WO2003051382A1

WO2003051382A1 - Procédé d'induction d'apoptose et compositions pour cette dernière

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Publication number: WO2003051382A1
Application number: PCT/JP2002/013146
Authority: WO
Inventors: Takeshi Mori
Original assignee: Sundory Co., Ltd.; Kyowa Engineering Co., Ltd.
Priority date: 2001-12-14
Filing date: 2002-12-16
Publication date: 2003-06-26
Also published as: CN1620305A; EP1454626A4; KR20040059495A; US20050163801A1; AU2002366310A1; JPWO2003051382A1; EP1454626A1

Description

明細書

アポトーシスを誘導する方法およびそのための組成物技術分野

本発明は、カヮリハラタケを抽出処理して得られる物質を含有するアポト一シスを誘導する方法およびそのための組成物に関する。背景技術

アポト一シス（プログラム細胞死）は、個体発生における形態形成の過程や成長した個体の組織の恒常性の維持などに重要な役割を果たしている。例えば、消化管上皮細胞の更新、自己抗原を認識する T細胞の破壊、いったん過剰に形成されてから特定の部位で細胞死が起ることにより特有な層構造が形成される中枢神経系などがその例である。一般に、細胞のアポトーシスによる死は、細胞内での新たなタンパク質合成を必要とし、細胞死を誘導する遺伝子は自殺遺伝子と呼ばれている。

一般に、癌細胞は何らかの遺伝子変異により自律増殖を獲得し、無制限に増殖し続ける。近年、アポトーシスの研究が進み、アポトーシスの分子機構が明らかになりつつある。前骨髄性白血病細胞株である H L 6 0細胞株は、アポトーシス誘導物質のスクリーニングに好適なモデルとしてよく用いられている。またこの H L 6 0細胞株は、分化誘導物質のスクリーニングにも最適なモデルである。 H L 6 0細胞株は分化誘導されると、増殖が抑制され、最終分化により造腫瘍作用を失う（脱癌状態）。癌治療において、アポ卜一シスの誘導ならびに分化誘導が有効な手段として考えられている。ある種の抗癌剤ゃレチノイン酸誘導体はすでに臨床応用されている。抗腫瘍効果を有する植物由来の物質もまた多く見出されている。近年では、タキサン系抗癌剤、ビン力アルカロイド系抗癌剤、カンプトテンシン（アルカロイド）などが開発され、臨床で成果を上げている。

ノ、ラタケ属担子菌 A g a r i c u s b 1 a z e i M u r i 1 1 (力ヮリハラタケ）は、一般にァガリクス茸と呼ばれ、抗腫瘍活性を有することが知られている。カヮリハラタケの粉末または種々の抽出物は、健康食品として経口的に利用されている。カヮリハラタケ由来の成分に関し、）3— D—グルカンに代表される多糖類、タンパク質などの高分子物質の作用に関する報告が多数ある。しかし、タンパク質、多糖類などの高分子物質は、一般に、必ずしも消化管からの吸収が良いとは限らない。これまで、一般に、カヮリハラタケの菌体成分は消化され難いことが知られており、医薬品および健康食品として、優れた生理活性を有し、かつ経口投与が可能なカヮリハラタケ由来の物質が求められている。発明の開示

カヮリハラタケ由来の素材について、細胞増殖抑制作用、分化誘導作用、またはアポトーシス誘導作用を確認し、優れた生理活性を有し、かつ経口投与が可能な医薬品および健康食品の材料となるカヮリハラタケ由来の素材を提供する。本発明は、細胞のアポトーシスを誘導する組成物に関し、この組成物は、カヮリハラタケの抽出物を含む。

好ましくは、上記組成物は、薬学的に受容可能なキャリアをさらに包含する。好ましくは、上記細胞は癌細胞である。

好ましくは、上記組成物は、分化誘導剤をさらに含む。

好ましくは、上記分化誘導剤はビタミン A誘導体である。

好ましくは、上記ビタミン A誘導体は、トレチノインである。

上記ビタミン A誘導体はまた、カロテノイドであり得る。

本発明はまた、細胞のアポトーシスを誘導する方法に関し、この方法は、カヮリハラタケの抽出物を含む組成物を被験体に投与する工程を包含する。

好ましくは、上記組成物は分化誘導剤をさらに含む。好ましくは、上記分化誘導剤は、ビタミン A誘導体である。

好ましくは、上記ビタミン A誘導体はトレチノインである。

代表的には、上記カヮリハラタケの抽出物は、カヮリハラタケの子実体を熱水抽出することにより得られる。

上記カヮリハラタケの抽出物は、カヮリハラタケの子実体を熱水抽出する工程、抽出物を透析処理する工程および透析外液をクロマトグラフィー処理する工程によって得られる分子量 1 0 0〜2 0 0 0のクロマトグラフィ一主溶出画分を有効成分として含み得る。

あるいは、上記カヮリハラタケの抽出物は、カヮリハラタケの子実体を熱水抽出する工程、抽出物にエタノールを加えて混合し、混合物を遠心分離して沈殿と上澄液に分ける工程、上澄液にエタノールを加えて混合し、混合物を遠心分離して沈殿と上澄液に分ける工程および沈殿物を蒸留水に溶解して透析処理する工程によって得られる透析外液を有効成分として含み得る。 '

上記カヮリ八ラタケの抽出物は、必要に応じて、薬学的に受容可能なキャリアと配合された形態であり得る。このような薬学的に受容可能なキャリアは当業者に公知であり、制限されないで、例えば、以下を包含する：リンゲル溶液、ハンクス溶液、または緩衝化生理食塩水などの緩衝液；ゴマ油などの脂肪酸、ォレイン酸ェチルまたはトリグリセリドなどの合成脂肪酸エステル；ラク卜一ス、スクロース、マンニトール、ソルビト一ルなどの糖類；トウモロコシ、コムギ、イネ、ジャガイモなどの植物由来デンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルポキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース； 7 ラビアゴム、トラガカントゴムなどのゴム；ゼラチン、コラーゲンなどのタンパク質；架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩など。

