WO2003042679A1

WO2003042679A1 - Biosensor

Info

Publication number: WO2003042679A1
Application number: PCT/JP2002/011808
Authority: WO
Inventors: Miwa Hasegawa; Tomohiro Yamamoto; Shin Ikeda; Toshihiko Yoshioka
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co., Ltd.
Priority date: 2001-11-14
Filing date: 2002-11-12
Publication date: 2003-05-22
Also published as: EP1445605A1; US20040082045A1; US7056425B2; CN1498344A; JPWO2003042679A1; EP1445605A4

Description

1 明細書バイォセンサ技術分野

本発明は、試料中の特定成分を、迅速、高感度かつ簡便に定量することができるバイォセンサ、特にコレステロールセンサに関する。背景技術

従来のバイォセンサの一例として、グルコースセンサについて説明する。

代表的なグルコースセンサは、スクリーン印刷などの方法によって絶縁性基板上に少なくとも測定極および対極を含む電極系を形成し、この電極系上に親水性高分子、酸化還元酵素および電子メディエー夕を含む酵素反応層を形成して得られる。酸化還元酵素としては例えばダルコ一スォキシダ一ゼを用い、また、電子メデイエ一夕としては例えばフェリシアン化力リゥム、フエ口セン誘導体またはキノン誘導体などの金属錯体もしくは有機化合物などを用いる。また、前記酵素反応層には、必要に応じて緩衝剤が加えられる。

このようなバイオセンサの酵素反応層上に、基質を含む試料液を滴下すると、酵素反応層が溶解して酵素と基質が反応する。この反応に伴つて電子メデイエ一夕が還元される。酵素反応終了後、還元された電子メディェ一タを電気化学的に酸化すると、酸化電流値から試料液中の基質濃度を求めることができる。

また、このようなバイオセンサは、測定対象物質を基質とする酵素を用いることで、様々な物質を測定することが原理的には可能である。例えば、酸化還元酵素にコレステロールォキシダーゼまたはコレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼを用いれば、各種医療機関で診断指針に用いられる血清中のコレステロ一ル値を測定することができる。

この場合、コレステロールエステラーゼの酵素反応の進行は非常に遅いので、適切な界面活性剤を添加することにより、コレステロールエステラーゼの活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮することができるが、反応系に含まれる界面活性剤が血球に悪影響を及ぼし、ダルコースセンサのように全血そのものを測定することが不可能である。これに対し、全血からろ過によって血球を除去して得られる血漿のみを迅速にセンサ内（試料液供給路）に供給するため、試料液供給路の開口部付近にフィルタ（血球ろ過部）を設ける提案がなされている。

ところが、センサ内へのフィルタの組み込み方が適していないと、フィルタ内に捕捉された血球が破壊され、へモグロビンが溶出してしまう, そうすると、血球成分をフィル夕でろ過することが困難となり、小さいヘモグロビンは試料供給路内に流入してしまい、測定誤差の原因となつてしまう。

これは、試料液を吸収する前のフィルタの厚みと、試料液を吸収して膨張したフィルタの厚みとの差が、フィルタを上下から保持している押さえ部の間隔と適合していない点に原因があると考えられる。フィル夕を上下から保持する押さえ部の間隔が膨張したフィル夕の厚みに対して狭すぎると、フィルタの膨張が妨げられる。そして、膨張が妨げられたフィル夕の孔径は十分に広がることができず、浸透してきた血球を破壊してしまうのである。

これに対し、試料液によって異なるへマトクリット値（赤血球容積比）に起因してフィル夕の膨張の程度も異なるため、あらかじめ膨張したフィルタの厚みを想定して前記押さえ部の上下の間隔を広めに設定すると、センサの保存期間中にフィルタがずれてしまうおそれがある。さらに、試料液の吸収による膨張を抑えるべく、フィルタそのものの厚みを従来より薄くすることも考えられるが、この場合、例えば特願 2 0 0 0 - 3 9 9 0 5 6号明細書において記載されているようにフィルタの一次側の端部から試料液を吸引させただけでは、一定時間内に吸収できる量が減ってしまい、フィル夕の二次側部分から出る血漿の流出速度が遅くなり、センサ内、特に試料液供給路内が血漿で飽和する速度が遅くなり、測定時間が長くなつてしまう。

