子及びレポーター遺伝子
としては、特に限定されず公知のいかなるマーカー遺伝
子及びレポーター遺伝子をも用いることができる。例え
ば、マーカー遺伝子としては、ハイグロマイシンＢホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子、ネオマイシンホスホトラ
ンスフェラーゼ遺伝子、オロチジン−５−リン酸デカル
ボキシラーゼ遺伝子等を用いることができ、レポーター
遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼ遺伝子、β−グルクロニダーゼ遺伝子等を
用いることができる。
【００１５】本発明のベクターの構築は、公知の方法に
従って行なうことができる。本発明のベクターの構築に
用いることができるベクターは、特に限定されず公知の
いかなるベクターであってもよい。例えば、pUC18 、pU
C19 、M13mp18 、M13mp19 、λgt10、λgt11、YIp32 、
YRp7、pBI221等を本発明のベクターの構築に用いること
ができる。本発明の形質転換体は、本発明のベクターを
宿主に導入し宿主を形質転換することにより得ることが
できる。形質転換される宿主は特に限定されないが、担
子菌であるのが好ましい。本発明のベクターの宿主への
導入は、公知の方法を用いて行なうことができる。例え
ば、プロトプラスト法、リチウム法、エレクトロポレー
ション法、又はこれらの変法を用いて本発明のベクター
を宿主に導入することができる。
従って行なうことができる。本発明のベクターの構築に
用いることができるベクターは、特に限定されず公知の
いかなるベクターであってもよい。例えば、pUC18 、pU
C19 、M13mp18 、M13mp19 、λgt10、λgt11、YIp32 、
YRp7、pBI221等を本発明のベクターの構築に用いること
ができる。本発明の形質転換体は、本発明のベクターを
宿主に導入し宿主を形質転換することにより得ることが
できる。形質転換される宿主は特に限定されないが、担
子菌であるのが好ましい。本発明のベクターの宿主への
導入は、公知の方法を用いて行なうことができる。例え
ば、プロトプラスト法、リチウム法、エレクトロポレー
ション法、又はこれらの変法を用いて本発明のベクター
を宿主に導入することができる。
【００１６】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明する。但し、本発明はこれらの実施例により何ら限
定されるものではない。 〔実施例１〕 ホンシメジからのＧＰＤ遺伝子の単離 （１）先ず、ホンシメジ（Lyophylum shimeji）の培養
菌糸体から以下の方法で全ＤＮＡを抽出、精製した。野
生のホンシメジ子実体から菌糸を組織分離しＧＭＹ寒天
培地（グルコ−ス１％、麦芽エキス１％、酵母エキス0.
4％、寒天1.5％）で２５℃で培養した。この栄養菌糸を
寒天培地ごと細かく切り刻み、1.5リットルのＧＭＹ液
体培地（グルコ−ス１％、麦芽エキス１％、酵母エキス
0.4％、pH5.6）に接種して２週間程度振とう培養した。
得られた菌糸体（湿重量約100ｇ）を凍結乾燥した。
説明する。但し、本発明はこれらの実施例により何ら限
定されるものではない。 〔実施例１〕 ホンシメジからのＧＰＤ遺伝子の単離 （１）先ず、ホンシメジ（Lyophylum shimeji）の培養
菌糸体から以下の方法で全ＤＮＡを抽出、精製した。野
生のホンシメジ子実体から菌糸を組織分離しＧＭＹ寒天
培地（グルコ−ス１％、麦芽エキス１％、酵母エキス0.