本発明はまた、癌細胞のアポ卜一シスを誘導するための組成物の調製のためのカヮリハラタケの抽出物の使用に関する。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の効果を示す図であって、カヮリハラタケの抽出物（ABMK -22) 存在下の白血病細胞株（HL— 60株）の増殖抑制効果を示す。

図 2は、本発明の効果を示す図であって、カヮリハラタケの抽出物（ABMK -22) 存在下の白血病細胞株（HL— 60株）の増殖抑制効果を示す。

図 3は、本発明の効果を示す図であって。カヮリハラタケの抽出物（ABMK -22) 存在下の白血病細胞株（HL - 60株）の増殖抑制効果を示す。

図 4は、本発明の効果を示す図であって、カヮリハラタケの抽出物（ABMK -22) 存在下の白血病細胞株（HL— 60株）の増殖抑制効果を示す。

図 5は、本発明の効果を示す図であって、カヮリハラタケの抽出物（ABMK

-22) 存在下の白血病細胞株（HL— 60株）の増殖抑制効果を示す。

図 6は、本発明の効果を示す図であって、カヮリハラタケの抽出物（ABMK -22) 存在下の白血病細胞株（HL— 60株）の増殖抑制効果を示す。

図 7は、本発明の効果を示す図であって、カヮリハラタケの抽出物（ABMK -22) の白血病細胞株（HL— 60株）に対する分化誘導効果を示す。

図 8は、分化誘導剤（ATRA) の白血病細胞株（HL— 60株）に対する分化誘導効果を示す図である。

図 9は、本発明の効果を示す図であって、カヮリハラタケの抽出物（ABMK -22)の白血病細胞株（HL— 60株）に対するアポトーシス誘導効果を示す。図 10は、本発明の効果を示す図であって。カヮリハラタケの抽出物（ABM

K-22) および分化誘導剤（トレチノイン）併用による白血病細胞株（HL— 60株）に対するアポト一シス誘導効果を示す。

図 1 1は、分化誘導剤（VD₃) の白血病細胞株（HL— 60株）に対する分化誘導効果を示す図である。

図 12は、カヮリハラタケの抽出物（ABMK— 22) に含まれる成分の白血病細胞株（HL— 60株）に対する増殖抑制効果を示す図である。図 1 3は、カヮリハラタケの抽出物（A B MK—2 2 ) に含まれる成分の白血病細胞株（H L— 6 0株）に対するアポトーシス誘導効果を示す図である。図 1 4は、カヮリハラタケの抽出物（A B MK— 2 2 ) に含まれる成分の免疫賦活活性を示す図である。

図 1 5は、カヮリハラタケの抽出物（A B MK—2 2 ) に含まれる成分の免疫賦活活性を示す図である。

図 1 6は、ピシバニールの免疫賦活活性を示す図である。発明を実施するための最良の形態

以下に本発明の細胞のアポトーシスを誘導するカヮリハラタケ由来の素材または組成物の製法について説明する。

本発明で用いられるカヮリハラタケは、カヮリハラタケの子実体または菌糸体部分であって、天然物であっても人工培養物であってもよい。市販されている乾燥物もまた便利に利用できる。カヮリハラタケは、そのまま、または裁断され、または粉砕されて、カヮリハラタケの抽出物の調製に供される。

カヮリハラタケの抽出物は、溶媒として水、低級アルコールなどを用いて得たカヮリハラタケ由来成分を含むカヮリハラタケの抽出物であって、代表的には、水、エタノール、含水エタノールなどが用いられるが、細胞のアポトーシスを誘導する活性を有する画分が抽出される限り任意の溶媒を用い得る。一般に、上記溶媒は、上記乾燥子実体またはその粉末の重量に対して 2〜1 0倍の重量で添加されて抽出操作が行われる。上記溶媒の例として、水、エタノール、プロパノ一ル、ブ夕ノール、アセトン、 1 , 3—ブチレングリコール、酢酸ェチル、へキサン、塩化メチレン、メタノールまたはそれらの混合物が挙げられる。

代表的には、カヮリハラタケの抽出物は、上記溶媒として水を用い、力ヮリハラタケを熱水抽出することによって得られる。

代表的には、カヮリハラタケの熱水抽出は、乾燥子実体に 5から 1 0倍の水を加えて 1〜 3時間加熱還流することによって行われる。カヮリハラタケの熱水抽出は、熱水抽出残渣についてもさらに加熱還流を繰り返して行われ得る。このようにして得られる熱水抽出液は、凍結乾燥、スプレードライなど、当業者に公知の方法によって乾燥物（以下乾燥物 Aという）とする。この乾燥物に、 5〜2 0 倍の水を加え、透析チューブに入れ数倍の蒸留水で 1 0〜1 5時間透析し、透析外液を凍結乾燥することによって、細胞のアポトーシスを誘導する活性を有する乾燥物（以下乾燥物 Cという）を得ることができる。

次に、透析内液についても、さらに流水中で 2 0〜4 0時間透析し、そして蒸留水で 2回各数時間透析した後に得られる透析内液を上記と同様に乾燥物とすることにより、細胞のアポトーシスを誘導する活性を有する乾燥物（以下乾燥物 B という）を得ることができる。

次に、得られた上記乾燥物 Cを、約 1 0倍の蒸留水に溶解し、蒸留水を流出溶媒としてクロマトグラフィーを行い、 2 0 mLずつ分取し、多くの画分を得る。得られた画分の中程の主溶出画分で、ゲル濾過法によって分子量 1 0 0〜2 0 0 0の画分が、本発明の細胞のアポトーシスを誘導する活性を有する画分である。これらの画分は、さらに O D S (ォクタデシルシラン化シリ力ゲル) を用いる逆相クロマトグラフィ一、 D E A E— T O Y O P E A R L 6 5 0を用いるイオン交換クロマトグラフィーなどを用いて分析すると、アルギニン、リジン、マンニトールの他、数種の成分を含んでいることが確認されている。

