CN1216996C

CN1216996C - 编码内－β－N－乙酰基葡糖胺酸酶A的基因

Info

Publication number: CN1216996C
Application number: CN961219629A
Authority: CN
Inventors: 竹川薰; 岩原章二郎
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1995-10-27
Filing date: 1996-10-26
Publication date: 2005-08-31
Anticipated expiration: 2016-10-26
Also published as: CA2187386C; EP0769550A2; EP0769550A3; CA2187386A1; US5985637A; CN1153820A

Abstract

本发明涉及编码具有内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶A活性或其功能等同变异体的分离DNA和利用重组DNA技术以所述分离的DNA生产具有内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶A活性的多肽或其功能等同变异体的方法。

Description

编码内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶A的基因

本发明涉及编码具有内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶A活性之多肽的DNA和利用所述DNA生产具有内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶A活性的之多肽的方法。

近几年来，有关称为复合糖(如糖蛋白和糖脂)之分子糖链部分的各种生理功能引起了人们的注意。现在，破坏糖的酶类充当着阐明糖链结构和生物学功能很有用的工具。尤其是内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶催化糖蛋白N-连接的糖链还原末端的二-N-乙酰壳二糖的GlcNAcβ1-4GlcNAc键断裂反应使糖链从所述蛋白质上切掉，并在蛋白质一边留下N-乙酰氨基葡糖，因此该酶已被用于糖蛋白的结构或功能分析。

同样，已知一些形式的内-β-N-乙酰氨基葡糖苷酶催化糖链重排反应；特别是已有报道，来自Arthobacter Protoformiae AKU 0647菌株的内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶(下文也称为内-A)具有非常强的糖链重排活性(日本专利公开号5-64594)。确切地说，内-A有效地催化其中被切除糖蛋白N-连接的寡甘露糖型糖链并转移至受体糖或复合糖的反应。内-A酶因此而不仅在糖蛋白糖链的结构分析中，而且在诸如复合糖糖链的修饰和新糖蛋白的制备等其它目的中非常有用。

已知形式的内-A来源于Arthrobacter protoformiae[Applied andEnvironmental Microbiology，55，3107，3112(1989)]。

然而，在培养Arthrobacter protoformiae以获得内-A的方法中，同时也产生了蛋白酶和其它的糖苷酶。从内-A中分离和纯化这些共同存在的酶类是很困难的。而且，为了诱导内-A酶的产生，必须在培养基中加入卵清蛋白或糖肽。因此需要开发一种能够以低成本生产高纯度内-A的方法。

尽管已经知道了由Arthrobacter protofomiae纯化内-A的方法(Applied and εnvironmentaeMicrobiology，55，3107-3112，1989)，但仍不了解内-A的氨基酸序列或基因结构，因此还没有用基因工程技术生产内-A的方法。

本发明的一个目的是提供含有编码具有内-A活性之多肽的核苷酸序列的DNA。

本发明的目的还在于提供含有编码具有内-A活性之多肽的DNA的重组DNA。

本发明的目的还在于提供含有上述重组DNA作为插入片段的表达载体。

本发明的目的还在于提供携带上述表达载体的转化体。

本发明的目的还在于提供利用本发明的DNA以工业规模生产具有内-A活性多肽的有利方法。

为了阐明内-A的氨基酸序列和编码内-A的核苷酸序列，本发明人生产内-A的菌株(Arthrobacter protoformiae AKU 0647)中进行了广泛的研究，并首次成功地确定了该基因的完整核苷酸序列和内-A的氨基酸序列。本发明人还成功地发展了一种在工业水平上利用内-A基因生产内-A的有利方法。基于这些事实，本发明得以完成。

在一个实施方案中，本发明涉及含有编码具有内-A活性之多肽的核苷酸序列的分离或重组DNA，或其功能等同的变异体。

在另一实施方案中，本发明涉及含有本发明的DNA或功能等同变异体的表达载体，该DNA含有编码具有内-A活性之多肽的核苷酸序列，其中所述表达载体能够在原核或真核细胞中繁殖。

在另外的实施方案中，本发明涉及用本发明表达载体转化的原核细胞或真核细胞。

在另外的实施方案中，本发明涉及生产具有内-A活性多肽或其功能等同变异体的方法，包括下列步骤；

(a)培养将表达载体导入宿主细胞获得的转化体，该表达载体含有本发明的DNA；和

(b)从步骤(a)所得的培养物中回收具有内-A活性的多肽或其功能等同的变异体。

内-A的完整氨基酸序列和编码所述酶之基因的核苷酸序列由本发明首次提出，因此，通过重组DNA技术能够有利地进行具有内-A活性多肽的工业规模生产。

图1表示经PCR扩增的DNA片段之限制性酶切图。

图2表示3kb ClaI插入片段和2.5kb HindIII/PstI插入片段的限制性酶切图。

图3表示内-A的Western印迹分析结果。

本文所使用的术语内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶被定义为具有“应用和环境微生物学”(Appied and εnvironmental Microbiology， 55，3107-3112，1989)所述的下列理化特性：

1.作用

作用于糖蛋白的N连接的糖链以断裂该糖链还原末端二-N-乙酰壳二糖的GlcNAc β1-4GlcNAc键。

2.底物特异性

作用于寡甘露糖型糖链、糖肽和糖蛋白，但不作用于复合糖链。

3.最适pH和pH稳定性

最适pH的范围是5.0-11.0，该酶在pH5.0-7.0时稳定。

4.最适温度和温度稳定性

最适温度是60℃；该酶在高达60℃时是稳定的。

本文所用术语“具有内-A活性的多肽”不仅包括天然的内-A，并且还包括基于氨基酸序列修饰作用得到的变异体，所述修饰作用例如有氨基酸残基的缺失、替换、插入或增加，只要其保留内-A活性。

本文所用的“天然内-A”包括但不限于由节杆菌产生的。也包括来源于其它微生物的，如细菌、酵母、放线菌、真菌、子囊菌和担子菌，以及那些来源于植物和动物细胞的内-A。

本文所使用的术语“功能等同的变异体”的定义如下：

天然存在的蛋白质可以因为所述蛋白质本身在体内或纯化过程中的修饰作用等，以及因为编码所述蛋白质基因的多态性和突变而在其氨基酸序列中发生氨基酸缺失、插入、增加、替换和其它改变。已经熟知的一个事实是存在一些这类在生理学或生物学方面基本上等同于无变异蛋白质的多肽。在结构上不同于所对应的蛋白质，但与所述蛋白质没有明显功能差异的多肽被称为功能等同的变异体。

相同的定义用于通过将这类变异经人工方法引入蛋白质氨基酸序列中所得的多肽。虽然因此能得到变化更大的变异体，但所得的变异体仍被看作是功能等同的变异体，只要其生理学活性基本等同于原始无变异的蛋白质。

例如，E.coli中所表达的蛋白质N端的甲硫氨酸残基通常被报道经甲硫氨酸氨肽酶的作用去掉，但有些这类被表达的蛋白质有甲硫氨酸残基，而有些则无。然而，甲硫氨酸的存在或缺乏在大多数情况下不影响蛋白质活性。同样还了解到，用丝氨酸取代人白介素2(IL-2)氨基酸序列中的特定半胱氨酸所得的肽仍保持IL-2活性(Science，224，1431，(1984))。

此外，在用基因工程生产蛋白质的过程中，所需蛋白质通常以融合蛋白的形式表达。例如，将来自其它蛋白质的N端肽链加至所需蛋白质的N端能增强所需蛋白质的表达，或者通过将适宜的肽链加至所需蛋白质的N端或C端、表达所述蛋白质和使用对所加肽链表现出亲和力的载体能够使得所需蛋白质的纯化过程更容易。

而且，对于每种氨基酸而言，已知存在1-6种有关决定某基因上特定氨基酸的密码子(三联碱基的组合)。因此，有可能存在许多编码一种氨基酸序列的基因，尽管其取决于所述氨基酸序列。实际上，基因是不稳定的，而且对于基因而言，进行核酸变异也并非罕见。基因的变异可能不影响将被编码的氨基酸序列(沉默变异)；在这种情况下，可以认为已产生了编码相同氨基酸序列的不同基因。该可能性并非微不足道，即使在编码特定氨基酸序列的基因被分离时，在形成含有所述基因的许多代生物体之后，就产生了各种编码相同氨基酸序列的基因。

