ES2316620T3 - Ensayo de inmunidad celular con peptidos fijados en un soporte solido. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de detección y/o de caracterización in vitro de la respuesta inmune celular de un sujeto frente a un antígeno, mediante puesta en contacto de una muestra biológica que comprende linfocitos T CD4 + y/o linfocitos T CD8 + presentes en las células mononucleares de la sangre periférica de dicho sujeto con uno o más péptido(s) que constituye(n) un epítopo(s) T de dicho antígeno que puede(n) ser presentado(s) por una molécula del CMH de dicho sujeto y detección de los linfocitos T efectores activados mediante esta puesta en contacto, procedimiento que se caracteriza porque dicho(s) péptido(s) está(n) fijado(s) en un soporte sólido.
Description
Ensayo de inmunidad celular con péptidos fijados
en un soporte sólido.
La invención se refiere a nuevos medios de
detección de la inmunidad celular.
La inmunidad por mediación celular juega un
papel principal en la respuesta inmunitaria frente a microorganismos
tales como virus, así como algunas bacterias o algunos protozoos
que son capaces de desarrollarse en el interior de las células del
hospedador, escapando de este modo a los anticuerpos. Esta inmunidad
interviene también en los fenómenos de rechazo de injerto y de
destrucción de tumores.
Mientras que en el caso de la inmunidad humoral
los efectores moleculares son los anticuerpos secretados por los
linfocitos B, los efectores moleculares de la inmunidad celular son
los receptores TcR anclados en la membrana citoplasmática de los
linfocitos T.
El reconocimiento de un epítopo T por TcR
implica un mecanismo mucho más complejo que el que interviene en el
reconocimiento de un epítopo B por un anticuerpo. En efecto, el TcR
solamente reconocerá al péptido que constituye su epítopo si éste
está asociado con una molécula de clase I o de clase II del CMH
(Complejo Mayor de Histocompatibilidad) en la superficie de una
célula presentadora. Los TcR de los linfocitos T CD4 y CD8
reconocen de este modo a los epítopos presentados respectivamente
por las moléculas de clase II y por las moléculas de clase I del
CMH.
Se define como "epítopo T" de un antígeno,
cualquier fragmento peptídico de dicho antígeno que puede ser
reconocido en el contexto de CMH apropiado, por el receptor TcR de
un linfocito T e inducir la activación de dicho linfocito.
El tamaño de un epítopo T varía según la clase
de la molécula de CMH que presenta el péptido; los epítopos T
CD8^{+} presentados por las moléculas del CMH de clase I tiene un
tamaño de 8 a 10 aminoácidos, mientras que los epítopos T CD4^{+}
presentados por las moléculas del CMH de clase II tiene un tamaño de
13 a 25 aminoácidos.
Para un mismo antígeno y para una misma clase de
CMH, la secuencia de los epítopos varía según el alelo de CMH en
cuestión.
Para muchos antígenos, se ha identificado gran
variedad de epítopos T restringidos a diferentes alelos del CMH de
clase II o del CMH de clase I y las secuencias de estos epítopos
están disponibles en la bibliografía.
La interacción TcR-epítopo T
asociado a CMH induce, en presencia de diversas señales de
co-estimulación que resultan de la interacción de
moléculas en superficie de las células T y de moléculas en la
superficie de las células presentadoras, una estimulación de los
linfocitos que se traduce en una multiplicación celular que
desemboca en linfocitos T efectores.
Los linfocitos efectores pueden agruparse en
diferentes poblaciones según sus funciones efectoras, que definen
diversos tipos de respuesta inmunitaria. Estas poblaciones pueden
distinguirse particularmente por su capacidad para secretar
diferentes moléculas (citoquinas, factores líticos) o combinaciones
de moléculas particulares. Por ejemplo, entre los linfocitos
efectores que pueden diferenciarse a partir de las células CD4^{+}
o CD8^{+}, se mencionarán los linfocitos Th1 o T1, que se
caracterizan por la secreción de citoquinas particularmente
interleuquina 2 (IL-2) e interferón gamma
(IFN-\gamma) y las células Th2 o T2 que secretan
citoquinas tales como IL-4, IL-5,
IL-6 e IL-10.
