WO2003031952A1 - Dispositif de detection de luminescence et plaque de jeux ordonnes de microechantillons - Google Patents

Dispositif de detection de luminescence et plaque de jeux ordonnes de microechantillons Download PDF

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WO2003031952A1
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microarray plate
microwell
light emission
microarray
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PCT/JP2001/008587
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Kenji Yasuda
Satoshi Takahashi
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Hitachi, Ltd.
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    • G01N2201/08—Optical fibres; light guides
    • G01N2201/0846—Fibre interface with sample, e.g. for spatial resolution

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting luminescence of nucleic acids and proteins in a biological sample, and relates to a technique suitable for measuring genes and proteins in a small amount of a sample.
  • Luminescence detection methods such as chemiluminescence and bioluminescence, can achieve an order of magnitude higher sensitivity than fluorescence and absorption methods.
  • a microplate or an optical cell has often been used for the method of detecting light emission (Japanese Patent Application Laid-Open Nos. Hei 6-225572 and Hei 6-102182).
  • Microarrays have a fixed area of about 100 to 100 xm in diameter where specific nucleic acids and proteins are immobilized, and a width of about 100 to 30 mm and a length of about 20 to 50 mm on a slide glass.
  • Spot areas are installed at equal intervals over the area of Fluorescence detection technology is often used for spots on such microarrays.However, the fluorescence generated from the surface of the microscopic area is observed, so sensitivity may be insufficient. A detection method suitable for the luminescence method is desired.
  • Microarray play There is also a method of measuring the whole object with a CCD camera or a photographic film (“Molecular methods for virus detection” edited by DL Wiedbrauk and DHFarkas, W> Chapter 7, 'Detection Methods Using Chemiluminescence', Academic Press (San Diego, USA ), 1995), like microarray, diameter
  • the present invention was devised by examining a method for simultaneously detecting light emission from a plurality of micro areas having a diameter of 20 to 500 m with high sensitivity and high accuracy. It was done.
  • An object of the present invention is to provide a technique particularly suitable for microarrays, which is used immediately after the start of a luminescence reaction and measures while reducing the influence of peripheral interference light emission.
  • the present invention provides a technique suitable for detecting a micro-reaction zone having a diameter of 1/10 or less of a diameter of several mm such as a microplate by a luminescence method such as a chemiluminescence method. It is intended to provide. Disclosure of the invention
  • the luminescence reaction is carried out in a microwell provided on the microarray plate, and a photoconductive guide is used for receiving the luminescence, and the distance between the light receiving end of the photoconductive guide and the reaction surface is minimized to detect the amount of emitted luminescence.
  • a photoconductive guide is used for receiving the luminescence, and the distance between the light receiving end of the photoconductive guide and the reaction surface is minimized to detect the amount of emitted luminescence.
  • it was also devised to reduce the amount of luminescence from other nearby micro-wells. Thin for small micro-wells By using a photoconductive guide (using an optical fiber) and reducing the distance between the tip surface of the guide and the reaction surface in the microwell, light emission loss can be reduced, and detection can be performed with a small amount of reagent.
  • a flat microarray plate substrate is used, an opaque sheet having through holes provided in a predetermined arrangement is bonded to the substrate, and the through hole portion of the sheet is used as a micro-well.
  • a partition was provided between the minute reaction zones to reduce the interference light.
  • the microarray plate having a microwell can be manufactured by adding a microscope slide glass, but is not limited thereto.
  • the partition walls between the small reaction areas (microwells) prevent diffusion of the chemiluminescent reaction solution, block light emission between the small reaction areas, and reduce mixing of disturbing light emission.
  • a photoconductive guide using an optical fiber cable is suitable.
  • the luminescence reaction includes a method of labeling a chemiluminescent substance, a method of generating a luminescent reaction product by enzymatic labeling, a method of generating bioluminescence by an enzyme reaction, and the like. Can also be applied.
  • the reaction product diffuses into the aqueous solution, making it impossible to identify the luminescent area with a normal flat microarray.However, with a partition, diffusion can be prevented, and spots can be easily identified. is there.
  • the shape of the micro-well it is easiest to make the shape of the micro-well circular, but it is not limited to a circular shape.Also, a large number of magnetic microparticles of several micrometers or less are dispersed in the micro-well, and the surface of the particle has reactive nucleic acids or proteins.
  • the micro-reaction zone may be set by fixing.
  • the shoulder of the hole preferably has a sharp angle at the open end and a smooth surface to prevent scattering of light emission outside the hole.
  • a luminescent substance with a long luminescent life and a luminescent substance with a short luminescent life are used as markers for different objects, and multiple luminescent When the images are measured, different nucleic acid chains and protein molecules can be easily distinguished.
  • Luminol and acridinium ester can be used as the chemiluminescent labeling substance, and horseradish peroxidase, alkaline phosphatase and the like can be used for the luminescence reaction.
  • a bioluminescence method using firefly luciferase for labeling can also be used.
  • the present invention relates to a luminescence detection device for detecting a luminescence reaction substance captured in a plurality of microgels of a microarray plate aligned at a predetermined interval, the device comprising: holding means for holding the microarray plate; In order to introduce the substrate solution for luminescence reaction into individual microwells in combination with multiple photoconductive guides and photoconductive guides whose tips can be inserted into the microwells at the same interval as the microwells formed on the plate A light emitting detection unit which is positioned above the holding means and which can move up and down with respect to the holding means, and a driving means which drives the light emission detecting unit vertically with respect to the holding means.
  • the light-emitting detection unit driven downward by the driving means is inserted into the micro-well of the micro-array plate with the tip of the photoconductive guide inserted.
  • the center spacing between the photoconductive guides is in the range of about 40-20000; m.
  • the luminescent substrate solution is added to the microwell by the base solution injection means.
  • control means for measuring the emission intensity are provided.
  • the microarray plate for detecting light emission includes a substrate having a flat surface, and an opaque sheet having a plurality of through holes aligned at predetermined intervals and adhered to the flat surface of the substrate.
  • a reactive substance fixing area is set on the substrate surface exposed at the bottom of the through hole of the opaque sheet.
  • the opaque sheet preferably has water repellency.
  • the through holes range in diameter from 100 m to 1000 m.
  • the method for detecting a target biopolymer comprises a plurality of methods at a predetermined interval.
  • the target biopolymer is a nucleic acid having a specific base sequence or a specific protein
  • the specific protein can be, for example, any one of an antibody, an antigen, a receptor, and a lectin.
  • the luminescence amount of each individual of the micro reaction area of a microarray plate can be measured with high precision and sensitivity.
  • FIG. 1 is an explanatory view showing an example of a microarray plate for light emission detection used in the present invention.
  • FIG. 1 (a) is a perspective view
  • FIG. 1 (b) is a cross-sectional view taken along line AA.
  • FIG. 2A and 2B are explanatory views showing another example of the microarray plate for light emission detection used in the present invention, wherein FIG. 2A is a perspective view, and FIG.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating an example of the light emission detection device according to the present invention.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a light emission detection unit detecting light emission from a light emission area in proximity to a microarray plate.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view showing a state in which one of the luminescence detection units in which a photoconductive guide and a substrate injection capillary are integrated is inserted into a microwell.