此外，借助各种基因工程技术很容易经人工生产多种编码相同氨基酸序列的基因。

例如，当编码所需蛋白质的天然基因中所用的密码子在用于经基因工程生产所述蛋白质的宿主中的可用性低时，所表达的蛋白质量有时就不够多。此时，通过人为地将所述密码子转变为另一种在宿主中有高度可用性而又不改变被编码的氨基酸序列的密码子以增强所需蛋白质的表达。因此，当然有可能人为地产生各种编码一特定氨基酸序列的基因。这类人为产生的不同多核苷酸因而也包括在本发明范围内，只要编码本文所公开的氨基酸。

此外，因为所需蛋白质氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基发生至少一种改变(如缺失、增加、插入或取代)，所得的多肽通常具有与所需蛋白质在功能上相同的活性；编码这类多肽的DNA也包括在本发明的范围内，无论其是从天然来源中分离的还是经人工方法生产的。

总之，编码功能上等同之多肽的DNA核苷酸序列通常彼此表现为高同源性。能够与本发明的DNA杂交并编码具有内-A活性多肽的DNA因此也包括在本发明的范围内。

本发明在下文参照来自Arthorobacter protoformiae AKU 0647的内-A进行详细描述。

菌株Arthrobacter protoformiae AKU0647已于1991年8月14日根据布达佩斯条约保藏在日本国立生命科学和人类技术研究院(Agency of Industrial Science and Technology of 1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibarakiken，Japan)，登记号为FERM BP-4948。

1)首先，根据已公开的方法(Applied and εnviromental Microbiology， 55，3107-3112，(1989))培养Arthrobacter ProtoformiaeAKU 0647，然后从培养物中分离并纯化由所述菌株产生的内-A。

2)其次，获取有关被纯化内-A的部分氨基酸序列信息。部分氨基酸序列的测定是通过基于经常规方法进行的Edman降解直接将纯化的内-A进行氨基酸测序而在内-AN端氨基酸序列的10-20个残基区域中测得的(蛋白质测序仪476A，Applied Biosystems)。另外，通过将纯化的内-A经具有高特异性的蛋白水解酶作用(如无色杆菌蛋白酶I或N-甲苯磺酰基-L-苯丙氨酰氯甲基酮(TPCK)-胰蛋白酶)而有限地水解和用反相HPLC分离并纯化所得的肽片段来对所得的纯化肽片段进行氨基酸测序也是有效的。

3)在所得部分氨基酸序列信息的基础上克隆内-A基因。为此，应用了通用的PCR或杂交技术。

a)以部分氨基酸序列信息为基础，设计用作Southern杂交探针的合成寡核苷酸。

b)Arthrobacter，Protoformiae AKU0647的基因组DNA用适宜的限制性酶完全消化，并进行琼脂糖凝胶电泳，再将所得片段经常规方法吸印至尼龙膜上。

c)被分开的DNA片段基于部分氨基酸序列信息所设计的合成寡核苷酸的杂交反应在常用条件下进行。例如，尼龙膜在含鲑精DNA的预杂交液中封闭，加入各种³²P标记的合成寡核苷酸，继而保温过夜。洗涤尼龙膜后，进行放射自显影以检测与合成的寡核苷酸探针杂交的DNA片段。从凝胶中抽提并纯化与所检测的条带相应的DNA片段。

d)将如此所得的与合成的寡核苷探针杂交的DNA片段经常用方法插入质粒载体。有用的质粒载体包括但不限于pUC18、pUC19、pUC119和pTV118N。

e)重组的质粒然后被导入宿主以转化之。当宿主是E.coli时，其可以是野生菌株或变异菌株，只要该菌株能够被转化。这一质粒转化过程可以通过常用方法来实现，所述方法例如《分子克隆实验手册》(T.Maniatisetal.，Cold Spring HarborLaboratory Press，1982)第250页所描述的方法。

f)然后，筛选携带所需DNA片段的转化子。

为此，要利用质粒载体的特征。例如对于pUC19而言，通过筛选含有氨苄青霉素平板上的氨苄青霉素抗性菌落或筛选含氨苄青霉素、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)和异丙基-β-D-硫半乳糖吡喃糖苷(IPTG)平板上呈氨苄青霉素抗性的白色菌落来筛选具有导入外源基因的菌落。

g)将携带含有所需DNA片段之载体的菌落从上述菌群中挑选出来，这一过程可通过根据载体类型作适当选择的菌落杂交或噬菌斑杂交来进行。PCR方法也是适用的。

h)一旦挑选出含有所需DNA片段的载体，则利用常规方法测定插入到所述载体中所需DNA片段的核苷酸序列，所述方法如双脱氧链终止法(Proceedings of the National Academyof Sciences of the USA， 74，5463，(1977))。将所测得的核苷酸序列与内-A的N端序列、部分氨基酸序列、分子量等进行比较，以确定该核苷酸是所需内-A基因的完整序列或是部分序列。由如此所得的含内-A基因之DNA片段确定了内-A基因的结构和完整的氨基酸序列。

i)当含有所需DNA的载体不含全长的内-A基因时，所需全长内-A基因的获得可以通过用其它的限制性酶消化Arthrobacterprotoformia AKU 0647的基因组DNA、借助如上所述利用一部分上述所得DNA片段作探针进行杂交等获得消化片段的缺失部分和连接缺失部分。

为了获得所需基因，通过利用基于下列部分氨基酸序列信息设计的寡核苷酸引物进行的PCR方法尝试着从Arthrobacter Potoformiae AKU 0647克隆内-A基因，但克隆所需基因的努力全部失败。

鉴于这些情况，本发明人进行了更广泛的研究，首次发现通过以利用基于内-A的内部氨基酸序列设计并合成的特定合成的寡核苷酸作为用基因组DNA作模板之PCR的引物能够扩增所需的内-A基因部分。

本发明在下文进行详细描述。首先，用基于部分氨基酸序列信息和Arthrobacter protoformiae AKU 0647的基因组DNA设计的合成寡核苷酸引物作为模板进行PCR以产生所需基因片段。具体地说，合成了下列片段：根据N端氨基酸序列A-23(SEQ IDNO：5)设计的寡核苷酸引物1(SEQ ID NO：6)、根据部分氨基酸序列A-46(SEQ ID NO：7)设计的寡核苷酸引物2(SEQ ID NO：8)、根据部分氨基酸序列A-20(SEQ ID NO：9)设计的寡核苷酸引物3(SEQ ID NO：10)和根据部分氨基酸序列A-12(SEQ ID NO：11)设计的寡核苷酸引物4(SEQID NO：12)。为了便于测定扩增产物的核苷酸序列，将在引物1的5’端侧加上一个BamHI位点，在其它引物的5’端侧加上一个EcoRI位点。

PCR是根据《PCR技术》(edited by εrlich H.A.，published by Stockton Press in1989)所述方法、利用例如Gene Amp Reagent Kit(Perkin-Elmer(etas Instruments)进行的。扩增反应进行30个循环，每次循环的条件是94℃1分钟、49℃1分30秒和72℃1分30秒。在用Arthrobacter Protoformiae AKU 0647菌株的基因组DNA作模板、联合使用引物1和2进行完第一次PCR后，再用第一次反应混合物部分及联合的引物1和3进行第二次PCR；对第二次反应混合物接下来进行的凝胶电泳分析没能检测到属于被扩增DNA的清晰条带。用引物1和4的组合进行的另一次PCR在琼脂糖凝胶电泳中产生了属于被扩增DNA的特异性条带。该扩增DNA片段用例如双脱氧链终止法等常用方法进行碱基测序。检测到了对应于内-A部分氨基酸序列的序列，并成功地获得了所需内-A基因部分。当然，通过进行用如此所得基因片段作探针的杂交方法的另外程序，能够克隆编码全长内-A序列的基因。

如此所得由Arthrobacter protofomiae AKU 0647产生的编码内-A之基因的完整核苷酸序列已测定，其序列如SEQ ID NO：2所示，而且，由其推测的完整氨基酸序列也已测定，如SEQ ID NO：1所示。应该注意的是，有许多除了SEQ IDNO：2的序列外对应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列，并且所有具有这类核苷酸序列的DNA都包括在本发明范围内。本发明的DNA还包括编码具有SEQ ID NO：1氨基酸序列部分并仍保持内-A活性成功能上相等同活性之多肽的DNA。具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列部分并编码有内-A活性或功能上等同活性之多肽的DNA也包括在本发明范围内。还要包括的是能够与上述DNA杂交并编码具有内-A活性或功能上等同性之多肽的DNA。

