WO2003062412A1

WO2003062412A1 - Fucane sulfate

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Publication number: WO2003062412A1
Application number: PCT/JP2003/000334
Authority: WO
Inventors: Takeshi Sakai; Hitomi Amarume; Katsushige Ikai; Ikunoshin Kato
Original assignee: Takara Bio Inc.
Priority date: 2002-01-18
Filing date: 2003-01-17
Publication date: 2003-07-31
Also published as: JPWO2003062412A1; US20050255564A1; EP1466969A1; JP4262601B2; EP1466969A4

Description

明細書硫酸化フカン技術分野

本発明は糖鎖工学分野において有用な硫酸ィ匕フカンを分解する酵素、該酵素の製造方法、並びに糖鎖工学用試薬として有用な硫酸ィ匕フカンオリゴ糖及びそれらの製造方法に関する。背景技術

褐藻類には何種類もの硫酸化多糖が含まれている。これらの硫酸ィ匕多糖は硫酸化フカンあるいはフコィジンと総称されることが多いが、その構造は由来となる海藻により異なる。例えば、 Fu c u s v e s i c u l O S U Sヽ刃コメ、マコンブ、ォキナヮモズク、モズク、ワカメメカブそれぞれから抽出される硫酸化多糖は異なる構造を持つ（例えば、酒井武、他 1名、「バイオサイエンスとインダストリー」、 2002年 6月、第 60卷、第 6号、 p. 377— 380参照。）。また、一般に一種の海藻から硫酸ィ匕多糖画分を調製すると、数種の分子種の硫酸ィ匕多糖が混在してレ、る。

これまでに構造が決定された硫酸ィ匕多糖の分子種としては、硫酸化フカン（例えば、国際公開第 99/41288号パンフレツト参照。 ) 、硫酸ィ匕フコダルクロノマンナン（例えば、国際公開第 96/34004号パンフレット、国際公開第 02/0861 16号パンフレツト参照。）、硫酸化フコガラタタン（例えば、国際公開第 00ノ 50464号パンフレット参照。）、硫酸化ダルクロノフカン (例えば、国際公開第 01Z81560号パンフレツト参照。 ) 等が挙げられる。硫酸化フカン画分には強い抗凝血活性（例えば、国際公開第 99/41288号パンフレット参照。）、硫酸ィ匕フコグルクロノマンナン画分には癌細胞に対するアポトーシス誘導活性（例えば、国際公開第 97Z26896号パンフレット参照。）が報告されている等、硫酸ィヒ多糖は一般に何らかの生物活性を持つことが多い。そのため、硫酸化多糖を医薬品として開発する試みがなされている。 JP03/00334

2 硫酸ィヒ多糖を医薬品として開発する際、その構造を決定する必要が生じるが、その硫酸ィ匕多糖を分解する酵素を用いれば構造を決定する際に非常に有利である。しかし褐藻類の硫酸ィ匕多糖を分解する酵素は市販されておらず、しかも褐藻類の硫酸化多糖は海藻の種によつて異なるため、硫酸ィヒ多糖の構造を決めるにはその硫酸化多糖を特異的に分解する酵素が必要となる。

Fu c u s v e s i c u l o s u s由来硫酸ィ匕フカンは抗凝血作用、クラミジァの子宮表皮細胞への定着阻害作用、アレルギー反応抑制作用、移植臓器の拒絶抑制作用等を持つことが報告されている（例えば日本特許第 3042543号公報参照）。これらの活性と構造の関係を解明するため Fu c u s v e s i c u 1 o s u sや A s c o p h y 1 1 urn n o d o s u m由来硫酸匕フカンの構造が研究されている力物理ィ匕学的な分析によりその平均的な構造が提唱されているものとして、酸加水分解により一部のオリゴ糖を調製し構造を解明したもの (L i o n e l C h e v o 1 o t、他 4名、「C a r b o h y d r a t e R e s e a r c h」、 2001年、第 330卷、 p. 529— 535) が挙げられる。該文献には、非還元末端糖の第 2位と第 3位の炭素に硫酸基が結合した硫酸化フカンの構造式が開示されている。しかしながら、構造を決定したオリゴ糖画分は全体の 2 %程度であり、そのオリゴ糖画分は種々の分子量のォリゴ糖の混合物であり、還元性末端糖及び非還元性末端糖も一定ではない。すなわち、提唱された構造が全フコィダンの主鎖構造であることが証明されていないばかり力 \ 生産効率も低く、構造の均一なオリゴ糖に分離することは困難である。

また、 Fu cu s v e s i c u l o s u sや A s c o p hy l l um n o d o s umから硫酸ィ匕フカン画分を調製すると、数種の分子種の硫酸化多糖が混在している。一般に、目的とする生物活性を担う分子種以外の硫酸ィ匕多糖は不必要であり、時には不必要な分子種が副作用を誘発させるだけの場合もある。

また、構造的に均一な F u c s v e s i c u l o s u sや A s c o p h y

1 1 um n o d o s um由来硫酸化フカンのオリゴ糖を、再現性よく調製できれば生物活性と構造の関係を解明する際非常に有用である。例えば、褐藻類由来硫酸化多糖画分に含まれる硫酸化フカンを分解してオリゴ糖を生成させる酵素 (例えば、国際公開第 99/ 1288号パンフレツト参照）が知られているが、この酵素はコンブ目褐藻類の硫酸ィ匕フカンによく作用して硫酸化フカンォリゴ糖を生成させる力 ^¾、 F u c u s v e s i c u l o s u sや A s c o p hy l 1 u m n o d o s um等のヒバマタ目褐藻類の硫酸ィ匕フカンには作用しない。さらに、国際公開第 96/34004号パンフレット、国際公開第 02Z08611 6号パンフレツト記載の硫酸化フコダルク口ノマンナンを分解する酵素、国際公開第 00/50464号パンフレツト記載の硫酸ィ匕フコガラタタンを分解する酵秦は、 Fu c u s v e s i c u l o s u sや A s c o p hy l l um n o d o s um等のヒバマタ目褐藻類の硫酸化フカンには作用しない。発明の目的

以上のことから、ヒパマタ目褐藻類由来硫酸ィ匕多糖画分に含まれる分子種のそれぞれを特異的に分解する酵素、酵素的に製造した構造が均一なオリゴ糖、及びそれらの製造方法が求められてレ、た。

すなわち、本発明の目的は、糖鎖工学的に有用なヒバマタ目褐藻類由来硫酸ィ匕フカンを分解する酵素、該酵素の製造方法、及び硫酸ィ匕フカンに該酵素を作用させて得られるオリゴ糖及びその製造方法を提供することにある。発明の概要

本発明者らは鋭意研究の結果、フコフイラス属に属する細菌の 1菌株、フコフィラスフコイダノリイティカス（Fu c o p h i l u s f c o i d a n o l y t i c u s) S I— 1234力新規な硫酸ィ匕フカン分解酵素を生産することを見出し、該酵素の製造方法を見出した。また、該酵素を利用してヒバマタ目褐藻類由来硫酸化多糖画分から構造の均一な新規な硫酸化フカンォリゴ糖を製造できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明の第 1の発明は、フコフイラス属細菌の培養物から得られた硫酸化フカン分解酵素に関する。

本発明の第 1の発明において、該酵素は、硫酸化フカン分角酵素生産能を有するフコフィラス属細菌を培養し、その培養物から採取することができる。

本発明の第 1の発明において、硫酸化フカン分解酵素は特に限定はされないが例えば、エンド型 α— (1-4) Lーフコシダーゼ、ェキソ型 Lーフコシダーゼ、硫酸化フカン低分子化酵素 Α、硫酸化フカンデァセチラーゼおよびそれらの任意の組み合わせが含まれる。

エンド型ひ一 (1-4) L—フコシダーゼとしては、下記の理ィ匕学的性質を有するものが例示される：

(I) 下記式（V) で表される硫酸ィ匕フカンオリゴ糖に作用して、 α— (1— 4) L—フコシル結合をエンド的に切断する；

(I I) 約 6〜8の範囲に至適 ρΗを有する；

(I I I) 約 10〜40°Cに至適温度を有する；

(I V) 分子量：ゲルろ過法にて測定した場合、約 11万〜 13万である。

ェキソ型 Lーフコシダーゼは、下記の理化学的性質を有することを特徴とする：

(I) 硫酸化フカンに作用して、 Lーフコース残基をェキソ的に切断する；硫酸ィ匕フカン低分子化酵素 Aの理ィ匕学的性質は以下の通りである。

(I) 作用：硫酸化フカンに作用して、硫酸基を切断し、硫酸を遊離する（硫酸化フカンスルファターゼ）。硫酸化フカンの低分子化を促進する。

硫酸ィ匕フカンデァセチラ一ゼの理ィ匕学的性質は以下の通りである。

(I) 作用：硫酸ィ匕フカンに作用して、酢酸を遊離する。硫酸化フカンの低分子化を促進する。

本発明の第 2の発明は、褐藻類由来硫酸化多糖に本発明の第 1の発明の硫酸化フ力ン分解酵素を作用させて得られる硫酸化フカンオリゴ糖に関する。

本発明の第 2の発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、褐藻類由来硫酸化多糖に本発明の第 1の発明の硫酸化フカン分解酵素を作用させて取得することを特徴とする硫酸化フカンォリゴ糖の製造方法によって調製することができる。

本発明の第 3の発明は、下記一般式 (I) で表される糖ィ匕合物又はその塩に関する。

(式中、 Rは H又は S0₃ H又は CH₃ CO又は下記一般式（VI I) であり、は H又は S0₃ H又は CH₃ COである。 R、 Rェのうち少なくとも 1つは S0₃ Hである。 nは 1以上の整数である。）

(式中、 Rは H又は SO₃ H又は CH₃ COである。）

本発明の第 4の発明は、下記一般式 (I) で表される硫酸化フカンオリゴ糖又はその塩に関する。

(式中、 Rは H又は S0₃ H又は CH₃ CO又は下記一般式（VI I) であり、は H又は S0₃ H又は CH₃ COである。 R、 Rェのうち少なくとも 1つは S0₃ Hである。 nは：！〜 4の整数である。）

(式中、 Rは H又は SO₃ H又は CH₃ COである。）

本発明の第 5の発明は、本発明の第 1の発明の硫酸化フカン分解酵素をヒバマタ目褐藻類由来硫酸化多糖に作用させて下記一般式（VI I I) で表される硫酸化フカンオリゴ糖を製造する製造方法に関する。

