WO2003019195A2 - Test de l'immunite cellulaire par des peptides fixes sur support solide - Google Patents

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Definitions

  • the invention relates to new means of detecting cellular immunity.
  • Cell-mediated immunity plays a major role in the immune response to microorganisms such as viruses, as well as certain bacteria or certain protozoa which are capable of growing inside the host cells, thus escaping the antibodies. It is also involved in transplant rejection phenomena and the destruction of tumors.
  • the molecular effectors are the antibodies secreted by B lymphocytes
  • the molecular effectors of cellular immunity are the TcR receptors anchored in the cytoplasmic membrane of T lymphocytes.
  • TcR Recognition of a T epitope by TcR involves a much more complex mechanism than that involved in the recognition of a B epitope by an antibody. Indeed, the TcR will recognize the ' peptide constituting its epitope only if the latter is associated with a class I or class II molecule of the MHC (major histocompatibility complex) on the surface of a presenting cell. The TcR of the CD4 and CD8 T lymphocytes thus recognize the epitopes presented respectively by the . class II molecules and by class I molecules of the MHC.
  • T epitope of an antigen, any peptide fragment of said antigen capable of being recognized in the context of appropriate MHC, by the TcR receptor of a T lymphocyte, and of inducing the activation of said lymphocyte.
  • T epitope The size of a T epitope varies according to the class of the MHC molecule presenting the peptide; CD8 + T epitopes presented by MHC class I molecules have a size of 8 to 10 amino acids, while CD4 + T epitopes presented by MHC class II molecules have a size of 13 to 25 amino acids.
  • sequence of epitopes varies according to the allele of the MHC concerned.
  • T epitopes restricted to different alleles of MHC class II or MHC class I have been identified and the sequences of these epitopes are available in the literature.
  • TcR-T epitope interaction associated with MHC induces, in the presence of various co-stimulation signals which result from the interaction of molecules on the surface of T cells and of molecules on the surface of presenting cells, stimulation of lymphocytes resulting in cell multiplication resulting in effector T cells.
  • Effector lymphocytes can be grouped into different populations according to their effector functions, which define various types of immune response. These populations can be distinguished in particular by their capacity to secrete different molecules (cytokines, lytic factors) or combinations of particular molecules.
  • cytokines cytokines, lytic factors
  • Thl or Tl lymphocytes which are characterized by the secretion of cytokines, in particular interleukin 2 (IL-2) and gamma interferon (IFN- ⁇ ), and Th2 or T2 cells which secrete cytokines such as IL-4, IL-5, IL-6 and IL-10.
  • IL-2 interleukin 2
  • IFN- ⁇ gamma interferon
  • cell-mediated immunity Unlike humoral immunity which is not significantly detectable about 1 month after a first contact with an immunogen, cell-mediated immunity appears within a few days after this first contact; it then persists for a long time, in the form of memory T lymphocytes, which are capable of proliferating and rapidly acquiring effector functions during a subsequent presentation of the same immunogen.
  • Cellular immunity can therefore be a good indicator, allowing the very early detection of a immune response to a specific antigen, and determining the type of immune response involved.
  • the detection of antigen-specific effector T cells is used in various research laboratories, for example in the context of vaccine development, to search for immunizing epitopes and to assess the intensity and type of the immunogenic response.
  • An approach which is increasingly used to assess cellular immunity to an antigen consists in providing peptides constituting known T epitopes of said antigen and in analyzing the reactivity of T lymphocytes vis-à-vis these peptides.
  • this technique was used to identify specific CD8 + effector T cells influenza virus epitopes (LALVANI et al., J. Exp. Med. 186, 859-865, 1997); to analyze the CD ⁇ T response vis-à-vis peptides representing various epitopes of HIV1 used in vaccines (GAHERY-SEGARD et al., J. Virol., 74, 1694-1703, 2000); to detect the presence of infection by Mycobacterium tuberculosis by detection of effector T cells specific for epitopes of the ESAT-6 antigen (LALVANI et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 163, 824-828, 2001).
  • the inventors have now found that, surprisingly, bringing a subject's T cells into contact with peptides constituting epitopes recognized by said T cells, fixed on a solid support, leads to the activation of specific effector T cells of said epitopes.
  • the present invention relates to the use of a solid support to which is attached at least one peptide constituting an T epitope of an antigen for the detection and / or characterization in vitro of cellular immunity with respect to said antigen.
  • the present invention relates in particular to a method for detecting and / or characterizing mv tro the cellular immune response of a subject vis-à-vis an antigen, by contacting a biological sample comprising CD4 + T lymphocytes and / or CD8 + T lymphocytes present in peripheral blood monocytic cells (PBMCs) of said subject with one or more peptide (s) constituting a T epitope (s) of said antigen capable of be presented by a MHC molecule of said subject and detection of effector T cells activated by this contacting, which method is characterized in that the said peptide (s) is (are) fixed (s) on a solid support.
  • PBMCs peripheral blood monocytic cells
  • the biological sample can consist of a preparation of purified CD4 + or CD8 + T cells. It can also consist of a preparation of PBMCs obtained from a blood sample from said subject; advantageously, whole blood can also be used.
  • At least 2 peptides constituting 2 different T epitopes of said antigen, and at least one of which is capable of being presented by a molecule of the MHC of said subject are fixed solid support audit.
  • a mixture of said peptides is fixed to said solid support.
  • said solid support consists of a microtiter plate, said peptides being fixed in at least 2 different wells of said plate and the biological sample is divided into at least 2 aliquots, of which each is brought into contact with one of said peptides.
  • the peptide (s) used can constitute a CD4 + T epitope (s), or a CD8 + T epitope (s).