利用如上所述已经测定的完整核苷酸序列的完整内-A基因或其部分，可以从来自除Arthrobacter protoformiae AKU0647之外生物体的基因组文库或(DNA文库中筛选编码具有内-A活性并与所述内-A高度同源的DNA。杂交反应可在常用条件下进行。例如，制备吸印了得自除Arthrobacter protoformiae AKU 0647之外生物体的基因组DNA文库或cDNA文库的尼龙膜。该尼龙膜在含6×SSC、0.5％SDS、5×Denhardt液和100μg/ml鲑精DNA的预杂交液中于65℃封闭，加入每一种³²P标记的合成的寡核苷酸探针，继而于65℃保温过夜。当尼龙膜用6×SSC于室温下漂洗10分钟一次后，再用含0.1％SDS的2×SSC于室温下漂洗10分钟一次，用含0.1％SDS的0.2×SSC于45℃漂洗30分钟一次。进行放射自显影以检测与所用探针杂交的片段。通过改变漂洗及其它条件可以得到表现为不同同源变的基因。

另一方面，用于PCR反应的引物可以由本发明基因的核苷酸序列设计。通过使用所述引物的PCR，有可能检测到与本发明基因高度同源的基因片段或得到完整基因。

为了利用本发明的内-A基因生产具有内-A活性的多肽，下述方法是有利的。

首先，用含有所需内-A基因的载体转化宿主。然后在常用条件下培养转化体以产生具有内-A活性的多肽。根据具体条件，所述多肽以包涵体的形式产生。适用的宿主包括微生物、动物细胞和植物细胞。

通过例如测定内-A活性来证实多肽的表达是有帮助的。借助已公开的方法(Applied and EnvironmentalMicrobiology， 55，3107-3112(1989))、利用重组E.coli细胞提取物作为酶溶液能够测定活性。

当观察到了所需的内-A表达时，如果该转化体是E.coli的话，通过设定有关培养基组合物、培养基pH、培养温度、所用诱导物的量、诱导时间、培养时间等适于内-A表达的理想条件能够有效地生产内-A。

内-A可用常规方法从转化体培养物中纯化出来。象E.coli这样的转化体在培养过程中于胞内积聚内-A，收集被培养的转化体细胞可通过离心、超声处理破碎细胞等方法，然后再进行离心等，以产生无细胞提取物，其可由通常的蛋白质纯化方法，如盐析和包括离子交换、凝胶过滤、疏水性和亲和层析等各种层析方法纯化。根据所用宿主-载体系统的不同，表达产物可由转化体分泌至胞外；在这种情况下，所述产物可以如上所述相同的方式从培养物上清液中纯化。

当内-A转化体产生于胞内时，各种酶同样也存在于细胞中，但纯化内-A非常容易，因为这些酶相对于内-A的量而言是以痕量存在的。当内-A被分泌至胞外，培养基成分等也同时存在。然而，这些共同存在的物质通常几乎不含能干拢内-A纯化的蛋白质成分；其有利之处在于不需进行从Arthrobacter protoformiae AKU 0647培养物中纯化内-A的艰苦分离过程。

当宿主是E.coli时，表达产物有时以不溶性包涵体形式形成。在这种情况下，培养之后离心收集细胞，超声处理予以破碎等，然后再离心等以分离含包涵体的不溶部分。洗涤后，以常用的蛋白质增溶剂如尿素或盐酸胍溶解包涵体，继而用各种层析方法纯化，例如离子交换、凝胶过滤、疏水和亲和层析；如果需要的话，在此之后通过透析或稀释进行重析叠处理，以产生保留内-A活性的所需多肽。可以用各种层析法纯化所得的标准制备物以产生具有内-A活性的高纯度多肽。

如上所述的相同过程可用于生产和纯化上述DNA的功能等同变异体。

如上所述，本发明提供了由Arthrobacter protopormiae AKU 0647产生的内-A的初级结构及其基因结构。对本发明基因结构的阐明使得能够用生物技术生产具有内-A活性的多肽或其功能等同变异体。通过使用采用了重组DNA技术的本发明方法，可以以低成本生产具有内-A活性或其功能等同变异体的高纯度多肽。

实施例

下面的实施例举例说明了本发明，但无意于以任何方式限制本发明。

实施例1克隆内-A结构基因

(1)提取和纯化基因组DNA

将内-A生产菌Arthrobacter protoformiaeAKU 0647(FERM BP-4948)接种到含有0.5％酵母提取物、0.5％胨和0.5％NaCl pH7.5的10ml培养基中，于28℃预培养18小时，之后，将10ml培养液转移至5个各含有100ml上述相同培养基的每个锥形瓶中，摇育24小时。完成培养后，将培养液离心以收集细胞，然后用EDTA盐液(0.15M NaCl、0.1M EDTA、pH8.0)洗两次，再加入0.5ml溶菌酶溶液【在TE盐液(0.1MNaCl、10mM EDTA、0.1M Tris-HCl，pH8.0)中溶解，浓度为20mg/ml】，继而于37℃振荡10分钟。接下来加入5ml 5％SDS溶液(溶解于TE盐液中)。当混合物于60℃振荡20分钟之后，加入130μl蛋白酶K(10mg/ml)，终浓度为50μg/ml，再于37℃保温3小时。然后将反应混合物冷却至室温，并在用TE缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA，pH8.0)饱和的等体积苯酚存在的条件下缓慢地搅拌。以8000rpm离心20分钟后，收集上层(下文称为苯酚提取物)。向水层中逐渐加入2倍体积的冷乙醇以沉淀DNA，然后将其缠绕在玻棒上，分别以70％、80％和90％冷乙醇溶液洗，并在空气中缓和地风干(下文称为乙醇沉淀物)。该干燥物溶解于18ml 0.1×SSC【20×SSC(3M NaCl，0.3M柠檬酸钠)稀释后使用】；加入2ml 10×SSC和100μl RNaseA(10mg/ml)(终浓度50μg/ml)，再于37℃温育1小时。反应之后，进行去和乙醇沉淀处理。所得沉淀物溶于2ml 0.1×SSC中，针对TE缓冲液透析24小时，然后进行酚/氯仿抽提、氯仿抽提和乙醇沉淀，继而离心收集DNA，再将该DNA溶于TE缓冲液中，得到基因组DNA溶液。由其吸光率测得如此所得基因组的浓度为509μg/ml。琼脂糖电泳证明基因组DNA的大小不小于24kb。

(2)测定内-A的部分氨基酸序列

用《应用和环境微生物学》(55，3107-3112，(1989))所述方法纯化的内-A直接经气相Edman裂解法测氨基酸序列，以确定N端氨基酸序列A-23(SEQ ID NO：5)。在被吡喃基乙基化之后【1nmol内-A加至用450mM N-乙基吗啉/甲酸盐缓冲液pH8.5预先平衡过的脱盐柱(Fast Desalting ColumnPC3.2/10，Pharmacia)，并用相同的缓冲液洗脱；所得洗脱液收集在玻璃小管中浓缩至干燥。分别将10μl吡啶、2μl 4-乙烯吡啶、2μl三-N-丁基膦和10μl水置于直径大于上述玻璃小管的玻璃试管中。含样品的玻璃小管被放在所述玻璃试管中；在将玻璃试管密封后，于100℃反应5分钟；反应完成后，从试管中取出玻璃小管，并彻底干燥；所得吡喃基乙基化的产物用于赖氨酰内肽酶消化】，用赖氨酰内肽酶【40μl含4M尿素的的10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、50μl10mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)、10μl 0.1M氯化钙和2pmol赖氨酰内肽酶被加入玻璃小管中，于37℃反应过夜】消化上述酶蛋白；从所得消化产物中经HPLC分离并纯化肽片段(Smart System，Pharmacia；柱，mRPC C2/C18，SC2.1/10；流速，1ml/分；洗脱液A，0.1％三氟乙酸溶液；洗脱液B，含0.1％三氟乙酸的乙腈；以加样时的0％洗脱液B至完成加样时的10％流脱液B的密度梯度进行洗脱，在此之后，洗脱液B的浓度在85分钟内增至60％)。每一肽片段都进行氨基酸测序，以确定部分氨基酸序列A-46(SEQ ID NO：7)、A-20(SEQ ID NO：9)和A-12(SEQ ID NO：11)。