4％、寒天1.5％）で２５℃で培養した。この栄養菌糸を
寒天培地ごと細かく切り刻み、1.5リットルのＧＭＹ液
体培地（グルコ−ス１％、麦芽エキス１％、酵母エキス
0.4％、pH5.6）に接種して２週間程度振とう培養した。
得られた菌糸体（湿重量約100ｇ）を凍結乾燥した。
【００１７】凍結乾燥菌糸体２ｇを乳鉢で破砕し、ＤＮ
Ａ抽出用緩衝液（100mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、1
00mM ＮａＣｌ、100mM エチレンジアミン四酢酸（以下
ＥＤＴＡと略称）、１％ドデシル硫酸ナトリウム（以下
ＳＤＳと略称）、１％メルカプトエタノ−ル）に懸濁し
て６５℃で２時間保温した。25,000×ｇで１０分間遠心
し、上清を別の遠心チュ−ブに移した後、等量のＴＥ
（10mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、1mM ＥＤＴＡ）飽
和フェノ−ルを加えてゆっくり撹拌し、再び25,000×
ｇ、１０分間遠心して上清を回収するという除蛋白操作
を行なった（フェノ−ル処理）。フェノ−ル処理を数回
繰り返した後ＴＥ飽和フェノ−ル：クロロホルム＝１：
１の溶液で同様の処理を行い、上清を回収後1／10量の5
MＮａＣｌと2.5倍量のエタノ−ルを加えてＤＮＡを析出
させた（エタノ−ル沈澱）。細いガラス棒で析出した糸
状のＤＮＡを巻き取り、１mlのＴＥに溶かした後、最終
濃度50μg／mlのRNase A（SIGMA CHEMICAL CO.）を加え
て37℃、20分保温しRNAを分解した。フェノ−ル処理を
２回行ってRNase Aを除去し、エタノ−ル沈澱を行って
ガラス棒にてＤＮＡを巻き取り、１mlのＴＥに溶かして
ホンシメジの全ＤＮＡ試料とした。凍結乾燥菌糸体２ｇ
から１ｍｇ以上の全ＤＮＡが得られた。
Ａ抽出用緩衝液（100mM トリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、1
00mM ＮａＣｌ、100mM エチレンジアミン四酢酸（以下
ＥＤＴＡと略称）、１％ドデシル硫酸ナトリウム（以下
ＳＤＳと略称）、１％メルカプトエタノ−ル）に懸濁し
て６５℃で２時間保温した。25,000×ｇで１０分間遠心
し、上清を別の遠心チュ−ブに移した後、等量のＴＥ
（10mMトリス−塩酸緩衝液(pH8.0)、1mM ＥＤＴＡ）飽
和フェノ−ルを加えてゆっくり撹拌し、再び25,000×
ｇ、１０分間遠心して上清を回収するという除蛋白操作
を行なった（フェノ−ル処理）。フェノ−ル処理を数回
繰り返した後ＴＥ飽和フェノ−ル：クロロホルム＝１：
１の溶液で同様の処理を行い、上清を回収後1／10量の5
MＮａＣｌと2.5倍量のエタノ−ルを加えてＤＮＡを析出
させた（エタノ−ル沈澱）。細いガラス棒で析出した糸
状のＤＮＡを巻き取り、１mlのＴＥに溶かした後、最終
濃度50μg／mlのRNase A（SIGMA CHEMICAL CO.）を加え
て37℃、20分保温しRNAを分解した。フェノ−ル処理を
２回行ってRNase Aを除去し、エタノ−ル沈澱を行って
ガラス棒にてＤＮＡを巻き取り、１mlのＴＥに溶かして
ホンシメジの全ＤＮＡ試料とした。凍結乾燥菌糸体２ｇ
から１ｍｇ以上の全ＤＮＡが得られた。
【００１８】（２）ホンシメジのグリセルアルデヒド−
３−リン酸デヒドロゲナ−ゼ遺伝子（ＧＰＤ遺伝子）の
検出は以下の手法により行った。すでに報告されている
Schizophyllm commune 、Agaricus bisporus 、及び P
hanerochaete chrysosporiumのＧＰＤ遺伝子の塩基配列
を参考にして（Martin C. Harmsen ら. Curr. genet. 2
2, 447-454 (1992) 参照）、担子菌のＧＰＤ遺伝子の最
もよく保存されていると思われる部分の配列に従って以
下に示すようなＰＣＲ用プライマ−を作製した。 プライマ−１： 5'-GGTCTACATGTTCAAGTACGAC-3' プライマ−２： 5'-TAGCCCCACTCGTTGTCGTACC-3' このプライマ−を用いて以下の反応条件でＰＣＲを行
い、約950bpのＤＮＡ断片を得た。
３−リン酸デヒドロゲナ−ゼ遺伝子（ＧＰＤ遺伝子）の
検出は以下の手法により行った。すでに報告されている
