WO2003014163A1 - Anticorps anti-idiotypiques de molecules hla de classe i et leur utilisation pour la preparation de compositions destinees a inhiber l'activation vasculaire - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet un anticorps anti-idiotypique d'une molécule HLA de classe 1, un fragment ou un dérivé de celui-ci, ainsi qu'un gène codant cet anticorps. L'invention concerne aussi une composition pharmaceutique utile pour prévenir ou inhiber l'angiogénèse comprenant au moins un tel anticorps anti-idiotypique.

Description

ANTICORPS ANTI-IDIOTYPIQUES DE MOLECULES HLA DE CLASSE I ET LEUR UTILISATION POUR LA PREPARATION DE COMPOSITIONS DESTINEES A INHIBER L'ACTIVATION VASCULAIRE .

La présente invention se rapporte au domaine de l'inhibition de 1 ' angiogénèse impliquée dans des nombreux syndromes prolifératifs pathologiques. L'invention concerne des anticorps anti-idiotypiques de molécules du Complexe Major d'Histocompatibilité (CMH) et tout particulièrement à des anticorps anti-idiotypiques de molécules solubles HLA de classe 1, comme HLA-Gs ou HLA-B7s. L'invention concerne la préparation de ces anticorps et leur utilisation dans des compositions pharmaceutiques utiles pour inhiber 1 ' angiogénèse , et donc destinées au traitement des pathologies angiogéniques impliquant des cellules endothéliales et en particulier pour enrayer leur prolifération tumorale. L'invention vise également l'utilisation de ces anticorps anti-idiotypiques pour vectoriser des substances d' intérêt thérapeutique ou de diagnostic au niveau des cellules endothéliales impliquées dans un processus d' angiogénèse pathologique ou non pathologique.

Les cellules endothéliales tapissent l'intérieur de tous les vaisseaux sanguins de l'organisme. Ces cellules ont un phénotype quiescent, elles ne prolifèrent quasiment pas, seulement 0,01% des cellules endothéliales sont engagées dans la division cellulaire à un moment donné. Le rôle physiologique des cellules endothéliales est très vaste, elles participent à de nombreux phénomènes vitaux pour l'organisme : coagulation sanguine, maintien de la pression artérielle, recrutement de cellules circulantes, synthèse de cytokines, construction de nouveaux vaisseaux irriguant les territoires voisins lors d'une hypoxie. Toutes ces fonctions nécessitent ou s'accompagnent d'un changement de phenotype des cellules endothéliales qui deviennent alors «activées», c'est à dire que la paroi vasculaire devient capable de fixer des cellules du sang circulant ou de répondre aux actions chimiotactiques des facteurs de croissance. L'activation endothéliale est donc un état transitoire commun aux cellules endothéliales, préalable à toute réponse fonctionnelle.

Chez l'adulte, les parois de ces vaisseaux ne présentent pas de molécules d'adhésion pour immobiliser les lymphocytes du sang circulant. Lors d'une inflammation, les cellules endothéliales expriment à leur surface des molécules d'adhésion les lymphocytes activés -en particulier les cellules NK (natural killer) - c'est à dire qu'elles déroulent des antennes pour immobiliser les lymphocytes tueurs. Lors des greffes par exemple le maintien au froid du greffon suffit à activer les cellules endothéliales du greffon qui alors deviennent capables d'immobiliser les lymphocytes. Ces lymphocytes pourront traverser la couche des cellules endothéliales ou les détruire puis coloniser le greffon et induire la synthèse de cytokines, ce qui amplifie la réaction immunitaire et aboutit à la destruction du greffon.

Lorsqu'un territoire requiert un apport accru en oxygène et en nutriments, il réagit en relarguant des facteurs solubles qui convertissent le phenotype des cellules endothéliales en un phenotype activé, et des facteurs mitogènes pour les cellules endothéliales de phenotype activé. Ces cellules endothéliales acquièrent enfin un phenotype angiogenique et deviennent capables d'effectuer le programme d ' angiogénèse, c'est-à-dire le développement de nouveaux vaisseaux sanguins à partir du réseau préexistant. Ce phénomène est normal et contrôlé lors d'une blessure ou dans la maturation du corps jaune de l'ovaire; en revanche, il devient dangereux dans des situations pathologiques où 1 ' angiogénèse n'est plus contrôlée, par exemple dans la rétinopathie diabétique, la polyarthrite et le développement tumoral. L'entrée d'une cellule dans un programme d' angiogénèse nécessite son activation préalable (Ortéga, 1997 ; Ortéga, 1999) .