(式中、 Rは H又は SO H又は CH₃ CO又は下記一般式（VI I) であり Rのうち少なくとも 1つは SO Hである。 nは 1以上の整数である。）

(式中、 Rは H又は SO H又は CH₃ COである）図面の簡単な説明

図 1 ：本発明により得られる硫酸化フカン分解酵素の pHと相対活性（％) の関係を表すグラフである。

図 2 ：本発明により得られる硫酸化フカン分解酵素の温度 (°C) と相対活性 (%) の関係を表すグラフである。

図 3 ：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖 1一（1) の¹ H— NMR スぺクトを示す図である。

図 4 ：本発明により得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一 (1) の^{1 3} C-NM Rスぺクトルを示す図である。

図 5 ：本発明により得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一 (1) の質量分析（マス）スぺクトルを示す図である。

図 6 ：本発明により得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一（2) の¹ Η— NMR スぺクトルを示す図である。

図 7 ：本努明により得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一 (2) の^{1 3} C-NM Rスぺクトルを示す図である。

図 8 ：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖 1一 (2) の質量分析（マス）スぺクトノレを示す図である。 JP03/00334

8 図 9 ：本発明により得られる硫酸化フカンオリゴ糖 1— (3) の¹ H— NMR スぺクトルを示す図である。

図 10 ：本発明により得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一 (3) の^{1 3} C-N MRスぺクトルを示す図である。

図 11 ：本発明により得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一 (3) の質量分析

(マス）スぺクトルを示す図である。

図 12 ：本発明により得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一（4) の¹ H— NM Rスぺクトルを示す図である。

図 13 ：本発明により得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糠 1一（4) の^{1 3} C-N MRスぺクトルを示す図である。

図 14 ：本発明により得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一（4) の質量分析 (マス）スぺクトルを示す図である。

図 15 ：本発明により得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一 (5) の¹ H— NM Rスぺクトルを示す図である。

図 16 ：本発明により得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一 (5) の^{1 3} C-N

MRスぺクトルを示す図である。

図 17 ：本発明により得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一 (5) の質量分析 (マス）スぺクト^"を示す図である。

図 18 ：本発明により得られるエンド型 α— （1—4) L一フコシダーゼの ρ Ηと相対活性 (%) の関係を表すグラフである。

図 19 ：本発明により得られるエンド型 α— (1-4) L—フコシダーゼの温度（°C) と相対活性 (%) の関係を表すグラフである。発明の詳細な説明

以下本発明に関して具体的に説明する。

本発明の糖ィ匕合物を得るための原料としては、特に限定されるものではないが、例えば、 Fu c u s v e s i c u l o s u s、 As c o phy l l um n o d o s um等ヒバマタ目の褐藻類由来の硫酸化フカンが使用できる。該ヒバマタ目褐藻類は本発明の糖化合物の生産効率が高く原料として好適である。本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素とは、褐藻類由来硫酸化フカンに作用して還元性末端にフコースを持つォリゴ糠を生成させる酵素である。

本発明の硫酸ィ匕フカン由来オリゴ糖は、硫酸ィ匕フカンに本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素を作用させて得られるオリゴ糖で、還元性末端糖がフコースである。本発明で使用する硫酸ィ匕フカンを製造する際にはまず、褐藻類を水性溶媒で抽出し、硫酸化多糖画分を得る。その際硫酸化フカンの低分子化を防ぐためには、 p Hは 4〜 9、温度は 100 °C以下が好ましい。また、上記硫酸化多糖画分中のァミノ酸や低分子性の色素等は限外ろ過で効率良く除去できる。疎水性物質の除去 ίこは活性炭処理等も有効である。

このようにして褐藻類の硫酸化多糖画分を得ることができる。該硫酸化多糖画分、硫酸化フカンを含有する画分である硫酸化フカン画分、硫酸化フカンのいずれもが本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素の基質として使用できる。該画分を陰ィォン交換カラムで分離すればより純度の高い硫酸化フカンを得られる。上記の硫酸化多糖画分も陰イオン交換カラムで精製した硫酸ィヒフカンもともに本発明の硫酸化フカン分解酵素を精製する際の活性測定用基質、及び硫酸化フカンォリゴ糖製造時の原料として使用できる。

本発明の硫酸化フカン分解酵素の製造に使用される細菌としては、硫酸化フカン分解酵素を生産する細菌であれば特に限定はないが例えば、フコフィラスフコイタノリティカス (Fu c o p h i l u s f u c o i d a n o l y t i c u s) S I— 1234株が挙げられる。

なお、上記のフコフィラスフコイダノリティカス S I _ 1234株はナマコの腸内より本発明者らが新たに検索して得た細菌で、その菌学的性質は次のとおりである。

a. 形態的性質

本菌は直径 1. 2〜： 1. 6 μπιの球菌である。

胞子の有無なし

グラム染色性陰性

b . 生理的性質

(1) 生育温度 25°Cで生育する。 (2) 酸素に対する態度好気性

(3) カタラーゼ陽性

(4) ォキシダーゼ陰性

(5) 塩類要求性

0 %食塩培地での生育陰性

1 %食塩培地での生育陰性

海水培地での生育陽性

(6) キノン系メナキノン 7

(7) 菌体内 DNAの GC含量 52%

(8) OF—テスト酸を生成しない

(9) 集落の色調特徴的な集落色素を生成せず

(10) 運動性陰性

(1 1) 滑走性陰性

(12) 鞭毛なし

本菌株は、バージーズマニュアルォブディターミネイティブバタテリォ口ンー ι,β e r g e y s M a n n u a 1 o f De t e rmi n a t i v e B a c t e l i o l o gy) , 第 9卷（1994) に記載の基本分類によればグループ 4 (グラム陰性好気性桿菌及び球菌）に分類される。しかし本菌株は、電子伝達鎖にメナキノン 7を有し、 G C含量が 52 %とレヽぅ点でグループ 4 に属する菌と大いに異なる。

そこで、本菌株の 16 S r RN Aをコードする DN Aの塩基配列を決定し、既知の細菌と相同性を比較したところ 16 S r RNAをコードする DNAの全域（約 1500塩基）にわたつて相同性の高い既知菌株は存在しなかった。 16 S r RNAをコードする DN Aの全配列の相同性が 90%以下の場合、両細菌の属が同じであることはない。一方 DNAデータベースに登録されている 16 S r RNAをコードする DNAの配列をもとに、系統樹を作成したところ、本菌株と類縁の細菌は総て V e r r u c omi c r o b i aに属するものであった。そこで、本発明者らは、遺伝子的分類において本菌株は V e r r u c omi c r o b i aの新属の細菌であると断定し、フコフィラスフコイダノリティカス S 1 -1234と命名した。

なお、上記菌株は Fucophilus fucoidanolyticus SI-1234と表示され、日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央第 6 (郵便番号 305— 8566) 独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに FERM P-17517 として平成 1 1年 8月 18日（原寄託日）より寄託され、プダぺスト条約に基づき上記独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに F E RM BP 一 7495として平成 13年 3月 7日（移管日）より寄託されている。

本菌株の 1 6 S r RNAをコードする DN Aの配列を配列表の配列番号 1に記載する。従って、 16 S r RNAをコードする DNAの配列より、フコフィラスフコイダノリティカス S I— 1234と同属と判断される細菌から得られた硫酸ィ匕フカン分解酵素も本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素に含まれる。すなわち、菌学的にフコフィラスフコイダノリティカス S I— 1234と同属と判断される細菌に加え、その 16 S r RNAをコードする DNAの配列がフコフィラスフコイダノリティカス S I— 1234と同属と判定できる細菌はフコフィラス属細菌であると判断される。

本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素を生産する細菌を培養するにあたり、培地に加える栄養源は使用する微生物が利用し、該酵素を生産するものであればよく、炭素源としては、例えば、硫酸化フカン、 Fu c u s v e s i c u l o s u sや A s c o p h y 1 urn n o d o s u m等の?毎藻、アルギン酸、ラミナラン、フコース、グノレコース、マンニトーノレ、グリセ口一ノレ、サッカロース、マノレトース、デンプン等が利用でき、窒素源としては、酵母エキス、ペプトン、カザミノ酸、コーンスティープリカ一、肉エキス、脱脂大豆、硫安、塩化アンモニゥム、尿素、尿酸等が適当である。その他にナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシゥム、亜鉛等の塩化物、リン酸塩、硫酸塩等を加えてもよい。なお、一般に海水から採取した微生物は、海水あるいは市販の人工海水中で極めて生育し易い。

また、培養条件は使用する微生物、培地組成等に応じ、本発明の硫酸化フカン分解酵素の生産量が最大になるように設定するが、一般に培養温度は 15〜3

0 °C、培地の pHは 5〜9がよく、 5〜72時間の通気攪拌培養で本発明の硫酸化フカン分解酵素の生産量は最高に達する。培養終了後、遠心分離で菌体と培養上清に分画し、それぞれから本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素を得ることができる。上記のフコフィラスフコイダノリィティカス S I— 1234を適当な培地で培養し、その菌体を集め、通常の細胞破砕手段、例えば超音波処理で菌体を破砕すると無細胞抽出液が得られる。次いでこの抽出液から通常の精製手段により、硫酸ィ匕フカン分解酵素を精製することもできる。例えば、塩析、イオン交換カラムクロマト、疎水カラムクロマト、ゲルろ過等により精製した本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素を得られる。また、上述の培養上清中にも本発明の硫酸化フカン分解酵素が存在するので、菌体内酵素と同様の精製手段で精製できる。本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素は、少なくとも以下の 4種類の酵素、エンド型ひ一 l- 4) L—フコシダーゼ、ェキソ型 L—フコシダーゼ、硫酸化フカン低分子化酵素 A、硫酸ィ匕フカンデァセチラーゼを含む。

本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素の理ィ匕学的性質は以下の通りである。

(I) 作用：硫酸化フカンに作用して、フコースを還元性末端に持つオリゴ糖を生成させる。

(I I) 至適 pH：本酵素の至適 pHは 7. 0〜8. 5付近にある（図 1 ) 。すなわち図 1は本酵素の反応時の p Hと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性 (%) 、横軸は pHを示す。

(I I I) 至適温度：本酵素の至適温度は約 30〜40°C付近にある（図 2) 。すなわち、図 2は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性 (%) 、横軸は温度 (°C) を示す。

