WO2003035876A1 - Verwendung einer doppelsträngigen ribonukleinsäure zur behandlung einer infektion mit einem (+)-strang-rna-virus - Google Patents

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WO2003035876A1
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strand
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virus
helicase
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Anja Krebs
Matthias John
Detlef Schuppan
Stefan Limmer
Roland Kreutzer
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Ribopharma Ag
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Definitions

  • the invention relates to the use of a double-stranded ribonucleic acid for the treatment of an infection with a (+) strand RNA virus and the use of such a ribonucleic acid for the production of a medicament, a medicament and a method for inhibiting the replication of a (+) - strand RNA virus.
  • DE 101 00 586 C1 discloses a method for inhibiting the expression of a target gene in a cell, in which an oligoribonucleotide with a double-stranded structure is introduced into the cell. One strand of the double-stranded structure is complementary to the target gene.
  • (+) Strand RNA viruses have an RNA as the carrier of the genetic information, on which protein synthesis can take place directly inside the cell. No transcription is required. Apart from a 3 'and a 5' untranslated region, the entire length of the virus genome is translated into a polyprotein. The individual, functionally active structural and non-structural proteins emerge from the polyprotein by cleavage. In the viral genome, the sequences of the structural proteins are followed by the sequences of the non-structural proteins.
  • the non-structural protein NS3 is an ultimate functional enzyme with a serine protease domain and NTPase and helicase activity.
  • the object of the present invention is to avoid the disadvantages of the prior art.
  • an effective use for treating an infection with a (+) strand RNA virus is to be provided.
  • a medicament for the treatment of an infection with a (+) strand RNA virus and a use for the production of such a medicament are to be provided.
  • a method for inhibiting the replication of a (+) strand RNA virus is to be provided.
  • a double-stranded ribonucleic acid for the treatment of an infection with a (+) strand RNA virus, a strand S1 of the dsRNA having a region which is at least partially complementary to a section of the translatable area of the virus genome.
  • the invention further relates to the use of such a dsRNA for the manufacture of a medicament for the treatment of an infection with a (+) strand RNA virus.
  • the section of the translatable region of the virus genome is arbitrary. Although the virus genome codes for numerous proteins, it is surprisingly sufficient for inhibiting the replication of the (+) strand RNA virus if a dsRNA is used with a strand S1 which is complementary to any section of the translatable region of the virus genome. Such dsRNA can permanently destroy the integrity of the viral RNA genome through RNA interference. It is therefore ideal for treating an infection with such a virus. The treatment leads to a permanent improvement in the disease.
  • the (+) strand RNA virus can be a hepatitis C virus (HCV).
  • HCV hepatitis C virus
  • the possibility of effective treatment is particularly important here because vaccination against hepatitis C viruses has not been possible until now. HCV infection can lead to serious illnesses in humans, especially chronic hepatitis, liver cirrhosis and liver cancer.
  • the dsRNA causes the (+) strand RNA of the (+) strand RNA virus to be cut enzymatically in the region of the section mentioned.
  • the areas located in front of the interface in the reading direction of the viral RNA can nevertheless be translated and at least partially lead to functional proteins.
  • the expression of these proteins is not necessarily inhibited.
  • the dsRNA is suitable for inhibiting the expression of a polyprotein encoded by the virus genome. The inhibition can also take place only partially, i.e. such that only a part of the complete polyprotein is expressed or so that the total amount of the polyprotein expressed is reduced.
  • the dsRNA is preferably suitable for inhibiting the expression of a functional protease or helicase encoded by the virus genome, in particular the HCV-NS3 helicase.
  • the section to which the strand S1 of the dsRNA is complementary can be arranged in the reading direction of the viral RNA before or in the region of the viral genome coding for the helicase.
  • the inhibition of viral helicase expression is Surprisingly particularly advantageous. This is because the inventors have found that the presence of the viral helicase reduces the replication-inhibiting effect of the dsRNA. By inhibiting the expression of the helicase, the effect of the dsRNA is stronger than in inhibiting the expression of other viral proteins.
  • the complementary region of the dsRNA can have fewer than 25, in particular 19 to 24, preferably 20 to 24, particularly preferably 21 to 23, in particular 22 or 23, nucleotides.
  • a dsRNA with this structure is particularly efficient in the treatment of the virus infection and in particular in the inhibition of the replication of the virus.
  • the strand S1 of the dsRNA can have less than 30, preferably less than 25, particularly preferably 21 to 24, in particular 23, nucleotides. The number of these nucleotides is also the number of the maximum possible base pairs in the dsRNA. Such a dsRNA is particularly stable intracellularly.
  • the dsRNA preferably has at least at one end of the dsRNA a single-stranded overhang formed from 1 to 4, in particular 2 or 3, nucleotides. Single-stranded overhangs reduce the stability of the dsRNA in blood, serum and cells and at the same time increase the replication-inhibiting effect of the dsRNA. It is particularly advantageous if the dsRNA has the overhang only at one end, in particular at its end which has the 3 'end of the strand S1. The other end is then smooth in the case of a dsRNA having two ends, ie without overhangs.
  • an overhang at one end of the dsRNA is sufficient to enhance the replication-inhibiting effect of the dsRNA, without lowering the stability to the same extent as by two overhangs.
  • a dsRNA with only one overhang has been found in both Cell culture media as well as in blood, serum and cells have been shown to be sufficiently stable and particularly effective. Inhibiting the replication of the viruses is particularly effective if the overhang is at the 3 'end of the strand S1.
  • the dsRNA has a strand S2 in addition to the strand S1, i.e. it is made up of two single strands.
  • the dsRNA is particularly effective if the strand S1 (antisense strand) has a length of 23 nucleotides, the strand S2 has a length of 21 nucleotides and the 3 'end of the strand S1 has a single-stranded overhang formed from two nucleotides.
