CN1650004A - 纤维素分解酶基因及其用途 - Google Patents

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Abstract

一种处理木屑的方法，其包括：制备编码反义RNA的DNA的步骤，所述反义RNA与担子菌－来源的纤维素消化酶基因的完整转录产物或其一部分基本互补；构造含有(a)上述DNA、或(b)含有上述DNA的重组DNA和具有启动子活性的DNA片段的载体的步骤，其中所述DNA与所述DNA片段是以这样一种方式结合的，即纤维素消化酶的反义RNA是通过所述DNA的转录形成的；使用载体进行转录并由此制备具有被抑制的纤维素消化酶活性的宿主细胞的步骤；并用具有被抑制的纤维素消化酶活性的宿主细胞接种木屑由此处理木屑。

Description

纤维素分解酶基因及其用途
技术领域
本发明涉及一种使用编码纤维素分解酶的基因的反义基因处理木屑的方法。
背景技术
在造纸和纸浆工业中生产的纸浆根据其生产方法的不同分为机械纸浆和化学纸浆。
机械纸浆是通过用机械能物理研磨木纤维而生产的。因为这种机械纸浆几乎含有所有木成分，因此它可以较高产率生产，并由此，可生产出高度不透明的薄纸。然而，机械纸浆的缺点在于研磨时需要较高的电力，且所生产出来的纸几乎不具有纸强度。
人们已经广泛筛选过可解决上述问题且不会降低纸浆产率的微生物。例如，已经报道过在有葡萄糖存在的条件下，用担子菌Phanerochaete chrysosporium处理桤木第一次精制过的热机械纸浆(TMP)，然后经过第二次精制，则精制所需的能量降低了25％-30％(Bar-Lev和T.K.Kirk，Tappi J.，65，111，1982)。此外，当用Phanerochaete chrysosporium和Dichomitus squalens处理山杨木时，所得纸的强度高于对照组的强度(Myers.，Tappi J.，105，1988)。Akamathu等人已经在杨木上培养了包括毛革盖菌在内的10株白腐真菌，从而检验纸浆产率、精制能、和纸浆强度。结果，他们发现，在所用菌株中，毛革盖菌可优选作为木屑预处理中所用的真菌，这是因为这种真菌可降低精制能并增加结晶度。然而，同时，毛革盖菌可产生约7％的产率(Akamathu等人，Mokuzai gakkaishi，30(8)697-702，1984)。此外，使用从61种类型(85株)的白腐真菌中初步选择的10种类型的白腐真菌，Nishibe等人已经微生物分解了来源于水胡桃碎屑和软木的二次精制TMP。之后，他们选择性地进行去木质作用。他们选择了Coprinus cinereus和Phanerochaetechrysosporium，它们可导致纸浆纤维更少降解，且他们已经指出在有葡萄糖和尿素存在的条件下，这些真菌可控制纸强度的降低。然而，当在30℃下用上述真菌处理纸浆共14天时，纸浆产率分别降低了6.3％和9.7％。当使用毛革盖菌时，产率降低了7.5％(Nishibe等人，Japan Tappi，42(2)，1988)。Kashino等人已经从自然界筛选出了白腐真菌IZU-154，且木质素已经选择性被Phanerochaetechrysosporium和Trametes versicolor分解。他们已经证实当如此处理硬木7天时，精制能降低1/2-2/3。此外，他们还证实了纸浆强度大约增加了2倍。当处理软木10-14天时，精制能降低2/3，还观察到纸浆强度增加。当加入培养基时，7天即可获得相同的结果(Kashino等人，Tappi.J.，76(12)，167，1993)。此外，近来已在U.S.A建立了由研究院和几个纸浆和造纸公司，包括作为中心的USDA Forest Products Laboratory组成的木质素协会。木质素协会已筛选了一种菌株，其具有较高的分解木质素的能力，和较低的分解纤维素的能力，结果该协会从自然界中新分离出了Ceriporiopsissubvermispora。该协会已经研究出了使用这种菌株可降低机械纸浆所用的能量。该协会已经报道了这种菌株可使生产TMP所需的能量降低近40％，例如在这种情况下，产率降低约3％-5％。该协会还报道了对纸强度没有所担心的不利作用，但这种强度稍稍增加。USDA ForestProducts Laboratory已经建造了一个试验工厂，并在其中进行了分离的Ceriporiopsis subvermispora的验证试验。美国工厂考虑在工厂的木屑堆置场进行微生物处理(Scott等人，Tappi J.，81.12.153，1998)。在这种情况下，因保存木屑的木屑堆的内部具有较高温度，因此甚至在高温下仍然需要具有作用的菌株。然而因为分离的Ceriporiopsis subvermispora仅在32℃或更低的温度下具有作用，因此这种真菌不适于实际使用。
此外，已经通过先前筛选获得的微生物并不是必然对木质素分解具有高度选择性。因为它们不仅分解木质素而且分解纤维素，它们导致纸浆产率或纸强度降低。因此，进一步希望获得或生产对木质素分解具有较高选择性的微生物，即对分解纤维素具有抑制能力并对分解木质素具有极好能力的微生物。
Ander等人已经生产出了对木质素分解具有较高选择性的突变体。他们已经通过UV辐射将突变引入到Sporotrichum pulverulentum中，如此他们研制出了具有较低纤维素酶活性的菌株Ce144。桦木屑是利用野生型菌株和上述纤维素酶-缺乏的Ce144而被分解的。因此，人们发现前者分解木质素和木聚糖较好，而后者分解木质素和木聚糖较好但几乎不能分解葡聚糖(Ander和Eriksson，SvenskPapperstidning，18，643，1975)。用这种Ce144处理桦木6周，之后，从其生产机械纸浆。结果，人们发现纸强度增加了(Ander和Eriksson，Svensk Papperetidning，18，641，1975)。此外，已经报道过当使用桦木和松木进行实验时，用于纤维化和精制纤维所需的能量通过增加处理时间而降低了30％(Eriksson和Vallander.，Svensk Papperstid 85，R33，1982)。他们还从辐射射脉菌生产出了具有较低纤维素酶活性的Ce126。用这种Ce126处理由松木制造的木屑和纸浆，然后从其生产机械纸浆。结果，人们发现纸强度在两种情况下都没有提高，但是观察到精制能降低了。此外，重量降低了2％或更少(Samuelsson等人，Svensk Papperstid，8，221，1980)。
如上所述，已经生产出了具有较低纤维素酶活性的突变株，而且已经考虑了这种突变株在处理机械纸浆中的用途。然而，因为这些突变株是通过紫外辐射而被诱变处理的，它们具有生长速度缓慢和需要花费较长时间分解纸浆的问题。因此，希望生产出一种突变株，它具有正常的生长速度，而且具有被抑制的纤维素分解活性。
另一方面，化学纸浆是通过使用化学品溶解木材的木质素，从而得到纤维素和半纤维素的生产方法获得的。目前，用氢氧化钠和硫酸钠对牛皮纸浆进行去木质作用已经成为主流。相对于机械纸浆而言，牛皮纸浆也是用微生物处理的，并在蒸煮之前经过去木质作用，由此尝试降低生产能量并提高纸浆质量。
例如，已经报道过当用Phanerochaete chrysosporium处理红橡木或山杨木30天，则相同Ka值下的产率提高，并由此降低了打浆能，提高了抗拉强度和爆裂强度(Oriaran等人，Tappi，73，147，1990)。同样，已经根据使用Phanerochaete chrysosporium进行的实验报道了爆裂强度和撕裂强度的增加(Chen等人，Wood Fiber Sci.，27.198，1995)。Molina等人已经报道了当用Trametes versicolor和Pleurotus ostreatus处理辐射松木时，生产能量可降低11％-14％。然而在使用Trametes versicolor的情况下，观察到纸浆强度降低(Molina，50th Appita Annual General Conference，pp.57-63，1996；Molina，51st Annual General Conference，pp.199-206)。Bajpai等人已经报道过在使用微生物Ceriporiopsis subvermispora进行的实验中，活性碱可降低18％，蒸煮时间可降低33％，白液中硫的程度降低30％(P.Bajpai等人，J.Pulp and PaperScience：27(7)，235-239，2001)。
如上所述，用微生物处理牛皮纸浆可改善蒸煮，由此导致能量降低。然而，在某些情况下，这种用微生物进行的处理可降低产率或纸强度。因此，在机械纸浆的情况下，对于用微生物进行处理的实际应用而言，需要获得或生产出对木质素分解具有较高选择性的微生物，这种微生物具有极好的分解木质素的能力和被抑制的分解纤维素的能力。
在这种纤维素分解酶(分解纤维素的酶)中，一种通常被称作纤维素酶的酶可将β-1，4-葡聚糖(纤维素)或其衍生物中β-1，4-吡喃葡萄糖基的键水解。这种酶广泛分布在高等植物、微生物如真菌或细菌、软体动物等中。已知纤维素酶广义上分为以在内-方式水解纤维素主链中的β-1，4-吡喃葡萄糖基键的内切葡聚糖酶(CMC酶)，和主要除去纤维素主链末端上的纤维二糖残基的外切葡聚糖酶(微晶纤维素酶)。这些水解酶协同作用于纤维素，以致纤维素底物可降低其分子量从而产生纤维二糖，并进一步，由于β-葡萄糖苷酶的涉及，它可被分解成葡萄糖单元。
此外，纤维二糖脱氢酶是一种氧化还原酶，它可将纤维二糖或纤维低聚糖氧化产生cellobionolactone，并同时，还原醌，如铁的金属络合物，苯氧基，或氧。这种酶在微生物分解纤维素时，与纤维素酶同时产生(Eriksson等人，FEBS Lett.，49，282-285，1974)。此外，这种酶可免除由于纤维二糖造成的纤维素酶活性的抑制，即，免除由于纤维二糖造成的产品的抑制(Igarashi等人，Eur.J.Biochem.，253，101，1998)。从这些事实可以看出纤维二糖脱氢酶与纤维素酶结合促进纤维素的分解。此外，因为纤维二糖脱氢酶可引起Fenton反应，产生可有力分解纤维素的羟基，因此认为这种酶与纤维素的分解十分相关。这种推论还可从Dumonceaux等人生产出具有被抑制的纤维二糖脱氢酶活性的突变株，及其性质的分解结果得到支持。Dumonceaux等人已经使用抗生素菲洛霉素作为指标，通过同源重组生产出了纤维二糖脱氢酶-缺乏株。他们已经报道当使用无定形纤维素作为碳源时，纤维二糖脱氢酶-缺乏株的生长速度与野生型菌株的生长速度几乎相等，但是当在微晶纤维素上培养时，纤维二糖脱氢酶-缺乏株的生长速度明显减慢，且纤维二糖脱氢酶-缺乏株可以和野生型菌株相等的水平分解包含在阔叶树未漂白纸浆中的木质素或合成木质素14C-DHP(Dumonceaux，Enzyme and Microb.29，478-489，2001)。
按照有关纤维二糖脱氢酶等的一般性介绍(G.Henriksson等人，J.Biotechnol.78(2000)93-113)，产生这种酶的微生物的例子包括使木材腐烂的真菌，如Phanerochaete chrysosporium、Trametesversicolor、群交裂褶菌、单纯粉孢革菌、Myceliophtorethermophila、或Fumicola insolens。
此外，关于编码纤维二糖脱氢酶的基因(此后称作纤维二糖脱氢酶基因)，在Phanerochaete chrysosporium的情况下，例如，已经克隆了K3株的cDNA(Raices等人，FEBS Letters，69，233-238，1995)，和OGC101株的cDNA(Li等人，Appl.Environ.Microbiol.，62(4)，1329-1335，1996)和染色体DNA(Li等人，Appl.Environ.Microbiol.，63(2)，796-799，1997)。此外，关于Trametes versicolor(T.J.Dumonceaux等人，Gene.210.211-219(1998))和朱红密孔菌(S.M.Moukha等人，Gene，234，23-33，1999)，且，已经报道了纤维二糖脱氢酶基因的存在。
如上所述，纤维二糖脱氢酶和编码该酶的基因已经公开。然而，没有关于纤维素分解酶，包括作为典型例子的来源于毛革盖菌的纤维二糖脱氢酶，或纤维素分解酶基因的报道，而它们是获得或生产对木质素分解具有较高选择性的微生物所必需的，用于使用微生物进行处理生产机械纸浆或化学纸浆，也没有关于应用上述基因的基因重组技术的报道。此外，没有公开过使用通过这种基因重组获得的转化体处理纸浆的有效方法。
另一方面，纤维素分解酶的使用长时间具有吸引人的强烈兴趣。例如，纤维素分解酶以各种方式的使用，如将该酶加入到家用洗涤剂中、由于用该酶进行表面处理的纤维素聚合物质、如纤维的重整、废纸的脱墨处理、或食品加工已经被研究。因此，需要生产大量纤维素分解酶的方法。作为生产大量纤维二糖脱氢酶的尝试，已经报道过将作为结构有效启动子的D-甘油醛-3-磷酸脱氢酶与Phanerochaetechrysosporium的纤维二糖脱氢酶-1基因的上游连接(Li.，Biochem.Biophys.Res.Commun.，270，141-146，2000)。然而，因为Phanerochaete chrysosporium在日本被称作破坏性真菌，而不能使用它。因此，希望研究出一种使用无害微生物生产大量纤维素分解酶，包括作为典型例子的纤维二糖脱氢酶的技术，但迄今为止，还没有报道过有关使用纤维素分解酶基因，如来源于毛革盖菌的纤维二糖脱氢酶基因的上述技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用编码纤维素分解酶的基因的反义基因处理木屑的方法。
为了解决上述问题，本发明人已经集中研究并广泛筛选了产生纤维素分解酶，包括作为典型例子的纤维二糖脱氢酶的真菌。结果，他们已经发现毛革盖菌可产生纤维素分解酶。此外，本发明人还成功克隆了编码这种纤维素分解酶的基因。此外，他们还研究出了一种使用其反义基因控制上述基因表达的方法。他们已经按照上述方法从木屑生产纸浆，并已经成功控制了产率或纸强度的降低，由此完成了本发明。
也就是说，本发明提供下列特征：
(1)一种处理木屑的方法，包括下列步骤：
制备编码反义RNA的DNA，所述反义RNA与来源于担子菌的纤维素分解酶基因的转录产物的全部或一部分基本互补；
制备含有(a)上述DNA，或(b)含有上述DNA的重组DNA和具有启动子活性的DNA片段的载体，其中上述DNA与上述DNA片段结合，这样纤维素分解酶基因的反义RNA就可作为转录的结果而产生；
用上述载体转化宿主细胞，从而制备具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞；并
将上述具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞接种到木屑中，而处理它们。
(2)根据(1)的方法，其中所述纤维素分解酶基因含有选自编码纤维二糖脱氢酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶、属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶、属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶、和属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶的各基因的一个或多个基因。
(3)根据(2)的方法，其中所述纤维二糖脱氢酶基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的纤维二糖脱氢酶基因：
(a)SEQ ID No.1或3所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有纤维二糖脱氢酶酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.1或3的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有纤维二糖脱氢酶酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(4)根据(2)的方法，其中所述纤维二糖水解酶I的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的纤维二糖水解酶I的基因：
(a)SEQ ID No.7、9或11所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有纤维二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.7、9或11的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有纤维二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(5)根据(2)的方法，其中所述纤维二糖水解酶II的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的纤维二糖水解酶II的基因：
(a)SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有纤维二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.14的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有纤维二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(6)根据(2)的方法，其中所述属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶的基因：
(a)SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.18的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(7)根据(2)的方法，其中所述属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶的基因：
(a)SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.20的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(8)根据(2)的方法，其中所述属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶的基因：
(a)SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.24的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(9)根据(2)的方法，其中所述属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶的基因：
(a)SEQ ID No.28所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.28的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
(10)根据(1)-(9)任何一项的方法，其中担子菌是毛革盖菌或Phanerochaete chrysosporium。
(11)根据(1)-(10)任何一项的方法，其中宿主细胞是毛革盖菌。
(12)一种通过(1)-(11)任何一项的方法获得的木屑。
(13)一种使用(12)的木屑生产纸浆的方法。
(14)一种通过(13)的方法获得的纸浆。
本说明书包括日本专利申请号第2002-48675的说明书和/或附图中公开内容的一部分或全部，其是本申请的优先权文件。
附图简述
图1是表示本发明纤维二糖脱氢酶作用于纤维二糖的反应的分析结果图；
图2是表示本发明纤维二糖脱氢酶最佳pH的图。在图中，◆代表甘氨酸-HCl，■代表醋酸，▲代表磷酸；
图3是表示本发明纤维二糖脱氢酶的pH稳定性的图。在图中，◆代表甘氨酸-HCl，■代表醋酸，▲代表磷酸；
图4是表示本发明纤维二糖脱氢酶的最佳反应温度的图；和
图5是表示本发明纤维二糖脱氢酶的热稳定性的图。
序列表的描述
SEQ ID NO.5是噬斑杂交中所用的探针。
SEQ ID NO.6是噬斑杂交中所用的探针。
SEQ ID NO.13是噬斑杂交中所用的探针。
SEQ ID NO.16是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.17是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.22是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.23是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.26是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.27是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.30是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.31是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.32是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.33是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.34是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.35是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.36是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.37是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.38是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.39是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.40是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.41是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.42是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.43是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.44是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.45是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.46是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.47是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.48是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.49是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.50是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.51是PCR反应中所用的引物。
SEQ ID NO.52是PCR反应中所用的引物。
进行本发明的方式
下面将进一步详细描述本发明。
本发明提供一种处理木屑的方法，包括下列步骤：制备编码反义RNA的DNA，所述反义RNA与来源于担子菌的纤维素分解酶基因的转录产物的全部或一部分基本互补；制备含有(a)上述DNA、或(b)含有上述DNA的重组DNA和具有启动子活性的DNA片段的载体，其中上述DNA与上述DNA片段结合，这样纤维素分解酶基因的反义RNA就可作为转录的结果而产生；使用上述载体进行转化，从而制备具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞；并将上述具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞接种到木屑中，由此处理它们。
在本说明书中，可使用任何类型的担子菌，只要它具有分解纤维素的能力。特别优选毛革盖菌，它的日本名称是Aragekawaratake。
此外，对纤维素分解酶基因没有特别限制，只要该酶可分解纤维素。这种纤维素分解酶基因的优选例子可包括纤维二糖脱氢酶基因、纤维二糖水解酶I基因、纤维二糖水解酶II基因、和内切葡聚糖酶基因。更具体而言，可使用下面1-7中描述的各种基因。值得注意的是，这些基因可单独使用，但它们也可以一种或多种类型组合的形式使用。
1.一种含下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的纤维二糖脱氢酶基因：
(a)SEQ ID No.1或3所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有纤维二糖脱氢酶酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.1或3的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有纤维二糖脱氢酶酶活性的蛋白的核苷酸序列。
2.一种含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的纤维二糖水解酶I的基因：
(a)SEQ ID No.7、9或11所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有纤维二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.7、9或11的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有纤维二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
3.一种含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的纤维二糖水解酶II的基因：
(a)SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有纤维二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.14的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有纤维二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
4.一种含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶的基因：
(a)SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.18的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
5.一种含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶的基因：
(a)SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.20的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