また、上記の方法で得られる熱水抽出液に等量のエタノールを加えて混合し、遠心分離処理して沈殿と上澄液に分ける。得られる上澄液にさらにその 1から 3 倍量のエタノールを加えて混合し、遠心分離処理して得られる沈殿を蒸留水に溶解し、この溶液を透析処理して得られる透析外液もまた低分子画分であって、本発明の細胞のアポトーシスを誘導する活性を有する画分である。

このようにして得られた細胞のアポ卜一シスを誘導する活性を示すカヮリハラタケの抽出物またはその画分は、そのまま、あるいは経口医薬製剤の製造に用いられる種々の賦形剤と共に医薬製剤の製造に用いることができる。また、この細胞のアポ卜一シスを誘導する活性を示す力ヮリハラ夕ケの熱水抽出物またはその画分は、そのまま、または他の食品と共に健康飲食品として利用することができる。

本発明の組成物は、代表的には、生体適合性の薬学的キャリア（例えば、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、デキストロース、および水など）とともに経口的に摂取され得る。本発明の組成物は、単独または他の薬剤もしくは食品素材と組み合わせて摂取され得る。

本発明の組成物は、経口的または非経口的に投与され得る。非経口的投与は、局所、皮膚塗布、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、クモ膜下腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻孔内投与を含む。好ましくは、本発明の組成物は、静脈注射および動脈注射により投与される。本発明の薬学的組成物の処方および投与の詳細は、例えば、当該分野における教科書「REMINGT〇N ' S PHARMA CEUT I CAL S C I ENCESJ (Ma a c k Pub l i s h i ng C o. 、 Ea s t on、 PA) に記載に従って行なわれ得る。

経口投与のための組成物は、投与に適した投与形態で当該分野で周知の薬学的に受容可能なキャリアを用いて処方され得る。このようなキャリアは、得られる組成物が、患者による摂取に適した、錠剤、丸剤、糖衣剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁物などに処方されることを可能とする。

本発明の組成物は、カヮリハラタケ抽出物を、アポトーシスを誘導するに有効な量で含む。「薬理学的に有効な量」は、当業者に十分に認識される用語であり、意図される癌症状を軽減するために有効なカヮリハラタケ抽出物の量をいう。従つて、薬学的に有効な量は、アポトーシスを誘導するのに十分な量である。

「薬理学的に有効な量」を確認する有用なアツセィの例は、被験体における癌症状の軽減の程度を測定することである。実際に投与されるカヮリハラタケ抽出物の量は、処置が適用される個体の健康状態などに依存し、所望の効果が達成されるように最適化された量である。薬学的に有効な量を決定することは、当業者にとつて慣用的な手順である。

薬学的に有効な量は、まず、細胞培養によるインビトロアッセィまたは適切な動物モデルによって評価され得る。次に、このような情報を用いて、ヒトにおける投与に有用な量および投与の経路を決定し得る。

アポト一シスを誘導するのに十分な量の目安は、制限されないで、本発明のァポトーシスを誘導する画分の乾燥固形分として、成人に対し、 0. 1~308 人日、好ましくは 3〜15 人 Z日となる量である。

また、上記のアポトーシスを誘導する活性を有するカヮリハラタケの抽出物またはその画分は、その機能を発揮するに十分な量で、選択された 1種またはそれ以上の食品素材と混合される。選択された 1種またはそれ以上の食品素材は、当業者に公知の形態、通常粉末形態で、この免疫賦活活性を有する画分と混合される。そしてこれらは、用途または好みに応じて、液状の食品として供することができる。あるいはハードカプセル、ソフトカプセルなどのカプセル剤、錠剤もしくは丸剤としてか、または粉末状、顆粒状、茶状、ティ一パック状もしくは、飴状などの形状に成形され得る。

以下、実施例により本発明をより詳細に説明するが、以下の実施例は本発明の例示であり、本発明を制限するものではない。実施例

(実施例 1 )

Agar i cu s b l az e i Mu r i 1 1 '300 g (協和ァガリクス茸）に蒸留水 2 Lを加え、 2時間加熱還流を行った。得られた液を濾過して濾液 (熱水抽出液）と残查とに分けた。残查には再び蒸留水 2 Lを加え、さらに 2時間加熱還流して熱水抽出を行い濾液を得た。さらに残った残查についてもう一度同様の熱水抽出を行った。得られた濾液を合わせて凍結乾燥し、乾燥物 A (15 3 g：抽出率 51 %) を得た。

50 gの乾燥物 Aに 50 OmLの蒸留水を加え、透析チューブ（S p e c t r a/Po r Memb r a n e 50 X 31、 8mm i d X30m、 FE— 0526 - 65) に入れた。これを 3 Lの蒸留水に対して 1 2時間透析した。得られた透析外液を凍結乾燥して乾燥物 C (27 g ：抽出率 53%) を得た。透析内液についてはさらに流水中で 30時間透析し、その後蒸留水で 2回（各 4時間、合計 8時間）透析した後、透析内液を凍結乾燥し、乾燥物 B (l l g ：抽出率 2 2 %) を得た。続いて、 3 gの乾燥物 Cを 3 OmLの蒸留水に溶かし、 TOYO PEARL HW40 C (40mm i d X 420 mm) を用いるクロマトグラフィ一を行った。流出溶媒はすべて蒸留水を用いた。各フラクションについてそれぞれ 2 OmLずつ分取し、画分 1〜30を得た。それらのフラクションは薄層クロマトグラフィーを参考にして以下の 5群に分けた。重量は次の通りであつた。画分；！〜 1 1 (75mg、 2. 5%) 、画分 12〜1 5 (920mg、 3 0. 7%) 、画分 1 6〜： 1 7 (1 570mg、 52. 3%) 、画分 18〜： 1 9 ( 2 70mg、 9 %) 、画分 20〜28 (97mg、 3. 2 %) 。

