WO2003044523A1 - Procede de detection de tumeur maligne et kit de detection - Google Patents

Procede de detection de tumeur maligne et kit de detection Download PDF

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WO2003044523A1
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malignant tumor
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tumor
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Katsu Honzawa
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Hamamatsu Photonics K.K.
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G01N33/57488—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving compounds identifable in body fluids

Definitions

  • the present invention relates to a method and a kit for detecting a malignant tumor.
  • the present invention relates to a simple detection method and a detection kit using an amino group-containing low molecular weight tumor marker for early detection of a malignant tumor.
  • Amino group-containing compounds such as 3-hydroxyproline, pteridines, and polyamines are known as low-molecular-weight tumor markers for malignant tumors.
  • a commonly used method for analyzing polyamines is an enzymatic method, in which the total amount of free polyamines (force davelin, spermine, putretsin) is measured using acylpolyamine amidohydrolase.
  • Many types of cancer such as esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, bile duct cancer, knee cancer, lung cancer, ovarian cancer, prostate cancer, showed a discrimination rate of nearly 50% (Akiyuki Okubo, clinician, 24 , 11, 2234-2238 (1998)).
  • 3-Hydroxyproline is an amino acid specific to type IV collagen, a component of the basement membrane. When cancer cells proliferate and the basement membrane is breached, 3-hydroxyproline S is excreted in urine (Kubochi, K. et al .: Development of a direct measurement assay for collagenase against type I and type ⁇ V collagens m tissue homogenate ana its application in stomach and lung cancers.In Proteinases in inflammation and Tumor Invasion (Tschesche, H. ed.), 337- 356 (Walter de Gruyter and Co., Berline, 1986)). Okazaki and colleagues also used the ninhydrin method to analyze 97 cancer patients and 211 healthy subjects using an automatic amino acid analyzer.
  • liquid column chromatography has been used to detect and quantify the above-described various amino group-containing low molecular tumor markers.
  • it takes time to find analysis conditions suitable for a specific marker, and furthermore, it takes time for separation operation and detection, and the reproducibility of detection is not good.
  • the device itself has drawbacks such as difficulty in downsizing, and it has been extremely difficult to apply clinically to the diagnosis of subjects.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and has as its object to provide a simple and rapid detection method and detection kit for malignant tumors using an amino group-containing low molecular weight tumor marker. I do.
  • the present inventors considered that it is urgently necessary to establish a method for easily detecting and quantifying an amino group-containing low molecular weight tumor marker without using a liquid chromatography method.
  • the amino group-containing low-molecular-weight tumor marker in the sample is selectively labeled with an amino group-labeled dye (even in the presence of other in vivo amino group-containing low-molecular-weight compounds), and the labeled amino group-containing low-molecular-weight tumor is labeled.
  • the amount of marker can be quantified by spectroscopic techniques. Furthermore, by comparing the calculated value of the amount of the low-molecular weight tumor marker containing an amino group in the sample thus obtained with the threshold value of the tumor marker, it is possible to easily and quickly detect a malignant tumor. This led to the completion of the present invention.
  • step (c) calculating the amount of the labeled amino-group-containing low-molecular-weight tumor marker in the sample from the measured value obtained in step (b);
  • step (d) comparing the calculated value obtained in step (c) with a threshold value for the amino group-containing low-molecular-weight tumor marker, wherein the calculated value is larger than the threshold value, and if the calculated value is positive for the presence of a malignant tumor, Do
  • a method for detecting a malignant tumor comprising the above steps, is provided.
  • tumor markers such as antigens and antibodies
  • small molecule tumor markers are non-specific for tumor tissue, and the detection method of the present invention is suitable for primary screening of malignant tumors.
  • the method for detecting a malignant tumor may further include a step of pretreating the specimen before step (a).
  • the method for detecting a malignant tumor may further include, between steps (c) and (d), a step of correcting the calculated value of the amino group-containing low-molecular-weight tumor marker.
  • the amino group-labeled dye is preferably 4-chloro-172-trobenzozofurazan or 4-funoleol-72-trobenzofurazane.
  • an amino group-labeled dye is previously immobilized on a solid phase.
  • step (b) is preferably performed by fluorescence measurement.
  • the low-molecular-weight tumor marker containing an amino group is preferably 3-hydroxyproline.
  • the specimen is preferably urine.
  • the concentration is preferably corrected based on the amount of creatinine in the sample.
  • kits for detecting a malignant tumor using an amino group-containing low molecular tumor marker in a sample a standard solution of an amino group-containing low molecular tumor marker, an amino group-labeled dye, and a buffering agent
  • the kit for detecting a malignant tumor is provided, which comprises at least:
  • an amino group-labeled dye is preferably immobilized on a solid phase.
  • FIG. 1 shows that 3-hydroxyproline and 4-chloro-17-nitrobenzofurazan present in urine samples collected from healthy persons and cancer patients according to the method of the present invention.
  • the fluorescence intensity of the reaction product with (NBD-C 1) was measured, and the measured values were corrected for the creatine concentration in the urine sample for each sample, and the values were plotted separately for healthy subjects and malignant tumor patients. is there.
  • the present invention is characterized in that a malignant tumor is detected by selectively labeling an amino group-containing low molecular tumor marker in a sample from a subject and quantifying the labeled amino group-containing low molecular tumor marker. I do.