本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素の一例であるエンド型 α— (1-4) L—フコシダーゼの理ィヒ学的性質は以下の通りである。

(I) 下記式（V) で表される硫酸化フカンオリゴ糖に作用して、ひ一（1— 4) Lーフコシル結合をェンド的に切断する；

(I I) 至適 pH：本酵素の至適 pHは 6〜 8付近にある（図 18)。

すなわち図 18は本酵素の反応時の p Hと相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性 (%) 、横軸は pHを示す。

(I I I) 至適温度：本酵素の至適温度は約 10〜40°C付近にある（図 19) 。すなわち、図 18は本酵素の反応時の温度と相対活性の関係を表すグラフであり、縦軸は相対活性 (%) 、横軸は温度 (°C) を示す。

(I V) ) 分子量：ゲルろ過法にて測定した場合、約 11万〜 13万である。本発明の硫酸化フカン分解酵素の一例であるェキソ型 L一フコシダーゼの理ィ匕学的性質は以下の通りである。

(I) 作用：硫酸ィ匕フカンに作用して、 Lーフコース残基をェキソ的に切断する。本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素の一例である硫酸ィヒフカン低分子化酵素 Aの理化学的†生質は以下の通りである。

(I) 作用：硫酸ィ匕フカンに作用して、硫酸基を切断し、硫酸を遊離する（硫酸ィ匕フカンスノレファターゼ）。硫酸化フカンの低分子化を促進する。

本発明の硫酸ィヒフカン分解酵素の一例である硫酸化フカンデァセチラ一ゼの理化学的性質は以下の通りである。

(I) 作用：硫酸化フカンに作用して、酢酸を遊離する。硫酸化フカンの低分子化を促進する。本発明の硫酸化フカン分解酵素は、硫酸ィ匕フカン分解活性を測定して確認でき、生産菌の無細胞抽出液でも、各種カラムクロマトで精製後の酵素溶液でも確認でさる。

フコブイラスフコイダノリティカス S 1 - 1 2 3 4株は硫酸ィ匕フカンを資ィ匕する微生物であり、硫酸化フカンを分解するために菌体内及び菌体外に本発明の硫酸化フカン分解酵素を生産する。

本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、本発明の硫酸化フカン分解酵素を硫酸化フカン、若しくは硫酸ィ匕フカン含有物に作用させて調製できる。硫酸ィ匕フカン含有物としては、例えば硫酸ィ匕フカンの部分精製品、褐藻類由来硫酸化多糖画分、褐藻類の水性溶媒抽出物、若しくは褐藻類藻体が好適に使用できる。

本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を調製する際、硫酸化フカン、若しくは硫酸ィ匕フ力ン含有物の溶解は定法で行えばよく、溶解液中の硫酸化フカン、若しくは硫酸ィ匕フカン含有物はその最高溶解濃度でもよいが、通常はその操作性、反応に使用する本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素の量等を考慮して選定すればよい。硫酸化フカンの溶解液としては、水、緩衝液等より目的に応じて選択すればよい。溶解液の p Hは通常中性付近で、酵素反応は通常 3 0 °C付近で行う。反応に使用する本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素の使用量、反応液の組成、反応時間等の調整により、碎酸化フカンオリゴ糖の分子量を調整できる。この様にして得られた本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖を分子量分画あるいは陰イオン交換カラムで分画して、更に均一な分子量の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を調製できる。分子量分画は定法、例えばゲルろ過法や限外ろ過法を使用すればよい。低分子化物は、必要に応じて更にイオン交換樹脂処理、活性炭処理等の精製操作を行ってもよく、必要に応じて脱塩処理、無菌処理、凍結乾燥処理もできる。これらの方法で、後述のごとく、 NMR分析で構造決定可能な均一な構造の本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を得られる。

本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、硫酸基を分子中に有しており、該基は種々の塩基と反応し、塩を形成する。本発明の硫酸化フカンオリゴ糖は、塩になった状態が安定であり、通常ナトリゥム及び Z又は力リゥム及び/又はカルシウム等の塩の形態で提供される。これらの物質の塩はダウエックス 5 O W等の陽イオン交換樹脂を利用して遊離の本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖に導ける。また、これらは、必要に応じ公知慣用の塩交換を行い所望の種々の塩に交換できる。

本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖は、薬学的に許容される塩、例えばナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カルシウム、マグネシウム、亜鉛等のアルカリ土類金属、アンモニア等の塩とすることができる。

本発明の糖化合物、硫酸化フカンオリゴ糖は、その非還元末端糖の第 2位、第 3位の炭素に水酸基が結合しているのが特徴である。さらに、本発明の糖化合物、硫酸化フカンオリゴ糖においては、ァセチル基、フコシル基が結合していてもよい。

本発明の硫酸化フカン分解酵素は硫酸ィ匕フカンを低分子化するため硫酸ィ匕フカンの構劍军析に使用できる。また、本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖は糖鎖工学用試薬として使用できる。例えば、特公平 5— 6 5 1 0 8号公報記載の方法により 2—アミノビリジルイ匕（P A化）を行い、後述のごとく該オリゴ糖の P A化物を調製すれば、種々の硫酸化フカン分解酵素の基質として使用できるなど糖鎖工学用試薬として極めて有用な物質を提供できる。また、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖を抗原として、抗体を作製することができ、該抗体は硫酸化多糖の構造の特定に使用できる。

実施例

以下に本発明を実施例をもって具体的に示すが、本発明は以下の実施例の範囲のみに限定されるものではない。

参考例 1 Fucus vesiculosus由来硫酸化多糖画分の調製

乾燥した Fucus vesiculosus藻体を粉碎し、その l k gを 1 0リツトルの 8 0 %ェタノールに懸濁し、 2 5 ^DCで 3時間攪拌後ろ過、洗浄し残さを得た。その残さを 3 0リットルの 1 0 O mM 塩ィ匕ナトリウムを含む 3 O mM リン酸緩衝液（p H 6 . 5 ) 中に懸濁し、 9 5 °Cで 2時間処理後、 3 0 °Cに冷却し、 1 0 0 gの活性炭、 3 0 0 0 Uのアルギン酸リアーゼ（ナガセ生化学工業製）、及ぴ 3 . 7 5リツトルのエタノールを添加し 2 4時間攪拌後、遠心分離して上清を得た。その上清を排除分子量 1 0万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機で 4リットルに濃縮後、 1 0 O mM 塩化ナトリウムで溶媒を置換した。この溶液を⁴。 C まで冷却し、 0 . 5 N 塩酸で p Hを 2 . 0とし、生じた沈殿を遠心分離で除去し、上清を得た。その上清の p Hを 1 N 水酸化ナトリウムで 8 . 0とし、上記の限外ろ過機で 2リットルに濃縮後、 2 O mM 塩化ナトリゥムで溶媒を置換し、遠心分離で不溶物を除去後、凍結乾燥して 8 0 gの Fucus vesiculosus由来硫酸化多糖画分を得た。

参考例 2 Ascophyllum nodosum由来硫酸化多糖画分の調製

市販の Ascophyllum nodosum粉末 1 k g力ら、参考例 1の方法で 1 0 0 gの Ascophyllum nodosum由来硫酸化多糖画分を得た。

参考例 3 ガゴメコンブ由来硫酸ィヒ多糖画分の調製

市販の乾燥ガゴメコンブをカッターミル（増幸産業製）で破碎してチップとし、

1 k gのチップから、参考例 1の方法で 3 8 gのガゴメコンプ由来硫酸化多糖画分を得た。

参考例 4 Fucus vesiculosus由来硫酸化フカン画分の調製

7 gの参考例 1記載の Fucus vesiculosus由来硫酸化多糖画分を 7 0 0 m 1の 1 0 0 mM 塩化ナトリウムを含む 2 0 mM ィミダゾール塩酸緩衝液 ( p H 6 .

0 ) に溶解し、同緩衝液で平衡化させた 5リットルの D E A E—セル口ファイン A— 8 0 0にかけた。試料を流した後、 1 0リツトルの同緩衝液で洗浄し、 1 0 0〜： 1 6 0 0 mMの塩化ナトリゥム濃度勾配で溶出させ、分取（5 0 0 m l ) した。各画分に含まれる総糠量をフエノール硫酸法で、総ゥロン酸量を力/レバゾール硫酸法で測定した。溶出塩化ナトリウム濃度 7 0 0〜 8 0 0 mMの画分を、限外ろ過（排除分子量 1 0万）で濃縮、脱塩後凍結乾燥し、 1 . O gの Fucus vesiculosus由来硫酸化フカン画分を得た。

参考例 5 Ascophyllum nodosum由来硫酸ィヒフカン画分の調製

7 gの参考例 2記載の Ascophyllum nodosum由来硫酸化多糖画分から、参考例 4の方法で 1 . 1 gの Ascophyllum nodosum由来硫酸ィ匕フカン画分を得た。

参考例 6 硫酸化フカン分解酵素活性測定方法

本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素は硫酸化フカンに作用して硫酸ィ匕フカンを低分子化させる。これを利用して下記の方法で硫酸ィヒフカン分解酵素の活性を測定した。また、本発明の硫酸化フカン分解酵素は Fucus vesiculosus及び Ascophylum nodosum由来硫酸化フカンに作用するが、活性測定には Fucus vesiculosus由来硫酸ィ匕フカンを基質に用いた。

すなわち、 2. 5%の濃度になるように溶解した参考例 4記載の Fucus vesiculosus由来硫酸化フカン画分溶液 4. 8 μ 1、 60 μ 1の 50 mM ィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 8) 、 6 μ 1の 1M 塩ィ匕カルシウム、 9 _μ 1 の 4Μ 塩ィ匕ナトリウム、 28. 2 μ 1の水、及ぴ 1 2 μ 1の本発明の硫酸化フカン分解酵素とを混合し、 30°Cで 3時間反応させた後、反応液を 1 00°Cで 1 0分間処理し、 H P L Cで分析した。対照として、本発明の硫酸化フカン分解酵素の代わりに、その酵素溶液の溶媒を用いて反応させたもの及び硫酸ィ匕フカン画分の代わりに水を用いて反応させたものを同様に分析した。 HPLCの分析は下記の様に行った。カラム S h o d e X S B— 806 HQ