Al contrario que la inmunidad humoral que
solamente es detectable de forma significativa aproximadamente 1
mes después de un primer contacto con un inmunógeno, la inmunidad
por mediación celular aparece varios días después de un primer
contacto; esta inmunidad persiste a continuación durante un periodo
largo, en forma de linfocitos T de memoria, que pueden proliferar y
adquirir rápidamente funciones efectoras durante una posterior
presentación del mismo inmunógeno.
La inmunidad celular puede constituir, por lo
tanto, un buen indicador, que permite la detección muy precoz de
una respuesta inmunitaria frente a un antígeno determinado y la
determinación de la respuesta inmunitaria desenca-
denada.
denada.
La detección de linfocitos T efectores
específicos de antígeno se utiliza en diferentes laboratorios de
investigación, por ejemplo en el marco del desarrollo de vacunas,
para buscar epítopos inmunizadores y evaluar la intensidad y el
tipo de respuesta inmunógena.
Un enfoque cada vez más habitualmente utilizado
para evaluar la inmunidad celular frente a un antígeno consiste en
suministrar péptidos que constituyen epítopos T conocidos de dicho
antígeno y en analizar la reactividad de los linfocitos T frente a
estos péptidos.
Este enfoque puede utilizarse teóricamente para
el diagnóstico o el seguimiento de patologías que conllevan una
respuesta por mediación celular. Sin embargo, al contrario que la
inmunidad humoral, que puede detectarse fácilmente in vitro
demostrando la formación de un complejo
antígeno-anticuerpo, la detección de la inmunidad
celular implica el empleo de técnicas pesadas difícilmente
utilizables en el ámbito de análisis rutinarios.
En efecto, es necesario:
- 1)
- presentar a los linfocitos epítopos a ensayar, en condiciones que permitan su reconocimiento por el TcR y la activación de los linfocitos;
- 2)
- detectar los linfocitos efectores activados.
Algunos métodos desarrollados recientemente
permiten simplificar la detección de las células efectoras. Como
ejemplo, la técnica ELISPOT, descrita inicialmente por VERSTEEGEN
et al., (J. Immunol. Methods, 111, 25-29,
1988) permite detectar y caracterizar linfocitos T efectores
específicos de epítopos, presentes entre las células de la sangre
periférica, mediante detección de los factores secretados por dichos
linfocitos después de la re-estimulación mediante
péptidos que representan epítopos T.
Por ejemplo, esta técnica se utilizó para
identificar linfocitos efectores T CD8^{+} específicos de epítopos
del virus de la gripe (LALVANI et al., J. Exp. Med. 186,
859-865, 1997); para analizar la respuesta T
CD8^{+} frente a péptidos que representan diversos epítopos de
VIH1 utilizados en vacunas (GAHERY-SEGARD et
al., J. Virol., 74, 1694-12703, 2000); para
detectar la presencia de una infección por Mycobacterium
tuberculosis mediante detección de linfocitos efectores T
específicos de epítopos del antígeno ESAT-6 (LALVANI
et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 163,
824-828, 2001).
Los ensayos descritos en las publicaciones
mencionadas anteriormente se realizaron añadiendo una solución de
cada uno de los péptidos a ensayar a una suspensión obtenida
mediante separación en gradiente de FICOL de células mononucleares
de la sangre periférica (PBMC); se sabe en efecto que, en estas
condiciones, estos péptidos pueden cargarse directamente en las
moléculas del CMH y presentarse a los linfocitos.
El documento WO9823960 describe un procedimiento
para la determinación de la activación de los linfocitos T
específicos para un antígeno, que comprende la puesta en contacto de
una muestra de sangre periférica que comprende linfocitos T con
péptidos no inmovilizados que constituyen epítopos T de dicho
antígeno y la detección del interferón \gamma producido.