  • a CD4 + T epitope (s) and a CD8 + T epitope (s) can also be used simultaneously, separately or as a mixture.
  • bringing the peptides attached to the solid support into contact with the biological sample to be tested is carried out under the same conditions as in the methods of the prior art where the peptides are present in the liquid phase. Generally, this contacting will be carried out by incubation for 5 to 20 hours at 37 ° C., in the presence of 5% of CO 2 .
  • activated effector T lymphocytes can be carried out by conventional methods.
  • the soluble factors (cytokines or lytic factors) secreted by these lymphocytes will be assayed.
  • the assay of IL-2 or IFN- ⁇ makes it possible to characterize a Thl or Tl response
  • the assay of IL-4, IL-5, IL-6 or IL-10 allows to characterize a Th2 or T2 response.
  • Other soluble factors which essentially characterize CD8 + T lymphocytes such as chemokines (RANTES), or molecules with a lysis function (such as perforin / granzyme) can also be assayed.
  • RANTES chemokines
  • a lysis function such as perforin / granzyme
  • activated T lymphocytes which may be used in the context of the present invention are, for example, intracellular labeling of cytokines.
  • the method according to the invention makes it possible to considerably simplify the test procedure, in particular in the case of analyzes involving the parallel use of different peptides, which are conventionally carried out in the wells of a microtiter plate, or in a series of tubes.
  • the attachment of the peptides to a solid support makes it possible to stabilize them and protect them from degradation which occurs rapidly in a liquid medium.
  • the peptides retain their specific activation properties of T lymphocytes for at least 24 hours at 20 ° C., at least a week at 4 ° C, and at least 15 days in a freezer at -80 ° C, while solutions of the same peptides lose their properties in a few hours at 37 ° C.
  • the present invention has the advantage of considerably reducing the concentrations of peptides used, thus allowing a very substantial reduction in costs.
  • the present invention also relates to a kit for implementing a method in accordance with the invention, comprising an assortment of peptides derived from the same antigen, each of which constitutes a T epitope of said antigen, fixed on a solid support. .
  • kits in accordance with the invention solid supports and methods of fixing the peptides to said supports can be used, of the same type as those which are usually used in particular for antigen antibody assay kits.
  • supports made of plastic materials such as polystyrene, polyethylene or polyvinyl chloride, supports made of nitrocellulose, supports made of silica-based materials, such as glass, etc.
  • the fixing of the peptides can be carried out by techniques also known in themselves; the choice of The most appropriate techniques depend on the support concerned, and on the physicochemical properties of the peptides chosen.
  • the attachment of the peptides can be carried out by adsorption.
  • the support and the fixing conditions will of course be chosen so as to avoid the desorption of the peptides during the addition of the biological sample to be tested and the incubation therewith.
  • the peptides will be attached to the support by covalent bonding, directly or via a spacer arm.
  • the surface of the support can be activated by means of agents such as carbodiimide derivatives, N-hydroxysuccynimide derivatives, sulfosuccynimide derivatives etc.
  • Biotinylated peptides can also be used, fixed on a support covered with avidin.
  • the support can be in the form of a tube or a set of tubes, a microtiter plate, one or more strips, beads, etc.
  • the antigen may in particular be an infectious microorganism (virus, protozoan, bacteria), a tumor antigen, an autoimmune antigen or an allergen. If it is a microorganism, the peptides constituting the assortment can be derived from different antigenic proteins of this organism.
  • peptides constituting the assortment depends of course on the antigen concerned, and on the precise use for which the kit is intended. These will be peptides previously identified as constituting CD4 + or CD8 + T epitopes of the antigen concerned.
  • this assortment will include peptides capable of being presented by alleles different from the MHC. It may consist of peptides constituting CD4 + T epitopes, peptides constituting CD8 + T epitopes, or a mixture of these two types of epitopes.
  • the peptides constituting the assortment can be mixed and fixed in the form of a mixture to the solid support.
  • the solid support is a microtiter plate or a set of tubes
  • different peptides or combinations of peptides can also be fixed separately, each peptide or combination of peptide being fixed inside one of the wells of the microtitration plate , or one of the tubes.
  • a kit according to the invention can also further comprise means for detecting activated effector T lymphocytes.
  • These means can, for example, consist of reagents for assaying soluble factors produced by said lymphocytes.
  • the present invention can, for example, be implemented in human or animal health:
  • viruses such as HIV (human i munodeficiency virus) 1 and 2, FIV (feline immunodeficiency virus), HTLV-1 (Human T Lymphocyte Virus type I), viruses of different types hepatitis, etc; parasites such as Toxo * plasma, or Plasmodium; prions, etc. ; - in the context of screening and monitoring the development of pathologies of tumor origin.
  • viruses such as HIV (human i munodeficiency virus) 1 and 2, FIV (feline immunodeficiency virus), HTLV-1 (Human T Lymphocyte Virus type I), viruses of different types hepatitis, etc; parasites such as Toxo * plasma, or Plasmodium; prions, etc. ; - in the context of screening and monitoring the development of pathologies of tumor origin.
  • examples include: melanoma, breast cancer, myeloid leukemia, cancers associated with a viral infection, such as cervical cancer associated with the human papilloma virus, etc.
  • autoimmune diseases in the context of screening and monitoring the development of autoimmune diseases.
  • the present invention allows, by the detection of cell-mediated immunity, a very early diagnosis of the appearance or the evolution of a pathology, before the appearance of clinical signs and before the appearance of the humoral response. This makes possible a faster medical decision, a better therapeutic strategy and a better chance of success of the treatment for the patients.