  • the end of the dsRNA located at the 5 'end of the strand S1 is smooth.
  • the dsRNA can be present in a preparation which is suitable for inhalation, oral intake, infusion and injection, in particular for intravenous or intraperitoneal infusion or injection.
  • the preparation can, in particular exclusively, consist of a physiologically compatible solvent, preferably a physiological saline solution or a physiologically compatible buffer, and the dsRNA.
  • the physiologically compatible buffer can be a phosphate-buffered saline solution.
  • the dsRNA is preferably in a physiologically compatible solution, in particular a physiologically compatible buffer or a physiological saline solution, or of a micellar structure, preferably a liposome Virus capsid, enclosed in a capsoid or a polymeric nano or microcapsule or bound to a polymeric nano or microcapsule.
  • the physiologically compatible buffer can be a phosphate-buffered saline solution.
  • a micellar structure, a virus capsid, a capsoid or a polymeric nano- or microcapsule can facilitate the uptake of the dsRNA into infected cells.
  • the polymeric nano- or microcapsule consists of at least one biodegradable polymer, for example polybutyl cyanoacrylate.
  • the polymeric nano- or microcapsule can transport and release dsRNA contained in or bound to it in the body.
  • the dsRNA can be administered orally orally, by inhalation, infusion or injection, in particular intravenous or intraperitoneal infusion or injection.
  • the dsRNA is preferably used in a dosage of at most 5 mg, in particular at most 2.5 mg, preferably at most 200 ⁇ g, particularly preferably at most 100 ⁇ g, preferably at most 50 ⁇ g, in particular at most 25 ⁇ g, per kg of body weight and day. It has been shown that the dsRNA already in this dosage has an excellent effectiveness in treating an infection with a (+) - stranded RNA virus.
  • the invention further relates to a medicament for the treatment of an infection with a (+) strand RNA virus, the medicament containing a double-stranded ribonucleic acid (dsRNA), one strand S1 of which at least in sections to a section of the translatable region of the virus genome has complementary area.
  • the medicament is preferably present in at least one administration unit which contains the dsRNA in an amount which has a dosage of at most 5 mg, in particular at most 2.5 mg, preferably at most 200 ⁇ g, particularly preferably at most 100 ⁇ g, preferably at most 50 ⁇ g, in particular at most 25 ⁇ g, per kg of body weight and day.
  • the administration unit can be designed for a single administration or ingestion per day.
  • the entire daily dose is contained in one administration unit. If the administration unit is designed for repeated administration or ingestion per day, the dsRNA is contained therein in a correspondingly smaller amount that enables the daily dose to be reached.
  • the administration unit can also be designed for a single administration or ingestion for several days, e.g. B. by releasing the dsRNA over several days. The administration unit then contains a corresponding multiple of the daily dose.
  • a method for inhibiting the replication of a (+) strand RNA virus in a cell is also provided, at least one double-stranded ribonucleic acid (dsRNA) being introduced into the cell and one strand S1 of the dsRNA being one part of the translatable Has region of the virus genome at least partially complementary area.
  • dsRNA double-stranded ribonucleic acid
  • the invention also relates to a dsRNA, one strand S1 of which has a region which is at least partially complementary to a section of the translatable region of the genome of a (+) strand RNA virus.
  • HCV has a genome of approximately 9600 nucleotides. It codes for the structural proteins C, El and E2 and for the non-structural proteins NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a and NS5b. Since molecular biological analyzes with HCV in cell culture are very difficult, the effect of dsRNA on viral gene sequences is examined using a non-pathogenic replacement system. For this purpose, the part of the viral genome coding for the structural proteins C, E1 and E2 has been replaced by a neomycin cassette which mediates neomycin resistance.
  • the modified viral genome is registered with the Gene Accession Number AJ242654 at the National Center for Biotechnology Information (NCBI), National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA. It has been transfected into HuH-7 liver cells (JCRB0403, Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank, National Institute of Health Sciences, Kamiyoga 1-18-1, Setagaya-ku, Tokyo 158, Japan). It replicates in these cells in the presence of the neomycin analog G418 without causing infectious particles.
  • the system which enables the stable replication of the modified HCV genome (Lohmann et al. Science 285, (1999), page 110) is also referred to as the "replicon model" for hepatitis C viruses.
  • the dsRNAs used have the following sequences, designated SEQ ID NO: 1 to SEQ ID NO: 4 in the sequence listing:
  • dsRNAl which corresponds to a sequence from the region coding for NS3: S2: 5'- AGA CAG UCG ACÜ UCA GCC UGG-3 '(SEQ ID NO: 1) Sl: 3'-GG UCU GUC AGC UGA AGU CGG A -5' (SEQ ID NO: 2)
  • dsRNA2 which as a negative control without relation to the sequence of NS3 corresponds to the sequence of nucleotides 886-909 of the vector pEGFP-Cl, accession number U55763, NCBI:
  • S2 represents the sense strand and Sl the anti-sense strand, i.e. the sequence of strand S2 is identical to the corresponding sequence from the HCV.
  • the HuH-7 cells are cultured in the presence of 1 mg / ml of the antibiotic G418 in Dulbecco's modified Eagle's medium with 20% fetal calf serum.
  • 80,000 cells per well (3.5 cm diameter) of a 6-well plate were sown in 2 ml of medium.
  • "Fugene 6" catalog number 1814443
  • Sorefene 6 100 ⁇ l serum-free medium (SFM) were mixed with 5 ⁇ l Fugene 6 reagent in a reaction vessel and incubated for 5 min at RT.