  • Tumor markers are substances that are produced in large amounts by tumor cells and are usually not detected and are also called tumor-associated antigens. Furthermore, autoantibodies to the antigen can be tumor markers since they are produced only after the antigen is produced in the same manner.
  • neoplastic cells may produce large amounts of hormones, enzymes, specific low-molecular compounds, and the like, all of which are useful for detecting the presence of malignant tumors (cancer).
  • an amino group-containing low molecular tumor marker particularly 3-hydroxyproline, is used as a tumor marker.
  • the reason for using the amino-group-containing low-molecular tumor marker is, as already described, easier to detect and quantify than high-molecular compounds such as antigen-antibody, and non-specific (tissue or organ) detection of malignant tumors (Ie, primary screen jungle).
  • an amino group-labeled pigment is used to label an amino group-containing low molecular tumor marker.
  • the former is 3-hydroxyproline, it is preferably 4-chloro-17 trovenzofurazan (NBD-).
  • NBD-F monofluoro-7-2 trovenzofurazan
  • NBD—C1 is used.
  • Samples that can be used in the present invention include serum, plasma, urine, cerebrospinal fluid, amniotic fluid, ascites, and all biological samples collected in normal in vitro diagnosis, such as lymphocytes, and a washing solution of tissues and cells with a solvent. And an extract.
  • urine and serum can be preferably used, but urine is more preferable in that, unlike blood sampling, urine is collected without pain.
  • the sample is urine
  • urine collected from the subject is centrifuged, and the resulting urine supernatant is hydrolyzed by reaction with hydrochloric acid. Subsequently, the hydrolyzed urine supernatant is freeze-dried and redissolved in buffer.
  • the buffer used for reconstitution is a borate buffer, a phosphate buffer, a Tris buffer, or the like.
  • urine as a sample may be diluted with an organic solvent miscible with water.
  • organic solvent used for this purpose include dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), and ethanol.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF dimethylformamide
  • ethanol ethanol
  • the specimen is reacted with an amino group-labeled dye to label an amino group-containing low molecular weight tumor marker contained in the specimen.
  • an amino group-labeled dye to label an amino group-containing low molecular weight tumor marker contained in the specimen.
  • the reaction between the two is typically as follows: It will be implemented as follows. That is, the sample is brought into contact with NBD-C1, and incubated at room temperature (about 20 to 50 ° C) for a predetermined time (1 to 2 minutes).
  • This reaction time is a time sufficient for only NBD-C1 and 3-hydroxyproline to react, and even if an amino group-containing low molecular weight compound (contaminant amino acid, etc.) is present in the sample, the Has low reactivity with NBD-C1 and produces little reactant under the above set reaction conditions, which may interfere with spectroscopic measurements.
  • the contact reaction can be performed regardless of whether the reaction system is a liquid phase or a liquid phase Z solid phase.
  • NBD-C1 since NBD-C1 is insoluble in water, it is used by dissolving it in an organic solvent that is miscible with water.
  • organic solvents include methanol, ethanol, ethynoleether, ethyl acetate, DMF, DMSO, acetate, and acetonitrile. Of these, acetonitrile is particularly preferred.
  • ⁇ of the reaction system is kept constant (particularly, the pH is in the range of about 8.0 to about 9.0).
  • a buffer is added to the reaction system. Suitable buffers include borate buffer, phosphate buffer, Tris buffer and the like. (Fixed)
  • the labeling reaction is performed in a liquid / solid phase system.
  • the amino group-labeled dye to be used is immobilized on a solid phase.
  • Suitable solid phases include tubes containing microtubes (made of glass or plastic), plates (eg, 96Z384 microwell plates), pipette tips, polystyrene beads, latex particles, magnetic particles, etc.
  • the material and shape of the sample is no particular limitation on the material and shape of the sample as long as it can be used and does not interfere with the spectroscopic measurement of the sample after the labeling reaction.
  • the immobilization method physical adsorption, covalent bonding, or other known methods can be used.
  • a surfactant and Z or a dispersing aid to more uniformly disperse and immobilize the amino group-labeled dye.
  • Suitable dispersing aids include polyethylene glycol, cyclodextrin, dextran and the like.
  • Suitable surfactants include Triton_X, sodium dodecyl sulfate (SDS), Tween-20, and the like.
  • an amino group-containing low-molecular weight tumor marker labeled with an amino group-labeled dye is spectroscopically measured, and the amount of the amino group-containing low-molecular weight tumor marker present in the sample is calculated.
  • the spectroscopic means to be used is not particularly limited as long as it can measure the fluorescence intensity or absorbance of the labeled dye.
  • the labeled amino compound has a fluorescent peak at about 550 nm. In addition, it has an absorption peak near about 500 nm. Therefore, in this case, an apparatus capable of measuring the visible absorption spectrum in the range of about 350 nm to about 600 nm is desirable. Also, an excitation wavelength of about 250 to 550 nm can be used, and about 350 to
  • An apparatus capable of measuring the fluorescence spectrum in the range of 600 nm is also desirable.
  • a sample of an amino group-containing low-molecular-weight tumor marker, an amino compound is reacted with a dye labeled with an amino group to measure the fluorescence intensity or absorbance of the labeled amino compound, and the concentration of the amino compound used is determined. And prepare a calibration curve for the amino compound in advance. The measured value of the fluorescence intensity or absorbance obtained from the specimen is compared with this calibration curve to calculate the amount of the labeled amino-group-containing low-molecular-weight tumor marker in the specimen.