  • the present invention will be better understood with the aid of the additional description which follows, which refers to nonlimiting examples illustrating its implementation for the characterization of specific cellular immunity vis-à-vis different viral pathogens .
  • EXAMPLE 1 FIXING ON A SOLID SUPPORT OF PEPTIDES CONSTITUTING T-EPITOPES
  • HIV-1 virus human immunodeficiency virus
  • CMV cytomegalovirus
  • EBV virus Epstein Barr virus
  • HIV-1 virus gag 77-85 (SLYNTVATL, HLA A2)
  • GAG 260-268 EIYKRWIIL, HLA A2
  • Nef 82-91 (KAALDLSHFL, HLA A2) CMV virus:
  • EBNA 3A 379-387 RPPIFIRRL, HLA B7
  • EBNA 3C 163-171 EGVG RHV, HLA B44
  • HLA-A2 (HLA-A2) seropositive for HIV-1 were tested as follows.
  • a test was carried out by the conventional ELISPOT method: 200 ⁇ l (10 5 cells) of suspension of PBMCs from the same patient are deposited in the wells of a 96-well plate, NUNC (identical to that on which peptides have been fixed), and mixed with 10 ⁇ g of peptide gag 77-85, GAG 260-268, or Nef 82-91 in solution in conventional culture medium.
  • PBMCs were also deposited in wells without peptides, as a control.
  • the plates are incubated overnight at 37 ° C. in an incubator in the presence of 5% of CO 2 .
  • a 96-well nitrocellulose plate (MILLIPORE) was covered with 100 ⁇ l / well of anti-IFN ⁇ antibody (MABTECH, 1-D1K), diluted to 1 ⁇ g / ml in carbonate buffer for 2 hours at 37 ° C.
  • the plate was then washed in PBS and saturated with RPMI, SVF 10% at a rate of 100 ⁇ l / well, for 2 hours at 37 ° C.
  • EXAMPLE 3 CHARACTERIZATION OF A CELLULAR IMMUNITY FROM CMV
  • PBMCs purified from the blood of a patient were tested as follows.
  • 2 x 10 5 cells suspended in conventional medium are deposited in each of the wells to which the CMV peptides have been fixed, as described in Example 1 above.
  • a test was carried out by the conventional ELISPOT method: 2 ⁇ 10 5 suspension cells of PBMCs from the same patient are deposited in the well of a 96-well plate (NUNC) (identical to that to which the peptides were fixed), and mixed with- 10 ⁇ g of peptide GB 619-628 or IEI 378-389.
  • NUNC 96-well plate
  • PBMCs were also deposited in wells without peptides, as a control.
  • EXAMPLE 4 STORAGE OF FIXED PEPTIDES ON SOLID SUPPORT.
  • EBNA 3A 379-387 (RPPIFIRRL, B7), and EBNA 6 290-299 (EENLLDFVRF, B44), constituting known CD8 + T epitopes of EBV, was fixed on the internal wall of a polystyrene tube, according to the following protocol :
  • plasma blood was taken.
  • the plasma 100, 50 and 12.5 microliters was deposited in duplicate on a plate

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Abstract

L'invention concerne : une méthode de détection de l'immunité cellulaire (vis-à-vis d'un antigène), utilisant un support solide sur lequel est fixé un assortiment de peptides constituant des épitopes T de l'antigène à tester, des kits pour la mise en oeuvre de ladite méthode.

Description

TEST DE L' IMMUNITE CELLULAIRE PAR DES PEPTIDES FIXES SUR
SUPPORT SOLIDE.
L'invention est relative à de nouveaux moyens de détection de l'immunité cellulaire. L'immunité à médiation cellulaire joue un rôle majeur dans la réponse immunitaire vis-à-vis de microorganismes tels que des virus, ainsi que certaines bactéries ou certains protozoaires qui sont capables de se développer à l'intérieur des cellules de l'hôte, échappant ainsi aux anticorps. Elle intervient aussi dans des phénomènes de rejet de greffe et la destruction de tumeurs.
Alors que dans le cas de l'immunité humorale, les effecteurs moléculaires sont les anticorps sécrétés par les lymphocytes B, les effecteurs moléculaires de l'immunité cellulaire sont les récepteurs TcR ancrés dans la membrane cytoplasmique des lymphocytes T.
La reconnaissance d'un épitope T par le TcR implique un mécanisme beaucoup plus complexe que celui qui intervient dans la reconnaissance d'un épitope B par un anticorps. En effet, le TcR ne reconnaîtra le ' peptide constituant son épitope que si celui-ci est associé à une molécule de classe I ou de classe II du CMH (complexe majeur d' histocompatibilité) à la surface d'une cellule présentatrice. Les TcR des lymphocytes T CD4 et CD8 reconnaissent ainsi les epitopes présentés respectivement par les. molécules de classe II et par les molécules de classe I du CMH.
On définit comme « épitope T » d'un antigène, tout fragment peptidique dudit antigène capable d' être reconnu dans le contexte de CMH approprié, par le récepteur TcR d'un lymphocyte T, et d'induire l'activation dudit lymphocyte .
La taille d'un épitope T varie selon la classe de la molécule de CMH présentant le peptide ; les epitopes T CD8+ présentés par les molécules du CMH de classe I ont une taille de 8 à 10 acides aminés, alors que les epitopes T CD4+ présentés par les molécules du CMH de classe II ont une taille de 13 à 25 acides aminés. Pour un même antigène et pour une même classe de CMH, la séquence des epitopes varie selon l'allèle du CMH concerné .