Schizophyllm commune 、Agaricus bisporus 、及び P
hanerochaete chrysosporiumのＧＰＤ遺伝子の塩基配列
を参考にして（Martin C. Harmsen ら. Curr. genet. 2
2, 447-454 (1992) 参照）、担子菌のＧＰＤ遺伝子の最
もよく保存されていると思われる部分の配列に従って以
下に示すようなＰＣＲ用プライマ−を作製した。 プライマ−１： 5'-GGTCTACATGTTCAAGTACGAC-3' プライマ−２： 5'-TAGCCCCACTCGTTGTCGTACC-3' このプライマ−を用いて以下の反応条件でＰＣＲを行
い、約950bpのＤＮＡ断片を得た。
【００１９】
【００２０】なお、耐熱性ＤＮＡポリメラ−ゼ（Tth DN
A polymerase）と10× reaction bufferは東洋紡績
（株）、dNTPはDNA Polymerization Mixをファルマシア
バイオテク（株）より購入した。増幅されたＤＮＡ断
片は大腸菌用ベクタ−pUC18（Yanisch-Perron,C. et a
l. Gene 33, 103 (1985)参照）の制限酵素SmaI切断部位
に連結し、サ−カムベントフォトト−プＤＮＡシ−クエ
ンスキット（New EnglandBiolabs,Inc.,USA）により塩
基配列を決定してＧＰＤ遺伝子の一部であることを確認
した。さらにこのＤＮＡ断片をNEBlotフォトト−プキッ
ト（New England Biolabs,Inc.,USA）によりビオチン標
識し、これをプロ−ブとしてホンシメジ全ＤＮＡに対し
てサザンハイブリダイゼ−ションを行い、図１に示した
ＧＰＤの構造遺伝子とその転写制御領域（プロモーター
領域及びターミネーター領域）を含む約2.75キロベ−ス
のＤＮＡ断片を検出した。
A polymerase）と10× reaction bufferは東洋紡績
（株）、dNTPはDNA Polymerization Mixをファルマシア
バイオテク（株）より購入した。増幅されたＤＮＡ断
片は大腸菌用ベクタ−pUC18（Yanisch-Perron,C. et a
l. Gene 33, 103 (1985)参照）の制限酵素SmaI切断部位
に連結し、サ−カムベントフォトト−プＤＮＡシ−クエ
ンスキット（New EnglandBiolabs,Inc.,USA）により塩
基配列を決定してＧＰＤ遺伝子の一部であることを確認
した。さらにこのＤＮＡ断片をNEBlotフォトト−プキッ
ト（New England Biolabs,Inc.,USA）によりビオチン標
識し、これをプロ−ブとしてホンシメジ全ＤＮＡに対し
てサザンハイブリダイゼ−ションを行い、図１に示した
ＧＰＤの構造遺伝子とその転写制御領域（プロモーター
領域及びターミネーター領域）を含む約2.75キロベ−ス
のＤＮＡ断片を検出した。
【００２１】（３）図１に示したホンシメジ由来のＤＮ
Ａ断片は以下のように２断片に分割して単離した。ホン
シメジの全ＤＮＡを制限酵素HindIIIで切断しアガロ−
スゲル電気泳動でＤＮＡ断片を分画後、この電気泳動パ
タ−ンに対してサザンハイブリダイゼ−ションによるＧ
ＰＤ遺伝子の検出を行ったところ、タ−ミネ−タ−領域
を含む約1.75キロベ−スのＤＮＡ断片が検出された。こ
のＤＮＡ断片を大腸菌用ベクタ−pUC18のHindIII切断部
位に連結してクロ−ニングし、プラスミドpLS-DWを得た
（図２参照）。一方、ホンシメジの全ＤＮＡを制限酵素
HincIIとHindIIIの両方で切断してアガロ−スゲル電気
泳動で分画後、この電気泳動パタ−ンに対してサザンハ
イブリダイゼ−ションを行いプロモ−タ−領域を含む約
１キロベ−スのＤＮＡ断片を検出した。このＤＮＡ断片
を大腸菌用ベクタ−pUC18のHincII-HindIII切断部位に
連結してクロ−ニングし、プラスミドpLS-UPを得た（図
３参照）。クロ−ニングされたこの２つのＤＮＡ断片に
関して、図１に示されている各種制限酵素によって切断
箇所を詳細に調べるとともに塩基配列の決定を行い、こ
れらがＧＰＤ遺伝子の全領域と配列番号１及び２で示さ
れる領域を含む転写制御領域を有することを確認した。
Ａ断片は以下のように２断片に分割して単離した。ホン