(3)制备Arthrobacter protoformiae AKU0647菌株的基因文库

向上述(1)中制备的10μl基因组DNA(509μg/ml)中加入8单位Sau 3AI(Takara Shuzo)，使总体积为50μl，之后于37℃分别消化20、30、40和60秒。通过加入15μl 100mM EDTA(pH8.0)和于60℃加热20分钟在每一时间点终止上述反应。

琼脂糖凝胶电泳证明，随着反应的进行，该基因组DNA被部分酶切成约24kb-1kb。

将上述部分消化产物的溶液合并进行琼脂糖电泳；切除大小为大约4-23kb的DNA片段，用EASY TRAP(Takara Shuzo)回收DNA并进行乙醇沉淀；将所得沉淀物溶解于10μl TE缓冲液中。

利用连接试剂盒(Takara Shuzo)，使得λEMBL3臂(STRATAGENE)和所得的大约4-23kb DNA片段的各种产物在表1所示组合物中于16℃反应10分钟，以产生重组载体。

表1

λEMBL3臂	0.5μL(0.5μg)
λEMBL3臂	0.5μL(0.5μg)	DNA片段	8.5μL
3M NaCl	1.0μL	DNA片段	8.5μL
3M NaCl	1.0μL	溶液B(试剂盒中)	10μL
总计	20μL	溶液B(试剂盒中)	10μL

该反应混合物进行乙醇沉淀；所得沉淀物溶解于4ml TE缓冲液中，产生连接DNA溶液，再用Gigapack II Gold Packaging Extract(STRATAGENE)将其进行体外包装。

分别将经体外包装制备的噬菌体液1μl、5μl和10μl加入600μl E.coli P2392悬液【制备：在含10mM MgSO₄和0.2％麦芽糖的50ml TB培养基(0.5％NaCl、1.0％胨，pH7.4)中于28℃培养E.coli P2392菌株10小时，收集细胞并将细胞悬浮于10mM MgSO₄中至600nm的吸光率为0.5】，继而于37℃温育15分钟，以该噬菌体感染菌株。

接下来，向预先于50℃温育的顶部琼脂【NZY培养基(0.5％NaCl、0.5％酵母提取物、0.2％MgSO₄·7H₂O，1.0％NZ胺)、0.7％琼脂糖】中加入上述被噬菌体感染的液体，立即混合，然后将混合物倾注于预先于37℃温育的底部琼脂(NZY培养基，3％琼脂)之上，于37℃温育8小时。在证实平皿中的菌斑长成0.5-1.0mm大小时，将其贮存于冰箱(4℃)中。

出现了培养基上的噬菌斑用作基因文库。在所得菌斑中，随机选取6个检查DNA插入片段。出现6个克隆中的4个含有大约10kb DNA插入片段。

同样，进行相同的程序以产生大约10000克隆的基因文库。

(4)克隆含有内-A基因的DNA片段。

合成由上文(2)中测定N端氨基酸序列A-23(SEQ ID NO：5)设计的引物1(SEQ ID NO：6)，由部分氨基酸序列A-46(SEQ ID NO：7)设计的引物2(SEQ ID NO：8)、由部分氨基酸序列A-20(SEQ ID NO：9)设计的引物3(SEQID NO：10)和由部分氨基酸序列A-12(SEQ ID NO：11)设计的引物4(SEQ ID NO：12)。为了便于测定扩增产物的核苷酸序列，将引物1的5’端侧加上一个BamHI位点，在其它引物的5’端侧边加上一个EcoRI位点。

根据《PCR技术》(edited by εrlich H.A.，Published by Stockton Press in1989)描述的方法，使用Gene Amp试剂盒(Perkin-ElmerCetus Instruments)，以Arthrobacterprotoformiae AKU 0647菌株作模板并利用上述的引物进行PCR。该反应进行30个循环，每次循环于94℃1分钟、49℃1分30秒和72℃1分30秒。

该PCR在以引物1(SEQ ID NO：6)和引物4(SEQID NO：12)相联合的单个操作中产生了DNA片段的特异性扩增。

将以引物1和4相联合扩增的DNA片段(约1.2Kb)切除，用EASY TRAP(Takara Shuzo)收集DNA。该DNA片段用EcoRI和BamHI(Takara Shuzo)消化，并用连接试剂盒(Takara Shuzo)于质粒pBluescript(STRATAGENE)的EcoRI和BamHI位点连接。

为了绘制被扩增DNA片段(约1.2kb)的限制性图谱，用HindIII(Takara Shuzo)消化所述片段，结果显示，在该DNA片段中心附近存在一个HindIII位点(图1)。

接下来，用双脱氧链终止法分析所扩增的DNA片段，以确定距BamHl和εcoRI两位点的核苷酸序列。此外，用双脱氧链终止法还测定了所扩增DNA片段中心唯一的HindIII位点两侧的核苷酸序列。BamHI位点一侧的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：13所示；EcoRI位点一侧的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：14所示；HindIII位点的BamHI位点一侧的核苷酸序列的序列表中SEQ ID NO：15所示；HindIII位点的EcoRI位点一侧的核苷酸序列如序列表中SEQID NO：16所示。

结果，除了引物1和4的序列外，在所测的序列中发现了相当于内-A部分氨基酸序列的序列；所以成功地得到了一部分所需的内-A基因。

(5)克隆内-A基因

下一步，利用上述(4)中所得的DNA片段(约1.2kb)作为探针，筛选上述(3)中制得的基因文库。

首先，使用ECL随机引物标记系统(Amersham Corporation)并按照该系统说明的指导标记480μg扩增的DNA片段(大约1.2kb)。

利用标记的DNA片段体探针进行与上述(3)中制备的基因文库的噬菌斑杂交。进行该杂交反应是根据ECL随机引物标记系统的说明书手册中描述的方法和《分子克隆实验手册》(2nd edition，edited by Maniatiset al.，Chapter 2，p108-122，published by Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)所述方法。具体地说，将AmershamCorporation生产的尼龙膜(商标名Hybond-N⁺)切成片，并刻上1mm深的槽体记号以确定尼龙膜的方向。将其置于上述(3)所制备的基因文库平皿上。该平罩放置5分钟，然后缓慢地将尼龙膜从平皿上剥下，放到滤纸上，以0.5M NaOH温润，以正面接触平皿的上面，放置5分钟。然后将此尼龙膜转移到干滤纸上以除去水。用FUNA-UV-1-LINKERFS-800(Funakoshi)将DNA固定于尼龙膜上。用于噬菌斑杂交的滤纸于是就制成了。

所制得的滤纸在含5×SSC【1×SSC＝8.77g NaCl和4.41g柠檬酸钠溶于1升水中所得的溶液】、0.5％SDS、100μg/ml鲑精DNA和5×Denhardt′s(含牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll，各0.1％浓度)的溶液中于60℃预杂交1小时，然后如上所述标记DNA片段，并将其作为标记的探针加入，使浓度为5ng/ml(标记的探针先在沸水中加热5分钟，然后在冰中迅速淬冷)，继而于60℃杂交8小时50分钟。

下一步，将滤纸先后在含0.1％SDS1×SSC中于60℃漂洗15分钟、含0.1％SDS0.5×SSC中于60℃漂洗15分钟和于缓冲液A(0.1M Tris-HCl，pH7.5，0.6M NaCl)于25℃漂洗1分钟。接下来，为了进一步减小杂交本底，用上述系统所附带的封闭液在用缓冲液A稀释20倍后于25℃洗平皿30分钟。

然后，在含有上述系统所附带的HRP标记的抗荧光素抗体溶于1/1000体积缓冲液A(含0.5％BSA)的溶液中于25℃进行抗体反应30分钟。接下来，平皿分别在含0.5％BSA的缓冲液A中于25℃洗30分钟和在含0.1％吐温20的缓冲液A中于25℃洗10分钟。相同的程序共进行3次。

下一步，在含有上述系统所附带的检测试剂1和2的1∶1混合物的溶液中于25℃进行1分钟检测反应，之后将该滤纸以如同放置自显影相同的方式曝光20分钟。

结果，得到13个阳性噬菌斑，将每个都悬浮于500μl SM缓冲液(0.58％NaCl、0.2％MgSO₄·7H₂O，50mMTris-HCl，pH7.5，0.010％明胶)，置于室温下1小时，随后离心。收集所得上清液作为噬菌斑液，并加入1滴氯仿作为防腐剂之后贮存于4℃。