Pour de très nombreux antigènes, une grande variété d' epitopes T restreints à différents allèles du CMH de classe II ou du CMH de classe I a été identifiée et les séquences de ces epitopes sont disponibles dans la littérature .
L' interaction TcR-épitope T associé au CMH induit, en présence de divers signaux de co-stimulation qui résultent de l' interaction de molécules en surface des cellules T et de molécules en surface des cellules présentatrices, une stimulation des lymphocytes se traduisant par une multiplication cellulaire aboutissant à des lymphocytes T effecteurs.
Les lymphocytes effecteurs peuvent être regroupés en différentes populations selon leurs fonctions effectrices, qui définissent divers types de réponse immunitaire. Ces populations peuvent être distinguées notamment par leur capacité à sécréter différentes molécules (cytokines, facteurs lytiques) ou combinaisons de molécules particulières. Par exemple, parmi les lymphocytes effecteurs qui peuvent se différencier à partir des cellules CD4+ ou CD8+, on citera les lymphocytes Thl ou Tl, qui se caractérisent par la sécrétion de cytokines notamment l' interleukine 2 (IL-2) et l'interféron gamma (IFN-γ) , et les cellules Th2 ou T2 qui sécrètent des cytokines telles que l'IL-4, l'IL-5, l'IL-6 et l'IL-10.
Contrairement à l'immunité humorale qui n'est détectable d'une façon significative environ 1 mois après un premier contact avec un immunogène, l'immunité à médiation cellulaire apparaît en quelques jours après ce premier contact ; elle persiste ensuite pendant une longue période, sous forme de lymphocytes T mémoire, qui sont capables de proliférer et d'acquérir rapidement des fonctions effectrices lors d'une présentation ultérieure du même immunogène.
L' immunité cellulaire peut donc constituer un bon indicateur, permettant la détection très précoce d'une réponse immunitaire vis-à-vis d'un antigène déterminé, et la détermination du type de réponse immunitaire mise en jeu.
La détection de lymphocytes T effecteurs spécifiques d'antigène est utilisée dans différents laboratoires de recherche, par exemple dans le cadre de la mise au point de vaccins, pour rechercher les epitopes immunisants et évaluer l'intensité et le type de la réponse immunogène .
Une approche de plus en plus souvent utilisée pour évaluer l'immunité cellulaire vis-à-vis d'un antigène consiste à fournir des peptides constituant des epitopes T connus dudit antigène et à analyser la réactivité des lymphocytes T vis-à-vis de ces peptides.
Cette approche peut théoriquement être utilisée pour le diagnostic ou le suivi de pathologies entraînant une réponse à médiation cellulaire. Toutefois, contrairement à l'immunité humorale, que l'on peut détecter facilement in vi tro par mise en évidence de la formation d'un complexe antigène-anticorps, la détection de l'immunité cellulaire implique la mise en œuvre de techniques lourdes difficilement utilisables dans le cadre d'analyses de routine.
Il est en effet nécessaire :
1) de présenter aux lymphocytes les epitopes à tester, dans des conditions permettant leur reconnaissance par le TcR et l'activation des lymphocytes ;
2) de détecter les lymphocytes effecteurs activés .
Certaines méthodes développées récemment permettent de simplifier la détection des cellules effectrices. A titre d'exemple, la technique ELISPOT, initialement décrite par VERSTEEGEN et al . (J. Immunol. Methods, 111, 25-29, 1988) permet de détecter et caractériser des lymphocytes T effecteurs spécifiques d' epitopes, présents parmi les cellules du sang périphérique, par détection des facteurs sécrétés par lesdits lymphocytes après restimulation par des peptides représentant des epitopes T.
Par exemple, cette technique a été utilisée pour identifier des lymphocytes effecteurs T CD8+ spécifiques d' epitopes du virus de la grippe (LALVANI et al . , J. Exp. Med. 186, 859-865, 1997) ; pour analyser la réponse T CDδ" vis-a-vis de peptides représentant divers epitopes de HIV1 utilises dans des vaccins (GAHERY-SEGARD et al . , J. Virol., 74, 1694-1703, 2000) ; pour déceler la présence d'une infection par Mycobacterium tuberculosis par détection de lymphocytes effecteurs T spécifiques d' epitopes de l'antigène ESAT-6 (LALVANI et al . , Am. J. Respir. Crit. Care Med., 163, 824-828, 2001) . Les essais décrits dans les publications mentionnées ci-dessus ont été effectues en ajoutant une solution de chacun des peptides à tester à une suspension obtenue par séparation sur gradient de FICOL de cellules monocytaires du sang périphérique (PBMCs) ; on sait en effet que dans ces conditions, ces peptides peuvent être chargés directement par les molécules du CMH et présentés aux lymphocytes .
Or les Inventeurs ont maintenant constate que, de façon surprenante, la mise en contact des lymphocytes T d'un sujet avec des peptides constituant des epitopes reconnus par lesdits lymphocytes T, fixés sur un support solide, entraînait l'activation de lymphocytes T effecteurs spécifiques desdits epitopes.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'un support solide auquel est fixé au moins un peptide constituant un épitope T d' un antigène pour la détection et/ou la caractéπsation in vitro de l'immunité cellulaire vis-a-vis dudit antigène.
La présente invention a en particulier pour objet un procédé de détection et/ou de caractérisation m vi tro de la réponse immune cellulaire d'un sujet vis-à-vis d'un antigène, par mise en contact d'un échantillon biologique comprenant des lymphocytes T CD4+ et/ou des lymphocytes T CD8+ présents dans les cellules monocytaires du sang périphérique (PBMCs) dudit sujet avec un ou plusieurs peptide (s) constituant un (des) épitope (s) T dudit antigène capable (s) d'être présenté (s) par une molécule du CMH dudit sujet et détection des lymphocytes T effecteurs activés par cette mise en contact, lequel procédé est caractérisé en ce que le (s) dit (s) peptide (s) est (sont) fixé (s) sur un support solide .