シメジの全ＤＮＡを制限酵素HindIIIで切断しアガロ−
スゲル電気泳動でＤＮＡ断片を分画後、この電気泳動パ
タ−ンに対してサザンハイブリダイゼ−ションによるＧ
ＰＤ遺伝子の検出を行ったところ、タ−ミネ−タ−領域
を含む約1.75キロベ−スのＤＮＡ断片が検出された。こ
のＤＮＡ断片を大腸菌用ベクタ−pUC18のHindIII切断部
位に連結してクロ−ニングし、プラスミドpLS-DWを得た
（図２参照）。一方、ホンシメジの全ＤＮＡを制限酵素
HincIIとHindIIIの両方で切断してアガロ−スゲル電気
泳動で分画後、この電気泳動パタ−ンに対してサザンハ
イブリダイゼ−ションを行いプロモ−タ−領域を含む約
１キロベ−スのＤＮＡ断片を検出した。このＤＮＡ断片
を大腸菌用ベクタ−pUC18のHincII-HindIII切断部位に
連結してクロ−ニングし、プラスミドpLS-UPを得た（図
３参照）。クロ−ニングされたこの２つのＤＮＡ断片に
関して、図１に示されている各種制限酵素によって切断
箇所を詳細に調べるとともに塩基配列の決定を行い、こ
れらがＧＰＤ遺伝子の全領域と配列番号１及び２で示さ
れる領域を含む転写制御領域を有することを確認した。
【００２２】〔実施例２〕次に、ホンシメジＧＰＤ遺伝
子の転写制御領域を組み込んだ担子菌の形質転換用ベク
タ−構築の実際を、ハイグロマイシンＢホスホトランス
フェラ−ゼ遺伝子（ｈｐｈ遺伝子）をマ−カ−遺伝子と
して用いた場合について述べる。 （１）先ず、プラスミドpLS-UPを制限酵素HincIIで切断
し、ホンシメジＧＰＤ遺伝子のプロモ−タ−領域を含む
約500ベ−スのＤＮＡ断片を得た。これを大腸菌用ベク
タ−pUC18のHincII切断部位に連結し、プラスミドpLS-P
ROを作出した（図４参照）。ホンシメジＧＰＤ遺伝子は
制限酵素NcoIによって開始コドンATGの直前で切断さ
れ、プロモ−タ−領域と構造遺伝子以下の領域に分離で
きることが塩基配列の決定により明かとなっている。そ
こでプラスミドpLS-PROを制限酵素NcoIで切断し、DNA B
lunting Kit（宝酒造（株））により切り口を平滑末端
化した。さらに制限酵素KpnIで切断することにより、下
流側にKpnIの切り口を露出させた。一方、ｈｐｈ遺伝子
はプラスミドpHph 0（ベ−リンガ−マンハイム（株））
を鋳型としてＰＣＲにより増幅した。増幅の反応条件は
以下の通りである。 プライマ−A ： 5'-GGCCCGGGATGACCATGATTACGCCAAGCT-3' SmaI プライマ−B ： 5'-GGGGTACCCGAACTGTGGACGAGAACTGTG-3' KpnI
子の転写制御領域を組み込んだ担子菌の形質転換用ベク
タ−構築の実際を、ハイグロマイシンＢホスホトランス
フェラ−ゼ遺伝子（ｈｐｈ遺伝子）をマ−カ−遺伝子と
して用いた場合について述べる。 （１）先ず、プラスミドpLS-UPを制限酵素HincIIで切断
し、ホンシメジＧＰＤ遺伝子のプロモ−タ−領域を含む
約500ベ−スのＤＮＡ断片を得た。これを大腸菌用ベク
タ−pUC18のHincII切断部位に連結し、プラスミドpLS-P
ROを作出した（図４参照）。ホンシメジＧＰＤ遺伝子は
制限酵素NcoIによって開始コドンATGの直前で切断さ
れ、プロモ−タ−領域と構造遺伝子以下の領域に分離で
きることが塩基配列の決定により明かとなっている。そ
こでプラスミドpLS-PROを制限酵素NcoIで切断し、DNA B
lunting Kit（宝酒造（株））により切り口を平滑末端
化した。さらに制限酵素KpnIで切断することにより、下
流側にKpnIの切り口を露出させた。一方、ｈｐｈ遺伝子
はプラスミドpHph 0（ベ−リンガ−マンハイム（株））
を鋳型としてＰＣＲにより増幅した。増幅の反応条件は
以下の通りである。 プライマ−A ： 5'-GGCCCGGGATGACCATGATTACGCCAAGCT-3' SmaI プライマ−B ： 5'-GGGGTACCCGAACTGTGGACGAGAACTGTG-3' KpnI
【００２３】
【００２４】なお、Ex Taq DNA polymerase は宝酒造
（株）から購入し、dNTP、10×bufferはEx Taq DNA po
lymeraseに添付されていたものを用いた。増幅されたｈ
ｐｈ遺伝子は制限酵素SmaIとKpnIで切断し、先に制限酵