Il a été montré que les cellules endothéliales expriment des molécules HLA de classe I à leur surface dont le rôle n'est pas clairement établi (Majema, 1997 ; Rebman 1997 ; Blaschitz 1997) . Il a été proposé que la surexpression de ces molécules HLA de classe I par les cellules endothéliales pourrait inhiber la migration transendothéliale des lymphocytes NK et contribuer à atténuer le rejet de greffe. Par ailleurs la dimérisation de molécules HLA-I par l'intermédiaire d'un anticorps reconnaissant toutes les molécules HLA-I stimule l'expression de récepteurs du FGF2 à la surface des cellules endothéliales et leur prolifération (Harris, 1997) . Les molécules HLA de classe I ont été décrites comme pouvant s'associer structurellement à certains récepteurs membranaires , y compris des récepteurs à l'insuline et récepteurs à EGF. Il a aussi été démontré que des peptides dérivés de molécules HLA de classe I pouvaient réguler la fonction des récepteurs à l'insuline. Cependant, à ce jour aucune description d'un quelconque rôle non immunologique de la forme soluble de HLA Gl n'a été rapporté et il n'existe non plus de données expérimentales démontrant la présence de récepteurs au HLA-I sur les cellules endothéliales. Aucun effet biologique des HLA-I sur ces cellules ou dans 1 ' angiogénèse n'a été décrit.

Les Inventeurs ont développé une expertise dans le domaine de l' activation endothéliale, et ont cherché à vérifier si la dimérisation de molécules HLA-I par l'anticorps W6/32 (Barnstable CJ, 1978 ; Brodsky FM, 1982) stimulait l'expression des récepteurs du VEGF. Sachant que certaines molécules HLA-I possèdent un polymorphisme important et qu'elles se lient à des récepteurs distincts encore mal connus, un mime polyvalent des HLA-I a été préparé grâce à la stratégie de fabrication d'anticorps anti - idiotypiques .

En conséquence, l'invention a pour objet un anticorps anti-idiotypique d'une molécule HLA de classe 1. L'invention envisage tant des anticorps anti- idiotypiques polyclonaux ou monoclonaux qui peuvent être préparés par des techniques décrites dans la littérature

(Kohler G, 1976) à partir de molécule HLA de classe 1 comme rapportées dans la partie expérimentale ci-après. Il peut aussi s'agir de fragments de tels anticorps anti- idiotypique comme des fragments Fab'2 ou Fab ou d'une combinaison de tels fragments.

Il s'agit de préférence d'anticorps anti- idiotypique de toute molécule HLA de classe I soluble ou non. Avantageusement, la molécule HLA de classe 1 est choisie parmi : HLA-A, B, C, D, F, ou G.

Ainsi, l'invention concerne des anticorps anti- idiotypiques de molécules dérivés des molécules HLA de classe 1, solubles ou non, présentant des propriétés anti- angiogéniques que l'homme du métier est à même de tester. Il peut s'agir de fragments, de forme tronquée, de séquences modifiées par délétion, addition ou suppression d'un ou plusieurs acides aminés.

L'invention concerne aussi une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence polynucléotidique codant pour un anticorps anti-idiotypique de toute molécule HLA de classe I, soluble ou non, un fragment ou dérivé de celui-ci. Une telle molécule d'acide nucléique est utile pour la préparation des anticorps anti-idiotypiques selon l'invention par des techniques de génie génétique.

L'invention envisage à titre de molécule d'acide nucléique comprenant une séquence polynucléotidique codant un anticorps anti-idiotypique d'une molécules soluble HLA de classe 1, une molécule d'acide nucléique comprenant ladite séquence placée sous le contrôle de séquences de régulation de son expression. Une telle molécule d'acide nucléique est un vecteur, comme par exemple un plasmide, un virus recombinant, une cellule transfectée par un vecteur d'expression plasmidique ou viral.

Les anticorps anti-idiotypiques selon l'invention sont remarquables en ce qu' ils sont capables de se fixer sur les cellules endothéliales et d'inhiber l' activation endothéliale menant à 1 ' angiogénèse .

L'invention a donc aussi pour objet une composition pharmaceutique utile pour prévenir ou inhiber 1 ' angiogénèse comprenant au moins un anticorps anti-idiotypique ou une molécule d'acide nucléique codant un tel anticorps comme défini précédemment.

Une telle molécule d'acide nucléique est utile dans des protocoles de thérapie génique ou de thérapie cellulaire consistant à administrer la dite molécule d'acide nucléique ou des cellules transformées par la dite molécule d'acide nucléique a un individu de façon à exprimer l'anticorps anti-idiotypique et ainsi inhiber

1 ' angiogénèse .