Ahora bien, los inventores constataron ahora
que, de forma sorprendente, la puesta en contacto de los linfocitos
T de un sujeto con péptidos que constituyen epítopos reconocidos por
dichos linfocitos T, fijados en un soporte sólido, conllevaba la
activación de linfocitos T efectores específicos de dichos
epítopos.
La presente invención se basa en la utilización
de un soporte sólido al que está fijado al menos un péptido que
constituye un epítopo T de un antígeno para la detección y/o la
caracterización in vitro de la inmunidad celular frente a
dicho antígeno.
La presente invención se refiere en particular a
un procedimiento de detección y/o de caracterización in
vitro de la respuesta inmune celular de un sujeto frente a un
antígeno, mediante puesta en contacto de una muestra biológica que
comprende linfocitos T CD4^{+} y/o linfocitos T CD8^{+}
presentes en las células mononucleares de la sangre periférica
(PBMC) de dicho sujeto con uno o más péptido(s) que
constituye(n) un epítopo(s) T de dicho antígeno
que
puede(n) ser presentado(s) por una molécula del CMH de dicho sujeto y detección de los linfocitos T efectores activados mediante esta puesta en contacto, procedimiento que se caracteriza porque dicho(s) péptido(s) está(n) fijado(s) en un soporte sólido.
puede(n) ser presentado(s) por una molécula del CMH de dicho sujeto y detección de los linfocitos T efectores activados mediante esta puesta en contacto, procedimiento que se caracteriza porque dicho(s) péptido(s) está(n) fijado(s) en un soporte sólido.
La muestra biológica puede estar constituida por
una preparación de linfocitos T CD4^{+} o CD8^{+} purificados.
La muestra también puede estar constituida por una preparación de
PBMC obtenida a partir de una extracción de sangre de dicho sujeto;
ventajosamente, también puede utilizarse sangre total.
De acuerdo con una realización preferida del
procedimiento de acuerdo con la invención, al menos 2 péptidos que
constituyen 2 epítopos T diferentes de dicho antígeno y de los
cuales al menos uno puede ser presentado por una molécula del CMH
de dicho sujeto, están fijados al soporte sólido.
De acuerdo con una disposición ventajosa de esta
realización, una mezcla de dichos péptidos está fijada a dicho
soporte sólido.
De acuerdo con otra disposición ventajosa de
esta realización, dicho soporte sólido está constituido por una
placa de microtitulación, estando dichos péptidos fijados en al
menos 2 pocillos diferentes de dicha placa y la muestra biológica
se divide en al menos 2 alícuotas de las que cada una se pone en
contacto con uno de dichos péptidos.
La utilización de una mezcla de péptidos permite
detectar rápidamente la existencia de una respuesta inmune por
mediación celular frente al antígeno en cuestión. La utilización por
separado de diferentes péptidos permite analizar mejor los
componentes de esta respuesta.
En todos los casos, el(los)
péptido(s) utilizado(s) puede(n) constituir un
epítopo(s) T CD4^{+} o un epítopo(s) T CD8^{+}.
También puede(n) utilizarse simultáneamente un
epítopo(s) T CD4^{+} y un epítopo(s) T CD8^{+},
por separado o en mezcla.
Las demás modalidades de realización del
procedimiento de acuerdo con la invención pueden ser idénticas a
las utilizadas en los métodos de detección in vitro de la
respuesta inmune celular conocidos en la técnica anterior.
Por ejemplo, la puesta en contacto entre los
péptidos fijados al soporte sólido y la muestra biológica a ensayar
se realiza en las mismas condiciones que en los métodos de la
técnica anterior donde los péptidos están presentes en la fase
líquida. Generalmente, esta puesta en contacto se realizará mediante
incubación durante de 5 a 20 horas a 37ºC, en presencia del 5% de
CO_{2}.
Del mismo modo, la detección de los linfocitos T
efectores activados puede realizarse mediante métodos
convencionales.