素処理をしておいたpLS-PROに連結して（DNA Ligation
Kit Ver.1 （宝酒造（株））使用）プラスミドpLS-PH
を作出した（図５参照）。これはホンシメジＧＰＤ遺伝
子のプロモ−タ−の下流にマ−カ−遺伝子であるｈｐｈ
遺伝子を連結した、ベクタ−の中間体である。
（株）から購入し、dNTP、10×bufferはEx Taq DNA po
lymeraseに添付されていたものを用いた。増幅されたｈ
ｐｈ遺伝子は制限酵素SmaIとKpnIで切断し、先に制限酵
素処理をしておいたpLS-PROに連結して（DNA Ligation
Kit Ver.1 （宝酒造（株））使用）プラスミドpLS-PH
を作出した（図５参照）。これはホンシメジＧＰＤ遺伝
子のプロモ−タ−の下流にマ−カ−遺伝子であるｈｐｈ
遺伝子を連結した、ベクタ−の中間体である。
【００２５】（２）プラスミドpLS-PHを制限酵素KpnIで
切断し、DNA Blunting Kit（宝酒造（株））を用いて平
滑末端化した。一方、プラスミドpLS-DWを制限酵素XhoI
とHincIIで切断し、ホンシメジＧＰＤ遺伝子のタ−ミネ
−タ−領域を含む約950 bpのＤＮＡ断片を得た。このＤ
ＮＡ断片をDNA Blunting Kit（宝酒造（株））を用いて
平滑末端化し、先に制限酵素処理及び平滑末端化処理を
しておいたプラスミドpLS-PHにDNA Ligation Kit Ver.1
（宝酒造（株））を用いて連結しプラスミドpLS-PHTを
作出した（図６参照）。ここでプラスミドpSL-PHに連結
したＤＮＡ断片はタ−ミネ−タ−領域だけでなくホンシ
メジＧＰＤの構造遺伝子の一部も含んでおり、ｍＲＮＡ
はｈｐｈ遺伝子とホンシメジＧＰＤ遺伝子との融合遺伝
子のコピ−として転写されるが、翻訳の段階でｈｐｈ遺
伝子の終止コドンが認識されホンシメジＧＰＤの部分を
含まないハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ−ゼ
が生産される。従ってこれにより、目的のベクタ−が完
成した。
切断し、DNA Blunting Kit（宝酒造（株））を用いて平
滑末端化した。一方、プラスミドpLS-DWを制限酵素XhoI
とHincIIで切断し、ホンシメジＧＰＤ遺伝子のタ−ミネ
−タ−領域を含む約950 bpのＤＮＡ断片を得た。このＤ
ＮＡ断片をDNA Blunting Kit（宝酒造（株））を用いて
平滑末端化し、先に制限酵素処理及び平滑末端化処理を
しておいたプラスミドpLS-PHにDNA Ligation Kit Ver.1
（宝酒造（株））を用いて連結しプラスミドpLS-PHTを
作出した（図６参照）。ここでプラスミドpSL-PHに連結
したＤＮＡ断片はタ−ミネ−タ−領域だけでなくホンシ
メジＧＰＤの構造遺伝子の一部も含んでおり、ｍＲＮＡ
はｈｐｈ遺伝子とホンシメジＧＰＤ遺伝子との融合遺伝
子のコピ−として転写されるが、翻訳の段階でｈｐｈ遺
伝子の終止コドンが認識されホンシメジＧＰＤの部分を
含まないハイグロマイシンＢホスホトランスフェラ−ゼ
が生産される。従ってこれにより、目的のベクタ−が完
成した。
【００２６】〔実施例３〕ホンシメジＧＰＤ遺伝子の転
写制御領域を組込んだ担子菌の形質転換用ベクタ−の担
子菌への導入方法の実際を、プラスミドpLS-PHTを木材
腐朽菌シイタケ（Lentinula edodes）及び菌根菌チチア
ワタケ（Suillus granulatus）に導入し形質転換した場
合について述べる。
写制御領域を組込んだ担子菌の形質転換用ベクタ−の担
子菌への導入方法の実際を、プラスミドpLS-PHTを木材
腐朽菌シイタケ（Lentinula edodes）及び菌根菌チチア
ワタケ（Suillus granulatus）に導入し形質転換した場
合について述べる。
【００２７】（１）シイタケの栄養菌糸をＧＭＹ寒天培
地（直径９cmのシャ−レ４枚）に接種し、20日ほど培養
する。この培養菌糸を寒天培地ごとメスで細かく切り刻
みシャ−レ１枚につき200 mlのＧＭＹ液体培地に移植し
て４日間25℃で静置培養した。培養後300 ml容量の遠心
チュ−ブ４本に移し、4,000×ｇ、10分間遠心して上清
を捨て集菌した。菌糸体を洗浄液（0.6 Mマンニト−
ル、0.05 Mマレイン酸-水酸化ナトリウム緩衝液(pH5.