6.一种含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶的基因：
(a)SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID NO.24的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
7.一种含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶的基因：
(a)SEQ ID No.28所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID NO.28的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
上面1.中描述的纤维二糖脱氢酶基因可通过下列过程获得。
染色体DNA是通过提取染色体DNA的常规方法，如Yelton等人的方法从毛革盖菌制备的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，1470(1984))。随后，用部分分解的适宜限制酶如Sau3AI处理所得的染色体DNA，然后通过蔗糖密度梯度超速离心分离所得产物，从而获得10kbp-25kbp大小的DNA片段。将所得DNA片段与噬菌体DNA连接，其已经用产生相同粘性末端的限制酶处理过。EMBL3(A-M，Frishauf等人，J.Mol.Biol.170，827(1983))λ噬菌体DNA是这种噬菌体DNA的例子。使所得与DNA片段连接的噬菌体经过体外包装，将所得产物用作染色体DNA文库。进行亚克隆时，可使用通常所用的克隆载体，优选大肠杆菌载体。例如，可使用pUC质粒，如pUC18(C.Yanisch-Perron等人，Gene，33，103(1985))。克隆载体不限于上述例子，还可使用可商业得到的克隆载体或在公开出版物中描述的已知载体。
为了从上述染色体基因文库分离纤维二糖脱氢酶基因，用赖氨酰内肽酶完全消化从毛革盖菌获得并已纯化的纤维二糖脱氢酶，然后使消化物经过氨基酸测序。之后，使用合成DNA探针进行噬斑杂交，其中所述合成DNA探针是以从所得氨基酸序列估计的核苷酸序列为基础生产的，从而选择含有纤维二糖脱氢酶基因的克隆。含有纤维二糖脱氢酶基因的DNA片段是从所选择的克隆中分离出来的。之后，制备其限制性酶切图谱，并测定其序列。该序列可通过将上述含有纤维二糖脱氢酶基因的片段插入到适宜的克隆载体(例如，pUC载体，如pUC19)中，然后应用Sanger等人的方法而测定(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，5463(1977))。
按照上述过程，已经测定了SEQ ID NOS：1和3所示、编码来源于毛革盖菌的纤维二糖脱氢酶的核苷酸序列。SEQ ID No.1所示具有3,420bp核苷酸序列的基因是来源于毛革盖菌的7,207bp纤维二糖脱氢酶基因组基因的结构基因，其被称作纤维二糖脱氢酶1基因。SEQID No.3所示具有3,480bp核苷酸序列的基因是来源于毛革盖菌的5,345bp纤维二糖脱氢酶基因组基因的结构基因，其被称作纤维二糖脱氢酶2基因。
SEQ ID No.1所示纤维二糖脱氢酶1基因的结构基因部分由16个外显子和15个内含子(间插序列)组成。
更具体而言，外显子1位于129-177之间，内含子1位于178-239之间，外显子2位于240-498之间，内含子2位于499-557之间，外显子3位于558-667之间，内含子3位于668-716之间，外显子4位于717-833之间，内含子4位于834-885之间，外显子5位于886-1028之间，内含子5位于1029-1077之间，外显子6位于1078-1242之间，内含子6位于1243-1301之间，外显子7位于1302-1374之间，内含子7位于1375-1425之间，外显子8位于1426-1480之间，内含子8位于1481-1534之间，外显子9位于1535-2165之间，内含子9位于2166-2223之间，外显子10位于2224-2351之间，内含子10位于2352-2407之间，外显子11位于2408-2456之间，内含子11位于2457-2509之间，外显子12位于2510-2598之间，内含子12位于2599-2653之间，外显子13位于2654-2799之间，内含子13位于2800-2859之间，外显子14位于2860-2930之间，内含子14位于2931-2995之间，外显子15位于2996-3100之间，内含子15位于3101-3157之间，外显子16位于3158-3274之间。此外，由核苷酸序列No.3275代表和正向的区是包括终止子在内的3’-非翻译区。
此外，人们发现从核苷酸序列分析估计的氨基酸序列是由768个氨基酸残基组成的氨基酸序列，其在SEQ ID No.2中表示。
另一方面，SEQ ID No.3中所示纤维二糖脱氢酶2基因的结构基因部分由16个外显子和15个内含子组成。
更具体而言，外显子1位于159-207之间，内含子1位于208-269之间，外显子2位于270-528之间，内含子2位于529-587之间，外显子3位于588-697之间，内含子3位于698-746之间，外显子4位于747-863之间，内含子4位于864-915之间，外显子5位于916-1058之间，内含子5位于1059-1107之间，外显子6位于1108-1272之间，内含子6位于1273-1331之间，外显子7位于1332-1404之间，内含子7位于1405-1455之间，外显子8位于1456-1510之间，内含子8位于1511-1564之间，外显子9位于1565-2195之间，内含子9位于2196-2253之间，外显子10位于2254-2381之间，内含子10位于2382-2437之间，外显子11位于2438-2486之间，内含子11位于2487-2539之间，外显子12位于2540-2628之间，内含子12位于2629-2683之间，外显子13位于2684-2829之间，内含子13位于2830-2887之间，外显子14位于2888-2958之间，内含子14位于2959-3025之间，外显子15位于3026-3130之间，内含子15位于3131-3208之间，外显子16位于3209-3325之间。此外，由核苷酸序列No.3326代表和正向的区是包括终止子在内的3’-非翻译区。
此外，人们发现从核苷酸序列分析估计的氨基酸序列是由768个氨基酸残基组成的氨基酸序列，其在SEQ ID No.4中表示。
此外，在纤维二糖脱氢酶1基因中，SEQ ID No.1所示核苷酸序列中的核苷酸129-核苷酸3274的纤维二糖脱氢酶基因部分是有用的。在纤维二糖脱氢酶2基因中，SEQ ID No.3所示核苷酸序列中的核苷酸159-核苷酸3325的纤维二糖脱氢酶基因部分是特别有用的。
来源于毛革盖菌的纤维二糖脱氢酶基因的DNA片段可通过PCR从含有上述纤维二糖脱氢酶染色体基因的DNA片段获得。作为PCR中所用的引物，由大约10-50个核苷酸组成、优选由大约15-30个核苷酸组成的序列，它们是以SEQ ID NOS：1和3所示的上述核苷酸序列为基础获得的，以及与其互补的序列，可被用作有义引物和反义引物。例如，可使用SEQ ID No.31所示的有义引物和SEQ ID No.32所示的反义引物(参考实施例12)。
应注意的是，转化的大肠杆菌菌株，大肠杆菌JM109/pCHCDH1和大肠杆菌JM109/pCHCDH2，它们的基因组DNA含有来源于毛革盖菌的纤维二糖脱氢酶基因的序列，所述菌株独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(the AIST Tsukuba Central 6，Higashi1-1-1，Tsukuba，Ibaraki，Japan)中保藏，保藏号分别为FERM BP-8278和FERM B-8279，保藏日期为2002年2月8日。含有包含在这些保藏菌株中的、SEQ ID No.1或3所示的核苷酸序列的DNA也包括在本发明中。
上面2.中所述的纤维二糖水解酶I基因可通过下列过程获得。
噬斑杂交是按照与上面1.中所述基因制备相同的方式进行的，从而制备含有纤维二糖水解酶I基因的克隆。含有纤维二糖水解酶I基因的DNA片段是从所选择的克隆中分离出来的，接着制备其限制性酶切图谱，并测定其序列。这种测序可通过将含有纤维二糖水解酶I基因的DNA片段插入到适宜的克隆载体(例如，pUC载体，如pUC19)中，然后应用Sanger等人的方法(如上所述)进行。
按照上述过程，测定SEQ ID NOS：7、9、或11所示、编码来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I的核苷酸序列。如此测定的核苷酸序列分别被称作纤维二糖水解酶I-1基因、纤维二糖水解酶I-2基因、和纤维二糖水解酶I-3基因。
此外，人们发现从上述核苷酸序列分析估计的氨基酸序列分别是SEQ ID No.8所示的由456个氨基酸残基组成的氨基酸序列、SEQ IDNo.10所示的由456个氨基酸残基组成的氨基酸序列、SEQ ID No.12所示的由457个氨基酸残基组成的氨基酸序列。
上述纤维二糖水解酶I-1-I-3基因的DNA片段可通过PCR从含有上述纤维二糖水解酶I-1-I-3的染色体基因的DNA片段获得。作为PCR引物，由大约10-50个核苷酸组成、优选由大约15-30个核苷酸组成的序列，它们是以上述核苷酸序列(SEQ ID NOS：7、9、和11)为基础获得的，以及与其互补的序列，可被用作有义引物和反义引物。
上面3.中所述的纤维二糖水解酶II基因可通过下列过程获得。
噬斑杂交是按照与上面1.中所述基因制备相同的方式进行的，从而制备含有纤维二糖水解酶II基因的克隆。含有纤维二糖水解酶II基因的DNA片段是从所选择的克隆中分离出来的，接着制备其限制性酶切图谱，并测定其序列。这种测序可通过将含有纤维二糖水解酶II基因的DNA片段插入到适宜的克隆载体(例如，pUC载体，如pUC19)中，然后应用Sanger等人的方法(如上所述)进行。
按照上述过程，测定SEQ ID No：14所示、编码来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶II的核苷酸序列。此外，人们发现从上述核苷酸序列分析估计的氨基酸序列是SEQ ID No.15所示的由453个氨基酸残基组成的氨基酸序列。
上述纤维二糖水解酶II基因的DNA片段可通过PCR从含有上述纤维二糖水解酶II染色体基因的DNA片段获得。作为PCR引物，由大约10-50个核苷酸组成、优选由大约15-30个核苷酸组成的序列，它们是以上述核苷酸序列为基础获得的，以及与其互补的序列，可被用作有义引物和反义引物。
上面4.中所述的属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶的基因可通过下列过程获得。
mRNA是从通过使毛革盖菌在木屑上生长而获得的细胞体中回收的，然后按照常规方法产生cDNA文库。为了从所得的cDNA文库中分离属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶基因，在适宜的琼脂培养基上形成噬斑，并从其中随机分离若干噬斑。之后，用两种类型的适宜引物扩增来源于毛革盖菌的cDNA部分，并分析其核苷酸序列，从而分离含有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶基因的DNA片段。
按照上述过程，测定SEQ ID No：18所示、编码属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶的核苷酸序列。此外，人们发现从上述核苷酸序列分析估计的氨基酸序列是SEQ ID No.19所示的由374个氨基酸残基组成的氨基酸序列。
属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶基因的DNA片段可通过PCR从含有上述属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶基因的DNA片段获得。作为PCR引物，由大约10-50个核苷酸组成、优选由大约15-30个核苷酸组成的序列，它们是以SEQ ID No：18所示的核苷酸序列为基础获得的，以及与其互补的序列，可被用作有义引物和反义引物。
此外，上面5.中所述的属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶的基因可通过下列过程获得。
按照与上面4.中所述基因制备相同的方式，从cDNA文库中随机分离噬斑。之后，扩增来源于毛革盖菌的cDNA部分，并分析其核苷酸序列，从而分离属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶的基因。
按照上述过程，测定SEQ ID No：20所示、编码属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶的核苷酸序列。此外，人们发现从上述核苷酸序列分析估计的氨基酸序列是SEQ ID No.21所示的由至少215个氨基酸残基组成的氨基酸序列。
属于来源于毛革盖菌的糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶基因的DNA片段可通过PCR从含有上述属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶基因的DNA片段获得。作为PCR引物，由大约10-50个核苷酸组成、优选由大约15-30个核苷酸组成的序列，它们是以SEQ ID No：20所示的核苷酸序列为基础获得的，以及与其互补的序列，可被用作有义引物和反义引物。
此外，上面6.中所述的属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶的基因可通过下列过程获得。
在适宜的培养基中培养担子菌Phanerochaete chrysosporium，然后通过上面1.中所述Yelton等人的方法回收染色体DNA。关于所得的染色体DNA，产生两个适宜的PCR引物，它们是根据Phanerochaetechrysosporium的染色体DNA的数据库预测的。之后，通过常规方法扩增目标DNA片段，从而获得属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶基因。
按照上述过程，测定SEQ ID No：24所示、编码来源于Phanerochaete chrysosporium的属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶的核苷酸序列。此外，人们发现从上述核苷酸序列分析估计的氨基酸序列是SEQ ID No.25所示的由386个氨基酸残基组成的氨基酸序列。
来源于Phanerochaete chrysosporium的属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶基因的DNA片段可通过PCR从含有上述属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶基因的DNA片段获得。作为PCR引物，由大约10-50个核苷酸组成、优选由大约15-30个核苷酸组成的序列，它们是以SEQID No：24所示的核苷酸序列为基础获得的，以及与其互补的序列，可被用作有义引物和反义引物。
此外，上面7.中所述的属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶的基因可通过下列过程获得。
含有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶基因的克隆是按照与上面6.中所述基因制备相同的方式，使用适宜的PCR引物制备的。含有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶基因的DNA片段是从所选择的克隆中分离出来的，然后制备其限制性酶切图谱，并测定其序列。这种测序可通过将含有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶基因的DNA片段插入到适宜的克隆载体(例如，pUC载体，如pUC19)中，然后应用Sanger等人的方法(如上所述)进行。
按照上述过程，测定SEQ ID No：28所示、编码来源于Phanerochaete chrysosporium的属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶的核苷酸序列。此外，人们发现从上述核苷酸序列分析估计的氨基酸序列是SEQ ID No.29所示的由592个氨基酸残基组成的氨基酸序列。
属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶基因的DNA片段可通过PCR从含有上述属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶基因的DNA片段获得。作为PCR引物，由大约10-50个核苷酸组成、优选由大约15-30个核苷酸组成的序列，它们是以SEQ ID No：28所示的核苷酸序列为基础获得的，以及与其互补的序列，可被用作有义引物和反义引物。
在本方法的第一步中，存在着编码反义RNA的制备DNA，所述反义RNA与来源于上述担子菌的纤维素分解酶基因转录产物的全部或一部分基本互补。
在本说明书中，术语“反义RNA”是指所含序列与作为上述纤维素分解酶基因转录产物的mRNA的全部或一部分基本互补的核苷酸序列，其中，在它存在于细胞中的情况下，它与和其互补的纤维素分解酶基因的mRNA结合，且它由此抑制纤维素分解酶基因的转录并抑制其表达。
此外，术语“基本上”在这里是指只要反义RNA与mRNA结合形成双链，且它抑制mRNA翻译为蛋白，则所述序列可包含突变，如缺失、取代或添加。
上述序列的长度可适当测定，只要它能够抑制本发明纤维素分解酶基因中任何一个的表达。它无需与纤维素分解基因的整个核苷酸序列的长度相等。例如，当纤维素分解酶基因的表达被抑制时，所述序列优选含有这种核苷酸序列，即它编码属于血红素-结合位点的SEQ IDNOS：2和4中位置80和128上的氨基酸，和与黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)-结合位点相对应的SEQ ID NOS：2和4中位置236和241上的氨基酸。
反义RNA的制备和所述序列的使用是通过本领域技术人员已知的常规方法进行的。更具体而言，纤维素分解酶基因的反义RNA可通过进行PCR从而得到纤维素分解酶基因核苷酸序列的外显子部分而获得，或通过用适宜的限制酶消化纤维素分解酶基因而获得。此外，反义RNA还可从纤维素分解酶基因的cDNA获得。此外，这种反义RNA可以是根据纤维素分解酶基因的核苷酸序列信息人工生产的合成RNA。
在本方法的第二步中，制备了一种载体，它含有(a)编码上面得到的反义RNA的DNA，或(b)含有编码上面得到的反义RNA的DNA的重组DNA和具有启动子活性的DNA片段，其中上述DNA与上述DNA片段连接，这样纤维素分解酶基因的反义RNA就可作为转录的结果而产生。
在本说明书中，表达方式“这样纤维素分解酶基因的反义RNA就可作为转录的结果而产生”用于表示当编码反义RNA的DNA在宿主中启动子的作用下，被转录到mRNA中时，可产生能够结合本发明纤维素分解酶基因的mRNA从而形成双链，并由此抑制纤维素分解酶基因表达的反义RNA。
为了使DNA结合DNA片段从而产生反义RNA，编码反义RNA的DNA可与反义方向(反向)具有启动子序列的DNA片段下游连接，然后通过启动子的作用，它被转录到mRNA中。所得mRNA是纤维素分解酶基因核苷酸序列的反义RNA。
对启动子基因没有特别限制，只要它是具有启动子功能的基因片段，但可使用任何类型的基因作为启动子基因。启动子基因的例子可包括GPD启动子和ras基因启动子。这些启动子基因可以在基因库中登记的序列、在公开出版物中描述的序列等为基础，通过已知的基因组克隆方法或PCR方法获得。否则，关于保藏的基因，还可使用由于供给需要而可获得的那些。
含有启动子序列和纤维素分解酶基因或编码上述基因反义RNA的DNA的基因可经过限制性位点的引入，或粘性末端处理，如果需要，然后使用适宜的DNA连接酶将它们彼此连接起来。作为重组DNA技术，包括克隆、连接反应、PCR等，例如，可使用在J.Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989，和Short Protocols InMolecular Biology，Third Edition，A Compendium of Methods fromCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.中描述的那些。
对载体的类型没有特别限制。它是根据用载体转化的宿主类型而选择的。作为载体，可使用能够在原核生物或真核生物宿主细胞中自主复制或能够在染色体中同源重组的那些。这种载体的例子可包括质粒、病毒包括噬菌体、和粘粒。载体可适当含有选择性标记、复制起点、终止子、多接头、增强子、核糖体-结合位点等。原核生物或真核生物，如细菌、高等真菌、酵母菌、动物、或植物所用的各种载体可商业得到，或这些载体在公开出版物等中描述。使用这些载体，可将编码本发明纤维二糖脱氢酶基因的反义RNA的DNA或重组DNA引入到载体中。
DNA可使用，例如，J.Sambrook等人(如上所述)描述的技术引入。为了将编码本发明纤维二糖脱氢酶基因的反义RNA的DNA或重组DNA引入到载体中，如上所述，它应被引入到载体中，这样本发明纤维二糖脱氢酶基因的反义RNA可作为转录的结果而产生。
在本方法的第三步中，转化是用上述载体进行的，从而制备具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞。
这里可使用任何宿主细胞，只要该细胞在表达编码本发明纤维二糖脱氢酶基因的反义RNA的DNA时发挥启动子活性。这种宿主细胞的例子不仅可包括真菌，如担子菌、真菌、或酵母菌，还可包括其它真核生物(动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、藻类等)和原核生物(细菌、裂殖藻等)。这些之中，优选的宿主细胞是担子菌，更优选毛革盖菌。更具体而言，例如，随后在实施例中描述的营养缺陷型突变株OJI-1078(FERM BP-4210)，其缺少毛革盖菌的鸟氨酸氨基甲酰基转移酶，可被用作宿主。
转化方法的实例可包括氯化钙/PEG法、磷酸钙法、醋酸锂法、电穿孔、原生质体法、原生质球法、脂质转染、和农杆菌法，但不限于此。
在本方法的第四步中，将上述具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞接种在木屑上，由此处理木屑。
在本说明书中，术语“木屑”用于表示通过将木材机械破碎成2-3cm大小所获得的木屑。这里可使用任何类型的木屑，只要它们可从包括针叶树，如松果松、日本柳松、冷杉、云杉、花旗松或辐射松在内的树木，阔叶树如Fagales、桦、桤、枫、桉、杨、刺槐、柳安木或橡树获得，它们可被用作纸浆等的原料。
用具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞处理木屑。如果具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞可在其中充分生长，则木屑可在不经过预处理的情况下直接使用。然而，如果具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞由于预处理而更容易生长，由此杀死其它微生物，那么优选进行这种预处理以使用高压灭菌器或通入蒸汽进行消毒。
使用具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞处理木屑的温度优选10℃-60℃，更优选20℃-30℃。木屑中的水含量设定为20％-80％，优选30％-50％。如果具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞可在没有空气供给的条件下充分生长，则无需向木屑中供给空气。然而，通常可将0.001-1L/(1分钟)的空气供给1L木屑(在下文中，空气供给单位为L/(1分钟))，且优选将0.01vvm-0.1vvm空气供给上述体积的木屑。
接种到木屑中的具有被抑制纤维素分解酶活性的宿主细胞用量可适宜测定，除非它降低了纸浆产率或纸强度。
具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞可用灭菌水降解，然后将它们接种在木屑上并在其中培养。否则，可将培养基加入到木屑中，以便处理它们。其中可使用任何培养基，只要具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞可在其中生长。这种培养基的例子可包括碳源，如葡萄糖、纤维二糖、或无定形纤维素。此外，还可使用氮源，如酵母提取物、胨、各种类型的氨基酸、大豆、玉米浆、或氮化合物，如各种类型的无机氮。此外，如果需要，可适当使用各种类型的盐、维生素、矿物质等。
在用具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞处理木屑的情况下，可在机械纸浆如热机械纸浆(TMP)、磨碎纸浆(GP)、或精制磨碎纸浆(RGP)的生产中观察到精制能量的降低或纸强度的增加，在化学纸浆如牛皮纸浆或亚硫酸盐纸浆的生产中获得蒸煮的提高或纸强度的增加。
此外，本发明方法中使用的具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞还可用于生产纤维素分解酶，其包括在适宜的培养基中培养和所产生的纤维素分解酶的回收。
在这种情况下，当纤维素分解酶以具有信号肽的融合形式被表达或翻译时，它是以分泌物的形式产生的，且可从培养基中直接分离它。相反，当纤维素分解酶以非分泌物的形式产生时，细胞可被分离，然后通过处理，如超声波处理或匀化而被分解，从而获得细胞提取物，且可从提取物中分离纤维素分解酶。酶的分离和纯化可通过使用，如溶剂提取、盐析、脱盐、有机溶剂沉淀、超滤、离子交换、疏水相互反应、HPLC、凝胶过滤和亲和色谱、电泳、或色谱聚焦的单一方法或若干方法的组合来进行。
例如，使GPD启动子，一种ras启动子与本发明纤维素分解酶基因的上游连接，接着通过应用重组DNA技术，产生大量纤维素分解酶。上述启动子，例如，可从含有来源于毛革盖菌的GPD启动子基因的重组大肠杆菌，即大肠杆菌JM109/pCHGP(FERM P-15015)制备，上述启动子还可从含有来源于毛革盖菌的ras启动子基因的重组大肠杆菌，即大肠杆菌DH5α/pCHRAS(FERM P-17352)制备。
本发明方法中所用的由纤维二糖脱氢酶基因编码的蛋白(纤维二糖脱氢酶)具有下列物理化学性质。
(1)作用
纤维二糖脱氢酶的活性是通过在Method in Enzymology中描述的方法测量的(Wood等人，Vol.160，Academic press，INC.Calfornia)。也就是说，将二氯酚靛酚(由Sigma Chemical Company制造)和纤维二糖(由Kanto Kagaku制造)溶解在pH5的50mM醋酸盐缓冲溶液中，两个成分的浓度分别变为0.33mM和0.67mM。之后，将纤维二糖脱氢酶加入到所得缓冲溶液中，接着在37℃下反应。反应开始后，连续测量550nm处的吸光度(光学长度：1cm)，即二氯酚靛酚的最大吸收波长。由此获得图1所示的结果。
如图1所示，二氯酚靛酚的降低是由于纤维二糖脱氢酶的还原反应结果而观察到的。根据当消除反应系统中的纤维二糖或纤维二糖脱氢酶时，没有观察到二氯酚靛酚降低的事实，以及虽然使用细胞色素C或Mn(III)-丙二酸络合物代替二氯酚靛酚，但还是观察到相同的还原反应的事实，显然该酶是纤维二糖脱氢酶。
(2)测量滴度的方法
纤维二糖脱氢酶的活性是如下测量的。通过将250μl 0.67mM二氯酚靛酚(由Sigma Chemical Company制造)、100μl 3.33mM纤维二糖(由Kanto Kagaku制造)、和100μl pH5的250mM醋酸盐缓冲溶液混合而生产溶液，之后向混合溶液中加入50μl试验溶液，接着在37℃下反应。反应开始后，连续测量550nm处的吸光度(光学长度：1cm)(摩尔吸收系数：3965L/mol/cm)，即二氯酚靛酚的最大吸收波长。关于纤维二糖脱氢酶的活性单位，将1个单位定义为在上述条件下，每分钟还原1μmol二氯酚靛酚所需酶的量(单位：U)。