これに対し、一定時間内に吸収できる試料液の量を増やすために吸引面積を広くし、フィルタの上部から試料液を滴下すると、フィル夕に試料液が浸透する速度よりも試料液がフィル夕の表面を流れる速度の方が速くなる。そのため、フィル夕の表面を流れた試料液が、試料液供給路とフィル夕を接続する試料液供給路の開口部から、試料液供給路内へ流入し、測定誤差を引き起こす原因となってしまう。

そこで、例えば特願 2 0 0 1— 1 5 2 8 6 8号明細書においては、前記フィルタの一次側部分を下から保持する第一押さえ部、前記フィルタの二次側部分を上下から保持する第二押さえ部、前記フィル夕の中央部分を上から保持する第三押さえ部、および前記第二押さえ部と第三押さえ部との間において前記フィル夕を囲む空隙部を設け、フィルタを上下から保持する押さえ部の間隔が、膨張したフィルタの厚みに適合しなくても、フィル夕の膨張が妨げられることにより起こる血球破壊を防止し得る技術が開示されている。また、試料液を直接フィルタに滴下することにより、血球がフィル夕の表面を流れて試料液供給路内に流入して生じる測定誤差を抑制することができる旨が記載されている。

しかし、フィルタを用いたセンサの場合、ろ過された血漿が試料液供給路内に流入して飽和した後も、血漿の粘性や全血中の血漿量により、空気孔で止まるはずの血漿が、空気孔から溢れ出してしまう場合がある, 試料液である全血は、血球成分と液体成分（血漿）とからなり、人によつてことなるが、その比率（赤血球容積比）は約 2 0〜 6 0 %の範囲内にある。また、全血中のコレステロール濃度によって粘性が異なる。これらの違いにより、同じ試料液を添加しても、流入速度が異なるだけでなく、粘性が低かったり赤血球容積比が低かったりした場合、流入した血漿が空気孔に達しても、電極基板上を伝わって、試料液供給路外に溢れるという問題があった。

そこで、本発明は、上記のような不都合をなくし、試料液の血漿の粘性や全血中の血漿量に関係なく、空気孔で血漿が止まるように改良したバイオセンサを提供することを目的とする。さらに、本発明は、高精度で応答性が優れ、全血を測定対象とするコレステロールセンサを提供することを目的とする。発明の開示

本発明は、絶縁性基板、前記基板上に設けられた測定極および対極を含む電極系、前記絶縁性基板を覆うカバ一、酸化還元酵素および/または電子メディェ一タを含む少なくとも 1つの反応層、前記絶縁性基板および前記カバーにより形成され前記電極系および前記反応層を含む試料液供給路、前記試料液供給路において前記カバーに設けられた第 1の空気孔、試料液添加部、ならびに前記試料液供給路および試料液添加部の間に設けられた血球をろ過するフィル夕を具備し、前記フィル夕で血球をろ過された血漿が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるバイオセンサであって、前記試料液供給路において前記絶縁性基板に第 2の空気孔が設けられていることを特徴とするバイォセンサに関する < 前記バイォセンサにおいては、前記第 1の空気孔と前記第 2の空気孔とが連通しているのが好ましい。図面の簡単な説明

図 1は、本発明の一実施の形態に係るバイオセンサの分解斜視図である。

図 2は、本発明の一実施の形態に係るバイオセンサの合体斜視図である。

図 3は、同センサの反応層などを除いた概略縦断面図である。

図 4は、同センサの電極系付近を示した概略縦断面図である。

図 5は、本発明の実施例のコレステロールセンサの応答特性を示す図である。発明を実施するための最良の形態

上記のように、本発明に係るバイオセンサは、電極系と反応層とを含み、終端部側に第 1の空気孔を有する試料液供給路と試料液添加部との間に設けられた血球をろ過するフィル夕を具備し、前記フィル夕で血球をろ過された血漿が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引される。そして、前記試料液供給路に第 1の空気孔とは別に第 2の空気孔を具備することを特徴とする。