画分 16 (以下 1 S Y_ 16という）の赤外線吸収スペクトル（I R) デ一夕は以下の通りであった。

画分 16 : I R (KB r) 3390、 3325、 3285、 2940、 2920、 1 641、 1634、 1622、 1 61 5、 1 600、 1 595、 1405、 1 394、 1084、 1020 :分子量（ゲル濾過法） 100〜 2000。

(実施例 2)

実施例 1と同様の熱水抽出を実施して、合わせた濾液（熱水抽出液） 6 Lを得た。この濾液を減圧濃縮して 1 Lとし、これに多糖を分離する目的でエタノール 1 Lを加えて混合し、遠心分離して沈殿と上澄液を得た。この上澄液にさらにェタノ一ル 3 Lを加えて混合し、遠心分離して得られる沈殿を蒸留水に溶解し、透析処理した。得られた透析外液を凍結乾燥し、得られた粉末を ABMK— 22とした。

(実施例 3)

ァガリクス熱水抽出物の透析外液の凍結乾燥粉末（ABMK— 22) の細胞増殖抑制作用（試験 1) 、細胞分化誘導作用（試験 2) 、およびアポト一シス誘導作用（試験 3) を調べた。

各々の生理活性試験は以下の方法により実施した。

1. 細胞増殖抑制作用（試験 1) ： CD— DST (Co l l a ge n ge l d r o p l e t embe dd e d c u l t u r e— d r ug s e n s i t i v i t y t e s t) 法および血球計数計算板を用いて調べた。

CD— D ST法は、 H. Kob aya s h iらの方法（ I NTERNAT I O NAL J OURNAL OF ONCOLOGY 11 : 449一 455、 1 997) に従って実施した。

要約すれば、まず、被験細胞（HL60細胞株）の懸濁液を、コラーゲン（例えば、 I型コラーゲン（C e 1 1 ma t r i X Type CD, N i t t a G e 1 a t i n I nc. ) ) , 再構築緩衝液および培養培地 (例えば、濃縮 F— 1 2培地）と氷冷下で混合し、被験細胞をコラーゲンゲルに包埋する。得られた混合液を、多ゥエルプレートのゥエル中に、ゥエルあたり 10³〜10⁴細胞（コラ一ゲンゲルドロップとして約 3滴）となるように入れ、 C〇₂インキュベータ中 37°Cで一晩培養する。次いで、被験薬剤を所定の濃度で添加し、 24時間培養する。その後、薬剤を除去し、ゥエル中の細胞を緩衝液ですすいで培地を添加しさらに 7日間インキュベートする。培養終了後、コララーゲンゲル中に生育したコロニーをニュートラルレッドで染色する。さらに、各コラーゲンゲルドロップを 10%中性ホルマリン緩衝液で固定し、水で洗浄した後、風乾して画像解析する。細胞増殖抑制効果は癌細胞の増殖形態とニュートラルレツド染色度の差異を利用して癌細胞コロニーのみの補完体積値を算出し、 ABMK— 22非処理群と処理群との相対増殖率の比を求めた。 CD— DST法は、主に固形癌の d r u g s e n s i t i v i t y t e s t法として開発されたが、 g r o w t h a s s ay法であるため、細胞の増殖状態の測定に応用可能である。

血球計数計算板を用いる方法は、臨床検査法提要第 30版（平成 5年 8月 20 日発行、金原出版株式会社、東京）に記載の方法に従って行った。

2. 細胞分化誘導作用（試験 2) ： NBT (ニトロブル一 'テトラゾリゥム）還元能で判定した。

N B T還元能は、 S . J . Co l l i n sらの方法（I n t. J. C an c e 1" : 25、 21 3— 218頁（1980) ) に準じて行った。要約すれば、 HL 60細胞の約 2 X 10⁵細胞をペレツト化し、 RPM I - 1640培地で洗浄した後、 0. 1 %NBTおよび 100 n g/m 1の ph o r bo l e s t e r (T PA) を含む RPM I _ 1640培地に懸濁し、 37 °Cで 40分間培養する。これを顕微鏡下に観察し、青黒色の沈着物を有する細胞を、分化した細胞として評価した。

3. アポト一シス誘導作用（試験 3) ： TUNEL法（ t e rm i n a 1 d e o x ynu c 1 e o t i dy l t r a n s f e r a s e (TdT) -me d i a t e d d e oxyu r i d i n e t r i p h o s ph a t e (d UTP) - i o t i n n i c k e nd- l a b e l i ng me t hod) を用レ^ て測定した。 TUN EL法は、 1992年、 Gav r i e l iら（Ya e l G av r i e l iら、 The J ou r n a l o f Ce l l B i o l o gy、第 1 19卷、 No. 3、 1992年 1 1月、 493— 501頁）によって報告された、組織切片上アポトーシスを指摘する方法である。種々の病態における個々の細胞レベルでのアポトーシスの観察、形態変化との対比を可能にする方法として知られている。 TUNEL法は、 Gav r i e 1 iら（前述）の方法に準じ、 Ap o p t o s i s i n s i t u De t e c t i on K i t w a k o (和光純薬工業株式会社）を用い、 HL— 60細胞株に対して行った。

4. 細胞増殖抑制作用（試験 1) の測定結果

HL 60細胞株を用いた測定の結果、 CD— DST法は、浮遊系細胞の増殖状態を測定するには適当でないことが明らかとなった。従って、細胞増殖抑制作用は、血球計数計算板を用いて測定した。

まず、 HL60細胞株の増殖を、種々の濃度の A BMK - 22の存在下で調べ、 HL 60株の増殖曲線を得た。すなわち、 HL 60細胞株の初期細胞数を 20万 ZmLとし、 ABMK- 22を、それぞれ、 0. 1、 0. 25、 0. 5、 0. 7