(3)底物特异性
纤维二糖脱氢酶不仅作用于纤维二糖和纤维低聚糖，而且作用于含有纤维素的Avicel和硬木牛皮纸浆。
(4)最佳pH和稳定的pH范围
最佳反应pH和pH稳定性是使用甘氨酸-HCl缓冲溶液(pH2-4)、醋酸盐缓冲溶液(pH4-6)、和磷酸盐缓冲溶液(pH6-8)测量的。酶活性是在上述各pH下测量的。结果在图2中表示。
从图2可以发现，酶反应的最佳pH是pH4-pH6。此外，酶是4℃下在50mM各缓冲溶液中培养24小时，然后测量酶活性。结果在图3中表示。该酶在pH2-pH5之间稳定。
(5)适于发挥作用的温度范围
酶活性是在改变反应温度时测量的。结果在图4中表示。该酶在20℃-40℃的温度范围显示较高活性。此外，将酶在特定温度下的50mM醋酸盐缓冲溶液(pH5)中培养30分钟，然后测量酶活性。结果在图5中表示。
从图5可以发现在40℃下处理30分钟后，该酶可维持大约80％或更高活性，且在50℃下处理30分钟后，它可维持大约30％甚或更高活性。
(6)等电点
等电聚焦是使用由SERVA Electrophoresis GmbH制造的PRECOAT在pH3-pH10下进行的。因此发现等电点为4.2。
(7)分子量
分子量是通过SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳测量的。结果，发现分子量约为91,700。
(8)金属离子或抑制剂的影响
将各种物质，如金属盐或抑制剂加入到酶溶液中，使浓度变为1mM，接着在4℃下过夜培养。之后，将相同类型的金属盐加入到反应溶液中，使浓度变为1mM，然后测量酶活性。结果在表1中表示。从表1可以发现，酶被叠氮化钠和EDTA较弱抑制，被Hg2+和SDS较强抑制。
表1
    金属盐(1mM)     相对活性(％)
    无     100
    FeSO4     0
    ZnSO4     72
    CuSO4     82
    BaCl2     71
    MgCl2     64
    CaCl2     65
    CoCl2     53
    MnCl2     35
    AlCl2     23
    HgCl2     0
    NiCl2     60
    LiCl2     45
    ZnCl2     32
    CuCl2     53
    NaN3     46
    EDTA     45
    SDS     0
而还存在着有关先前已知的纤维二糖脱氢酶的下列报道。
Henriksson等人已经报道了来源于Phanerochaetechrysosporium的纤维二糖脱氢酶具有5.0的最佳反应pH、约4.2的等电点、和89,000的分子量(Eur.J.Biochem.，196(1991)101-106)。然而，该纤维二糖脱氢酶的最佳反应温度是50℃。
Roy等人已经报道了来源于Trametes versicolor的纤维二糖脱氢酶具有5.0的最佳反应pH、约4.2的等电点、和97,000的分子量(Appl.Environ.Microbiol.，62(1996)4417-4427)。然而，该纤维二糖脱氢酶的最佳反应温度是50℃。
Fang等人已经报道过来源于群交裂褶菌的纤维二糖脱氢酶(Arch.Biochem.Biophys.，353-1(1998)37-46)。然而，该纤维二糖脱氢酶的最佳反应pH是4.5，其分子量是102,000。他们既没有描述它的最佳温度也没有描述它的等电点。
Schmidhalter、Canevascini等人已经报道过来源于单纯粉孢革菌的纤维二糖脱氢酶，其具有约3.9的等电点(Arch.Biochem.Biophys.，300-2(1993)559-563)。然而，该纤维二糖脱氢酶的最佳反应pH是4.0，其分子量是111,000。他们没有描述最佳反应温度。
Canevascini等人已经报道过来源于Myceliophtorethermophila的纤维二糖脱氢酶，其具有约4.1的等电点和91,000的分子量(Eur.J.Biochem.，198(1991)43-52)。然而该纤维二糖脱氢酶的最佳反应pH是7.0，其反应最佳温度没有描述。
Shou等人已经报道过来源于Humicola insolens的纤维二糖脱氢酶，其具有约4.0的等电点和92,000的分子量(Biochem.J.，330(1991)565-571)。该纤维二糖脱氢酶的最佳反应pH是7.0，其反应最佳温度是65℃。
如上所述，由本发明方法中所用的纤维二糖脱氢酶基因编码的纤维二糖脱氢酶在最佳温度、最佳pH、分子量、和等电点方面不同于已知的纤维二糖脱氢酶。因此，认为这种纤维二糖脱氢酶是一种新的纤维二糖脱氢酶。已知的纤维二糖脱氢酶的物理化学性质在表2中表示。
表2
  分子量(kD)    等电点   最佳pH   最佳温度(℃)
  PhanerochaeiechrysosporiumTrametes versicolor群交裂褶菌单纯粉孢革菌MyceliophtorethermophilaHumicola insolens     89971021119192     4.24.2没有描述3.94.14.0     5.05.04.54.07.07.0     5050没有描述没有描述没有描述65   Eur.J.Biochem.，196(1991)101-106Appl.Environ Microbiol.，62(1996)4417-4427Arch.Biochem.Biophys.，353-1(1998)37-46Arch.Biochem.Biophys.，300-2(1993)559-563Eur.J.Biochem.，198(1991)43-52Biochem.J.，330(1991)565-571
对具有产生纤维二糖脱氢酶能力的毛革盖菌没有特别限制。例如，可使用毛革盖菌IFO4917株。
来源于毛革盖菌的纤维二糖脱氢酶可通过，例如，在培养基中培养可产生纤维二糖脱氢酶的毛革盖菌，并收集所得培养物中的纤维二糖脱氢酶而获得。具有任何组成的培养基都可被用作上述培养毛革盖菌的培养基，只要上述真菌可在其中增殖。作为培养基的营养物，可广泛使用通常在毛革盖菌培养中所用的那些。其中可使用任何碳源，只要它可被吸收。葡萄糖、纸浆、微晶纤维素等可被用作这种碳源。其中可使用任何可得到的氮化合物作为氮源。例如，酵母提取物、胨、各种类型的氨基酸、大豆、玉米浆、各种类型的无机氮都可被用作这种氮源。此外如果需要，可适当使用各种类型的盐、维生素、矿物质等。
培养的温度和pH可在毛革盖菌能够增殖的范围内适当确定。例如，培养温度是20℃-55℃，更优选25℃-30℃，pH是3-9，优选4-6。
来源于毛革盖菌的纤维二糖脱氢酶是由于在上述条件下培养毛革盖菌，而作为分泌产物在培养液中产生的。因此，该酶是从由于培养得到的培养产物中收集的。从培养产物收集的溶液可直接用作纤维二糖脱氢酶粗酶溶液。然而，还可通过盐析、超滤、或冷冻干燥而浓缩或合并纤维二糖脱氢酶。此外，纤维二糖脱氢酶可通过硫酸铵分离、凝胶过滤的分子量分离、各种类型的离子交换树脂、羟磷灰石、疏水色谱、等电分离等而被纯化。这些方法可重复进行，且此外如果需要，该方法可与其它纯化方法结合使用。
实施例
本发明将在下列实施例中更详细地描述。然而，这些实施例不是对本发明范围的限制。
[实施例1]来源于毛革盖菌的染色体DNA文库的制备
在琼脂平板培养基中培养毛革盖菌IFO4917株，并使用软木塞钻孔器从培养物中切下一直径5mm的琼脂片。然后将它接种到200ml的葡萄糖-胨培养基中(其含有2％葡萄糖、0.5％聚胨、0.2％酵母提取物、KH2PO4、和0.05％MgSO4，然后用磷酸调节至pH4.5)，接着在28℃下旋转摇动7天。培养完成后，收集细胞体，然后用1L灭菌水洗涤。之后，用液氮将细胞体冷冻。
将5g冷冻的细胞体在研钵中压碎。将压碎的细胞体转移到离心试管中，然后向其中加入10ml溶解缓冲溶液(100mM Tris(pH8)、100mMEDTA、100mM NaCl、和蛋白酶K，这样变为100μg/ml)，接着在55℃下培养3小时。培养完成后，进行苯酚处理和氯仿处理。向水相中逐渐加入乙醇。当DNA沉积时，采集染色体DNA，然后将其混悬在TE溶液中。
用限制酶Sau3AI部分分解100μg所得染色体DNA，然后通过5％-20％蔗糖密度梯度超速离心(30,000rpm，18小时)分离，从而收集具有20-40kbp大小的断裂部分。使用T4 DNA连接酶将该断裂部分与Toyobo Co.，Ltd.制造的噬菌体λEMBL3-Bam臂连接。所得噬菌体DNA用STRATAGENE制造的Gigapack Gold包装。之后，用所得产物感染大肠杆菌P2329，从而得到染色体DNA文库。
[实施例2]从染色体DNA文库分离纤维二糖脱氢酶基因
含有纤维二糖脱氢酶基因的克隆是通过噬斑杂交从上述染色体DNA文库中选择的。按照常规方法进行一系列操作(Sambrook等人，Molecular Cloning A Laboratory Manua1/2nd Edition(1989))。噬斑杂交所用探针是通过使用由Amersham制造的寡DNA标记试剂盒，用荧光素标记具有下列序列的合成寡聚物的3’-末端而获得的。
5’-TA(T/C)GA(A/G)AA(T/C)AA(A/G)ATT(T/C/A)TT(T/C/A/G)-3’(SEQ ID No.5)
结果，4个阳性克隆可从大约40,000个噬斑中选择。重组噬菌体DNA是通过常规方法从所述阳性克隆制备的，然后用各种类型的限制酶消化它，接着使用上述合成DNA进行DNA杂交。结果，在通过用限制酶XhoI消化获得的片段中，观察到与探针杂交的两个不同克隆，它们是5.3kbp和7.2kbp大小的DNA带。
通过琼脂糖凝胶电泳切下上述具有7.2kbp和5.3kbp大小的DNA片段，然后将它们亚克隆到大肠杆菌载体pBluescriptII SK+的XhoI位点中。之后，用载体转化大肠杆菌JM109株。大量制备亚克隆的DNA，然后通过超速离心(50,000rpm，16小时，15℃)纯化，接着测序。核苷酸序列是使用由United States Biochemical制造的测序试剂盒测定的。
核苷酸序列在SEQ ID NOS：1和3中表示。人们发现来源于毛革盖菌的纤维二糖脱氢酶基因在上述核苷酸序列的范围内被15个内含子断开。此外，证实了从所述核苷酸序列估计的氨基酸序列(SEQ ID NOS：2和4)与迄今为止已经报道过的纤维二糖脱氢酶基因的那些高度相似。
[实施例3]从染色体DNA文库分离纤维二糖水解酶I-1基因
噬斑杂交是按照与实施例2相同的方式进行的。其中所用探针是通过使用由Amersham制造的寡DNA标记试剂盒，用荧光素标记具有下列序列的合成寡聚物的3’-末端而获得的，其中所述序列是以从其它生物中分离出来的纤维二糖水解酶I基因的核苷酸序列为基础制备的。
5’-GA(T/C)ATCAAGTT(T/C)ATC(A/G)ATGG-3’(SEQ ID No.6)
结果，2个阳性克隆可从大约40,000个噬斑中选择。重组噬菌体DNA是通过常规方法从所述阳性克隆制备的，然后用各种类型的限制酶消化它，接着使用上述合成DNA进行DNA杂交。结果，在通过用限制酶PstI和NheI消化获得的片段中，观察到与探针杂交的克隆，它是3.9kbp的单一DNA带。
通过琼脂糖凝胶电泳切下上述3.9-kbp的DNA片段，然后将它亚克隆到大肠杆菌载体pBluescriptsII SK-的PstI-SpeI位点中。之后，用载体转化大肠杆菌JM109株，从而得到含有来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I-1基因的质粒pCHCBHI26。测定亚克隆的DNA片段的核苷酸序列。
所述核苷酸序列在SEQ IN No.7中表示。人们发现来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I-1基因在上述核苷酸序列的范围内被2个内含子断开。此外，从所述核苷酸序列估计的氨基酸序列在SEQ ID No.8中表示。
[实施例4]从染色体DNA文库分离纤维二糖水解酶I-2基因
噬斑杂交是按照与实施例2相同的方式进行的。其中所用探针是通过使用由Amersham制造的寡DNA标记试剂盒，用荧光素标记具有实施例3中所用、SEQ ID No.6所示核苷酸序列的合成寡聚物的3’末端而获得的。
结果，3个阳性克隆可从大约40,000个噬斑中选择。重组噬菌体DNA是通过常规方法从所述阳性克隆制备的，然后用各种类型的限制酶消化它，接着使用上述合成DNA进行DNA杂交。结果，在通过用限制酶SalI消化获得的片段中，观察到与探针杂交的克隆，它是4.2-kbp的单一DNA带。
通过琼脂糖凝胶电泳切下上述4.2-kbp的DNA片段，然后将它亚克隆到大肠杆菌载体pUC19的SalI位点中。之后，用载体转化大肠杆菌JM109株，从而得到含有来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I-2基因的质粒pCHCBHI27。测定亚克隆的DNA片段的核苷酸序列。
所述核苷酸序列在SEQ IN No.9中表示。人们发现来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I-2基因在上述核苷酸序列的范围内被2个内含子断开。此外，从所述核苷酸序列估计的氨基酸序列在SEQ ID No.10中表示。
[实施例5]从染色体DNA文库分离纤维二糖水解酶I-3基因
噬斑杂交是按照与实施例2相同的方式进行的。其中所用探针是通过使用由Amersham制造的寡DNA标记试剂盒，用荧光素标记具有实施例3中所用、SEQ ID No.6所示核苷酸序列的合成寡聚物的3’末端而获得的。
结果，2个阳性克隆可从大约40,000个噬斑中选择。重组噬菌体DNA是通过常规方法从所述阳性克隆制备的，然后用各种类型的限制酶消化它，接着使用上述合成DNA进行DNA杂交。结果，在通过用限制酶EcoRI和BamHI消化获得的片段中，观察到与探针杂交的克隆，它是4.6-kbp的单一DNA带。
通过琼脂糖凝胶电泳切下上述4.6-kbp的DNA片段，然后将它亚克隆到大肠杆菌载体pUC19的EcoRI-BamHI位点中。之后，用载体转化大肠杆菌JM109株，从而得到含有来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I-3基因的质粒pCHCBHI31。测定亚克隆的DNA片段的核苷酸序列。
所述核苷酸序列在SEQ IN No.11中表示。人们发现来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I-3基因在上述核苷酸序列的范围内被2个内含子断开。此外，从所述核苷酸序列估计的氨基酸序列在SEQ ID No.12中表示。
[实施例6]从染色体DNA文库分离纤维二糖水解酶II基因
噬斑杂交是按照与实施例2相同的方式进行的。其中所用探针是通过使用由Amersham制造的寡DNA标记试剂盒，用荧光素标记具有下列序列的合成寡聚物的3’末端而获得的，其中所述序列是以从其它生物中分离出来的纤维二糖水解酶II基因的核苷酸序列为基础制备的。
5’-CAGTGGGGOGACTGGTGCAAC-3’(SEQ ID No.13)
结果，8个阳性克隆可从大约100,000个噬斑中选择。重组噬菌体DNA是通过常规方法从阳性克隆制备的，然后用各种类型的限制酶消化它，接着使用上述合成DNA进行DNA杂交。结果，在通过用限制酶EcoRI和NcoI消化获得的片段中，观察到与探针杂交的克隆，它是5.0kbp的单一DNA带。
为了回收上述DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳切下5.0-kbp的DNA片段，该DNA片段是通过用限制酶NcoI消化，用克列诺夫片段使其平滑，并进一步用EcoRV消化而获得的。然后将它亚克隆到大肠杆菌载体pUC19的SamI位点中，从而得到含有来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶II基因的质粒pCHCBHII。之后，用该质粒转化大肠杆菌JM109株。测定亚克隆的DNA片段的核苷酸序列。
所述核苷酸序列在SEQ IN No.14中表示。人们发现来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶II基因在上述核苷酸序列的范围内被6个内含子断开。此外，从所述核苷酸序列估计的氨基酸序列在SEQ ID No.15中表示。
[实施例7]毛革盖菌cDNA文库的制备
将6g干重的蓝桉木屑放在具有9.5cm直径的玻璃量器中，然后在121℃下灭菌15分钟。培养基是通过将20ml胨培养基(其含有1.0％聚胨、0.2％酵母提取物、KH2PO4、和0.05％MgSO4，然后用磷酸调节至pH4.5)加入到如此处理的木屑中制备的。之后，使用软木塞钻孔器，从毛革盖菌IFO4917株的琼脂平板培养物中切下每个均为5mm直径的琼脂片，然后将所得的3个琼脂片接种在上述获得的培养基中，接着在30℃下静止培养10天。培养完成后，收集细胞体，然后用液氮冷冻。
之后，通过胍-盐酸法收集冷冻细胞体中的总RNA。随后，使用由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造的Oligotex-dT<super>mRNA纯化试剂盒制备多(A)+RNA。之后，使用由STRATAGENE制造的cDNA合成试剂盒合成cDNA，并使EcoRI位点与其5’侧连接，使XhoI位点与其3’侧连接。然后将它插入到λZAPII载体的EcoRI-XhoI位点中，并使用体外包装试剂盒生产cDNA文库。
[实施例8]从毛革盖菌cDNA文库中分离属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶基因
将实施例7中生产的cDNA文库溶液适当稀释至可在量器上分离噬斑，然后用该溶液感染大肠杆菌XL1 Blue MRF’株，接着在37℃下过夜培养，从而形成噬斑。将上述获得的单一噬斑混悬在SM缓冲液中。使用通用测序引物，M13(-20)引物(GTAAAACGACGGCCAGT，SEQ IDNo.16)和M13反向引物(GGAAACAGCTATGACCATG，SEQ ID No.17)进行PCR反应以扩增cDNA片段。随机分析由此获得的cDNA片段的核苷酸序列。结果，发现了编码属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶的cDNA基因。所述核苷酸序列在SEQ ID No.18中表示，从其估计的氨基酸序列在SEQ ID No.19中表示。
[实施例9]从毛革盖菌cDNA文库中分离属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶基因
将实施例7中生产的cDNA文库溶液适当稀释至可在量器上分离噬斑，然后用该溶液感染大肠杆菌XL1 Blue MRF’株，接着在37℃下过夜培养，从而形成噬斑。将上述获得的单一噬斑混悬在SM缓冲液中。使用通用测序引物，M13(-20)引物(GTAAAACGACGGCCAGT，SEQ IDNo.16)和M13反向引物(GGAAACAGCTATGACCATG，SEQ ID No.17)进行PCR反应以扩增cDNA片段。随机分析由此获得的cDNA片段的核苷酸序列。结果，发现了编码属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶的cDNA基因。所述核苷酸序列在SEQ ID No.20中表示，从其估计的氨基酸序列在SEQ ID No.21中表示。
[实施例10]从担子菌Phanerochaete chrysosporium的染色体DNA中分离属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶基因
使用软木塞钻孔器，从Phanerochaete chrysosporium ATCC34541株的琼脂平板培养物中切下每个具有5mm直径的琼脂片，并将这5片接种到100ml葡萄糖-胨培养基(其含有2％葡萄糖、0.5％聚胨、0.2％酵母提取物、KH2PO4、和0.05％MgSO4，然后用磷酸调节至pH4.5)中，接着在30℃下摇动培养5天。培养完成后，收集细胞体，然后用液氮冷冻。将5g冷冻的细胞体在研钵中压碎。将压碎的细胞体转移到离心试管中，然后向其中加入10ml溶解缓冲溶液(100mMTris(pH8)、100mM EDTA、100mM NaCl、和蛋白酶K，这样它变为100μg/ml)，接着在55℃下培养3小时。培养完成后，进行苯酚处理和氯仿处理。向水相中逐渐加入乙醇。当DNA沉积时，采集染色体DNA，然后将其混悬在TE溶液中，从而产生Phanerochaete chrysosporium的染色体DNA溶液。
使用下述两个DNA引物，在上述Phanerochaete chrysosporium的染色体DNA溶液上进行PCR反应，从而获得属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶的染色体基因。
5’-ATGAAGTTACTTCTTGCTCTC-3’        (SEQ ID No.22)
5’-TCACAGGAAGGGTTCGAGTGC-3’        (SEQ ID No.23)
所得核苷酸序列在SEQ ID No.24中表示。人们发现来源于Phanerochaete chrysosporium的属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶基因在上述核苷酸序列的范围内被15个内含子断开。此外，从所述核苷酸序列估计的氨基酸序列在SEQ ID No.25中表示。
[实施例10]从担子菌Phanerochaete chrysosporium的染色体DNA中分离属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶基因
使用下述两个DNA引物，在实施例10中制备的Phanerochaetechrysosporium的染色体DNA溶液上进行PCR反应，从而获得属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶基因。
5’-ATGATACCTCTCCGCTCTGC-3’         (SEQ ID No.26)
5’-TATCTTCCTGATGCGATTCC-3’         (SEQ ID No.27)
所得核苷酸序列在SEQ ID No.28中表示。人们发现来源于Phanerochaete chrysosporium的属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶基因在上述核苷酸序列的范围内被7个内含子断开。此外，从所述核苷酸序列估计的氨基酸序列在SEQ ID No.29中表示。
[实施例12]使用毛革盖菌来源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子构造毛革盖菌来源的纤维二糖脱氢酶基因的表达载体
将纤维二糖脱氢酶基因的结构基因区与毛革盖菌启动子的下游连接起来，由此用甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子区取代原始的纤维二糖脱氢酶基因，从而获得纤维二糖脱氢酶基因的表达载体。
更具体而言，用EcoRI和BamHI消化甘油醛-3-磷酸脱氢酶的染色体基因，获得一个3.8-kbp的DNA片段(片段1)。使用T4 DNA连接酶将片段1与噬菌体载体M13mp18的EcoRI-BamHI位点连接起来。用其转化大肠杆菌JM109株，从而制备单链噬菌体DNA。
随后，合成SEQ ID No.30中所示的DNA引物，并将它退火成上述单链噬菌体DNA。然后，通过引物延伸法仅合成GPD基因的启动子区，并用限制酶EcoRI(由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)消化它，从而制备一个0.9-kbp的DNA片段(片段2)。
5’-CATGGTGTGTGGTGGATG-3’          (SEQ ID No.30)
另一方面，为了仅提取编码纤维二糖脱氢酶的成熟酶的基因区，使用质粒pCHCDH1作为模板，用SEQ ID NOS：31和32所示用于延长的引物进行PCR反应，从而获得具有约3.5kbp大小的DNA片段(片段3)。
5’-AAGTTCAAGAGTCTCCTGT-3’         (SEQ ID No.31)
5’-GGTACAGTACTTATCTGTAT-3’        (SEQ ID No.32)
用限制酶EcoRI和SmaI(Takara Shuzo Co.，Ltd.)消化大肠杆菌载体pUC18，将上述两种类型的DNA片段混合，并使用T4 DNA连接酶将它们彼此连接起来。之后用其转化大肠杆菌JM109株。将其中已经同时插入上述两种类型的DNA片段—片段2和3的质粒从氨苄西林-抗性转化株中分离出来。该质粒被称为pGPCDH1。
[实施例13]构造具有纤维二糖脱氢酶基因的反义序列的质粒
按照与实施例12相同的方法获得一个0.9-kb的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子区片段2。使用T4 DNA连接酶将所得片段2与pUC18的EcoRI-SmaI位点连接起来，用其转化大肠杆菌JM109株。将其中已经插入上述片段2的质粒从氨苄西林-抗性转化株中分离出来。该质粒被称作pCHGP1。用限制酶NcoI-XbaI消化质粒pCHGP1，从而制备载体部分(片段4)。
此外，使用下述两个引物(SEQ ID NOS：33和34)，在含有来源于毛革盖菌的纤维二糖脱氢酶1基因的质粒pCHCDH1上进行PCR反应，从而扩增一个大约650-bp的DNA片段，该DNA片段含有来源于毛革盖菌的纤维二糖脱氢酶基因的第8个外显子。之后，用限制酶XbaI和NcoI消化扩增产物，得到DNA片段(片段5)。
5’-TCTAGATTTACTGGTACCCCAACAACAATG-3’    (SEQ ID No.33)
5’-CCATGGGTTGATCGACGGGTTGTCAGACACG-3’   (SEQ ID No.34)
将上述片段4与上述片段5混合，然后用T4 DNA连接酶将它们彼此连接起来。之后，用其转化大肠杆菌JM109株。将其中已经插入上述片段5的质粒从氨苄西林-抗性转化株中分离出来。该质粒被称为pGPantiCDH1。用限制酶XbaI和HindIII消化质粒pGPantiCDH1，从而制备载体部分(片段6)。
随后，使用下述两个引物(SEQ ID NOS：35和36)，在含有来源于毛革盖菌的锰过氧化物酶基因的质粒pBSMPOG1(FERM P-14933)上进行PCR反应，从而扩增锰过氧化物酶的C-末端非翻译区。用限制酶XbaI和HindIII消化扩增产物，得到大约1-kb的DNA片段(片段7)。
5’-TCTAGAGTCACCTCCGT-3’               (SEQ ID No.35)
5-AAGCTTGGGTACTGTG-3’                  (SEQ ID No.36)
将上述片段6与上述片段7混合，然后用T4 DNA连接酶将它们彼此连接起来。将其中已经正向插入上述DNA片段7的质粒从氨苄西林-抗性转化株中分离出来。该质粒被称为pGPCDHAM。
[实施例14]构造具有来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I基因的反义序列的质粒
用限制酶NcoI和XbaI消化实施例13中得到的质粒pGPCDHAM，从而制备载体部分的DNA片段(片段8)。随后，使用下述两个引物，在实施例3中得到的质粒pCHCBHI26上进行PCR反应，其含有来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I基因，从而扩增一个大约750-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化扩增产物，得到DNA片段(片段9)。
5’-TCTAGAGCCAACCTCGAGGGGTGG-3’         (SEQ ID No.37)
5’-CCATGGGAACGTCGAGCCGATGGG-3’         (SEQ ID No.38)