  • the concentration of the calculated value of the amount of the amino group-containing low-molecular weight tumor marker obtained above is because the calculated value has a dilution error due to the difference in the amount of water intake and the amount of water divergence of the subject.
  • the creatine concentration in the sample is measured and the calculated value is corrected based on this.
  • a malignant tumor is detected based on the amount of the amino group-containing low-molecular-weight tumor marker in the sample obtained as described above.
  • the amount of the amino group-containing low-molecular weight tumor marker in a sample of a healthy subject as a control is calculated in the same manner.
  • concentration correction is necessary, the above-mentioned concentration correction is performed in the same manner to obtain a threshold value for one amino group-containing low-molecular-weight tumor marker. This threshold value is compared with a calculated value (or a corrected value) of an amino group-containing low-molecular-weight tumor marker in the subject's sample.
  • the subject is determined to be positive for the presence of the malignant tumor.
  • malignant tumors can be detected.
  • the present invention contemplates the primary screening of malignant tumors, where the positive test only implies that the subject may have a malignant lupus ulcer.
  • the subject who has received such a judgment should use another diagnostic agent (CEA, AFP, PSA, etc.) or a diagnostic method for other organ-specific malignant tumors, or use a biopsy, X-ray or MRI, etc. Inspection You should have a checkup.
  • Primary or metastatic malignant tumors that can be diagnosed using the detection method and the detection kit of the present invention are extremely diverse, and the following are typical examples.
  • these malignant tumors can be detected at various stages of progress, particularly at the first stage, and benign tumors in a subject to be screened can be detected. It can be identified from the presence or absence of malignant tumors.
  • kits that does not require complicated operations are preferable so that malignant tumors can be easily detected.
  • the kit since a large number of physiologically active substances are present in a living body, it is required that the kit be a detection kit capable of specifically discriminating and quantifying a grave marker.
  • the present invention satisfies such various requirements and provides a detection kit suitable for the method for detecting a malignant tumor according to the present invention, which comprises a standard solution of an amino group-containing low molecular weight tumor marker, an amino group-labeled dye, And a buffer.
  • a sample diluent (solvent, etc.), dissolution aid, solid-phased standard reagent, positive control, etc. may be included.
  • the buffer may be provided in a solid or liquid form, and is preferably a phosphate buffer, a phosphate buffer, a Tris buffer, or the like generally used in biochemical reactions, which is weakly alkaline. If necessary, a buffer is used to maintain the labeling reaction system of the amino group-containing low molecular weight triple ulcer marker in an appropriate pH region as described above.
  • the reaction system may be a liquid phase or any system of a liquid phase / solid phase.
  • the detection kit can take a corresponding form, but in order to maximize the advantages of the present invention, the latter system must be used. That is, a liquid z solid phase system is preferred. Therefore, it is preferable that the amino group-labeled dye is immobilized on a solid phase.
  • a detection kit having a structure in which the amino group-labeled dye is immobilized on a solid phase a large number of samples can be measured at the same time, which facilitates the test.
  • the solid phase used for this is as already listed, and a microtube, a 96-microwell plate and the like are particularly preferable.
  • the form and container of the detection kit vary depending on the labeling reaction system (that is, the combination of the amino group-containing low-molecular-weight tumor marker and the amino group-labeled dye). There is no particular limitation as long as it does. Specifically, what is disclosed in the embodiments is one example.
  • OmM NBD-C1 acetonitrile solution 1001 containing 0.1% Triton-X and 0.5% polyethylene glycolone into each well of a 96 well plate and open at 30 ° C. For 2 hours.
  • the solid phase (96-well plate) containing the immobilized NBD-C1 can be stored in a cool, dark place when sealed under a nitrogen atmosphere.
  • the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 505 nm and an emission wavelength of 650 nm was measured using a fluorescence plate reader.
  • creatine in the same urine was measured using a creatine test ⁇ Co-kit (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).
  • the amount of hydroxyproline was calculated as the 3-hydroxyproline value (mg Z g creatine) per 1 g creatine in urine.
  • Fig. 1 shows a plot of the calibration values obtained in this way.
  • the amount of an amino group-containing low-molecular-weight tumor marker in a specimen is calculated, and the calculated value is compared with a threshold to detect the malignant tumor. Can be performed quickly and easily.
  • the kit for detecting a malignant tumor of the present invention is a kit suitable for carrying out the method of the present invention, can be stored for a long period of time, and can carry out the method of the present invention when necessary.
  • the method for detecting a malignant tumor and the kit for detection according to the present invention since an amino-labeled dye is immobilized on a solid phase, labeling is performed by adding a sample to the solid phase.
  • the generation of the low-molecular-weight tumor marker containing an amino group enables faster detection of a malignant tumor.
  • the handling of the detection kit becomes simpler, and a large number of samples can be detected at once.