5、 1、 2、 2. 5、 3、 4、および SmgZlmLの濃度となるように添加して培養し、 4日間経時的に細胞数を測定した。

図 1に、各濃度の ABMK— 22存在下における、 HL60細胞の増殖曲線を示す。図 1中の各シンポルは、図 1の下に示した各シンポルに対応して記載された数字の ABMK— 22濃度（mgZm 1 )存在下での細胞数測定結果を示す（個 /ml) 。図 2〜図 5は、それぞれ培養 1日目、 2日目、 3日目および 4日目の細胞数測定結果を、培養日数毎に AMBK— 22の濃度に対してプロットしたものである。

図 2に示すように、培養 1日目では、 lmg/mLまでの濃度の ABMK— 22 は、 HL 60細胞の増殖には影響を示さず、 2mg/mL以上の濃度で、 ABMK 一 22は、濃度依存的に HL 60細胞の増殖を抑制した。

図 3に示すように、培養 2日目では、 0. 25mg/mL以上の濃度の ABMK 一 22は、コントロールに比べ、濃度依存的に HL 60細胞の増殖を抑制した。図 4に示すように、培養 3日目では、 0. lmgZmL濃度の ABMK— 22 は、コントロールに比べ、 HL 60細胞の増殖を約 50%抑制した。また、増殖が抑制された細胞は、形態学的にも細胞死を引き起こしていた。そして 0. 25 mg/mL以上の濃度の ABMK— 22存在下では、コントロールに比べ、生細胞が著しく低減し、優れた殺細胞効果を示した。図 5に示すように、培養 4日目では、 0. lmgZmL濃度の ABMK— 2は、コントロールに比ぺ、 HL 60細胞の増殖を約 84 %抑制した。また増殖が抑制された細胞は、形態学的にも細胞死を引き起こしてした。そして 0. 25mgZ mL以上の濃度の ABMK— 22は、培養 3日目と同様、 HL 60細胞に対し優れた殺細胞効果を示した。

図 6は、上記の結果を、コントロールに対する増殖抑制効果 (T/C ) として経時的に示した結果である。縦軸は、コントロールに対する増殖抑制効果（T/ C%) を、横軸は、培養に添加した ABMK— 22の濃度を表す。図 6に示されるように、 ABMK- 22は、 HL60細胞に対して時間依存的な増殖抑制効果を示した。すなわち、培養 1日目（黒丸）では 2mgZmL以上、そして培養 2 日目（白四角）では lmg/mL以上の濃度で濃度依存的な HL 60細胞の抑制効果が観察された。培養 3日目（白三角）および 4日目（白丸）では、いずれも、低濃度の ABMK— 22で HL 60細胞の優れた増殖抑制効果が観察され、この抑制効果は、細胞死によるものであることが確認された。

5. 細胞分化誘導作用（試験 2) の測定結果

種々の濃度の ABMK— 22の存在下で、 4日間、 HL 60細胞を培養し、 A BMK— 22の分化誘導能を測定した。各濃度の HL 60細胞株の分化の指標である NBT還元能の測定結果を図 7に示した。図 7に示されるように、 ABMK 一 22は、濃度依存的に NBT陽性細胞を増加させ、 4mgZmL濃度では生細胞の約 33%が分化していた。この値は、 HL 60細胞株の分化のコントロールとして用いられているオールトランスレチノイン酸（ATRA) の 10— ⁸〜10 一⁷ Mに相当する優れた分化誘導作用である（図 8を参照のこと）。図 8は、 AT R Aの細胞分化誘導作用を同じアツセィ系で測定した結果である。

6. アポトーシス誘導作用（試験 3) の測定結果

上記の結果から、 ABMK— 22は、時間依存的に殺細胞効果を示し、かつ、低濃度でも殺細胞効果を示したことから、 ABMK— 22がアポトーシスを誘導したと考えられた。そこで、 ABMK— 22のアポトーシス誘導作用を TUNE L法で確認した。

ABMK—22を 1日間添加した上記の結果（図 2) より、細胞増殖がコント口ールと変わりなかった 1 m g ZmLと、増殖が著しく抑制されていた 5 m g Z mLを選び、 ABMK— 22を 1日間添加し、アポト一シスの誘導作用を測定した。結果を図 9に示す。図 9に示す結果は、各試験群について測定した結果を示す。図 9に示されるように、 ABMK— 22を lmgZmL添加したところ、コントロールに比べアポト一シスが誘導される傾向（p<0. 053) を示し、 5 mgZmLでは有意に（pぐ 0. 001) アポトーシスが誘導されていた。 lm gZmLと 5mgZmLの比較でも、 5mgZmLが有意に（p<0. 001) アポトーシスを誘導していた（S t ud e n t t—検定）。以上の結果から、 ABMK— 22による HL60細胞株の細胞死は、アポトーシスが誘導された結果生じた死であることが確認された。 (実施例 4) ABMK— 22の分化誘導剤との併用効果

HL 60細胞株に対して分化誘導作用を有する物質は、前述の活性型ビタミン D₃製剤（VD₃) と a l l— t r an s r e t i n o i c a c i d (ATR A；トレチノイン） ) がよく知られている。

HL 60細胞株は、 VD₃で単球 'マクロファ一ジ系に分化誘導され、そして ATRAで顆粒球系に分化誘導される。図 10に、各種濃度の ABMK— 22と、 10— ⁹〜10— 濃度の ATRAとの組み合わせによる、 HL60細胞株の細胞分化誘導作用を NBT還元能により評価した結果を示す。図 10に示されるように、 ABMK— 22と低濃度（10—⁹Μ〜10— "M) ATRAとの併用により、濃度依存的に分化が誘導され 10—⁹Mの ATRAとの併用では、分化の著しい亢進がみられ、併用効果が認められた。

図 1 1は、 10一⁶ M〜： L 0— M濃度の 1ひ， 25 (OH) 2D 3 (活性型ビ夕ミン D₃、以下 VD₃) 単独の HL 60細胞株の細胞分化誘導作用を NBT還元能により評価した結果を示す。図示されるように、 VD₃濃度が 10— ^1QM以下であると、 VD₃単独は細胞分化誘導作用を示さない。また図 8に示したように、 ATR A濃度が 10 _ ⁹ M以下であると A T R Aは分化誘導能を示さない。