L'échantillon biologique peut être constitué par une préparation de lymphocytes T CD4+ ou CD8+ purifiés . Il peut aussi être constitué par une préparation de PBMCs obtenue à partir d'un prélèvement de sang dudit sujet ; avantageusement, on peut également utiliser du sang total.
Selon un mode de mise en œuvre préféré du procédé conforme à l'invention, au moins 2 peptides constituant 2 epitopes T différents dudit antigène, et dont l'un au moins est capable d'être présenté par une molécule du CMH dudit sujet sont fixés audit support solide.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de mise en œuvre, un mélange desdits peptides est fixé audit support solide.
Selon une autre disposition avantageuse de ce mode de mise en œuvre, ledit support solide est constitué par une plaque de microtitration, lesdits peptides étant fixés dans au moins 2 puits différents de ladite plaque et l'échantillon biologique est divisé en au moins 2 aliquotes dont chacune est mise en contact avec l'un desdits peptides.
L'utilisation d'un mélange de peptides permet de détecter rapidement l'existence d'une réponse immune à médiation cellulaire vis-à-vis de l'antigène concerné.
L'utilisation séparée de différents peptides permet de mieux analyser les composantes de cette réponse.
Dans tous les cas, le (s) peptide (s) utilisé (s) peu(ven)t constituer un (des) épitope (s) T CD4+, ou un (des) épitope (s) T CD8+. On peut également utiliser simultanément un (des) épitope (s) T CD4+, et un (des) épitope (s) T CD8+, séparément ou en mélange.
Les autres modalités de mise en œuvre du procédé conforme à l'invention peuvent être identiques à celles utilisées dans les méthodes de détection in vi tro de la réponse immune cellulaire connues dans l'art antérieur.
Par exemple, la mise en contact entre les peptides fixés au support solide et l'échantillon biologique à tester s'effectue dans les mêmes conditions que dans les méthodes de l'art antérieur où les peptides sont présents dans la phase liquide. Généralement, cette mise en contact s'effectuera par incubation pendant 5 à 20 heures à 37°C, en présence de 5% de C02.
De même, la détection des lymphocytes T effecteurs activés peut s'effectuer par les méthodes classiques .
Avantageusement, on effectuera le dosage des facteurs solubles (cytokines ou facteurs lytiques) sécrétés par ces lymphocytes. Par exemple, le dosage de l'IL-2 ou de l'IFN-γ permet de caractériser une réponse Thl ou Tl, alors que le dosage de l'IL-4, l'IL-5, l' IL-6 ou l'IL-10, permet de caractériser une réponse Th2 ou T2. D'autres facteurs solubles qui caractérisent essentiellement les lymphocytes T CD8+ comme les chimiokines (RANTES), ou les molécules à fonction de lyse (comme perforine/granzyme) peuvent également être dosés .
D'autres méthodes de détection des lymphocytes T activés éventuellement utilisables dans le cadre de la présente invention sont par exemple le marquage intracellulaire des cytokines.
Par rapport aux méthodes d'évaluation de l'immunité cellulaire connues dans l'art antérieur, dans lesquelles les peptides à tester sont ajoutés dans la suspension de cellules, le procédé conforme à l'invention permet de simplifier considérablement la procédure d'essai, notamment dans le cas d'analyses impliquant l'utilisation en parallèle de différents peptides, qui s'effectuent classiquement dans les puits d'une plaque de microtitration, ou dans une série de tubes.
En effet, alors que les techniques de l'art antérieur nécessitent d'ajouter aux cellules à tester un peptide ou un mélange de peptides défini dans chacun des puits de la plaque ou dans chaque tube de la série, il est possible, dans le cadre de la mise en œuvre de la présente invention, d'utiliser des plaques ou des tubes préparés d'avance, chacun des puits desdites plaques ou chacun desdits tubes étant recouvert du peptide ou du mélange de peptides souhaité. Ceci permet de réduire considérablement les manipulations nécessaires, donc de diminuer le temps nécessaire à la mise en œuvre de l'essai et d'augmenter sa reproductibilité en limitant les causes d'erreur.
En outre, la fixation des peptides sur un support solide permet de stabiliser ceux-ci et de les protéger de la dégradation qui intervient rapidement en milieu liquide. A titre d' illustration, dans le cas de peptides fixés par adsorption sur les puits d'une plaque de microtitration en polystyrène, les peptides conservent leurs propriétés d' activation spécifique des lymphocytes T pendant au moins 24 heures à 20 °C, au moins une semaine à 4°C, et au moins 15 jours dans un congélateur à -80°C, alors que des solutions des mêmes peptides perdent leurs propriétés en quelques heures à 37°C.
De plus, la présente invention présente l'avantage de diminuer considérablement les concentrations de peptides utilisés, permettant ainsi une diminution très conséquente des coûts.
La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en œuvre d'un procédé conforme à l'invention, comprenant un assortiment de peptides issus d'un même antigène, dont chacun constitue un épitope T dudit antigène, fixés sur un support solide.
Pour la réalisation de kits conformes à l'invention, on peut utiliser des supports solides, et des méthodes de fixation des peptides auxdits supports, de même type que ceux qui sont habituellement utilisés notamment pour les kits de dosage antigène anticorps.
