WO2003000738A2 - Wasserlösliches, einen aminozucker aufweisendes antibiotikum in form eines polysaccharidkonjugats - Google Patents

Wasserlösliches, einen aminozucker aufweisendes antibiotikum in form eines polysaccharidkonjugats Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to water-soluble, orally or parenterally administrable preparations of antibiotics having an amino sugar in the form of a conjugate with a polysaccharide based on starch or starch derivatives, in particular hydroxyethyl starch and hydroxypropyl starch, and a process for their cost-effective production in high yield. Hydroxyethyl starch is particularly preferred as the polysaccharide.
  • Antibiotics with an amino sugar are in particular amphotericin B, daunorubicin and doxorubicin, all of which have an amino group in the C 3 position of the amino sugar portion.
  • Amphotericin B is mainly administered parenterally, daunorubicin and doxorubicin must be used IV. be administered.
  • Amphotericin B is a polyen antibiotic isolated from Streptomyces nodosus. Chemically, it is a macrocyclic lactone (macrolide) with 7 conjugated double bonds in an all-trans configuration within a 38-membered lactone ring, to which the amino sugar D-mycosamine is bound via an O-glycosidic bond.
  • Amphotericin B is amphoteric and has lipophilic and hydrophilic regions in the molecule, which enable it to form complexes with the sterols contained in the cytoplasmic membrane of fungi, which leads to a disturbance in cell permeability. Since bacterial membranes do not contain sterols, the antibiotic effect of Amphotericin B is selectively directed against fungi.
  • Amphotericin B Because of the broad spectrum of action of Amphotericin B, which covers practically all human pathogenic fungi, it is the method of choice for systemic treatment of mycotic infections in humans. Especially in patients whose immune system is impaired, e.g. in HIV or cancer patients, the treatment of the associated invasive fungal infections has increased significantly in recent years.
  • Amphotericin B is sometimes associated with rather massive side effects.
  • amphotericin B i.v. applied usually with a daily dose of 0.5 to 0.7 mg / kg body weight.
  • the dosage must be adjusted or adjusted individually.
  • patients with a weakened immune system usually need higher doses than usual, e.g. 1 mg / kg body weight daily, which can be increased up to 1.5 mg / kg in difficult forms - if tolerable.
  • the parenteral duration of use can extend from a few weeks to several months.
  • Amphotericin B Because of its toxicity and side effects, Amphotericin B should therefore only be administered in life-threatening circumstances. On the other hand, however, it is caused by disorders caused by the immune system - e.g. in AIDS or after organ transplants - mycoses often the only effective remedy.
  • amphotericin as a whole has pronounced hydrophobic properties, so that it is practically insoluble in water in the physiological pH range. It is difficult to dissolve even in organic solvents. Therefore, the current commercial preparations are relatively complicated pharmaceutical forms, which have additional disadvantages.
  • a suitable solution mediator e.g. Na deoxycholate
  • the solubility in water can be increased.
  • the BRISTOL-MYERS SQUIBB originator preparation intended for infusion available in Germany under the trade name "Amphotericin B”
  • Amphotericin B the stock solution thus obtained can only be used with electrolyte-free carrier solutions, e.g. a 5% glucose solution, diluted to the desired final concentration.
  • This preparation also has a low therapeutic index, i.e. the window between the effective and toxic dose is very narrow.
  • this preparation is not very effective in certain clinical pictures because the active substance does not reach the site of the mycotic infection or only in too small a concentration, so that amphotericin B does not or only has its characteristic antifungal activity can unfold insufficiently.
  • amphotericin B preparations which represent lipid formulations, for example lipid complexes with amphotericin B, colloidal dispersions of cholesteryl sulfate with amphotericin B and liposomally packaged amphotericin B. All of these medicinal forms are shown Although a larger therapeutic index and a higher tolerance, in particular a lower nephrotoxicity compared to a conventional amphotericin B deoxycholate formulation, which is why they can also be administered in higher doses, the side effects described above cannot be avoided entirely at high doses ,
  • amphotericin B As a further method of converting amphotericin B into a water-soluble form for injection purposes, the formation of an amphotericin B-arabinogalactan conjugate is described in the literature (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 43 No. 8, 1999, 1975-1981).
  • Arabinogalactan is a water-soluble polysaccharide obtained from larch from arabinose and galactose units in a ratio of 1: 6.
  • Amphotericin B binds to arabinogalactan in 4 steps. Arabinogalactan is first subjected to periodate oxidation, with vicinal hydroxyl groups of the sugar units being converted into dialdehydes with ring cleavage.
  • the aminos group of mycosamine from amphotericin B is coupled to an aldehyde group to form an imine (Schiff base) and finally the imine group is converted into an amine group by means of Na borohydride. Group and unreacted aldehyde groups converted into hydroxyl groups.
  • the coupling reaction is carried out at pH 11. This pH value is a compromise between the yield of the conjugate formed on the one hand and the toxicity of the conjugate on the other. Below pH 10, amphotericin B is water-insoluble and the yields are low. From pH 12, amphotericin B is relatively readily water-soluble, which enables higher yields, but the product obtained is toxic. Toxicity was also observed when the final step of Na borohydride reduction was omitted.
  • the antibiotics daunorubicin and doxorubicin belong to the group of anthracyclines and differ only by a hydroxyl group. They are soluble in water. Doxorubicin is obtained from cultures of the fungus Streptomyces peuceticus var. Caesius, Daunomycin from Streptomyces peuceticus or coeruleorubidus.
  • daunorubicin and doxorubicin are able to inhibit DNA and RNA synthesis with the formation of very stable, long-lasting DNA intercalation complexes.
  • cytochrome P-450 reductase and NADPH they form semiquinone radicals, which in turn trigger further radical reactions (superoxide anion and hadroxyl radicals). This gives these antibiotics a pronounced cytostatic effect, which is why they are used as cytostatics in cancer therapy.
  • antibiotics are only insufficiently absorbed after oral administration, they must be (strictly) IV. in short infusions over 10 to 15 minutes. They are distributed quickly in the organism, with the highest concentrations in the heart, lungs, spleen and kidneys being detected.
  • the object of the present invention is therefore to provide pharmaceutical forms for such amino sugar-containing antibiotics in which the specific toxic side effects are reduced, which ensure a more uniform, controlled distribution in the organism and thus allow a higher dosage and which are nevertheless easy to use.
  • Another object of the invention is to provide an inexpensive method for producing these dosage forms with a high yield.
  • Starch or starch derivatives can be solved with such antibiotics.
  • composition is a water-soluble antibiotic derivative containing an aminosugar
  • polysaccharide portion of the conjugate is linked to the amino group at C 3 of the amino sugar of the antibiotic to form a peptide bond.
  • starch or starch derivatives are amylose (unbranched only with ⁇ -l, 4-glycosidic linkage) and / or amylopectin (branched, additionally with ⁇ -l, 6-glycosidic linkage) and in particular hydroxyalkylated starch.
  • amylose or amylopectin commercially available so-called "soluble" starch is used. The latter can also be in hydroxyethylated and hydroxypropylated form.