5)）200 mlに懸濁し4,000×ｇ、10分間遠心して洗浄し
た。この洗浄操作を３回繰り返し集菌後菌糸体を50 ml
の遠心チュ−ブ４本に移して酵素溶液（0.5％セルラ−
ゼオノヅカR-10（生化学工業（株））、0.1％ノボザイ
ム234（Novo Nordisk,Denmark）、0.6 Mマンニト−ル、
0.05 Mマレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝液(pH5.5)）1
00 mlに懸濁した。30℃で３時間反応後、G3のガラスフ
ィルタ−で濾過して残った菌糸を除去し2,000×ｇで遠
心してプロトプラストを集めた。このプロトプラストを
10 mlのMTC緩衝液（0.6Mマンニト−ル、10mMトリス−塩
酸緩衝液(pH8.0) 、1 mM EDTA 、50 mM塩化カルシウ
ム）に懸濁後、2,000×ｇで遠心してプロトプラストを
集め、上清を捨てた。この洗浄操作を３回繰り返し2×1
07 個／400μlになるようプロトプラストをMTC緩衝液に
懸濁した。このプロトプラスト溶液400μlに40μgのプ
ラスミドpLS-PHTを加えて氷水中に10分間保温した後ジ
−ンパルサ−（Bio-Rad raboratories,Inc.,USA）で電
気パルスを加え、再び氷水中に10分間保温した。2.5倍
量の0.6MＳＭＹ液体培地（0.6Mシュ−クロ−ス、1%麦芽
エキス、0.4%イ−ストエキス）を加えて25℃で３日間培
養して細胞壁を再生させた後、50μg／mlのハイグロマ
イシンＢ（和光純薬工業（株））を含む0.6MＳＭＹ寒天
培地（0.6Mシュ−クロ−ス、1%麦芽エキス、0.4%イ−ス
トエキス、1.5%寒天）にまいて25℃で２週間培養し出現
したコロニ−を拾った。再び50μg／mlのハイグロマイ
シンＢを含む0.6MＳＭＹ寒天培地に植え、生育してきた
株を形質転換体の候補株とした（シイタケ野生株に対す
るハイグロマイシンＢの最小生育阻止濃度は10μg／m
l）。このプラスミド導入の実験結果を以下の表１に示
す。
地（直径９cmのシャ−レ４枚）に接種し、20日ほど培養
する。この培養菌糸を寒天培地ごとメスで細かく切り刻
みシャ−レ１枚につき200 mlのＧＭＹ液体培地に移植し
て４日間25℃で静置培養した。培養後300 ml容量の遠心
チュ−ブ４本に移し、4,000×ｇ、10分間遠心して上清
を捨て集菌した。菌糸体を洗浄液（0.6 Mマンニト−
ル、0.05 Mマレイン酸-水酸化ナトリウム緩衝液(pH5.
5)）200 mlに懸濁し4,000×ｇ、10分間遠心して洗浄し
た。この洗浄操作を３回繰り返し集菌後菌糸体を50 ml
の遠心チュ−ブ４本に移して酵素溶液（0.5％セルラ−
ゼオノヅカR-10（生化学工業（株））、0.1％ノボザイ
ム234（Novo Nordisk,Denmark）、0.6 Mマンニト−ル、
0.05 Mマレイン酸−水酸化ナトリウム緩衝液(pH5.5)）1
00 mlに懸濁した。30℃で３時間反応後、G3のガラスフ
ィルタ−で濾過して残った菌糸を除去し2,000×ｇで遠
心してプロトプラストを集めた。このプロトプラストを
10 mlのMTC緩衝液（0.6Mマンニト−ル、10mMトリス−塩
酸緩衝液(pH8.0) 、1 mM EDTA 、50 mM塩化カルシウ
ム）に懸濁後、2,000×ｇで遠心してプロトプラストを
集め、上清を捨てた。この洗浄操作を３回繰り返し2×1
07 個／400μlになるようプロトプラストをMTC緩衝液に
懸濁した。このプロトプラスト溶液400μlに40μgのプ
ラスミドpLS-PHTを加えて氷水中に10分間保温した後ジ
−ンパルサ−（Bio-Rad raboratories,Inc.,USA）で電
気パルスを加え、再び氷水中に10分間保温した。2.5倍
量の0.6MＳＭＹ液体培地（0.6Mシュ−クロ−ス、1%麦芽
エキス、0.4%イ−ストエキス）を加えて25℃で３日間培
養して細胞壁を再生させた後、50μg／mlのハイグロマ
イシンＢ（和光純薬工業（株））を含む0.6MＳＭＹ寒天
培地（0.6Mシュ−クロ−ス、1%麦芽エキス、0.4%イ−ス
トエキス、1.5%寒天）にまいて25℃で２週間培養し出現
したコロニ−を拾った。再び50μg／mlのハイグロマイ
シンＢを含む0.6MＳＭＹ寒天培地に植え、生育してきた
株を形質転換体の候補株とした（シイタケ野生株に対す
るハイグロマイシンＢの最小生育阻止濃度は10μg／m
l）。このプラスミド導入の実験結果を以下の表１に示
す。
【００２８】
【表１】
【００２９】（２）表１にある４株の形質転換体候補株
を50μg／mlのハイグロマイシンＢを含むＧＭＹ液体培
地1.5リットルに接種し、１ヶ月間振盪培養した。得ら
れた菌糸体を凍結乾燥し、実施例１の（１）で述べたの
と同様の方法で全ＤＮＡを抽出、精製した。この４株の
全ＤＮＡと野生株の全ＤＮＡを鋳型として実施例２の
（２）で述べたのと同様の方法でＰＣＲを行ったとこ
ろ、形質転換体候補株の全ＤＮＡを鋳型に用いた場合の
みｈｐｈ遺伝子とほぼ同じ分子量のＤＮＡ断片が増幅さ
れた。さらにこのうちの１株の全ＤＮＡを用いｈｐｈ遺
伝子をプロ−ブとしてサザンハイブリダイゼ−ションを
行ったところ、ｈｐｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片がシイタ