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Description

明細書
悪性腫瘍の検出方法および検出用キット 技術分野
本発明は、 悪性腫瘍の検出方法および検出用キットに関する。 特に、 本発明は 悪性腫瘍を早期に発見するためにァミノ基含有低分子腫瘍マーカーを利用する簡 易な検出方法および検出用キットに関する。
背景技術
悪性腫瘍の低分子腫瘍マーカーとして、 3—ヒドロキシプロリン、 プテリジン 類、 ポリアミン等のアミノ基含有化合物が知られている。
このようなアミノ基含有化合物の臨床的研究は、 1 9 7 1年に Russellらがガ ン患者尿中にポリアミン排出が増加することを見出してから、 注目されだした (Russel, D. H.ら： Cancer Res. , 31， 1555—1558 (1971) )。
汎用されているポリアミンの分析法は酵素法であり、 ァシルポリアミン ·アミ ドヒドロラーゼ (acylpolyamine amidohydrolase)を用いて遊離型ポリアミン (力 ダベリン、 スペルミン、 プトレツシン） の総量を測定する。 食道ガン、 胃ガン、 大腸ガン、 胆管ガン、 膝臓ガン、 肺ガン、 卵巣ガン、 前立腺ガン等多くの種類の ガンで 5 0 %近くの判別率を示した (大久保昭行、 臨床医, 24, 11, 2234-2238 (1998) )。
3—ヒドロキシプロリンは、 基底膜の構成成分である I V型コラーゲンに特異 的なアミノ酸であり、 ガン細胞が増殖して基底膜が破れると、 尿中に 3—ヒドロ キシプロリンカ S排出される（Kubochi, K.ら： Development of a direct measurement assay for collagenase against type I and type 丄 V collagens m tissue homogenate ana its application in stomach and lung cancers. In Proteinases in inflammation and Tumor Invasion (Tschesche, H. ed. )， 337-356 (Walter de Gruyter and Co. , Berline, 1986) )。 さらに、 岡崎らは、 ニンヒドリン法を用い て、 アミノ酸自動分析機により各種のガン患者 9 7人と健常人 2 1 1人について 尿中の 3—ヒドロキシプロリン量を測定した。 その結果、 ガンの判別率は 4 2 % であった。一方、健常人が異常値を示す割合は、わずか 2 °/。であった（Okazaki, I. ら： J. Lab. Clin. Med.， 120， 908 - 920 (1992) )。
上記の各種ァミノ基含有低分子腫瘍マーカーを検出 ·定量するには、従来液体力 ラムクロマトグラフィー法が用いられてきた。 かかる液体カラムクロマトグラフ ィ一法においては、特定のマーカーに適する分析条件を見出すのに時間が掛かり、 さらに分離操作、 検出にも時間を要する上に、 検出の再現性もよくない。 また、 装置そのものも、 小型化しにくい等の欠点があり、 被験者の診断への臨床的応用 が極めて難しいものであった。
発明の開示
本発明は、 このような現状に鑑みなされたものであり、 アミノ基含有低分子腫 瘍マーカーを利用して、 悪性腫瘍の簡便で、 迅速な検出方法および検出用キット を提供することを目的とする。
上記目的を達成するには、 アミノ基含有低分子腫瘍マーカーを液体クロマトグ ラフィ一法によらず、 簡便に検出 ·定量する方法を確立することが急務であると、 本発明者等は考えた。
そこで、 アミノ基標識色素によって検体中のアミノ基含有低分子腫瘍マーカー を選択的 （他の生体内ァミノ基含有低分子化合物の存在下でも） に標識し、 この 標識されたァミノ基含有低分子腫瘍マーカーの量を分光学的手法で、 定量するこ とができることを見出した。 さらに、 このようにして求めた検体中のアミノ基含 有低分子腫瘍マーカー量の算出値をその腫瘍マーカーについての閾値と比較する ことによって、 簡便かつ迅速に悪性腫瘍の検出が可能となることも見出し、 本発 明を完成するに至った。
すなわち、 本発明によって、 検体中のアミノ基含有低分子腫瘍マーカーを利用 する、 悪性腫瘍の検出方法において、
( a ) 検体をァミノ基標識色素と反応させて、 標識されたァミノ基含有低分子腫 瘍マーカーを生成させるステップ；
( b ) ステップ （a ) 後の検体の蛍光強度、 或いは吸光度を測定するステップ；
( c ) ステップ （b ) で得られた測定値から検体中の前記標識されたアミノ基含 有低分子腫瘍マーカー量を算出するステップ；
( d ) ステップ （c ) で得られた算出値を前記アミノ基含有低分子腫瘍マーカー についての閾値と比較するステップ、 ここで該算出値が該閾値より大き 、場合、 悪性腫瘍の存在に関して陽性とする、
以上のステップを含むことを特徴とする悪性腫瘍の検出方法が提供される。
抗原や抗体等の腫瘍マーカーと異なって、 低分子腫瘍マーカーは、 腫瘍組織に 非特異的であり、 本発明の検出方法は悪性腫瘍の一次スクリ一ユングに適してい る。