Ventajosamente, se realizará la dosificación de
los factores solubles (citoquinas o factores líticos) secretados
por estos linfocitos. Por ejemplo, la dosificación de
IL-2 o de INF-\gamma permite
caracterizar una respuesta Th1 o T1, mientras que la dosificación
de IL-4, IL-5, IL-6
o IL-10, permite caracterizar una respuesta Th2 o
T2. Otros factores solubles que caracterizan esencialmente a los
linfocitos T CD8^{+} como quimioquinas (RANTES) o las moléculas
con función de lisis (como perforina/granzima) también pueden
dosificarse.
Otros métodos de detección de los linfocitos T
activados opcionalmente utilizables en el marco de la presente
invención son por ejemplo el marcado intracelular de las
citoquinas.
Con respecto a los métodos de evaluación de
inmunidad celular conocidos en la técnica anterior, en los cuales
los péptidos a ensayar se añaden en la suspensión de células, el
procedimiento de acuerdo con la invención permite simplificar
considerablemente el procedimiento de ensayo, particularmente en el
caso de análisis que implican la utilización en paralelo de
diferentes péptidos, que se realizan convencionalmente en los
pocillos de una placa de microtitulación o en una serie de
tubos.
En efecto, mientras que las técnicas de la
técnica anterior necesitan añadir a las células a ensayar un péptido
o una mezcla de péptidos definida, en cada uno de los pocillos de
la placa o en cada tubo de la serie, es posible, en el marco de la
realización de la presente invención, utilizar placas o tubos
preparados de antemano, estando cada uno de los pocillos de dichas
placas o cada uno de dichos tubos recubiertos del péptido o de la
mezcla de péptidos deseada. Esto permite reducir considerablemente
las manipulaciones necesarias, por lo tanto disminuir el tiempo
necesario para la realización del ensayo y aumentar su
reproductibilidad limitando las causas de error.
Además, la fijación de los péptidos en un
soporte sólido permite estabilizarlos y protegerlos de la
degradación que se produce rápidamente en medio líquido. Como
ilustración, en el caso de péptidos fijados mediante adsorción en
los pocillos de una placa de microtitulación de poliestireno, los
péptidos conservan sus propiedades de activación específica de los
linfocitos T durante al menos 24 horas a 20ºC, al menos una semana a
4ºC y al menos 15 días en un congelador a -80ºC, mientras que
soluciones de los mismos péptidos pierden sus propiedades en varias
horas a
37ºC.
37ºC.
Además, la presente invención presenta la
ventaja de reducir considerablemente las concentraciones de péptidos
utilizados, permitiendo de este modo una reducción muy importante
del coste.
La presente invención también se refiere a un
kit para la realización de un procedimiento de acuerdo con la
invención, que comprende un surtido de péptidos procedentes de un
mismo antígeno, de los que cada uno constituye un epítopo T de
dicho antígeno, fijados en un soporte sólido.
Para la realización de los kits de acuerdo con
la invención, pueden utilizarse soportes sólidos y métodos de
fijación de los péptidos a dichos soportes, del mismo tipo que los
que se utilizan habitualmente para los kits de dosificación de
antígeno-anticuerpo.
Por ejemplo, pueden utilizarse soportes de
materiales plásticos tales como poliestireno, polietileno o cloruro
de polivinilo, soportes de nitrocelulosa, soporte de materiales a
base de sílice, tales como vidrio, etc.
La fijación de los péptidos puede realizarse
mediante técnicas también conocidas por sí mismas; la elección de
las técnicas más apropiadas depende del soporte en cuestión y de las
propiedades fisicoquímicas de los péptidos seleccionados.
Por ejemplo, pueden sintetizarse directamente
los péptidos en el soporte o fijar a éste péptidos
presintetizados.
Por ejemplo, la fijación de los péptidos puede
realizarse mediante adsorción. El soporte y las condiciones de
fijación se seleccionarán por supuesto para evitar la desorción de
los péptidos durante la adición de la muestra biológica a ensayar y
la incubación con ésta.
Ventajosamente, los péptidos se fijarán al
soporte mediante enlace covalente, directamente o por medio de un
brazo espaciador. En este caso la superficie del soporte puede
activarse por medio de agentes tales como derivados de
carbodiimida, derivados de N-hidroxisuccinimida,
derivados de sulfosuccinimida, etc.