Par exemple, on peut utiliser des supports en matériaux plastiques tels que le polystyrène, le polyéthylène ou le chlorure de polyvinyle, des supports en nitrocellulose, des supports en matériaux à base de silice, tels que le verre, etc.
La fixation des peptides peut s'effectuer par des techniques également connues en elles-mêmes ; le choix des techniques les plus appropriées dépend du support concerné, et des propriétés physicochimiques des peptides choisis-.
On peut par exemple synthétiser directement les peptides sur le support, ou fixer à celui-ci des peptides présynthétisés.
Par exemple, la fixation des peptides peut s'effectuer par adsorption. Le support et les conditions de fixation seront bien entendu choisis de manière à éviter la désorption des peptides lors de l'addition de l'échantillon biologique à tester et de l'incubation avec celui-ci.
Avantageusement, les peptides seront fixés au support par liaison covalente, directement ou par l'intermédiaire d'un bras espaceur. Dans ce cas la surface du support peut être activée par l' intermédiaires d'agents tels que les dérivés de carbodiimide, les dérivés de N- hydroxysuccynimide, les dérivés de suifosuccynimide etc.
On peut également utiliser des peptides biotinylés, fixés sur un support recouvert d'avidine.
Le support peut être sous forme d'un tube ou d'un ensemble de tubes, d'une plaque de microtitration, d'une ou plusieurs bandelettes, de billes, etc.
L' antigène peut être en particulier un microorganisme infectieux (virus, protozoaire, bactérie), un antigène tumoral, un antigène auto-immun ou un allergène. S'il s'agit d'un micro-organisme, les peptides constituant l'assortiment peuvent être issus de différentes protéines antigéniques de cet organisme.
Le choix des peptides constituant l'assortiment dépend bien entendu de l'antigène concerné, et de l'utilisation précise à laquelle est destiné le kit. Il s'agira de peptides précédemment identifiés comme constituant des epitopes T CD4+ ou CD8+ de l'antigène concerné.
Avantageusement, cet assortiment comprendra des peptides capables d' être présentés par des allèles différents du CMH. Il peut être constitué de peptides constituant des epitopes T CD4+, de peptides constituant des epitopes T CD8+, ou d'un mélange de ces deux types d' epitopes. Les peptides constituant l'assortiment peuvent être mélangés et fixés sous forme de mélange au support solide. Lorsque le support solide est une plaque de microtitration ou un ensemble de tubes, différents peptides ou combinaisons de peptides peuvent également être fixés séparément, chaque peptide ou combinaison de peptide étant fixé à l'intérieur de l'un des puits de la plaque de microtitration, ou de l'un des tubes.
Un kit conforme à l'invention peut également comprendre en outre des moyens de détection des lymphocytes T effecteurs activés. Ces moyens peuvent par être constitués par des réactifs de dosage des facteurs solubles produits par lesdits lymphocytes.
La présente invention peut par exemple être mise en œuvre, en santé humaine ou animale :
- dans le cadre du dépistage et du suivi de l'évolution d'infections par différents agents pathogènes entraînant une réponse immunitaire cellulaire. A titre d' exemples on citera : des virus tels que les HIV (human i munodeficiency virus) 1 et 2, le FIV (féline immunodeficiency virus), le HTLV-1 (Human T Lymphocyte Virus type I), les virus des différents types d'hépatite, etc ; des parasites tels que Toxo *plasma , ou Plasmodium ; les prions, etc. ; - dans le cadre du dépistage et du suivi de l'évolution de pathologies d'origines tumorales. A titre d'exemples on citera : le mélanome, le cancer du sein, les leucémies myéloïdes, les cancers associés à une infection virale, comme le cancer du col associé au papilloma virus humain, etc. ;
- dans le cadre du dépistage et du suivi de l'évolution de maladies auto-immunes. A titre d'exemple on citera le diabète de type I, la sclérose en plaques, etc. ;
- dans le cadre du dépistage et du suivi de l'évolution des maladies de type allergique. A titre d'exemple, on citera des allergènes comme les graminées, les pollens, certains médicaments. Quelle que soit l'utilisation concernée, la présente invention permet, par la détection de l'immunité à médiation cellulaire, un diagnostic très précoce de l'apparition ou de l'évolution d'une pathologie, avant l'apparition des signes cliniques et avant l'apparition de la réponse humorale. Ceci rend possible une décision médicale plus rapide, une meilleure stratégie thérapeutique et de meilleures chances de succès du traitement pour les patients. La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant sa mise en œuvre pour la caractérisation d'une immunité cellulaire spécifique vis-à-vis de différents pathogènes viraux. EXEMPLE 1 : FIXATION SUR UN SUPPORT SOLIDE DE PEPTIDES CONSTITUANT DES EPITOPES T.
Différents peptides constituant des epitopes CD8+ connus de trois virus différents : le virus HIV-1 (virus de 1' immunodeficience humaine), le CMV (cytomegalovirus) et le virus EBV (virus d' Epstein Barr) , ont été synthétisés. Ces peptides sont les suivants :
Virus HIV-1: gag 77-85 (SLYNTVATL, HLA A2)
GAG 260-268 (EIYKRWIIL, HLA A2 )
Nef 82-91 (KAALDLSHFL, HLA A2 ) Virus CMV :
GB 619-628 (FIAGNSAYEYV, HLA A2 )
IEI 378-389 (SDEEEAIVAYTL, HLA B18)
Virus EBV :
EBNA 3A 379-387 (RPPIFIRRL, HLA B7) EBNA 3C 163-171 (EGGVG RHV, HLA B44) .
Ces peptides ont été fixés au fond des puits d'une plaque en polystyrène, par le protocole suivant.