上記悪性腫瘍の検出方法において、 ステップ （a ) の前に検体を前処理するス テツプをさらに含むこともある。
また、 上記悪性腫瘍の検出方法において、 ステップ （c ) とステップ （d ) の 間に、 アミノ基含有低分子腫瘍マーカーの算出値を濃度捕正するステップをさら に含むこともある。
上記悪性腫瘍の検出方法において、 好ましくは前記ァミノ基標識色素が 4ーク ロロ一 7一二トロべンゾフラザンまたは 4—フノレオロー 7一二トロベンゾフラザ ンである。
また、 上記悪性腫瘍の検出方法において、 好ましくはァミノ基標識色素が予め 固相に固定化されている。
また、 上記悪性腫瘍の検出方法において、 好ましくはステップ （b ) が蛍光測 定によって行われる。
また、 上記悪性腫瘍の検出方法において、 好ましくはァミノ基含有低分子腫瘍 マーカーが 3—ヒドロキシプロリンである。
また、 上記悪性腫瘍の検出方法において、 好ましくは検体が尿である。 また、 前記悪性腫瘍の検出方法において、 好ましくは検体中のクレアチニン量 によって濃度補正が行われる。
さらに、 本発明によれば、 検体中のアミノ基含有低分子腫瘍マーカーを利用す る、 悪性腫瘍の検出用キットにおいて、 アミノ基含有低分子腫瘍マーカーの標準 溶液、 アミノ基標識色素、 および緩衝剤を少なくとも含むことを特徴とする、 前 記悪性腫瘍の検出用キットが提供される。
上記悪性腫瘍の検出用キットにおいて、 好ましくはァミノ基標識色素が、 固相 に固定化されている。
図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の方法に従い、 健常人およびガン患者から採取された尿検体中 に存在する 3—ヒ ドロキシプロリンと 4—クロ口一 7—ニトロべンゾフラザン
(N B D - C 1 )との反応生成物の蛍光強度を測定し、測定値を各検体について、 尿検体中のクレアチン濃度で補正した値を健常人群および悪性腫瘍患者群に分け てプロットした図である。
発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の好適な実施の形態に即し、 本発明に係る悪性腫瘍の検出方法お ょぴ検出用キットについて詳細に説明する。
本発明は、 被験者からの検体中のアミノ基含有低分子腫瘍マーカーを選択的に 標識し、 標識されたァミノ基含有低分子腫瘍マーカーを定量することにより、 悪 性腫瘍を検出することを特徴とする。
(ァミノ基含有低分子腫瘍マーカー）
腫瘍マーカーは、 腫瘍細胞が多量に産生する物質であり、 通常では、 検出され ない物質で腫瘍関連抗原ともよばれる。 さらに、 該抗原に対する自己抗体も、 同 様に抗原が産生されてはじめて、生成するので腫瘍マーカーとなりうる。その他、 腫瘍化した細胞が多量のホルモン、 酵素、 特定の低分子化合物等を産生すること もあり、これらは、いずれも悪性腫瘍（ガン）の存在を検出するのに有用である。 本発明では、 アミノ基含有低分子腫瘍マーカー、 特に 3—ヒドロキシプロリン を腫瘍マーカーとして利用する。 アミノ基含有低分子腫瘍マーカーを利用する理 由は、 既に述べた通り、 抗原抗体等の高分子化合物よりも、 検出および定量し易 く、 さらに悪性腫瘍の非特異的 （組織或いは臓器） な検出 （すなわち、 一次スク リ一ユング) に適しているからである。
(ァミノ基標識色素）
本発明では、 ァミノ基含有低分子腫瘍マーカーを標識するのにアミノ基標識色 素を使用するが、 前者が 3—ヒドロキシプロリンであるとき、 好ましくは 4ーク ロロ一 7 トロべンゾフラザン （N B D— C 1 ) または 4一フルオロー 7—二 トロべンゾフラザン （N B D— F ) をァミノ基標識色素として使用する。 特に好 ましくは、 N B D— C 1を使用する。
(検体）
本発明で使用できる検体としては、 血清、 血漿、 尿、 髄液、 羊水、 腹水、 リン パ球等の通常の体外診断において採取されるすべての生体試料、 さらに組織や細 胞の溶媒等による洗浄液および抽出液が挙げられる。 それらの内で、 尿および血 清が好ましく使われ得るが、 特に尿は、 採血と異なり痛みを伴わずに採取される 点で、 より好ましい。
(検体の前処理）
前記検体をァミノ基標識色素と反応させて、 検体中に含まれるアミノ基含有低 分子腫瘍マーカーを標識するためには、 標識反応に先立ち検体を前処理すること が好ましい場合がある。 本発明で使用される前処理の方法は、 検体の種類によつ て異なるが、 特定の検体について公知の手法が適用できる。 例えば検体が尿であ るとき、 被験者から採取された尿を遠心分離にかけ、 得られた尿の上澄み液を塩 酸との反応によって加水分解する。 引き続き、 加水分解された尿の上澄み液を凍 結乾燥し、 緩衝液に再溶解する。 再溶解に使用する緩衝液は、 ホウ酸緩衝液、 リ ン酸緩衝液、 トリス緩衝液等である。 また、必要ならば、検体としての尿を水と混和性の有機溶媒で希釈してもよい。 このために使用される有機溶媒としては、ジメチルスルホキシド（DMSO)、 ジ メチルホルムアミ ド （DMF)、 エタノール等が挙げられる。 さらに、 検体中の標 識されたアミノ基含有低分子腫瘍マーカーの濃度が分光学的測定 （後述） には低 すぎる場合には、 適当な濃度に濃縮することが可能である。 具体的には、 濃縮の 手段として溶媒の除去、 クロマトグラフィー等を用いて検体を濃縮する。