También pueden utilizarse péptidos biotinilados,
fijados a un soporte recubierto de avidina.
El soporte puede tener forma de tubo o de
conjunto de tubos, de placa de microtitulación, de una o más bandas,
de perlas, etc.
El antígeno puede ser en particular un
microorganismo infeccioso (virus, protozoo, bacteria), un antígeno
tumoral, un antígeno autoinmune o un alérgeno. Si se trata de un
microorganismo, los péptidos que constituyen el surtido pueden
obtenerse de diferentes proteínas antigénicas de este organismo.
La elección de los péptidos que constituyen el
surtido depende por supuesto del antígeno en cuestión y de la
utilización precisa a la que está destinada el kit. Serán péptidos
identificados anteriormente como constituyentes de epítopos T
CD4^{+} o CD8^{+} del antígeno en cuestión.
Ventajosamente, este surtido comprenderá
péptidos que pueden ser presentados por diferentes alelos del CMH.
Puede estar constituidos por péptidos que constituyen epítopos T
CD4^{+}, por péptidos que constituyen epítopos T CD8^{+} o por
una mezcla de estos dos tipos de epítopos.
Los péptidos que constituyen el surtido pueden
mezclarse y fijarse en forma de mezcla al soporte sólido. Cuando el
soporte sólido es una placa de microtitulación o un conjunto de
tubos, también pueden fijarse por separado diferentes péptidos o
combinaciones de péptidos, estando cada péptido o combinación de
péptidos fijada en el interior de uno de los pocillos de la placa
de microtitulación o de uno de los tubos.
Un kit de acuerdo con la invención también puede
comprender medios de detección de los linfocitos T activados. Estos
medios pueden estar constituidos por reactivos de dosificación de
factores solubles producidos por dichos linfocitos.
La presente invención puede emplearse por
ejemplo en salud humana o animal:
- -
- en el marco de la detección sistemática y del seguimiento de la evolución de infecciones por diferentes agentes patógenos que conllevan una respuesta inmunitaria celular. Como ejemplos se mencionarán: virus tales como los VIH (virus de inmunodeficiencia humana) 1 y 2, el VIF (virus de inmunodeficiencia felina), el VLTH-1 (virus de linfocitos T humanos de tipo 1), los virus de los diferentes tipos de hepatitis, etc.; parásitos tales como Toxoplasma o Plasmodium; priones, etc.;
- -
- en el marco de la detección sistemática y del seguimiento de la evolución de patologías de origen tumoral. Como ejemplo se mencionarán: melanoma, cáncer de mama, leucemias mieloides, cánceres asociados a una infección vírica, como cáncer de cuello del útero asociado al virus del papiloma humano, etc.;
- -
- en el marco de la detección sistemática y del seguimiento de la evolución de enfermedades autoinmunes. Como ejemplo se mencionará diabetes de tipo I, esclerosis en placas, etc.;
- -
- en el marco de la detección sistemática y del seguimiento de la evolución de enfermedades de tipo alérgico. Como ejemplo se mencionarán alérgenos como gramíneas, pólenes, algunos medicamentos.
\vskip1.000000\baselineskip
Sea cual sea su utilización en cuestión, la
presente invención permite, mediante la detección de la inmunidad
por mediación celular, un diagnóstico muy precoz de la aparición o
de la evolución de una patología, antes de la aparición de los
signos clínicos y antes de la aparición de la respuesta humoral.
Esto hace posible una decisión médica más rápida, una mejor
estrategia terapéutica y mayores posibilidades de éxito del
tratamiento para los pacientes.
La presente invención se entenderá mejor con
ayuda de la siguiente descripción, que se refiere a ejemplos no
limitantes que ilustran su aplicación para la caracterización de una
inmunidad celular específica frente a diferentes antígenos
virales.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Se sintetizaron diferentes péptidos que
constituyen epítopos CD8^{+} conocidos de tres virus diferentes:
el virus
VIH-1 (virus de inmunodeficiencia humana), CMV (citomegalovirus) y virus VEB (virus Epstein-Barr).