癌細胞の増殖、分化およびアポトーシスは互いに関連していると考えられる。ある物質による増殖抑制は、細胞周期を止める。分化は増殖抑制の後誘導される。アポト一シスは直接的に死のシグナルを押す。細胞の増殖、分化およびアポトーシスは、方向性を決定するスィッチが異なるだけではないかと考えられる。従つて、ある物質の質的および量的な違いは、同時に細胞に増殖抑制、分化、アポト —シスを誘導し得る可能性がある。

癌細胞の分化誘導に対しては VD₃や AT R Aがすでに臨床使用されているが、副作用（VD₃では高カルシウム血症、 ATR Aではレチノイン酸症候群）のため、 VD₃は主に外用薬、 ATRAは APL (前骨髄性白血病：遺伝子変異が明らかな癌）のみに使用されている。

本明細書で示される結果、特に図 8および図 10に示される結果は、これら分化誘導物質の分化誘導が発現されない低濃度条件下で、他の物質（特に力ヮリハラタケ）と併用することによって、分化を有意に誘導し得ることを示す。また、これらの結果は、 ABMK— 22とビタミン A様物質（カロテノイド）との組み合わせによつとも併用効果によって分化を有意に誘導し得ることを示唆している。実際、本発明者らは、このことを証明している結果を得ている。

(実施例 5) ABMK-22に含まれる成分のアポト一シス誘導作用実施例 2で得られた A BMK— 22中のアポトーシス誘導作用をもつ成分を同定するために、 ABMK— 22をさらに精製および分画し、得られた成分について、上記実施例 3の 3. アポトーシス誘導作用（試験 3)に記載の方法に従って、得られた成分のアポトーシス誘導作用を調べた。 1. ABMK— 22に含まれる成分の精製および分画と構造解析実施例 2に記載の方法で得られた ABMK— 22 (約 13. 5mg) を 30m Lの蒸留水に溶かし、担体として ODS (50mm i d x 300 mm) を用いる逆'相クロマトグラフィーを行った。溶出溶媒は、蒸留水、 5 %メタノール Z水、 70 %メタノール Z水、および 100%メタノールを用い、順次成分を溶出した。各フラクションについてそれぞれ 20 OmLずつ分取し、各フラクションは、それらの薄層クロマトグラフィーによる分析結果を参考にして、以下の 5群に分けた。 ABMK 2201 (18. 7g、 93. 5%)、 ABMK 2202 (445m g、 2. 2%)、 ABMK2203 (36. 9mg、 0. 18%)、 ABMK22. 04 (3. 5 %)、 ABMK2205 (91. 3mg、 0. 46%)。続いて、 A BMK2202を 5 Omgづっ高速液体クロマトグラフィー（HPLC、 ODS カラム 20mm i d X 250 mm) に付し、 5 %メタノール/水で溶出させることにより ABMK6873 (34. 7mg、 0. 17%) および ABMK04 15 (2. 2mg、 0. 011%) をそれぞれ単離した。

ABMK6873および ABMK 0415について、以下の条件の質量分析および NMR分析に供し、その構造を解析した結果、これら 2つの成分は、それぞれ、以下の構造をもつ )3— N— (ァ—ダルタミル）一4一ホルミルフエ二ルヒドラジン（以下の式 Iで表される構造をもつ）および N— （3—力ルポキシプロピル） —2—ホルミル一 5—ヒドロキシメチルピロ一ル（以下の式 I Iで表される構造をもつ）、であることが確認された。

(NH₂)-C00H (式 I)

(式 I I)

[質量分析]

得られたピーク成分の凍結乾燥粉末を、 1 OmgZmlの濃度になるように、 m i 1 i—Q水を加えて水溶液とした後に測定に供した。測定装置として、 J E OL HX 110/11 OAタンデム型質量分析計を用い、以下の： FAB、E I、 C Iおよび HRFABの質量分析において、それぞれ、ポジティブ（FAB、 E I、 C I)、ネガティブ（FAB、 C I) およびネガティブ（HRFAB) の測定モードで測定した。なお、各質量分析における分解能は、 FAB、 E Iおよび C Iについて 1000、そして HRFABについて 5000で行った。

(1) FAB-MS

マトリックスとしてグリセ口一ルを用いた。試料搭載台でグリセロールと試料とを 1 ： 1 (vZv) で混合した直後に測定を行った。質量較正には、ポジティブモードではアルカリイオンの混合物を、ネガティブモードではョゥ化セシゥム (C s I ) のグリセロール溶液を使用した。

(2) E I一 MSおよび C I -MS

試料そのものをイオン源に導入した。 C Iではイオンガスとしてイソブタンを使用した。

(3) HRFAB - MS

質量較正試料として PEG— 500を使用した。試料搭載台でグリセロールと試料とを 1 ： 1 (vZv) で混合した後に適量の PEG— 500を添加し、直後にネガティブモードで測定を行った。質量較正は、目的ピーク（[M— H] —=2 10) を挟む 2本の PEG— 500のピークを選択して行った。

[NMR分析]

B r u k e r DMX 500核磁気共鳴装置 H 500MHz) および J E OL J NM— A400核磁気共鳴装置（^HA O OMHz) を用いて行った。質量分析後の試料を凍結乾燥後、重水（ 0. 3ml)に溶解して測定に供した。また、溶媒を重クロ口ホルムに再置換した試料を用いた測定も行った。

[結果の解析]

ABMK0415 :

上記各種質量分析モードにおけるいずれのスペクトルにおいても分子量 21 1 に相当するピークが観測され、この化合物の分子量は 21 1と決定された。次いで、ピーク感度がより良好なネガティブモードで HRFAB— MS測定を行つたところ、観測された精密質量 (m/z = 21 0. 0757)がC₁₀H₁₂〇₄N (— 1. Ommu) とよい一致を示したことから、ピ一ク I成分の分子式は、 C₁₀H ₁₈〇₄Nと決定された。