(ァミノ基含有低分子 JB瘍マーカーの標識反応）
次いで、 検体をァミノ基標識色素と反応させて、 検体中に含まれるアミノ基含 有低分子腫瘍マーカーを標識する。 本発明の特に好適な実施の形態で、 アミノ基 含有低分子腫瘍マーカーとして 3—ヒドロキシプロリン、 アミノ基標識色素とし て NBD— C 1を選択するとき、 両者の反応は典型的には、 次のようにして実施 される。 すなわち、 検体を NBD— C 1と接触させ、 室温 （約 20〜50°C) で 所定時間 ( 1〜 2分) インキュベートする。 この反応時間は、 NBD— C 1と 3 —ヒ ドロキシプロリンとのみが反応するのに十分な時間であり、 検体中にアミノ 基含有低分子化合物 （夾雑アミノ酸等） が存在しても、 これらは NBD— C 1と の反応性が低く、 前記設定反応条件下では、 分光学的測定を妨害するかもしれな レ、反応物質をほとんど生成しない。
前記接触反応は、 反応系が液相、 または液相 Z固相のいずれの系であっても実 施できる。 前者の場合、 NBD— C 1は水に不溶性であるため、 水と混和する有 機溶媒に溶解させて使用する。 このような有機溶媒として、 具体的には、 メタノ ール、 エタノール、 ジェチノレエーテル、 酢酸ェチル、 DMF、 DMSO、 ァセト ン、 ァセトニトリル等が挙げられる。 これらの中で、 ァセトニトリルが特に、 好 ましい。
また、 反応系の ρΗを一定に保つ （特に、 pHを約 8. 0〜約 9. 0の範囲） ことが好ましい。 このため、 反応系に緩衝剤を添加する。 適当な緩衝剤は、 ホウ 酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 トリス緩衝液等である。 (固定化）
本発明に係る悪性腫瘍の検出方法を用いて多数の検体を一度に検査する場合、 前記標識反応が液相/固相系で実施されることが望ましい。 このような目的のた めには、 使用するァミノ基標識色素を固相に固定化する。 適当な固相としては、 マイクロチューブを含むチューブ（ガラスまたはプラスチック製）、プレート（例え ば、 9 6 Z 3 8 4マイクロウエノレプレート）、 ピペットチップ、 ポリスチレンビー ズ、 ラテックス粒子、 磁性粒子等が使用可能であり、 標識反応後の検体の分光学 的測定を妨げない物であればその材質や形状に特に制限はない。 また、 固定化法 も、 物理吸着、 共有結合、 その他公知の方法を利用することができる。 物理吸着 により、 アミノ基標識色素を固相に固定化するとき、 界面活性剤および Zまたは 分散補助剤を使用し、 ァミノ基標識色素をより均一に分散させて固定化すること が好ましい。 適当な分散補助剤としては、 ポリエチレングリコール、 シクロデキ ストリン、 デキストラン等が挙げられる。 また、 適当な界面活性剤としては、 T r i t o n _ X、硫酸ドデシルナトリウム （S D S )、 T w e e n— 2 0等が挙げ られる。
(分光学的測定）
次のステップでアミノ基標識色素を用いて標識されたァミノ基含有低分子腫瘍 マーカーを分光学的に測定し、 検体中に存在するァミノ基含有低分子腫瘍マーカ 一量を算出する。 使用する分光学的手段は、 標識色素の蛍光強度、 或いは吸光度 を測定できるものであれば、 特に制限はない。
再び、 低分子腫瘍マーカーとして 3—ヒドロキシプロリン、 ァミノ基標識色素 として N B D— C 1を例に取ると、 標識アミノ化合物は、 約 5 5 0 n m付近に蛍 光ピークを有する。 また、 約 5 0 0 n m付近に吸収ピークを有する。 従って、 こ の場合、 約 3 5 0〜約 6 0 0 n mの範囲の可視部吸収スぺク トルを測定できる装 置が望ましい。 また、 約 2 5 0 ~ 5 5 0 n mの励起波長が使用でき、 約 3 5 0〜
6 0 0 n mの範囲で蛍光スぺクトルが測定できる装置も望ましい。 3—ヒドロキシプロリン量を測定する場合、 N B D— C 1との蛍光性反応物の 蛍光スペク トル （蛍光強度） を測定することが検出感度の点からより好ましい。 ァミノ基含有低分子腫瘍マーカーであるァミノ化合物の標品とァミノ基標識色 素を反応させ、 標識されたァミノ化合物の蛍光強度、 或いは吸光度の測定 を求 め、 これを使用した該ァミノ化合物の濃度に対してプロットし、 ァミノ化合物の 検量線を予め作成しておく。 検体から得られた蛍光強度、 或いは吸光度の測定値 をこの検量線と比較して、 検体中の標識されたァミノ基含有低分子腫瘍マー力一 量を算出する。
(濃度補正）
検体が尿である場合、 前記で得られたァミノ基含有低分子腫瘍マーカー量の算 出値を濃度補正する必要がある。 これは被験者の水分摂取量や水分発散量が異な るため前記算出値に希釈誤差が生じるからである。 この目的のために検体中のク レアチン濃度を測定し、 これに基づき算出値を補正する。
(悪性腫瘍の検出）