将上述片段8与上述片段9混合，使用T4 DNA连接酶将它们彼此连接起来。之后，用其转化大肠杆菌JM109株。将其中已经插入上述DNA片段9的质粒从氨苄西林-抗性转化株中分离出来。该质粒被称作pGPCBHI26AM。
[实施例15]构造具有来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I基因的反义序列的质粒
用限制酶NcoI和XbaI消化实施例13中得到的质粒pGPCDHAM，从而制备载体部分的DNA片段(片段8)。随后，使用下述两个引物，在实施例4中得到的质粒pCHCBHI27上进行PCR反应，其含有来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I基因，从而扩增一个大约750-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化扩增产物，得到DNA片段(片段10)。
5’-TCTAGAGCCAACGTCCTCGGCTGG-3’        (SEQ ID No.39)
5’-CCATGGGTAGGTCGAGCCGATGGG-3’        (SEQ ID No.40)
将上述片段8与上述片段10混合，使用T4 DNA连接酶将它们彼此连接起来。之后，用其转化大肠杆菌JM109株。将其中已经插入上述DNA片段10的质粒从氨苄西林-抗性转化株中分离出来。该质粒被称作pGPCBHI27AM。
[实施例16]构造具有来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I基因的反义序列的质粒
用限制酶NcoI和XbaI消化实施例13中得到的质粒pGPCDHAM，从而制备载体部分的DNA片段(片段8)。随后，使用下述两个引物，在实施例5中得到的质粒pCHCBHI31上进行PCR反应，其含有来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I基因，从而扩增一个大约750-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化扩增产物，得到DNA片段(片段11)。
5’-TCTAGAGCCAACGTCCTCGGCTGG-3’        (SEQ ID No.41)
5’-CCATGGAGCGTAGGTCGAGCCAATG-3’       (SEQ ID No.42)
将上述片段8与上述片段11混合，使用T4 DNA连接酶将它们彼此连接起来。之后，用其转化大肠杆菌JM109株。将其中已经插入上述DNA片段11的质粒从氨苄西林-抗性转化株中分离出来。该质粒被称作pGPCBHI31AM。
[实施例17]构造具有源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶II基因的反义序列的质粒
用限制酶NcoI和XbaI消化实施例13中得到的质粒pGPCDHAM，从而制备载体部分的DNA片段(片段8)。随后，使用下述两个引物，在实施例6中得到的质粒pCHCBHII上进行PCR反应，其含有来源于毛革盖菌的纤维二糖水解酶I基因，从而扩增一个大约600-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化扩增产物，得到DNA片段(片段12)。
5’-TCTAGAATCTACCTGAGCCCTTAC-3’        (SEQ ID No.43)
5’-CCATGGCTCACTAGTGGCGAGACC-3’        (SEQ ID No.44)
将上述片段8与上述片段12混合，使用T4 DNA连接酶将它们彼此连接起来。之后，用其转化大肠杆菌JM109株。将其中已经插入上述DNA片段12的质粒从氨苄西林-抗性转化株中分离出来。该质粒被称作pGPCBHIIAM。
[实施例18]构造具有来源于毛革盖菌的属于家族61的内切葡聚糖酶基因的反义序列的质粒
用限制酶NcoI和XbaI消化实施例13中得到的质粒pGPCDHAM，从而制备载体部分的DNA片段(片段8)。随后，使用下述两个引物，在实施例12中得到的来源于毛革盖菌的属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶cDNA基因上进行PCR反应，从而扩增一个大约600-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化扩增产物，得到DNA片段(片段13)。
5’-TCTAGAGCTCACGGTTTCATTCATG-3’       (SEQ ID No.45)
5’-CCATGGGGTGTAGAGCCCCGGAATG-3’       (SEQ ID No.46)
将上述片段8与上述片段13混合，使用T4 DNA连接酶将它们彼此连接起来。之后，用其转化大肠杆菌JM109株。将其中已经插入上述DNA片段13的质粒从氨苄西林-抗性转化株中分离出来。该质粒被称作pGPEG61AM。
[实施例19]构造具有来源于毛革盖菌的属于家族12的内切葡聚糖酶基因的反义序列的质粒
用限制酶NcoI和XbaI消化实施例13中得到的质粒pGPCDHAM，从而制备载体部分的DNA片段(片段8)。随后，使用下述两个引物，在实施例9中得到的来源于毛革盖菌的属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶cDNA基因上进行PCR反应，从而扩增一个大约700-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化扩增产物，得到DNA片段(片段13)。
5’-TCTAGAGCGGGCCCGTACTCGCTC-3’       (SEQ ID No.47)
5’-CCATGGGTAATGTGATTCCTGTCG-3’       (SEQ ID No.48)
将上述片段8与上述片段13混合，使用T4 DNA连接酶将它们彼此连接起来。之后，用其转化大肠杆菌JM109株。将其中已经插入上述DNA片段13的质粒从氨苄西林-抗性转化株中分离出来。该质粒被称作pGPEG12AM。
[实施例20]构造具有来源于Phanerochaete chrysosporium的属于家族5的内切葡聚糖酶基因的反义序列的质粒
用限制酶NcoI和XbaI消化实施例13中得到的质粒pGPCDHAM，从而制备载体部分的DNA片段(片段8)。随后，使用下述两个引物，在实施例10中得到的来源于Phanerochaete chrysosporium的属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶基因上进行PCR反应，从而扩增一个大约600-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化扩增产物，得到DNA片段(片段15)。
5’-TCTAGAATGAAGTACTTCTTGCTC-3’        (SEQ ID No.49)
5’-CCATGGCGTTTGGCGTACCGTCTG-3’        (SEQ ID No.50)
将上述片段8与上述片段15混合，使用T4 DNA连接酶将它们彼此连接起来。之后，用其转化大肠杆菌JM109株。将其中已经插入上述DNA片段14的质粒从氨苄西林-抗性转化株中分离出来。该质粒被称作pGPPCEG5AM。
[实施例21]构造具有来源于Phanerochaete chrysosporium的属于家族5的内切葡聚糖酶基因的反义序列的质粒
用限制酶NcoI和XbaI消化实施例13中得到的质粒pGPCDHAM，从而制备载体部分的DNA片段(片段8)。随后，使用下述两个引物，在实施例11中得到的来源于Phanerochaete chrysosporium的属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶基因上进行PCR反应，从而扩增一个大约500-bp的DNA片段。之后，用限制酶NcoI和XbaI消化扩增产物，得到DNA片段(片段16)。
5’-TCTAGACCCCGGTACAGACGCCGC-3’         (SEQ ID No.51)
5’-CCATGGGATGTTAGGAATGATCTG-3’         (SEQ ID No.52)
将上述片段8与上述片段16混合，使用T4 DNA连接酶将它们彼此连接起来。之后，用其转化大肠杆菌JM109株。将其中已经插入上述DNA片段15的质粒从氨苄西林-抗性转化株中分离出来。该质粒被称作pGPPCEG9AM。
[实施例22]转化毛革盖菌的方法
a.单核菌株的培养
将大约30个、每个具有约6mm直径的玻璃珠放在500ml-体积的Erlenmeyer烧瓶中。将100ml SMY培养基(1％蔗糖、1％麦芽汁、和0.4％酵母提取物)分配到上述烧瓶中，然后灭菌。之后，使用软木塞钻孔器从含有毛革盖菌OJI-1078株的琼脂平板培养基上切下一个具有5mm直径的琼脂片。然后将该琼脂片接种在上述SMY培养基中，接着在28℃下静止培养7天(预培养)。然而，为了使菌丝断裂，每天摇动烧瓶1次或2次进行混合。随后，将200ml SMY培养基分配到1L-体积的Erlenmeyer烧瓶中，再向其中加入旋转器，接着灭菌。之后，通过用尼龙筛(具有30μm孔径)过滤收集预培养的菌丝，并将菌丝的总量接种在培养基中，接着在28℃下培养。培养时，每天用搅拌器搅拌培养基2小时，从而使菌丝断裂。该培养进行4天。
b.原生质体的制备
通过用尼龙筛(具有30μm孔径)过滤收集上述液体培养菌丝，然后用渗透调节溶液(0.5M MgSO4、50ml马来酸盐缓冲液(pH5.6))洗涤所收集的菌丝。随后，将100mg湿细胞体混悬在1ml细胞壁-消化酶溶液中。轻轻摇动该混合物的同时，在28℃下培养3小时，并释放出原生质体。作为细胞壁-消化酶溶液，可结合使用下列可商业得到的酶制剂。也就是说，将5mg Cellulase ONOZUKA(由Yakult制造的纤维素酶ONOZUKA RS)和10mg Yatalase(由Takara Shuzo Co.，Ltd.制造)溶于1mg上述渗透调节溶液中，并将所得溶液用作酶溶液。
c.原生质体的纯化
使用尼龙筛(具有30μm孔径)除去上述酶反应溶液中的菌丝片段。之后，为了提高原生质体的回收率，用上述渗透调节溶液洗涤尼龙筛上存留的菌丝片段和原生质体1次。将所得原生质体混悬液离心(1,000kxg，5分钟)除去上清液。将残留物混悬在4ml 1M蔗糖(20mM MOPS缓冲溶液，pH6.3)中。将所得混悬液再次离心，用上述1M蔗糖溶液洗涤所得产物2次。将沉淀物混悬在500μl含有40mM氯化钙的1M山梨糖醇溶液(20mM MES，pH6.4)中，并将所得混悬液用作原生质体溶液。将该溶液在4℃下保存。
使用血细胞计数器，通过用窥器直接观察来测定原生质体浓度。所有离心操作都是在室温下，使用摇摆式转子以1,000xg进行5分钟。
d.转化
将实施例12中得到的质粒pGPCDH1(2μg)加入到100μl浓度为106个细胞/100μl的原生质体溶液中。此外，作为选择性标记，将0.2μg含有来源于毛革盖菌的鸟氨酸氨基甲酰基转移酶的质粒pUCR1(日本专利公开号(Kokai)第6-054691A(1994)；FERM BP-4201)加入到上述混合溶液中，接着在冰上冷却30分钟。随后，以和液体量相等的量向其中加入PEG溶液(50％PEG3400、20mM MOPS(pH6.4))，接着在冰上冷却30分钟。之后，将所得溶液混合到含有0.5M蔗糖和亮氨酸的基本琼脂培养基(1％琼脂)中，并将混合物分散在平板上。将上述平板在28℃下培养几天，从而得到转化体。然后，从该转化体制备DNA，通过DNA杂交证实其中掺入了目标纤维二糖脱氢酶基因的表达质粒pGPCDH1。
[实施例23]
将实施例22获得的转化体接种在300ml-体积、含有100ml葡萄糖-胨培养基(其含有30g/l葡萄糖、10g/l聚胨、1.5g/l KH2PO4、0.5g/lMgSO4、和2mg/l盐酸硫胺，并用磷酸调节至pH4.5)的Erlenmeyer烧瓶中，接着在28℃下以100rpm摇动培养。使用上述纤维二糖脱氢酶活性测量法，随时测量纤维二糖脱氢酶的活性。对照中的纤维二糖脱氢酶活性是0.02U/ml，但转化体中是0.2U/ml。
[实施例24]具有被抑制的纤维二糖脱氢酶活性的转化体的选择
转化是按照上面实施例22中的转化方法所述，使用实施例13中生产的质粒pGPCDHAM代替质粒pGPCHD1进行的。将所得转化体接种到300ml-体积、含有100ml硬木氧-漂白的牛皮纸浆(LOKP)-胨培养基(其含有1％LOKP、0.5％聚胨、0.2％酵母提取物、0.15％KH2PO4、和0.05％MgSO4，并用磷酸调节至pH4.5)的Erlenmeyer烧瓶中，接着在28℃下，以100rpm摇动培养。使用上述纤维二糖脱氢酶活性测量法，随时测量纤维二糖脱氢酶活性。结果，人们发现可获得具有最大70％被抑制的纤维二糖脱氢酶活性的转化体。
[实施例25]用具有被抑制的纤维二糖脱氢酶的转化体处理木屑
将在实施例24中选择的具有被抑制的纤维二糖脱氢酶活性的转化体在28℃下，在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中培养，然后将培养物在4℃下保存。使用软木塞钻孔器从平板中切下每个均具有5mm直径的5个切片。然后将这5片接种在300ml-体积、含有100ml葡萄糖-胨培养基(其含有2％葡萄糖、0.5％聚胨、0.2％酵母提取物、KH2PO4、和0.05％MgSO4，并用磷酸调节至pH4.5)的Erlenmeyer烧瓶中，接着在28℃下，以100rpm摇动培养1周。培养完成后，过滤细胞体，并用灭菌水洗涤留存在细胞体中的培养基。将细胞体与灭菌水混合，然后用Waring搅拌器将它们压碎15秒。之后，将细胞体接种在1kg干重的桉木中，使细胞体的干重变为10mg。接种后，充分搅拌混合物，使细胞体均匀分散。作为培养，在换气条件下，在28℃下静止培养1周。每当需要时，充入饱和的水蒸气，使木屑中的水分含量变为40％-65％。进行换气时，排出空气的量被设定为0.01vvm/木屑。
[实施例26]使用具有被抑制的纤维二糖脱氢酶活性的转化体生产机械纸浆
木屑是从辐射松木制备的，并按照与实施例25相同的方式处理木屑。使用实验室精制机(由Kumagai Riki KOGYO)搅打处理过的木屑，并将加拿大标准打浆度设定为200ml。之后，按照Tappi试验方法T205om-81制备进行纸浆物理试验所用的手工片，按照Tappi试验T220om-83进行手工纸浆片的物理试验。其中所用电能是用瓦特计(3133型Hiokidenki)和集成计数器(3141型)测量的。木屑产率可通过将含水的1kg干重的木屑放在容器中，测量处理之前和之后的木屑干重，并利用下列公式计算木屑产率而得到：
(处理后的干重)/(处理前的干重)×100
如下面表3所示，使用具有被抑制的纤维二糖脱氢酶的转化体可控制木屑产率的降低，并可降低精制能。此外，撕裂强度和爆裂强度均增加。比较起来，当用野生型菌株处理木屑时，可能获得降低精制能的效果，但纸强度也降低了。
表3
用具有被抑制的纤维二糖脱氢酶活性的微生物处理木屑对机械纸浆的影响
   对照   转化体  野生型菌株
木屑产率(％)    99.8   98.9     94.7
精制能  (Kw·h/ton)    2560   1792     1840
撕裂指数(mN·m2/g)    7.92   8.21     6.95
爆裂指数(kPa·m2/g)    1.35   1.52     1.21
[实施例27]蒸煮用具有被抑制的纤维二糖脱氢酶活性的转化体处理的木屑
按照与实施例25相同的方式处理由桉木制造的木屑。之后，称量400g干重的木屑。将蒸煮白液加入到高压釜中的木屑中，可获得值为5的液体比例、30％的硫度、和17％的活性碱(Na2O)。之后，将蒸煮温度设定为150℃，进行Kraft蒸煮。Kraft蒸煮完成后，分离出黑液，并使用高浓缩精制机精制所得木屑。之后，用滤布将精制木屑离心脱水，然后用水洗涤，三次。然后，过筛除去未蒸煮的产物，并使残留物经过离心脱水，从而得到蒸煮的未漂白纸浆。
向通过上述Kraft蒸煮获得的纸浆中加入2.0质量％的NaOH，然后向其中注射氧气，接着在0.49Mpa(5kg/cm2)的氧计示压力下，于100℃处理60分钟。
按照下面所述，使上述所得纸浆经过顺序为D-E-P-D的4-步漂白处理。在第一步二氧化氯处理(D)中，制备纸浆，使纸浆浓度变为10质量％，向其中加入0.4质量％的二氧化氯，接着在70℃下处理40分钟。随后，用离子交换水洗涤纸浆，然后脱水。将纸浆浓度调节为10质量％，并向其中加入1质量％的氢氧化钠，接着在70℃下进行碱提取处理(E)90分钟。随后，用离子交换水洗涤纸浆，然后脱水。将纸浆浓度调节至10质量％，连续向纸浆中加入0.5质量％的过氧化氢和0.5质量％的氢氧化钠，接着在70℃下进行过氧化氢处理(P)120分钟。随后，用离子交换水洗涤纸浆，然后脱水。将纸浆浓度调节至10％，并向纸浆中加入0.25质量％的二氧化氯，接着在70℃下进行二氧化氯处理(D)180分钟。最后，用离子交换水洗涤纸浆，然后脱水，从而得到与JIS P 8123一致的具有86.0％洁白度的漂白纸浆。
用精制机搅打由此获得的具有4质量％浓度的纸浆，使打浆度变为410ml(CSF)。
[实施例28]Ka值的测量、用于纸浆物理试验的手工片的制备、和手工纸浆片的物理试验
κ值是按照JIS P 8211测量的。用于纸浆物理试验的手工片是按照Tappi试验方法T205-om81制备的，手工纸浆片的物理试验是按照Tappi试验T220om-83进行的。如下面表4所示，当用转化体或野生型菌株处理木屑时，Ka值在蒸煮后降低，筛选的产率增加，且筛选的次品降低。此外，如下面表5所示，当把转化体与野生型菌株进行比较时，转化体不会引起纸强度降低。
表4
用具有被抑制的纤维二糖脱氢酶活性的微生物处理木屑对蒸煮的影响
   对照    转化体  野生型菌株
蒸煮后的Ka值    20.1    17.6     17.7
筛选的产率(％)    45.7    47.8     47.3
筛选的次品(％)    1.20    0.65     0.84
表5
用具有被抑制的纤维二糖脱氢酶活性的微生物处理木屑对纸强度的影响
洁白度＝86，且CSF(加拿大标准打浆度(Canadian shopperFreeness))＝410ml
    对照    转化体   野生型菌株
PFI(rev)     2,600    2,200     2,200
撕裂指数 (mN·m2/g)     9.4    9.3     8.5
断裂长度 (km)     8.62    8.71     7.34
爆裂指数 (kPa·m2/g)     6.76    7.72     7.54
耐折强度 (logT)     2.31    2.35     2.19
注意)对照是指通过木屑处理生产的纸浆片，其中没有进行微生物处理
[实施例29]选择具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体
转化是按照上面实施例22中的转化方法所述，使用实施例14生产的质粒pGPCBHI26AM代替质粒pGPCHD1进行的。按照与实施例24相同的方法培养所得的转化体。之后，应用纤维二糖水解酶I活性的测量方法，使用4-甲基-O-umbellifferyl-cellobioside作为底物，随时测量纤维二糖水解酶I的活性。结果，人们发现可得到具有最大60％被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体。
[实施例30]用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体处理木屑
按照与实施例25相同的方法，使用在实施例29中选择的具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化株处理由桉木制造的木屑。
[实施例31]使用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体生产机械纸浆
按照与实施例25相同的方式处理由辐射松木制造的木屑。使所处理的木屑经过与实施例26相同的试验。如下面表6所示，使用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体可控制木屑产率的降低，并降低精制能。此外，撕裂强度和爆裂强度均增加。比较起来，当用野生型菌株处理木屑时，可获得降低精制能的效果，但纸强度也降低了。
表6
用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的微生物处理木屑对机械纸浆的影响
   对照   转化体  野生型菌株
木屑产率(％)    99.8    98.7     94.7
精制能  (Kw·h/ton)    2560    1782     1840
撕裂指数(mN·m2/g)    7.92    8.02     6.95
爆裂指数(kPa·m2/g)    1.35    1.50     1.21
[实施例32]蒸煮用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体处理的木屑
在实施例30中处理的木屑是通过与实施例27相同的方法蒸煮的。
[实施例33]Ka值的测量、用于纸浆物理试验的手工片的制备、和手工纸浆片的物理试验
κ值等的测量是按照与实施例28中所述相同的方式，对在实施例32中获得的纸浆进行的。如下面表7所示，当用转化体或野生型菌株处理木屑时，Ka值在蒸煮后降低，筛选的产率增加，且筛选的次品降低。此外，如下面表8所示，当把转化体与野生型菌株进行比较时，转化体不会引起纸强度降低。
表7
用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的微生物处理木屑对蒸煮的影响
   对照   转化体  野生型菌株
蒸煮后的Ka值    20.1    17.7     17.7
筛选的产率(％)    45.7    47.9     47.3
筛选的次品(％)    1.20    0.75     0.84
表8
用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的微生物处理木屑对纸强度的影响
洁白度＝86，且CSF(加拿大标准打浆度)＝410ml
   对照   转化体  野生型菌株
PFI(rev)    2,600    2,300     2,200
撕裂指数(mN·m2/g)    9.4    9.4     8.5
断裂长度(km)    8.62    8.51     7.34
爆裂指数(kPa·m2/g)    6.76    7.82     7.54
耐折强度(logT)    2.31    2.34     2.19
注意)对照是指通过木屑处理生产的纸浆片，其中没有进行微生物处理
[实施例34]选择具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体
转化是按照上面实施例22中的转化方法所述，使用实施例15生产的质粒pGPCBHI27AM代替质粒pGPCHD1进行的。按照与实施例26相同的方法培养所得的转化体。之后，应用纤维二糖水解酶I活性的测量方法，使用4-甲基-O-umbellifferyl-cellobioside作为底物，随时测量纤维二糖水解酶I的活性。结果，人们发现可得到具有最大70％被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体。
[实施例35]用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体处理木屑
按照与实施例25相同的方法，使用在实施例34中选择的具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化株处理由桉木制造的木屑。
[实施例36]使用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体生产机械纸浆
按照与实施例25相同的方式，使用在实施例34中获得的转化体处理由辐射松木制造的木屑。使所处理的木屑经过与实施例26相同的试验。如下面表9所示，使用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体可控制木屑产率的降低，并可降低精制能。此外，撕裂强度和爆裂强度均增加。比较起来，当用野生型菌株处理木屑时，可获得降低精制能的效果，但纸强度也降低了。
表9
用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的微生物处理木屑对机械纸浆的影响
   对照    转化体   野生型菌株
木屑产率(％)    99.8     98.5     94.7
精制能  (Kw·h/ton)    2560     1752     1840
撕裂指数(mN·m2/g)    7.92     8.11     6.95
爆裂指数(kPa·m2/g)    1.35     1.42     1.21
[实施例37]蒸煮用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体处理的木屑
按照与实施例25相同的方式处理由桉木制造的木屑。之后，通过与实施例27相同的方法蒸煮所处理过的木屑。
[实施例38]Ka值的测量、用于纸浆物理试验的手工片的制备、和手工纸浆片的物理试验
κ值等的测量是按照与实施例28中所述相同的方式，对在实施例37中获得的纸浆进行的。如下面表10所示，当用转化体或野生型菌株处理木屑时，Ka值在蒸煮后降低，筛选的产率增加，且筛选的次品降低。此外，如下面表11所示，当把转化体与野生型菌株进行比较时，转化体不会引起纸强度降低。
表10
用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的微生物处理木屑对蒸煮的影响
   对照   转化体  野生型菌株
蒸煮后的Ka值    20.1    17.5     17.7
筛选的产率(％)    45.7    48.2     47.3
筛选的次品(％)    1.20    0.45     0.84
表11
用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的微生物处理木屑对纸强度的影响
洁白度＝86，且CSF(加拿大标准打浆度)＝410ml
   对照    转化体  野生型菌株
PFI(rev)    2,600    2,300     2,200
撕裂指数(mN·m2/g)    9.4    9.1     8.5
断裂长度(km)    8.62    8.54     7.34
爆裂指数(kPa·m2/g)    6.76    7.75     7.54
耐折强度(logT)    2.31    2.31     2.19
注意)对照是指通过木屑处理生产的纸浆片，其中没有进行微生物处理
[实施例39]选择具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体
转化是按照上面实施例22中的转化方法所述，使用实施例16生产的质粒pGPCBHI31AM代替质粒pGPCHD1进行的。按照与实施例24相同的方法培养所得的转化体。之后，应用纤维二糖水解酶I活性的测量方法，使用4-甲基-O-umbellifferyl-cellobioside作为底物，随时测量纤维二糖水解酶I的活性。结果，人们发现可得到具有最大70％被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体。
[实施例40]用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体处理木屑
按照与实施例25相同的方法，使用在实施例39中选择的具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化株处理由桉木制造的木屑。
[实施例41]使用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体生产机械纸浆
按照与实施例25相同的方式，使用在实施例39中获得的转化体处理由辐射松木制造的木屑。使所处理的木屑经过与实施例26相同的试验。