また、前記第 1の空気孔は前記第 2の空気孔と連通しているのが好ましい。

上記構成により、試料液の血漿の粘性、全血中の血漿量および赤血球容積比の違いに関係なく、血漿を試料液供給路内に止めることが可能である。従来は、これらの違いがあれば、流入した血漿が空気孔に達すると、空気孔で止まることなく絶縁性基板上を伝わって、試料液供給路外に試薬とともに溢れ出し、測定誤差の原因となっていた。しかし、絶縁性基板上に、第 1の空気孔と連通する第 2の空気孔を開けることにより . 絶縁性基板上を伝わって、試料液供給路外に溢れ出すことがなくなり、試料液の粘性や試料中のろ過される成分の割合に関係なく自動的に測定されるろ液の容量が規定されるため、測定誤差を解消することが可能となる。さらに、試料液は試料液供給路内のみに存在するので、センサ以外の部分（測定機器や測定者など）に対する汚染の危険性を低くすることもできる。

本発明に用いる電子メディエータとしては、フェリシアン化カリウムの他、コレステロールォキシダーゼなどの酸化還元酵素との電子伝達能を有するレドックス化合物から選択することができる。

酸化還元酵素は、測定対象物を基質とする酵素であり、グルコースを測定対象物とするセンサでは、ダルコ一スォキシダ一ゼを用いる。診断指針に用いられる血清中のコレステロール値を測定するには、コレステロールの酸化反応を触媒する酵素コレステロールォキシダ一ゼまたはコレステロ一ルデヒドロゲナ一ゼとコレステロールエステルをコレステロ

—ルに変化させる過程を触媒する酵素であるコレステロールエステラ一ゼを用いる。コレステロ一ルエステラーゼの酵素反応の進行は非常に遅いので、例えば適切な界面活性剤を添加することにより、コレステロ一ルエステラーゼの活性を向上させ、全体の反応に要する時間を短縮することができる。

電子メデイエ一夕を含む層および酸化還元酵素を含む反応層は、センサ内の電極系上またはその近傍の位置に配置する。電極系を設けた基板に組み合わされて基板との間に電極系に試料液を供給する試料液供給路を形成するカバー部材を有するセンサにおいては、前記試料液供給路に露出する部分や試料液供給路の開口部などに前記反応層を設けることができる。いずれの位置であっても、導入された試料液によって反応層が容易に溶解して電極系に到達できることが好ましい。

また、電極を保護し、形成される反応層の剥離を抑制するために、電極系上に接して親水性高分子層が形成されることが好ましい。さらに、電極系以外でも、反応層を形成する際の下地として親水性高分子層が形成されるか、または最下層の反応層に親水性高分子が含まれることが好ましい。

特に、電子メデイエ一夕を含む反応層の溶解性を高めるために、当該反応層は界面活性剤と分離させておくことが好ましい。また、保存安定性のために、コレステロールの酸化反応を触媒する酵素コレステロールォキシダ一ゼおよびコレステロールエステラーゼと分離させておくことが好ましい。

血糖値を測定するバイオセンサでは、試料液が反応層へ導入されるように、電極系上に形成された層などを被覆すべく、脂質を含む層を形成する例がある（たとえば特開平 2 - 0 6 2 9 5 2号公報）。本発明のコレステロールを測定するバイォセンサでは、反応層の一部を凍結乾燥法により形成するか（例えば特願 2 0 0 0— 0 1 8 8 3 4号明細書）、力バー部材の表面に、界面活性剤またはプラズマ照射などにより処理して. 親水性を付与するのが好ましい。このような構成をとると、脂質層は設けなくてもよい。

親水性高分子としては、例えば、水溶性セルロース誘導体、特にェチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリビエルピロリドン、ポリビニルアルコール、ゼラチン、ァガロース、ポリアクリル酸もしくはその塩、デンプンもしくはその誘導体、無水マレイン酸の重合体もしくはその塩、ポリアクリルアミド、メタクリレート樹脂、またはポリ一 2—ヒドロキシェチルメタクリレートなどを用いることができる。界面活性剤としては、例えば、 n—才クチル— i3—D—チォダルコシド、ポリエチレングリコールモノドデシルェ一テル、コール酸ナトリウム、ドデシルー |3—マルトシド、ジュ一クロースモノラウレート、デォキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、 N , N 一ビス ( 3 - D -ダルコンアミドプロピル) デォキシコールアミドまたはポリオキシエチレン（ 1 0 ) ォクチルフエ二ルェ一テルなどがあげられる。