さらに、 上記のようにして、 求めた検体中のアミノ基含有低分子腫瘍マーカー 量を基準にして、 悪性腫瘍の検出を行う。 これには、 比較対照となる健常人の検 体中のアミノ基含有低分子腫瘍マーカー量を同様にして算出する。 ここでも、 前 記の濃度補正が必要であれば、 同様にして行い、 アミノ基含有低分子腫瘍マーカ 一についての閾値を得る。 この閾値と被験者の検体中のァミノ基含有低分子腫瘍 マーカーの算出値 （または補正値） とを比較する。 その結果、 該算出値が該閾値 より大きければ、 その被験者は悪'性腫瘍の存在に関して陽性と判定する。 このよ うにして、 悪性腫瘍の検出が可能となる。 本発明の企図するところは、 悪性腫瘍 の一次スクリーニングであり、 前記陽性判定が意味するのは、 その被験者が悪性 月重瘍を患っている可能性があるということにとどまる。 望ましくは、 そのような 判定を受けた被験者は、 再度、 他の臓器特異的な悪性腫瘍の診断薬 （C E A、 A F P、 P S A等） または診断方法、 或いは生検、 X線または MR I等を用いる検 査を受診するべきである。
(検出可能な悪性腫瘍）
本発明の検出方法および検出用キットを用いて診断できる原発性または転移性 悪性腫瘍は、極めて多様であり、以下に例示するものがその代表的なものである。 すなわち、 乳ガン、 前立腺ガン、 肝臓ガン、 肺ガン、 結腸直腸ガン、 胃ガン、 膝 臓ガン、膀胱ガン、頭頸部ガン、 腎臓ガン、子宮頸ガン、子宮ガン、 甲状腺ガン、 脳腫瘍、 舌ガン、 リンパ腫、 多発性骨髄腫、 黒色腫、 白血病等である。 本発明の 検出方法および検出用キットによれば、 これらの悪性腫瘍を、 種々の進行段階、 特に、 第 1期の段階で検出可能であり、 スクリ一二ング対象の被験者中の良性腫 瘍の存在や悪性腫瘍の不在から識別できる。
(検出用キット）
3常の診断業務においては、 簡便に悪性腫瘍の検出を行い得るよう、 複雑な操 作が必要ないキットが好ましい。 また、 生体中には、 多数の生理活性物質が存在 するから、 重瘍マーカーを特異的に判別し、 定量し得る検出用キットであること が要求される。 本 明は、 このような数々の要求を満たし、 本発明に係る悪性腫 瘍の検出方法に適した検出キットを提供するが、 これはァミノ基含有低分子腫瘍 マーカーの標準溶液、 アミノ基標識色素、 および緩衝剤を少なくとも含むことを 特徴とする検出用キットである。 これらの成分の他に、検体希釈剤 （溶媒等）、溶 解補助剤、 固相化標準試薬、 陽性コントロール等を含んでもよい。
前記緩衝剤は、 固体または液体の形態で提供されてよく、 生化学反応に一般に 使われるホゥ酸緩衝液、 リン酸緩衝液、 トリス緩衝液等であつて弱アル力リ性の ものが好ましい。 緩衝剤は、 上述のように必要ならば、 アミノ基含有低分子 3重瘍 マーカーの標識反応系を適当な p H領域に保っために使用する。
上述のとおり、ァミノ基含有低分子腫瘍マーカーの標識反応は、反応系が液相、 または液相/固相のいずれの系でもよい。 従って、 検出用キットもそれに対応し た形態を取り得るが、 本発明の利点を最大限、 享受するためには、 後者の系、 す なわち液相 z固相系が好ましい。 そのため、 アミノ基標識色素が、 固相に固定化 されているものが好ましいことになる。 このようなアミノ基標識色素が、 固相に 固定化された構成を有する検出用キットであると、 多数の検体を同時に測定しう るので、 検査を行い易い。 このために使用する固相は、 既に列挙したとおりであ り、 特にマイクロチューブ、 96マイクロウェルプレート等が好ましい。
なお、 検出用キッ トの形態、 容器等は、 標識反応系 （すなわち、 アミノ基含有 低分子腫瘍マーカーとアミノ基標識色素との組み合わせ） によって異なるが、 検 体の測定に際して、 一式のキットを構成するものであれば、 特に限定はない。 具 体的には、 実施例に開示するものがその一例である。
(実施例）
以下に実施例を挙げ、 本発明を更に詳しく説明するが、 本発明はこれらの諸例 に何ら制限されるものではない。
(実施例 1 ) 尿検体中の 3—ヒドロキシプロリンの定量
(固定化 NBD— C 1の調製）
96ウエノレプレートの各ゥエルに 0. 0 1 %の T r i t o n—Xと 0. 5 %の ポリエチレングリコーノレとを含む 1 OmMの NBD— C 1ァセトニトリル溶液 1 00 1を入れ、 30°Cのオープンで 2時間、 乾燥した。 この固定化 NBD— C 1を有する固相 （96ゥエルプレート） は、 窒素雰囲気下でシールすると、 冷暗 所で保存できる。
(尿検体の前処理）
健常人 （21サンプル） および悪性腫瘍患者 （1 7サンプル） から採取した尿 を、 3000 x gで 10分間遠心分離した。 遠心分離によって得られた尿の上澄 み液を収集し、 その上澄みの各 2 m 1を、 6 Mの塩酸 2 m 1を含むネジ付き試験 管に入れ、 1 50 °Cで 2時間加水分解した。 加水分解した尿各 10 μ 1を凍結乾 燥し、 5 OmMホウ酸緩衝液 （ρΗ 10. 0) を 100 1加えた。
(標識反応） 上記 N B D— C 1を固定化した 9 6ゥエルプレートに、 上記処理尿 5 0 1を 分注し、 室温で 1分間攪拌して反応させた後、 0 . 5 M H C 1を 1 0 0 1加 えた。
(蛍光測定）