Ainsi, ces anticorps anti-idiotypiques et les molécules d'acide nucléique correspondantes sont particulièrement adaptées pour la préparation de médicaments destinés à prévenir ou à traiter 1 ' angiogénèse et donc la prolifération des cellules endothéliales. Parmi les pathologies dont le traitement nécessite l'inhibition de l' activation endothéliale, on peut citer le rejet d' allogreffes et de xénogreffes, les acrocyanoses , les sclérodermies, les cancers, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, les angiomes, les angiocarcinomes, en particulier la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention sont aussi utiles pour la préparation de greffons entre le prélèvement et la transplantation. On sait en effet, que le froid suffit à induire la translocation d' intégrines permettant l'adhésion de lymphocytes activés sur les cellules endothéliales, et donc à activer les cellules endothéliales. La désactivation endothéliale réalisée par la mise en oeuvre des anticorps anti-idiotypiques et des compositions les contenant selon l'invention permettrait donc de s'opposer à la réaction de rejet. L'invention concerne donc un procédé de préparation de greffons entre le prélèvement et la transplantation consistant à mettre en contact le dit greffon avec des anticorps anti-idiotypiques selon l'invention. La concentration en anticorps anti-idiotypiques pour cette application serait par exemple de l'ordre de 100 microgrammes à 100 mg par kilo de poids corporel.

La mise en évidence dans le cadre de l'invention de la fixation des molécules HLA de classe 1 sur un récepteur à la surface des cellules endothéliales permettent également d'utiliser les anticorps anti-idiotypiques de ces molécules pour identifier plus précisément ces récepteurs et identifier des ligands. De tels ligands sont utiles soit pour stimuler soit pour inhiber l' activation endothéliale et ainsi disposer de nouveaux agents actifs pour traiter les pathologies. Parmi les pathologies nécessitant de stimuler l' activation endothéliale et donc 1 ' angiogénèse on peut citer la cicatrisation, la maturation du corps jaune de l'ovaire, la perfusion des territoires ischémies lors de thromboses vasculaires comme dans l'artérite des membres inférieurs et l'infarctus du myocarde. A titre de substance de référence capable de stimuler 1 ' angiogénèse on peut citer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre les molécules HLA de classe 1, comme l'anticorps 6/32.

Une méthode d' identification des récepteurs des molécules HLA de classe 1 à la surface des cellules endothéliales selon l'invention comprend les étapes suivantes :

- Purification de l'anticorps monoclonal selon les techniques connues de l'homme du métier.

Préparation d'une matrice de chromatographie d'affinité dans laquelle l'anticorps monoclonal purifié est conjugué à la phase solide.

- Chromatographie d'un lysat cellulaire (exemple cellules endothéliales cultivées) ou tissulaire (par exemple placenta humain) . - Elution du récepteur par un agent chaotropique

(NaCl, urée, chlorure de guanidine, choc acide ou basique) ou ligand spécifique (exemple fragment Fab du susdit anticorps) .

- Séquençage de la protéine par les techniques classiques.

Une méthode d'identification de ligands des récepteurs des molécules HLA de classe 1 à la surface des cellules endothéliales selon l'invention comprend des étapes similaires, excepté que la matrice de la chromatographie d'affinité présentera le récepteur purifié précédemment ou un fragment. Alternativement le récepteur pourra être remplacé par un récepteur recombinant obtenu par les techniques de génie génétique.

L'invention s'intéresse encore au dosage des molécules HLA de classe I ou d'anticorps anti-idiotypiques, comme marqueurs de pathologies angiogéniques . Par exemple l'anticorps W6/32 ou tout autre anticorps anti molécule HLA de classe I est immobilisé sur un support. Il est mis en contact une quantité fixe de l'anticorps anti-idiotypique marqué par de la biotine ou un élément radioactif tel que l'iode 125 et un volume connu du liquide biologique contenant la molécule à tester qui rentre donc en compétition avec la liaison de l'anticorps anti-idiotypique marqué sur l'anticorps anti HLA de classe I. Ainsi donc la diminution de la liaison de l'anticorps marqué anti- idiotypique est proportionnelle à la quantité d'anticorps anti-idiotypique ou de molécules HLA de classe I dans le milieu biologique. Ainsi, l'invention a pour objet une méthode de dosage de molécules HLA de classe I ou d'anticorps anti-idiotypiques de ces molécules éventuellement présentes dans un échantillon biologique comprenant : la mise en contact desdites molécules ou anticorps de l'échantillon avec une quantité déterminée d'anticorps anti-idiotypiques de l'invention, avantageusement marqués et fixés à des anticorps antimolécule HLA de classe I,

- la mesure de la diminution de la liaison des anticorps anti-idiotypiques marqués avec les anticorps anti-molécule HLA de classe I.

Avantageusement, cette méthode est réalisée en immobilisant les anticorps anti-molécule HLA de classe I sur un support .