  • the average molecular weight can be in the range between 2000 and 2 ⁇ 10 6 daltons.
  • the average degree of polymerization should, however, be at least 15 and in a preferred one Embodiment range up to about 3000 (corresponding to an average molecular weight of about 5 • 10 5 ).
  • the use of hydroxyethyl starch is particularly preferred.
  • the molecular weight of the HES should preferably be above the kidney threshold for HES, ie above 70,000 Daltons.
  • a HES of specification 130 / with an average molecular weight of 130,000 daltons is particularly preferred.
  • the degree of substitution MS is preferably in the range from 0.1 to 0.8. In a preferred embodiment, the degree of substitution is in the range from 0.3 to 0.5.
  • the preferred C 2 / C 6 ratio is in the range from 2 to 12, in a particularly preferred embodiment in the range from 5 to 11.
  • HES can be both unbranched are present only with predominantly ⁇ -1,4-glycosidic linkages and also branched with both ⁇ -1,4-glycosidic linkages and also ⁇ -1,6-glycosidic linkages.
  • the binding of the polysaccharide to the amino group of the amino sugar of the antibiotic is carried out by oxidizing the free, reducing aldehyde group of the terminal polysaccharide molecule, preferably with J 2, to form an aldonic acid group, which in turn contains a free hydroxyl group of the terminal sugar unit. preferably on the C 4 atom of the terminal sugar unit, a lactone ring is formed which can then form a peptide bond with the amino group of the amino sugar of the antibiotic.
  • the coupling reaction according to the invention of the oxidation product at the reducing end of HES with the amino group of the amino sugar can also be used high yield in an organic solvent, for example DMSO, in which, for example, the antibiotic amphotericin B is soluble.
  • the conjugate obtained surprisingly also proved to be non-toxic, so that it can also be administered orally.
  • the conjugate can be dissolved or diluted to the desired applicable final concentration with electrolyte-containing solvents or mixtures (e.g. a mixture of isotonic saline and glucose solution).
  • higher doses e.g. For the amphotericin B conjugate, apply daily doses of up to 15 mg of amphotericin B.
  • hydroxyethyl starch can in any case be administered intravenously as a plasma expander in large doses, when HES and amphotericin B are coupled, unreacted portions of HES are physiologically harmless and therefore do not need to be separated from the reaction product, which is of great economic advantage in the synthesis.
  • amphotericin B no final hydrogenation is required in order to make the conjugate formed less toxic.
  • unbound hydroxyethyl starch itself on amphotericin B is even a solubilizing one Exerts an effect, whereby an additional stabilization of the antifungal active ingredient can be achieved with excess HES.
  • an antibiotic-HES conjugate according to the invention is that the polysccharide portion is degradable by serum ⁇ -amylase. This degradation is described in detail in the relevant literature on the pharmacokinetics of the HES used as plasma expanders.
  • the peptide bond between the polysaccharide component and the antibiotic in vivo is in principle accessible to an enzymatic attack.
  • amphotericin B As was shown from studies on Candida albicans, known as the leading microorganism from the spectrum of the possible fungal infection germs, the conjugates of amphotericin B according to the invention had comparable efficacies to the lipid formulations. In the hemolysis test on sheep erythrocytes it was possible to demonstrate that the in vitro toxicity of an amphotericin B-HES conjugate is significantly lower than that of commercial amphotericin B deoxycholate formulations.
  • a significant advantage of an antibiotic-HES conjugate according to the invention can be seen in the fact that the pharmacokinetic properties of the conjugate obtained can be adjusted practically tailored to the needs of a particular patient by suitable selection of molecular weight, degree of substitution, substitution pattern and degree of branching of the HES used.
  • the solution obtained is then passed through an H + ion exchange column (Amberlite IR 120) and then dialyzed against distilled water in a dialysis tube with an exclusion limit of 4-6 kD over a period of 20 h.
  • the dialyzed product is lyophilized and the degree of oxidation is determined using the SOMOGYI method.
  • the method of SOMOGYI was used to determine the oxidized HES (ox-HES) formed (Meth. Carbohydrate Chem., 1, 384-386, 1962). The method is based on the determination of the free aldehyde groups via the reduction of Cu 2+ to Cu + . Cu ⁇ is oxidized again to Cu 2+ with the aid of iodine formed from iodide and iodate. Excess iodine is then titrated using thiosulfate.
  • amphotericin B-HES conjugates obtained were characterized by their UV spectrum (0.5 g / 5 ml H 2 O dcst ) and showed the bands typical for polymeric or micellar interactions of amphotericin B in the range of 300-400 nm. In contrast to free amphotericin B, which is practically insoluble in water, the amphotericin-HES conjugates obtained had a water solubility of> 0.1 g / 5 ml H 2 0.
  • Weight average molecular weight M w 102,700
  • This characteristic data essentially corresponded to the characteristic data of the HES used.
  • amphotericin B from Bristol-Meyers-Squibb, batch name: A068
  • Amphotericin B from Bristol-Meyers-Squibb, batch name: A068
  • the active ingredient of which is said to be hemolytic from a concentration of 8 ⁇ g / ml
  • Stock solution for preparation according to the invention 1 1.61 g of Ampho-HES (corresponding to a weight fraction of 50 mg of amphotericin B) were dissolved in 50 ml of 5% glucose solution (batch number: 9233A4 from Braun Melsungen). The active substance content of the stock solution thus prepared was 1 mg of amphotericin B per ml. Three dilutions of this stock solution were prepared in accordance with Table 2 and also examined for their haemolytic effect.
  • amphotericin B deoxycholate formulation A 50 mg bottle was washed with 10 ml A. a. injectabilia (lot number: 0514A63 from Braun Melsungen) and diluted in 5% glucose solution to 0.12 mg / ml amphotericin B.
  • Hemolysis comparison test 5 ml each of the solutions to be tested were mixed with 1 ml of the above erythrocyte suspension, transferred to a cleaned centrifuge tube and incubated for 20 minutes in a water bath at 37 ⁇ 1 ° C. The mixture was then centrifuged for 5 minutes at a relative centrifugal acceleration of 2000.
  • the absorbance of the supernatant was measured. 5 ml of the 0.9% NaCl solution and the 5% glucose solution, which were mixed with 1 ml the erythrocyte suspension was mixed, also incubated for 20 minutes at 37 ⁇ 1 ° C and then centrifuged as above.
  • the absorbances of the respective supernatants against the negative controls were measured at a wavelength of 576 nm using a cuvette with a 10 mm layer thickness. Due to the different colorations of the solutions, the extinction was also measured for comparison of the solutions without erythrocyte suspension.
  • the tested, commercially available amphotericin B deoxycholate formulation shows a strong haemolytic effect even at a concentration of 0.1 mg / ml in the test mixture under the above test conditions.
  • the supernatant had an absorbance of 2.271 at 576 nm and was colored strongly red.
  • ampho-HES preparation according to the invention had no hemolytic effect up to a concentration of 0.2 mg amphotericin B per ml observe. Only at a concentration of 0.4 mg / ml was there a slight red color in the supernatant of the test mixture compared to the negative control, which was also noticeable in the absorbance values. At this amphotericin B concentration in the test mixture, there is a slight hemolytic activity.