如下面表12所示，使用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体可控制木屑产率的降低，并可降低精制能。此外，撕裂强度和爆裂强度均增加。比较起来，当用野生型菌株处理木屑时，可获得降低精制能的效果，但纸强度也降低了。
表12
用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的微生物处理木屑对机械纸浆的影响
   对照   转化体  野生型菌株
木屑产率(％)    99.8    98.3     94.7
精制能(Kw·h/ton)    2560    1820     1840
撕裂指数(mN·m2/g)    7.92    8.35     6.95
爆裂指数(kPa·m2/g)    1.35    1.43     1.21
[实施例42]蒸煮用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的转化体处理的木屑
在实施例39中获得的木屑是通过与实施例27相同的方法蒸煮的。
[实施例43]Ka值的测量、用于纸浆物理试验的手工片的制备、和手工纸浆片的物理试验
κ值等的测量是按照与实施例28中所述相同的方式，对在实施例42中获得的纸浆进行的。如下面表13所示，当用转化体或野生型菌株处理木屑时，Ka值在蒸煮后降低，筛选的产率增加，且筛选的次品降低。此外，如下面表14所示，当把转化体与野生型菌株进行比较时，转化体不会引起纸强度降低。
表13
用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的微生物处理木屑对蒸煮的影响
   对照   转化体  野生型菌株
蒸煮后的Ka值    20.1    17.8     17.7
筛选的产率(％)    45.7    47.4     47.3
筛选的次品(％)    1.20    0.63     0.84
表14
用具有被抑制的纤维二糖水解酶I活性的微生物处理木屑对纸强度的影响
洁白度＝86，且CSF(加拿大标准打浆度)＝410ml
   对照    转化体  野生型菌株
PFI(rev)    2,600    2,200     2,200
撕裂指数(mN·m2/g)    9.4    9.1     8.5
断裂长度(km)    8.62    8.61     7.34
爆裂指数(kPa·m2/g)    6.76    7.73     7.54
耐折强度(logT)    2.31    2.35     2.19
注意)对照是指通过木屑处理生产的纸浆片，其中没有进行微生物处理
[实施例44]选择具有被抑制的纤维二糖水解酶II活性的转化体
转化是按照上面实施例22中的转化方法所述，使用实施例17生产的质粒pGPCBHIIAM代替质粒pGPCHD1进行的。按照与实施例23相同的方法培养所得的转化体。定期采集所培养的细胞体，并回收mRNA，并测量纤维二糖水解酶II基因的表达量。结果，人们发现所得转化体的被抑制的纤维二糖水解酶II活性较之宿主细胞少约50％。
[实施例45]用具有被抑制的纤维二糖水解酶II活性的转化体处理木屑
按照与实施例25相同的方法，使用在实施例44中选择的具有被抑制的纤维二糖水解酶II活性的转化株处理由桉木制造的木屑。
[实施例46]使用具有被抑制的纤维二糖水解酶II活性的转化体生产机械纸浆
按照与实施例25相同的方式，使用在实施例44中获得的转化体处理由辐射松木制造的木屑。按照实施例26中描述的方法，对所处理过的木屑进行纸强度等的分析。如下面表15所示，使用具有被抑制的纤维二糖水解酶II活性的转化体可控制木屑产率的降低，并可降低精制能。此外，撕裂强度和爆裂强度均增加。比较起来，当用野生型菌株处理木屑时，可获得降低精制能的效果，但纸强度也降低了。
表15
用具有被抑制的纤维二糖水解酶II活性的微生物处理木屑对机械纸浆的影响
   对照   转化体  野生型菌株
木屑产率(％)    99.8    98.1     94.7
精制能  (Kw·h/ton)    2560    1830     1840
撕裂指数(mN·m2/g)    7.92    8.25     6.95
爆裂指数(kPa·m2/g)    1.35    1.44     1.21
[实施例47]蒸煮用具有被抑制的纤维二糖水解酶II活性的转化体处理的木屑
在实施例45中获得的木屑是通过与实施例27相同的方法蒸煮的。
[实施例48]Ka值的测量、用于纸浆物理试验的手工片的制备、和手工纸浆片的物理试验
κ值等的测量是按照与实施例28中所述相同的方式，对在实施例47中获得的纸浆进行的。如下面表16所示，当用转化体或野生型菌株处理木屑时，Ka值在蒸煮后降低，筛选的产率增加，且筛选的次品降低。此外，如下面表17所示，当把转化体与野生型菌株进行比较时，转化体不会引起纸强度降低。
表16
用具有被抑制的纤维二糖水解酶II活性的微生物处理木屑对蒸煮的影响
   对照   转化体  野生型菌株
蒸煮后的Ka值    20.1    18.1     17.7
筛选的产率(％)    45.7    47.1     47.3
筛选的次品(％)    1.20    0.86     0.84
表17
用具有被抑制的纤维二糖水解酶II活性的微生物处理木屑对纸强度的影响
洁白度＝86，且CSF(加拿大标准打浆度)＝410ml
   对照    转化体  野生型菌株
PFI(rev)    2,600    2,300     2,200
撕裂指数(mN·m2/g)    9.4    8.7     8.5
断裂长度(km)    8.62    8.45     7.34
爆裂指数(kPa·m2/g)    6.76    7.49     7.54
耐折强度(logT)    2.31    2.32     2.19
注意)对照是指通过木屑处理生产的纸浆片，其中没有进行微生物处理
[实施例49]选择具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体
转化是按照上面实施例22中的转化方法所述，使用实施例18生产的质粒pGPEG61AM代替质粒pGPCHD1进行的。按照与实施例23相同的方法培养所得的转化体。随时采集培养液，测量羧甲基纤维素(CMC)-分解活性。结果，人们发现所得转化体的被抑制的内切葡聚糖酶活性较之宿主细胞少约50％。
[实施例50]用具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体处理木屑
按照实施例25中描述的方法，使用在实施例49中选择的具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化株处理由桉木制造的木屑。
[实施例51]使用具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体生产机械纸浆
按照与实施例25相同的方式，使用在实施例49中获得的转化体处理由辐射松木制造的木屑。按照实施例26中描述的方法，对所处理过的木屑进行纸强度等的分析。如下面表18所示，使用具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体可控制木屑产率的降低，并可降低精制能。此外，撕裂强度和爆裂强度均增加。比较起来，当用野生型菌株处理木屑时，可获得降低精制能的效果，但纸强度也降低了。
表18
用具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶被抑制活性的微生物处理木屑对机械纸浆的影响
   对照   转化体  野生型菌株
木屑产率(％)    99.8    98.6     94.7
精制能  (Kw·h/ton)    2560    1800     1840
撕裂指数(mN·m2/g)    7.92    8.21     6.95
爆裂指数(kPa·m2/g)    1.35    1.41     1.21
[实施例52]蒸煮用具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体处理的木屑
在实施例50中获得的木屑是通过与实施例27相同的方法蒸煮的。
[实施例53]Ka值的测量、用于纸浆物理试验的手工片的制备、和手工纸浆片的物理试验
κ值等的测量是按照与实施例28中所述相同的方式，对在实施例52中获得的纸浆进行的。如下面表19所示，当用转化体或野生型菌株处理木屑时，Ka值在蒸煮后降低，筛选的产率增加，且筛选的次品降低。此外，如下面表20所示，当把转化体与野生型菌株进行比较时，转化体不会引起纸强度降低。
表19
用具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶被抑制活性的微生物处理木屑对蒸煮的影响
    对照   转化体  野生型菌株
蒸煮后的Ka值     20.1    17.7     17.7
筛选的产率(％)     45.7    47.6     47.3
筛选的次品(％)     1.20    0.73     0.84
表20
用具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶被抑制活性的微生物处理木屑对纸强度的影响
洁白度＝86，且CSF(加拿大标准打浆度)＝410ml
   对照    转化体  野生型菌株
PFI(rev)    2,600    2,200     2,200
撕裂指数(mN·m2/g)    9.4    9.5     8.5
断裂长度(km)    8.62    8.63     7.34
爆裂指数(kPa·m2/g)    6.76    7.63     7.54
耐折强度(logT)    2.31    2.33     2.19
注意)对照是指通过木屑处理生产的纸浆片，其中没有进行微生物处理
[实施例54]选择具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体
转化是按照上面实施例22中的转化方法所述，使用实施例19生产的质粒pGPEG12AM代替质粒pGPCHD1进行的。按照与实施例23相同的方法培养所得的转化体。随时采集培养液，测量羧甲基纤维素(CMC)-分解活性。结果，人们发现所得转化体的被抑制的内切葡聚糖酶活性较之宿主细胞少约50％。
[实施例55]用具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体处理木屑
按照实施例25中描述的方法，使用在实施例54中选择的具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化株处理由桉木制造的木屑。
[实施例56]使用具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体生产机械纸浆
按照与实施例25相同的方式，使用在实施例54中获得的转化体处理由辐射松木制造的木屑。按照实施例26中描述的方法，对所处理过的木屑进行纸强度等的分析。如下面表21所示，使用具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体可控制木屑产率的降低，并可降低精制能。此外，撕裂强度和爆裂强度均增加。比较起来，当用野生型菌株处理木屑时，可获得降低精制能的效果，但纸强度也降低了。
表21
用具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶被抑制活性的微生物处理木屑对机械纸浆的影响
   对照   转化体  野生型菌株
木屑产率(％)    99.8    98.5     94.7
精制能  (Kw·h/ton)    2560    1860     1840
撕裂指数(mN·m2/g)    7.92    8.06     6.95
爆裂指数(kPa·m2/g)    1.35    1.43     1.21
[实施例57]蒸煮用具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体处理的木屑
在实施例55中获得的木屑是通过与实施例27相同的方法蒸煮的。
[实施例58]Ka值的测量、用于纸浆物理试验的手工片的制备、和手工纸浆片的物理试验
κ值等的测量是按照与实施例28中所述相同的方式，对在实施例56中获得的纸浆进行的。如下面表22所示，当用转化体或野生型菌株处理木屑时，Ka值在蒸煮后降低，筛选的产率增加，且筛选的次品降低。此外，如下面表23所示，当把转化体与野生型菌株进行比较时，转化体不会引起纸强度降低。
表22
用具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶被抑制活性的微生物处理木屑对蒸煮的影响
   对照   转化体  野生型菌株
蒸煮后的Ka值    20.1    18.2     17.7
筛选的产率(％)    45.7    47.1     47.3
筛选的次品(％)    1.20    0.93     0.84
表23
用具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶被抑制活性的微生物处理木屑对纸强度的影响
洁白度＝86，且CSF(加拿大标准打浆度)＝410ml
   对照    转化体  野生型菌株
PFI(rev)    2,600    2,400     2,200
撕裂指数(mN·m2/g)    9.4    9.3     8.5
断裂长度(km)    8.62    8.58     7.34
爆裂指数(kPa·m2/g)    6.76    7.63     7.54
耐折强度(logT)    2.31    2.31     2.19
注意)对照是指通过木屑处理生产的纸浆片，其中没有进行微生物处理
[实施例59]选择具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体
转化是按照上面实施例22中的转化方法所述，使用实施例20生产的质粒pGPEG5AM代替质粒pGPCHD1进行的。按照与实施例23相同的方法培养所得的转化体。随时采集培养液，测量羧甲基纤维素(CMC)-分解活性。结果，人们发现所得转化体的被抑制的内切葡聚糖酶活性较之宿主细胞少约20％。
[实施例60]用具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体处理木屑
按照实施例25中描述的方法，使用在实施例59中选择的具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化株处理由桉木制造的木屑。
[实施例61]使用具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体生产机械纸浆
按照与实施例25相同的方式，使用在实施例59中获得的转化体处理由辐射松木制造的木屑。按照实施例26中描述的方法，对所处理过的木屑进行纸强度等的分析。
如下面表24所示，使用具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体可控制木屑产率的降低，并可降低精制能。此外，撕裂强度和爆裂强度均增加。比较起来，当用野生型菌株处理木屑时，可获得降低精制能的效果，但纸强度也降低了。
表24
用具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶被抑制活性的微生物处理木屑对机械纸浆的影响
   对照   转化体  野生型菌株
木屑产率(％)    99.8    98.2     94.7
精制能(Kw·h/ton)    2560    1910     1840
撕裂指数(mN·m2/g)    7.92    8.05     6.95
爆裂指数(kPa·m2/g)    1.35    1.34     1.21
[实施例62]蒸煮用具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体处理的木屑
在实施例60中获得的木屑是通过与实施例27相同的方法蒸煮的。
[实施例63]Ka值的测量、用于纸浆物理试验的手工片的制备、和手工纸浆片的物理试验
κ值等的测量是按照与实施例28中所述相同的方式，对在实施例62中获得的纸浆进行的。如下面表25所示，当用转化体或野生型菌株处理木屑时，Ka值在蒸煮后降低，筛选的产率增加，且筛选的次品降低。此外，如下面表26所示，当把转化体与野生型菌株进行比较时，转化体不会引起纸强度降低。
表25
用具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶被抑制活性的微生物处理木屑对蒸煮的影响
   对照   转化体  野生型菌株
蒸煮后的Ka值    20.1    17.9     17.7
筛选的产率(％)    45.7    46.8     47.3
筛选的次品(％)    1.20    0.95     0.84
表26
用具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶被抑制活性的微生物处理木屑对纸强度的影响
洁白度＝86，且CSF(加拿大标准打浆度)＝410ml
   对照    转化体  野生型菌株
PFI(rev)    2,600    2,300     2,200
撕裂指数(mN·m2/g)    9.4    9.4     8.5
断裂长度(km)    8.62    8.55     7.34
爆裂指数(kPa·m2/g)    6.76    7.36     7.54
耐折强度(logT)    2.31    2.26     2.19
注意)对照是指通过木屑处理生产的纸浆片，其中没有进行微生物处理
[实施例64]选择具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体
转化是按照上面实施例22中的转化方法所述，使用实施例21生产的质粒pGPEG9AM代替质粒pGPCHD1进行的。按照与实施例23相同的方法培养所得的转化体。随时采集培养液，测量羧甲基纤维素(CMC)-分解活性。结果，人们发现所得转化体的被抑制的内切葡聚糖酶活性较之宿主细胞少约30％。
[实施例65]用具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体处理木屑
按照实施例25中描述的方法，使用在实施例64中选择的具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化株处理由桉木制造的木屑。
[实施例66]使用具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体生产机械纸浆
按照与实施例25相同的方式，使用在实施例64中获得的转化体处理由辐射松木制造的木屑。按照实施例26中描述的方法，对所处理过的木屑进行纸强度等的分析。
如下面表27所示，使用具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体可控制木屑产率的降低，并可降低精制能。此外，撕裂强度和爆裂强度均增加。比较起来，当用野生型菌株处理木屑时，可获得降低精制能的效果，但纸强度也降低了。
表27
用具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶被抑制活性的微生物处理木屑对机械纸浆的影响
   对照   转化体  野生型菌株
木屑产率(％)    99.8    98.1     94.7
精制能  (Kw·h/ton)    2560    1860     1840
撕裂指数(mN·m2/g)    7.92    7.98     6.95
爆裂指数(kPa·m2/g)    1.35    1.36     1.21
[实施例67]蒸煮用具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶被抑制活性的转化体处理的木屑
在实施例65中获得的木屑是通过与实施例27相同的方法蒸煮的。
[实施例68]Ka值的测量、用于纸浆物理试验的手工片的制备、和手工纸浆片的物理试验
κ值等的测量是按照与实施例28中所述相同的方式，对在实施例67中获得的纸浆进行的。如下面表28所示，当用转化体或野生型菌株处理木屑时，Ka值在蒸煮后降低，筛选的产率增加，且筛选的次品降低。此外，如下面表29所示，当把转化体与野生型菌株进行比较时，转化体不会引起纸强度降低。
表28
用具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶被抑制活性的微生物处理木屑对蒸煮的影响
   对照   转化体    转化体
蒸煮后的Ka值    20.1    18.1     17.7
筛选的产率(％)    45.7    46.7     47.3
筛选的次品(％)    1.20    0.86     0.84
表29
用具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶被抑制活性的微生物处理木屑对纸强度的影响
洁白度＝86，且CSF(加拿大标准打浆度)＝410ml
   对照    转化体  野生型菌株
PFI(rev)    2,600    2,200     2,200
撕裂指数(mN·m2/g)    9.4    9.6     8.5
断裂长度(km)    8.62    8.44     7.34
爆裂指数(kPa·m2/g)    6.76    7.45     7.54
耐折强度(logT)    2.31    2.25     2.19
注意)对照是指通过木屑处理生产的纸浆片，其中没有进行微生物处理
[实施例69]纤维二糖脱氢酶活性
1.测量方法的概述
纤维二糖脱氢酶活性是如下测量的。通过将250μl 0.67mM二氯酚靛酚(由Sigma Chemical Company制造)、100μl 3.33mM纤维二糖(由Kanto Kagaku制造)、和100μl pH5的250mM醋酸盐缓冲溶液混合生产一种溶液，之后，向混合溶液中加入50μl试验溶液，接着在37℃下反应。反应开始后，连续测量550nm处的吸光度(光学长度：1cm)(摩尔吸收系数：3965L/mol/cm)，即二氯酚靛酚的最大吸收波长。关于纤维二糖脱氢酶的活性单位，将一个单位定义为在上述条件下，每分钟减少1μmol二氯酚靛酚所需酶的量(单位：U)。
2.粗酶溶液(1)的制备
将100ml含有1.0％硬木氧-漂白的牛皮纸浆(κ值：8.5，洁白度：46.0％)、1.0％胨、0.005％MgSO4·7H2O、0.15％KH2PO4、和20ppb盐酸硫胺的液体培养基(pH5.0)放在500ml-体积的Erlenmeyer烧瓶中，然后用纸密封该烧瓶，接着在121℃下蒸汽灭菌15分钟。使用接种环将毛革盖菌IFO4917接种在所得产物中，接着在27℃下旋转摇动培养(幅度：25mm，120次往复运动/分钟)。培养完成后，将培养物离心(10,000rpm×10分钟)从而分离培养物上清液，由此获得纤维二糖脱氢酶的粗酶溶液。在上述条件下测量该酶的活性。结果，人们发现培养开始后第72小时的时候，培养物上清液中的纤维二糖脱氢酶活性是0.06U/ml。
3.粗酶溶液(2)的制备
将100ml含有1.0％Avicel(由Funakoshi Co.，Ltd.制造)、1.0％胨、0.005％MgSO4·7H2O、0.15％KH2PO4、和20ppb盐酸硫胺的液体培养基(pH5.0)放在500ml-体积的Erlenmeyer烧瓶中，然后用纸密封该烧瓶，接着在121℃下蒸汽灭菌15分钟。使用接种环将毛革盖菌IFO4917接种在所得产物中，接着在27℃下旋转摇动培养(幅度：25mm，120次往复运动/分钟)。培养完成后，将培养物离心(10,000rpm×10分钟)从而分离培养物上清液，由此获得纤维二糖脱氢酶的粗酶溶液。在上述条件下测量该酶的活性。结果，人们发现培养开始后第72小时的时候，培养物上清液中的纤维二糖脱氢酶活性是0.07U/ml。
4.纤维二糖脱氢酶(1)的纯化
使在实施例1或2中获得粗酶溶液经过硫酸铵分离，然后通过离心(20,000rpm×10分钟)回收80％的沉积部分。之后，将所得部分溶于20mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)中。使用由含有1M硫酸铵的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)平衡的Resource 15PHE(直径1.6×3cm；由Amersham制造)，使所得粗酶溶液经过疏水色谱。
以1M-0M的硫酸铵浓度梯度，用20mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)洗脱吸附部分。将所得部分分成9ml的部分，并因此获得活性部分。使用由含有100mM氯化钠的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)平衡的HiLoad26/60 Superdex 200(直径2.6×60cm；由Amersham制造)，使所得部分经过凝胶过滤色谱。色谱法是以1.5ml/分钟的流速进行的，将样品分成3ml的部分，从而获得活性部分。
收集这些部分，并使用由20mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)平衡的POROS HQ(直径4.6×10cm；由ABI制造)进行离子交换色谱。以0M-1M的浓度梯度，用上述含有氯化钠的缓冲溶液洗脱吸附的部分，并由此获得活性部分。
上述活性部分经过SDS聚丙烯酰胺电泳。结果，证实了该部分被均匀纯化。纯化酶相对于培养液的产率是4.9％，特异性活性是10.5U/mg。
5.纤维二糖脱氢酶(2)的纯化
当把实施例1或2中获得的粗酶溶液冷冻然后融化时，可使葡聚糖-样物质沉积。通过离心(20,000rpm×10分钟)除去这些葡聚糖-样物质，然后加入硫酸铵使硫酸铵浓度变为1M。使用由含有1M硫酸铵的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)平衡的Resource 15PHE(直径1.6×3cm；由Amersham制造)，使所得粗酶溶液经过疏水色谱。
以1M-0M的硫酸铵浓度梯度，用20mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)洗脱吸附部分。将所得部分分成9ml的部分，并因此获得活性部分。使用由含有100mM氯化钠的20mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)平衡的HiLoad26/60 Superdex 200(直径2.6×60cm；由Amersham制造)，使所得部分经过凝胶过滤色谱。色谱法是以1.5ml/分钟的流速进行的，将样品分成3ml的部分，从而获得活性部分。收集这些部分，并使用由20mM磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)平衡的monoQ HR 5/5(直径0.5×5cm；由Amersham制造)进行离子交换色谱。以0M-0.4M的浓度梯度，用上述含有氯化钠的缓冲溶液洗脱吸附的部分。将所得部分分成1ml的部分，并由此获得活性部分。
上述活性部分经过SDS聚丙烯酰胺电泳。结果，证实了该部分被均匀纯化。纯化酶相对于培养液的产率是16.6％，特异性活性是10.5U/mg。
工业实用性
本发明提供一种编码来源于担子菌的纤维素分解酶的基因，一种用含有上述基因或上述基因的反义基因的重组载体转化的转化体，及其应用。具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞是通过使用上述编码纤维素分解酶的基因的反义基因进行基因重组而制备的，具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞可用于处理木屑，从而实现产率和纸强度均极佳的纸浆生产方法。
这里引用的所有公开出版物、专利和专利申请均整体引入此处作为参考。
                             序列表
<110>OJI PAPER CO.，LTD.