Les anticorps anti-idiotypiques selon l'invention sont remarquables en ce qu' ils peuvent se fixer à la surface des cellules endothéliales grâce aux récepteurs des molécules HLA de classe 1. Ainsi, les dits anticorps anti- idiotypiques sont utiles pour vectoriser des substances d'intérêt au niveau de foyers d' activation endothéliale pathologique ou non, comme de sites angiogéniques . L'invention a donc pour objet l'utilisation d'un anticorps anti-idiotypique d'une molécule HLA de classe 1 seul ou associé à une substance d'intérêt pour la préparation d'une composition destinée à inhiber 1 ' angiogénèse ou à détecter des sites angiogéniques.

La substance d' intérêt peut être une substance chimique ou biologique active comme un médicament. On peut citer à titre d'exemple de tels médicaments : une toxine animale ou végétale, un composé radioactif, une drogue cytostatique ou cytolytique, un gène suicide ou une anti- sens .

La substance d' intérêt peut être aussi une substance de diagnostic comme un traceur radioactif ou un produit de contraste pour l'imagerie par résonance magnétique permettant de marquer les sites angiogéniques.

Les foyers d' activation endothéliale peuvent ainsi être visualisés dans tout système d'imagerie médicale.

L'invention concerne donc un composé constitué d'un anticorps anti-idiotypique d'une molécule HLA de classe 1, ou d'un dérivé de celui-ci, couplé à une substance d'intérêt comme défini ci-dessus, ledit composé étant capable de se fixer aux cellules endothéliales par l'intermédiaire d'un récepteur. Les anticorps de l'invention constituent donc un système de vectorisation de substances d' intérêt au niveau des cellules endothéliales impliquées dans des phénomènes angiogéniques particulièrement utiles pour traiter ou détecter les pathologies indiquées précédemment . Le couplage de l'anticorps anti-idiotypique avec la substance d' intérêt peut être réalisé par tout moyen de liaison clivable ou non clivable dans un milieu biologique comme par exemple :

- Couplage par liaison covalente Réaction d'oxydation aboutissant à la substitution d'un atome d'hydrogène par un atome d'iode sur un noyau indole

Ces composés de l'invention peuvent être aussi des protéines ou de gènes de fusion.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent où il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :

- La figure 1 représente le titre des souris sur cellules Fv et montre que Igld/HLA-I reconnaît des récepteurs sur les cellules endothéliales.

- La figure 2 montre que l'effet chimiotactique du 6/32 n'est pas inhibé par les VEGFRls ou VEGFR2s alors que l'effet chimiotactique du VEGF est aboli.

La figure 3 montre l'inhibition de l'action chimiotactique du VEGF par Igld/HLA-I.

- La figure 4 montre qu' Igld/HLA-I n'a pas d'effet sur la prolifération basale des cellules HUVEC.

La figure 5 montre l'action des anticorps monoclonaux anti-idiotypique de HLA de classe 1 sur la prolifération des cellules endothéliales.

A - METHODES D'ETUDE.

I - Réactifs .

1.1 - Protéines utilisées.

Le VEGF (isoforme de 165 acides aminés) est produit par infection de cellules d'insecte SF9 par un baculovirus recombinant contenant le cDNA correspondant et le FGF2 est produit chez Escherichia Coli (Plouët et al., 1997).

L'anticorps 6/32 est produit par injection de l'hybridome dans le péritoine de souris Balb/c. Les ascites sont recueillies 10-15 jours après l'inoculation et les IgG purifiées par précipitation au sulfate d'ammonium suivie de chromatographie sur protéine A sepharose. Les fragments Fab sont préparés par clivage à la papaïne.

Les récepteurs solubles du VEGF sont produits dans le milieu conditionné de cellules CHO transfectées par la construction correspondante. Les domaines extracellulaires des récepteurs VEGFR1 et VEGFR2 (boucles de type immunoglobuline 1-7) sont synthétisés par PCR, puis séquences pour vérifier qu'il n'y a pas eu de mutation. Les inserts sont ensuite insérés dans le vecteur pcDNA- 3/myc/His (Invitrogen) . Les plasmides sont transfectés dans des cellules CHO pgsA-745 et les clones sécréteurs sélectionnés par leur résistance à la généticine. Le milieu conditionné (1 litre) est ensuite précipité par 50% (poids/poids) de sulfate d'ammonium, dialyse contre du tampon Tris 0,01 M, NaCl 0,05 M puis chromatographie sur une colonne de Sp Sepharose. Les fractions actives sont collectées par un gradient discontinu de NaCl (0,2-0,5 M) puis chromatographiées sur une colonne de nickel-sepharose . La pureté des protéines VEGFR1 et VEGFR2 purifiées est ensuite attestée par gel de polyacrylamide-SDS (>90%) et conservés à -80°C jusqu'à l'utilisation. 1.2 - Cellules utilisées.