  • dsRNA2 corresponds to approx. 0.1 ⁇ mol / 1 final concentration dsRNA2
  • 3 ⁇ g dsRNAl corresponds to approx. 0.1 ⁇ mol / 1 final concentration dsRNAl
  • 1.5 ⁇ g dsRNAl plus 1, 5 ⁇ g dsRNA2 corresponds to approx. 0.05 ⁇ mol / 1 final concentration dsRNAl
  • 300 ng dsRNAl plus 2.7 ⁇ g dsRNA2 corresponds to approx. 0.01 ⁇ mol / 1 final concentration dsRNAl.
  • the parent concentrations of dsRNAl and dsRNA2 were 20 ⁇ M each (corresponds to approx.
  • dsRNA The effect of dsRNA on the replication of the modified HCV genome was determined using quantitative PCR. About 36 hours after the transfection, the cells were unlocked and the RNA contained was removed using the PeqGold RNAPure kit from PEQLAB Biotechnologie GmbH, Carl-Thiersch-Str. 2 b, D-91052 Er Weg, order number 30-1010, insulated in accordance with the manufacturer's instructions.
  • RNA 100-1000 ng
  • 100 pmol oligo-dT primer or 50 pmol random primer were used as primers.
  • 10 ⁇ l RNA (100-1000 ng), 0.5 ⁇ l oligo dT primer (100 pmol) and 1 ⁇ l random primer (50 pmol) were incubated for 10 min at 70 ° C. and then briefly stored on ice.
  • TAMRA carboxy-tetra-methyl-rhodamine
  • NS3 probe 5 '-CAT TGT CGT AGC AAC GGA CGC TCT AAT GAC-3' (SEQ ID NO 5)
  • ß2-microglobulin is a constitutively expressed protein. The following were used for quantification:
  • ß2-microglobulin probe 5 -AAC CGT CAC CTG GGA CCG AGA CAT GTA-3 ⁇ (SEQ ID NO 8)
  • ß2-Microglobulin Primer 5 -CCG ATG TAT ATG CTT GCA GAG TTA A-3 ⁇ (SEQ ID NO 9)
  • the NS3 probe and the ⁇ 2-microglobulin probe each had a FAM label at the 5 'end and a TAMRA label at the 3' end.
  • HCV NS3 cDNA was determined as a ratio to the amount of ⁇ 2-MG cDNA and represented graphically in FIG. 1.
  • "pEGFP" represents the value determined by transfection with dsRNA2 (control) and "HCV 0.1 ⁇ mol / 1", “HCV 0.05 ⁇ mol / 1” and "HCV 0.01 ⁇ mol / 1" each by transfection 0.1 ⁇ mol / 1, 0.05 ⁇ mol / 1 and values determined for 0.01 ⁇ mol / 1 NS3-specific dsRNAl.
  • Transfection with dsRNAl resulted in about 60-fold inhibition at 0.1 ⁇ mol / 1, 0.05 ⁇ mol / 1 and at 0.01 ⁇ mol / 1 in the medium compared to transfection with the non-specific control dsRNA2.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Behandlung einer Infektion mit einem (+)-Strang-RNA-Virus, wobei ein Strang S1 der dsRNA einen zu einem Abschnitt des translatierbaren Bereichs des Virusgenoms zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist.

Description

Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure zur Behandlung einer Infektion mit einem (+) -Strang-RNA-Virus
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure zur Behandlung einer Infektion mit einem (+) -Strang-RNA-Virus und die Verwendung einer solchen Ribonukleinsäure zur Herstellung eines Medikaments, ein Medikament und ein Verfahren zur Hemmung der Replikation eines (+)- Strang-RNA-Virus .
Aus der DE 101 00 586 Cl ist ein Verfahren zur Hemmung der Expression eines Zielgens in einer Zelle bekannt, bei dem ein Oligoribonukleotid mit doppelsträngiger Struktur in die Zelle eingeführt wird. Ein Strang der doppelsträngigen Struktur ist dabei komplementär zum Zielgen.
(+) -Strang-RNA-Viren weisen als Träger der genetischen Information eine RNA auf, an welcher im Zellinneren direkt eine Proteinsynthese stattfinden kann. Es ist somit keine Tran- skription erforderlich. Das Virusgenom wird abgesehen von einem 3 ' - und einem 5 ' -untranslatierten Bereich in seiner ganzen Länge in ein Polyprotein translatiert . Aus dem Polypro- tein gehen durch Spaltungen die einzelnen, funktioneil aktiven Struktur- und Nichtstrukturproteine hervor. Im viralen Genom schließen sich an die Sequenzen der Strukturproteine die Sequenzen der Nichtstrukturproteine an. Das Nichtstrukturprotein NS3 ist ein ultifunktionelles Enzym mit einer Se- rinprotease-Domäne sowie NTPase- und Helikaseaktivität . Bisherige Therapieansätze zur Behandlung einer Infektion mit ei- nem (+) -Strang-RNA-Virus sind wenig erfolgreich und führen bei einem großen Teil der Infizierten zu keiner anhaltenden Besserung des Krankheitszustands. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu vermeiden. Insbesondere soll eine wirksame Verwendung zur Behandlung einer Infektion mit einem (+) -Strang-RNA-Virus bereitgestellt werden. Weiterhin soll ein Medikament zur Behandlung einer Infektion mit einem (+)- Strang-RNA-Virus sowie eine Verwendung zur Herstellung eines solchen Medikaments bereitgestellt werden. Weiterhin soll ein Verfahren zur Hemmung der Replikation eines (+) -Strang-RNA- Virus bereitgestellt werden.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1, 2, 16, 30 und 41 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 3 bis 15, 17 bis 29, 31 bis 40 und 42 bis 53.
Erfindungsgemäß ist eine Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Behandlung einer Infektion mit einem (+) -Strang-RNA-Virus vorgesehen, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zu einem Abschnitt des translatierbaren Be- reichs des Virusgenoms zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung einer solchen dsRNA zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Infektion mit einem (+) -Strang- RNA-Virus .