10 μg de peptide en tampon carbonate ont été déposés dans une plaque de microtitration à 96 puits (plaque en polystyrène, NUNC MAXISORB) . La fixation des peptides s'est faite par adsorption pendant 2 heures à température ambiante. Les peptides non-fixés sont éliminés par deux lavages en PBS .
EXEMPLE 2 : CARACTERISATION D'UNE IMMUNITE CELLULAIRE VIS-AVIS DE H V-1 Des PBMCs purifiées à partir du sang d'un patient
(HLA-A2) séropositif pour HIV-1 ont été testées comme suit.
1 ) Activation des lymphocytes :
200 μil (105 cellules) de suspension cellulaire dans du milieu de culture classique (RPMI, 10% de SAB) sont déposés dans chacun des puits dans lesquels lequel ont été fixés les peptides de HIV-1, comme décrit à l'Exemple 1 ci- dessus .
A titre de témoin positif, un essai a été effectué par la méthode ELISPOT classique : 200 μl (105 cellules) de suspension des PBMCs du même patient sont déposés dans les puits d'une plaque 96 puits, NUNC (identique à celle sur laquelle ont été fixés les peptides) , et mélangées avec 10 μg de peptide gag 77-85 , GAG 260-268, ou Nef 82-91 en solution dans du milieu de culture classique. Dans les 2 essais, des PBMCs ont également été déposées dans des puits sans peptides, à titre de contrôle. o
Les plaques sont incubées une nuit à 37 C dans un incubateur en présence de 5% de C02.
2) Sélection des lymphocytes T CD8+ activés : Le lendemain, la présence des cellules CD8+ activées est révélée selon le protocole suivant :
Une plaque de 96 puits en nitrocellulose (MILLIPORE) a été recouverte avec 100 μl/puits d'anticorps anti-IFNγ (MABTECH, 1-D1K) , dilué à 1 μg/ml dans du tampon carbonate pendant 2 heures à 37 °C.
La plaque a été ensuite lavée en PBS et saturée avec du RPMI, SVF 10% à raison de 100 μl/puits, pendant 2 heures à 37°C.
200 μl de suspension cellulaire activée comme décrit en 1) ci-dessus sont déposés dans cette plaque. L'incubation s'effectue pendant 5 heures à 37 °C, 5% C02. Après 1 lavage en PBS IX et 5 lavages en PBS T EEN 0,05%, on ajoute 100 μl/puits d'anticorps anti-IFN-γ Biotin (MABTECH, 7-B6-l-Biotin) à 1 μg/ml, et on incube pendant de 2 heures à température ambiante. Les plaques sont lavées 5 fois en PBS-TWEEN
0,05%.
100 μl/puits Extravidin-AKP (SIGMA, n° 2636) dilué au 1/5000 en PBS TWEEN 0,05%, BSA 1% ont ajoutés.
L'incubation s'effectue pendant 1 heure à température ambiante. Les plaques sont à nouveau lavées 5 fois en PBS
TWEEN 0,05%.
La révélation s'effectue à l'aide du kit BIORAD (n° 170-6432) .
Après 1/2 heure à 1 heure, la réaction est arrêtée en lavant les plaques avec de l'eau. Les plaques sont séchées à l'air.
Les résultats sont illustrés par la Figure 1.
A : Essai ELISPOT classique ;
B : Essai effectué avec les peptides fixés sur support solide.
Dans les 2 cas, seul le peptide gag 77-85 induit une activation de lymphocytes T CD8+ effecteurs sécrétant de 1' IFN-γ. Ces résultats montrent que l'utilisation de peptides fixés sur un support solide est au moins aussi efficace pour induire l'activation de cellules effectrices que celle de peptides présentés en phase liquide.
EXEMPLE 3 : CARACTERISATION D'UNE IMMUNITE CELLULAIRE VIS-AVIS DE CMV
Des PBMCs purifiées à partir du sang d'un patient (HLA-A2, B18) ont été testées comme suit.
2 x 105 cellules en suspension dans du milieu classique sont déposés dans chacun des puits dans lesquels lequel ont été fixés les peptides de CMV, comme décrit à l'Exemple 1 ci-dessus. A titre de témoin positif, un essai a été effectué par la méthode ELISPOT classique : 2 x 105 cellules de suspension des PBMCs du même patient sont déposés dans les puits d'une plaque 96 puits (NUNC) (identique à celle sur laquelle ont été fixés les peptides) , et mélangées avec- 10 μg de peptide GB 619-628 ou IEI 378-389.
Dans les 2 essais, des PBMCs ont également été déposées dans des puits sans peptides, à titre de contrôle.
L' incubation et la révélation des plaques sont effectuées comme décrit dans l'exemple 2 ci-dessus.
Les résultats sont illustrés par la Figure 2.
A Essai ELISPOT classique ; B Essai effectué avec les peptides fixés sur support solide.
Dans les 2 cas, seul le peptide GB 619-628 induit une activation de lymphocytes T CD8+ effecteurs sécrétant de l'IFN-γ. Ces résultats confirment ceux observés dans le cas des peptides de HIV-1.
EXEMPLE 4 : CONSERVATION DES PEPTIDES FIXES SUR SUPPORT SOLIDE .
Des plaques dans les puits desquelles ont été fixés les peptides de EBV, comme décrit à l'Exemple 1 ci- dessus, ont été conservées :
A) à 20°C pendant 24H ;
B) à 4°C pendant 7 jours ;
C) à -80°C pendant 15 jours.
2 x 105 PBMCs purifiées à partir du sang d'un patient (HLA B7/B44) en suspension dans du milieu de culture classique sont déposés dans chacun des puits de ces plaques, et testées comme décrit à l'Exemple 3 ci-dessus.