Les milieux de culture et les sérums proviennent de la compagnie Life Technologies™. Les cellules endothéliales de veines de cordon ombilical humain (HUVEC) sont cultivées sur plastique recouvert de gélatine diluée à 0,2% dans du PBS . Les cellules sont cultivées en milieu endothélial SFM supplémenté par 50 unités/ml de pénicilline, 50 μg/ml de streptomycine, et 20% de sérum de veau fœtal et maintenues dans une étuve à 10% C02. Ces cultures sont entretenues avec du VEGF à 2 ng/ml ajouté au milieu tous les deux jours .

Les cellules endothéliales d'aorte bovine fœtale (FBAE) sont cultivées sur plastique recouvert de gélatine diluée à 0,2% dans du PBS . Les cellules sont cultivées en milieu DMEM-glutamax supplémenté par 50 unités/ml de pénicilline, 50 μg/ml de streptomycine, et 10% de sérum de veau nouveau-né et maintenues dans une étuve à 10 % C02. Ces cultures sont entretenues avec du VEGF à 2 ng/ml ajouté au milieu tous les deux jours et exhibent un phenotype angiogenique .

II - Préparation d'anticorps anti-idiotypiques.

11.1 - Fabrication d'anticorps préimmuns (Ig PI) . Avant chaque immunisation, du sang est prélevé, le sérum est fractionné immédiatement après le recueil et 1,5 ml de sérum est chromatographie sur une colonne de protéine A. La colonne est lavée par du PBS et les immunoglobulines sont éluées par de la glycine 0,2 M, pH 2,5, immédiatement neutralisées par adjonction de 1/5 du volume de K2HP04 1 M, puis dialysées contre du PBS. Les immunoglobulines (Ig PI) s o n t c o n s e r v é e s à

-80 °C jusqu'à leur utilisation.

11.2 - Anticorps anti-idiotypiques de HLA-I (Ig2Id HLA-1) .

Les souris reçoivent par voie sous-cutanée 10 μg de 6/32 mélangé volume à volume avec de l'adjuvant complet de Freund sous un volume final de 100 μl . Quatre rappels sont effectués toutes les deux semaines par injection par voie intapéritonéale du mélange, excepté que l'adjuvant complet est remplacé par de l'adjuvant incomplet.

La veille de la fusion, soit à J 67, cinq souris Balbc non- immunisées sont sacrifiées pour l'obtention des macrophages servant de cellules nourricières aux hybridomes. Les macrophages sont récupérés par injection de 8ml de milieu de culture ISCOVE dans le péritoine des souris. Après centrifugation, les macrophages sont repris dans du milieu ISCOVE contenant 20% de sérum de veau foetal (Biochrom, lot 5612). Ces cellules sont ensuite distribuées dans 20 plaques de 96 puits à raison de lOOμl par puits

(environ 3 x 10 cellules/puits) .

Le lendemain, soit à J 68, les souris présentant les titres les plus élevés d'anticorps anti-Id sont sacrifiées. Leurs rates sont prélevées et dilacérées dans du milieu ISCOVE pour libérer les splénocytes. Le tissu conjonctif est dégagé et les splénocytes sont centrifugés et comptés. En parallèle, la lignée de myélome de souris Ag8X63 a été cultivée depuis 10 jours dans du milieu ISCOVE à 20% de sérum Myoclone. Ces cellules sont lavées et numérées .

Les deux types cellulaires, splénocytes et myélomes, sont mélangés de façon à obtenir un rapport de 1 cellule de myélome Ag8X63 pour 6 splénocytes. La fusion s'effectue par ajout de 20 fois 50 μl de polyethylene glycol (PEG) à 30 secondes d'intervalle. 4 ml de milieu ISCOVE préchauffé à 37°C sont alors ajoutés goutte à goutte sur la suspension cellulaire, puis après une période d'incubation de 4 minutes à 37°C, 4 ml sont ajoutés. La suspension est centrifugée puis le culot cellulaire est alors repris dans 100 ml de milieu ISCOVE complémenté avec 20% de sérum de veau fœtal et du HAT IX (50X: Hypoxanthine 5mM, Aminoptérine 20μM et Thymidine 0.8mM) et distribué à raison de lOOμl par puits sur les macrophages. Après 5 jours, 100 μl de milieu HAT est ajouté, et entre 8 et 14 jours le milieu conditionné de chaque hybridome est prélevé pour mesurer la quantité d'anticorps dirigés contre les fragments Fab de l'anticorps 6/32

(Elisa anti-idiotype) et les cellules endothéliales. Les hybridomes sélectionnés pour leur capacité à sécréter des anticorps anti-Id sont alors clones, c'est-à- dire que les cellules sont ensemencées en condition de dilution limite (5 cellules/ml) sous un volume de 0,1 ml par puits. Le milieu est changé après 10 jours. Après 15 jours, certains puits contiennent des foyers de cellules qui se sont multipliées à partir de la cellule ensemencée au départ, donc toutes ces cellules sont identiques et sont issues du même clone. Quand la surface occupée par les cellules représente au moins la moitié de la surface totale du puits, le milieu est prélevé et analysé comme précédemment. A ce stade, on peut sélectionner les clones producteurs d'anticorps anti-Id et connaître leur spécificité.