  • FIG. 6 is a side sectional view of FIG.
  • FIG. 7 is a schematic reaction diagram showing the interrelationship between a labeled probe, a sample nucleic acid chain, and a capture probe.
  • FIG. 8 is an explanatory diagram of another experimental example using the microarray plate and the luminescence measuring device according to the present invention.
  • FIG. 1 is an explanatory view showing an example of a microarray plate for light emission detection used in the present invention.
  • FIG. 1 (a) is a perspective view
  • FIG. 1 (b) is a cross-sectional view taken along line AA.
  • a shallow rectangular recess (sample introduction area) 11 is formed on a part of the surface of a glass plate such as a slide glass, and a plurality of circular recesses are formed on the bottom surface of the rectangular recess. (Small wells) 12 are formed in an array.
  • Each of the plurality of microwells 12 has a flat bottom, and a part of the bottom is a reaction molecule immobilization area for immobilizing a nucleic acid probe that hybridizes with a target nucleic acid in a sample.
  • the sample introduction area 11 is provided for simultaneously dispensing one type of sample containing a large number of components to all the microwells 12 assembled in this area. If a fixed amount of sample can be dispensed into each microwell 12, the sample introduction area 11 is unnecessary.
  • the dimensions of the sample introduction area and the microwell are not particularly limited, but as an example, the sample introduction area is 15 mm long x 15 mm wide x 0.2 mm deep, and a nucleic acid probe is fixed on the bottom.
  • the microwell provided with a reaction molecule immobilization section for use is a circle having a diameter of about 150 m and a depth of about 100 m. The distance between the centers of the circular micro-wells is 300 zm.
  • the material of the microarray plate 10 may be plastic, silicon, or the like in addition to glass. It is not necessary to be transparent. Rather, if it is colored in a color that absorbs light, such as black, the reflection of light is reduced, and interference between light emission in adjacent reaction molecule-immobilized areas can be preferably prevented.
  • the micro-well 12 may be formed by cutting or chemical etching, or may be formed by a mold.
  • FIG. 2A and 2B are explanatory views showing another example of the microarray plate for light emission detection used in the present invention, wherein FIG. 2A is a perspective view, and FIG.
  • This microarray plate 20 is formed by bonding an opaque sheet 23 having through holes arranged in an array to a glass or plastic slide glass 13 forming a rectangular recess (sample introduction area) 21.
  • the structure is the same as that shown in FIG. Specifically, a slide glass with an average thickness of about 1 mm
  • a rectangular recess with a depth of about 0.5 mm and a depth of about 15 mm is formed with a width of 15 mm and a width of 15 mm, and a plurality of through holes with a diameter of 350 xm are formed in a predetermined arrangement.
  • a black carbon-containing polyethylene sheet 23 having a thickness of 15 mm and a thickness of about 250 m was prepared.
  • the through-hole formed in the sheet becomes a microwell 22 in which a minute reaction area is set on the bottom surface, and the sheet material existing between the microwells serves as a light shielding wall.
  • the material of the sheet it is desired that the sample and the substrate liquid do not infiltrate, and a water-repellent material is preferable. With a water-absorbing material, the solution permeates into the surroundings, making it unsuitable for measurement. Fluoropolymer materials such as PTFE (polytetrafluoroethylene) are also suitable for this purpose.
  • the color of the sheet surface is preferably a color such as black that does not easily cause scattered light, but is not necessarily limited to black.
  • FIG. 3 is a schematic diagram illustrating an example of the light emission detection device according to the present invention. Here, an example using the microarray plate 10 shown in FIG. 1 will be described.
  • the light emission detection device is composed of a micro array plate fixed base 31 holding a micro array plate 10 on the top surface, a light emission detection unit 32 that can move up and down with respect to the fixed base 31, and a light emission detection unit 32 that moves up and down.
  • a light-emitting unit moving arm 33 for causing the light-emitting unit to move, and a column 34 for supporting the light-emitting unit moving arm 33 are provided.
  • a plunger press-down mechanism 38 for injecting each microwell of 10 is provided. These elements are installed in a housing 30 that blocks external light.
  • the light emission detection unit 32 is connected to the photocounting device 40 by a photoconductive guide bundle 39.
  • the control unit 45 controls the light emission detection unit moving arm 33, the pump 36, the plunger pressing mechanism 38, and the photo force pointing device 40.
  • the control unit 45 controls the elevation of the light emission detection unit moving arm 33, and before each reaction, Each photoconductive guide 41 is lowered to near the surface of the reaction area, and the luminescent substrate solution is added by operating the plunger pressing mechanism 38 to start the luminescent reaction. Further, the light emission intensity is measured by the photo counting device 40. After that, wash the tip of each photoconductive guide 41 to remove dirt such as substrate components. Next, it is moved over the other micro reaction area on the micro array plate to cause a luminescence reaction in the next area, and measurement is performed. This reaction, measurement, and washing are repeated for all micro reaction areas, the luminescence intensity is measured, and the data is sent to the data processing device.
  • FIG. 4 is a schematic diagram of a light emission detection unit detecting light emission from a light emission area in proximity to a microarray plate.
  • the light emission detection unit 32 includes a plurality of photoconductive guides 41 arranged at the same interval as the plurality of micro-wells 12 provided on the microarray plate 10.
  • the plurality of photoconductive guides 41 are fixed to the fixing holes of the light emitting detection unit moving arm 33 at the same interval, and the photoconductive guide fixing spacers 42 at the same position at the lower position are fixed. It is fixed to the hole and integrated.
  • the light emission detection unit 32 includes one or several height-controlling rod members 62 extending downward from the light emission detection unit moving arm 33 along with the light conduction guide 41 (see FIG. 6). Is provided.
  • the light emission detection unit 32 moves down the light emission detection unit moving arm 33 while the photoconductive guide 41 is aligned with a plurality of microwells 12 provided on the microarray plate 10.
  • the tip of each photoconductive guide 41 is inserted into the microwell.
  • the tip of the photoconductive guide 41 becomes a micro-well. It does not touch the bottom surface of 12.
  • the light received on the light receiving surface at the tip of each photoconductive guide 41 of the light emission detection unit 32 is individually detected by a multi-channel photomultiplier tube built in the photon counting device 40.
  • FIG. 5 is a cross-sectional view of a state in which one of the luminescence detection units in which the photoconductive guide and the substrate injection capillary are integrated is inserted into the microwell
  • FIG. 6 is a side sectional view thereof.
  • the photoconductive guide 41 includes a core 41a, a clad 41b, and a coating 41c.
  • the diameter of the core 41a is about 50 rn, and the outer diameter of the coating 41c is about 120 / m.
  • the photoconductive guides 41 are integrally provided with substrate injection capillaries 51, respectively.