Der Abschnitt des translatierbaren Bereichs des Virusgenoms ist beliebig. Obwohl das Virusgenom für zahlreiche Proteine kodiert, ist es für eine Hemmung der Replikation des (+)- Strang-RNA-Virus überraschenderweise ausreichend, wenn eine dsRNA mit einem zu einem beliebigen Abschnitt des translatierbaren Bereichs des Virusgenoms komplementären Strang Sl verwendet wird. Eine solche dsRNA kann durch RNA-Interferenz die Integrität des viralen RNA-Genoms dauerhaft zerstören. Sie ist damit ideal zu einer Behandlung einer Infektion mit einem solchen Virus geeignet. Die Behandlung führt zu einer anhaltenden Besserung des Krankheitszustands.
Das (+) -Strang-RNA-Virus kann ein Hepatitis C-Virus (HCV) sein. Hier ist die Möglichkeit einer wirksamen Behandlung besonders bedeutend, da ein Impfschutz gegen Hepatitis C-Viren bisher nicht möglich ist. Eine HCV-Infektion kann beim Menschen zu schwerwiegenden Erkrankungen führen, insbesondere über eine chronische Hepatitis zu Leberzirrhose und Leberkrebs .
In einer infizierten Zelle bewirkt die dsRNA, dass die (+)- Strang-RNA des (+) -Strang-RNA-Virus im Bereich des genannten Abschnitts enzymatisch geschnitten wird. Die in Ableserichtung der viralen RNA vor der Schnittstelle gelegenen Bereiche können dennoch translatiert werden und dabei zumindest teilweise zu funktioneilen Proteinen führen. Die Expression dieser Proteine ist nicht zwangsläufig gehemmt. Bei einer vor- teilhaften Ausgestaltung des Verfahrens ist die dsRNA zur Hemmung der Expression eines vom Virusgenom kodierten Poly- proteins geeignet. Die Hemmung kann dabei auch nur teilweise erfolgen, d.h. so, dass nur ein Teil des vollständigen Poly- proteins exprimiert wird oder so, dass die Gesamtmenge des exprimierten Polyproteins reduziert wird.
Vorzugsweise ist die dsRNA zur Hemmung der Expression einer funktionsfähigen vom Virusgenom kodierten Protease oder Heli- kase, insbesondere der HCV-NS3-Helikase, geeignet. Dazu kann der Abschnitt, zu welchem der Strang Sl der dsRNA komplementär ist, in Ableserichtung der viralen RNA vor oder in dem für die Helikase kodierenden Bereich des Virusgenoms angeordnet sein. Die Hemmung der Expression der viralen Helikase ist überraschenderweise besonders vorteilhaft. Die Erfinder haben nämlich festgestellt, dass das Vorhandensein der viralen Helikase die replikationshemmende Wirkung der dsRNA reduziert. Durch die Hemmung der Expression der Helikase ist die Wirkung der dsRNA stärker als bei der Hemmung der Expression anderer viraler Proteine.
Der komplementäre Bereich der dsRNA kann weniger als 25, insbesondere 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweisen. Eine dsRNA mit dieser Struktur ist besonders effizient in der Behandlung der Virus-Infektion und insbesondere in der Hemmung der Replikation des Virus. Der Strang Sl der dsRNA kann weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vor- zugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweisen. Die Zahl dieser Nukleotide ist zugleich die Zahl der in der dsRNA maximal möglichen Basenpaare. Eine solche dsRNA ist intrazellulär besonders beständig.
Vorzugsweise weist die dsRNA zumindest an einem Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang auf. Einzelsträngige Überhänge verringern die Stabilität der dsRNA in Blut, Serum und Zellen und verstärken gleichzeitig die replikationshem- mende Wirkung der dsRNA. Besonders vorteilhaft ist es, wenn die dsRNA den Überhang ausschließlich an einem, insbesondere ihrem das 3 ' -Ende des Strangs Sl aufweisenden, Ende aufweist. Das andere Ende ist dann bei einer zwei Enden aufweisenden dsRNA glatt, d.h. ohne Überhänge, ausgebildet. Überraschen- derweise hat es sich gezeigt, dass zur Verstärkung der repli- kationshemmenden Wirkung der dsRNA ein Überhang an einem Ende der dsRNA ausreichend ist, ohne dabei die Stabilität in einem solchen Maße zu erniedrigen wie durch zwei Überhänge. Eine dsRNA mit nur einem Überhang hat sich sowohl in verschiedenen Zellkulturmedien als auch in Blut, Serum und Zellen als hinreichend beständig und besonders Wirksam erwiesen. Die Hemmung der Replikation der Viren ist besonders effektiv, wenn sich der Überhang am 3 ' -Ende des Strangs Sl befindet.
Vorzugsweise weist die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 auf, d.h. sie ist aus zwei Einzelsträngen gebildet. Besonders wirksam ist die dsRNA, wenn der Strang Sl (Antisinn- Strang) eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist. Das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA ist dabei glatt ausgebildet.
Die dsRNA kann in einer Zubereitung vorliegen, die zur Inha- lation, oralen Aufnahme, Infusion und Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intraperitonealen Infusion oder Injektion, geeignet ist. Die Zubereitung kann dabei, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlö- sung oder einem physiologisch verträglichen Puffer, und der dsRNA bestehen. Der physiologisch verträgliche Puffer kann eine phosphatgepufferte Salzlösung sein. Es hat sich nämlich überraschenderweise herausgestellt, dass eine lediglich in einem solchen Lösungsmittel oder einem solchen Puffer gelöste und verabreichte dsRNA von Zellen aufgenommen wird und die Expression eines Zielgens bzw. Replikation eines Virus hemmt, ohne das die dsRNA dazu in einem besonderen Vehikel verpackt sein muss.