  • the test preparation showed a strong hemolytic activity at a concentration of 0.83 mg / ml, where the supernatant was colored strongly red. In addition, microscopic few intact erythrocytes were found in the supernatant, which could not sediment into the pellet due to the high viscosity during the sedimentation period.

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Abstract

Es sollten neue Arzneiformen für die aminozuckerhaltigen Antibiotika Amphotericin B, Daunorubicin und Doxorubicin bereitgestellt werden, bei welchen die bekannten Nebenwirkungen reduziert und welche unkompliziert anwendbar sind. Das Antimykotikum Amphotericin B ist nephrotoxisch. Die Cytostatika Daunorubicin und Doxorubicin sind stark kardiotoxisch. Die neuen Arzneiformen sind Antibiotika-Stärke-Konjugate, wobei das Antibiotikum mit dem Polysaccharid an dessen reduzierendem Ende über eine Peptidbindung verknüpft ist. Verfahrensmässig erfolgt diese Bindung über J2-Oxidation des Stärkederivats an seinem reduzierenden Ende in wässriger alkalischer Lösung und anschliessender Kopplung des so oxidierten Stärkederivats an das Antibiotikum in organischer Lösung. Die erhaltenen Konjugate sind weniger toxisch. Der Polysccharid-Anteil ist durch Serum-α-Amylase abbaubar und die Peptidbindung einem enzymatischen Angriff zugänglich.

Description

Wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum in Form eines
Polysaccharidkonjugats
Die vorliegende Erfindung betrifft wasserlösliche, oral oder parenteral applizierbare Zubereitungen von einen Aminozucker aufweisenden Antibiotika in Form eines Konjugats mit einem Polysaccharid auf Basis von Stärke oder Stärkederivaten, insbesondere Hydroxyethylstärke und Hydroxypropylstärke, sowie ein Verfahren zu deren kostengünstiger Herstellung in hoher Ausbeute. Besonders bevorzugt als Polysaccharid ist Hydroxyethylstärke. Als Antibiotika mit einem Aminozucker kommen insbesondere Amphotericin B, Daunorubicin und Doxorubicin in Betracht, welche allesamt eine Aminogruppe in C3-Position des Amionozuckeranteils aufweisen.
Die aminozuckerhaltigen Antibiotika Amphotericin B, Daunorubicin und Doxorubicin finden in der Therapie breite Anwendung und stellen oft das Mittel der Wahl dar, obwohl sie teils gravierende Nebenwirkungen zeigen. Amphotericin B wird überwiegend parenteral appliziert, Daunorubicin und Doxorubicin müssen zwingend i.v. verabreicht werden.
Amphotericin B ist ein aus Streptomyces nodosus isoliertes Polyen- Antibiotikum. Chemisch handelt es sich um ein makrocyclisches Lacton (Makrolid) mit 7 konjugierten Doppelbindungen in all-trans-Konfiguration innerhalb eines 38-gliedrigen Lactonrings, an welchen über eine O-glykosidische Bindung der Aminozucker D-Mycosamin gebunden ist. Amphotericin B ist amphoter und besitzt lipophile und hydrophile Regionen im Molekül, welche es befähigen, mit den in der Cytoplasmamembran von Pilzen enthaltenen Sterolen Komplexe zu bilden, was zu einer Störung der Zellpermeabilität führt. Da Bakterienmembranen keine Sterole enthalten, ist die antibiotische Wirkung von Amphotericin B selektiv gegen Pilze gerichtet.
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Wegen des breiten Wirkungsspektrums von Amphotericin B, das praktisch alle menschenpathogenen Pilze umfaßt, ist es für eine systemische Behandlung mykotischer Infektionen beim Menschen das Mittel der Wahl. Insbesondere bei Patienten, deren Immunsystem beeinträchtigt ist, wie z.B. bei HIV- oder Krebs-Patienten, hat die Behandlung der damit einhergehenden invasiven Pilzinfektionen in den letzten Jahren stark zugenommen.
Andererseits ist jedoch der Einsaz von Amphotericin B mit teils ziemlich massiven Nebenwirkungen verbunden. Bei generalisierten Mykosen und Organmykosen wird Amphotericin B i.v. appliziert, üblicherweise mit einer täglichen Dosis von 0,5 bis 0,7 mg/kg Körpergewicht. Da aber die Verträglichkeit von Amphotericin B von Patient zu Patient unterschiedlich ist, muß die Dosierung individuell eingestellt bzw. angepaßt werden. Darüber hinaus benötigen Patienten mit geschwächtem Immunsystem meist höhere Dosen als üblich, z.B. täglich 1 mg/kg Körpergewicht, die bei schwierigen Verlaufsformen - sofern verträglich - bis zu 1,5 mg/kg gesteigert werden können. Die parenterale Anwendungsdauer kann sich dabei von einigen Wochen bis zu mehreren Monaten hinziehen.
Im Laufe einer parenteralen Behandlung kommt es dann gewöhnlich zu infusionstypischen Reaktionen, wie z.B. Fieber, Erbrechen und Schüttelfrost, die gewöhnlich symtomatisch behandelt werden, so daß eine Unterbrechung der Infusionsbehandlung nicht erforderlich ist. Weit schwerwiegender sind jedoch die oftmals auftretenden Leber- und insbesondere Nierenfunktionsstörungen. So fällt etwa zu Beginn einer Therapie die glomeruläre Filtrationsrate stets um etwa 40% ab. Bei der Mehrzahl der Behandelten bleibt sie über die gesamte Therapiedauer hinweg erniedrigt. Entsprechend steigen Kreatinin im Serum und Harnstoff im Blut an. Gelegentlich sind sogar über die Therapiedauer hinaus irreversible Schädigungen zu beobachten. Nach zwei- bis dreiwöchiger Therapie tritt auch häufig Anämie auf, die zu Hämatoktit- Werten von 25 bis 30% führen kann. Die Blutbildveränderungen sind jedoch in der Regel nach Beendigung der Therapie wieder voll reversibel.
Wegen seiner Toxizität und Nebenwirkungen sollte Amphotericin B daher nur bei lebensbedrohlichen Umständen verabreicht werden. Andererseits stellt es jedoch bei den durch Störungen des Immunsystems - z.B. bei AIDS oder nach Organtransplantationen - auftretenden Mykosen häufig das einzig wirksame Mittel dar.
Trotz hydrophiler Domänen innerhalb des Moleküls weist Amphotericin als ganzes ausgeprägte hydrophobe Eigenschaften auf, so daß es im physiologischen pH-Bereich in Wasser praktisch unlöslich ist. Selbst in organischen Lösungsmitteln ist es nur schwer löslich. Daher stellen die derzeitigen Handelspräparate relativ kompliziert aufgebaute Arzneiformen dar, welche mit zusätzlichen Nachteilen behaftet sind. Mit einem geeigneten Lösungsvemiittler, wie z.B. Na-Desoxycholat, läßt sich die Löslichkeit in Wasser erhöhen. So liegt z.B. das zur Infusion vorgesehene Originatorpräparat von BRISTOL-MYERS SQUIBB (in Deutschland unter der Handelsbezeichnung "Amphotericin B" erhältlich) als Trockensubstanz vor, welche in Wasser rekonstituiert werden muß und dann als mizellare Dispersion von Amphotericin B und Na-Desoxycholat in Wasser vorliegt. Um eine applikationsfertige Infusionslösung zu erhalten, kann die so erhaltene Stammlösung nur noch mit elektrolytfreien Trägerlösungen, wie z.B. einer 5% Glucoselösung, bis zur erwünschten Endkonzentration verdünnt werden.