  • the substrate injection capillary 51 is, for example, a thin glass tube having an outer diameter of 30 and an inner diameter of 20 urn, and is fixed to the coating surface of the photoconductive guide 41 with an adhesive layer 52.
  • a microsyringe 37 is connected to the upper end of each of the substrate injection cavities 51 by a silicone rubber tube or the like, and a slight constant pressure is applied to the plunger of the microsyringe 37 from the plunger press-down mechanism 38.
  • the luminescence reaction substrate solution can be injected into the micro-well 12 from the lower end of the injection cavity 51.
  • the tip of the injection capillary 51 is aligned with the tip surface of the photoconductive guide 41, and the luminescent reaction substrate solution is transmitted along the surface, and is connected to the reactive molecule immobilization area 61 provided on the bottom of the micro-well 12. It penetrates into the gap.
  • FIG. 6 shows a state where the substrate solution 65 of the chemiluminescence reaction injected from the substrate solution injection capillary is stored in the microwell 12 of the microarray plate 10.
  • the rod-shaped member 62 for height control is used to stop the tip of the photoconductive guide 41 and the tip of the substrate solution injection capillary 51 at a fixed height from the bottom surface of the micro-well 12. If the tip surface of the photoconductive guide 41 is in contact with the reactive molecule-immobilized region 61 in the microwell 12, the chemiluminescent reaction substrate solution 65 comes into contact with the labeling enzyme, etc., due to bubbles, voids, etc. Therefore, it is desirable to keep a certain distance between the surface of the reaction molecule immobilization area 61 and the tip surface of the photoconductive guide 41.
  • the tip of the rod member 62 for height control is located above the tip of the photoconductive guide 41, and the tip of each photoconductive guide 41 is inserted in alignment with the microwell. Is designed to come in contact with the surface of the microarray plate at a position outside the microwell when the microplate is used.
  • a distance of about 20 m between the tip of the photoconductive guide 41 and the bottom of the well is considered. It was set so that a gap was created. This enabled simultaneous measurement in a large number of microreaction zones, greatly improving processing capacity.
  • the height control guide can be made of a photoconductive guide.
  • the light introduced from the light source for detection through the photoconductive guide for height control is a small
  • a large change occurs in the reflected light intensity that reflects off the bottom surface of 1 and returns to the height control photoconductive guide again, causing the tip surface of the height control photoconductive guide to contact the microarray plate.
  • the height can be controlled not only by detecting the reflected light but also by measuring the vertical movement distance.
  • the height control member can be designed to be in contact with the bottom surface of the micro-well 12. In that case, the tip of the height control member is projected below the photoconductive guide 41.
  • a silylating agent having a sulfhydryl (SH) group was reacted on the bottom surface of each microwell 12 to introduce the SH group to the surface.
  • a microarray maker (arrayer) is used. 1 n 1 spots were spotted on each spot area, and reacted with SH groups introduced at the center of the reaction molecule immobilization area 61 set on the bottom of the microwell 12 to immobilize them. After drying the immobilized nucleic acid probe, the unfixed unnecessary reagents and coexisting components were washed with pure water to obtain a clean microarray plate.
  • test sample uniformly over the entire sample introduction area 1 1 (15 mm long x 15 mm wide x 0.2 mm deep) including the microwell 12 and fix it in each microwell.
  • Reaction with a nucleic acid probe for chemical capture The genome DNA of hepatitis B virus (HBV) was used as a measurement target.
  • Various synthesized oligonucleotides (base length 50 bp) were used as nucleic acid probes for capture and labeling.
  • the hybridization reaction was performed for about 5 hours while the microarray plate was sealed and left in an incubator heated at about 45 ° C.
  • the nucleic acid strand to be measured was captured and measured in a sandwich using two types of probes.
  • the horseradish peroxidase was previously bound to the labeled nucleic acid probe that reacts with the unbound site of the capture probe of the target nucleic acid strand to be measured by an ordinary method. After hybridization, remove the unbound labeled nucleic acid probe solution. The sample was sucked up with a pipette, and then the washing solution 40] was repeatedly injected and discharged several times. Next, a labeled probe-bound nucleic acid probe was added, and incubation was performed for another 5 hours. After hybridization, the unbound nucleic acid probe solution was sucked up with a micropipette, and then the washing solution 401 was divided into several portions and injection and discharge were repeated with the micropipette.
  • FIG. 7 is a schematic reaction diagram showing the interrelationship between a labeled probe, a sample nucleic acid chain, and a capture probe.
  • the capture nucleic acid probe 73 is immobilized there.
  • the target nucleic acid 74 in the sample hybridizes with the nucleic acid probe 73 by a hybridization reaction.
  • a labeled nucleic acid probe 75 to which a luminescent labeling substance 76 has been bound is bound to the unbound site of the target nucleic acid 74 with the capture probe.
  • the microarray plate 10 was placed on the microarray plate fixing base 31 of the luminescence detecting device shown in FIG.
  • the luminescence detection unit 32 is positioned on the micro-well (diameter 150_im) of the microarray plate 10, and the luminescence detection unit moving arm 33 is driven to lower the luminescence detection unit 32.
  • Sixteen photoconductive guides 41 are incorporated in the light emission detection unit 32 of the illustrated example. The movement of the light emission detection unit 32 was stopped when the tip of the height control rod member 62 in the light emission detection unit 32 contacted the surface of the microarray plate 10.
  • the photoconductive guide 41 of the luminescence detecting unit 32 and the substrate injection capillary 51 are inserted into the micro-well 12, and the tip thereof is at a height of 20 m from the bottom of the micro-well 12.
  • the gap between the lower surface of each photoconductive guide 41 and the reaction molecule immobilization area 61 of the microwell 12 contains the enzyme reaction substrate luminol and hydrogen peroxide using the injection cavities 15.
  • the reaction was started by adding about I n1 of the reaction solution, and the luminescence intensity from the time of injection of the reaction solution to the lapse of 10 seconds was measured by photon counting with a 16-channel photomultiplier tube (Hamamatsu Photonics). The measurement was performed with an apparatus 40.
  • luminescence was measured under the same reagent reaction conditions as above, except that the microarray plate shown in FIG. 2 was used. As a result, in the spot where the sample solution containing the target nucleic acid chain was reacted at 10 pM, the relative luminescence intensity was about 50 times higher than the luminescence intensity of the sample not containing the target nucleic acid chain.
  • microarray plate 20 shown in FIG. 2 As shown in FIG. 8, different nucleic acid chain-immobilized silica particles 81 were dispensed into microwells 22 by 1 n 1 each.
  • the microarray plate 20 of this example nothing is fixed to the bottom surface of each microwell 22.
  • a sample containing the nucleic acid to be measured is injected into the sample introduction area 21 of the microarray plate 411, and the sample is dispensed into each microwell 22. Binds to silica fine particles that capture this I let it. After hybridization for 12 hours at 40, washing was carried out sufficiently.
  • the microarray plate was placed on the luminescence detection device shown in FIG. Luminescence was detected.
  • a sample containing the DNA strand to be measured at a concentration of 1 nM gave an emission intensity about 30 times higher than that of the sample not containing the target DNA strand.