次に、構造情報を得る目的で各種 NMR測定を行い、 HMBCスペクトルのクロスピ一ク情報を基に解析した結果、上記式 I Iで示される構造をもっと推定された。

ABMK68 73 ：

FAB— MSにおいて、 mZz 266で偽分子イオン MH +を観察し、 E I 一 MSにおいて、トリフロォ口酢酸および酢酸誘導体については、それぞれ、 m /z 649

で M+イオンを、 mZz 331で [M_ H₂0] +イオンを観察した。 ^NMRにより、アルデヒドプロトン、 P—置換芳香環およびグルタミン酸残基— CO— CH₂— CH₂— CH (NH₂) -COO Hが特徴付けられた。 2個の芳香族プロトン（d 7. 91 p pm)の脱シールド、中性溶液（31 3 nm) およびアルカリ性溶液（385 nm) での UV吸収、 m /z 1 36 (C₇H₈N₂0) における重要なイオンの発生は、 p—ホルミルフェニルヒドラジンュニッ卜と一致した。

UVA¹²⁰ _maxnm (1 o g ε) ； 23 1 (3. 79)、 313 (4. 1 9) ; + N aOH 248 (3. 76)、 385 (4. 30)； +HC 1 23 1 (3. 7 9)、 3 1 3 (4. 1 9)： FAB⁺MS mZz (相対強度）： 266 (MH⁺、 100)、 20 1 (62)、 166 (16)、 137 (20)、 136 (15)、 1 3 2 (39)、 12 1 (16) ; ^ NMR (400. MHz、 D₂0) 9. 73 (1 H、 s、 — CHO)、 7. 9 1 (2H、 d、 J = 8. 5Hz)、 7. 03 (2H、 d、 J = 8. 5Hz)ゝ 3. 91 (1H、 t、 J = 6Hz、 Ha)、 2. 67 (2 H、 m、 Hr) 231 (2H、 m、 H)3)。

2. ABMK— 22に含まれる成分のアポトーシス誘導作用

次いで、 ABMK0415および ABMK6873の凍結乾燥粉末について、上記実施例 3の 3. アポトーシス誘導作用（試験 3) に記載のようにアポト一シス誘導作用を測定した。 ABMK0415は、 2. 07X 10— ⁶M〜 2. 07 X 10— ⁴M濃度範囲で、そして ABMK6873は、 2. 7Χ 10-⁶Μ〜2· 7 X 10_⁴Μ濃度範囲で試験した。結果を、図 12および図 13に示す。

図 12は、種々の濃度の ABMK0415および ΑΒΜΚ6873存在下における HL— 60細胞株の増殖曲線である。図 12中の各シンボルは、図 12の左上に示した各シンボルに対応して記載された濃度の成分の存在下における細胞数測定結果を示す（個 Zml)。白丸は、アポトーシス誘導能についてポジティブコントロールのァクチノマイシン D (ACD)、そして黒丸は、薬剤なしの対照試験区の測定結果である。

図 12に示されるように、 ABMK0415および ABMK6873のいずれもが、ほぼ濃度依存的に HL— 60細胞の増殖を抑制し、特に、 ABMK041 5の 2. 07X 10— ⁴M存在下、および ABMK6873の 2. 7X 10— ⁴M存在下では、 HL— 60細胞の増殖が著しく抑制されることが示された。

図 13は、培養 2日後の、 ABMK0415の 2. 07 X 10— ⁴M存在下および ABMK6873の 2. 7X 10— ⁴M存在下における、アポトーシス陽性細胞の比率を示した図である。図 13の横軸は各試験区を、そして縦軸はアポト一シスを起こした細胞の割合を示す。図 13に示されるように、 ABMK041 5の 2. 07 X 10— ⁴M存在下では、約 35%の細胞において、そして ABMK68 73の 2. 7 X 10— ⁴M存在下では、約 70 %の細胞においてそれぞれアポトーシスが誘導され、 ABMK0415および ABMK6873がアポト一シス誘導能を有していることが確認された。

(実施例 6) ABMK-22に含まれる成分の免疫賦活活性の測定

上記の ABMK0415および ABMK6873について、免疫賦活活性を測定した。

樹状細胞（d e nd r i t i c c e 1 1 ) は、免疫の成立に関与する細胞である。樹枝状細胞、樹状白血球、 D細胞とも呼ばれる。脳を除く生体内各種組織器官に分布する骨髄細胞由来の樹枝状形態をとる細胞群の総称である。この細胞群には、リンパ系樹状細胞（ 1 ymp h o i d dend r i t i c c e l l)、ランゲルハンス細胞、ベール細胞、相互連結細胞、間質細胞（ i n t e r s t i t i o n a 1 c e l l) などが含まれる。生体内で異物の侵入により開始される炎症応答に伴い、異物を取り込んで（p i no c y t o s i s) 局所から輸入リンパ管を経て所属リンパ節または血流に乗って脾臓へと移動する。 T細胞依存性領域に達した後、抗原をクラス I I抗原と結合した形で提示し特異的 T細胞を活性化することにより免疫応答を開始させることが知られている。いわば免疫の根幹をつかさどる細胞である。本実施例では、 ABMK0415および ABMK 6873の免疫賦活活性を、単球の樹状細胞への誘導能をアツセィすることにより確認した。

1. 材料および方法

1. 一 1. 材料

同意を得ることのできた 2人の健常人の末梢血を材料として用いた。

1. 2. 末梢血単核細胞（p e r i ph e r a l l ood mononu c l e a r c e l l : PBMC) の分離

へパリン加採血された全血検体から F i c o l 1— P a que比重遠心法により PBMCを分離した。

1. 3. 被験試料

上記 ABMK0415および ABMK6873を被験試料とした。各実験に使用する細胞の培養液（10% じ3加1^ ]^ 1 - 1640, 5%ヒト AB血清加 RPM I - 1640) に、 ABMK0415および ABMK6873それぞれ 2 0 OmgZm 1の濃度で溶解し、孔径 0. 22 のフィルターを通して濾過滅菌したものを被験試料とした。