Dieses Präparat weist zudem einen nur geringen therapeutischen Index auf, d.h. das Fenster zwischen effektiver und toxischer Dosis ist sehr schmal. Darüber hinaus ist, trotz des relativ breiten Wirkungsspektrums von Amphotericin B, dieses Präparat bei bestimmten Krankheitsbildern wenig effektiv, weil die Wirksubstanz den Ort der mykotischen Infektion nicht oder nur in zu kleinen Konzentrationen erreicht, so daß Amphotericin B dort seine charakteristische antifungale Wirkung nicht oder nur unzureichend entfalten kann.
Um diese Nachteile des Originatorpräparats zu überwinden, wurde eine Reihe von Amphotericin B-Präparaten entwickelt, welche Lipid-Formulierungen darstellen, z.B. Lipidkomplexe mit Amphotericin B, kolloide Dispersionen von Cholesterylsulfat mit Amphotericin B und liposomal verpacktes Amphotericin B. Alle diese Arzneiformen weisen zwar einen größeren therapeutischen Index und eine höhere Verträglichkeit, insbesondere eine geringere Nephrotoxizität im Vergleich mit einer herkömmlichen Amphotericin B- Desoxycholat-Formulierung auf, weshalb sie auch in höheren Dosen verabreicht werden können, dennoch lassen sich bei hohen Dosen die oben beschriebenen Nebenwirkungen nicht ganz vermeiden.
Ein gravierender Nachteil solcher Lipidformulierungen von Amphotericin B ist jedoch in den sehr hohen Herstellungkosten und den damit verbundenen Handelspreisen zu sehen. Darüber hinaus müssen diese komplizierten Arzneiformen bis zu ihrer applikationsfertigen Form nach wie vor in umständlicher Weise rekonstituiert werden. Nicht zuletzt wegen dieser Nachteile ist trotz der verbesserten therapeutischen Breite bei den Lipidformulierungen des Amphotericins B eine breite Akzeptanz auf dem Markt ausgeblieben.
Als weitere Methode, Amphotericin B in eine wasserlösliche Form für Injektionszwecke zu überführen, ist in der Literatur die Bildung eines Amphotericin B-Arabinogalactan-Konjugats beschrieben (Antimicrobial Agents and Chemotherapy, Vol. 43 No. 8, 1999, 1975-1981). Arabinogalactan ist ein aus Lärchen gewonnenes wasserlösliches Polysaccharid aus Arabinose- und Galactose-Einheiten im Verhältnis 1 :6. Die Bindung von Amphotericin B an Arabinogalactan erfolgt in 4 Schritten. Zunächst wird Arabinogalactan einer Perjodat- Oxydation unterzogen, wobei vicinale Hydroxylgruppen der Zuckereinheiten unter Ringspaltung in Dialdehyde überführt werden. Nach Reinigung der Reaktionsprodukte über eine Anionen-Austauschersäule wird die Amino-Gruppe des Mycosamins von Amphotericin B unter Bildung eines Imins (Schiffsche Base) an eine Aldehydgruppe gekoppelt und schließlich über eine Reduktion mit Hilfe von Na-Borhydrid die Imin-Gruppe in eine Amin- Gruppe sowie nicht umgesetzte Aldehydgruppen in Hydroxylgruppen überführt.
Die Kopplungsreaktion wird bei pH 11 ausgeführt. Dieser pH-Wert stellt einen Kompromiß zwischen der Ausbeute des gebildeten Konjugats einerseits und der Toxizität des Konjugats andererseits dar. Unterhalb von pH 10 ist Amphotericin B wasserunlöslich und die Ausbeuten sind gering. Ab pH 12 ist Amphotericin B relativ gut wasserlöslich, was höhere Ausbeuten eπnöglicht, aber das erhaltene Produkt ist toxisch. Toxizität war ebefalls zu beobachten, wenn der letzte Schritt der Na-Borhydrid-Reduktion unterblieb. Die Antibiotika Daunorubicin und Doxorubicin gehören zur Gruppe der Anthracycline und unterscheiden sich lediglich durch eine Hydroxylgruppe. Sie sind in Wasser löslich. Doxorubicin wird aus Kulturen des Pilzes Streptomyces peuceticus var. caesius gewonnen, Daunomycin aus Streptomyces peuceticus oder coeruleorubidus .
Figure imgf000006_0001
Daunorubicin: R = H Doxorubicin: R = OH
Durch ihren Tetracyclin-Rest sind Daunorubicin und Doxorubicin befähigt, unter Ausbildung sehr stabiler, über längere Zeit beständiger DNA-Interkalationskomplexe die DNA- und RNA-Synthese zu hemmen. Darüber hinaus bilden sie im Rahmen ihrer intrazellulären Metabolisierung mit Hilfe der Cytochrom-P-450-Reduktase und NADPH Semichinon- Radikale, welche ihrerseits weitere Radikalreaktionen auslösen (Superoxidanion- und Hadroxylradikale). Dadurch gewinnen diese Antibiotika eine ausgeprägte cytostatische Wirkung, weshalb sie als Cytostatika bei der Krebstherapie eingesetzt werden.
Da diese Antibiotika nach oraler Applikation nur unzureichend resorbiert werden, müssen sie (streng) i.v. in Kurzinfusionen über 10 bis 15 Minuten verabreicht werden. Ihre Verteilung im Organismus erfolgt schnell, wobei die höchsten Konzentrationen in Herz, Lunge, Milz und Niere nachgewiesen wurden.