カラム温度 25°C

溶離液 5 mM ァジィ匕ナトリウムを含む 50 mM 塩化ナトリウム流斑 1 m 1 Z分

検出示差屈折率検出器

1単位の硫酸化フカン分解酵素活性は上記反応系において 1分間に 1 m o 1 eのフコシル結合を切断する酵素量とした。切断したフコシル結合の量は下記式により求めた。

F d X (Sm/Pm- 1) / (SmX 1 80 X 0. 01) =\J/ 1

F d ：反応に用いた硫酸ィ匕フカン量（Ai g)

Sm：基質硫酸化フカンの平均分子量

Pm：反応後の硫酸ィヒフカンの平均分子量

ISO:反応時間（分）

0.01:酵素液量（ml )

また、タンパク質の定量は、酵素液の 280 nmの吸光度を測定することにより行い、その際 lmgZmlのタンパク質溶液の吸光度を 1. 0として計算した。実施例 1 硫酸化フカン分解酵素の調製

フコフィラスフコイダノリイティカス（Fu c o p h i 1 u s f c o i d a n o l y t i c u s) S I— 1234を、参考例 1に記載の Fucus

vesiculosus由来硫酸化多糖画分 0. 2 %とペプトン 1 %を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製） pH8. 0からなる培地 600m 1を 120°C、 20分間ォートクレーブ処理した培地に接種し、 24 °Cで 72時間培養して種培養液とした。参考例 1に記載の Fucus vesiculosus由来硫酸ィヒ多糖画分 0. 2%、ぺプトン 1%、及び消泡剤（KM70、信越化学工業製）を含む人工海水（ジャマリンラボラトリー製） pH8. 0からなる培地 20リットルを 30リットルのジャ一ファーメンターに入れ、 120° (、 20分間オートクレーブ処理した培地に、上記の種培養液を接種し、毎分 125回転の回転速度で、 24°Cで 48時間培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体及び培養上清を得た。

この菌体を 700m 1の 25 OmM 塩化ナトリウムと 10mM 塩化カルシゥムを含む 10 mM イミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 0 ) に懸濁し、超音波破碎後、遠心分離して上清を得た。この上清を同じ緩衝液で充分透析し、遠心分離して上清、すなわち、本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素粗酵素溶液を得た。なお、上記の培養上清と粗酵素溶液に含まれる、硫酸ィ匕フカン分解酵素活性を参考例 6記載の方法で測定した結果、培養液上清には培地 1 m 1あたり 0. 05 mU、菌体抽出液には培地 1mlあたり 0. 05 mUの活性が検出された。

上記の硫酸ィ匕フカン分解酵素粗酵素溶液を限外ろ過により溶媒を 10 mM 塩化カルシウム、 3 OmM 塩化ナトリウム、 5mM アジィ匕ナトリウムを含む 1 0 mMのィミダゾール一塩酸緩衝液（ p H 7. 0 ) に交換し、同緩衝液で平衡化させた 500mlの0£ £_セルロファィン _800にかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、 3 OmMから 35 OmMの塩ィ匕ナトリゥムの濃度勾配により溶出させた。分取は 1本あたり 51 m 1とした。

各フラクションの硫酸ィ匕フカン分解酵素活性を測定し、活性画分のうち、塩化ナトリゥム濃度 60〜14 OmMで溶出された画分をDEAE—l画分、塩ィ匕ナトリゥム濃度 140〜230111^1で溶出された画分を0£八£ー2画分とした。上記の DEAE— 1画分を 1 OmM 塩化カルシウム、 100 mM 塩化ナトリウム、 5 mM アジ化ナトリゥムを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 0 ) で平衡ィ匕させた 200mlの硫酸ィ匕セル口ファイン（生化学ェ業）にかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、 100 mMから 60 OmMの塩ィ匕ナトリゥムの濃度勾配により溶出させた。分取は 1本あたり 2 Om 1とした。

各フラクションの硫酸ィ匕フカン分解酵素活性を測定し、活性画分のうち、塩ィ匕ナトリゥム濃度 290〜37 OmMで溶出された画分をDEAE—l S画分とした。

上記の DEAE— 2画分を 1 OmM塩ィヒカルシゥム、 20 OmM 塩化ナトリゥム、 5 mM ァジィ匕ナトリウムを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液

(pH7. 0) で平衡ィ匕させた 20 Om 1の硫酸ィ匕ーセル口ファイン（生化学ェ業）にかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、 200 mMから 1500 mMの塩化ナトリゥムの濃度勾配により溶出させた。分取は 1 本あたり 2 Om 1とした。

各フラクションの硫酸化フカン分解酵素活性を測定し、活性画分のうち、塩ィ匕ナトリゥム濃度 240〜35 OmMで溶出された画分を DEAE— 2 S画分とした。

実施例 2 硫酸ィ匕フカン分解酵素粗酵素溶液を用いた硫酸ィ匕フカンオリゴ糖の調製、精製、及び構造解析

(1) 基質の調製

乾燥した Fucus vesiculosus藻体 60 gを粉砕し、 1リツトルの 80%ェタノールに懸濁し、 2時間攪拌後、ろ過し、残さを充分洗浄した。得られた残さに対して上記の洗浄工程をさらに 2回行い、洗浄残さを得た。この洗浄残さに 4リツトルの 5 OmM 塩化カルシウム、 40 OmMの塩化ナトリゥム、及び 10% ェタノールを含む 20 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液（ p H 7 · 0 ) に懸濁後、 24時間攪拌し、遠心分離により Fucus vesiculosus抽出液を得た。

得られた Fucus vesiculosus抽出液に上記の抽出用緩衝液を加えながら、排除分子量 10万のホロファイバーを装着させた限外ろ過機により限外ろ過し、低分子物質を除去した。最終的に 32 Om 1とし、遠心分離により沈殿を除去した。こうして、 Fucus vesiculosus咼分子画分を得た。

( 2 ) 硫酸化フカンォリゴ糖の調製

実施例 2— (1) 記載の Fucus vesiculosa高分子画分全量に実施例 1記載の DEAE— 1 S画分（硫酸化フカン分解酵素活性として 1. 78mU) 及び DE

AE—2 S画分（硫酸化フカン分解酵素活性として 1. 97mU) を混合し、 2 5 °Cで 5日間反応させた後、実施例 1記載の DEAE— 1 S画分（硫酸化フカン分解酵素活性として 1. 54 mU) 及ぴ D E A E— 2 S画分（硫酸ィ匕フカン分解酵素活性として 1. 70 mU) を混合し、 25 °Cで 13日間反応させた。

反応液を排除分子量 1万のホロフアイバーを装着させた限外ろ過装置にかけ、分子量 1万以下のオリゴ糖画分を回収し、硫酸ィ匕フカンオリゴ糖混合物 1とした。

(3) 硫酸ィ匕フカンオリゴ糖の精製

実施例 2— （ 2 ) で得られた硫酸化フカンォリゴ糖混合物 1に水を加え、 10 mMとなるようにイミダゾールを、 1 OmMとなるように塩ィ匕ナトリゥムを添加し、 10 mM塩化ナトリゥムを含む 10 mM ィミダゾールー塩酸緩衝液 ( H

6. 0) で平衡化した 50 Om 1の DEAE—セル口ファイン A— 800のカラムにかけ、 1リツトルの同じ緩衝液で洗浄後、 10〜： 1200 mMの塩化ナトリゥム濃度勾配で溶出させ、 1本あたり 50 m 1で分取した。各フラクションの総糖量をフエノールー硫酸法で測定した。その結果、 5種のピークが存在していたのでそれぞれのピーク部分を集めオリゴ糖 1一 (1) から 1一（5) 画分とした。オリゴ糖 1一 (1) 〜1一（3) 画分をそれぞれ、エバポレーターで 4 Om 1 に濃縮後、 1◦ %エタノールで平衡化させたセルロフアイン G C L— 25のカラム（4. 1 X 90. 5 cm) にかけ、 10 %エタノールで溶出して脱塩した。オリゴ糖 1一 (1) 及び 1一（2) はそのまま凍結乾燥により乾固した。こうして 15 m g及び 75 m gの本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1— ( 1 ) 及び 1一

(2) を得た。

脱塩したォリゴ糖 1一 (3) 画分を集め、 10 mMとなるようにイミダゾーノレを、 20 OmMとなるように塩化ナトリウムを加え、 pHを 6とした。このオリゴ糖溶液を 200 mM 塩化ナトリウムを含む 10 mM イミダゾールー塩酸緩 0300334

21 衝液 (pH6. 0) で平衡化した 10 Om 1の DEAE—セル口ファイン A— 8 00の力ラムにかけ、 300mlの同じ緩衝液で洗浄後、 200〜 700 mMの塩化ナトリウム濃度勾配で溶出させ、 1本あたり 10 m 1で分取した。各フラクシヨンの総糖量をフエノールー硫酸法で測定した。その結果、溶出塩濃度 430 mMから 48 OmMの画分に分子量が均一なオリゴ糖が存在していたのでその画分を集めた。この画分をエバポレーターで 4 Omlに濃縮後、 10%エタノールで平衡ィ匕させたセル口ファイン GCL— 25のカラム（4. 1 X 90. 5 c m) にかけ、 10 %ェタノ一ルで溶出して脱塩した。脱塩したォリゴ糖溶液を凍結乾燥により乾固した。こうして^{3 5} m gの本発明の硫酸化フカンォリゴ糖 1— (3) を得た。

オリゴ糖 1— (4) 画分に水を加え、 30 OmMの塩化ナトリウムを含む 10 mM ィミダゾールー塩酸緩衝液、（ p H 6 ) と導電率を同じにした。このオリゴ糖溶液を 300 mM 塩ィ匕ナトリウムを含む 10 mM ィミダゾールー塩酸緩衝液（pH6. 0) で平衡ィ匕した 5 Om 1の DEAE—セル口ファイン A— 800 の力ラムにかけ、 100 m 1の同じ緩衝液で洗浄後、 300〜 800 mMの塩ィ匕ナトリウム濃度勾配で溶出させ、 1本あたり 4. 9mlで分取した。各フラクションの総糖量をフエノ一ルー硫酸法で測定した。その結果、溶出塩濃度 450m Mから 63 OmMの画分に分子量が均一なオリゴ糖が存在していたのでその画分を集めた。この画分をェパポレーターで 4 Om 1に濃縮後、 10%エタノールで平衡ィ匕させたセル口ファイン GCL— 25のカラム（4. 1 X 90. 5 cm) にかけ、 1◦ %ェタノ一ルで溶出して脱塩した。脱塩したォリゴ糖溶液を凍結乾燥により乾固した。こうして 112m gの本発明の硫酸化フカンオリゴ糖 1— (4) を得た。