<120>纤维素分解酶及其用途
<130>PH-1724-PCT
<160>52
<170>PatentIn Ver.3.1
<210>1
<211>3420
<212>DNA
<213>毛革盖菌
<220>
<223>发明人：Akira，Tsukamoto；Seiji，Nakagame；Mari，Kabuto；Jun Sugiura；Hisako Sakaguchi；Atsushi Furujyo
<400>1
catgtcctgt cggctccttg aatgctcggg tctttctcgc gataccgaag tgctgggcaa 60
cccggggacg cgtataaagt ccaaaaaatc ggtctttgac ggtgagcgcg acactacgac 120
tgcccgccat gaagttcaag agtctcctgt tgtccgtgtt gccgttggtc ggctctggta 180
tgttgcggcc ttccatccga caccgagacg agacgctgac agtaacacgc cacgaccagt 240
ctactcccag gtcgccgcac cctaccagga cgccggcaac ggcttcgtct ttgacggtgt 300
cactgatcca gtgcatagcg tcacgtatgg aatcgtcctc cctcaggcgg cctccagctc 360
ggagttcatt ggcgagatcg tcgcgccaaa cgacgcacaa tggatcggtt tggctcttgg 420
aggagccatg atcggcgacc tgcttctcgt cgcatggcca tatgagaaca aaattatttt 480
ctcccctcgc tacgcgacgt gagtatatgc tgttacatgt atgcagacgc tacgggctaa 540
atacgccaat ctcacagcgg gtacacgctg ccggcggtct acgaaggccc aaccattacc 600
acactcccgt ccagttcgat caactcgacg cactggaagt tcgtgttccg ctgccagaac 660
tgcacatgtg cgtacctcac attacgtatg acgtctccaa ctaaacctct tcacagcctg 720
ggatggcgga agcattgacc cctccggcac tggcgtcttc gcgtgggcgt actcgaacgt 780
cgcagtagat acccccgccg atcccaacag cagcttcgcc gagcacaccg actgtaagcg 840
atcatctctg aaccatggta ctgaatcact catggtatat cgcagtcggc ttcttcggcg 900
tcaacttccc cgatgctcag aactcgaact accaaagcta cctccagggc aacgccggca 960
ctccccctcc cacatccgtc cctagcggcc cttccagcac tacgactact actggtccta 1020
cggcaaccgt gagggcttcc acttcgctgt gcaggacgtt gctaacggtc tgtacaggct 1080
acgccgtttg actacatcgt cgttggtgcc ggcccaggtg gtctcatcgc tgccgatcgc 1140
ttgtcggagg cgggcaagaa ggtccttctt cttgagcgtg gtggaccttc gactgcagag 1200
accggcggca cttacgatgt cccatgggcc aagtccgcta acgtgagttg aatacccttg 1260
aatcgataat gcgcacaccg actgactccc atccatggta gctcacaaaa ttcgatgtcc 1320
cgggattgtt cgagacgctg ttcaccgaca cgaacccatt ctggtggtgc aagggtgggt 1380
cggtttctgg aagcgcatgt caacgtcgct aagaaagcct tctagacacc aacttctttg 1440
ctggatgcat tctcggtggc ggtaccacgg tcaacggagc gtaagtgcat tgactctgcc 1500
gtgcccaagc agccctcctg acgacaatct acagtcttta ctggtacccc aacaacaatg 1560
acttctccac cgccagcgga tggccgagca gctggaccaa ccaccagccg ttcaccaaca 1620
agctgaagca gcgtctgccg agcacagacc acccctccac cgacggccag cgctacctcg 1680
aacagtccgc gaacgtcgtc cagcagctgc tccagagcca gggctaccgg caggtcacga 1740
tcaacgacga cccggactcc aaggaccacg tcttcggcta cagcgcgttt gacttcctca 1800
acgggcagcg cgccggtccc gtcgcgacgt acttccagac cgcgctcgcg cgcaagaact 1860
tcgtgtaccg cgacaacgtg ctcgtcacgc aggtcatccg caacggctcg acgatcacgg 1920
gcgtgcgcac gaacgacctc accatcgggc ccgacggcat cgtgcccctc aacccgaacg 1980
gccgcgtcat ccttgctggc ggctcgttcg ggaccccgcg catcctgttc caaagcggca 2040
tcgggccgac ggacatgctc caggtcgtgc agggcaacgc gcaggccgcg gcgaacctgc 2100
ccccgcagaa ccagtggatc aacctcccgg tcggccaggc cgtgtctgac aacccgtcga 2160
tcaacgtgag tgacgctgca tacgcgttca agcccgccgg cctgaggctg acatggctcg 2220
tagttggtct tcactcaccc gagcatcgac gcgtacgaca actgggcgac cgtatggtcg 2280
aacccaaggc aggcggacgc tcagcagtac ctgcagagcc gctccggcgt gttggcgggc 2340
gcgtccccga agtacgttcg acatcgcgcc tggagtcttg caggtgtctg accagtcctc 2400
tctacaggct gaacttctgg agggcctacg gcggcagtga cggtatcacc cgctacgtat 2460
gtctatgttc gtcttgatct ccggtgctac gacctgacat tggccgtagg cgcaaggaac 2520
tgtccgtcct ggcgcagcat ccgtgaacac ctccgttgcg tacaacgcga gccagatctt 2580
cacgatcacc ctctacctgt gggtaccagc ccgaccgtat gtggactgtg cagctaaccg 2640
tgcaccacta caggtccaac ggtatccagt cgcgcggtcg catcggcgtg gacgccgccc 2700
tgaacgcgaa ggcgctcgtc aacccctggc tcaccaacgc cgtcgacaag acgatcctgc 2760
tgcaggccct gcacgacgtc gtctccacac tgaataacgg taaggccact tctccgtacc 2820
tgcctgcgcg cgcgccgctc atgcctctcc ttcctccagt ccaaggcctg acgatgatca 2880
cccccgacca caccatgacg atcgagcagt acgtcgacgc ctacgacccg gtgagtcccg 2940
cccgcagcat cccggcgaaa taaaaaacgg acgctgacgc ccccgtccca cgcaggcgac 3000
gatgtgctcc aaccactggg tgggcgccgc gaagatcggc acaagcccgt ccacggccgt 3060
cgtcgacgag aacgcgaagg tgttcaacac ggacaacctg gtacgtttcc ctgccctttt 3120
tcttcccgtg ccctccgctg acgcggcctt cctgcagttc atcgtcgatg cgtccatcat 3180
cccgtctctg ccggtcggga acccgcaggg cctgctcatg tctgcggccg agcaggccgt 3240
gtcgaagatc ctcgcgctcg ccggaggacc gtgaggcagg gggttcaaaa gcatttggag 3300
cgctgctatg gtagaccatg aagcgggatg ggtcctgtcg atatgagaca cgatgtatat 3360
attatatatt ctgcacggtt ttcttcttcc tggaagcctg atgaggctct cgacgtgcca 3420
<210>2
<211>768
<212>PRT
<213>毛革盖菌
<400>2
Met Lys Phe Lys Ser Leu Leu Leu Ser Val Leu Pro Leu Val Gly Ser
  1               5                  10                  15
Val Tyr Ser Gln Val Ala Ala Pro Tyr Gln Asp Ala Gly Asn Gly Phe
             20                  25                  30
Val Phe Asp Gly Val Thr Asp Pro Val His Ser Val Thr Tyr Gly Ile
         35                  40                  45
Val Leu Pro Gln Ala Ala Ser Ser Ser Glu Phe Ile Gly Glu Ile Val
     50                  55                  60
Ala Pro Asn Asp Ala Gln Trp Ile Gly Leu Ala Leu Gly Gly Ala Met
 65                  70                  75                  80
Ile Gly Asp Leu Leu Leu Val Ala Trp Pro Tyr Glu Asn Lys Ile Ile
                 85                  90                  95
Phe Ser Pro Arg Tyr Ala Thr Gly Tyr Thr Leu Pro Ala Val Tyr Glu
            100                 105                 110
Gly Pro Thr Ile Thr Thr Leu Pro Ser Ser Ser Ile Asn Ser Thr His
        115                 120                 125
Trp Lys Phe Val Phe Arg Cys Gln Asn Cys Thr Ser Trp Asp Gly Gly
    130                 135                 140
Ser Ile Asp Pro Ser Gly Thr Gly Val Phe Ala Trp Ala Tyr Ser Asn
145                 150                 155                 160
Val Ala Val Asp Thr Pro Ala Asp Pro Asn Ser Ser Phe Ala Glu His
                165                 170                 175
Thr Asp Phe Gly Phe Phe Gly Val Asn Phe Pro Asp Ala Gln Asn Ser
            180                 185                 190
Asn Tyr Gln Ser Tyr Leu Gln Gly Asn Ala Gly Thr Pro Pro Pro Thr
        195                 200                 205
Ser Val Pro Ser Gly Pro Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr Gly Pro Thr
    210                 215                 220
Ala Thr Ala Thr Pro Phe Asp Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Pro Gly
225                 230                 235                 240
Gly Leu Ile Ala Ala Asp Arg Leu Ser Glu Ala Gly Lys Lys Val Leu
                245                 250                 255
Leu Leu Glu Arg Gly Gly Pro Ser Thr Ala Glu Thr Gly Gly Thr Tyr
            260                 265                 270
Asp Val Pro Trp Ala Lys Ser Ala Asn Leu Thr Lys Phe Asp Val Pro
        275                 280                 285
Gly Leu Phe Glu Thr Leu Phe Thr Asp Thr Asn Pro Phe Trp Trp Cys
    290                 295                 300
Lys Asp Thr Asn Phe Phe Ala Gly Cys Ile Leu Gly Gly Gly Thr Thr
305                 310                 315                 320
Val Asn Gly Ala Leu Tyr Trp Tyr Pro Asn Asn Asn Asp Phe Ser Thr
                325                 330                 335
Ala Ser Gly Trp Pro Ser Ser Trp Thr Asn His Gln Pro Phe Thr Asn
            340                 345                 350
Lys Leu Lys Gln Arg Leu Pro Ser Thr Asp His Pro Ser Thr Asp Gly
        355                 360                 365
Gln Arg Tyr Leu Glu Gln Ser Ala Asn Val Val Gln Gln Leu Leu Gln
    370                 375                 380
Ser Gln Gly Tyr Arg Gln Val Thr Ile Asn Asp Asp Pro Asp Ser Lys
385                 390                 395                 400
Asp His Val Phe Gly Tyr Ser Ala Phe Asp Phe Leu Asn Gly Gln Arg
                405                 410                 415
Ala Gly Pro Val Ala Thr Tyr Phe Gln Thr Ala Leu Ala Arg Lys Asn
            420                 425                 430
Phe Val Tyr Arg Asp Asn Val Leu Val Thr Gln Val Ile Arg Asn Gly
        435                 440                 445
Ser Thr Ile Thr Gly Val Arg Thr Asn Asp Leu Thr Ile Gly Pro Asp
    450                 455                 460
Gly Ile Val Pro Leu Asn Pro Asn Gly Arg Val Ile Leu Ala Gly Gly
465                 470                 475                 480
Ser Phe Gly Thr Pro Arg Ile Leu Phe Gln Ser Gly Ile Gly Pro Thr
                485                 490                 495
Asp Met Leu Gln Val Val Gln Gly Asn Ala Gln Ala Ala Ala Asn Leu
            500                 505                 510
Pro Pro Gln Asn Gln Trp Ile Asn Leu Pro Val Gly Gln Ala Val Ser
        515                 520                 525
Asp Asn Pro Ser Ile Asn Leu Val Phe Thr His Pro Ser Ile Asp Ala
    530                 535                 540
Tyr Asp Asn Trp Ala Thr Val Trp Ser Asn Pro Arg Gln Ala Asp Ala
545                 550                 555                 560
Gln Gln Tyr Leu Gln Ser Arg Ser Gly Val Leu Ala Gly Ala Ser Pro
                565                 570                 575
Lys Leu Asn Phe Trp Arg Ala Tyr Gly Gly Ser Asp Gly Ile Thr Arg
            580                 585                 590
Tyr Ala Gln Gly Thr Val Arg Pro Gly Ala Ala Ser Val Asn Thr Ser
        595                 600                 605
Val Ala Tyr Asn Ala Ser Gln Ile Phe Thr Ile Thr Leu Tyr Leu Ser
    610                 615                 620
Asn Gly Ile Gln Ser Arg Gly Arg Ile Gly Val Asp Ala Ala Leu Asn
625                 630                 635                 640
Ala Lys Ala Leu Val Asn Pro Trp Leu Thr Asn Ala Val Asp Lys Thr
                645                 650                 655
Ile Leu Leu Gln Ala Leu His Asp Val Val Ser Thr Leu Asn Asn Val
            660                 665                 670
Gln Gly Leu Thr Met Ile Thr Pro Asp His Thr Met Thr Ile Glu Gln
        675                 680                 685
Tyr Val Asp Ala Tyr Asp Pro Ala Thr Met Cys Ser Asn His Trp Val
    690                 695                 700
Gly Ala Ala Lys Ile Gly Thr Ser Pro Ser Thr Ala Val Val Asp Glu
705                 710                 715                 720
Asn Ala Lys Val Phe Asn Thr Asp Asn Leu Phe Ile Val Asp Ala Ser
                725                 730                 735
Ile Ile Pro Ser Leu Pro Val Gly Asn Pro Gln Gly Leu Leu Met Ser
            740                 745                 750
Ala Ala Glu Gln Ala Val Ser Lys Ile Leu Ala Leu Ala Gly Gly Pro
        755                 760                 765
<210>3
<211>3480
<212>DNA
<213>毛革盖菌
<400>3
agcgcacgcg gcgcgtacca aatgagcgtt catgtcctgt cggctccttg aatgctcggg 60
tctttctcgc ggtaccgaag tgctgggcaa cccggggacg cgtataaagt ccaaaaaatg 120
ggtcttgaac ggtgagcacg acactacgac cgcccgccat gaagctcaag agcctcctgt 180
tgtccgtgtt gccgttggtc ggctctggta tgttgcagcc ttctatctga catcgagacg 240
agacgctgac agtaacgcac cacgaacagt ctacccccag gtcgccgcac cctaccagga 300
cgccggcaac ggcttcgtct ttgacggtgt cactgaccca gtgcatagcg tcacctatgg 360
aatcgtcctc cctcaggcgg cctccagctc ggagttcatt ggcgagatcg tcgcgccaaa 420
cgacgcacaa tggatcggtt tggctcttgg aggagccatg atcggcgacc tgcttctcgt 480
cgcatggcca tatgagaaca aaatcatttt ctcccctcgc tacgcgacgt gagtatatgc 540
tgttacatgc atgcagacgc tcggggctaa atacgccaat attacagcgg gtacaccctg 600
ccggcggtct acgacggccc aaccattacc acactcccgt ccagttcggt caactcgacg 660
cactggaagt tcgtgtttcg ctgccagaac tgcacatgtg cgtacctcac atttcgtacg 720
acgtctccaa ctaaacctct tcacagcctg ggatggcgga agcattgacc cctccggcac 780
tggcgtcttc gcgtgggcgt actcgaacgt cgcagttgat acccccgccg atcccaacag 840
cagcttcgcc gagcacaccg actgtaagca atcatctctt aatcccggtg ccgaatcact 900
catggtatat cgcagtcggc ttcttcggcg tcaacttccc cgatgctcag aactcgaact 960
accaaaacta cctccagggc aacgccggca ccccccctcc cacgtccgtc cctagcggcc 1020
cttccagcac tacgactact actggtccta cggcaactgt gagcgcttcc acttcactgt 1080
gcagaacgtc gctaactttc tgtataggct acgccgtttg actacatcgt cgttggtgcc 1140
ggcccaggtg gtctcatcgc tgccgatcgc ctgtcggagg cgggcaagaa ggttcttctt 1200
cttgagcgtg gtggaccttc gacagcagag accggcggca cttacgatgc cccatgggcc 1260
aagtccgcta acgtgagttg aatacccttg aatcgataat gcgcacaccg actgactccc 1320
atccatggta gctcacaaaa ttcgatgtcc cgggattgtt cgagacgctg ttcaccgaca 1380
cgaacccatt ctggtggtgc aagggtgggt cggtttctgg aagcgcatgt caacgtcgct 1440
gagaaagcgt tctagatacc aacttctttg ctggatgcat tctcggtggc ggtaccacgg 1500
tcaacggagc gtaagtgcat cgactctgcc gtgtccaagc agtcctccta acgacaatct 1560
acagtcttta ctggtacccc aacaacaatg acttctccac ggccagcgga tggccgagca 1620
gctgggccaa ccaccagccg ttcaccagca agctgaagca gcgtctgccg agcacagacc 1680
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ttcaaagcca gggctaccgg caggtcacga tcaacgacga cccggactcc aaggaccacg 1800
tcttcggcta cagcgcgttc gacttcctca acgggcagcg cgccggcccc gttgcgacgt 1860
acttccagac cgcgctcgcg cgcaagaact tcgtgtaccg cgacaacgtg ctcgtcacgc 1920
aggtcatccg caacggctcg acgatcaccg gcgtgcgcac gaacgacctc accatcgggc 1980
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tcggccaggc cgtgtctgac aacccgtcga tcaacgtgag tgacgctgta tacgtgctct 2220
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gcgtacgaca actgggccac cgtgtggtcg aaccccaggc aggcggacgc tcagcagtat 2340
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<210>4
<211>768
<212>PRT
<213>毛革盖菌
<400>4
Met Lys Leu Lys Ser Leu Leu Leu Ser Val Leu Pro Leu Val Gly Ser
  1               5                  10                  15
Val Tyr Pro Gln Val Ala Ala Pro Tyr Gln Asp Ala Gly Asn Gly Phe
             20                  25                  30
Val Phe Asp Gly Val Thr Asp Pro Val His Ser Val Thr Tyr Gly Ile
         35                  40                  45
Val Leu Pro Gln Ala Ala Ser Ser Ser Glu Phe Ile Gly Glu Ile Val
     50                  55                  60
Ala Pro Asn Asp Ala Gln Trp Ile Gly Leu Ala Leu Gly Gly Ala Met
 65                  70                  75                  80
Ile Gly Asp Leu Leu Leu Val Ala Trp Pro Tyr Glu Asn Lys Ile Ile
                 85                  90                  95
Phe Ser Pro Arg Tyr Ala Thr Gly Tyr Thr Leu Pro Ala Val Tyr Asp
            100                 105                 110
Gly Pro Thr Ile Thr Thr Leu Pro Ser Ser Ser Val Asn Ser Thr His
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Trp Lys Phe Val Phe Arg Cys Gln Asn Cys Thr Ser Trp Asp Gly Gly
    130                 135                 140
Ser Ile Asp Pro Ser Gly Thr Gly Val Phe Ala Trp Ala Tyr Ser Asn
145                 150                 155                 160
Val Ala Val Asp Thr Pro Ala Asp Pro Asn Ser Ser Phe Ala Glu His
                165                 170                 175
Thr Asp Phe Gly Phe Phe Gly Val Asn Phe Pro Asp Ala Gln Asn Ser
            180                 185                 190
Asn Tyr Gln Asn Tyr Leu Gln Gly Asn Ala Gly Thr Pro Pro Pro Thr
        195                 200                 205
Ser Val Pro Ser Gly Pro Ser Ser Thr Thr Thr Thr Thr Gly Pro Thr
    210                 215                 220
Ala Thr Ala Thr Pro Phe Asp Tyr Ile Val Val Gly Ala Gly Pro Gly
225                 230                 235                 240
Gly Leu Ile Ala Ala Asp Arg Leu Ser Glu Ala Gly Lys Lys Val Leu
                245                 250                 255
Leu Leu Glu Arg Gly Gly Pro Ser Thr Ala Glu Thr Gly Gly Thr Tyr
            260                 265                 270
Asp Ala Pro Trp Ala Lys Ser Ala Asn Leu Thr Lys Phe Asp Val Pro
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Gly Leu Phe Glu Thr Leu Phe Thr Asp Thr Asn Pro Phe Trp Trp Cys
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Lys Asp Thr Asn Phe Phe Ala Gly Cys Ile Leu Gly Gly Gly Thr Thr
305                 310                 315                 320
Val Asn Gly Ala Leu Tyr Trp Tyr Pro Asn Asn Asn Asp Phe Ser Thr
                325                 330                 335
Ala Ser Gly Trp Pro Ser Ser Trp Ala Asn His Gln Pro Phe Thr Ser
            340                 345                 350
Lys Leu Lys Gln Arg Leu Pro Ser Thr Asp His Pro Ser Thr Asp Gly
        355                 360                 365
Gln Arg Tyr Leu Glu Gln Ser Ala Asn Val Val Gln Gln Leu Leu Gln
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Ser Gln Gly Tyr Arg Gln Val Thr Ile Asn Asp Asp Pro Asp Ser Lys
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Asp His Val Phe Gly Tyr Ser Ala Phe Asp Phe Leu Asn Gly Gln Arg
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Ala Gly Pro Val Ala Thr Tyr Phe Gln Thr Ala Leu Ala Arg Lys Asn
            420                 425                 430
Phe Val Tyr Arg Asp Asn Val Leu Val Thr Gln Val Ile Arg Asn Gly
        435                 440                 445
Ser Thr Ile Thr Gly Val Arg Thr Asn Asp Leu Thr Ile Gly Pro Asp
    450                 455                 460
Gly Ile Val Pro Leu Asn Pro Asn Gly Arg Val Ile Leu Ala Gly Gly
465                 470                 475                 480
Ser Phe Gly Thr Pro Arg Ile Leu Phe Gln Ser Gly Ile Gly Pro Thr
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Asp Met Leu Gln Val Val Gln Gly Asn Ala Gln Ala Ala Ala Asn Leu
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Pro Pro Gln Ser Gln Trp Ile Asp Leu Pro Val Gly Gln Ala Val Ser
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Asp Asn Pro Ser Ile Asn Leu Val Phe Thr His Pro Ser Ile Asp Ala
    530                 535                 540
Tyr Asp Asn Trp Ala Thr Val Trp Ser Asn Pro Arg Gln Ala Asp Ala
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Gln Gln Tyr Leu Gln Ser Arg Ser Gly Val Leu Ala Gly Ala Ser Pro
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Lys Leu Asn Phe Trp Arg Ala Tyr Gly Gly Ser Asp Gly Ile Thr Arg
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Tyr Ala Gln Gly Thr Val Arg Pro Gly Ala Ala Ser Val Asn Thr Ser
        595                 600                 605
Val Ala Tyr Asn Ala Ser Gln Ile Phe Thr Ile Thr Leu Tyr Leu Ser
    610                 615                 620
Asn Gly Ile Gln Ser Arg Gly Arg Ile Gly Val Asp Ala Ala Leu Asn
625                 630                 635                 640
Ala Lys Ala Leu Val Asn Pro Trp Leu Thr Asn Ala Val Asp Lys Thr
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Ile Leu Leu Gln Ala Leu His Asp Val Val Ser Thr Leu Asn Asn Val
            660                 665                 670
Gln Gly Leu Thr Met Ile Thr Pro Asp His Thr Met Thr Ile Glu Gln
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Tyr Val Asp Ala Tyr Asp Pro Ala Thr Met Cys Ser Asn His Trp Val
    690                 695                 700
Gly Ala Ala Lys Ile Gly Thr Ser Pro Ser Thr Ala Val Val Asp Glu
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Asn Ala Lys Val Phe Asn Thr Asp Asn Leu Phe Ile Val Asp Ala Ser
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Ile Ile Pro Ser Leu Pro Val Gly Asn Pro Gln Gly Leu Leu Met Ser
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Ala Ala Glu Gln Ala Val Ser Lys Ile Leu Ala Leu Ala Gly Gly Pro
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<210>5
<211>28
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
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<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>6
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<210>7
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<212>DNA
<213>毛革盖菌
<400>7
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<210>8
<211>456
<212>PRT
<213>毛革盖菌
<400>8
Met Phe Pro Thr Val Ser Leu Leu Ala Phe Ser Leu Leu Ala Thr Val
  1               5                  10                  15
Tyr Gly Gln Gln Val Gly Thr Leu Thr Ala Glu Asn His Pro Arg Leu
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Thr Val Gln Gln Cys Thr Ala Lys Asn Asn Cys Gln Thr Gln Gln His
         35                  40                  45
Ser Val Val Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Leu His Ala Thr Thr Gly
     50                  55                  60
Ser Asn Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Ala Leu Leu Cys Pro
 65                  70                  75                  80
Asp Ala Thr Thr Cys Ala Lys Asn Cys Ala Val Asp Gly Ala Asp Tyr
                 85                  90                  95
Ala Gly Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Asn Gly Asn Ala Leu Thr Leu Lys
            100                 105                 110
Phe Val Gln Gln Gly Pro Tyr Ser Lys Asn Ile Gly Ser Arg Val Tyr
        115                 120                 125
Leu Met Asp Ala Gln Asp Gln Lys Tyr Glu Leu Phe Asn Leu Lys Asn