  • the location of the reaction molecule immobilization area where the silica particles are placed can be freely set and changed to a plurality of microwells. It is also easy to change the amount of injected silica particles to change the trapping capacity. If the silica fine particles are further washed off, the microarray plate can be reused.
  • a partition surrounding the reaction area is provided around each of the reaction molecule-immobilized areas, so that the luminescence intensity from each of the minute areas is provided. Can be detected with high sensitivity and accuracy at low reagent cost.

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Description

明 細 書 発光検出装置、 発光検出用マイクロアレイプレート 技術分野
本発明は、 生体試料中の核酸やたんぱく質の発光検出法に関し、 微量な試料 中の遺伝子やたんぱく質の測定に好適な技術に関する。 背景技術
遺伝子やたんぱく質の測定件数は近年ますます増加しており、 測定の自動化、 簡便化が強く要望されるようになってきた。 しかし、 測定試料は貴重であり、 少量での計測が望まれている。 また、 そのような試料においては、 測定対象物 質の濃度も低いことが多く、 高感度な測定が望まれる。 化学発光や生物発光と いった発光検出法は、 蛍光法や吸光法に比べ一桁以上の高感度化が可能である。 従来、 発光検出方法には、 マイクロプレートや光学セルを用いることが多かつ た （特開平 6— 2 2 5 7 5 2号公報、 特開平 6— 1 0 2 1 8 2号公報） 。 しか しながら、 近年、 マイクロアレイと呼ばれるスライドグラス上に百から数万と いった多種類の D N Aやたんぱく質をスポットとして固定し、 特定の核酸やた んぱく質を捕捉、検出する技術が脚光を浴びている（M.Schena編" Microarray Biochip Technology", Eaton Publishing (Sunnyvale, USA) 2000年等参照）。 マイクロアレイは、 特定の核酸やたんぱく質を固定した領域サイズの直径が 1 0 0〜 1 0 0 0 x m程度であり、 スライドグラス上の幅 1 0〜 3 0 mm、 長 さ 2 0〜 5 0 mm程度の面積にわたり、 スポット領域を等間隔で設置してある。 このようなマイクロアレイ上のスポッ卜に対し、 蛍光検出する技術がよく用い られているが、 微小区域の表面から発生する蛍光を観測するので感度が不足す る場合があり、 感度において蛍光法にまさる発光法に適した検出方法が望まれ ている。
しかしながら、 発光計測の場合、 微小区域からの発光を、 位置精度良く計測 するのが難しく、 周囲からの迷光による妨害も大きい。 マイクロアレイプレー ト全体を C C Dカ メ ラや写真フ ィ ルムで計測する方法も あるが ( D.L.Wiedbrauk and D.H.Farkas 編 "Molecular methods for virus detection"、 W> 7章' Detection Methods Using Chemiluminescence', Academic Press (San Diego, USA) 、 1995年参照） 、 マイクロアレイのような、 直径
1 mm以下の微小スポッ卜が、 ある面積内に多数隣接して並置されている場合、 個々の微小区域の発光強度を精度良く計測するのは困難である。 一方、 微小ス ポット間の距離を離せば、 周囲の微小発光区域からの影響は少なくなるが、 数 千個所以上という多数の微小反応区域を同一のスライ ドグラス上に設けてあ るマイクロアレイにとって、 微小反応区域の数が減ることになり、 出来るだけ 多数の微小反応区域で捕捉ハイプリダイゼーション反応を同時に行わせよう とする目的に対して、 不都合である。 また処理能力を上げるために、 複数の微 小区域で同時に発光反応を行おうとすると、 やはり隣接する微小発光区域から の影響を少なくする必要がある。 しかしながら、 化学発光は発光の寿命時間も 短いので、 発光基質を添加した後、 短時間のうちに計測する必要があり、 発光 反応開始後の微小区域走査方式による計測は精度が良くない。
このような従来法の問題点を解決するべく、 本発明は、 直径 2 0〜 5 0 0 mの複数の微小区域内からの発光を、 同時に高感度で精度良く検出する方法を 検討して考案されたものである。 本発明は、 特に、 マイクロアレイに適した、 発光反応開始直後から周辺妨害発光の影響を低減しながら測定するための技 術を提供することを目的とする。 また、 本発明は、 マイクロプレートのような 直径数 mmのゥエルに比較して直径がその 1 / 1 0以下である微小反応区域 を化学発光法等の発光法で検出する上で好適な技術を提供することを目的と する。 発明の開示
本発明では発光反応をマイクロアレイプレートに設けた微小ゥエル内で行 い、 しかも発光の受光に光伝導ガイ ドを用い、 光伝導ガイ ドの受光端と反応面 との距離を極小にして検出発光光量の損失を減らすとともに、 周囲の他の微小 ゥエルからの発光混入を低減するように工夫した。 微小ゥエルに対応した細い 光伝導ガイド （光ファイバ一利用） を用い、 ガイド先端面と微小ゥエル内の反 応面の距離を狭めることにより、 発光の損失を低減でき、 また少量の試薬で検 出できるようにした。
また、 本発明の別の態様では、 平坦なマイクロアレイプレート基板を用い、 これに所定の配列で貫通穴を設けた不透明なシートを貼り合わせ、 シートの貫 通穴の部分を微小ゥエルとして利用することで、 微小反応区域間に隔壁を設け、 妨害光を低減できるようにした。 貫通穴の直径を光伝導ガイドに近い寸法にす ると、 周囲からの妨害発光の影響をさらに低減することができる。 貫通穴の形 状や寸法を変化させたり、 異なるサイズの貫通穴を組み合わせることにより、 必要に応じた多種類の計測が可能になる。