Ihre schnelle Verteilung im Organismus in Verbindung mit der Bildung reaktiver Radikale durch Metabolisierung scheint eine der Ursachen für die ausgeprägten toxischen Nebenwirkungen zu sein, wodurch insbesondere das Herz in Mitleidenschaft gezogen wird. Sowohl Doxorubicin als auch Daunorubicin sind ausgesprochen kardiotoxisch. Insbesondere die Kardiotoxität vom Spättyp, welche eine dosisabhängige kumulative Organtoxizität darstellt, ist in der Regel irreversibel und oftmals lebensbedrohend. Bei Überschreiten einer maximalen kumulativen Gesamtdosis, welche bei Erwachsenen bei 550 mg/m2 Körperoberfläche liegt, steigt die Inzidenz der anthracyclininduzierten Kardiomyopathie rasch an. Daher besteht ab einer Gesamtdosis von 550 mg/m2 Körperoberfläche eine etwa 5% Risiko für das Auftreten einer schweren Herzinsuffizienz. Ist diese kumulatitive Gesamtdosis erreicht, muß die Therapie unterbrochen werden.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, für solche aminozuckerhaltigen Antibiotika Arzneiformen zur Verfügung zu stellen, in welchen die spezifischen toxischen Nebenwirkungen reduziert sind, welche eine gleichmäßigere, kontrollierte Verbreitung im Organismus gewährleisten und damit eine höhere Dosierung zulassen und welche dennoch einfach anzuwenden sind. Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, ein kostengünstiges Verfahren zur Herstellung dieser Arzneiformen mit hoher Ausbeute zur Verfügung zu stellen.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß sich diese Aufgaben mit einem Konjugat von
Stärke oder Stärkederivaten mit solchen Antibiotika lösen läßt. Die erfindungsgemäße
Arznei form ist ein wasserlösliches, einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum-Derivat in
Form eines Polysaccharid-Konjugats der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000007_0001
H2C-O-R2 in welcher bedeuten:
B = ein in α-7,4-Verknüpfung verbundenes Polymer, ausgewählt aus der Gruppe
Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke, lösliche Amylose, lösliche Amylose in hydroxyethylierter und/oder hydroxypropylierter Form, lösliches Amylopektin, und lösliches Amylopektin in hydroxyethylierter und/oder hydroxypropylierter Form, R2 oder B,
Figure imgf000008_0001
CH3 R\ R4 unabhängig voneinander H, (CH,)2-OH oder CH2— CH
Figure imgf000008_0002
mit den Bedingungen, daß
B = Amylose oder Amylopektin ist, wenn R2 = R3 = R4 = H B = Hydroxyethylstärke, hydoxyethyliertes Amylopektin oder hydroxyethylierte Amylose ist, wenn R2, R3 ,R4 = (CH2),-OH sind, B = Hydroxypropylstärke, hydroxypropyliertes Amylopektin oder
CH, hydroxypropylierte Amylose ist, wenn R2, R3 , R4 = CH2— CH sind; ό )Hl
Figure imgf000008_0003
oder
Figure imgf000008_0004
und
Figure imgf000008_0005
mit der Bedingung, daß wenn
Figure imgf000009_0001
und wenn
Figure imgf000009_0002
wobei der Polysaccharidanteil des Konjugats mit der Aminogruppe an C3 des Aminozuckers des Antibiotikums unter Ausbildung einer Peptidbindung verknüpft ist.
Als Stärke oder Stärkederivate kommen Amylose (unverzweigt nur mit α-l,4-glykosidischer Verknüpfung) und/oder Amylopektin (verzweigt, zusätzlich mit α-l,6-glykosidischer Verknüpfung) sowie insbesondere hydroxyalkylierte Stärke in Betracht. Bei Verwendung von Amylose oder Amylopektin wird im Handel erhältliche sog. "lösliche" Stärke eingesetzt. Letztere kann auch in hydroxyethylierter und hydroxypropylierter Form vorliegen.
Bei dem erfindungsgemäß bevorzugten Einsatz der hydroxyalkylierten Stärken Hydroxyethylstärke und Hydroxypropylstärke kann das mittlere Molekulargewicht (Gew.- Mittel Mw) im Bereich zwischen 2000 und 2 • 106 Dalton liegen. Der mittlere Poymerisationsgrad soll jedoch mindestens 15 betragen und in einer bevorzugten Ausführungsform bis ca 3000 reichen (entsprechend einem mittleren Molekulargewicht von ca. 5 • lO5). Insbesondere bevorzugt ist der Einsatz von Hydroxyethylstärke.
Die im Folgenden gemachten Ausführungen mit Hydroxyethylstärke als besonders bevorzugter Ausführungsform gelten in anloger Weise auch für Hydroxypropylstärke.
Bevorzugt soll in einem erfindungsgemäßen Antibiotikum-HES-Konjugat das Molekulargewicht der HES über der Nierenschwelle für HES liegen, d.h. über 70000 Dalton. Besonders bevorzugt ist eine HES der Spezifikation 130/ mit einem mittleren Molekulargewicht von 130000 Dalton. Der Substitutionsgrad MS liegt vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 0,8. In bevorzugter Ausführungsform liegt der Substitutionsgrad im Bereich von 0,3 bis 0, 5. Das bevorzugte C2/C6- Verhältnis liegt im Bereich von 2 bis 12, in besonders bevorzugter Ausführungsform im Bereich von 5 bis 11. Dabei kann HES sowohl unverzweigt nur mit überwiegend α-l,4-glykosidischen Verknüpfungen vorliegen als auch verzweigt mit sowohl α-l,4-glykosidischen Verknüpfungen als auch α-l,6-glykosidischen Verknüpfungen.
In einem erfindungsgemäßen Konjugat erfolgt verfahrensmäßig die Bindung des Polysaccharids an die Aminogruppe des Aminozuckers des Antibiotikums, indem die freie, reduzierende Aldehydgruppe des endständigen Polysaccharid-Moleküls , vorzugsweise mit J2 zu einer Aldonsäuregruppe oxydiert wird, welche ihrerseits mit einer freien Hydroxylgruppe der endständigen Zuckereinheit, vorzugsweise am C4-Atom der endständigen Zuckereinheit, einen Lactonring ausbildet, der dann weiter mit der Aminogruppe des Aminozuckers des Antibiotikums eine Peptidbindung eingehen kann. Im Gegensatz zur Bildung einer Schiffschen Base aus den von einer Perjodat-Oxidation stammenden Aldehydresten des Arabinogalactans mit der Aminogruppe des Aminozuckers läßt sich die erfindungsgemäße Kopplungsreaktion des Oxydationsprodukts am reduzierenden Ende von HES mit der Aminogruppe des Aminozuckers (z.B. Mycosamin im Falle von Amphotericin B) mit großer Ausbeute in einem organischen Lösungsmittel, z.B. DMSO, ausführen, in welchem z.B. das Antibiotikum Amphotericin B löslich ist. (St
Figure imgf000011_0001
(Amp o-HES)
Diese Kopplungsreaktion erwies sich als außerordentlich selektiv und führte mit hoher Ausbeute zu einem Antibiotikum-Stärke-Konjugat, welches, anders als bei einer Perjodatoxidation, ein Molverhältnis zwischen Antibiotikum und Polysaccharid von 1 :1 ergibt.
Das erhaltene Konjugat erwies sich überraschenderweise auch als nicht toxisch, so daß es auch oral applizierbar ist. Die Kopplung des Polysaccharid-Trägers, insbesondere von HES, an das Antibiotikum bewirkte auch im Falle des an sich wasserunlöslichen Amphotericin B, daß das Konjugat insgesamt über eine ausreichende Wasserlöslichkeit verfügt. Dies hat zur Folge, daß die Lösung des Konjugats bzw. die Verdünnung auf die gewünschte applizierbare Endkonzentration auch mit elektrolythaltigen Lösungsmitteln bzw. Gemischen (z.B. einer Mischung aus isotonischer Kochsalzlösung und Glucoselösung) erfolgen kann. Da außerdem das erhaltene Konjugat nicht mehr toxisch ist, lassen sich damit höhere Dosen, z.B. für das Amphotericin B-Konjugat Tagesdosen bis zu 15 mg Amphotericin B-Anteil, applizieren.