    130                 135                 140
Gln Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Met Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu
145                 150                 155                 160
Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val Glu Met Asp Ala Asp Gly Gly Ala Ser
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Ser Phe Gly Thr Cys Cys Asn Glu Met Asp Val Trp Glu Ala Asn Lys
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Asn Gly Ala Ala Phe Thr Pro His Val Cys Ser Val Thr Ser Gln Thr
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Leu Cys Asp Lys Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ser Phe Arg Xaa Gly Asp
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Thr Val Val Thr Gln Phe Leu Thr Asn Asn Asn Gln Thr Ser Gly Gln
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Asp Gln Phe Cys Asn Ala Gln Lys Gln Val Phe Gly Asp Asp Asn Thr
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Gly Met Ala Leu Val Met Ser Ile Trp Asp Asp His Ala Ala Gly Met
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Leu Trp Leu Asp Ala Asp Tyr Pro Pro Thr Arg Pro Arg Pro Thr Pro
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Ile Glu Asn Ser Glu Ala Ser Ser Ser Val Thr Phe Ser Asn Ile Lys
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Val Gly Pro Ile Gly Ser Thr Phe
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<213>毛革盖菌
<400>9
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gcgttcggcg acaacaactc gttcgagagg ctcggcgggc tcaaggcgat gggcgccgcc 1260
ttcgacaagg gcatgagcct cgtcatgtcc atctgggacg accacgaggc gaagatgctc 1320
tggctcgaca gcgagtaccc cctcgacaag gacgcttcca cgcccggtgt ctctcgcggc 1380
ccctgcgcgc ggacctccgg cgagccgaag gacgtcgagt ccaacagccc cgacgcgacc 1440
gtcgtcttct ccaacatcaa gtacggcccc atcggctcga cctactaa              1488
<210>10
<211>456
<212>PRT
<213>毛革盖菌
<400>10
Met Phe Pro Ala Val Ala Leu Leu Ala Leu Ser Phe Phe Ala Ile Ala
  1               5                  10                  15
Tyr Gly Gln Gln Val Gly Thr Leu Thr Ala Glu Asn His Pro Lys Ile
             20                  25                  30
Thr Val Gln Gln Cys Thr Gly Lys Asn Ser Cys Gln Thr Leu Gln Arg
         35                  40                  45
Ser Val Val Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Leu His Ser Thr Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Asn Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Ser Ser Leu Cys Pro
 65                  70                  75                  80
Asp Pro Thr Thr Cys Ala Lys Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr
                 85                  90                  95
Ala Gly Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asn Gln Leu Ser Leu Lys
            100                 105                 110
Phe Val Thr His Gly Gln Tyr Ser Thr Asn Ile Gly Ser Arg Val Tyr
        115                 120                 125
Leu Leu Asp Gly Ser Asp Ser Lys Tyr Gln Gln Phe Asn Leu Lys Asn
    130                 135                 140
Gln Glu Phe Thr Phe Asp Ile Asp Met Ser Lys Leu Pro Cys Gly Leu
145                 150                 155                 160
Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val Glu Met Asp Ala Asp Gly Gly Leu Ser
                165                 170                 175
Arg Phe Pro Ser Asn Lys Ala Gly Ala Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys
            180                 185                 190
Asp Thr Gln Cys Pro His Asp Ile Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn
        195                 200                 205
Val Leu Gly Trp Thr Pro Ser Asp Ser Asp Pro Asn Ala Gly Ser Gly
    210                 215                 220
Gln Tyr Gly Thr Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser
225                 230                 235                 240
Met Gly Ala Ala Val Thr Pro His Val Cys Ser Val Thr Ser Gln Thr
                245                 250                 255
Arg Cys Ser Gly Thr Asp Cys Gly Asp Gly Asp Asn Arg Tyr Asn Gly
            260                 265                 270
Ile Cys Asp Lys Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ser Trp Arg Met Gly Asp
        275                 280                 285
Gln Thr Phe Leu Gly Pro Gly Lys Thr Val Asn Thr Asn Gln Lys Phe
    290                 295                 300
Thr Val Val Thr Gln Phe Leu Thr Asn Asn Asn Gln Thr Ser Gly Thr
305                 310                 315                 320
Leu Ser Glu Ile Arg Arg Leu Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Ala
                325                 330                 335
Asn Ser Lys Thr Lys Ile Pro Gly Met Asp Ala Tyr Asp Ser Ile Thr
            340                 345                 350
Asp Ala Phe Cys Asn Ala Gln Lys Gln Ala Phe Gly Asp Asn Asn Ser
        355                 360                 365
Phe Glu Arg Leu Gly Gly Leu Lys Ala Met Gly Ala Ala Phe Asp Lys
    370                 375                 380
Gly Met Ser Leu Val Met Ser Ile Trp Asp Asp His Glu Ala Lys Met
385                 390                 395                 400
Leu Trp Leu Asp Ser Glu Tyr Pro Leu Asp Lys Asp Ala Ser Thr Pro
                405                 410                 415
Gly Val Ser Arg Gly Pro Cys Ala Arg Thr Ser Gly Glu Pro Lys Asp
            420                 425                 430
Val Glu Ser Asn Ser Pro Asp Ala Thr Val Val Phe Ser Asn Ile Lys
        435                 440                 445
Tyr Gly Pro Ile Gly Ser Thr Tyr
    450                 455
<210>11
<211>1485
<212>DNA
<213>毛革盖菌
<400>11
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gtcggcacgc tcaccgccga gtcgcacccc aagctcagcg tgcagcaatg caccgccggc 120
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gaccccacca cgtgcgcggc aaactgtgcc ctcgatggcg ctgactactc tggtccgcgt 300
tgatctcacc tgaagaccct tgtgcatact caacaatccc tctaggcacc tacggtatca 360
ccaccagcgg caacgagctc aacctcaggt tcgtcacgaa gggccagtac tccaccaaca 420
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cgctctactt cgtggagatg gacaaggacg gtggctcatc ccgcttcccc accaacaagg 600
ccggctccaa gtacggtacc ggctactgcg acacccagtg cccgcacgat atcaagttca 660
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ttcaccgtcg tcacccagtt cctcaccgcg gacaacacga cgaccggcca gctcacggag 1080
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ggcgacacca actcgttcga gaagctcggc ggcctcgcgg agatgggcaa ggccttccag 1260
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ccgaccagct ctggcgtccc caccgatgtc gagtcgcaga gccccaacgc gaacgtcatc 1440
ttctccaaca tcaagaccgg ccccattggc tcgacctacg cttga                 1485
<210>12
<211>457
<212>PRT
<213>毛革盖菌
<400>12
Met Phe Pro Thr Ala Ala Leu Leu Ser Leu Ser Phe Ala Ala Ile Ala
  1               5                  10                 15
Tyr Gly Gln Gln Val Gly Thr Leu Thr Ala Glu Ser His Pro Lys Leu
             20                  25                  30
Ser Val Gln Gln Cys Thr Ala Gly Gly Ser Cys Gln Thr Leu Gln Arg
         35                  40                  45
Ser Val Val Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Leu His Ser Thr Ser Gly
     50                  55                  60
Ser Thr Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Ala Ser Leu Cys Pro
 65                  70                  75                  80
Asp Pro Thr Thr Cys Ala Ala Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr
                 85                  90                  95
Ser Gly Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asn Glu Leu Asn Leu Arg
            100                 105                 110
Phe Val Thr Lys Gly Gln Tyr Ser Thr Asn Ile Gly Ser Arg Val Tyr
        115                 120                 125
Leu Leu Ser Glu Asp Asp Ser Thr Tyr Glu Met Phe Asn Leu Asn Asn
    130                 135                 140
Gln Glu Phe Thr Phe Asp Val Asp Met Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu
145                 150                 155                 160
Asn Gly Ala Leu Tyr Phe Val Glu Met Asp Lys Asp Gly Gly Ser Ser
                165                 170                 175
Arg Phe Pro Thr Asn Lys Ala Gly Ser Lys Tyr Gly Thr Gly Tyr Cys
            180                 185                 190
Asp Thr Gln Cys Pro His Asp Ile Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn
        195                 200                 205
Val Leu Gly Trp Glu Gly Ser Pro Asn Asp Pro Asn Ala Gly Thr Gly
    210                 215                 220
Gln Tyr Gly Thr Cys Cys Asn Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Gln
225                 230                 235                 240
Asn Gly Ala Ala Val Thr Pro His Val Cys Ser Val Asp Gly Gln Thr
                245                 250                 255
Arg Cys Glu Gly Thr Asp Cys Gly Asp Gly Asp Glu Arg Tyr Asp Gly
            260                 265                 270
Ile Cys Asp Lys Asp Gly Cys Asp Phe Asn Ser Tyr Arg Met Gly Asp
        275                 280                 285
Gln Ser Phe Leu Gly Leu Gly Lys Thr Val Asp Thr Ser Lys Lys Phe
    290                 295                 300
Thr Val Val Thr Gln Phe Leu Thr Ala Asp Asn Thr Thr Thr Gly Gln
305                 310                 315                 320
Leu Thr Glu Ile Arg Arg Leu Tyr Val Gln Asp Gly Lys Val Ile Ala
                325                 330                 335
Asn Ser Lys Thr Asn Ile Pro Gly Leu Asp Ser Phe Asp Ser Ile Thr
            340                 345                 350
Asp Asp Phe Cys Asn Ala Gln Lys Glu Val Phe Gly Asp Thr Asn Ser
        355                 360                 365
Phe Glu Lys Leu Gly Gly Leu Ala Glu Met Gly Lys Ala Phe Gln Lys
    370                 375                 380
Gly Met Val Leu Val Met Ser Ile Trp Asp Asp His Ala Ala Asn Met
385                 390                 395                 400
Leu Trp Leu Asp Ser Asp Tyr Pro Thr Asp Ala Asp Pro Ser Lys Pro
                405                 410                 415
Gly Val Ala Arg Gly Pro Cys Pro Thr Ser Ser Gly Val Pro Thr Asp
            420                 425                 430
Val Glu Ser Gln Ser Pro Asn Ala Asn Val Ile Phe Ser Asn Ile Lys
        435                 440                 445
Thr Gly Pro Ile Gly Ser Thr Tyr Ala
    450                 455
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>13
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<210>14
<211>1704
<212>DNA
<213>毛革盖菌
<400>14
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tcttcctcgt cctcctgcat ctggggggtg cgtgtgctta ccactgcggt gcagtccgac 1620
gcgacggtcc ccgcacccga ggccggtacc tggttccagg cgtacttcga gaccctcgtg 1680
tccaaggcca acccgccgct gtga                                        1704
<210>15
<211>453
<212>PRT
<213>毛革盖菌
<400>15
Met Ser Lys Phe Ala Thr Leu Leu Ala Leu Leu Thr Val Val Pro Ser
  1               5                  10                  15
Leu Ala Tyr Ala Gln Ala Ser Leu Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly
             20                  25                  30
Phe Ser Gly Pro Thr Thr Cys Val Ala Gly Ala Val Cys Thr Lys Gln
         35                  40                  45
Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu Pro Gly Ala Ala Ala Pro Thr Thr
     50                  55                  60
Val Ala Pro Thr Thr Thr Pro Asn Ala Pro Thr Ser Ala Pro Gly Gly
65                   70                  75                  80
Gly Ser Pro Thr Ser Ser Ala Pro Ser Ala Pro Ser Ser Thr Pro Ala
                 85                  90                  95
Ala Gly Asn Pro Phe Asp Gly Phe Glu Ile Tyr Leu Ser Pro Tyr Tyr
            100                 105                 110
Ala Lys Glu Val Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ile Thr Asp Pro Thr Leu
        115                 120                 125
Lys Ser Lys Ala Ala Ser Val Ala Asn Ile Pro Thr Phe Thr Trp Leu
    130                 135                 140
Asp Ser Val Ser Lys Val Pro Asp Leu Gly Thr Tyr Leu Ala Asp Ala
145                 150                 155                 160
Ser Ser Ile Gln Ser Ser Thr Gly Lys Lys Gln Leu Val Pro Ile Val
                165                 170                 175
Val Tyr Asp Leu Pro Asp Arg Asp Cys Ala Ala Lys Ala Ser Asn Gly
            180                 185                 190
Glu Phe Ser Ile Ala Asp Gly Gly Ala Ala Lys Tyr Lys Asp Tyr Ile
        195                 200                 205
Asp Gln Ile Val Ala Gln Ile Lys Gln Phe Pro Asp Val Arg Val Val
    210                 215                 220
Ala Val Ile Glu Pro Asp Ser Leu Ala Asn Leu Val Thr Asn Leu Asn
225                 230                 235                 240
Val Gln Lys Cys Ala Asn Ala Glu Ala Thr Tyr Lys Ala Ser Val Thr
                245                 250                 255
Tyr Ala Leu Gln Gln Leu Ser Ser Val Gly Val Tyr Gln Tyr Met Asp
            260                 265                 270
Ala Gly His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ala Asn Ile Gln Pro Ala
        275                 280                 285
Ala Thr Leu Phe Ala Glu Met Phe Lys Ser Ala Asn Ser Ser Pro Phe
    290                 295                 300
Val Arg Gly Leu Ala Thr Asn Val Ala Asn Tyr Asn Ala Leu Thr Ala
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Ala Ser Pro Asp Pro Ile Thr Gln Asn Asn Pro Asn Tyr Asp Glu Ser
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Ala Gln Phe Val Val Asp Gln Gly Arg Ala Gly Gln Gln Asn Leu Arg
        355                 360                 365
Gln Gln Trp Gly Asp Trp Cys Asn Ile Lys Gly Ala Gly Phe Gly Thr
    370                 375                 380
Arg Pro Thr Thr Asn Thr Gly Asn Pro Leu Ile Asp Ala Ile Ile Trp
385                 390                 395                 400
Val Lys Pro Gly Gly Glu Ser Asp Gly Thr Ser Asn Ser Ser Ser Pro
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Ala Asn Pro Pro Leu
    450
<210>16
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>16
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<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>17
ggaaacagct atgaccatg                                               19
<210>18
<211>1327
<212>cDNA
<213>毛革盖菌
<400>18
aagcactcta ttgacaccgt catgttctcg tctaccctct ccttcgccgc cctcgcgctc 60
gcgctcgtcg cgcccactgc cgtcaacgct cacggtttca ttcatgaata tgagatcggc 120
ggcaagagct actccggttg gctcccgttc tcggacccct acgagagccc tgtcccgagc 180
cgcatcgagc gcaagatccc gagtgacggc cctatccttg atgtcacttc tcctgacctt 240
gcctgcaaca aggggggcga gtctggcgtc aaggccatcg ccactgcggc agcaggcagc 300
cagatcacct ttgactggaa cagttggccc gcagatcaca tgggcccggt gaccacatac 360
atggcgtctt gcaacggtga ttgcgcgtct ttcgatgcct ccaacgcgaa gtggttcaag 420
attgacgctg ccggctactc gaacggcaag tgggctgcca ccaagctcat tgagaacggc 480
gccaagtgga ccagcaccat tcccagcgag ctcaaggctg gtgaatactt ggtccgtcat 540
gagatcattg ctctccacga cgccggtgcg cctcagttct accccagctg cgctcaggtg 600
aaggtcactg gtggtggtag ccaggttccc tctggttcct ccctcgtgtc cattccgggg 660
ctctacacca ttcaggagtt cccgacatct ggtccgacag cttcaagagc tttgccattc 720
ctggacccgc ggtcgccttc agtggctcca acagcggctc tggcgattct cagcctgctg 780
cctcctcctc tacccacgcc gctacttctt cggcggcctc ccagtctgcg tcctcgacgc 840
aggttcacac ctccgcggag acctccgcgc aggcctcggc gacgtctgtt gcgtcccacg 900
catcttccgc tgcccacact tcctcggccg catccgcgtc gaagccctcg tcgacgggga 960
ccggaaggtg ctcctctaag cgcactcgcc gcggcatggt caagcgcaac gtctctcacc 1020
acgccaagcg ccaccaccat tgatttctct ttcttccttg cgctcttggc tgtctcgaga 1080
tctcgatatg cttcagagaa gcactggtcg acgggatctc aatcgatgtt gatacagatg 1140
ggttgactcc cctccgcgct ctgctcccac cgcgccgggg atagagtcct cgcgcgcggc 1200
ttccttaacg ttattcattc ctcgctccgc ataagtctcc gcatgctatg tatcggtgct 1260
gctagcccgc acgactgccc gacgattgta ccggaataca acgcgctttg tcctttgtga 1320
aaaaaaa                                                           1327
<210>19
<211>374
<212>PRT
<213>毛革盖菌
<400>19
Met Phe Ser Ser Thr Leu Ser Phe Ala Ala Leu Ala Leu Ala Leu Val
  1               5                  10                  15
Ala Pro Thr Ala Val Asn Ala His Gly Phe Ile His Glu Tyr Glu Ile
             20                  25                  30
Gly Gly Lys Ser Tyr Ser Gly Trp Leu Pro Phe Ser Asp Pro Tyr Glu
         35                  40                  45
Ser Pro Val Pro Ser Arg Ile Glu Arg Lys Ile Pro Ser Asp Gly Pro
     50                  55                  60
Ile Leu Asp Val Thr Ser Pro Asp Leu Ala Cys Asn Lys Gly Gly Glu
 65                  70                  75                  80
Ser Gly Val Lys Ala Ile Ala Thr Ala Ala Ala Gly Ser Gln Ile Thr
                 85                  90                  95
Phe Asp Trp Asn Ser Trp Pro Ala Asp His Met Gly Pro Val Thr Thr
            100                 105                 110
Tyr Met Ala Ser Cys Asn Gly Asp Cys Ala Ser Phe Asp Ala Ser Asn
        115                 120                 125
Ala Lys Trp Phe Lys Ile Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Asn Gly Lys Trp
    130                 135                 140
Ala Ala Thr Lys Leu Ile Glu Asn Gly Ala Lys Trp Thr Ser Thr Ile
145                 150                 155                 160
Pro Ser Glu Leu Lys Ala Gly Glu Tyr Leu Val Arg His Glu Ile Ile
                165                 170                 175
Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Pro Gln Phe Tyr Pro Ser Cys Ala Gln
            180                 185                 190
Val Lys Val Thr Gly Gly Gly Ser Gln Val Pro Ser Gly Ser Ser Leu
        195                 200                 205
Val Ser Ile Pro Gly Leu Tyr Thr Ile Gln Glu Phe Pro Thr Ser Gly
    210                 215                 220
Pro Thr Ala Ser Arg Ala Leu Pro Phe Leu Asp Pro Arg Ser Pro Ser
225                 230                 235                 240
Val Ala Pro Thr Ala Ala Leu Ala Ile Leu Ser Leu Leu Pro Pro Pro
                245                 250                 255
Leu Pro Thr Pro Leu Leu Leu Arg Arg Pro Pro Ser Leu Arg Pro Arg
            260                 265                 270
Arg Arg Phe Thr Pro Pro Arg Arg Pro Pro Arg Arg Pro Arg Arg Arg
        275                 280                 285
Leu Leu Arg Pro Thr His Leu Pro Leu Pro Thr Leu Pro Arg Pro His
    290                 295                 300
Pro Arg Arg Ser Pro Arg Arg Arg Gly Pro Glu Gly Ala Pro Leu Ser
305                 310                 315                 320
Ala Leu Ala Ala Ala Trp Ser Ser Ala Thr Ser Leu Thr Thr Pro Ser
                325                 330                 335
Ala Thr Thr Ile Asp Phe Ser Phe Phe Leu Ala Leu Leu Ala Val Ser
            340                 345                 350
Arg Ser Arg Tyr Ala Ser Glu Lys His Trp Ser Thr Gly Ser Gln Ser
        355                 360                 365
Met Leu Ile Gln Met Gly
    370             374
<210>20
<211>735
<212>DNA
<213>毛革盖菌
<400>20
gcgggcccgt actcgctcct gctcgaccag tggggcaagg acggcgcgac gtccggctcc 60
caatgcgcga acctcatcag cctgagcggc agtaccgtcg cgtggaagac gacctggcag 120
tggacgggcg gctccggcgt gaagagcttc acgaacatcc agctcaacga gggcctcaac 180
aagcagctca gcgcgatcaa gagcatcccc acgacgtggc agtggtcgca gagcgcgtcc 240
gggtcgatcg tcgcggacgt cgcgtacgac ctcttcacgg cgaacaccgc cgggggctcg 300
aacgtgaacg agatcatgat ctggctcgcg aacttcaacg cgggcccgat ctcgatccag 360
tacggcgcgg acggcaagcc cgtgcccgtc gcgtcgaacc tgagcctcgc gggccacacc 420
tggaacctgt acagcggctc gaacggcgcg aacgcggtgt tctcgttcct gcccacgagc 480
ggcacgatta cgagcttcag cggggacgtg aacgtgttcc tccagtactt gacgcagcac 540
cagggcgtca gcacctcgca gttcctcgtc accgcgcaag cgggtacgga gcctacatct 600
ggxtctgcga cgctcacgac gtctgcatac agcttggcta tcaactaggg agacgaaaca 660
tgtacattca gaacttgtgc cgacaggaat cacattactt cagacttccc gaaaaaaaaa 720
aaaaaaaaaa aaaaa                                                  735
<210>21
<211>216
<212>PRT
<213>毛革盖菌
<400>21
Ala Gly Pro Tyr Ser Leu Leu Leu Asp Gln Trp Gly Lys Asp Gly Ala
  1               5                  10                  15
Thr Ser Gly Ser Gln Cys Ala Asn Leu Ile Ser Leu Ser Gly Ser Thr
             20                  25                  30
Val Ala Trp Lys Thr Thr Trp Gln Trp Thr Gly Gly Ser Gly Val Lys
         35                  40                  45