また、脂質を使用する場合、例えばレシチン、ホスファチジルコリンホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質で、両親媒性脂質を好適に用いることができる。

なお、酸化電流の測定方法としては、測定極と対極のみの二電極方式と、参照極を加えた三電極方式があり、三電極方式の方がより正確な測定が可能である。

以下、図面を参照しながら、具体的な実施の形態により本発明を詳細に説明する。図 1は、本発明の好ましい実施の形態に係るバイオセンサの一例の分解斜視図である。

図 1に示すバイオセンサにおいて、例えばポリエチレンテレフ夕レートなどの絶縁性樹脂からなる絶縁性基板 1の左側部分には、パラジウムをスパッ夕し、かつレーザートリミングすることにより、作用極 2と対極 3を含む電極系が形成されている。電極の面積は、後述するスぺーサ一 7の上に形成されるスリット 1 2の幅に対応して決定される。また、絶縁性基板 1には粘着部 4および孔 5が形成されている。粘着部 4としては、例えば両面テープを絶縁性基板 1に貼り付けて形成すればよい。

スぺ—サ— 7には、フィル夕 6を収納する開口部 1 0、試料液供給路 1 2 ' を構成するスリット 1 2、スリット 1 2の左右両側には試料液をフィルタの一次側に導入するためのレール 9、および開口部 1 0からスリット 1 2に通じる連結部 1 1が形成されている。

カバ一 1 3は第 1の空気孔 1 7および開口部 1 6を有し、開口部 1 6 の左右両側には試料液をフィル夕の一次側部分に導入するためのレール 1 5が形成されている。

スぺーサー 1 8にはフィル夕 6を収納する開口部 2 1が設けられ、開口部 2 1の左右両側には試料液をフィル夕の一次側部分に導入するためのレ一ル 2 0が形成されている。

また、カバ一 2 2にはフィルタ 6を収納する開口部 2 5、押さえ部 (仕切り部） 2 6および孔 2 7が設けられ、開口部 2 5の左右両側には試料液をフィルタの一次側部分に導入するためのレール 2 4が形成されている。

図 1に示す各部材を一体化した際には、図 1に示すスぺ一サー 7における開口部 1 0、カバ一 1 3における開口部 1 6、スぺーサ一 1 8における開口部 2 1およびカバー 2 2における開口部 2 5が連通する。また、絶縁性基板 1における第 1の空気孔 1 7、スぺーサー 7におけるスリツト 1 2の終端部、カバ一 1 3における第 2の空気孔 3 1は連通している _t フィル夕 6は、ガラス繊維ろ紙からなり、絶縁性基板 1 と同じ平面への投影図において、図 1に示すように、二等辺三角形の形状を有している。

このセンサを組み立てるには、まず、図 1に示す一点鎖線で示すような位置関係で、スぺーサー 7上にカバー 1 3をのせ、合体基板 Aを得るこのとき、カバ一 1 3とスぺ一サー 7とを合体してスリット 1 2により形成される凹状部分には、後述するように反応層を形成する。

つぎに、図 1の一点鎖線で示すような位置関係で、スぺーサ一 1 8上にカバー 2 2をのせ、合体基板 Bを得る。

さらに、絶縁性基板 1、合体基板 Aおよび合体基板 Bを、図 1に示す一点鎖線で示すような位置関係で組み合わせ、絶縁性基板 1 と同じ平面への投影図において、略二等辺三角形状を有するフィル夕 6の一次側部分の右端（底辺側）が、絶縁性基板 1上の粘着部 4に接するように、フィルタ 6を設置する。 .