Weil Hydroxyethylstärke ohnedies in großen Dosen intravenös als Plasmaexpander appliziert werden kann, sind bei der Kopplung von HES und Amphotericin B nicht umgesetzte Anteile von HES physiologisch unbedenklich und brauchen daher nicht eigens vom Reaktionsprodukt abgetrennt zu werden, was bei der Synthese von großem ökonomischem Vorteil ist. Im Falle des Amphotericin B ist auch keine abschließende Hydrierung erforderlich, um das gebildete Konjugat weniger toxisch zu machen. Darüber hinaus wurde überraschenderwiese gefunden, daß ungebundene Hydroxyethylstärke an sich auf Amphotericin B sogar eine solubilisierende Wirkung ausübt, wodurch sich mit überschüssiger HES eine zusätzliche Stabilisierung des antimykotischen Wirkstoffs erzielen läßt.
Ein weiterer Vorteil eines erfindungsgemäßen Antibiotikum-HES-Konjugats besteht darin, daß der Polysccharid- Anteil durch Serum-α-Amylase abbaubar ist. Dieser Abbau ist in der einschlägigen Literatur zur Pharmokokinetik der als Plasmaexpander eingesetzten HES ausführlich beschrieben. Darüber hinaus ist auch die Peptidbindung zwischen dem Polysaccharid- Anteil und dem Antibiotikum in vivo einem enzymatischen Angriff prinzipiell zugänglich.
Wie sich aus Untersuchungen an dem als Leit-Mikroorganismus aus dem Spektrum der möglichen Pilzinfektionskeime bekannten Candida albicans zeigte, wiesen die erfindungsgemäßen Konjugate von Amphotericin B den Lipidformulierungen vergleichbare Wirksamkeiten auf. Im Hämolysetest an Schafserythrocyten konnte demonstriert werden, daß die in-vitro-Toxizität eines Amphotericin B-HES-Konjugats wesentlich geringer ist als bei handelsüblichen Amphotericin B-Desoxycholat-Formulierungen.
Ein maßgeblicher Vorteil eines erfindungsgemäßen Antibiotikum-HES-Konjugats ist darin zu sehen, daß sich durch geeignete Auswahl von Molekulargewicht, Substitutionsgrad, Substitutionsmuster und Verzweigungsgrad der eingesetzten HES die pharmakokinetischen Eigenschaften des erhaltenen Konjugats praktisch maßgeschneidert auf die Bedürfnisse eines jeweiligen Patienten einstellen lassen.
In den folgenden Beispielen wird das Herstellungsverfahren und die hämolytische Wirkung der bevorzugten Antibiotikum-HES-Konjugate näher erläutert.
Beispiel 1
Oxydation von HES 130kD:
10 g HES (130kD) werden in ein Reaktionsgefäß gegeben und in einem möglichst geringen Volumen Wasser in Lösung gebracht. Zu dieser Lösung werden unter Rühren (Magnetrührer) 2 ml einer 0, 1 N Jod-Lösung ca. 3 ml einer 0,1N NaOH-Lösung gegeben. Die Mischung wird solange gerührt, bis die Farbe, die J2 anzeigt, verschwunden ist. Die Zugabe von Jod-Lösung und/oder NaOH-Lösung wird mehrmals wiederholt bis insgesamt 10 ml 0,1N Jod-Lösung und 20 ml 0,1 N NaOH-Lösung zugegeben worden sind. Die erhaltenen Lösung wird sodann über eine H+-Ionenaustauschersäule (Amberlite IR 120) gegeben und anschließend in einem Dialyseschlauch mit einer Ausschlußgrenze von 4-6 kD über einen Zeitraum von 20 h gegen destilliertes Wasser dialysiert. Das dialysierte Podukt wird lyophilisiert und der Oxidationsgrad mit Hilfe der Methode von SOMOGYI ermittelt.
Ermittlung des Oxidationsgrades:
Zur Bestimmung des gebildeten oxydierten HES (ox-HES) wurde das Verfahren von SOMOGYI herangezogen (Meth. Carbohydrate Chem., 1, 384-386, 1962). Das Verfahren beruht auf der Ermittlung der freien Aldehyd-Gruppen über die Reduktion von Cu2+ zu Cu+. Cuτ wird mit Hilfe von aus Iodid und Iodat gebildetem Iod wieder zu Cu2+ oxidiert. Überschüssiges Iod wird sodann mittels Thiosulfat titriert.
Beispiel 2
Synthese eines Amphotericin B-HES-Konjugats:
In einem Reaktionsgefäß werden 650 mg (1,5 • 10"5 Mol) getrocknetes ox-HES (130 kD, Oxidationsgrad ca. 100%) und 2,8 mg (3,0* 10"6 Mol) Amphotericin B unter Rühren (Magnetrührer) in ca. 4 ml wasserfreiem DMSO bei Raumtemperatur unter N2-Atmosphäre gelöst. Unter Lichtausschluß wird die Mischung 24 h lang bei 70°C reagieren gelassen. Die Aufarbeitung des Reaktionsprodukts erfolgt unter Lichtausschluß nach Zugabe von 10 Vol. H20 mittels Dialyse gegen H,0 über einen Zeitraum von 48 h bei 4°C unter 4-maligem Wechseln des Wassers. Das anschließend lyophilisierte Produkt ergab ein schwach gelbliches Pulver.
Das Kopplungsverfahren wurde mit 3 weiteren Ansätzen wiederholt, wobei sich eine reproduzierbare Ausbeute für die Kopplungsreaktion von > 90% ergab. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 wiedergegeben. (Die in dieser Tabelle in der letzten Spalte angegebenen Ausbeutemengen beziehen sich auf das Kopplungsprodukt plus nicht umgesetzter HES). Tabelle 1
Figure imgf000014_0001
Die erhaltenen Amphotericin B-HES-Konjugate wurden über ihr UV-Spektrum charakterisiert (0,5 g / 5 ml H2Odcst) und zeigten im Bereich von 300-400 nm die für polymere bzw. mizellare Wechselwirkungen von Amphotericin B typischen Banden. Im Gegensatz zu freiem Amphotericin B, das in Wasser praktisch unlöslich ist, wiesen die erhaltenen Amphotericin- HES-Konjugate eine Wasserlöslichkeit von > 0,1 g / 5 ml H20 auf.
Mit Hilfe von LALLS-GPC (Low Angle Laser Light Scattering in Kombination mit Gel- Peπneations-Chromatographie) wurden folgende GPC-Kenndaten bestimmt:
Gewichtsgemitteltes Molekulargewicht Mw: 102.700
Zahlenmittel des Molekulargewichts: 36.050
Spitzenfraktion (10%): 24.050
Bodenfraktion (90%): 13.800
Diese Kenndaten entsprachen im wesentlichen den Kenndaten der verwendeten HES.