Vorzugsweise liegt die dsRNA in einer physiologisch verträglichen Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlösung, oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Virus-Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vor. Der physiologisch verträgliche Puffer kann eine phosphatgepufferte Salzlösung sein. Eine micel- lare Struktur, ein Virus-Kapsid, ein Kapsoid oder eine poly- mere Nano- oder Mikrokapsel kann die Aufnahme der dsRNA in infizierte Zellen erleichtern. Die polymere Nano- oder Mikrokapsel besteht aus mindestens einem biologisch abbaubaren Polymer, z.B. Polybutylcyanoacrylat . Die polymere Nano- oder Mikrokapsel kann darin enthaltene oder daran gebundene dsRNA im Körper transportieren und freisetzen. Die dsRNA kann oral, mittels Inhalation, Infusion oder Injektion, insbesondere intravenöser oder intraperitonealer Infusion oder Injektion, verabreicht bzw. eingenommen werden.
Vorzugsweise wird die dsRNA in einer Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körperge- wicht und Tag verwendet. Es hat es sich nämlich gezeigt, dass die dsRNA bereits in dieser Dosierung eine ausgezeichnete Effektivität in der Behandlung einer Infektion mit einem (+)- Strang-RNA-Virus aufweist.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Medikament zur Behandlung einer Infektion mit einem (+) -Strang-RNA-Virus, wobei das Medikament eine doppeisträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) enthält, deren einer Strang Sl einen zu einem Abschnitt des translatierbaren Bereichs des Virusgenoms zumindest ab- schnittsweise komplementären Bereich aufweist. Vorzugsweise liegt das Medikament in mindestens einer Verabreichungseinheit vor, welche die dsRNA in einer Menge enthält, die eine Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag ermöglicht. Die Verabreichungseinheit kann für eine einmalige Verabreichung bzw. Ein- nähme pro Tag konzipiert sein. Dann ist die gesamte Tagesdosis in einer Verabreichungseinheit enthalten. Ist die Verabreichungseinheit für eine mehrmalige Verabreichung bzw. Einnahme pro Tag konzipiert, so ist die dsRNA darin in einer entsprechend geringeren das Erreichen der Tagesdosis ermögli- chenden Menge enthalten. Die Verabreichungseinheit kann auch für eine einzige Verabreichung bzw. Einnahme für mehrere Tage konzipiert sein, z. B. indem die dsRNA über mehrere Tage freigesetzt wird. Die Verabreichungseinheit enthält dann ein entsprechend Mehrfaches der Tagesdosis.
Erfindungsgemäß ist weiterhin ein Verfahren zur Hemmung der Replikation eines (+) -Strang-RNA-Virus in einer Zelle vorgesehen, wobei mindestens eine doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) in die Zelle eingeführt wird und wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zu einem Abschnitt des translatierbaren Bereichs des Virusgenoms zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist. Die Erfindung betrifft außerdem eine dsRNA, deren einer Strang Sl einen zu einem Abschnitt des translatierbaren Bereichs des Genoms eines (+) -Strang-RNA- Virus zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist .
Wegen der weiteren vorteilhaften Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Medikaments, des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen dsRNA wird auf die vorangegangenen Ausführungen verwiesen. Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Zeichnung beispielhaft erläutert. Fig. 1 zeigt eine grafische Darstellung der Reduktion der HCV-RNA im HCV-Replikon-Modell durch Transfektion von NS3-spezifischer dsRNA.
HCV weist ein Genom von ca. 9600 Nukleotiden auf. Es kodiert für die Strukturproteine C, El und E2 und für die Nicht- Strukturproteine NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a und NS5b. Da molekularbiologische Analysen mit HCV in Zellkultur sehr schwierig sind, wird die Wirkung der dsRNA auf virale Gense- quenzen anhand eines nicht pathogenen Ersatzsystems untersucht. Hierzu ist der für die Strukturproteine C, El und E2 kodierende Teil des viralen Genoms durch eine Neomycin- Resistenz vermittelnde Neomycinkassette ersetzt worden. Das modifizierte virale Genom ist mit der Gene Accession Number AJ242654 beim National Center for Biotechnology Information (NCBI) , National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA registriert. Es ist in HuH-7-Leberzellen (JCRB0403, Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank, National Institute of Health Sciences, Kamiyoga 1-18-1, Setagaya-ku, Tokyo 158, Japan) transfiziert worden. Es repliziert in diesen Zellen in Gegenwart des Neomycin-Analogen G418 ohne infektiöse Partikel entstehen zu lassen. Das die stabile Replikation des modifizierten HCV-Genoms ermöglichende System (Lohmann et al . Science 285, (1999), Seite 110) wird auch als "Replikon-Modell" für Hepatitis C-Viren bezeichnet.
Die eingesetzten dsRNAs weisen folgende, im Sequenzprotokoll mit SEQ ID NO : 1 bis SEQ ID NO : 4 bezeichneten Sequenzen auf:
dsRNAl, welche einer Sequenz aus dem für NS3 kodierenden Bereich entspricht: S2: 5'- AGA CAG UCG ACÜ UCA GCC UGG-3' (SEQ ID NO: 1) Sl: 3'-GG UCU GUC AGC UGA AGU CGG A -5' (SEQ ID NO : 2)
dsRNA2, welche als Negativkontrolle ohne Beziehung zur Se- quenz von NS3 der Sequenz der Nukleotide 886-909 des Vektors pEGFP-Cl, Accession Number U55763, NCBI entspricht:
S2: 5'- CUA CGU CCA GGA GCG CAC CA UC -3' (SEQ ID NO : 3) Sl: 3'- CC GAU GCA GGU CCU CGC GUG GU AG -5' (SEQ ID NO: 4)
S2 stellt dabei jeweils den Sinn-Strang und Sl den Antisinn- Strang dar, d.h. die Sequenz des Strangs S2 ist identisch mit der entsprechenden Sequenz aus dem HCV.