从如此所得的噬菌斑体液中收集噬菌体DNA。用该噬菌体DNA体模板，在上述(4)描述的条件下用引物1(SEQ ID NO：6)和引物4(SEQ ID NO：12)进行PCR。结果，13个DNA克隆中有2个被琼脂糖凝胶电泳证实含有所希望的大约1.2kb DNA片段。

为了纯化这两个噬菌体DNA，如上所述制备其噬菌体液，分别将对应于所述噬菌体DNA 1μl、5μl或10μl加入600μl E.coli P2392悬液中【制备：在含10mM MgSO₄和0.2％麦芽糖的50ml TB培养基(0.5％NaCl，1.0％胨，pH7.4)中于28℃培养上述菌株10小时，收集细胞和在10mM MgSO₄中悬浮细胞，至600nm吸收值为0.5】，然后在37℃培育15分钟，以噬菌体液感染该菌株。

接下来，向3ml已于50℃的加热的顶部琼脂【NZY培养基(0.5％NaCl、0.5％酵母提取物、0.2％MgSO₄0·7H₂O，1.0％NZ胺)，0.7％琼脂糖】中加入上述被噬菌体感染的液体，立即混合，之后将混合物倾注于预先于37℃加热的底部琼脂(NZy培养基，3％琼脂)，于37℃培养8小时。

将其上出现了单一噬菌斑的各个平皿分别在上述相同条件下进行噬菌体杂交。从上述所得的阳性噬菌体中每个呼菌斑挑选两个平皿，并以上述相同方式制备噬菌体液以产生噬菌体DNA。利用各种噬菌体DNA作为模板，在上述(4)的条件下以引物1(SEQ ID NO：6)和引物4(SEQ ID NO：12)进行PCR；4种噬菌体DNA中有3种被琼脂糖凝胶电泳证实含有所希望的大约1.2kb DNA片段。

为了确定所得噬菌体DNA是否一致，每种都用BamHI和HindIII(Takara Shuzo)消化；其中的两种有相同的电泳图型，而由另一种得到了不同的电泳图型。

因此已成功地克隆了一部分所需内-A基因。在所得到的两种噬菌体DNA中(噬菌体DNA1和噬菌体DNA10)，噬菌体DNA1用于下面的实验，这是考虑到操作上的简便性而为。

(6)亚克隆内-A基因

上述(5)中得到的DNA克隆1用限制性酶ClaI、HindIII、PstI和SalI(Taraka Shuzo)中的每一种进行消化，然后用琼脂糖凝胶电泳，然后，根据《分子克隆实验手册》(2nd edition，edited by Maniatiis et al.，Chapter 9，p31-58，publishedby Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)所述方法，以上述(5)中标记的DNA片段(大约1.2kb)作为探针于60℃杂交12小时。

结果，用ClaI消化所得的大约3kb DNA与在上述(5)中标记的DNA片段(大约1.2kb)杂交。回收表现为杂交反应的大约3kbDNA片段，并与pBluescript sk(-)(STRATAGENE)的ClaI位点连接。该质粒命名为ClaI-3kb。ClaI-3kb插入片段的限制性酶图如图2所示。

用双脱氧链终止法测定该质粒插入片段的核苷酸序列。尽管在插入片段中发出了编码N端区的引物1和引物4的序列，但在C末端编码区方向的只含有的引物4末端大约0.3kb的部分。为了获得编码完整(端区的DNA片段，即HindIII-ClaI片段(大约0.9kb)，以上述(5)中所述方法相同的方式标记最靠近C端编码区的插入片段。利用该标记片段作探针，用HindIII、KpnI、PstI、PvuII、HindIII-KpnI、HindIII-PstI和HindIII-PvuII的各种酶切上述(5)中得到的DNA克隆1，然后进行琼脂糖凝胶电泳，在此之后，根据《分子克隆实验手》(2nd edition，edited by Maniatis et al.，Chapter 9，p31-58，published by Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)所述方法于60℃杂交12小时。

结果，用HindIII-PstI消化的大约2.5kb DNA与所用探针杂交。回收表现出杂交反应的约2.5kb DNA片段，并与pBluescript sk(-)(STRATAGENE)的HindIII-PstI连接。该质粒命名为HindIII/PstI-2.5kb。HindIII/PstI-2.5kb中插入片段的限制性图如图2所示。

用双脱氧链终止法测定上述质粒插入片段的核苷酸序列；发现所测定的序列中含有来自ClaI-3kb的HindIII-ClaI片段(约0.9kb)，在其3′侧有终止密码子。

通过将质粒HindIII/PstI-2.5kb和ClaI-3kb相结合就能够知到全长的内-A基因。内-A开放阅读码(ORF)的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：4所示，由其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：3所示。同样，以发现有关上述(2)中所得内-A的N端氨基酸序列A-23(SEQ ID NO：5)为基础，编码内-A核苷酸序列的例子如序列表中SEQ ID NO：2所示；由其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。

实施例2构建内-A表达质粒

(1)构建含全长内-A基因的质粒

用质粒ClaI-3kb中的插入片段取代质粒HindIII/2.5kb中的HindIII-ClaI片段以产生ClaI-PstI质粒，其含有编码全长内-A的基因。如此所得含全长内-A基因的质粒命名为pEACP。

用pEACP转化的E.coli XL1-Blue菌株被称为E.coli XL1-Blue/pEACP。以pEACP转化E.Coli XL1-Blue菌株并被称为E.coli XL1-Blue/pEACP的菌株已根据布达佩斯条约于1995年10月5日保藏于日本国立生命科学和人类技术学研究所(Agency of Industrial Science and Technology of1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibara-kiken，Japan)，登记号为FERM BP-5581。

(2)测定内-A活性

在含100μg/ml氨苄青霉素的5ml 2XTY培养基中于37℃培养E.Coli XL1-Blue/pEACP大约10小时。将该培养物肉汤的一部分离心，所得的上清液作为制粗制酶溶液用《应用及环境微生物学》( 55，3107-3112，1989)所述方法测定内-A活性。具体地说，在与表2所示组合物的反应于37℃进行1小时后，观察到大约9mU/ml的内-A活性。

表2

8mM	Dansylated asparagine glycopeptide	5μL
8mM	Dansylated asparagine glycopeptide	5μL	200mM	乙醇盐缓冲液(pH6.0)	10μL
粗制酶溶液	5μL			乙醇盐缓冲液(pH6.0)	10μL
粗制酶溶液	5μL			总计	20μL
	反应终止剂		5μL	总计	20μL

(3)内-A的Western印迹

为了确定从上述(2)的E.coli XL1-Blue/pEACP制得的粗制内-A溶液中的内A是否与从Arthrobacter protoformiae AKU0647菌株中得到的内-A一致，用《分子克隆实验室手册》(2nd edition，edited by Maniatis et al.，Chapter 18，p60-74，publishedby Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)所述方法进行Western印迹。用《分子克隆实验手册》(出处同前)18章第3-17页的方法制备所用的内-A抗体，用《应用及环境微生物学》(出处同前)的方法纯化内-A。结果如图3所示，其中第一道表示利用由Arthrobacterprotoformiae AKU 0647菌株制得的15ng内-A所得出的结果，第2道表示利用由上述(2)中的E.coli XL1-Blue/pEACP制备的粗制酶溶液的约2μg蛋白质获得的结果。

由图3可见，E.coli XL1-Blue/pEACP的内-A被证明是与从Arthrobacter protoformia AKU 0647菌株所得内-A相同的。

对本发明上述实施方案所作出的对于本领域技术人员是显而易见的那些改变意欲包括在权利要求的范围内。

序列表

(1)一般信息：

(iii)序列数：16

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：621个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Ser Thr Tyr Asn Gly Pro Leu Ser Ser His Trp Phe Pro Glu Glu