ケの染色体に挿入されていることが確認された。なお、
本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ及びターミネ
ーター活性を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドを導
入した木材腐朽菌シイタケMIL−S−001は、工業技術院
生命工学工業技術研究所にFERM P-16431 として寄託さ
れている（寄託日：平成 9年 9月17日）。
を50μg／mlのハイグロマイシンＢを含むＧＭＹ液体培
地1.5リットルに接種し、１ヶ月間振盪培養した。得ら
れた菌糸体を凍結乾燥し、実施例１の（１）で述べたの
と同様の方法で全ＤＮＡを抽出、精製した。この４株の
全ＤＮＡと野生株の全ＤＮＡを鋳型として実施例２の
（２）で述べたのと同様の方法でＰＣＲを行ったとこ
ろ、形質転換体候補株の全ＤＮＡを鋳型に用いた場合の
みｈｐｈ遺伝子とほぼ同じ分子量のＤＮＡ断片が増幅さ
れた。さらにこのうちの１株の全ＤＮＡを用いｈｐｈ遺
伝子をプロ−ブとしてサザンハイブリダイゼ−ションを
行ったところ、ｈｐｈ遺伝子を含むＤＮＡ断片がシイタ
ケの染色体に挿入されていることが確認された。なお、
本発明のプロモーター活性を有するＤＮＡ及びターミネ
ーター活性を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドを導
入した木材腐朽菌シイタケMIL−S−001は、工業技術院
生命工学工業技術研究所にFERM P-16431 として寄託さ
れている（寄託日：平成 9年 9月17日）。
【００３０】（３）さらにpLS-PHTの菌根菌に対する有
効性を確かめるため、栄養菌糸体の培養の容易なチチア
ワタケ（Suillus granulatus）への導入を行った。チチ
アワタケの栄養菌糸の培養、プロトプラストの作出、プ
ラスミドのプロトプラストへの導入方法等はシイタケの
場合と全く同様である。また、ハイグロマイシンＢのチ
チアワタケに対する最小生育阻止濃度は10μg／mlであ
った。プラスミドの導入実験の結果を以下の表２に示
す。
効性を確かめるため、栄養菌糸体の培養の容易なチチア
ワタケ（Suillus granulatus）への導入を行った。チチ
アワタケの栄養菌糸の培養、プロトプラストの作出、プ
ラスミドのプロトプラストへの導入方法等はシイタケの
場合と全く同様である。また、ハイグロマイシンＢのチ
チアワタケに対する最小生育阻止濃度は10μg／mlであ
った。プラスミドの導入実験の結果を以下の表２に示
す。
【００３１】
【表２】
【００３２】これら出現したコロニ−のうち印加電圧が
2.0kV／cm、3.0kV／cm、4.0kV／cmの試験区からランダ
ムに６株ずつ拾って50μg／mlのハイグロマイシンＢを
含むＧＭＹ寒天培地に植え、生育してきたものをそれぞ
れ１株ずつ選びシイタケの場合と同様にＰＣＲ及びサザ
ンハイブリダイゼ−ションを行ったところ、ｈｐｈ遺伝
子を含むＤＮＡ断片がチチアワタケの染色体に挿入され
ていることが確認された。以上の結果により、シイタケ
とチチアワタケで形質転換効率にかなりの差はあるもの
の、プラスミドpLS-PHTは担子菌の形質転換用ベクタ−
として木材腐朽菌及び菌根菌の両者に対して有効である
ことが示された。
2.0kV／cm、3.0kV／cm、4.0kV／cmの試験区からランダ
ムに６株ずつ拾って50μg／mlのハイグロマイシンＢを
含むＧＭＹ寒天培地に植え、生育してきたものをそれぞ
れ１株ずつ選びシイタケの場合と同様にＰＣＲ及びサザ
ンハイブリダイゼ−ションを行ったところ、ｈｐｈ遺伝
子を含むＤＮＡ断片がチチアワタケの染色体に挿入され
ていることが確認された。以上の結果により、シイタケ
とチチアワタケで形質転換効率にかなりの差はあるもの
の、プラスミドpLS-PHTは担子菌の形質転換用ベクタ−
として木材腐朽菌及び菌根菌の両者に対して有効である
ことが示された。
【００３３】
【発明の効果】本発明のプロモーター活性を有するＤＮ
Ａ及びターミネーター活性を有するＤＮＡを含むベクタ
ーによれば、木材腐朽菌と菌根菌のどちらの担子菌をも
形質転換することができる。
Ａ及びターミネーター活性を有するＤＮＡを含むベクタ
ーによれば、木材腐朽菌と菌根菌のどちらの担子菌をも
形質転換することができる。
【００３４】
配列番号：１ 配列の長さ：１８８ 配列の型：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リオフィラム シメジ（Lyophyllum shimeji） 配列の特徴 GPD遺伝子のプロモーター領域 配列 GACAAAGATC TGAGGCCTAG GGGGCTCACA GGAGTGAATG CAGTCCCGTT GTGATATTCG 60 TGAAAGTTCC AATTTGGATG ATGACGACAT AATCGATCTC CGATGGATTG ATTATCTACT 120 CAGCCATTAT AAAACCCGCC TGGTCGCAGC ACATCCCAAA CTCCCCCCTC ACACACTTTT 180 TTATCACC 188