微小ゥエルを有するマイクロアレイプレートは顕微鏡スライドグラスを加 ェして製造することができるが、 これに限定されない。 微小反応区域 （微小ゥ エル） 間の隔壁は化学発光反応液の拡散を防ぐとともに、 微小反応区域間の発 光を遮り、 妨害発光の混入を低減する役割を果たす。 このような限られた微小 空間の発光を個別に測定するには、 光ファイバ一 ·ケーブルを用いた光伝導ガ ィドが好適である。
発光反応には、 化学発光物質を標識する方法、 酵素標識して発光性の反応産 物を生じさせる方法、 酵素反応で生物発光を生じさせる方法などがあるが、 本 発明は、 いずれの方法にも適用できる。 酵素反応を利用した発光の場合、 反応 生成物が水溶液中に拡散していき、 通常の平坦なマイクロアレイでは発光区域 が特定できなくなるが、 隔壁があれば拡散を防止でき、 スポットの特定が容易 である。
微小ゥエルの形状は円形とするのが最も簡単であるが、 円形に限定されなレ^ また微小ゥエル内に数マイクロメータ以下の磁性微粒子を多数分散させ、 その 粒子表面に反応性の核酸やたんぱく質を固定しておくことで微小反応区域を 設定してもよい。 ゥエルの肩部は、 ゥエル外への発光の散乱を防ぐために、 ゥ エル開口端は鋭利な角度を持ち、 滑らかな表面を有するのが好ましい。
また、 発光の時間的減衰を考慮し、 発光寿命の長い発光物質と短い発光物質 をそれぞれ異なる対象の標識として用い、 一定時間間隔をおいて複数の発光画 像を測定すると、 異なる核酸鎖やたんぱく質分子を容易に区別することができ る。 化学発光標識物質としては、 ルミノール、 ァクリジニゥムエステル、 酵素 では、 西洋ヮサビ ·ペルォキシダ一ゼ、 アルカリ性フォスファターゼ等が発光 反応に使用できる。 感度をさらに上げる方法としては、 ホタル 'ルシフェラー ゼを標識に用いる生物発光法も使用できる。
本発明は、 所定の間隔で整列したマイクロアレイプレートの複数の微小ゥェ ル中に捕捉された発光反応物質を検出する発光検出装置であり、 この装置は、 マイクロアレイプレートを保持する保持手段と、 マイクロアレイプレートに形 成された微小ゥエルの間隔と同じ間隔で先端を微小ゥエルに挿入可能な複数 の光伝導ガイド及び光伝導ガイ ドと組み合わされて個々の微小ゥエルに発光 反応の基質溶液を導入するための基質溶液注入手を有し、 保持手段の上方に位 置し保持手段に対して上下動可能な発光検知ュニッ卜と、 発光検知ュニッ卜を 保持手段に対して上下方向に駆動する駆動手段と、 駆動手段によって下方に駆 動される発光検知ュニットを、 光伝導ガイドの先端がマイクロアレイプレート の微小ゥエルに挿入され、 しかも微小ゥエルの底面に接触しない所定位置に停 止させる手段と、 発光検知ュニットで受光された微小ゥエルからの発光を個別 に検出可能な光検出手段とを備えることを特徴とする。
光伝導ガイド間の中心間隔は約 4 0〜 2 0 0 0 ； mの範囲である。
前記装置は、 光伝導ガイドの先端がマイクロアレイプレートの微小ゥエルに 挿入され、 しかも微小ゥエルの底面に接触しない所定位置に停止させた後、 基 質溶液注入手段によって微小ゥエルに発光基質溶液を添加し、 発光強度を計測 する制御手段を備える。
本発明による発光検出用マイクロアレイプレートは、 平坦な表面を有する基 板と、 所定の間隔で整列された複数の貫通穴を有し基板の平坦な表面上に接着 された不透明シ一トとを備え、 不透明シートの貫通穴の底に露出した基板表面 に反応性物質固定区域を設定することを特徴とする。
不透明シ一卜は撥水性を有することが好ましい。 貫通穴は直径が 1 0 mか ら 1 0 0 0 mの範囲にある。
また、 本発明によるターゲット生体高分子の検出方法は、 所定の間隔で複数 の微小ゥエルが形成されたマイクロアレイプレートの微小ゥエルにターゲッ ト生体高分子を捕捉する反応性物質を固定した微粒子群を沈降させるステツ プと、 試料溶液を微小ゥエルに分注するステップと、 試料が分注されたマイク ロアレイプレートを所定時間、 所定温度に保持するするステップと、 ターゲッ ト生体高分子と結合する発光標識プローブ核酸鎖を微小ゥエルに添加するス テツプと、 微小ゥエルに発光反応の基質溶液を添加し、 発光を検出するステツ プとを含むことを特徵とする。
ターゲット生体高分子は特定の塩基配列を有する核酸や特定のたんぱく質 であり、 特定のたんぱく質は、 例えば抗体、 抗原、 受容体、 レクチンのいずれ かとすることができる。
本発明によると、 マイクロアレイプレートの微小反応区域の個々の発光量を 精度 ·感度良く測定することができる。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明で用いる発光検出用マイクロアレイプレートの一例を示す説 明図であり、 （a ) は斜視図、 （b ) はその A— A断面図である。
図 2は、 本発明で使用する発光検出用マイクロアレイプレートの他の例を示 す説明図であり、 （a ) は斜視図、 （b ) はその A— A断面図である。
図 3は、 本発明による発光検出装置の一例を示す概略図である。
図 4は、 マイクロアレイプレー卜に接近して発光区域からの発光を検出して いる発光検出ュニットの模式図である。
図 5は、 光伝導ガイドと基質注入キヤピラリーを一体化した発光検知ュニッ トの 1本が微小ゥエルに挿入された状態での横断面図である。
図 6は、 図 5の側断面図である。
図 7は、 標識プローブ、 試料核酸鎖、 捕捉プローブの相互関係を示す反応模 式図である。
図 8は、 本発明によるマイクロアレイプレート及び発光計測装置を用いた別 の実験例についての説明図である。 発明を実施するための最良の形態
本発明をより詳細に説述するために、 添付の図面に従ってこれを説明する。 図 1は本発明で用いる発光検出用マイクロアレイプレートの一例を示す説 明図であり、 （a ) は斜視図、 （b ) はその A— A断面図である。
図 1に示すマイクロアレイプレート 1 0は、 スライドガラスのようなガラス 板の表面の一部に浅い矩形の凹部 （試料導入区域） 1 1が形成され、 更にその 矩形凹部の底面に複数の円形の窪み （微小ゥエル） 1 2がアレイ状に形成され ている。 複数の微小ゥエル 1 2はそれぞれ平坦な底部を有し、 その底部の一部 が試料中のターゲット核酸とハイプリダイズする核酸プローブを固定する反 応分子固定化区域になっている。 試料導入区域 1 1は多数の成分を含む 1種類 の試料を、 この区域内に集合している全ての微小ゥエル 1 2に同時に分注する ために設けられている。 個々の微小ゥエル 1 2に試料を一定量ずつ分注できる 場合には、 試料導入区域 1 1は不要である。