Une fois les clones identifiés leur nature monoclonale a été confirmée par l'opération classique consistant à ensemencer une plaque de 96 puits avec des cellules issues du même clone diluées en conditions limites comme précédemment. Les clones sécréteurs doivent donc tous sécréter un anticorps de même spécificité pour que l'on déclare cet anticorps monoclonal.

Un troisième clonage est alors effectué pour s'assurer que les clones sont bien monoclonaux.

Le criblage des anticorps anti-Id est effectué par les 2 Elisa, comme décrit ci-après. III - Étude de la spécificité des anticorps.

III.1 - ELISA. a) anti - idiotype .

Les boîtes de plastique sont tapissées de fragments Fab de l'anticorps W6/32. Les puits sont incubés avec les immunoglobulines à tester (2 h, 37°C) . Après rinçages, les immunoglobulines fixées sont révélées à l'aide d'anticorps de chèvre conjugués à la peroxydase dirigés contre les fragments Fc immunoglobulines de souris.

Ainsi, si un anticorps se fixe sur les fragments Fab de 6/32, il est soit dirigé contre l' isotype soit contre l'idiotope. L'utilisation ultérieure d'un second ELISA dans lequel les boîtes sont tapissées de fragments Fab d'un anticorps de même isotype permettra d'éliminer les faux positifs et de ne conserver que les anticorps anti- idiotypiques, subséquemment dénommé Igld/HLA-I. La nature anti-idiotypique des surnageants d' hybridomes a été évaluée par ELISA sur plaques tapissées de fragments Fab de 6/32.

635 hybridomes ont été testés. 27 anticorps monoclonaux ont été obtenus, b) Cellules endothéliales.

Les cellules Fv sont incubées à 5000 cellules par puits de multiplaque 96. Après la confluence, les cellules sont rincées et fixées par un traitement n' induisant pas la perméabilisation (0,25% de glutaraldéhyde) , saturées par une solution de glycine 1M^~ pH8 puis par une solution d' IgG de lapin. Les cellules sont ensuite abondamment rincées puis les anticorps incubés 2 h à température ambiante. Après rinçages, les immunoglobulines fixées sont révélées à l'aide d'anticorps de chèvre conjugués à la peroxydase dirigés contre les immunoglobulines de souris.

Ainsi, si un anticorps se fixe sur les cellules endothéliales non perméabil isées alors que les immunoglobulines préimmunes ne le font pas, c'est qu'il reconnaît un récepteur spécifique sur ces cellules.

Les 27 anticorps monoclonaux ont ensuite été soumis à un test ELISA sur cellules F/V.

22 anticorps Igld/HLA-I reconnaissent des récepteurs sur les cellules endothéliales. III.2 - Migration cellulaire.

Les cellules FV sont ensemencées à forte densité dans des plaques de 12 puits en milieu DMEM supplémenté de 10% de sérum de veau nouveau-né et de 1 ng/ml de VEGF (50 000 cellules par puits) . Une fois la confluence atteinte les cellules sont transférées en milieu sans sérum et sans VEGF. Le lendemain les cellules sont décollées par grattage à l'aide d'une pointe mousse et rincées 3 fois. Les modulateurs sont ajoutés au milieu et 24 h après, les cellules sont fixées et colorées au May Grunwald Giemsa puis les cellules qui ont migré sont comptées dans au moins 8 champs .

III.3 - Prolifération cellulaire.

Les cellules HUVEC sont ensemencées à faible densité (2000 cellules/cm2) dans des boîtes de 12 puits dont la surface a été préalablement tapissée de gélatine. Les modulateurs sont ajoutés après l'adhésion des cellules, au plastique de culture, puis après 2 jours. Chaque condition est étudiée dans trois puits différents. Les cellules sont trypsinisées et comptées au cinquième jour. Le pourcentage d' inhibition est calculé comme le rapport :

(nombre de cellules de l'échantillon - nombre de cellules en absence de VEGF) / (nombre de cellules en présence de VEGF - nombre de cellules en absence de VEGF)

B - RÉSULTATS .

I - ELISA.

La nature anti-idiotypique des immunoglobulines purifiées a été évaluée par ELISA sur plaques tapissées de fragments Fab de 6/32. Les immunoglobulines pré-immunes ne se fixent pas sur les Fab et Igld/HLA-I le fait.