VIH-1 (virus de inmunodeficiencia humana), CMV (citomegalovirus) y virus VEB (virus Epstein-Barr).
\newpage
Estos péptidos son los siguientes:
Virus VIH-1:
- gag 77-85 (SLYNTVATL, HLA A2)
- GAG 260-268 (EIYKRWIIL, HLA A2)
- Nef 82-91 (KAALDLSHFL, HLA A2)
\vskip1.000000\baselineskip
Virus CMV:
- GB 619-628 (FIAGNSAYEYV, HLA A2)
- IEI 378-389 (SDEEEAIVAYTL, HLA B18)
\vskip1.000000\baselineskip
Virus VEB:
- EBNA 3A 379-387 (RPPIFIRRL, HLA B7)
- EBNA 3C 163-171 (EGGVGWRHV, HLA B44).
\vskip1.000000\baselineskip
Estos péptidos se fijaron al fondo de los
pocillos de una placa de poliestireno, mediante el siguiente
protocolo.
10 \mug de péptido en tampón carbonato se
depositaron en una placa de microtitulación de 96 pocillos (placa
de poliestireno, NUNC MAXISORB). La fijación de los péptidos se
realizó mediante adsorción durante 2 horas a temperatura ambiente.
Los péptidos no fijados se eliminan mediante dos lavados en PBS.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
PBMC purificadas a partir de sangre de un
paciente (HLA-A2) seropositivo para
VIH-1 se ensayaron de la siguiente manera.
200 \mul (10^{5} células) de suspensión
celular en un medio de cultivo convencional (RPMI, 10% de SAB) se
depositan en cada uno de los pocillos en los que se fijaron los
péptidos de VIH-1 como se ha descrito anteriormente
en el
Ejemplo 1.
Ejemplo 1.
Como control positivo, se realizó un ensayo
mediante el método ELISPOT convencional: 200 \mul (10^{5}
células) de suspensión de PBMC del mismo paciente se depositan en
los pocillos de una placa de 96 pocillos, NUNC (idéntica a aquella
en la que se fijaron los péptidos) y se mezclan con 10 \mug de
péptido gag 77-85, GAG 260-268 o
Nef 82-91 en solución en medio de cultivo
convencional.
En los 2 ensayos, también se depositaron PBMC en
pocillos sin péptidos, como control.
Las placas se incuban durante una noche a 37ºC
en una incubadora en presencia del 5% de CO_{2}.
\vskip1.000000\baselineskip
Al día siguiente, la presencia de células CD8+
activadas se revela de acuerdo con el siguiente protocolo:
Una placa de 96 pocillos de nitrocelulosa
(MILLIPORE) se recubrió con 100 \mul/pocillo de anticuerpo
anti-IFN\gamma (MABTECH, 1-D1K),
diluido a 1 \mug/ml en tampón carbonato durante 2 horas a
37ºC.
A continuación, la placa se lavó en PBS y se
saturó con RPMI, SVF al 10% a razón de 100 \mul/pocillo durante 2
horas a 37ºC.
200 \mul de suspensión celular activada como
se ha descrito en 1) anteriormente, se depositan en esta placa. La
incubación se realiza durante 5 horas a 37ºC, con el 5% de
CO_{2}.
\global\parskip0.980000\baselineskip
Después de 1 lavado en PBS 1X y 5 lavados en PBS
TWEEN al 0,05%, se añaden 100 \mul/pocillo de anticuerpos
anti-IFN-\gamma Biotina (MABTECH,
7-B6-1-Biotin) a 1
\mug/ml y se incuba durante 2 horas a temperatura ambiente.
Las placas se lavan 5 veces en
PBS-TWEEN al 0,05%.
Se añadieron 100 \mul/pocillo de
Extravidin-AKP (SIGMA, Nº 2636) diluido a 1/5000 en
PBS TWEEN 0,05%, BSA al 1%. La incubación se realiza durante 1 hora
a temperatura ambiente. Las placas se lavan de nuevo 5 veces en PBS
TWEEN 0,05%.