Beispiel 3
Hämolyse-Vergleichstest des Amphotericin B -HES -Konjugats:
Die hämolytische Wirkung des erfindungsgemäßen Ampho-HES-Präpararts wurde im Vergleich mit einer handelsüblichen Amphotericin B-Desoxycholat-Formulierung ("Amphotericin B" von Bristol-Meyers-Squibb, Chargen-Bezeichnung: A068), dessen Wirkstoff ab einer Konzentration von 8 μg/ml hämolytisch sein soll (R. Fal et al., Anti icrobial Agents and Chemotherapy, 1999, 1975-1981), ermittelt.
Stammlösung für erfindungsgemäßes Präparat: 1 1,61 g Ampho-HES (entsprechend einem Gewichtsanteil von 50 mg Amphotericin B) wurden in 50 ml 5% Glucose-Lösung (Chargenbez.: 9233A4 der Fa. Braun Melsungen) gelöst. Der Wirkstoffgehalt der so hergestellten Stammlösung betrug 1 mg Amphotericin B pro ml. Von dieser Stammlösung wurden gemäß Tabelle 2 drei Verdünnungen hergestellt und ebenfalls auf ihre hämolytische Wirkung untersucht.
Handelsübliches Vergleichspräparat (Amphotericin B-Desoxycholat-Formulierung): Eine Flasche ä 50 mg wurde mit 10 ml A. a. injectabilia (Chargenbez.: 0514A63 der Fa. Braun Melsungen) gelöst und in 5% Glucoselösung auf 0,12 mg/ml Amphotericin B verdünnt.
Herstellung der Erythrocytensuspension: Frisch entnommenes humanes Blut wurde etwa mit dem 5-fachen Volumen steriler 0,9 % NaCl-Lösung (Chargenbez.: 9055A64 der Fa. Braun Melsungen) verdünnt und 5 Minuten lang bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 2000 zentrifugiert. Danach wurde die überstehende Lösung abgesaugt und die sedimentierten Erythrocyten noch zweimal auf die gleiche Weise behandelt.
Die so gewaschenen Erythrocyten wurden in einer Neubauer-Zählkammer ausgezählt und - sofern erforderlich - mit steriler 0,9% NaCl-Lösung auf eine Endkonzentration von ca. 5 • 108 Erythrocyten pro ml nachverdünnt. Diese Suspension ist laut DIN-Morm bei Raumtemperatur bis zu max. 6 Stunden verwendbar.
Hämolyse- Vergleichstest: Je 5 ml der zu prüfenden Lösungen wurden mit 1 ml der obigen Erythrocytensuspension vermischt, in ein gereinigtes Zentrifugenröhrchen überfuhrt und 20 Minuten lang in einem Wasserbad bei 37 ± 1°C inkubiert. Anschließend wurde 5 Minuten bei einer relativen Zentrifugalbeschleunigung von 2000 zentrifugiert.
Von der überstehenden Flüssigkeit wurde die Extinktion gemessen. Als Negativkontrollen dienten jeweils 5 ml der 0,9% NaCl-Lösung und der 5% Glucose-Lösung, welche mit 1 ml der Erythrocytensuspension vermischt, ebenfalls 20 Minuten lang bei 37 ± 1°C inkubiert und dann wie oben zentrifugiert wurden.
Zur Prüfung auf Hämolyse wurden in einem Photometer die Extinktionen der jeweiligen Überstände gegen die Negativkontrollen bei einer Wellenlänge von 576 nm unter Verwendung einer Küvette mit 10 mm Schichtdicke gemessen. Auf Grund der unterschiedlichen Färbungen der Lösungen wurden zum Vergleich von den Lösungen ohne Erythrocytensuspension ebenfalls die Extinktion gemessen.
Die Ergebnisse der diversen Testansätze sind in Tabelle 2 zusammengefaßt.
Tabelle 2
Figure imgf000016_0001
' ) Lösungen im Überstand rot gefärbt
**') Wegen erhöhter Viskosität nach Zentrifugieren noch intakte Erythrocyten im Überstand mikroskopisch nachweisbar
Wie aus Tabelle 2 ersichtlich, zeigt die getestete, im Handel erhältliche Amphotericin B- Desoxycholat-Formulierung bereits bei einer Konzentration von 0,1 mg/ml im Testansatz unter den obigen Testbhedingungen stark hämolytische Wirkung. Der Überstand hatte bei 576 nm eine Extinktion von 2,271 und war stark rot gefärbt.
Im Vergleich dazu war beim erfϊndungsgemäßen Ampho-HES-Präparat bis zu einer Konzentration von 0,2 mg Amphotericin B pro ml keine hämolytische Wirkung zu beobachten. Erst bei einer Konzentration von 0,4 mg/ml war im Überstand des Testansatzes im Vergleich mit der Negativkontrolle eine leichte Rotfärbung zu erkennen, was sich auch in den Extinktionswerten bemerkbar machte. Bei dieser Amphotericin B-Konzentration im Testansatz liegt demnach eine leichte hämolytische Wirksamkeit vor. Eine starke hämolytische Wirksamkeit durch das Testpräparat war bei einer Konzentration von 0,83 mg/ml zu erkennen, wo der Überstand stark rot gefärbt war. Daneben ließen sich im Überstand auch noch mikroskopisch wenige intakte Erythrocyten nachweisen, die wegen der hohen Viskosität während der Sedimentationszeit noch nicht ins Pellet sedimentieren konnten.
Beispiel 4
Synthese eines Daunorubicin-HES-Konjugats:
In einem Reaktionsgefäß wurden 650 mg (1,5 • 10"5 Mol) getrocknetes ox-HES (130 kD, Oxidationsgrad ca. 100%) und 0,8 mg (3,0 * 10'6 Mol) Daunorubicin unter denselben Verfahrenbedingen wie in Beispiel 2 reagieren gelassen und wie in Beispiel 2 weiterbehandelt. Auch hier wurde eine reproduzierbare Ausbeute von ca 72 % erhalten.
Beispiel 5
Synthese eines Doxorubicin-HES-Konjugats:
In einem Reaktionsgefäß wurden 650 mg (1,5 • 10"5 Mol) getrocknetes ox-HES (130 kD, Oxidationsgrad ca. 100%) und 0,8 mg (3,0 * 10"6 Mol) Doxorubicin unter denselben Verfahrenbedingen wie in Beispiel 2 reagieren gelassen und wie in Beispiel 2 weiterbehandelt. Die erzielte Ausbeute betrug ebenfalls ca. 70 %.

Claims

Patentansprüche
1. Wasserlösliches einen Aminozucker aufweisendes Antibiotikum-Derivat in Form eines Polysaccharid-Konjugats der allgemeinen Formel (I)
Figure imgf000018_0001
in welcher bedeuten:
B = ein in a-1, ^-Verknüpfung verbundenes Polymer, ausgewählt aus der Gruppe
Hydroxyethylstärke, Hydroxypropylstärke, lösliche Amylose, lösliche Amylose in hydroxyethylierter und/oder hydroxypropylierter Form, lösliches Amylopektin, und lösliches Amylopektin in hydroxyethylierter und/oder hydroxypropylierter Form,
R2 = H, (CH,)--OH, oder B,
Figure imgf000018_0002
R3, K unabhängig voneinander H, (CH2)2-OH oder
Figure imgf000018_0003
mit den Bedingungen, daß
B = Amylose oder Amylopektin ist, wenn R2 = R3 = R4= H B = Hydroxyethylstärke, hydoxyethyliertes Amylopektin oder hydroxyethylierte Amylose ist, wenn R2, R3 , R4 = (CH2)2-OH sind, B = Hydroxypropylstärke, hydroxypropyliertes Amylopektin oder
hydroxypropylierte Amylose ist, wenn R2, R3 , R4 = smd;
Figure imgf000018_0004
Figure imgf000019_0001
oder
Figure imgf000019_0002
und
Figure imgf000019_0003
mit der Bedingung, daß wenn
Figure imgf000019_0004
und wenn
Figure imgf000019_0005
Figure imgf000020_0001
wobei der Polysaccharidanteil des Konjugats mit der Aminogruppe an C3 des Aminozuckers des Antibiotikums unter Ausbildung einer Peptidbindung verknüpft ist.