Die HuH-7-Zellen werden in Gegenwart von 1 mg/ml des Antibiotikums G418 in Dulbecco's modifiziertem Eagle's Medium mit 20 % fötalem Kälberserum kultiviert. Zur Transfektion wurden 80000 Zellen pro Vertiefung (3,5 cm Durchmesser) einer 6- Well-Platte in 2 ml Medium ausgesät. Als Transefektionshilfe wurde "Fugene 6" (Katalog-Nummer 1814443) der Firma Röche Diagnostics GmbH, Sandhofer Strasse 116, D-68305 Mannheim entsprechend der zugehörigen Arbeitsvorschrift eingesetzt. Dazu wurden in einem Reaktiongefäß 100 μl serumfreies Medium (SFM) mit 5 μl Fugene 6-Reagenz gemischt und 5 min bei RT in- kubiert. In einem weiteren Gefäß wurden jeweils 3 μg dsRNA2 (entspricht ca. 0,1 μmol/1 finale Konzentration dsRNA2), 3 μg dsRNAl (entspricht ca. 0,1 μmol/1 finale Konzentration dsRNAl) , 1,5 μg dsRNAl plus 1,5 μg dsRNA2 (entspricht ca. 0,05 μmol/1 finale Konzentration dsRNAl) oder 300 ng dsRNAl plus 2,7 μg dsRNA2 (entspricht ca. 0,01 μmol/1 finale Konzentration dsRNAl) vorgelegt. Die Stammkonzentrationen der dsRNAl und dsRNA2 betrug jeweils 20 μM (entspricht ca. 300 ng/μl) . Das Gemisch aus Fugene 6 und SFM wurde tropfenweise zu den Nukleinsäuren gegeben, mit einer Pipettenspitze vor- sichtig gemischt und 15 min bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Transfektion wurde der Reaktionsansatz tropfenweise zu den Zellen gegeben. Jede Transfektion wurde mindestens im Doppelansatz durchgeführt und in mindestens 2 unabhängigen Expe- rimenten verifiziert.
Die Wirkung der dsRNA auf die Replikation des modifizierten HCV Genoms wurde mittels quantitativer PCR bestimmt. Etwa 36 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen dazu aufge- schlössen und die enthaltene RNA mit dem Kit PeqGold RNAPure der Firma PEQLAB Biotechnologie GmbH, Carl-Thiersch-Str . 2 b, D-91052 Erlangen, Bestell Nummer 30-1010, gemäß Herstellervorschrift isoliert.
Anschließend wurden gleiche RNA-Mengen (100-1000 ng) zur Reversen Transkription mittels Superscript II der Firma Invi- trogen GmbH, Technologiepark Karlsruhe, Emmy-Noether Strasse 10, D-76131 Karlsruhe, Katalog-Nummer 18064-014 eingesetzt. Als Primer wurden 100 pmol Oligo-dT-Primer bzw. 50 pmol ran- dom Primer verwendet. 10 μl RNA (100-1000 ng) , 0,5 μl Oligo dT-Primer (100 pmol) und 1 μl random Primer (50 pmol) wurden 10 min bei 70°C inkubiert und dann kurz auf Eis gelagert. Anschließend sind 7 μl Reverse Transkriptase-Mix (4 μl 5 x Puffer; 2 μl 0,1 mol/1 DTT; 1 μl je 10mmol/l dNTP) , 1 μl Super- Script II und 1 μl des Ribonuklease Inhibitors RNAsin® der
Firma Promega GmbH, Schildkrötstr . 15, D-68199 Mannheim zugesetzt worden. Das Gemisch ist für 10 min bei 25°C, dann für 1 Stunde bei 42°C und abschließend für 15 min bei 70°C gehalten worden.
Von gleichen Volumina der gebildeten cDNA wurden im "Light- Cycler" der Firma Röche Diagnostics GmbH gemäß dem "TaqMan"- Verfahren der Firma PerkinElmer, Ferdinand-Porsche-Ring 17, D-63110 Rodgau-Jügesheim, nach Herstellerangaben mittels des LightCycler Fast Start DNA Master Hybridization Probes -Kits der Firma Röche Diagnostics GmbH spezifische cDNA- Mengen quantifiziert. Die Detektion erfolgt über eine mit dem Fluorophor 6'-FAM (Carboxyfluorescein) am 5 '-Ende und dem
Löschmolekül TAMRA (Carboxy-tetra-methyl-Rhodamin) am 3 '-Ende markierte Sonde. Dabei wird das Flourophor mit Licht angeregt und überträgt die Anregungsenergie auf das in unmittelbarer Nähe befindliche 3'-seitige Löschmolekül . Während der jewei- ligen Extensionsphasen der PCR Reaktion führt die 5 '-3' Exo- nukleaseaktivität der Taq DNA Polymerase zur Hydrolyse der Sonde und damit zur räumlichen Trennung des Fluorophors vom Löschmolekül. Die Fluoreszenz von 6'-FAM wird immer weniger gelöscht. Sie nimmt daher zu und wird quantitativ erfasst.
Zur Quantifizierung von HCV NS3-CDNA kamen zum Einsatz:
NS3-Sonde: 5 ' -CAT TGT CGT AGC AAC GGA CGC TCT AAT GAC-3 ' (SEQ ID NO 5)
NS3 Primer: 5 ' -CCT TGA TGT ATC CGT CAT ACC AAC TAG-3 ' (SEQ ID NO 6)
NS3 Reverse Primer: 5 ' -TGA GTC GAA ATC GCC GGT AA-3 ' (SEQ ID NO 7)
Weiterhin wurde ß2-Mikroglobulin-cDNA als Standard quantifiziert. ß2-Mikroglobulin (ß2-MG) ist ein konstitutiv in konstanter Menge exprimiertes Protein. Zur Quantifizierung kamen zum Einsatz:
ß2-Microglobulin-Sonde: 5 -AAC CGT CAC CTG GGA CCG AGA CAT GTA-3λ (SEQ ID NO 8) ß2-Microglobulin Primer: 5 -CCG ATG TAT ATG CTT GCA GAG TTA A-3λ (SEQ ID NO 9)
ß2-Microglobulin Reverse Primer: 5 x -CAG ATG ATT CAG AGC TCC ATA GA-3X (SEQ ID NO 10)
Die NS3-Sonde und die ß2-Microglobulin-Sonde wiesen jeweils am 5 ' -Ende eine FAM-Markierung und am 3 ' -Ende eine TAMRA- Markierung auf.