言い換えると、フィルタ 6の一次側部分の右端（底辺側）は、絶縁性基板 1上に配置され、かつ、スぺーサー 7の開口部 1 0、カバー 1 3の開口部 1 6、スぺーサ一 1 8の開口部 2 1、およびカバ一 2 2の開口部 2 5にはめ込まれた状態になる。また、フィル夕 6の二次側部分の左端 (頂点側）は、合体基板 Aの凹状部分の連結部 1 1と絶縁性基板 1 との間に挟まれた状態になる。

以上のようにして得られる本発明のバイォセンサの概略斜視図を図 2 に示す。また、その断面構造を図 3に示す。図 3は、本発明のバイオセンサの概略縦断面図であり、図 2に示す X— X線断面図に相当する。なお、図 3においては試料液供給路 1 2 ' に設けられる反応層などを省略した。

図 1 〜 3に示す本発明のバイオセンサにおいては、図 3に示すように、フィル夕 6 と他の部材とが非接触となる孔 5および孔 2 7が形成される。すなわち、本発明のバイオセンサにおいては、図 3に示すように、フィルタ 6の一次側部分を下から保持する第 1の押さえ部 a、フィルタ 6 の二次側部分を上下から保持する第 2の押さえ部 bおよび b '、ならびにフィルタ 6の中央部分を上から保持する第 3の押さえ部 cが形成される。さらに、第 2の押さえ部 bおよび b 'と第 3の押さえ部 c との間において、孔 5と孔 2 7は、開口部 1 0、 1 6および 2 1 (図 1参照）を介して連通し、フィルタ 6と他の部材とが非接触となる部分が形成されている。

また、図 1に示す開口端 8 、 1 4、 1 9および 2 3が連通し、図 2に示すように凹状部分である試料液添加部 3 0が形成されている。本発明のバイオセンサにおいては、この凹状部分が存在してセンサの端面が開口（外部に開放）していることにより、例えば試料液の添加方法として. 穿刺により出血した指先を試料液添加部 3 0に擦り付けることができる, そして、試料液は一時的に凹状部分に保持され、迅速にフィル夕の一次側部分へ集中して供給されることになる。

つぎに、図 4は、本発明のバイオセンサのさらに別の態様を示す概略縦断面図である。図 2では反応層および電極系を省いたが、図 4は反応層および電極系を示している。絶縁性基板 1の電極系（ 2および 3 ) 上に、親水性高分子層 2 8および反応層 2 9が形成されている。また、試料液供給路 1 2 ，の天井に相当するカバ一 1 3の下面側には反応層 3 0 が形成されている。なお、図 4に示すその他の部材は、図 3に示すものと同じである。

図 1 〜 4に示す本発明のバイォセンサは、その構造をわかりやすく説明するために、フィル夕と各種基板の 6種類の部材から作製されているが、カバ一 2 2とスぺーサ一 1 8 とが一つの部材で構成されていてもよく、またカバー 1 3とスぺ一サ一 7がーつの部材で構成されていてもよい。

このセンサを用いて血液中のコレステロールを測定するには、凹状部分である試料液添加部 3 0からフィル夕 6へ全血を供給する。このとき, スぺーサ— 7、カバー 1 3、スぺーサー 1 8およびカバ一 2 2が試料液添加部 3 0に接する部分には、レール 9、 1 5、 2 0およびカバ一 2 2 が面しているため、全血は効率よくフィルタ 6へ供給される。

そして、供給された血液はフィルタ 6の一次側部分の端面および上面からその内部へ浸透する。フィルタ 6内では、血球の浸透速度は液体成分である血漿の浸透速度より遅いので、血漿がフィル夕 6の二次側部分の先端からしみ出す。そして、しみ出た血漿は、電極系を覆う位置および Zまたはカバ一 1 3の裏面に担持された反応層を溶解しながら、電極系近傍、第 1の空気孔 1 7と第 2の空気孔 3 1の連通部分まで延びる試料液供給路 1 2 ' 全体を満たす。

試料液供給路 1 2 ' 全体が満たされると、フィルタ 6内の液体の流動も停止し、その時点で血球はフィルタ 6の二次側部分の端部に到達せず. フィルタ 6内に残る。したがって、フィルタ 6は、試料液供給路 1 2 ' 全体を満たすだけの量の血漿が通過してもなお血球がフィルタ 6の二次側部分に達しない程度に、血漿と血球との流通抵抗の差を有するように設計する必要がある。

本発明のフィルタとしては、孔径 1〜 7 x m程度のディプスフィルタを用いるのが好適である。また、フィルタの厚みは 3 0 0〜 4 0 0 m であるのが好ましい。