Les immunoglobulines ont ensuite été évaluées par leur capacité à reconnaître des cellules endothéliales activées. Comme l'indique la figure 1, les immunoglobulines pré-immunes ne se fixent pas sur les cellules endothéliales et Igld/HLA-I le fait. La figure 1 montre donc que Igld/HLA-I reconnaît des récepteurs sur les cellules endothéliales .

II - Migration. II a été démontré que la dimérisation de molécules

HLA de classe I transmembranaires induite par la ligation à l'aide de l'anticorps 6/32 stimulait la prolifération des cellules HUVEC. Cet effet serait dû à la surexpression de récepteurs du FGF2 (Harris, 1997) . Pour déterminer si cette ligation mettait en jeu aussi le système VEGF, les cellules ont été incubées avec 10 μg/ml de 6/32 et 1 μg/ml de VEGFRls ou VEGFR2s.

Les cellules FV sont ensemencées à forte densité (50 000 cellules/puits) dans des boîtes de 12 puits en présence de 2 ng/ml de VEGF. 2 jours après la confluence, la prolifération cellulaire est arrêtée par le transfert en milieu ne contenant ni sérum ni VEGF pendant 24 heures. Une blessure est alors pratiquée dans la monocoque par grattage à l'aide d'une pointe mousse, les cellules rincées abondamment puis 10 μg/ml de 6/32 ou 50 ng/ml de VEGF sont ajoutés en présence ou absence de 1 μg/ml de VEGFRls ou

VEGFR2s. Chaque condition est étudiée dans deux puits différents. 24 heures après les cellules sont rincées avec du milieu DMEM, colorées au May Grunwald-Giemsa et les cellules ayant migré sont comptées dans 8 champs par condition.

La figure 2 montre que l'effet chimiotactique du W6/32 n'est pas inhibé par les VEGFRls ou VEGFR2s alors que l'effet chimiotactique du VEGF est aboli. En conséquence, la signalisation du 6/32 n'est pas liée à celle du VEGF.

La figure 3 montre l'inhibition de l'action chimiotactique du VEGF par Igld/HLA-I.

Les cellules FV sont ensemencées à forte densité (50 000 cellules/puits) dans des boîtes de 12 puits en présence de 2 ng/ml de VEGF. 2 jours après la confluence la prolifération cellulaire est arrêtée par le transfert en milieu ne contenant ni sérum ni VEGF pendant 24 heures. Une blessure est alors pratiquée dans la monocouche par grattage à l'aide d'une pointe mousse, les cellules rincées abondamment puis 50 ng/ml de VEGF sont ajoutés en présence ou absence de 5-50 μg/ml de Igld/HLA-I. Chaque condition est étudiée dans deux puits différents. 24 heures après les cellules sont rincées avec du milieu DMEM, colorées au May Grunwald-Giemsa et les cellules ayant migré sont comptées dans 8 champs par condition.

Igld/HLA-I n'a pas d'effet sur la migration spontanée des cellules FV. En revanche un excès molaire de 100 fois suffit à inhiber pratiquement totalement l'activité chimiotactique du VEGF. En conséquence, la liaison de Igld/HLA-I à ses récepteurs endothéliaux induit un effet inhibant l'activité du VEGF.

III - Mitogénicité . Igld/HLA-I n'a pas d'effet sur la prolifération basale des cellules HUVEC (Figure 4) . En revanche 2 classes d'anticorps Igld/HLA-I peuvent être distinguées :

- Les anticorps inhibiteurs (sur un mode dépendant de la dose) de la prolifération des cellules HUVEC induite par le VEGF. En conséquence, la liaison de Igld/HLA-I à ses récepteurs endothéliaux induit un effet inhibant l'activité du VEGF.

- les anticorps stimulateurs (sur un mode dépendant de la dose) de la prolifération des cellules HUVEC induite par le VEGF. En conséquence, la liaison de Igld/HLA-I à ses récepteurs endothéliaux induit un effet stimulant de l'activité du VEGF.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

- Bian H, Reed EF . Anti-HLA class I antibodies transduce signais in endothelial cells resulting in FGF receptor translocation, down-regulation of ICAM-1 and cell prolifération. Transplant Proc 2001 ;33(1-2):311

- Bian H, Harris PE, Reed EF. Ligation of HLA class I molécules on smooth muscle cells with anti -HLA antibodies induces tyrosine phosphorylation, fibroblast growth factor receptor expression and cell prolifération. Int Immunol 1998;10(9) : 1315-23

- Barnstable CJ., Bodmer WF . , Brown G., Galfre G., Milstein C, Williams AF . , Ziegler A. Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes , HLA and other human cell surface antigens-new tools for genetic analysis .

- Blaschitz A., Lenfant F., Mallet V., Hartmann M., Bensussan A., Geraghty D. E., Le Bouteiller P. and Dohr G.

(1997) Endothelial cells in chorionic fetal vessels of first trimester placenta express HLA-G. Eur J Immunol 27,

3380-8.