試料導入区域や微小ゥエルの寸法は、 特に限定するものではないが、 一例を 挙げると、 試料導入区域は、 縦 1 5 mm X横 1 5 mm X深さ 0 . 2 mm、 底面 に核酸プローブ固定用の反応分子固定化区域を設けた微小ゥエルは直径が約 1 5 0 ; mの円形で、 深さ約 1 0 0 mである。 円形の微小ゥエルの中心間距 離は 3 0 0 z mである。
マイクロアレイプレート 1 0の材質はガラスのほか、 プラスチックゃシリコ ン等でもよい。 また、 透明である必要はなく、 むしろ黒色など光を吸収する色 に着色されていれば、 光の反射も減り、 隣接する反応分子固定化区域における 発光同士の干渉を防止できて好適である。 微小ゥエル 1 2は切削加工や化学ェ ツチングで形成してもよいが、 モールド型で形成してもよい。
図 2は、 本発明で使用する発光検出用マイクロアレイプレートの他の例を示 す説明図であり、 （a ) は斜視図、 （b ) はその A— A断面図である。
このマイクロアレイプレート 2 0は、 矩形の凹部 （試料導入区域） 2 1を形 成したガラスあるいはプラスチックからなるスライドグラス 1 3に、 貫通穴が アレイ状に配列された不透明シート 2 3を接着して、 図 1に示したのと同様の 構造としたものである。 具体的には、 平均厚さ約 1 mmのスライドグラスに縦 1 5 mm X横 1 5 mmで深さ約 0 . 5 mmの矩形凹部を形成し、それとは別に、 直径 3 5 0 x mの貫通穴を所定の配列で複数個形成した縦 1 5 mm X横 1 5 mm, 厚み約 2 5 0 mの黒色カーボン含有ポリエチレン製シート 2 3を用意 した。 そして、 ポリエチレン製シート 2 3の片面にエポキシ系接着剤を塗り、 スライ ドグラスに形成した凹部に一端から密着するよう貼り付けた。 こうして 製造されたマイクロアレイプレー卜 2 0は、 シートに形成した貫通穴の部分が 底面に微小反応区域が設定される微小ゥエル 2 2となり、 微小ゥエル間に存在 するシー卜材料が遮光壁となって、 隣接する微小ゥエルからの発光が妨害光と なるのを防止するため、 計測の再現性を向上することができる。
シートの材質としては、 試料や基質液の浸潤がないことが望まれ、 撥水性の 材料が好適である。 吸水性の材料では周囲へ溶液が浸透し、 計測に不適当であ る。 P T F E (ポリテトラフルォロエチレン） のようなフッ素系高分子材等も このような目的に好適である。 シート表面の色としては、 黒色のような散乱光 を起こしにくい色が望ましいが、 必ずしも黒色に限定されない。
図 3は、 本発明による発光検出装置の一例を示す概略図である。 ここでは、 図 1に示したマイクロアレイプレート 1 0を用いる例によって説明する。
発光検出装置は、 上面にマイクロアレイプレー卜 1 0を保持するマイクロア レイプレート固定台 3 1、 固定台 3 1に対して上下動可能な発光検知ュニッ 卜 3 2、 発光検知ュニット 3 2を上下動させるための発光検知ュニット移動ァー ム 3 3、'発光検知ュニット移動アーム 3 3を支持する支柱 3 4を備える。また、 発光基質液の入った発光基質液ポトル 3 5、 ボトル 3 5から発光基質液をマイ クロシリンジ 3 7に送出するためのポンプ 3 6、 マイクロシリンジ 3 7中の発 光基質液をマイクロアレイプレート 1 0の各微小ゥエルに注入するためのプ ランジャー押し下げ機構 3 8を備える。 これらの要素は、 外光を遮光する筐体 3 0中に設置されている。 発光検知ユニット 3 2は、 光伝導ガイ ドバンドル 3 9によってフォトカウンティング装置 4 0と接続されている。 発光検知ュニッ 卜移動アーム 3 3、 ポンプ 3 6、 プランジャー押し下げ機構 3 8及びフォ卜力 ゥンティング装置 4 0は、 制御部 4 5によって制御される。
制御部 4 5は発光検知ュニット移動アーム 3 3の昇降を制御し、 反応前に各 反応区域の表面近くまで各光伝導ガイ ド 4 1を下降させ、 プランジャー押し下 げ機構 3 8の操作により、 発光基質溶液を添加し、 発光反応を開始させる。 さ らにその発光強度をフォトカウンティング装置 4 0で計測する。 そののち、 各 光伝導ガイ ド 4 1先端を洗浄し、基質成分等の汚れを落とす。 次にマイクロア レイプレート上の、 他の微小反応区域の上に移動し、 次の区域での発光反応を 起こさせ、計測する。 この反応、 計測、 洗浄を繰り返し、 全微小反応区域に対 して行い、その発光強度を測定し、データ処理装置にデータを送付する。
図 4は、 マイクロアレイプレートに接近して発光区域からの発光を検出して いる発光検出ュニットの模式図である。
発光検知ュニット 3 2は、 マイクロアレイプレート 1 0に設けられた複数の 微小ゥエル 1 2と同じ間隔で配置された複数の光伝導ガイ ド 4 1を備える。 複 数の光伝導ガイド 4 1は、 間隔を揃えた発光検知ュニッ卜移動アーム 3 3の固 定穴に固定され、 この下方位置で同じく間隔を揃えた光伝導ガイド固定スぺー サ 4 2の固定穴に固定されて一体化されている。 また、 発光検知ユニット 3 2 は、 光伝導ガイド 4 1に混じって発光検知ュニッ卜移動アーム 3 3から下方に 延びる 1本あるいは数本の高さ制御用の棒状部材 6 2 (図 6参照））を備える。 発光検知ュニット 3 2は、 その光伝導ガイ ド 4 1がマイクロアレイプレート 1 0に設けられた複数の微小ゥエル 1 2に位置合わせされた状態で、 発光検知ュ ニッ 卜移動アーム 3 3を下降することにより、 各光伝導ガイド 4 1の先端が微 小ゥエル内に挿入される。 このとき、 高さ制御用の棒状部材 6 2がマイクロア レイプレー卜 1 0に当接した位置で発光検知ュニッ 卜 3 2の下降を停止する ことにより、 光伝導ガイ ド 4 1の先端は微小ゥエル 1 2の底面に接触すること はない。 発光検知ュニット 3 2の各光伝導ガイド 4 1の先端受光面で受光され た光は、 フォ トンカウンティング装置 4 0に内蔵されたマルチチヤンネル光電 子増倍管によって個別に検出される。
図 5は光伝導ガイ ドと基質注入キヤピラリーを一体化した発光検知ュニッ 卜の 1本が微小ゥエルに挿入された状態での横断面図であり、 図 6はその側断 面図である。