Ser Phe Thr Asn Ile Gln Leu Asn Glu Gly Leu Asn Lys Gln Leu Ser
     50                  55                  60
Ala Ile Lys Ser Ile Pro Thr Thr Trp Gln Trp Ser Gln Ser Ala Ser
 65                  70                  75                  80
Gly Ser Ile Val Ala Asp Val Ala Tyr Asp Leu Phe Thr Ala Asn Thr
                 85                  90                  95
Ala Gly Gly Ser Asn Val Asn Glu Ile Met Ile Trp Leu Ala Asn Phe
            100                 105                 110
Asn Ala Gly Pro Ile Ser Phe Gln Tyr Gly Ala Asp Gly Lys Pro Val
        115                 120                 125
Pro Val Ala Ser Asn Leu Ser Leu Ala Gly His Thr Trp Asn Leu Tyr
    130                 135                 140
Ser Gly Ser Asn Gly Ala Asn Ala Val Phe Ser Phe Leu Pro Thr Ser
145                 150                 155                 160
Gly Thr Ile Thr Ser Phe Ser Gly Asp Val Asn Val Phe Leu Gln Tyr
                165                 170                 175
Leu Thr Gln His Gln Gly Val Ser Thr Ser Gln Phe Leu Val Thr Ala
            180                 185                 190
Gln Ala Gly Thr Glu Pro Thr Ser Gly Ser Ala Thr Leu Thr Thr Ser
        195                 200                 205
Ala Tyr Ser Leu Ala Ile Asn Xaa
    210                 215
<210>22
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>22
atgaagttac ttcttgctct c                                           21
<210>23
<211>21
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>23
tcacaggaag ggttcgagtg c                                           21
<210>24
<211>1889
<212>DNA
<213>Phanerochaete chrysosporium
<400>24
atgaagtact tcttgctctc agtagcagcg acgcttgccc ttagtgcacc tgcgcttggt 60
gtcgctgtct ggggccaatg cggtgtaagc atatgtgttc atatgagagg cgtacgagaa 120
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actgcgttta tctgaacgat tgtgaggtca atgtcatttc aatgccatga tttgctgacc 240
gatatccttg cagattattc gcaatgccag cccggcgcgg cgacgaccac ggtccggtcg 300
acaagtacca ttgcttcaac gacatctacc gcaccatcaa gcagcaatag cctttgctcc 360
ggcagccgca cgaagttcaa gtttttcggt gtcaatgagt ctggtgctga gttcggtaat 420
ctcaacatcc caggtgtcct aggcacggac tacacctggc cttcgccgtc cagcatcgac 480
gtaagtgata catcatatca gagctgctaa gcaggttgct gatagtgatg cactagttct 540
tcatgggcaa gggattcaac accttccgca ttccgttcct catggagcgt atgagccctc 600
ccgcgacggg cctcaccggt ccgtttgatc agacctatct gagcggtctt cagacggtac 660
gccaaacgta atagctggac cttgcgggga gtaaggctga ccatcacctt acggcagatt 720
gtcagctata tcaccggaaa ggggggctat gcgctcgtag accgtgagtg acggctcgca 780
cgcaagtagt aggaggtcat ctgatagtga aggactgcag cgcacaactt tatgatctac 840
aatggcacaa ccattagcga cacaaacgcg tgagcactcc tttagtttcg tctctgcgtt 900
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cgtcttcgta cgtctgtttc catgcgtgaa gcctgcaagg gtcgcccctg atcggtttta 1080
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cccgcagaac ctgcccattg attgattgtt tcgcagcgtg gacgacttct tccggtaatg 1440
gtgctgtctt tggtgctatc caagatccca acaacaatgt tgccatcggt gagtgcggga 1500
agcgtaccgg tctgccaagt gctcacgggt aagcgtggga aagagatgca ccagtacctc 1560
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tccggtgtct ggctcggcgc tctctggtgg gccgcaggcc catggtgggg cacggtacgt 1860
gactgacctc ttgctgcgtg tgcacgtgca gactgctcat tgctgccaca gtatttccaa 1920
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ttcctgtga                                                         1989
<210>25
<211>386
<212>PRT
<213>Phanerochaete chrysosporium
<400>25
Met Leu Lys Tyr Ala Ser Ile Ala Leu Ala Leu Ala Thr Leu Gly Val
  1               5                  10                  15
Ala Gln Gln Gln Gln Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly
             20                  25                  30
Ala Thr Thr Cys Val Ala Gly Ser Val Cys Ser Val Leu Asn Pro Tyr
         35                  40                  45
Tyr Ser Gln Cys Ile Pro Gly Ala Ala Thr Val Thr Ser Ser Ser Ala
     50                  55                  60
Pro Ser Thr Pro Thr Pro Pro Ala Gly Ala Leu Pro Arg Leu Gly Gly
 65                  70                  75                  80
Val Asn Thr Ala Gly Tyr Asp Phe Ser Val Ala Thr Asp Gly Ser Phe
                 85                  90                  95
Thr Gly Thr Gly Val Ser Pro Pro Val Ser Gln Phe Ser His Phe Ser
            100                 105                 110
Ser Gln Gly Ala Asn Leu Tyr Arg Ile Leu Phe Ala Trp Gln Leu Met
        115                 120                 125
Thr Pro Thr Leu Gly Gly Thr Ile Ser Gln Ser Phe Leu Ser Arg Tyr
    130                 135                 140
Asp Gln Thr Val Gln Ala Ala Leu Asn Ser Gly Pro Asn Val Phe Val
145                 150                 155                 160
Ile Ile Asp Leu His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gly Ile Ile Ala
                165                 170                 175
Gln Gly Gly Pro Thr Asp Ala Gln Phe Gln Ser Ile Trp Thr Gln Leu
            180                 185                 190
Ala Gln Lys Tyr Gly Ser Asn Gln Arg Val Ile Phe Gly Ile Met Asn
        195                 200                 205
Glu Pro His Asp Ile Pro Ser Ile Ser Thr Trp Val Asn Ser Val Gln
    210                 215                 220
Gly Ala Val Asn Ala Ile Arg Ala Ala Gly Ala Thr Asn Tyr Leu Leu
225                 230                 235                 240
Leu Pro Gly Ser Ser Trp Ser Ser Ala Gln Ala Phe Pro Thr Glu Ala
                245                 250                 255
Gly Pro Leu Leu Val Lys Val Thr Asp Pro Leu Gly Gly Thr Ser Lys
            260                 265                 270
Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp Asn Ser Gly Thr
        275                 280                 285
His Pro Asp Cys Thr Thr Asp Asn Val Gln Val Leu Gln Thr Leu Val
    290                 295                 300
Gln Phe Leu Gln Ala Asn Gly Asn Arg Gln Ala Ile Leu Ser Glu Thr
305                 310                 315                 320
Gly Gly Gly Asn Thr Ser Ser Cys Glu Ser Leu Leu Ala Asn Glu Leu
                325                 330                 335
Ala Tyr Val Lys Ser Ala Tyr Pro Thr Leu Ala Gly Phe Ser Val Trp
            340                 345                 350
Ala Ala Gly Ala Phe Asp Thr Thr Tyr Val Leu Thr Val Thr Pro Asn
        355                 360                 365
Ala Asp Gly Ser Asp Gln Pro Leu Trp Val Asp Ala Val Lys Pro Asn
    370                 375                 380
Leu Pro
385
<210>26
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>26
atgatacctc tccgctctgc                                             20
<210>27
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>合成DNA
<400>27
tatcttcctg atgcgattcc                                             20
<210>28
<211>2138
<212>DNA
<213>Phanerochaete chrysosporium
<400>28
atgatacctc tccgctctgc agtcgcgtcc tcactacttc tcgccagtct cggggctgcc 60
cagctcccgc tgccgaaccc tccgtgggtg ccgccgaacg caacgttcgg gacgcaccct 120
agcaatcctt ctgacgggtc cgggaacccg cactggacga atatcctcgg gagcacgctc 180
tacttctatg aagaacagcg gagcggaaag ctgcccgtta cgaaccgcgt cccgtggcga 240
aacgatagtg cgacggacga cggcagggac gtcggactgg acctgagtgg cggctactat 300
gatgctggag gttcgtattt gagtacgctc tcccgagagg tcgtctaacc ttccggtgta 360
gactacatca agtatacctt tcctatggtg cgtaacacgc agcgtactgg ttctgaaagc 420
taatgtcaat ggcgacccag tccttctctg ttatgtctat atgctggggc gcgctggatt 480
atggcaaggg taaggcaaga atttctcgtt cgctgccctc cattgaaacc cgtctgcgtt 540
aggttatgac ctcgcaaacc aaaccgcgta tctcgacgac atgctccggt ggagcctaga 600
ctggctaatg aaggtatggt caaggatata cttgcatcga cttacctact tgtctgacga 660
tgcatgtcaa ggcccatcct gacccaaaca cgctgtatgt acaaatcggg gatgcagatc 720
tggacaacgc atattgggga ggcgacagag gcatacctac accaagaact tcatatgcaa 780
tcaacagtac caggtgcgcg ctttgtcgcg ttatcctcta ggcaatacta agattttgct 840
tagccccggt acagacgccg ccgcacaagc cgccgcggct ttcgctgcct gttctgcatt 900
atacaacaat cgaacattgt cgcagcccgc acctaacggt ataacaaata catcttacgc 960
atcgacgctc cttcagcatg cgcaacaact gtatcatttt gccacaaact cttctatacc 1020
tcaagttacc taccagacgt ccgtgccgtc ggtcgccgac gcatacgcat cctccggatt 1080
ccaagacgag ctagccatcg cggctctgtt tatctcgctt gcaggaaatt ctagcgacgc 1140
ttactcgcaa gcgtctcagc tttaccgcaa gcaagggctt tctaagcact tggaagatga 1200
cgctgtgttc aactgggatg agaagtcacc cggcgtcgcc cttcttgcgg cgcagattgc 1260
gcagaagtat cctcagctcg cgaacggcac tggtgtggat tggaagagcg acctgaacaa 1320
ctacttcgat cgcatcgtca acaacagtgg cagatcattc ctaacatcag gtaagcgtgt 1380
caatctctta tcccagttct tcgtgctgac agttcgctct aggcggtctg ctttattatc 1440
caggcgattc agacgacgct acccttaacc cggcattgaa cgctgccatg ctcctcttgc 1500
gctatgccga ctcgggcttt gcatccagca gtgagaagca gtctgtttac cgccagttcg 1560
cccagtctca aatcgactat ttcttgggca ataacccaat gactggtggg tagtgttttc 1620
ttgacattat gtctatccgc gtcttactcg ttgcagtacc gtatatggtt ggcgtgcacc 1680
cgaacgcgcc atcaaaccct cattctgcct tggctacggg tgcttcaccc caggacatcg 1740
cgaacatcga cacggtccca gagcacgagg cttacgtcct ttatggcgga gtagttggag 1800
ggccgaatga tgacgacctc ttttgggacc tacggagcga ttgggtggag aacgaggttg 1860
ggctggacta cgttgccccg gtcgtgacca tcgcggcgcg ggaactcgtc agtggagcag 1920
gcgacccttg gtacacacag ctgcaggttg ggtcgtacga ggagcggaga ccgggtggcc 1980
agccttgtga tgctgcaatc tctgcgggat gtcgcggcca tgattggaga gtgggcaaga 2040
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ggatggtgtt ggcatatagg aatcgcatca ggaagata                         2138
<210>29
<211>592
<212>PRT
<213>Phanerochaete chrysosporium
<400>29
Met Ile Pro Leu Arg Ser Ala Val Ala Ser Ser Leu Leu Leu Ala Ser
  1               5                  10                  15
Leu Gly Ala Ala Gln Leu Pro Leu Pro Asn Pro Pro Trp Val Pro Leu
             20                  25                  30
Asn Ala Thr Phe Gly Thr His Pro Ser Asn Pro Ser Asp Gly Ser Gly
         35                  40                  45
Asn Pro His Trp Thr Asn Phe Leu Glu Asn Thr Leu Tyr Phe Tyr Glu
     50                  55                  60
Glu Gln Arg Ser Gly Lys Leu Pro Val Thr Asn Arg Val Pro Trp Arg
65                   70                  75                  80
Asn Asp Ser Ala Thr Asp Asp Gly Arg Asp Val Gly Leu Asp Leu Ser
                 85                  90                  95
Gly Gly Tyr Tyr Asp Ala Gly Asp Tyr Ile Lys Tyr Thr Phe Pro Met
            100                 105                 110
Ser Phe Ser Val Met Ser Ile Cys Trp Gly Ala Leu Asp Tyr Gly Lys
        115                 120                 125
Gly Tyr Asp Leu Ala Asn Gln Thr Ala Tyr Leu Asp Asp Met Leu Arg
    130                 135                 140
Trp Ser Leu Asp Trp Leu Met Lys Ala His Pro Asp Pro Asn Thr Leu
145                 150                 155                 160
Tyr Val Gln Val Gly Asp Ala Asp Leu Asp Asn Ala Tyr Trp Gly Gly
                165                 170                 175
Asp Arg Gly Ile Pro Thr Pro Arg Thr Ser Tyr Ala Ile Asn Ser Thr
            180                 185                 190
Ser Pro Gly Thr Asp Ala Ala Ala Gln Ala Ala Ala Ala Phe Ala Ala
        195                 200                 205
Cys Ser Ala Leu Tyr Asn Asn Arg Thr Leu Ser Gln Pro Ala Pro Asn
    210                 215                 220
Gly Ile Thr Ser Thr Ser Tyr Ala Ser Thr Leu Leu Gln His Ala Gln
225                 230                 235                 240
Gln Leu Tyr Asn Phe Ala Thr Asn Ser Ser Val Pro Gln Val Thr Tyr
                245                 250                 255
Gln Ala Ser Glu Pro Ser Val Ala Asp Ala Tyr Ala Ser Ser Gly Phe
            260                 265                 270
Gln Asp Glu Leu Ala Ile Ala Ala Leu Phe Ile Ser Leu Ala Gly Asn
        275                 280                 285
Ser Ser Asp Ala Tyr Pro Gln Ala Ser Gln Val Tyr Arg Lys Gln Gly
    290                 295                 300
Leu Ser Lys His Leu Glu Asp Asp Ala Val Phe Asn Trp Asp Glu Lys
305                 310                 315                 320
Ser Pro Gly Val Ala Leu Leu Ala Ala Gln Ile Ala Gln Lys Tyr Pro
                325                 330                 335
Glu Leu Ala Asn Gly Thr Gly Val Asp Trp Lys Ser Asp Leu Asn Asn
            340                 345                 350
Tyr Phe Asp Arg Ile Val Ser Asn Ser Gly Arg Ser Phe Leu Thr Ser
        355                 360                 365
Gly Gly Leu Leu Tyr Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Asp Ala Thr Leu Asn
    370                 375                 380
Pro Ala Leu Asn Ala Ala Met Leu Leu Leu Arg Tyr Ala Asp Ser Gly
385                 390                 395                 400
Leu Ala Ser Ser Ser Glu Lys Gln Ser Ala Tyr Arg Gln Phe Ala Gln
                405                 410                 415
Ser Gln Ile Asp Tyr Phe Leu Gly Asn Asn Pro Met Thr Val Gln Tyr
            420                 425                 430
Met Val Gly Val His Pro Asn Ala Pro Ser Asn Pro His Ser Ala Leu
        435                 440                 445
Ala Thr Gly Ala Thr Pro Gln Asp Ile Ala Asn Ile Asp Thr Val Pro
    450                 455                 460
Glu His Glu Ala Tyr Val Leu Tyr Gly Gly Val Val Gly Gly Pro Asn
465                 470                 475                 480
Asp Asp Asp Leu Phe Trp Asp Leu Arg Ser Asp Trp Val Glu Ser Glu
                485                 490                 495
Val Gly Leu Asp Tyr Val Ala Pro Val Val Thr Ile Ala Ala Arg Glu
            500                 505                 510
Leu Val Ser Gly Ala Gly Asp Pro Trp Tyr Thr Gln Leu Gln Ala Gly
        515                 520                 525
Ser Tyr Glu Glu Arg Arg Pro Gly Gly Gln Pro Cys Asp Ala Ala Ile
    530                 535                 540
Ser Ala Gly Cys Arg Gly His Asp Trp Arg Val Gly Lys Ile Val Met
545                 550                 555                 560
Gly Ala Leu Val Gly Val Thr Gly Leu Val Val Leu Ser Leu Gly Thr
                565                 570                 575
Val Trp Met Val Leu Ala Tyr Arg Asn Arg Ile Arg Lys Ile
            580                 585                 590
<210>30
<211>18
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>30
catggtgtgt ggtggatg                                               18
<210>31
<211>19
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>31
aagttcaaga gtctcctgt                                             19
<210>32
<211>20
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>32
ggtacagtac ttatctgtat                                            20
<210>33
<211>30
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>33
tctagattta ctggtacccc aacaacaatg                                  30
<210>34
<211>31
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>34
ccatgggttg atcgacgggt tgtcagacac g                                31
<210>35
<211>17
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>35
tctagagtca cctccgt                                                17
<210>36
<211>16
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>36
aagcttgggt actgtg                                                 16
<210>37
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>37
tctagagcca acctcgaggg gtgg                                        24
<210>38
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>38
ccatgggaac gtcgagccga tggg                                        24
<210>39
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>39
tctagagcca acgtcctcgg ctgg                                        24
<210>40
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>40
ccatgggtag gtcgagccga tggg                                         24
<210>41
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>41
tctagagcca acgtcctcgg ctgg                                         24
<210>42
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>42
ccatggagcg taggtcgagc caatg                                        25
<210>43
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>43
tctagaatct acctgagccc ttac                                       24
<210>44
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>44
ccatggctca ctagtggcga gacc                                       24
<210>45
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>45
tctagagctc acggtttcat tcatg                                      25
<210>46
<211>25
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>46
ccatggggtg tagagccccg gaatg                                      25
<210>47
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>47
tctagagcgg gcccgtactc gctc                                       24
<210>48
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
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ccatgggtaa tgtgattcct gtcg                                        24
<210>49
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>49
tctagaatga agtacttctt gctc                                        24
<210>50
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>50
ccatggcgtt tggcgtaccg tctg                                        24
<210>51
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>51
tctagacccc ggtacagacg ccgc                                        24
<210>52
<211>24
<212>DNA
<213>人工的
<220>
<223>合成DNA
<400>52
ccatgggatg ttaggaatga tctg                                        24

Claims (14)

1.一种处理木屑的方法，包括下列步骤：
制备编码反义RNA的DNA，所述反义RNA与来源于担子菌的纤维素分解酶基因转录产物的全部或一部分基本互补；
制备含有(a)所述DNA、或(b)含有所述DNA的重组DNA和具有启动子活性的DNA片段的载体，其中所述DNA与所述DNA片段结合，这样纤维素分解酶基因的反义RNA就可作为转录的结果而产生；
用所述载体转化宿主细胞，从而制备具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞；并
将所述具有被抑制的纤维素分解酶活性的宿主细胞接种到木屑中以对其进行处理。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述纤维素分解酶基因包括选自编码纤维二糖脱氢酶、纤维二糖水解酶I、纤维二糖水解酶II、属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶、属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶、属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶、和属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶的各基因的一个或多个基因。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述纤维二糖脱氢酶基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的纤维二糖脱氢酶基因：
(a)SEQ ID No.1或3所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有纤维二糖脱氢酶酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.1或3的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有纤维二糖脱氢酶酶活性的蛋白的核苷酸序列。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶I的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的纤维二糖水解酶I的基因：
(a)SEQ ID No.7、9、或11所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有纤维二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.7、9或11的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有纤维二糖水解酶I基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述纤维二糖水解酶II的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的纤维二糖水解酶II的基因：
(a)SEQ ID No.14所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有纤维二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.14的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有纤维二糖水解酶II基因的酶活性的蛋白的核苷酸序列。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶的基因：
(a)SEQ ID No.18所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.18的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有属于糖酵解酶家族61的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
7.根据权利要求2所述的方法，其中所述属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶的基因：
(a)SEQ ID No.20所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.20的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有属于糖酵解酶家族12的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
8.根据权利要求2所述的方法，其中所述属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶的基因：
(a)SEQ ID No.24所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.24的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有属于糖酵解酶家族5的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
9.根据权利要求2所述的方法，其中所述属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶的基因是含有下列核苷酸序列(a)-(c)中任何一个的分离的属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶的基因：
(a)SEQ ID No.28所示的核苷酸序列；
(b)与所含核苷酸序列与(a)中核苷酸序列互补的核苷酸序列在严格条件下杂交、并编码具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列；和
(c)包含SEQ ID No.28的一个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，并编码具有属于糖酵解酶家族9的内切葡聚糖酶活性的蛋白的核苷酸序列。
10.根据权利要求1-9任何一项所述的方法，其中担子菌是毛革盖菌或Phanerochaete chrysosporium。
11.根据权利要求1-10任何一项所述的方法，其中宿主细胞是毛革盖菌。
12.一种通过权利要求1-11任何一项所述的方法得到的木屑。
13.一种使用权利要求12所述的木屑生产纸浆的方法。
14.一种通过权利要求13所述的方法得到的纸浆。
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