1 5 10 15

Leu Ala Gln Trp Glu Pro Asp Ser Asp Pro Asp Ala Pro Phe Asn

20 25 30

Arg Ser His Val Pro Leu Glu Pro Gly Arg Val Ala Asn Arg Val

35 40 45

Asn Ala Asn Ala Asp Lys Asp Ala His Leu Val Ser Leu Ser Ala

50 55 60

Leu Asn Arg His Thr Ser Gly Val Pro Ser Gln Gly Ala Pro Val

65 70 75

Phe Tyr Glu Asn Thr Phe Ser Tyr Trp His Tyr Thr Asp Leu Met

80 85 90

Val Tyr Trp Ala Gly Ser Ala Gly Glu Gly Ile Ile Val Pro Pro

95 100 105

Ser Ala Asp Val Ile Asp Ala Ser His Arg Asn Gly Val Pro Ile

110 115 120

Leu Gly Asn Val Phe Phe Pro Pro Thr Val Tyr Gly Gly Gln Leu

125 130 135

Glu Trp Leu Glu Gln Met Leu Glu Gln Glu Glu Asp Gly Ser Phe

140 145 150

Pro Leu Ala Asp Lys Leu Leu Glu Val Ala Asp Tyr Tyr Gly Phe

155 160 165

Asp Gly Trp Phe Ile Asn Gln Glu Thr Glu Gly Ala Asp Glu Gly

170 175 180

Thr Ala Glu Ala Met Gln Ala Phe Leu Val Tyr Leu Gln Glu Gln

185 190 195

Lys Pro Glu Gly Met His Ile Met Trp Tyr Asp Ser Met Ile Asp

200 205 210

Thr Gly Ala Ile Ala Trp Gln Asn His Leu Thr Asp Arg Asn Lys

215 220 225

Met Tyr Leu Gln Asn Gly Ser Thr Arg Val Ala Asp Ser Met Phe

230 235 240

Leu Asn Phe Trp Trp Arg Asp Gln Arg Gln Ser Asn Glu Leu Ala

245 250 255

Gln Ala Leu Gly Arg Ser Pro Tyr Asp Leu Tyr Ala Gly Val Asp

260 265 270

Val Glu Ala Arg Gly Thr Ser Thr Pro Val Gln Trp Glu Gly Leu

275 280 285

Phe Pro Glu Gly Glu Lys Ala His Thr Ser Leu Gly Leu Tyr Arg

290 295 300

Pro Asp Trp Ala Phe Gln Ser Ser Glu Thr Met Glu Ala Phe Tyr

305 310 315

Glu Lys Glu Leu Gln Phe Trp Val Gly Ser Thr Gly Asn Pro Ala

320 325 330

Glu Thr Asp Gly Gln Ser Asn Trp Pro Gly Met Ala His Trp Phe

335 340 345

Pro Ala Lys Ser Thr Ala Thr Ser Val Pro Phe Val Thr His Phe

350 355 360

Asn Thr Gly Ser Gly Ala Gln Phe Ser Ala Glu Gly Lys Thr Val

365 370 375

Ser Glu Gln Glu Trp Asn Asn Arg Ser Leu Gln Asp Val Leu Pro

380 385 390

Thr Trp Arg Trp Ile Gln His Gly Gly Asp Leu Glu Ala Thr Phe

395 400 405

Ser Trp Glu Glu Ala Phe Glu Gly Gly Ser Ser Leu Gln Trp His

410 415 420

Gly Ser Leu Ala Glu Gly Glu His Ala Gln Ile Glu Leu Tyr Gln

425 430 435

Thr Glu Leu Pro Ile Ser Glu Gly Thr Ser Leu Thr Trp Thr Phe

440 445 450

Lys Ser Glu His Gly Asn Asp Leu Asn Val Gly Phe Arg Leu Asp

455 460 465

Gly Glu Glu Asp Phe Arg Tyr Val Glu Gly Glu Gln Arg Glu Ser

470 475 480

Ile Asn Gly Trp Thr Gln Trp Thr Leu Pro Leu Asp Ala Phe Ala

485 490 495

Gly Gln Thr Ile Thr Gly Leu Ala Phe Ala Ala Glu Gly Asn Glu

500 505 510

Thr Gly Leu Ala Glu Phe Tyr Ile Gly Gln Leu Ala Val Gly Ala

515 520 525

Asp Ser Glu Lys Pro Ala Ala Pro Asn Val Asn Val Arg Gln Tyr

530 535 540

Asp Pro Asp Pro Ser Gly Ile Gln Leu Val Trp Glu Lys Gln Ser

545 550 555

Asn Val His His Tyr Arg Val Tyr Lys Glu Thr Lys His Gly Lys

560 565 570

Glu Leu Ile Gly Thr Ser Ala Gly Asp Arg Ile Tyr Leu Glu Gly

575 580 585

Leu Val Glu Glu Ser Lys Gln Asn Asp Val Arg Leu His Ile Glu

590 595 600

Ala Leu Ser Glu Thr Phe Val Pro Ser Asp Ala Arg Met Ile Asp

605 610 615

Ile Lys Ser Gly Ser Phe

620

(2)SEQ ID NO：2的信息

(i)序列特征：

(A)长度：1863bp

(B)类型：核型

(C)链数：双链

(D)拓朴学：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(vi)来源：

(A)Arthrobacter protoformiae

(B)AKU 0647

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

TCTACGTACA ACGGCCCGCT GTCCTCCCAT TGGTTTCCAG AGGAACTTGC CCAATGGGAA 60

CCAGACAGTG ATCCAGACGC ACCCTTTAAC AGAAGCCATG TTCCGCTGGA ACCAGGCCGC 120

GTTGCGAATA GGGTAAATGC TAATGCAGAC AAGGACGCAC ACCTTGTTTC GTTGTCCGCG 180

CTAAACAGGC ATACATCAGG TGTTCCATCG CAAGGAGCGC CAGTTTTCTA TGAAAATACG 240

TTCAGCTATT GGCATTATAC AGATTTGATG GTTTATTGGG CTGGTTCAGC TGGCGAAGGC 300

ATTATCGTTC CGCCAAGTGC CGATGTCATT GATGCATCGC ACCGAAATGG GGTGCCGATT 360

TTAGGAAATG TGTTCTTCCC GCCGACGGTT TATGGAGGGC AGCTAGAGTG GCTAGAACAA 420

ATGTTAGAGC AAGAGGAGGA CGGTTCATTC CCCCTTGCTG ACAAATTGCT AGAAGTCGCA 480

GACTATTATG GGTTTGACGG CTGGTTTATT AACCAAGAAA CAGAAGGGGC AGACGAAGGA 540

ACAGCCGAAG CCATGCAAGC TTTTCTCGTT TATTTGCAGG AACAAAAGCC AGAAGGCATG 600

CACATCATGT GGTATGACTC GATGATTGAT ACAGGGGCGA TCGCCTGGCA AAACCATTTA 660

ACGGATCGAA ATAAAATGTA CTTGCAAAAT GGCTCGACCC GCGTCGCTGA CAGCATGTTT 720

TTGAACTTTT GGTGGCGTGA CCAGCGCCAA TCGAACGAAT TGGCACAAGC ACTTGGCAGG 780

TCTCCGTATG ACCTCTATGC CGGAGTGGAT GTGGAAGCAC GAGGGACAAG TACCCCTGTT 840

CAGTGGGAAG GCCTGTTTCC TGAAGGAGAA AAGGCGCATA CATCACTCGG GTTATACCGT 900

CCAGATTGGG CATTTCAGTC AAGTGAAACA ATGGAAGCGT TTTATGAAAA AGAACTACAA 960

TTTTGGGTTG GCTCGACAGG AAATCCAGCC GAAACAGACG GCCAGTCAAA TTGGCCTGGC 1020

ATGGCGCACT GGTTTCCCGC GAAAAGCACC GCTACTTCGG TACCCTTTGT GACTCACTTT 1080

AATACGGGCA GCGGCGCTCA GTTTTCGGCA GAAGGCAAAA CTGTGTCGGA ACAGGAATGG 1140

AATAACCGCA GCCTTCAAGA TGTGCTGCCG ACATGGCGCT GGATTCAGCA TGGCGGCGAT 1200

TTAGAGGCAA CATTTTCTTG GGAAGAAGCG TTTGAAGGGG GAAGCTCGTT ACAATGGCAT 1260

GGCTCATTAG CGGAAGGAGA ACACGCCCAA ATCGAGCTCT ATCAAACAGA GTTGCCGATA 1320

AGCGAAGGCA CTTCGCTAAC GTGGACATTT AAAAGCGAGC ACGGCAACGA TTTAAATGTG 1380

GGCTTCCGTT TAGATGGGGA AGAGGACTTC CGTTATGTGG AAGGAGAACA GCGTGAATCG 1440

ATAAATGGTT GGACGCAGTG GACGTTGCCG CTGGATGCGT TTGCTGGTCA GACGATAACA 1500

GGGCTGGCAT TTGCAGCGGA AGGGAATGAG ACTGGGCTGG CAGAATTCTA TATTGGACAA 1560

CTGGCCGTAG GTGCTGATAG CGAAAAGCCT GCCGCTCCAA ACGTGAACGT ACGCCAGTAC 1620

GACCCAGACC CGAGTGGCAT TCAGCTCGTA TGGGAAAAAC AAAGCAACGT CCACCATTAC 1680

CGCGTTTATA AAGAAACAAA GCACGGCAAA GAGCTAATTG GCACATCTGC TGGAGATCGA 1740

ATTTACCTAG AAGGCCTAGT CGAGGAAAGC AAACAAAACG ACGTGCGTCT GCATATAGAA 1800

GCACTAAGTG AAACATTTGT GCCAAGTGAT GCTCGCATGA TCGACATAAA AAGCGGCTCG 1860

TTT 1863

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：645个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