オリゴ糖 1一 (5) 画分に水を加え、 40 OmMの塩ィ匕ナトリウムを含む 10 mMイミダゾールー塩酸緩衝液（pH 6) と導電率を同じにした。このオリゴ糖溶液を 400 mM塩化ナトリウムを含む 10 mMィミダゾールー塩酸緩衝液 ( H6. 0) で平後匕した 10 Om 1の DEAE—セル口ファイン A— 800の力ラムにかけ、 200 m 1の同じ緩衝液で洗浄後、 400〜 900 mMの塩化ナトリゥム濃度勾配で溶出させ、 1本あたり 10 m 1で分取した。各フラクションの総糖量をフヱノール一硫酸法で測定した。その結果、溶出塩濃度 64 OmMから 70 OmMの画分に分子量が均一なオリゴ糖が存在していたのでその画分を集めた。この画分をエバポレーターで 40mlに濃縮後、 10 %ェタノールで平衡ィ匕させたセル口ファイン GCL— 25のカラム（4. 1 X 90. 5 cm) にかけ、 10 %ェタノ一ルで溶出して脱塩した。脱塩したォリゴ糖溶液を凍結乾燥により乾固した。こうして 44m gの本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1— (5) を得た。

(4) 構造解析

実施例 2— (3) で得られた本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1— (1) 〜

(5) を 2—アミノビリジンで蛍光標識し、還元末端糖及び糖組成の分析を行つたところ、本発明の硫酸化フカンオリゴ糖 1_ (1) 〜（5) の還元性末端糖は総てフコースであった。また、中性糖組成も、総てフコースのみからなるものであった。次に、硫酸含量（塩ィヒバリウムを用いた比濁法による）を測定し、質量分析装置 (AP I - I I I、パーキンエルマ一 ·サイェクス社製）で質量を分析した。また、 J ΝΜ-α 500型核磁気共鳴装置（日本電子社製）及び D i g i t a 1 NMR ADVANCE 600 (B r u k e r An a 1 y t i k社製）で NMR分析を行った。分析試料は定法により重水で置換後、構造解析を行つた。構成糖の結合様式は、 ¹ H—検出異種核検出法である HMBC法を用いて行った。 ¹ H— NMRの帰属には DQF— COS Y法及ぴ HOHAHA法を、 ¹ ³ C_NMRの帰属にはHSQC法を用ぃた。以下に本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一 (1) 〜（5) の物性を示す。

(a) 本発明の硫酸ィヒフカンオリゴ糖 1一 (1) の物性

質量分析及ぴ NMR分析の帰属の結果を以下に示し、 ¹ H— NMRスぺクトルを図 3に、 ^{1 3} C— NMRスペクトルを図 4に、マススぺクトルを図 5にそれぞれ示した。図 3、 4において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p pm) を示す。また、図 5において、縦軸は相対強度 (%) を、横軸は、 mZz 値を示す。

分子量； 842

MS m/z ; 431. 1 , [M+Na⁺ - 2H⁺ ] ² - ; 885. 2, [M + 2Na + — 3H+ ] — H— NMR及び^{1 3} C— NMRによる分析結果を表 1、 2に示す。表 1

糖組成 L—フコース 4分子

硫酸基 3分子

なお、 ¹ H— NMR及び^{1 3} C— NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式 (I I) の通りである。

(II)

OH H

(b) 本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一 (2) の物性

質量分析及び NMR分析の帰属の結果を以下に示し、 ¹ H— NMRスぺクトルを図 6に、 ^{1 3} C— NMRスペクトルを図 7に、マススペクトルを図 8にそれぞれ示した。図 6、 7において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p pm) を示す。また、図 8において、縦軸は相対強度（％) を、横軸は、 mZz 値を示す。

分子量； 922

MS m/z ; 482. 1， [M+ 2 N a ⁺ 一 4H+ ] ² - ; 987. 1， [M + 3N a⁺ 一 4H+ ] 一 H— NMR及ぴ^{1 3} C— NMRによる分析結果を表 3、 4に示す。表 3

糖組成 Lーフコース 4分子

硫酸基 4分子

なお、 ¹ H— NMR及ぴ^{1 3} C— NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式 (I I I) の通りである。

(III)

OH H

(c) 本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一 (3) の物性

質量分析及ぴ NMR分析の帰属の結果を以下に示し、 ¹ H— NMRスぺクトルを図 9に、 ^{1 3} C— NMRスぺクトルを図 10に、マススぺクトルを図 11にそれぞれ示した。図 9、 10において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p pm) を示す。また、図 1 1において、縦軸は相対強度（°/。）を、横軸は、 m/ z値を示す。

分子量； 1454

MS m/z ; 379. 1， [M+ 3 N a + — 7H+ ] ⁴ — ; 513. 2， [M + 4Na+ _7H+ ] ³ - ； 781. 1， [M+ 5 N a ⁺ -7H⁺ ] ² ¹ H— NMR及ぴ^{1 3} C— NMRによる分析結果を表 5、 6に示す。表 5

ケミカルシフト値（p pm)

一 NMR ¹³C— NMR

ケミカルシフト値、多重度、

結合疋'数

F1-1 5.43， d， 3.5 91.4

F1-2 4.47, m 74.25 or 74.3 or 74.4

F1-3 4.01, dd， 3.5， 10.0 74.25 or 74.3 or 74.4

F1-4 4.04， m 69.9

F1-5 4.17, m 66.8

F1-6 1.18, d, 6.5 16.3

F2-1 5.33, m 95.67 or 95.71

F2-2 4.58, dd, 3.5， 11.0 73.3 or 73.4

F2-3 4.70, dd, 2.5， 11.0 74.8 or 74.9

F2-4 4.22, m 80.5

F2-5 4.49, m 68.7

F2-6 1.34, d, 6.5 16.5

F3-1 5.24， d, 3.5 99.7

F3-2 4.52, m 74.25 or 74.3 or 74.4

F3-3 4.16, dd, 3, 5， 10.0 74.25 or 74.3 or 74.4

F3-4 4.06, d， 3.0 70.3

F3-5 4.35, m 67.9

F3-6 1.24, d, 6.5 16.19

表 6

糖組成 Lーフコース 6分子

7分子

なお、 ¹ H— NMR及び^{1 3} C—NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式 (IV) の通りである。

(IV)

OH H (d) 本発明の硫酸化フカンオリゴ糖 1— (4) の物性

質量分析及ぴ NMR分析の帰属の結果を以下に示し、 ¹ H— NMRスぺクトルを図 12に、 ^{1 3} C— NMRスぺクトルを図 13に、マススぺクトルを図 14にそれぞれ示した。図 12、 13において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p pm) を示す。また、図 14において、縦軸は相対強度（％) を、横軸は、 m/z値を示す。

分子量； 1986

MS m/ z ; 418. 3, [M+ 5Na+ — 10H+ ] ⁵ - ; 528. 5，

[M+ 6Na ⁺ — 10H+ ] ⁴ - ; 712. 4, [M+ 7Na + — 10H+ ] ³ - ； 1080. 6, [M+ 8Na + — 10H+ ] ² - ¹ H —NMR及ぴ^{1 3} C— NMRによる分析結果を表 7〜9に示す。表 7

ケミカルシフ H直 (p pm)

^XH-NMR ¹³C— NMR

ケミカルシフト値、多重

度、結合定数

F1-1 5.43， d, 3.5 91.4

F1-2 4.47, dd, 4.0， 10.0 74.2 or 74.3 or 74.4

F1-3 4.01, dd, 3.5， 10.5 74.2 or 74.3 or 74.4

F1-4 4.04, d， 3.5 69.8 or 69.9

F1-5 4.18， m 66.8

F1 - 6 1.17， d, 7.0 16.3

F2-1 5.33， m 95.5 or 95.6 or 95.7

F2-2 4.58, dd, 3.5， 10.5 73.3 or 73.4

F2-3 4.70, dd, 2.5， 11.0 74.8 or 74.9

F2-4 4.23, m 80.6

F2-5 4.49, m 68.7

F2-6 1.33, m 16.5

F3-1 5.24, m 99.5 or 99.6 or 99.7

F3-2 4.52, ra 74.2 or 74.3 or 74.4

F3-3 4.16， dd, 3.0, 10.5 74.2 or 74.3 or 74.4

F3-4 4.06, m 70.2 or 70.27 or 70.32

F3-5 4.33, m 67.8

F3-6 1.23， m 16.2

9 ·9ΐ ui '_{εε Ί} 9-M

' 89 ω '93· 9-M

S ,08 Jo Ζ ·08 f-9d

6 'fl ο 8 'fl ο·π ^s£ τ 'ρρ 'ε £-9d f ' ε ΈΖ 9Όΐ '9 'ΡΡ '8S - Z-M

I "96 ^xo 9 "96 J° S "96 l-M

Z '91 ω 'ΖΖΊ 9- d

8· 9 ra '8ε· 9-9H

Z£ OA Jo iz -oi JO OL «ι '90· f-M f ' l o g - i JO ζ ' S ΌΤ 'ο'ε 'ΡΡ '9ΐ 'Ψ £-2ή f 'fL ュ⁰ ε · O Z ' l ra '29 -f Z~M

I '66 ュ⁰ 9 '66 J° 9 *66 ω ' Z '9 l~M

9 ·9ΐ 'εε'ι 9-fi

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S Ό8 J° Z 8 f-f

6 'fL J° 8 'U Ο Ι '9 'Ζ 'ΡΡ 'ε 'f £~M 'u JO ε ·εζ 9 ΐ '9 '8 'ΡΡ '89 ' Z-fd

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treoo/eodf/i3d JP03/00334

31 表 9

糖組成 Lーフコース 8分子

硫酸基 10分子

なお、 ¹ H— NMR及び^{1 3} C— NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式 (V) の通りである。

(e) 本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1— (5) の物性

質量分析及ぴ NMR分析の帰属の結果を以下に示し、 ¹ H— NMRスぺクトルを図 1 5に、 ^{1 3} C— NMRスぺクトルを図 1 6に、マススぺクトルを図 1 7にそれぞれ示した。図 1 5、 1 6において縦軸はシグナルの強度を、横軸は化学シフト値（p pm) を示す。また、図 1 7において、縦軸は相対強度（％) を、横軸は、 mZz値を示す。