光伝導ガイ ド 4 1は、 コア 4 1 a、クラッド 4 1 b及び被覆 4 1 cからなる。 コア 4 1 aの直径は約 5 0 rn , 被覆 4 1 cの外径は約 1 2 0 / mである。 光 伝導ガイ ド 4 1には、 それぞれ基質注入キヤピラリー 5 1が一体化して設けら れている。 基質注入キヤピラリー 5 1は、 例えば外径 3 0 , 内径 2 0 u rn のガラス細管であり、 光伝導ガイ ド 4 1の被覆表面に接着剤層 5 2で固定して ある。 個々の基質注入キヤビラリ一 5 1の上端には、 マイクロシリンジ 3 7が シリコンゴム管等で接続されており、 このマイクロシリンジ 3 7のプランジャ 一にプランジャー押し下げ機構 3 8からわずかな一定の圧力を加えることで、 注入キヤビラリ一 5 1の下端から微小ゥエル 1 2に発光反応基質液を注入す ることができる。 注入キヤピラリー 5 1の先端は光伝導ガイ ド 4 1の先端面に 揃えてあり、 発光反応基質液が表面を伝わり、 微小ゥエル 1 2の底面に設けら れた反応分子固定化区域 6 1との間隙に浸透するようになっている。 図 6は、 マイクロアレイプレート 1 0の微小ゥエル 1 2に、 基質溶液注入キヤピラリー から注入された化学発光反応の基質溶液 6 5が溜まっている状態を示してい る。
高さ制御用の棒状部材 6 2は、 光伝導ガイ ド 4 1と基質溶液注入キヤビラリ 一 5 1の先端を微小ゥエル 1 2の底面から一定の高さで停止させるために用 いられる。 光伝導ガイ ド 4 1の先端面が微小ゥエル 1 2内の反応分子固定化区 域 6 1 と接触していると、 気泡、 空隙などにより化学発光反応基質溶液 6 5が 標識酵素等に接触しにくくなるため、 反応分子固定化区域 6 1表面と光伝導ガ イ ド 4 1の先端面との間に一定の距離をおくのが望ましい。 図示の例の場合、 高さ制御用の棒状部材 6 2は先端が光伝導ガイ ド 4 1の先端よりも上方にあ り、 各光伝導ガイド 4 1の先端が微小ゥエルに整列して挿入されたとき、 微小 ゥエル外の位置でマイクロアレイプレート表面と接触するように設計されて いる。 この例では、 高さ制御用の棒状部材 6 2の先端部がマイクロアレイプレ ート表面と接触した状態で、 光伝導ガイ ド 4 1の先端面とゥエル底面との間に 約 2 0； mの隙間が生じるように設定した。 これにより多数の微小反応区域で の同時測定が可能となり、 処理能力が大幅に向上出来た。
高さ制御用ガイドを光伝導ガイ ドで構成することも可能である。 その場合に は、 検知用光源から高さ制御用光伝導ガイ ドを通じて導入した光が微小ゥエル 1 2の底面で反射し、 再び高さ制御用光伝導ガイ ドを戻ってくる反射光強度に 大きな変化が生じることで、 高さ制御用光伝導ガイ ドの先端面がマイクロアレ ィプレートに接触したことを検知することができる。 高さの制御は反射光での 検知以外に、 メカニカルな上下移動距離測定でも行うことができる。 また、 高 さ制御用部材は、 微小ゥエル 1 2の底面と接触するように設計することもでき る。 その場合には、 高さ制御用部材の先端を、 光伝導ガイ ド 4 1より下方に突 出させておく。
次に、 本発明によるマイクロアレイプレート及び発光計測装置を用いた実験 例について説明する。
図 1に示したマイクロアレイプレート 1 0を洗浄後、 各微小ゥエル 1 2の底 面に、 スルフヒドリル （S H) 基を有するシラン化剤を反応させ、 S H基を表 面に導入した。 次に。 アミノ基を末端に導入した捕捉用核酸プローブを含む溶 液と m—マレイミドベンゾィルー N—ヒドロキシスクシンイミ ド ·エステル溶 液を混合 ·反応させたのち、 マイクロアレイ作成装置 （アレイヤー） を用いて 各スポット領域に 1 n 1ずつスポットし、 微小ゥエル 1 2の底面に設定した反 応分子固定化区域 6 1の中央に導入した S H基と反応させ、 固定化した。 固定 化捕捉用核酸プローブは、 乾燥後、 固定されなかった不要試薬と共存成分を純 水で洗浄し、 清浄なマイクロアレイプレートとした。
微小ゥエル 1 2を含む試料導入区域 1 1 (縦 1 5 mm X横 1 5 mm X深さ 0 . 2 mm) 全体に一様に被験試料を 4 0 1分注し、 各微小ゥエル内の固定化捕 捉用核酸プローブと反応させた。 測定対象として B型肝炎ウィルス （H B V ) のゲノム D N Aを用いた。 捕捉用及び標識用の核酸プローブには合成したオリ ゴヌクレオチド （塩基長 5 0 b p ) 各種を用いた。 ハイブリダィゼ一シヨン反 応はマイクロアレイプレートを密封し、 約 4 5でに加温したィンキュベー夕内 に静置して約 5時間行った。
測定対象の核酸鎖をサンドィツチアツセィで 2種類のプローブを用いて捕 捉 ·計測した。 測定対象のターゲット核酸鎖の捕捉プローブ未結合部位と反応 する標識核酸プローブには、 常法で予め西洋わさびペルォキシダーゼを結合さ せておいた。 ハイブリダィゼーシヨン後、 未結合の標識核酸プローブ液をマイ クロピペットで吸いあげ、 次に洗浄液 4 0 】 を数回に分けて注入と排出を繰 り返した。 次に標識プローブ結合核酸プローブを添加し、 さらに 5時間インキ ュベーシヨンを行った。 ハイブリダィゼーシヨン後、 未結合の核酸プローブ液 をマイクロピペッ トで吸いあげ、 次に洗浄液 4 0 1 を数回に分けてマイクロ ピぺッ卜で注入と排出を繰り返した。
図 7は、 標識プローブ、 試料核酸鎖、 捕捉プローブの相互関係を示す反応模 式図である。
微小ゥエル 1 2に設けられた反応分子固定化区域の表面 7 1には、 S H基が 露出したプローブ固定部 7 2があり、 そこに捕捉用核酸プローブ 7 3が固定さ れる。 試料中のターゲット核酸 7 4は、 ハイブリダィゼーシヨン反応によって 核酸プローブ 7 3とハイブリダィズする。 ターゲッ 卜核酸 7 4の捕捉プローブ との未結合部位には、 発光標識物質 7 6が結合した標識核酸プローブ 7 5が結 合している。
最後の洗浄液を吸い上げた後、 マイクロアレイプレート 1 0を図 3に示した 発光検出装置のマイクロアレイプレート固定台 3 1上に置いた。 発光検知ュ二 ット 3 2をマイクロアレイプレート 1 0の微小ゥエル （直径 1 5 0 _i m) へ位 置決めし、 発光検知ュニット移動アーム 3 3を駆動して発光検知ュニッ ト 3 2 を下降させた。 図示した例の発光検知ュニッ ト 3 2中には 1 6本の光伝導ガイ ド 4 1が組み込まれている。発光検知ュニッ ト 3 2中の高さ制御用棒状部材 6 2の先端がマイクロアレイプレート 1 0の表面に接触したところで発光検知 ユニット 3 2の動きを止めた。 この状態で、 発光検知ユニッ ト 3 2の光伝導ガ イ ド 4 1及び基質注入キヤピラリー 5 1は微小ゥエル 1 2内に挿入され、 その 先端が微小ゥエル 1 2の底面から 2 0 mの高さのところで停止している。 次 に、 各光伝導ガイド 4 1の下面と微小ゥエル 1 2の反応分子固定化区域 6 1と の間の隙間に、 注入キヤビラリ一 5を用いて酵素反応基質ルミノ一ルと過酸化 水素を含む反応液を約 I n 1添加して発光反応を開始し、 反応液注入時点から 1 0秒経過後までの発光強度を、 1 6チャンネル光電子増倍管 （浜松ホトニク ス社） を内蔵したフォトンカウンティング装置 4 0で測定した。