El revelado se realiza con ayuda del kit BIORAD
(Nº 170-6432).
Después de entre 1/2 hora y 1 hora, la reacción
se interrumpe lavando las placas con agua. Las placas se secan al
aire.
Los resultados se ilustran mediante la Figura
1.
- A:
- Ensayo ELISPOT convencional;
- B:
- Ensayo realizado con los péptidos fijados en soporte sólido.
En los 2 casos, solamente el péptido gag
77-85 induce una activación de linfocitos T
CD8^{+} efectores que secretan IFN-\gamma.
Estos resultados muestran que la utilización de péptidos fijados en
un soporte sólido es al menos tan eficaz para inducir la activación
de células efectoras como la de péptidos presentados en fase
líquida.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
PBMC purificadas a partir de la sangre de un
paciente (HLA-A2, B18) se ensayaron de la siguiente
manera.
2 x 10^{5} células en suspensión en medio
convencional se depositan en cada uno de los pocillos en los que se
fijaron los péptidos de CMV, como se ha descrito anteriormente en el
Ejemplo 1.
Como control positivo, se realizó un ensayo
mediante el método ELISPOT convencional: 2 x 10^{5} células de
suspensión de PBMC del mismo paciente se depositan en los pocillos
de una placa de 96 pocillos, (NUNC) (idéntica a aquella en la que
se fijaron los péptidos) y se mezclan con 10 \mug de péptido GB
619-628 o IEI 378-389.
En los 2 ensayos, también se depositaron PBMC en
pocillos sin péptidos, como control.
La incubación y el revelado de las placas se
realizan como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 2.
Los resultados se ilustran mediante la Figura
2.
- A:
- Ensayo ELISPOT convencional;
- B:
- Ensayo realizado con los péptidos fijados en soporte sólido.
En los 2 casos, solamente el péptido GB
619-628 induce una activación de linfocitos T
CD8^{+} efectores que secretan IFN-\gamma.
Estos resultados confirman los observados en el caso de los péptidos
de VIH-1.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
4
Se conservaron placas en cuyos pocillos se
fijaron péptidos de VEB, como se ha descrito anteriormente en el
Ejemplo 1:
- A)
- a 20ºC durante 24 h;
- B)
- a 4ºC durante 7 días;
- C)
- a -80ºC durante 15 días.
2 x 10^{5} PBMC purificadas a partir de sangre
de un paciente (HLA B7/B44) en suspensión en medio de cultivo
convencional se depositan en cada uno de los pocillos de estas
placas y se ensayan como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo
3.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Los resultados se ilustran mediante la Figura
3.
- A:
- conservación a 20ºC durante 24 h;
- B:
- conservación a 4ºC durante 7 días;
- C:
- conservación a -80ºC durante 15 días.
Estos resultados muestran que las condiciones de
conservación no modifican las propiedades de activación de células
efectoras de los péptidos fijados en soporte sólido.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
5
\vskip1.000000\baselineskip
Una mezcla de los siguientes péptidos:
EBNA 3C 163-171 (EGGVGWRHV,
B44),
EBNA 3A 603-611 (RLRAEAGVK,
A3),
EBNA 4 416-424 (IVTDFSVIK,
A11),
EBNA 3C 881-891 (QPRAPIRPIPT,
B7),
EBNA 3A 379-387 (RPPIFIRRL, B7),
y
EBNA 6 290-299 (EENLLDFVRF,
844),
que constituyen epítopos T
CD8^{+} conocidos de VEB, se fijó en la pared interna de un tubo
de poliestireno, de acuerdo con el siguiente
protocolo:
- \quad
- 10 \mug de cada péptido diluido en tampón carbonato se depositaron en un tubo de poliestireno (tubo de 15 ml, CORNING). La fijación de los péptidos se realiza mediante adsorción durante 2 horas a temperatura ambiente. Los péptidos no fijados se eliminan mediante dos lavados en PBS.
- \quad
- 2 ml de sangre total de un paciente (HLA: A3-A11, B7/B44) se incubaron durante 5 horas en el tubo obtenido de este modo.