このような血球ろ過の過程を経て、血漿により溶解された反応層と血漿中の測定成分（コレステロールセンサであればコレステロール）との化学反応が生じ、一定時間経過後、電極反応により電流値を測定し、血漿中の成分を定量することができる。

また、試料液供給路 1 2 ' の電極系近傍における反応層の配置の例を示す図 4において、絶縁性基板 1の電極系上には、カルボキシメチルセルロースのナトリウム塩（以下、単に「C M C」という）などを含む親水性高分子層 2 8、および例えば電子メディェ一夕などの反応試薬を含む反応層 2 9が形成されている。また、カバ一 1 3とスぺーサ一 7を組み合わせて形成される試料液供給路 1 2 ' においては、カバー 1 3が試料液供給路 1 2 ' に露出する面に、酸化還元反応酵素を含む反応層 3 0 が形成されている。

図 1〜4に示すように、試料液供給路 1 2 ' の、液体が流通する方向に垂直な方向における距離は、フィルタ 6の一次側部分の厚さに比べて小さくしてあるが、フィルタ 6の二次側部分から 1 m mの部分は、試料液供給路 1 2 ' の連結部 1 1付近に圧縮して設置されている。

ここで、フィル夕 6の圧縮されている部分は、本発明の実施例におけるサイズのセンサによる吸引力の場合、二次側部分の先端から約 1 m m 程度までであるのが好ましかった。また、フィル夕 6の二次側部分を圧縮する程度については、二次側部分が一次側部分の約 1 / 4〜 1 / 3になるように圧縮すればよかった。

なお、センサの吸引力を数値で表すことは困難であるが、フィル夕の圧縮度合いが、スぺーサー 7の厚みが 1 0 0 _i mで、フィル夕の厚みが 3 7 0 /z mの場合の測定結果（流入速度）が良好であった。ただし、フィル夕の厚みが 3 1 0 t m以下の場合は、流入速度が遅かった。

このように、試料液供給路 1 2 ' の断面積をフィル夕 6の一次側部分の断面積よりも小さくすることにより、フィルタ 6で血球をろ過された血漿が毛細管現象によって、試料液供給路 1 2 ' 内に迅速に吸引させることができる。

反応層には、一般的に溶解しやすい部分と溶解し難い部分がある。溶解し易い部分は、試料液供給路 1 2 ' の縁、すなわちスぺーサ一 7のスリット 1 2の壁面に沿う部分や、液体の流れ方向における中央部分は溶解しにくい。フィル夕 6を通過した試料液は、スリット 1 2に沿って優先的に流れるため、中央部分が完全に溶け終わっていないにもかかわらず、試料液が空気孔を塞いでしまうことがある。フィルタ 6の二次側部分の中央部分が、左右両端部分より試料液供給路 1 2 ' 内へ突出していることにより、試料液供給路 1 2 ' 内の中央部分を優先的に流れ、これによって気泡を試料液供給路 1 2 ' の中央部分に残すことなく、速やかにセンサ内に血漿を流入させることができる。測定の際、穿刺により出血した指先を、試料液添加部 3 0からフィル夕 6へ供給すると、血液はフィル夕 6の一次側部分の端面と上面からその内側へ浸透する。このとき、仕切りとなる第 3の押さえ部 cがあるため、血液がフィル夕 6の表面を優先的に流れて試料液供給路 1 2 ' 内に直接流れ込むことはない。また、絶縁性基板 1と同じ平面における投影図において、第 3の押さえ部 cと第 1の押さえ部 aの位置は一致していないため、フィル夕 6の膨張が妨げられることがなく、血球が壊されるおそれもない。

前記電極系は、貴金属電極であることが好ましい。前記試料液供給路 1 2 ' の幅が、好ましくは 1 . 5 mm以下であるため、スクリーンを用いた印刷電極では電極面積を決定する精度が劣るからである。これに対し、貴金属電極は 0 . 1 m m幅でレーザートリミングすることが可能であり、電極面積を決定する精度が高い。