Leu Arg Lys Ala Phe Leu Val Gly Leu Val Cys Thr Ala Cys Val

1 5 10 15

Leu Leu His Asp Asp Pro Val Ala Ala Ser Thr Tyr Asn Gly Pro

20 25 30

Leu Ser Ser His Trp Phe Pro Glu Glu Leu Ala Gln Trp Glu Pro

35 40 45

Asp Ser Asp Pro Asp Ala Pro Phe Asn Arg Ser His Val Pro Leu

50 55 60

Glu Pro Gly Arg Val Ala Asn Arg Val Asn Ala Asn Ala Asp Lys

65 70 75

Asp Ala His Leu Val Ser Leu Ser Ala Leu Asn Arg His Thr Ser

80 85 90

Gly Val Pro Ser Gln Gly Ala Pro Val Phe Tyr Glu Asn Thr Phe

95 100 105

Ser Tyr Trp His Tyr Thr Asp Leu Met Val Tyr Trp Ala Gly Ser

110 115 120

Ala Gly Glu Gly Ile Ile Val Pro Pro Ser Ala Asp Val Ile Asp

125 130 135

Ala Ser His Arg Asn Gly Val Pro Ile Leu Gly Asn Val Phe Phe

140 145 150

Pro Pro Thr Val Tyr Gly Gly Gln Leu Glu Trp Leu Glu Gln Met

155 160 165

Leu Glu Gln Glu Glu Asp Gly Ser Phe Pro Leu Ala Asp Lys Leu

170 175 180

Leu Glu Val Ala Asp Tyr Tyr Gly Phe Asp Gly Trp Phe Ile Asn

185 190 195

Gln Glu Thr Glu Gly Ala Asp Glu Gly Thr Ala Glu Ala Met Gln

200 205 210

Ala Phe Leu Val Tyr Leu Gln Glu Gln Lys Pro Glu Gly Met His

215 220 225

Ile Met Trp Tyr Asp Ser Met Ile Asp Thr Gly Ala Ile Ala Trp

230 235 240

Gln Asn His Leu Thr Asp Arg Asn Lys Met Tyr Leu Gln Asn Gly

245 250 255

Ser Thr Arg Val Ala Asp Ser Met Phe Leu Asn Phe Trp Trp Arg

260 265 270

Asp Gln Arg Gln Ser Asn Glu Leu Ala Gln Ala Leu Gly Arg Ser

275 280 285

Pro Tyr Asp Leu Tyr Ala Gly Val Asp Val Glu Ala Arg Gly Thr

290 295 300

Ser Thr Pro Val Gln Trp Glu Gly Leu Phe Pro Glu Gly Glu Lys

305 310 315

Ala His Thr Ser Leu Gly Leu Tyr Arg Pro Asp Trp Ala Phe Gln

320 325 330

Ser Ser Glu Thr Met Glu Ala Phe Tyr Glu Lys Glu Leu Gln Phe

335 340 345

Trp Val Gly Ser Thr Gly Asn Pro Ala Glu Thr Asp Gly Gln Ser

350 355 360

Asn Trp Pro Gly Met Ala His Trp Phe Pro Ala Lys Ser Thr Ala

365 370 375

Thr Ser Val Pro Phe Val Thr His Phe Asn Thr Gly Ser Gly Ala

380 385 390

Gln Phe Ser Ala Glu Gly Lys Thr Val Ser Glu Gln Glu Trp Asn

395 400 405

Asn Arg Ser Leu Gln Asp Val Leu Pro Thr Trp Arg Trp Ile Gln

410 415 420

His Gly Gly Asp Leu Glu Ala Thr Phe Ser Trp Glu Glu Ala Phe

425 430 435

Glu Gly Gly Ser Ser Leu Gln Trp His Gly Ser Leu Ala Glu Gly

440 445 450

Glu His Ala Gln Ile Glu Leu Tyr Gln Thr Glu Leu Pro Ile Ser

455 460 465

Glu Gly Thr Ser Leu Thr Trp Thr Phe Lys Ser Glu His Gly Asn

470 475 480

Asp Leu Asn Val Gly Phe Arg Leu Asp Gly Glu Glu Asp Phe Arg

485 490 495

Tyr Val Glu Gly Glu Gln Arg Glu Ser Ile Asn Gly Trp Thr Gln

500 505 510

Trp Thr Leu Pro Leu Asp Ala Phe Ala Gly Gln Thr Ile Thr Gly

515 520 525

Leu Ala Phe Ala Ala Glu Gly Asn Glu Thr Gly Leu Ala Glu Phe

530 535 540

Tyr Ile Gly Gln Leu Ala Val Gly Ala Asp Ser Glu Lys Pro Ala

545 550 555

Ala Pro Asn Val Asn Val Arg Gln Tyr Asp Pro Asp Pro Ser Gly

560 565 570

Ile Gln Leu Val Trp Glu Lys Gln Ser Asn Val His His Tyr Arg

575 580 585

Val Tyr Lys Glu Thr Lys His Gly Lys Glu Leu Ile Gly Thr Ser

590 595 600

Ala Gly Asp Arg Ile Tyr Leu Glu Gly Leu Val Glu Glu Ser Lys

605 610 615

Gln Asn Asp Val Arg Leu His Ile Glu Ala Leu Ser Glu Thr Phe

620 625 630

Val Pro Ser Asp Ala Arg Met Ile Asp Ile Lys Ser Gly Ser Phe

635 640 645

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1935bP

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

TTGAGAAAAG CTTTTTTAGT CGGTCTTGTT TGCACAGCGT GTGTATTGCT CCATGATGAT 60

CCAGTTGCCG CATCTACGTA CAACGGCCCG CTGTCCTCCC ATTGGTTTCC AGAGGAACTT 120

GCCCAATGGG AACCAGACAG TGATCCAGAC GCACCCTTTA ACAGAAGCCA TGTTCCGCTG 180

GAACCAGGCC GCGTTGCGAA TAGGGTAAAT GCTAATGCAG ACAAGGACGC ACACCTTGTT 240

TCGTTGTCCG CGCTAAACAG GCATACATCA GGTGTTCCAT CGCAAGGAGC GCCAGTTTTC 300

TATGAAAATA CGTTCAGCTA TTGGCATTAT ACAGATTTGA TGGTTTATTG GGCTGGTTCA 360

GCTGGCGAAG GCATTATCGT TCCGCCAAGT GCCGATGTCA TTGATGCATC GCACCGAAAT 420

GGGGTGCCGA TTTTAGGAAA TGTGTTCTTC CCGCCGACGG TTTATGGAGG GCAGCTAGAG 480

TGGCTAGAAC AAATGTTAGA GCAAGAGGAG GACGGTTCAT TCCCCCTTGC TGACAAATTG 540

CTAGAAGTCG CAGACTATTA TGGGTTTGAC GGCTGGTTTA TTAACCAAGA AACAGAAGGG 600

GCAGACGAAG GAACAGCCGA AGCCATGCAA GCTTTTCTCG TTTATTTGCA GGAACAAAAG 660

CCAGAAGGCA TGCACATCAT GTGGTATGAC TCGATGATTG ATACAGGGGC GATCGCCTGG 720

CAAAACCATT TAACGGATCG AAATAAAATG TACTTGCAAA ATGGCTCGAC CCGCGTCGCT 780

GACAGCATGT TTTTGAACTT TTGGTGGCGT GACCAGCGCC AATCGAACGA ATTGGCACAA 840

GCACTTGGCA GGTCTCCGTA TGACCTCTAT GCCGGAGTGG ATGTGGAAGC ACGAGGGACA 900

AGTACCCCTG TTCAGTGGGA AGGCCTGTTT CCTGAAGGAG AAAAGGCGCA TACATCACTC 960

GGGTTATACC GTCCAGATTG GGCATTTCAG TCAAGTGAAA CAATGGAAGC GTTTTATGAA 1020

AAAGAACTAC AATTTTGGGT TGGCTCGACA GGAAATCCAG CCGAAACAGA CGGCCAGTCA 1080

AATTGGCCTG GCATGGCGCA CTGGTTTCCC GCGAAAAGCA CCGCTACTTC GGTACCCTTT 1140

GTGACTCACT TTAATACGGG CAGCGGCGCT CAGTTTTCGG CAGAAGGCAA AACTGTGTCG 1200

GAACAGGAAT GGAATAACCG CAGCCTTCAA GATGTGCTGC CGACATGGCG CTGGATTCAG 1260

CATGGCGGCG ATTTAGAGGC AACATTTTCT TGGGAAGAAG CGTTTGAAGG GGGAAGCTCG 1320

TTACAATGGC ATGGCTCATT AGCGGAAGGA GAACACGCCC AAATCGAGCT CTATCAAACA 1380

GAGTTGCCGA TAAGCGAAGG CACTTCGCTA ACGTGGACAT TTAAAAGCGA GCACGGCAAC 1440

GATTTAAATG TGGGCTTCCG TTTAGATGGG GAAGAGGACT TCCGTTATGT GGAAGGAGAA 1500