Les résultats sont illustrés par la Figure 3. A : conservation à 20 °C pendant 24H ;
B conservation à 4°C pendant 7 jours ; C conservation à -80°C pendant 15 jours. Ces résultats montrent que les conditions de conservation ne modifient pas les propriétés d' activation de cellules effectrices des peptides fixés sur support solide. EXEMPLE 5 : DETECTION D'UNE IMMUNITE CELLULAIRE VIS-A-VIS DE EBV A L'AIDE D'UN MELANGE DE PEPTIDES FIXES SUR SUPPORT SOLIDE .
Un mélange des peptides suivants : EBNA 3C 163-171 (EGGVGWRHV, B44),
EBNA 3A 603-611 (RLRAEAGVK, A3),
EBNA 4 416-424 (IVTDFSVIK, Ail),
EBNA 3C 881-891 (QPRAPIRPIPT, B7),
EBNA 3A 379-387 (RPPIFIRRL, B7), et EBNA 6 290-299 (EENLLDFVRF, B44), constituant des epitopes T CD8+ connus de EBV a été fixé sur la paroi interne d'un tube de polystyrène, selon le protocole suivant :
10 μg de chaque peptide dilué en tampon carbonate ont été déposés dans un tube en polystyrène (tube 15 ml, CORNING). La fixation des peptides s'effectue par adsorption pendant 2 heures à température ambiante. Les peptides non- fixés sont éliminés par deux lavages en PBS.
2 ml de sang total d'un patient (HLA : A3-A11, B7/B44) ont été incubés pendant 5 heures dans le tube ainsi obtenu .
Après cette incubation, le sang total a été centrifugé pendant 10 min à 1500 T/min et le surnageant
(plasma) du sang a été prélevé. Le plasma (100, 50 et 12,5 microlitres) a été déposé en duplicate sur une plaque de
96 puits pré-incubée avec un anticorps anti-IFN-gamma, pendant 2 h à une température de 20 °C. Après lavage, un 2eme anticorps anti-IFN-gamma biotinylé a été ajouté pendant 1 h à une température de 20°C. Puis l' extravidine-PA a été ajoutée pendant 1 h à une température de 20 °C et 100 microlitres de substrat MUP (substrat de la phosphase alcaline) a permis la révélation de la réaction. La lecture à été réalisée après
30 min.
Les résultats sont illustrés par la Figure 4. Légende de la Figure 4 :
I I : sans peptide Ëi : 10 microgrammes de peptide
Ces résultats montrent qu'il est possible de détecter la présence d'une réponse cellulaire spécifique d'un virus (ici détection du virus EBV) à partir du sang total d'un patient. Cette réponse cellulaire est spécifique au virus et la production d' IFN-gamma a été détectée à différentes dilutions de plasma. Le différentiel est significatif entre la production d' IFN-gamma obtenue à partir du sang total seul (contrôle négatif) ou du sang total incubé avec les peptides du virus EBV. Les cellules présentes dans le sang du patient 1056 ont été activées et ont produit de façon spécifique de l'INF-gamma en présence des peptides CD8+ dérivés du virus EBV.

Claims

REVENDICATIONS
1) Utilisation d'un support solide auque-1 est fixé au moins un peptide constituant un épitope T d'un antigène pour la détection et/ou la caractérisation in vi tro de l'immunité cellulaire vis-à-vis dudit antigène.
2) Procédé de détection et/ou de caractérisation in vi tro de la réponse immune cellulaire d'un sujet vis-à-vis d'un antigène, par mise en contact d'un échantillon biologique comprenant des lymphocytes T CD4+ et/ou des lymphocytes T CD8+ présents dans les cellules monocytaires du sang périphérique dudit sujet avec un ou plusieurs peptide (s) constituant un (des) épitope (s) T dudit antigène capable (s) d'être présenté (s) par une molécule du CMH dudit sujet et détection des lymphocytes T effecteurs activés par cette mise en contact, lequel procédé est caractérisé en ce que le (s) dit (s) peptide (s) est (sont) fixé (s) sur un support solide.
3) Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'au moins 2 peptides constituant 2 epitopes T différents dudit antigène, et dont l'un au moins est capable d'être présenté par une molécule du CMH dudit sujet sont fixés audit support solide.
4) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce qu'un mélange desdits peptides est fixé audit support solide.
5) Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit support solide est constitué par une plaque de microtitration, lesdits peptides étant fixés dans au moins 2 puits différents de ladite plaque et l'échantillon biologique est divisé en au moins 2 aliquotes dont chacune est mise en contact avec l'un desdits peptides.
6) Procédé selon une - quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le (s) peptide (s) utilisé (s) constitue (nt) un (des) épitope (s) T CD4+. 7) Procédé selon une quelconque des revendications 2 à 5, caractérisé en ce que le (s) peptide (s) utilisé (s) constitue (nt) un (des) épitope (s) T CD8+. 8) Kit pour la mise en œuvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 2 à 7, comprenant : .-
- un assortiment de peptides issus d'un même antigène, dont chacun constitue un épitope T identifié dudit antigène, fixés sur un support solide, et ; des moyens de détection des lymphocytes T effecteurs activés.
9) Kit pour la mise en œuvre d'un procédé selon une quelconque des revendications 2 à 5, comprenant un assortiment de peptides issus d'un même antigène, dont chacun constitue un épitope T identifié dudit antigène, fixés sur un support solide, ledit assortiment comprenant au moins un peptide constituant un épitope T CD4+et au moins un peptide constituant un épitope TCD8+.
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