各ゥヱルのサンプルについて、 蛍光プレートリーダーを使い、 励起波長 5 0 5 n mおよび蛍光波長 5 6 0 n mにおける蛍光強度を測定した。 各人の水分摂取量 (および Zまたは水分発散量）に基づく希釈誤差を補正するために、 同一尿中のク レアチンをクレアチン · テス ト ·ヮコーキット （和光純薬製） で測定し、 尿中 3 ーヒ ドロキシプロリン量を尿 1 gクレアチン当たりの 3—ヒ ドロキシプロリン値 (m g Z gクレアチン） として算出した。 このようにして得られた捕正値をプロ ットしたものが図 1である。
図 1に示すように、 悪性腫瘍患者から採取された尿と健常人から採取された尿 の蛍光測定結果から、 蛍光強度値 （補正後） に違いが見られた。 すなわち、 悪性 腫瘍患者の測定値は、 健常人の測定値よりも有意に大きかった。 健常人の測定値 の平均をとり、 これを閾値 ( 0 . 3 ) とすると、 腫瘍患者の個別の測定値は、 1 例（1 7サンプル中）を除いてすベて、閾値よりも大きかった。 この検査結果は、 1個体を除いて、 すべての症例の被験者で測定された蛍光強度値の比較が、 被験 者の悪性腫瘍の有無に関する臨床診断と一致することを示している。 従って、 本 発明に係る悪性腫瘍の検出方法および検出用キットを用いて悪性腫瘍の検出が可 能である。
産業上の利用可能性
以上示したように、 本発明に係る悪性腫瘍の検出方法によれば、 検体中のアミ ノ基含有低分子腫瘍マーカー量を算出し、該算出値を閾値と比較することにより、 悪性腫瘍の検出を迅速かつ簡便に行うことができる。
また、 血清や尿等の一般臨床検査で使用されてきた検体を用いて、 従来不可能 であった様々なァミノ基含有低分子腫瘍マーカーの検出を可能とする。 また、 本発明の悪性腫瘍検出用キットは、 本発明の方法を実施するのに適合し たキットであり、 長期保存ができ、 必要なときに本発明の方法の実施を可能とす る。
また、 本発明に係る悪性腫瘍の検出方法、 および検出用キットの好適な実施の 形態によれば、 ァミノ標識色素が固相に固定化されているので、 検体の該固相へ の添加によって標識されたァミノ基含有低分子腫瘍マーカーが生成されることか ら、 より迅速な悪性腫瘍の検出が可能となる。 また、 検出用キットの取り扱いも より簡単になり、 多数の検体を一度に検出することも可能となる。

Claims

請求の範囲
1. 検体中のアミノ基含有低分子腫瘍マーカーを利用する、 悪性腫瘍の検出方 法において、
(a) 検体をァミノ基標識色素と反応させて、 標識されたァミノ基含有低分子腫 瘍マーカーを生成させるステップ；
(b) ステップ （a) 後の検体の蛍光強度、 或いは吸光度を測定するステップ；
(c) ステップ （b) で得られた測定値から検体中の前記標識されたアミノ基含 有低分子腫瘍マーカー量を算出するステップ；
(d) ステップ （c) で得られた算出値を前記アミノ基含有低分子腫瘍マーカー についての閾値と比較するステップ、 ここで該算出値が該閾値より大きい場合、 悪性腫瘍の存在に関して陽性とする、
以上のステップを含むことを特徴とする悪性腫瘍の検出方法。
2. 前記アミノ基標識色素が予め固相に固定化されていることを特徴とする、 請求項 1に記載の悪性腫瘍の検出方法。
3. ステップ （a) の前に検体を前処理するステップをさらに含むことを特徴 とする、 請求項 1に記載の悪性腫瘍の検出方法。
4. ステップ （c) とステップ （d) の間に、 標識されたァミノ基含有低分子 腫瘍マーカーの算出値を濃度補正するステップをさらに含むことを特徴とする、 請求項 3に記載の悪性腫瘍の検出方法。
5. アミノ基含有低分子腫瘍マーカーが 3—ヒドロキシプロリンであることを 特徴とする、 請求項 4に記載の悪性腫瘍の検出方法。
6. アミノ基標識色素が 4一クロ口一 7—二トロべンゾフラザンまたは 4ーフ ルオロー 7—-トロべンゾフラザンであることを特徴とする、 請求項 5に記載の 悪性腫瘍の検出方法。
7. ステップ （b) が蛍光測定によって行われることを特徴とする、 請求項 6 に記載の悪性腫瘍の検出方法。
8 . ァミノ基標識色素が予め固相に固定化されていることを特徴とする請求項 7に記載の悪性腫瘍の検出方法。
9 · 検体が尿であることを特徴とする、請求項 2に記載の悪性腫瘍の検出方法。
1 0 . ステップ （c ) とステップ （d ) の間に、 標識されたァミノ基含有低分 子腫瘍マーカーの算出値を濃度補正するステップをさらに含むことを特徴とする、 請求項 9に記載の悪性腫瘍の検出方法。
1 1 . 検体中のクレアチニン量によって濃度捕正が行われることを特徴とする、 請求項 1 0に記載の悪性腫瘍の検出方法。
1 2 . 検体中のアミノ基含有低分子腫瘍マーカーを利用する、 悪性腫瘍の検出 用キットにおいて、 ァミノ基含有低分子腫瘍マーカーの標準溶液、 ァミノ基標識 色素、 および緩衝剤を少なくとも含むことを特徴とする、 前記悪性腫瘍の検出用 キット。
1 3 . 前記アミノ基標識色素が、 固相に固定化されていることを特徴とする、 請求項 1 2に記載の悪性腫瘍の検出用キット。
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