以下に、本発明の実施例を説明するが、本'発明はこれらのみに限定されるものではない。実施例

図 1 、 2および 4に示す構造を有するコレステロールセンサを以下のようにして作製した。なお、反応層 2 9には電子メデイエ一夕を含め、反応層 3 0にはコレステロールォキシダ一ゼ、コレステロールエステラーゼぉよび界面活性剤を含めた。

まず、絶縁性基板 1の電極系上に、 C M Cの 0 . 5重量％水溶液を 5 1滴下し、 5 0 °Cの温風乾燥機中で 1 0分間乾燥させることにより親水性高分子層 2 8を形成した。

つぎに、フェリシアン化カリウム水溶液 4 1 (フェリシアン化カリゥム 7 0 m M相当）を親水性高分子層 2 8の上に滴下し、 5 0 °Cの温風乾燥機中で 1 0分間乾燥させることにより、フェリシアン化カリウムを含む反応層 2 9を形成した。また、ノカルジァ由来のコレステロールォキシダ一ゼ（E C 1. 1. 3. 6 ： C h OD) とシユードモナス由来のコレステロールエステラーゼ（E C. 3. 1. 1. 1 3 ： C h E ) を溶解した水溶液に、界面活性剤であるポリオキシエチレン（ 1 0) ォクチルフエ二ルェ一テル（T r i t o n X— 1 0 0 ) を添加した。

得られた混合液を、試料液供給路 1 2 ' においてカバー 1 3の露出した部分に 0. 4 x l滴下し、一 1 9 6での液体窒素にて予備凍結後、凍結乾燥機で 2時間乾燥させることにより、 4 5 0 U/m 1 コレステロ一リレオキシダーゼ、 1 1 2 5 U/m 1 コレステロールエステラーゼおよび 2重量％界面活性剤を含む反応層 3 0を形成した。

また、厚さ約 3 0 0〜4 0 0 mのガラス繊維ろ紙を底辺 3 mm高さ 5 mmの二等辺三角形に打ち抜き、打ち抜いた片の二次側先端の角を丸く加工し、フィル夕を得た。そして、絶縁性基板 1と合体基板 Aとの間に略二等辺三角形状のフィルタ 6を設置した。

この後、前記絶縁性基板 1 と合体基板 Aとの間にフィルタ 6を設置した部材と、スぺ一サ一 1 8とカバー 2 2とを一体化した合体基板 Bとを接着することにより、図 1、 2および 4に示す構造を有するコレステロ —ルセンサを作製した。

このセンサに、試料液として種々の濃度を有する全血 1 0 1 を試料液添加部 3 0に添加し、 3分後に対極を基準にして測定極にアノード方向へ + 0. 2 Vのパルス電圧を印加し、 5秒後に作用極と対極との間に流れる電流値を測定した。その結果を図 5に示した。図 5は、全血のコレステロール濃度と電流値との関係を示すグラフである。

図 5から明らかなように、本発明のセンサによれば、コレステロール濃度と電流値との間に良好な直線性が得られることがわかる。産業上の利用の可能性

本発明によれば、試料液の血漿の粘性や全血中の血漿量に関係なく、空気孔で血漿が止まるように改良したバイォセンサを提供することができる。したがって、本発明によれば、高精度で応答性が優れ、全血を測定対象とするコレステロールセンサを提供することができる。

Claims

請求の範囲 1 . 絶縁性基板、前記基板上に設けられた測定極および対極を含む電極系、前記絶縁性基板を覆うカバー、酸化還元酵素および zまたは電子メディエー夕を含む少なくとも 1つの反応層、前記絶縁性基板および前記カバーにより形成され前記電極系および前記反応層を含む試料液供給路. 前記試料液供給において前記カバーに設けられた第 1の空気孔、試料液添加部、ならびに前記試料液供給路および試料液添加部の間に設けられた血球をろ過するフィル夕を具備し、前記フィル夕で血球をろ過された血漿が毛細管現象によって前記試料液供給路内に吸引されるバイオセンサであって、

前記試料液供給路において前記絶縁性基板に第 2の空気孔が設けられていることを特徴とするバイォセンサ。

2 . 前記第 1の空気孔と前記第 2の空気孔とが連通していることを特徴とする請求の範囲第 1項記載のバイオセンサ。