【００３５】配列番号：２ 配列の長さ：２７５ 配列の型：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名：リオフィラム シメジ（Lyophyllum shimeji） 配列の特徴 GPD遺伝子のターミネーター領域 配列 TAGATATCCC GTTCCCTACG ATCTCATCGC TCCCGCCCAT TGACACCCAA GCCCCCTTTT 60 CATCCACTTT CCACTTTTTC TCACTTGCTT AACGGGAGAG GAGATGTGGC TGATGCATGG 120 GCTGAAAGGA AACAACGGCT GTGATTCGGA CGCGTCTTAT GAGAAGGTAG TACTTTCCGA 180 CACATACGAC AATCGAAACA AATAGAAATT CTGTTGTACA AGTACTCGGA GTCATCATTC 240 AAGTACGTTT GTTTAGGTTG CTGCCGTGCT CTGAC 275
【図１】ホンシメジのＧＰＤ遺伝子とその転写制御領域
を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。
を含むＤＮＡ断片の制限酵素地図を示す図である。
【図２】プラスミドpLS-DWの制限酵素地図を示す図であ
る。
る。
【図３】プラスミドpLS-UPの制限酵素地図を示す図であ
る。
る。
【図４】プラスミドpLS-PROを構築するための手順を示
す図である。
す図である。
【図５】中間体ベクタ−pLS-PHを構築するための手順を
示す図である。
示す図である。
【図６】組換え発現ベクタ−pLS-PHTを構築するための
手順を示す図である。
手順を示す図である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (4)
- 【請求項１】 以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列に
より表され、かつプロモーター活性を有するＤＮＡ。 （ａ） 配列番号１に記載の塩基配列。 （ｂ） 配列番号１に記載の塩基配列において、１若し
くは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基
配列。 - 【請求項２】 以下の（ａ）または（ｂ）の塩基配列に
より表され、かつターミネーター活性を有するＤＮＡ。 （ａ） 配列番号２に記載の塩基配列。 （ｂ） 配列番号２に記載の塩基配列において、１若し
くは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基
配列。 - 【請求項３】 請求項１記載のＤＮＡ及び／又は請求項
２記載のＤＮＡを含むベクター。 - 【請求項４】 請求項３記載のベクターによって形質転
換された形質転換体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9301078A JP2986437B2 (ja) | 1997-10-31 | 1997-10-31 | 新規ベクター |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9301078A JP2986437B2 (ja) | 1997-10-31 | 1997-10-31 | 新規ベクター |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11127863A true JPH11127863A (ja) | 1999-05-18 |
| JP2986437B2 JP2986437B2 (ja) | 1999-12-06 |
Family
ID=17892612
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9301078A Expired - Lifetime JP2986437B2 (ja) | 1997-10-31 | 1997-10-31 | 新規ベクター |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2986437B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003070940A1 (fr) * | 2002-02-25 | 2003-08-28 | Oji Paper Co., Ltd. | Gene d'enzyme de digestion de la cellulose et utilisation dudit gene |
-
1997
- 1997-10-31 JP JP9301078A patent/JP2986437B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003070940A1 (fr) * | 2002-02-25 | 2003-08-28 | Oji Paper Co., Ltd. | Gene d'enzyme de digestion de la cellulose et utilisation dudit gene |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2986437B2 (ja) | 1999-12-06 |
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