分子量； 2 5 1 8

MS m/z ; 3 2 7. 6， [M+ 5 N a ⁺ — 1 3H+ ] ⁸ _ ; 37 7. 8,

[M+ 6 Na ⁺ - 1 3 H⁺ ] ⁷ - ; 444. 5， [M+ 7Na ⁺ - 1 3H⁺ ] ⁶ - ; 5 3 8. 0， [M+ 8Na + — 1 3H+ ] ⁵ - ; 6 78. 1， [M+ 9 Na + — 1 3H+ ] ⁴ - ; 9 1 2. 4， [M+ 1 0N a + _ 1 3⁺ ] ³ - ¹ H— NMR及ぴ^{1 3} C— NMRによる分析結果を表 1 0〜1 3に示す。表 10

ケミカノレシフト値 ( pm)

一 NMR ¹³C— NMR

ケミカルシフト値、多重度、

結合定数

F1-1 5.43, d， 4.0 91.4

F1-2 4.47, dd, 4.0， 10.0 74.1 or 74.3 or 74.4

F1-3 4.01, dd, 3.5， 10.5 74.1 or 74.3 or 74.4

F1-4 4.04, d, 2.5 69.8 or 69.9

F1-5 4.17， m 66.8

F1-6 1.17， d, 6.5 16.3

F2-1 5.35, m 95.3 or 95.6 or 95.7

F2-2 4.60, m 73.3 or 73.4

F2-3 4.70, dd, 2.5， 11.0 74.8 or 75.0

F2-4 4.22, m 80.6

F2-5 4.50, m 68.6 or 68.7 or 68.75 or 68.81

F2-6 1.33, m 16.45 or 16.54

F3-1 5.23， m 99.3 or 99.5 or 99.7

F3-2 4.52, m 74.1 or 74.3 or 74.4

F3-3 4.16, dd, 3.0， 10.5 74.1 or 74.3 or 74.4

F3-4 4.06, m 70.3

F3-5 4.32, q, 7.0 67.8

F3-6 1.23, ra 16.2 表 1 1

ケミカルシフト値（p p m)

一 NMR ^{1 3} C— NMR

ケミカルシフト値、多重度、

結合疋数

F4-1 5. 35, m 95. 3 or 95. 6 or 95. 7

F4-2 4. 60, m 73. 3 or 73. 4

F4-3 4. 75, m 74. 8 or 75. 0

F4-4 4. 22， m 79. 8 or 80. 1 or 80. 2

F4-5 4. 55, m 68. 6 or 68. 7 or 68. 75 or 68. 81

F4-6 1. 33, m 16. 45 or 16. 54

F5-1 5. 23， m 99. 3 or 99. 5 or 99. 7

F5-2 4. 52, m 74. 1 or 74. 3 or 74. 4

F5-3 4. 16, dd， 3. 0, 10. 5 74. 1 or 74. 3 or 74. 4

F5-4 4. 06, m 70. 3

F5-5 4. 39, m 67. 8

F5-6 1. 23， m 16. 2

F6-1 5. 35， m 95. 3 or 95. 6 or 95. 7

F6-2 4. 60, m 73. 3 or 73. 4

F6-3 4. 75, m 74. 8 or 75. 0

F6-4 4. 22, m 79. 8 or 80. 1 or 80. 2

F6-5 4. 55, m 68. 6 or 68. 7 or 68. 75 or 68. 81

F6-6 1. 33, m 16. 45 or 16. 54

表 12

糖組成 Lーフコース 10分子

硫酸基 13分子

なお、 ¹ H— NMR及び^{1 3} C—NMRにおけるピークの帰属の番号は下記式 (VI) の通りである。

(5) 本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素に含まれる酵素種

実施例 2に示すオリゴ糖 1— (1) 〜（5) は総て一般式（I) で表すことができる。すなわち同じ骨格を持つ多糖から生成してきたと考えられる。これらのォリゴ糖の還元性末端糖が総て Lーフコースであることから、硫酸化フカン分解酵素にはエンド型 _α— L一フコシダーゼが存在していることがわかった。また、これらのオリゴ糖は 2糖繰り返し構造を持っていることから、上記のエンド型ひ一 L一フコシダーゼは α (1-4) Lーフコシル結合を切断する酵素であることがわかった。また、上記のオリゴ糖を得たときの反応液には硫酸、 L—フコース、酢酸が検出されたことから、実施例 1で得られた硫酸ィ匕フカン分解酵素標品中には、スルファターゼ活性、フコシダーゼ活性、デァセチラーゼ活性が混在することが示唆された。

(6) エンド型ひ一 (1-4) L一フコシダーゼ活性測定

実施例 2記載の硫酸化フカンオリゴ糖 1一（4) を用いて、エンド型 a— (1 一 4) L一フコシダーゼの活性測定系を確立した。まず、実施例 2— （4) 記載の方法で本発明の硫酸化フカンオリゴ糖 1 _ (4) の還元性末端を 2—アミノビリジンで蛍光標識した。エンド型 _α_ (1-4) L一フコシダーゼの活'[~生は以下の様にして測定した。

すなわち、 75 μ 1の 10 OmMリン酸ナトリウム緩衝液（ρΗ7. 0) 、 7. 5 1の 2mg/m 1の牛血清アルブミン溶液、 3. 75μ 1の 4M塩化ナトリ 4

36 ゥム、 50. 25 μ 1の水、 6 At 1の 10 pmo 1/μ 1の本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一（4) の還元性末端を 2—アミノビリジンで蛍光標識したもの、及び 7. 5 μ 1の本発明のエンド型 a— (1 -4) L—フコシダーゼ溶液を混合し、 30 °Cで 3時間反応させた後、反応液を 100 °Cで 1 0分間処理し、 H P L Cで分析した。対照として、本発明のエンド型 α— (1-4) L一フコシダーゼの代わりに、その酵素の溶媒を用いて反応させたもの及ぴ基質の代わりに水を用いて反応させたものを同様に分析した。 HP LCは下記の様に行った。

カラム TSK - gel 0ctyl-80Ts (4.6 x 250 mm, 東ソー製）

カラム温度 40°C 各溶離液の 200 _mM酢酸トリェチルァミン緩衝液 pH5 5とァセトニトリルの比率を以下に記載する。

A液 95 5

B液 10 30

。液 40 60

H P L Cによる分析時の溶離液の組成を以下に記載する。

0〜 7分 A液

7〜25分 A液から Aと B液の混合液 (A： B = 1 0 ： 90) へのグラジェント。

25〜26分 Aと B液の混合液 (A： B = 1 0 ： 90) から Cへのグラジェント。

26〜34分 C液

流速 1 m 1 Z分

検出蛍光（励起波長 320 nm、蛍光波長 400 nm)

1単位のェンド型 α— (1 -4) Lーフコシダーゼ活性は上記反応系におレ、て 1分間に l /zmo 1 eのフコシル結合を切断する酵素量とした。切断したフコシル結合の量は下記式により求めた。

S/ (1 80 X 0. 0075 X 1 0⁶ ) =U/m 1

S ：分角军された基質のモル数 (pmo 1 e) 180 :反応時間（分）

0. 0075 :酵素液量 (m 1 )

また、タンパク質の定量は酵素液の 280 nmの吸光度を測定することにより行い、その際 lmgZmlのタンパク質溶液の吸光度を 1. 0として計算した。実施例 3 エンド型 _α_ (1—4) L—フコシダーゼ

(1) エンド型 _α— (1-4) L一フコシダーゼの部分精製

実施例 1の方法でフコフィラスフコイダノリイティカス S 1—1234を培養し、培養液 60リツトルカ、ら、遠心分離により菌体を回収した。 .

得られた菌体を 2360mlの 10 mM塩ィ匕カルシウムと 400 mMの塩化ナトリウムと 5 mMのアジ化ナトリゥムを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液（pH7. 0) に懸濁し、超音波破砕後、遠心分離して上清を得た。この上清を 5 OmMの塩ィ匕ナトリゥムと 5 mMのアジ化ナトリゥムを含む 1 OmMのィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 0) で充分透析し、生じた沈殿を遠心分離により除去して上清、すなわち本発明のエンド型 α— (1— 4) L—フコシダーゼの粗酵素溶液を得た。

上記のェンド型ひ一 (1-4) Lーフコシダーゼ粗酵素溶液を上記と同じ緩衝液で平衡化させた、 3000mlの DEAE—セル口ファイン A— 800にかけた。すなわち、本発明のエンド型 α— (1— 4) L—フコシダーゼの粗酵素溶液を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、 5 OmMから 60 OmMの塩ィ匕ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は 1本あたり 6 Omlとした。

各フラクションの本発明のエンド型ひ一 (1-4) L—フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を 20 OmMの塩ィ匕ナトリゥムと 20 mMのリン酸 2水素カリゥムを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液（ p H 7. 0 ) で平衡化させた 1 5 Omlのヒドロキシルァパタイトカラムにかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、平衡化用緩衝液で充分洗浄し、 20 mMから 400 mMのリン酸 2水素力リゥムの濃度勾配により溶出させた。分取は 1本あたり 1 Omlとした。

各フラクションのエンド型 α— (1-4) L一フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を排除分子量 1万の限外ろ過膜を装着させた限外ろ過機で濃縮し、 100 mMの塩化ナトリウムと 5 mMのアジ化ナトリゥムを含む 10 mMのィミダゾー P T/JP03/00334

38 ルー塩酸緩衝液 (pH7. 5) で平衡ィ匕させたセフアクリル S— 200のカラム

(4. 4X 100 cm) にかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、上記緩衝液で溶出させた。分取は 1本あたり 13 m 1とした。以上の精製工程を表 14に示す。表 14

タンパク質総活性比活性収率工程 (mg) (mU) (mU/ m gノ (%) 抽出液 29， 430 3, 070 0.104 100 透析 21， 900 3， 330 0.152 108

DEAE—セノレ口ファイン 478 685 1.43 22.3 ヒドロキシノレアパタイト 20.7 219 10.6 7.13 セフアクリル S- 200 2.66 32.7 12.3 1.07 本発明のエンド型 α— (1-4) L—フコシダーゼがエンド的に <¾ 1ー4 L— フコシル結合を切断することを確認するため下記の実験を行った。