2. Antibiotikum-Derivat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Molverhältnis zwischen dem Antibiotikum- und Polysaccharidanteil 1 :1 ist.
3. Antibiotikum-Derivat nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Polysaccharidanteil aus Hydroxyethylstärke besteht.
4. Antibiotikum-Derivat nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das mittlere Molekulargewicht der Hydroxyethylstärke im Bereich zwischen 2000 und 2 • 106 Dalton liegt.
5. Antibiotikum-Derivat nach den Ansprüchen 3 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke einen mittleren Polymerisationsgrad von mindestens 15 aufweist.
6. Antibiotikum-Derivat nach den Ansprüchen 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das mittlere Molekulargeicht der Hydroxyethylstärke > 70000 Dalton ist.
7. Antibiotikum-Derivat nach den Ansprüchen 3 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke die Spezifikation 130/ und einen Substitutionsgrad MS im Bereich von 0,1 bis 0,8 aufweist.
8. Antibiotikum-Derivat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke einen Substitutionsgrad MS im Bereich von 0,3 bis 0,5 aufweist.
9. Antibiotikum-Derivat nach jedem der Ansprüche 3 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke ein C2/C6-Substitutionsverhältnis im Bereich von 2 bis 12 aufweist.
10. Antibiotikum-Derivat nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke ein C2/C6-Substitutionsverhältnis im Bereich von von 5 bis 1 1 aufweist.
1 1. Antibiotikum-Derivat nach jedem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke unverzweigt in α-l,4-glykosidischer Verknüpfung vorliegt.
12. Antibiotikum-Derivat nach jedem der Ansprüche 3 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Hydroxyethylstärke verzweigt mit α-l,4-glykosidischer Verknüpfung und αr-1,6- glykosidischer Verknüpfung vorliegt.
13. Antibiotikum-Derivat nach jedem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum Amphotericin B ist.
14. Antibiotikum-Derivat nach jedem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum Daunorubicin ist.
15. Antibiotikum-Derivat nach jedem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Antibiotikum Doxorubicin ist.
16. Verfahren zur Herstellung eines Antibiotikum-Polysaccharid-Konjugats nach jedem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, das Polysaccharid an seinem reduzierenden Ende in wässriger alkalischer Lösung unter Ausbildung eines Lacton-Rings oxidiert wird und das erhaltene Produkt zusammen mit dem einen Aminozucker aufweisenden Antibiotikum zur Bildung enes Antibiotikum-Polysaccharid-Konjugats in einem organischen Lösungsmittel reagieren gelassen wird.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Oxidation des Polysaccharids am reduzierenden Ende mit J2 erfolgt.
18. Verfahren nach den Ansprüchen 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Kopplung des oxidierten Polysaccharids an das Antibiotikum in einem organischen Lösungsmittel erfolgt.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß als organisches Lösungsmittel Dimethylsulfoxid eingesetzt wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet daß als Polysaccharid Stärke oder eine Stärkederivat eingesetzt wird.
21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß Hydroxyethylstärke eingesetzt wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß Hydroxyethylstärke mit einem mittleren Molekulargewicht im Bereich zwischen 2000 und 2 • 106 Dalton eingesetzt wird.
23. Verfahren nach den Ansprüchen 21 und 22, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hydroxyethylstärke mit einem mittleren Polymerisationsgrad von mindestens 15 eingesetzt wird.
24. Verfahren nach den Ansprüchen 21 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hydroxyethylstärke mit einem mittleren Molekulargewicht von > 70000 Dalton eingesetzt wird.
25. Verfahren nach den Ansprüchen 21 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hydroxyethylstärke mit der Spezifikation 130/ und einem Substitutionsgrad MS im Bereich von 0,1 bis 0,8 eingesetzt wird.
26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hydroxyethylstärke mit einem einem Substitutionsgrad MS im Bereich von 0,3 bis 0,5 eingesetzt wird.
27. Verfahren nach jedem der Ansprüche 21 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hydroxyethylstärke mit einem C,/C6-Substitutionsverhältnis im Bereich von 2 bis 12 eingesetzt wird.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß eine Hydroxyethylstärke mit einem C2/C6-Substitutionsverhältnis im Bereich von 5 bis 11 eingesetzt wird.
29. Verfahren nach jedem der Ansprüche 21 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß eine unverzweigte Hydroxyethylstärke mit «-1,4-glykosidischer Verknüpfung eingesetzt wird.
30. Verfahren nach jedem der Ansprüche 21 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß eine verzweigte Hydroxyethylstärke mit or-l,4-glykosidischer Verknüpfung und α-1,6- glykosidischer Verknüpfung eingesetzt wird.
31. Verfahren nach jedem der Ansprüche 21 bis 30, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle der Hydroxyethylstärke Hydroxypropylstärke eingesetzt wird.
32. Verfahren nach jedem der Ansprüche 16 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß als Antibiotikum Amphotericin B eingesetzt wird.
33. Verfahren nach jedem der Ansprüche 16 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß als Antibiotikum Amphotericin B eingesetzt wird.
34. Verfahren nach jedem der Ansprüche 16 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß als Antibiotikum Daunorubicin eingesetzt wird.
35. Verfahren nach jedem der Ansprüche 16 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß als Antibiotikum Doxorubicin eingesetzt wird.
36. Verwendung eines Stärkederivats zur Herstellung eines Amphoceritin B-Konjugats zur systemischen Behandlung mykotischer Infektionen.
37. Verwendung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Stärkederivat Hydroxyethylstärke ist.
38. Verwendung nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Stärkederivat Hydroxypropylstärke ist.
39. Verwendung eines Stärkederivats zur Herstellung eines Daunorubicin-Konjugats zum Einsatz in der Krebstherapie.
40. Verwendung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß das Stärkederivat Hydroxyethylstärke ist.
41. Verwendung nach Anspruch 39, dadurch gekennzeichnet, daß das Stärkederivat Hydroxypropylstärke ist.
42. Verwendung eines Stärkederivats zur Herstellung eines Doxorubicin-Konjugats zum Einsatz in der Krebstherapie.
43. Verwendung nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß das Stärkederivat Hydroxyethylstärke ist.
44. Verwendung nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß das Stärkederivat Hydroxypropylstärke ist.
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