\vskip1.000000\baselineskip
Después de esta incubación, la sangre total se
centrifugó durante 10 min. a 1500 V/min. y el sobrenadante (plasma)
de la sangre se retiró. El plasma (100, 50 y 12,5 microlitros) se
depositó por duplicado en una placa de 96 pocillos
pre-incubada con un anticuerpo
anti-IFN-gamma, durante 2 h a una
temperatura de 20ºC. Después del lavado, se añadió un 2º anticuerpo
anti-IFN-gamma biotinilado durante 1
h a una temperatura de 20ºC. Después se añadió
extravidina-PA durante 1 h a una temperatura de 20ºC
y 100 microlitros de sustrato MUP (sustrato de la fosfatasa
alcalina) permitieron el revelado de la reacción. La lectura se
realizó después de 30 min.
Los resultados se ilustran mediante la figura
4.
Leyenda de la figura 4:
Estos resultados muestran que es posible
detectar la presencia de una respuesta celular específica de un
virus (en este caso detección del virus VEB) a partir de la sangre
total de un paciente. Esta respuesta celular es específica del
virus y la producción de IFN-gamma se detectó con
diferentes diluciones de plasma. El diferencial es significativo
entre la producción de INF-gamma obtenida a partir
de la sangre total en solitario (control negativo) o de la sangre
total incubada con los péptidos del virus VEB. Las células presentes
en la sangre del paciente 1056 se activaron y produjeron de forma
específica INF-gamma en presencia de los péptidos
CD8^{+} derivados del virus VEB.
Claims (8)
1. Procedimiento de detección y/o de
caracterización in vitro de la respuesta inmune celular de un
sujeto frente a un antígeno, mediante puesta en contacto de una
muestra biológica que comprende linfocitos T CD4^{+} y/o
linfocitos T CD8^{+} presentes en las células mononucleares de la
sangre periférica de dicho sujeto con uno o más péptido(s)
que constituye(n) un epítopo(s) T de dicho antígeno
que puede(n) ser presentado(s) por una molécula del
CMH de dicho sujeto y detección de los linfocitos T efectores
activados mediante esta puesta en contacto, procedimiento que se
caracteriza porque dicho(s) péptido(s) está(n)
fijado(s) en un soporte sólido.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, caracterizado porque al menos 2 péptidos
que constituyen 2 epítopos T diferentes de dicho antígeno y de los
que al menos uno puede ser presentado por una molécula del CMH de
dicho sujeto, están fijados a dicho soporte sólido.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizado porque una mezcla de dichos
péptidos está fijada a dicho soporte sólido.
4. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 2, caracterizado porque dicho soporte sólido
está constituido por una placa de microtitulación, estando dichos
péptidos fijados en al menos 2 pocillos diferentes de dicha placa y
la muestra biológica se divide en al menos 2 alícuotas de las que
cada una se pone en contacto con uno de dichos péptidos.
5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque
el(los) pépti-
do(s) utilizado(s) constituye(n) un epítopo(s) T CD4^{+}.
do(s) utilizado(s) constituye(n) un epítopo(s) T CD4^{+}.
6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque
el(los) pépti-
do(s) utilizado(s) constituye(n) un epítopo(s) T CD8^{+}.
do(s) utilizado(s) constituye(n) un epítopo(s) T CD8^{+}.
7. Kit para la realización de un procedimiento
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que
comprende:
- -
- un surtido de péptidos procedentes de un mismo antígeno, de los que cada uno constituye un epítopo T identificado de dicho antígeno, fijados en un soporte sólido, y
- -
- medios de detección de los linfocitos T efectores activados.
8. Kit para la realización de un procedimiento
de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que
comprende un surtido de péptidos procedentes de un mismo antígeno,
de los que cada uno constituye un epítopo T identificado de dicho
antígeno, fijados en un soporte sólido, comprendiendo dicho surtido
al menos un péptido que constituye un epítopo T CD4^{+} y al
menos un péptido que constituye un epítopo T CD8^{+}.
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