すなわち、本発明のエンド型 _α— (1-4) L一フコシダーゼを、還元性末端を 2—アミノビリジンで蛍光標識した本発明の硫酸化フカンオリゴ糠 1一 (4) に作用させた反応液を少量とり、乾固後、その中に存在するオリゴ糠を 2—アミノビリジンで蛍光標識し、 H P L Cにより分析した。なお、標準物質として本発明の硫酸ィ匕フカンオリゴ糖 1一 (2) を 2—アミノビリジンで蛍光標識したものを用いた。その結果、酵素反応により切断されて生じたオリゴ糖は総て本発明の硫酸化フカンオリゴ糖 1一 (2) と同じ物質であることがわかった。すなわち、本発明のエンド型 α— (1-4) L—フコシダーゼが、 Fu c u s v e s i c u 1 o s u s由来硫酸化フカンに存在する a— (1-4) L—フコシル結合をェンド的に切断する酵素であることが確認された。本発明のェンド型 a— ( 1一 4) L一フコシダーゼの至適 pHと至適温度をそれぞれ図 18、図 19に示す。し力しながら、本発明のエンド型 a— (1-4) L—フコシダーゼを単独で F u c u s v e s i c u l o s u s由来硫酸化フカン画分に作用させても低分子化させることができなかった。上述のように本発明の硫酸化フカン分解酵素を用いて硫酸ィ匕フカンオリゴ糖を調製する際には、反応液中に Lーフコース、硫酸、酢酸が生じることが分かっている。このこと力ら、本発明のエンド型ひ一（1一 4) L一フコシダーゼで硫酸化フカンを分解する際には、フコシダーゼ、スルファターゼ、デァセチラーゼ等が共存する必要があると考えられた。

そこで、本発明のエンド型 α— (1-4) L一フコシダーゼと共存して F u c u s V e s i c u 1 o s u s由来硫酸ィ匕フカンを低分子ィ匕させる活性を探索した。

( 2 ) 硫酸ィヒフ力ン低分子化酵素 A

本発明のエンド型ひ一 (1-4) L—フコシダーゼと共存して Fucus vesiculosus由来硫酸ィ匕フカンを低分子化させる酵素を調製するため、まず該酵素の活性測定系を以下の様に設定した。

すなわち、 12 μ 1の 500 mMィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 5) 、 4. 8 / 1の 2. 5%の Fucus vesiculosus由来硫酸化フカン画分、 6 1の 1 Mの塩ィ匕カルシウム、 9 μ 1の 4M塩ィ匕ナトリウム、 40. 2μ 1の水、 24μ 1の 0. 35— 0. 4mUZm 1の本発明のエンド型 a— (1—4) L—フコシダーゼ、及ぴ 24 μ 1の本発明の硫酸化フカン低分子化酵素 A溶液を混合し、 3 0°Cで 3時間反応させた後、反応液を 100°Cで 10分間処理し、 HPLCで分祈した。対照として、本発明の硫酸化フカン低分子化酵素 A溶液の代わりに、その酵素の溶媒を用いて反応させたものを同様に分析した。 H P L Cは下記の様に打った。

カラム SB- 806HQ (4.6 X 250 mm, 昭和電工製）

カラム温度 25°C

溶離液 5 mMの了ジィ匕ナトリウムを含む 50 mMの塩化ナトリウム

速 1 m 1 Z分

検出示差屈折率検出器

1単位の本発明の硫酸化フカン低分子化酵素 Aの酵素活性は上記反応系におレヽて 1分間に 1 μπιο 1の割合で、本発明のエンド型 α— (1-4) Lーフコシダーゼによるフコシル結合の切断を増加させる酵素量とした。切断したフコシル結合の量は下記式により求めた。

(120/SMr ) X (SMr/PMr - 1) X 1/180 X 0. 024=U 300334

40

/ml

120 :基質に使用した硫酸化フカン量（At g)

SMr ：基質の平均分子量

PMr ：反応生成物の平均分子量

180 :反応時間（分）

0. 024 :酵素液量（m 1 )

また、タンパク質の定量は酵素液の 280 nmの吸光度を測定することにより行い、その際 lmg/mlのタンパク質溶液の吸光度を 1. 0として計算した。実施例 4 硫酸化フカン低分子化酵素 A

(1) 硫酸ィ匕フカン低分子化酵素 Aの部分精製

実施例 1の方法でフコフィラスフコイダノリィティカス S I— 1234を培養し、培養液 60リツトルから、遠心分離により菌体を回収した。

得られた菌体を 278 Om 1の 1 OmM塩化カルシウムと 40 OmMの塩化ナトリウムと 5 mMのアジ化ナトリウムと 5 mMの；8—メルカプトエタノールを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 0 ) に懸濁し、超音波破枠後、遠心分離して上清を得た。この上清を 1 OmMの塩化カルシウムと 1 OmMの塩化ナトリウムと 5mMの ]3—メルカプトエタノールと 5mMのアジ化ナトリウムを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 0 ) で充分透析し、生じた沈殿を遠心分離により除去して上清を得た。

得られた上清を上記と同じ緩衝液で平衡化させた、 3000mlの DEAE— セル口ファイン A— 800にかけた。すなわち、上記の上清を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、 10 mMから 600 mMの塩化ナトリゥムの濃度勾配により溶出させた。分取は 1本あたり 60 m 1とした。

各フラクションの、本発明の硫酸化フカン低分子化酵素 Aの酵素活性を測定し、活性画分（60—110 mM塩化ナトリゥム溶出画分）を 10 mMの塩化カノレシゥムと 8 OmMの塩化ナトリゥムと 5 mMの j3—メルカプトエタノールを含む 1 0 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 0 ) で平衡化させた 200 m 1の DEAE—セル口ファイン A— 800カラムにかけた。すなわち、該酵素溶液を添加後、平衡化用緩衝液で充分洗浄し、 80 mMから 240 mMの塩化ナトリウムの濃度勾配により溶出させた。分取は 1本あたり 2 Om 1とした。

各フラクションの硫酸ィ匕フカン低分子化酵素 Aの酵素活性を測定し、活性画分を、 20 OmMの塩化ナトリウムと 1 OmMの塩ィ匕カルシウムと 5mMの ]3—メルカプトェタノールを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液（ p H 7 · 0 ) で平衡ィ匕させた 2 Om 1の硫酸化セル口ファインのカラムにかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、 200から 70 OmMの塩化ナトリゥムの濃度勾配により溶出させた。分取は 1本あたり 2m 1とした。以上の精製工程を表 15に示す。表 15

タンノク質総活性比活性収率工程 (m (mU/ m g) (%)

U)

抽出液 33， 600 731 0.0218 100 透析 30， 900 736 0.0238 101

DEAE—セノレ口ファ^! ン 567 97.2 0.171 13.3

DEAE—セノレ口ファ rン 102 43.6 4.27 5.96 硫酸ィ匕セル口ファイン 9.66 8.40 0.870 1.14 本発明の硫酸化フ力ン低分子化酵素 Aの作用機作を確認するため下記の実験を行った。

すなわち、本発明の硫酸ィ匕フカン低分子化酵素 Aを、 Fucus vesiculosus由来硫酸ィ匕フカンに作用させた反応液を少量とり、その中に存在する遊離の硫酸の量を HP LCにより分析した。なお、標準物質としては硫酸ナトリウムを用いた。その結果、酵素反応により遊離の硫酸が生じることがわかった。すなわち、本発明の硫酸化フカン低分子化酵素 Aが、 Fucus vesiculosus由来硫酸化フカンに作用して硫酸基を切断する酵素であり、硫酸化フカンスルファターゼ活†生を有することが確認された。

しかしながら、本発明のエンド型一 (1-4) L一フコシダーゼと本発明の硫酸化フカン低分子化酵素 Aだけを Fucus vesiculosus 由来硫酸ィ匕フカン画分に作用させても実施例 2に記載したオリゴ糖を得られるほどには低分子化させることができなかった。上述のように本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素を用いて硫酸ィ匕フカンオリゴ糖を調製する際には、反応液中に L—フコース、酢酸も生じることが分かっている。このこと力ら、 Fucus vesiculosus由来硫酸化フカンを分解する際には、本発明のエンド型 α— (1-4) L—フコシダーゼと本発明の硫酸ィ匕フカン低分子化酵素 A以外に、フコシダーゼやデァセチラーゼ等が共存する必要があると考えられた。

そこで、本発明のエンド型一 (1-4) L一フコシダーゼ及び本発明の硫酸ィ匕フカン低分子化酵素 Aと共存して Fucus vesiculosus 由来硫酸化フカンの低分子化を促進させる活性を探索した。なお、探索する対象の酵素を以下、ェキソ型 L一フコシダーゼという。

(2) ェキソ型 L一フコシダーゼ

本努明のェキソ型 L _フコシダーゼを調製するため、まず該酵素の活性測定系を以下の様に設定した。

すなわち、 12 μ 1の 500 mMィミダゾール一塩酸緩衝液 (pH7. 5) 、 4. 8/ lの 2. 5%の Fucus vesiculosus由来硫酸ィ匕フカン画分、 6 μ 1の 1

Μの塩化カルシウム、 9 μ 1の 4Μ塩ィ匕ナトリウム、 16. 2 μ 1の水、 24 μ 1の 0. 35— 0. 4mU/m 1の本発明のエンド型 α— (1—4) L—フコシダーゼ、 24μ 1の 0. 04— 0. 05 mU/m 1の本発明の硫酸ィヒフカン低分子化酵素 A、及び 24μ 1の本発明のェキソ型 L一フコシダーゼを混合し、 3 0 °Cで 3時間反応させた後、反応液を 100 °Cで 10分間処理し、 HPLCで分析した。対照として、本発明のェキソ型 L一フコシダーゼ溶液の代わりに、その酵素の溶媒を用いて反応させたものを同様に分析した。 HPLCは下記の様に行つた。

カラム SB- ⁸0⁶HQ (4.6 x 250 mm, 昭和電工製）

カラム温度 25°C

溶離液 5 mMのアジィ匕ナトリウムを含む 50 mMの塩化ナトリウム流速 1 m 1 Z分

検出示差屈折率検出器

1単位のェキソ型 L—フコシダーゼ活性は上記反応系において 1分間に 1 m 300334

43 o 1 eの割合でフコシル結合の切断を増加させる酵素量とした。増加したフコシル結合の量は下記式により求めた。

(120/SMr) X (SMr/PMr— 1) X 1/180 X 0. 024=U /m 1

120 :基質に使用した硫酸ィヒフカン量 g)