Die Menge an HCV NS3-cDNA wurde als Verhältnis zur Menge von ß2-MG-cDNA bestimmt und graphisch in Fig. 1 dargestellt. "pEGFP" stellt den durch ausschließliche Transfektion mit dsRNA2 (Kontrolle) ermittelten Wert und "HCV 0,1 μmol/1" , "HCV 0,05 μmol/1" und "HCV 0,01 μmol/1" die durch Transfektion mit jeweils 0,1 μmol/1, 0,05 μmol/1 und bei 0,01 μmol/1 NS3-spezifischer dsRNAl ermittelten Werte dar.
Die Transfektion mit dsRNAl führte bei 0,1 μmol/1, 0,05 μmol/1 und bei 0,01 μmol/1 finaler Konzentration im Medium zu einer etwa 60-fachen Hemmung im Vergleich zur Transfektion mit der unspezifischen Kontrolle dsRNA2.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure
(dsRNA) zur Behandlung einer Infektion mit einem (+)- Strang-RNA-Virus, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zu einem Abschnitt des translatierbaren Bereichs des Virusgenoms zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist .
2. Verwendung einer doppelsträngigen Ribonukleinsäure (dsRNA) zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer Infektion mit einem (+) -Strang-RNA-Virus, wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zu einem Abschnitt des translatierbaren Bereichs des Virusgenoms zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist.
3. Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das (+) -Strang- RNA-Virus ein Hepatitis C-Virus (HCV) ist.
4. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA zur Hemmung der Expression eines vom Virusgenom kodierten Polyproteins geeignet ist.
5. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA zur Hemmung der Expression einer funktionsfähigen vom Virusgenom kodierten Protease oder Helikase, insbesondere der HCV-NS3-Helikase, geeignet ist.
6. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Abschnitt in Ableserichtung der viralen RNA vor oder in dem für eine Helikase, insbesondere die HCV-NS3- Helikase, kodierenden Bereich des Virusgenoms angeordnet ist .
7. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der komplementäre Bereich weniger als 25, insbesondere 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist.
8. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweist.
9. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA zumindest an einem Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten ein- zelsträngigen Überhang aufweist.
10. Verwendung nach Anspruch 9, wobei die dsRNA den Überhang ausschließlich an einem, insbesondere ihrem das 3 ' -Ende des Strangs Sl aufweisenden, Ende aufweist.
11. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist und der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten ein- zelsträngigen Überhang aufweist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist .
12. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA in einer Zubereitung vorliegt, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbeson- dere zur intravenösen oder intraperitonealen Infusion oder Injektion, geeignet ist.
13. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zubereitung, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem physiolo- gisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA besteht.
14. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA in einer physiologisch verträglichen Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlösung, oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Virus-Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt.
15. Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die dsRNA in einer Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höchstens 100 μg, vorzugsweise höch- stens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag verwendet wird.
16. Medikament zur Behandlung einer Infektion mit einem (+) - Strang-RNA-Virus, wobei das Medikament eine doppelsträn- gige Ribonukleinsäure (dsRNA) enthält, deren einer Strang Sl einen zu einem Abschnitt des translatierbaren Bereichs des Virusgenoms zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist.
17. Medikament nach Anspruch 16, wobei das (+) -Strang-RNA- Virus ein Hepatitis C-Virus (HCV) ist.
18. Medikament nach Anspruch 16 oder 17, wobei die dsRNA zur Hemmung der Expression eines vom Virusgenom kodierten Po- lyproteins geeignet ist.
19. Medikament nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei die dsRNA zur Hemmung der Expression einer funktionsfähigen vom Virusgenom kodierten Protease oder Helikase, insbesondere der HCV-NS3-Helikase, geeignet ist.
20. Medikament nach einem der Ansprüche 16 bis 19, wobei der Abschnitt in Ableserichtung der viralen RNA vor oder in dem für eine Helikase, insbesondere die HCV-NS3-Helikase, kodierenden Bereich des Virusgenoms angeordnet ist.
21. Medikament nach einem der Ansprüche 16 bis 20, wobei der komplementäre Bereich weniger als 25, insbesondere 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist.
22. Medikament nach einem der Ansprüche 16 bis 21, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweist.
23. Medikament nach einem der Ansprüche 16 bis 22, wobei die dsRNA zumindest an einem Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzel- strängigen Überhang aufweist.
24. Medikament nach Anspruch 23, wobei die dsRNA den Überhang ausschließlich an einem, insbesondere ihrem das 3 ' -Ende des Strangs Sl aufweisenden, Ende aufweist.
25. Medikament nach einem der Ansprüche 16 bis 24, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist und der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzel- strängigen Überhang aufweist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
26. Medikament nach einem der Ansprüche 16 bis 25, wobei das Medikament eine Zubereitung aufweist, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur intravenösen oder intraperitonealen Infusion oder Injektion, geeignet ist.
27. Medikament nach Anspruch 26, wobei die Zubereitung, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem physiologisch verträgli- chen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA besteht.
28. Medikament nach einem der Ansprüche 16 bis 27, wobei die dsRNA in dem Medikament in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physio- logischen Kochsalzlösung, oder von einer micellaren
Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Virus-Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt.