-Brodsky FM, Parham P. Monomorphic anti-HLA-A, B, C monoclonal antibodies detecting molecular subunits and combinatorial déterminants. J Immunol 1982 128 (1) : 129-35 - Kohler G, Howe SC, Milstein C. Fusion between immunoglobulin-secreting and nonsecreting myeloma cell lines. Eur J Immunol 1976 Apr; 6 (4) : 292-5

- Lanier L. L. (1998) NK cell receptors . Annu J?ev Immunol 16, 359-93.

- Maejima M., Fujii T., Kozuma S., Okai T., Shibata Y. and Taketani Y. (1997) Présence of HLA-G-expressing cells modulâtes the ability of peripheral blood mononuclear cells to release cytokines . Am J Reprod Immunol 38, 79-82. - Ortéga N., Jonca F., Vincent S., Favard C, Ruchoux M-M, Plouët J., 1997. Systemic activation of the vascular endothelial growth factor receptor flk-1 selectively triggers angiogenic endothelial cells. Am. J. Pathol., 151, 1215-1224.

- Ortéga N.,Hutchings H., Plouët J. , 1999. Signal relays in the VEGF System. Front. Biosc, 4, D141-D152.

- Plouët J. , Moro F., Coldeboeuf N. , Bertagnolli S., Clamens S., Bayard F., 1997. Extracellular cleavage of the vascular endothelial growth factor 189 aa forrm by ^"urokinae is required for its mitogeriic activity. J. Biol . Chem., 272, 13390-13396.

- Prats, H., Kaghah, M., Prats, A.C., Klagsbrun, M., Lelias, J.M., Liauzun, P., Chalon, P., Tauber, J.P., Amalric, F., Smith, J.A. (1989). High molecular mass forms of fibroblast growth factor are initiated by alternative CUG codons. Proc. Natl . Acad. Sci . USA. 86, 1836-1840.

- Rebmann V., Pfeiffer K. , Passle Taylor R. N. (1997) Review: immunobiology of preeclampsia . Am J Reprod Immunol 37, 79-86.

Claims

REVENDICATIONS

1) Un anticorps anti-idiotypique d'une molécule HLA de classe 1, un fragment ou un dérivé de celui-ci.

2) Un anticorps anti-idiotypique selon la revendication 1, choisi parmi un anticorps monoclonal, un anticorps polyclonal, un fragment comme Fab'2 ou Fab ou une combinaison de ceux-ci.

3) Un anticorps anti-idiotypique selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la molécule HLA de classe 1 est choisie parmi : HLA-A, B, C, D, F, ou G.

4) Une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence polynucléotidique codant pour un anticorps anti-idiotypique d'une molécule HLA de classe 1 selon l'une des revendications 1 à 3.

5) Une composition pharmaceutique utile pour prévenir ou inhiber 1 ' angiogénèse comprenant au moins un anticorps anti-idiotypique selon l'une des revendications 1 à 3 ou une molécule d'acide nucléique selon la revendication 4.

6) Utilisation d'anticorps anti-idiotypique selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une molécule d'acide nucléique selon la revendication 4 pour la préparation d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter une pathologie impliquant une activation endothéliale.

7) Utilisation selon la revendication 6, caractérisée en ce que la pathologie impliquant une activation endothéliale est choisie dans le groupe comprenant : le rejet d' allogreffes et de xénogreffes, les acrocyanoses , les sclérodermies , les cancers, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoide, les angiomes, les angiocarcinomes, en particulier la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi.

8) Utilisation d'anticorps anti-idiotypique selon l'une des revendications 1 à 3 ou d'une molécule d'acide nucléique selon la revendication 4 pour la préparation d'une composition pharmaceutique utile pour la conservation de greffons entre le prélèvement et la transplantation.

9) Utilisation d'anticorps anti-idiotypique selon l'une des revendications 1 à 3 associé à une substance d'intérêt pour la préparation d'une composition destinée à inhiber 1 ' angiogénèse ou à détecter des sites angiogéniques .

10) Un composé constitué d'un anticorps anti- idiotypique d'une molécule HLA de classe 1 selon l'une des revendications 1 à 3 couplé à une substance d' intérêt en thérapie ou diagnostic.

11) Méthode de dosage de molécules HLA de classe I ou d'anticorps anti-idiotypiques de ces molécules éventuellement présentes dans un échantillon biologique caractérisée en ce qu'elle comprend :

_* la mise en contact desdites molécules ou anticorps de l'échantillon avec une quantité déterminée d'anticorps anti-idiotypiques selon l'une des revendications 1 à 3 marqués et fixés à des anticorps antimolécule HLA de classe I,

- la mesure de la diminution de la liaison des anticorps anti-idiotypiques marqués avec les anticorps anti-molécule HLA de classe I.