SMr ：基質の平均分子量

PMr ：反応生成物の平均分子量

180 :反応時間（分）

0. 024 :酵素液量（m 1 )

また、タンパク質の定量は酵素液の 280 nmの吸光度を測定することにより行い、その際 lmgZm lのタンパク質溶液の吸光度を 1. 0として計算した。実施例 5 ェキソ型 Lーフコシダーゼの部分精製

実施ィ列 2の方法でフコフィラスフコイダノリィティカス S I— 1234を培養し、培養液 60リツトルから、遠心分離により菌体を回収した。

得られた菌体を 2780mlの 10 mM塩化カルシウムと 400 mMの塩化ナトリウムと 5 mMのアジ化ナトリウムと 5 mMの —メルカプトエタノールを含む 1 OmMのイミダゾールー塩酸緩衝液 (pH7. 0) に懸濁し、超音波破碎後、遠心分離して上清を得た。この上清を 1 OmMの塩化カルシウムと 1 OmMの塩ィ匕ナトリゥムと 5 mMの —メルカプトエタノールと 5mMのアジ化ナトリゥムを含む 10 mMのィミダゾールー塩酸緩衝液（ p H 7. 0 ) で充分透析し、生じた沈殿を遠心分離により除去して上清を得た。

得られた上清を上記と同じ緩種 ί液で平衡化させた、 3000mlの DEAE— セル口ファイン A— 800にかけた。すなわち、上記の上清を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、 10 mMから 600 mMの塩化ナトリゥムの濃度勾配により溶出させた。分取は 1本あたり 60 m 1とした。

各フラクションのェキソ型 L一フコシダーゼ活性を測定し、活性画分 (170 〜 205 mM塩化ナトリゥム溶出画分）を 10 mMの塩化カルシウムと 50 mM の塩化ナトリウムと 5 mMの一メルカプトエタノールを含む 1 OmMのィミダゾール一塩酸緩衝液 (pH7. 0 ) で充分透析し、同緩衝液で平衡化させた 50 m 1の硫酸ィ匕セル口ファインカラムにかけた。すなわち、該酵素溶液を添加後、平衡化用緩衝液で充分洗浄し、 50 mMから 1 Mの塩化ナトリゥムの濃度勾配により溶出させた。分取は 1本あたり 5 m 1とした。

各フラクションの本発明のェキソ型 L—フコシダーゼ活性を測定し、活性画分を、 1 0 OmMの塩化ナトリウムと 1 OmMの塩ィ匕カルシウムと 5mMの j3—メルカプトエタノールと 5 mMのアジィ匕ナトリゥムを含む 1 OmMのィミダゾール一塩酸緩衝液 (ρ Η7. 5) で平衡化させた 20m lの硫酸化セル口ファインのカラムにかけた。すなわち、酵素溶液を添加後、上記緩衝液で充分洗浄し、 1 0 0から 7 0 OmMの塩ィヒナトリゥムの濃度勾配により溶出させた。分取は 1本あたり 2. 3 m 1とした。以上の精製工程を表 1 6に示す。表 16

タンパク総活性比活性収率工程 (mg) (m KmU/^/ m g (%)

U)

抽出液 33， 600 12, 400 0.369 100 透析 30， 900 11,900 0.385 96.0

DEAE—セノレ口ファ 'ン 231 778 3.37 6.27 硫酸ィヒセル口ファイン 42.7 1, 180 27.6 9.52 硫酸ィヒセル口： 7ァイン 8.32 1,090 131 8.79 本発明のェキソ型 L一フコシダーゼの作用機作を確認するため下記の実験を行つた。

すなわち、本発明のェキソ型 L一フコシダーゼを、 Fucus vesiculosus由来硫酸ィ匕フカンに作用させた反応液を少量とり、その中に存在する遊離の L一フコースの量を遊離型 Lーフコース定量用キットにより測定した。その結果、酵素反応により遊離の Lーフコースが生じることがわかった。すなわち、本発明のェキソ型 L—フコシダーゼが、 Fucus vesiculosus由来硫酸化フカンに作用して Lーフコース残基を切断する酵素であり、ェキソ型 Lーフコシダーゼであることが確認された。

本発明のエンド型ひ一 (1 -4) L一フコシダーゼと本発明の硫酸ィ匕フカン低分子化酵素 Aと本発明のェキソ型 L一フコシダーゼを Fucus vesiculosus 由来硫酸化フカン画分に作用させると、硫酸化フカンを低分子化させ実施例 2に記載したオリゴ糖とほぼ同等の分子量のオリゴ糖が生成した。しかしながら、上述のように本発明の硫酸ィ匕フカン分解酵素を用いて硫酸ィ匕フカンオリゴ糖を調製する際には、反応液中に酢酸も生じることが分かっている。

そこで、 Fucus vesiculosus由来硫酸化フカンを 1 Nの水酸化ナトリゥムで処理することにより O—ァセチル基を加水分解したもの及ぴ未処理の Fucus vesiculosus由来硫酸ィ匕フカンを基質に用いて、本発明のエンド型 α _ ( 1— 4 ) Lーフコシダーゼ及ぴ本発明の硫酸化フカン低分子化酵素 Αを作用させたところ、明らかに O—ァセチル基を除去した、 Fucus vesiculosus由来硫酸ィ匕フカンのみ低分子ィ匕が進むことがわかり、硫酸化フカンの脱ァセチル化が、 Fucus vesiculosus由来硫酸ィ匕フカンの酵素的低分子化に必要な反応であることが確認できた。

また、この結果力、ら、本発明のエンド型 α— ( 1 - 4 ) L一フコシダーゼと本発明の硫酸ィヒフカン低分子化酵素 Αと本発明のェキソ型 Lーフコシダーゼの中に硫酸ィヒフカンデァセチラーゼの混入が考えられたので、以下の反応系により該酵素活性を測定した。

すなわち、 6 1の 5 0 0 mMィミダゾールー塩酸緩衝液 ( p H 7 . 5 ) 、 7 . 2 μ 1の 2 . 5 %の Fucus vesiculosus由来硫酸ィ匕フカン画分、 3 μ 1の 1 Μの塩ィ匕カルシウム、 4 . 5 μ 1の 4 Μ塩ィ匕ナトリウム、 3 3 . 3 μ 1の水、及ぴ 6 μ 1の硫酸ィ匕フカンデァセチラーゼ含有酵素溶液を混合し、 3 0 °Cで 3時間反応させた後、反応液を 1 0 0 °Cで 1 0分間処理し、市販の酢酸定量用キットを用いて酢酸量を定量した。対照として、硫酸化フカンデァセチラーゼ含有酵素溶液の代わりに、その酵素溶液の溶媒を用いて反応させたものを同様に分析した。この結果、実施例で部分精製した本発明の硫酸ィ匕フカン低分子化酵素 A及ぴ本発明のェキソ型 L一フコシダーゼにはともに硫酸ィ匕フカンデァセチラーゼが含まれていることがわかった。

このこと力ら、 Fucus vesiculosus由来硫酸ィ匕フカンを分解する際には、本発明のエンド型 _α— ( 1 - 4 ) L—フコシダーゼ、本発明の硫酸化フカン低分子化酵素 A、本発明のェキソ型 L—フコシダーゼ及び硫酸化フカンデァセチラーゼが関与していることがわかった。産業上の利用の可能性

本発明により硫酸ィ匕フカンの構军析や硫酸ィヒフカンオリゴ糖の再現性よい製造に用いることができる新規の硫酸ィ匕フカン分解酵素及ぴ該酵素の製造方法が提供される。また、該酵素を使用することにより製造できる、糖鎖工学用試薬として有用な硫酸化フカンオリゴ糖及びそれらの製造方法が提供される。

Claims

請求の範囲

1. フコフィラス（Fu c o p h i 1 u s) 属細菌の培養物から得られたヒパマタ目褐藻由来硫酸化フカン分解酵素。

2. 下記の理化学的性質を有することを特徴とするエンド型ひ一 (1-4) L ーフコシダーゼである請求項 1記載の硫酸化フ力ン分解酵素：

(I) 下記式（V) で表される硫酸ィ匕フカンオリゴ糖に作用して、ひ一（1— 4) Lーフコシル結合をエンド的に切断する；

(I I ) 約 6〜 8の範囲に至適 p Hを有する；

(I I I) 約 10〜40°Cに至適温度を有する。

3. フコフイラス属細菌を培養し、その培養物から該酵素を採取することを特徴とする請求項 1記載の硫酸化フカン分解酵素の製造方法。

4 - 褐藻類由来硫酸ィヒ多糖に請求項 1記載の硫酸ィヒフカン分解酵素を作用させて得られる硫酸ィ匕フカンオリゴ糖。

5 · 褐藻類由来硫酸化多糖に請求項 1記載の硫酸化フカン分解酵素を作用させて取得することを特徴とする硫酸ィ匕フカンオリゴ糖の製造方法。

6. 下記一般式 (I) で表される糖化合物又はその塩。

(式中、 Rは H又は S0₃ H又は CH₃ CO又は下記一般式（VI I) であり、 R₁はH又はSO₃H又はCH₃COでぁる。 R、 R丄のうち少なくとも 1つは S O₃ Hである。 nは 1以上の整数である。）

(式中、 Rは H又は S0₃ H又は CH₃ COである。）

7. 下記一般式（I) で表される硫酸ィ匕フカンオリゴ糖又はその塩。

(式中、 Rは H又は S〇₃ H又は CH₃ CO又は下記一般式（VI I) であり、 1^は H又は S0₃H又は CH₃COである。 R、 R iのうち少なくとも 1つは S 0。 Hである。 nは：！〜 4の整数である。）

(式中、 Rは H又は S〇₃ H又は CH₃ COである。）

8. 請求項 1記載の硫酸化フカン分解酵素をヒバマタ目褐藻類由来硫酸ィ匕多糖に作用させて下記一般式（V I I I) で表される硫酸ィ匕フカンオリゴ糖を製造する製造方法：

(式中、 Rは H又は SO₃ H又は CH₃ CO又は下記一般式（V I I) であり、 Rのうち少なくとも 1つは S〇₃ Hである。 nは 1以上の整数である）： (VII)

OR H

(式中、 Rは H又は S0₃ H又は CH₃ COである）。

9. ヒ/ マタ目褐藻類が F u c u s v e s i c u 1 o s u s又は A s c o p hy l l um n o d o s umである、請求項 8記載の硫酸化フカンオリゴ糖の製造方法。