1. 4. 免疫賦活活性の測定

新規化合物の免疫賦活活性効果を、インビトロにおけるヒト末梢血単球由来樹状細胞（d e nd r i c c e 1 1 ： DC) 誘導能から検討した。

P BMCを炭酸ガスィンキュベ一夕一で 1時間ディシュ処理し、単球に富む付着細胞分画を得た。得られた細胞を、 GM—CSF (D I ACLONE Re s e a r c h製）および I L— 4 (BD B i o s c i e n c e s製）の各々 50 OUZml存在下で、 5 %ヒト AB血清加 RPM I _ 1640 (日研生物医学研究所製）中で培養した。

培養には、径 3. 5 cmのディッシュ（NUNC社製）を用いた。培養 6日目にピシバニ一ルおよび新規化合物を、それぞれ最終濃度がピシバニ一ルについては 0. l KEZml、そして ABMKO 41 5および ABMK6873については 200 g/m 1となるように加えた。なお、ピシバニ一ル（中外製薬製）は、 D C誘導能をもつポジティブコントロールとして用いた。ネガティブコントロ一ルは、 5 %ヒト AB血清加 RPM 1 - 1640を用いて同様に培養した細胞である。

デイシュ内のすべての DCを培養開始 7日目に回収し、その表面抗原をモノクローナル抗体（抗— CD 80 ； BD B i o s c i e n c e社製）を用いたフロ一サイトメトリーで解析した。なお、有意差検定は S t u d e n t ' s t - t e s tを用いて行った。

2.

検討を行った被験体で、 DC培養開始 6日目に ABMK041 5および ABM K6873を添加することによって、 CD 80分子の著しく強い発現誘導が認められた。その代表的パターンを示した一例を図 14および図 1 5に示す。

図 14は ABMK6873についての試験結果を示す。図 14の上に示すチヤ一卜は、被験試料非添加の細胞のフローサイトメトリ一解析結果を、図 14の下に示すチャートは、 ABMK6873を添加した後の培養細胞のフローサイトメトリ一解析結果を示す。図においてチヤ一卜の横軸は、蛍光強度（10 g) を、縦軸は、細胞数を、そして Mlはコントロール抗体（I gGl F I TC) 測定値より設定した領域をそれぞれ示す。

図 14に示されるように、 ABMK6873の添加により、約 92% (測定数値は示さず）の DC上に CD 80の発現の増加が認められ、 ABMK6873の添加によって樹状細胞の活性化が誘導されることが示された。なお、 CD 80の発現は、 DCが Ml領域に存在することによって示される。

同様に、図 15は ABMK0415についての試験結果を示す。図 15の上に示すチャートは、被験試料非添加の細胞のフローサイトメトリ一解析結果を、図 15の下に示すチャートは、 ABMK0415を添加した後の培養細胞のフローサイトメトリー解析結果を示す。示されるチャートの横軸および縦軸は図 14と同じである。

図 15に示されるように、 ABMK0415の添加後により、約 20% (測定数値は示さず）の DC上に CD80の発現の増加が認められ、 ABMK0415 の添加によって樹状細胞の活性化が誘導されることが示された。

その一方、図 16は、同じ PBMCについて、 DC培養開始 6日目にピシバニ —ルを添加することによって得られた結果を示す。ピシパニールは DC誘導能をもつことが知られる物質である。図 16の上はピシパニール非添加、そして図 1 6の下はピシパニール添加により、約 26% (測定数値は示さず）の DC上に C D 80の発現増加が認められ、ピシバニールの添加によって樹状細胞の活性化が誘導されたことを示す。

図 14、図 15および図 16の結果により、 ABMK0415および ABMK

6873はともに、 DC誘導能を有し、特に ABMK6873は、ピシバニールよりも強い D C誘導能を有することが示された。産業上の利用可能性

癌細胞のアポトーシスを誘導する組成物およびそれを含む健康食品が提供される。カヮリハラタケ抽象物は、白血病細胞株の増殖を抑制し、そしてアポトーシスを誘導する成分を含んおり、アポトーシスの誘導ならびに分化誘導は、癌治療において有効な手段であるので、癌患者に有用な医薬品および健康食品が提供可能となる。

Claims

請求の範囲

I . 細胞のアポ卜一シスを誘導する組成物であって、カヮリハラタケの抽出物を含む組成物。

2 .薬学的に受容可能なキヤリアをさらに包含する、請求項 1に記載の組成物。

3 . 前記細胞が癌細胞である、請求項 1に記載の組成物。

4. 分化誘導剤をさらに含む、請求項 1に記載の組成物。

5 . 前記分化誘導剤が、ビタミン A誘導体である、請求項 4に記載の組成物。

6 . 前記ビタミン A誘導体がトレチノインである、請求項 5に記載の組成物。

7 . 前記力ワラリハラタケの抽出物が、カヮリハラタケの子実体を熱水抽出する工程、得られる抽出物にエタノールを加えて混合し、遠心分離して沈殿物と上澄液に分ける工程、該上澄液にエタノールを加えて混合し、遠心分離して沈殿物と上澄液に分ける工程、該沈殿物を蒸留水に溶解して透析処理する工程を包含する方法によって得られる透析外液である、請求項 1に記載の組成物。

8 . 細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、カヮリハラタケの抽出物を含む組成物を被験体に投与する工程を包含する、方法。

9 . 前記組成物が、薬学的に受容可能なキャリアをさらに包含する、請求項 8 に記載の方法。

1 0 . 前記細胞が癌細胞である、請求項 8に記載の方法。

I I . 前記組成物が分化誘導剤をさらに含む、請求項 8に記載の方法。.

1 2 .前記分化誘導剤が、ビタミン A誘導体である、請求項 1 1に記載の方法。

1 3 .前記ビタミン A誘導体がトレチノインである、請求項 1 2に記載の方法。

1 4. 癌細胞のアポト一シスを誘導するための組成物の調製のための力ヮリ八ラタケの抽出物の使用。