CAGCGTGAAT CGATAAATGG TTGGACGCAG TGGACGTTGC CGCTGGATGC GTTTGCTGGT 1560

CAGACGATAA CAGGGCTGGC ATTTGCAGCG GAAGGGAATG AGACTGGGCT GGCAGAATTC 1620

TATATTGGAC AACTGGCCGT AGGTGCTGAT AGCGAAAAGC CTGCCGCTCC AAACGTGAAC 1680

GTACGCCAGT ACGACCCAGA CCCGAGTGGC ATTCAGCTCG TATGGGAAAA ACAAAGCAAC 1740

GTCCACCATT ACCGCGTTTA TAAAGAAACA AAGCACGGCA AAGAGCTAAT TGGCACATCT 1800

GCTGGAGATC GAATTTACCT AGAAGGCCTA GTCGAGGAAA GCAAACAAAA CGACGTGCGT 1860

CTGCATATAG AAGCACTAAG TGAAACATTT GTGCCAAGTG ATGCTCGCAT GATCGACATA 1920

AAAAGCGGCT CGTTT 1935

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：22个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：N端片段

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

Ser Thr Tyr Asn Gly Pro Leu Ser Ser His Xaa Phe Pro Glu Glu

1 5 10 15

Leu Ala Gln Xaa Glu Pro Asp

20

(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

GTTTGGATCC TTYCCNGARG ARYTNGCNCA 30

(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：32个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部片段

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

Ala Ala His Leu Val Ser Leu Ser Ala Leu Asn Arg His Thr Ser

1 5 10 15

Gly Val Pro Ser Gln Gly Ala Pro Val Phe Tyr Glu Asn Thr Phe

20 25 30

Ser Tyr

(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

GTTTGAATTC ANAGTRTTYT CRTARAANAC 30

(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：27个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部片段

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

Ala His Thr Ser Leu Gly Leu Tyr Arg Pro Asp Trp Ala Phe Gln

1 5 10

Ser Ser Glu Thr Met Glu Ala Phe Tyr Glu Ser Leu

20 25

(2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：33bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

GTTTGAATTC TCRTARAANG CYTCCATNGT YTC 33

(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：25个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：肽

(v)片段类型：内部片段

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

Ser Thr ALa Thr Ser Val Pro Phe Val Thr His Phe Asn Thr Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ala Gln Phe Ser Ala Glu Gly Lys

20 25

(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：30bp

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸(合成DNA)

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

GTTTGAATTC TGRTTRAART GNGTNACRAA 30

(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：260bp

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

GGATCCTTTC CCGGAGAGCT TGCGCAATGG GAACCAGACA GTGATCCAGA CGCACCCTTT 60

AACAGAAGCC ATGTTCCGCT GGAACCAGGC CGCGTTGCGA ATAGGGTAAA TGCTAATGCA 120

GACAAGGACG CACACCTTGT TTCGTTGTCC GCGCTAAACA GGCATACATC ARGTGTTCCA 180

TCGCAAGGAG CGCCAGTTTT CTATGAAAAT ACGTTCAGCT ATTGGCATTA TACAGATTTG 240

ATGGTTTATT GGGCTGGTTC 260

(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：359bp

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

KGTGCGTGGA CCAGCGCCAA TCGAACGAAT TGCACAAGCA CTTTGGCAGG TCTCCGTATG 60

ACCTCTATGC CGGAGTGGAT GTGGAAGCAC GAGGACAAGT ACCCCKGTTC AGTGGAAGGC 120

CTGTTTCCTG AAGGAGAAAA GGCGCATACA TCACTCGGGT TATACCGTCC AGATTGGGCA 180

TTTCAGTCAA GTGAAACAAT GGAAGCGTTT TATGAAAAAG AACTACAATT TGGGGTTGGC 240

TCGACAGGAA ATCCAGCCGA AACAGACGGC CAGTCAAATT GGCCTGGCAT GGGGCACTGG 300

TTTCCCGCGA AAAGCACCGC TACTTCGGTA CCCTTTGTAA CTCACTTTAA CACGAATTC 359

(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：322bp

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

GCTATTGGCA TTATACMAGA TTTGATGGTT TATTGGGCTG GTTCAGCTGG SCGAAGNCAT 60

TAATCGTTCC GVCCAAGTGC CGATGTCATT GATGCATCGC ACCGAAATGG GGTGCCGATT 120

TTAGGAAATG TGTTCTTCCC GCCGACGGTT TATGGAGGGC AGCTAGAGTG GCTAGAACAA 180

ATGTTAGAGC AAGAGGAGGA CGGTTCATTC CCCCTTGCTG ACAAATTGCT AGAAGTCGCA 240

GACTATTATG GGTTTGACGG CTGGTTTATT AACCAAGAAA CAGAAGGGGC AGACGAAGGA 300

ACAGCCGAAG CCATGCAAGC TT 322

(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：335bp

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓朴结构：线性

(ii)分子类型：基因组DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

AAGCTTTTCT CGTTTATTTG CAGGAACAAA AGCCAGAAGG CATGCACATC ATGTGGTATG 60

ACTCGATGAT TGATACAGGG GCGATCGCCT GGCAAAACCA TTTAACGGAT CGAAATAAAA 120

TGTACTTGCA AAATGGCTCG ACCCGCGTCG CTGACAGCAT GTTTTTGAAC TTTTGGTGGC 180

GTGACCAGCG CCAATCGAAC GAATTGRCAC AARRCACTTG GCAGGTCTCC RTATGACCTC 240

TADTRCCGGA GTAGATGTGG AAGCACGAGG GACAAGTACC CCTGTTCAGT GGGAAGRCCT 300

GTTTCCTGAA GAGAAAGGCG CATACATVAC TCVNG 335

Claims

1.编码具有内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶A活性的分离的DNA，该分离的DNA选自：

(a)具有SEQ ID NO：2核苷酸序列的DNA；

(b)具有编码SEQ ID NO：1氨基酸序列的核苷酸序列的DNA；

(c)在含有5×SSC、0.5％SDS、100μg/ml鲑精DNA和5×Denhardt’s的溶液中，在60℃下能够与(a)杂交的DNA序列，其中1×SSC＝8.77g NaCl和4.41g柠檬酸钠溶于1升水中所得的溶液，5×Dehardt’s溶液含有牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和Ficoll，各0.1％浓度。

2.根据权利要求1的分离的DNA，其中的多肽来源于节杆菌属的菌株。

3.根据权利要求2的分离的DNA，其中的多肽来源于保藏号为FERM BP-4948的Arthrobacter protoformiae AKU0647菌株。

4.一种重组DNA，含有权利要求1-3中任一项的DNA序列。

5.含有权利要求4之重组DDN的载体。

6.根据权利要求5的载体，其中所述重组DNA有效地与启动子连接。

7.用权利要求5或6的载体转化的细胞。

8.生产由权利要求1-3中任一项的DNA编码的多肽的方法，包括下列步骤：

(a)培养权利要求7的细胞，和

(b)从步骤(a)所得培养物中回收具有内-β-N-乙酰基葡糖胺酸酶A活性的多肽。