29. Medikament nach einem der Ansprüche 16 bis 28, wobei das Medikament in mindestens einer Verabreichungseinheit vorliegt, welche die dsRNA in einer Menge enthält, die eine Dosierung von höchstens 5 mg, insbesondere höchstens 2,5 mg, bevorzugt höchstens 200 μg, besonders bevorzugt höch- stens 100 μg, vorzugsweise höchstens 50 μg, insbesondere höchstens 25 μg, pro kg Körpergewicht und Tag ermöglicht.
30. Verfahren zur Hemmung der Replikation eines (+) -Strang- RNA-Virus in einer Zelle, wobei mindestens eine doppel- strängige Ribonukleinsäure (dsRNA) in die Zelle einge- führt wird und wobei ein Strang Sl der dsRNA einen zu einem Abschnitt des translatierbaren Bereichs des Virusgenoms zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist .
31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei das (+) -Strang-RNA- Virus ein Hepatitis C-Virus ist.
32. Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, wobei die Expression eines vom Virusgenom kodierten Polyproteins gehemmt wird.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 32, wobei die Expression einer funktionsfähigen vom Virusgenom kodierten Protease oder Helikase, insbesondere der HCV-NS3- Helikase, gehemmt wird.
34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei der Abschnitt in Ableserichtung der viralen RNA vor oder in dem für eine Helikase, insbesondere die HCV-NS3-Helikase, kodierenden Bereich des Virusgenoms angeordnet ist.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 34, wobei der komplementäre Bereich weniger als 25, insbesondere 19 bis
24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 35, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweist.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 36, wobei die dsRNA zumindest an einem Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, insbesondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzel- strängigen Überhang aufweist.
38. Verfahren nach Anspruch 37, wobei die dsRNA den Überhang ausschließlich an einem, insbesondere ihrem das 3 ' -Ende des Strangs Sl aufweisenden, Ende aufweist.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 38, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist und der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzel- strängigen Überhang aufweist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 30 bis 39, wobei die dsRNA in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch verträglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlösung, oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Virus-Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt.
41. Doppelsträngige Ribonukleinsäure (dsRNA) , deren einer Strang Sl einen zu einem Abschnitt des translatierbaren Bereichs des Genoms eines (+) -Strang-RNA-Virus zumindest abschnittsweise komplementären Bereich aufweist.
42. DsRNA nach Anspruch 41, wobei das (+) -Strang-RNA-Virus ein Hepatitis C-Virus (HCV) ist.
43. DsRNA nach Anspruch 41 oder 42, wobei die dsRNA zur Hem- mung der Expression eines vom Virusgenom kodierten Poly- proteins geeignet ist.
44. DsRNA nach einem der Ansprüche 41 bis 43, wobei die dsRNA zur Hemmung der Expression einer funktionsfähigen vom Virusgenom kodierten Protease oder Helikase, insbesondere der HCV-NS3-Helikase, geeignet ist.
45. DsRNA nach einem der Ansprüche 41 bis 44, wobei der Abschnitt in Ableserichtung der viralen RNA vor oder in dem für eine Helikase, insbesondere die HCV-NS3-Helikase, kodierenden Bereich des Virusgenoms angeordnet ist.
46. DsRNA nach einem der Ansprüche 41 bis 45, wobei der komplementäre Bereich weniger als 25, insbesondere 19 bis 24, bevorzugt 20 bis 24, besonders bevorzugt 21 bis 23, insbesondere 22 oder 23, Nukleotide aufweist.
47. DsRNA nach einem der Ansprüche 41 bis 46, wobei der Strang Sl weniger als 30, vorzugsweise weniger als 25, besonders vorzugsweise 21 bis 24, insbesondere 23, Nukleotide aufweist.
48. DsRNA nach einem der Ansprüche 41 bis 47, wobei die dsRNA zumindest an einem Ende der dsRNA einen aus 1 bis 4, ins- besondere 2 oder 3, Nukleotiden gebildeten einzelsträngi- gen Überhang aufweist.
49. DsRNA nach Anspruch 48, wobei die dsRNA den Überhang ausschließlich an einem, insbesondere ihrem das 3 ' -Ende des Strangs Sl aufweisenden, Ende aufweist.
50. DsRNA nach einem der Ansprüche 41 bis 49, wobei die dsRNA neben dem Strang Sl einen Strang S2 aufweist und der Strang Sl eine Länge von 23 Nukleotiden, der Strang S2 eine Länge von 21 Nukleotiden und das 3 ' -Ende des Strangs Sl einen aus zwei Nukleotiden gebildeten einzelsträngigen Überhang aufweist, während das am 5 ' -Ende des Strangs Sl gelegene Ende der dsRNA glatt ausgebildet ist.
51. DsRNA nach einem der Ansprüche 41 bis 50, wobei die dsRNA in einer Zubereitung vorliegt, die zur Inhalation, oralen Aufnahme, Infusion oder Injektion, insbesondere zur in- travenösen oder intraperitonealen Infusion oder Injektion, geeignet ist.
52. DsRNA nach Anspruch 51, wobei die Zubereitung, insbesondere ausschließlich, aus einem physiologisch verträglichen Lösungsmittel, vorzugsweise einer physiologischen Kochsalzlösung oder einem physiologisch verträglichen Puffer, insbesondere einer phosphatgepufferten Salzlösung, und der dsRNA besteht.
53. DsRNA nach einem der Ansprüche 41 bis 52, wobei die dsRNA in einer Lösung, insbesondere einem physiologisch ver- träglichen Puffer oder einer physiologischen Kochsalzlösung, oder von einer micellaren Struktur, vorzugsweise einem Liposom, einem Virus-Kapsid, einem Kapsoid oder einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel umschlossen oder an einer polymeren Nano- oder Mikrokapsel gebunden vorliegt ,
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