その結果、 ターゲッ 卜核酸鎖を濃度 1 0 p m o 1 / 1で含む試料溶液を反応 させたスポッ 卜では、 含まない試料に比較して約 6 0倍の相対発光強度を得た, また隣接する微小区域にて反応させた夕ーゲッ ト核酸鎖を 1 0 p m o 1 Z 1 含む試料溶液の発光強度の影響は 5 %以下であり、 無視できた。 マイクロアレ ィプレー卜全体の発光強度分布は、 各光伝導ガイ ドからの出力をプロッ 卜する ことで、 見ることができる。
また、 マイクロアレイプレートとして図 2に示したものを用いた以外、 上記 と同様な試薬反応条件で発光を計測した。 その結果、 ターゲット核酸鎖を 1 0 p M含む試料溶液を反応させたスポットでは、 含まない試料での発光強度に比 較して約 5 0倍の相対発光強度を得た。
上記と同様の実験を、 標識酵素としてアルカリ性フォスファターゼを西洋ヮ サビ · ペルォキシダーゼの替わりに用いて行うことができた。 基質としては、 たとえば、ジォキセタン化合物の Lumigen APS-5 (Lumigen社）を用いると、 長寿命の発光計測が実現でき、 同一時間で従来の基質の約 1 0倍の光量が得ら れた。
本発明によるマイクロアレイプレート及び発光計測装置を用いた別の実験 例について説明する。
粒径が平均 4 . 0 /_i mの 0 . 0 1 % (W/W) シリカ粒子懸濁液に、 1 %ァ ーァミノプロピルトリエトキシシランのエタノール溶液を 1ノ 1 0量添加し、 6 0 で 3時間加温し、 表面にアミノ基を導入した。 アビジンたんぱく質溶液 をァミノ化処理を施したシリカ粒子に加え、 1 %ダルタールアルデヒドを添加 して固定した。 次に、 末端をピオチン修飾した捕捉用プローブ核酸鎖を各種用 意し、 分割したアビジン固定シリカ微粒子懸濁液と反応させ、 捕捉プローブ核 酸鎖固定シリカ粒子を作製した。
図 2に示したマイクロアレイプレー卜 2 0を用い、 図 8に示すように、 異な る核酸鎖固定化シリカ粒子 8 1を 1 n 1ずつ、 微小ゥエル 2 2に分注した。 本 例のマイクロアレイプレート 2 0は、 各微小ゥエル 2 2の底面には何も固定さ れていない。 シリカ微粒子懸濁液を空気乾燥させたあと、 マイクロアレイプレ 一卜の試料導入区域 2 1に測定対象核酸を含む試料を 4 0 1注入し、 各微小 ゥエル 2 2に分注し、 測定対象核酸鎖を、 これを捕捉するシリカ微粒子に結合 させた。 4 0で、 1 2時間のハイブリダィゼーシヨン後、充分に洗浄を行った。 次に、 マイクロアレイプレートを図 3に示した発光検出装置に設置し、 発光 標識酵素アル力リ性フォスファターゼを結合させた発光標識プローブ核酸鎖 を各微小ゥエルに加え、 前記と同様にして各微小ゥエルからの発光を検出した。 その結果、 測定対象の D N A鎖を 1 n Mの濃度で含む試料からは、 対象とする D N A鎖を含まない試料に比較して約 3 0倍の発光強度が得られた。 この例の 場合、 シリカ粒子を置く反応分子固定化区域の場所は複数の微小ゥエルに自由 に設定、 変更できる。 また、 注入シリカ粒子量を変化させ、 捕捉容量を変える ことも容易である。 さらにシリカ微粒子を洗い落とせば、 マイクロアレイプレ 一トを再利用することも可能である。 産業上の利用可能性
本発明によれば、 複数の反応分子固定化区域を有するマイクロアレイの発光 検出に際し、 反応区域を取り囲む隔壁を、 各反応分子固定化区域の周囲に設け ることにより、 個々の微小区域からの発光強度を感度及び精度良く、 低試薬コ ストで検出することが可能になる。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 複数の微小ゥエルが所定の間隔で整列したマイクロアレイプレートの前記 微小ゥエル中に捕捉された発光反応物質を検出する発光検出装置であって、 前記マイクロアレイプレートを保持する保持手段と、
前記マイクロアレイプレートに形成された微小ゥエルの間隔と同じ間隔で 先端を前記微小ゥエルに挿入可能な複数の光伝導ガイドと、 前記光伝導ガイド と組み合わされて個々の微小ゥエルに発光反応の基質溶液を導入するための 基質溶液注入手段とを有し、 前記保持手段の上方に位置し前記保持手段に対し て上下動可能な発光検知ュニットと、
前記発光検知ュニットを前記保持手段に対して上下方向に駆動する駆動手 段と、
前記駆動手段によって下方に駆動される発光検知ュニットを、 前記光伝導ガ ィドの先端が前記マイクロアレイプレートの微小ゥエルに挿入され、 しかも前 記微小ゥエルの底面に接触しない所定位置に停止させる手段と、
前記発光検知ュニットで受光された前記微小ゥエルからの発光を個別に検 出可能な光検出手段とを備えることを特徴とする発光検出装置。
2 . 請求項 1記載の発光検出装置において、 隣接する前記光伝導ガイド間の中 心間隔は 4 0〜2 0 0 0 x mの範囲であることを特徴とする発光検出装置。
3 . 請求項 1又は 2記載の発光検出装置において、 前記光伝導ガイドの先端が 前記マイクロアレイプレートの微小ゥエルに挿入され、 しかも前記微小ゥエル の底面に接触しない所定位置に停止させた後、 基質溶液注入手段によって前記 微小ゥエルに発光基質溶液を添加し、 発光強度を計測する制御手段を備えるこ とを特徴とする発光検出装置。
4 . 平坦な表面を有する基板と、 所定の間隔で整列された複数の貫通穴を有し 前記基板の平坦な表面上に接着された不透明シートとを備え、 前記不透明シー 卜の貫通穴の底に露出した前記基板表面に反応性物質固定区域を設定するこ とを特徴とする発光検出用マイクロアレイプレート。
5 . 請求項 4記載の発光検出用マイクロアレイプレートにおいて、 前記不透明 シートは撥水性を有することを特徴とする発光検出用マイクロアレイプレー 卜。
6 . 請求項 4又は 5記載の発光検出用マイクロアレイプレートにおいて、 前記 貫通穴は直径が 1 0 mから 1 0 0 0〃mの範囲にあることを特徴とする発 光検出用マイクロアレイプレート。
7 . 所定の間隔で複数の微小ゥエルが形成されたマイクロアレイプレートの前 記微小ゥエルにターゲッ ト生体高分子を捕捉する反応性物質を固定した微粒 子群を沈降させるステップと、
試料溶液を前記微小ゥエルに分注するステップと、
前記試料が分注されたマイクロアレイプレートを所定時間、 所定温度に保持 するするステップと、
前記夕ーゲッ ト生体高分子と結合する発光標識プローブ核酸鎖を前記微小 ゥエルに添加するステップと、
前記微小ゥエルに発光反応の基質溶液を添加し、 発光を検出するステップと を含むことを特徴とする夕一ゲッ ト生体高分子の検出方法。
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