EA013910B1

EA013910B1 - Конъюгаты гидроксиалкилкрахмала и действующего вещества, полученные химическим лигированием через тиазолидин

Info

Publication number: EA013910B1
Application number: EA200800822A
Authority: EA
Inventors: Норберт Цандер; Хельмут Кноллер
Original assignee: Фрезениус Каби Дойчланд Гмбх
Priority date: 2005-09-12
Filing date: 2006-09-12
Publication date: 2010-08-30
Also published as: JP2009507973A; KR20080065602A; JP5242398B2; WO2007031266A2; BRPI0615732A2; AU2006291527B2; CN102492047A; WO2007031266A3; EP1933878B1; EA200800822A1; CN101262889B; ATE543515T1; HK1119395A1; ES2382303T3; AU2006291527A1; ZA200802252B; EP1933878A2; IL189466A0; US20080207562A1; EP1762250A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к способу получения конъюгатов действующего вещества и гидроксиалкилкрахмала и к конъюгатам действующего вещества и гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, где конъюгаты получают путем ковалентного связывания гидроксиалкилкрахмала и действующего вещества с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I), (I'), (I''), в которой R, R, R, R, Rи Rнезависимо выбирают из группы, состоящей из водорода, необязательно подходящим образом замещенной, линейной, циклической и/или разветвленной алкильной, арильной, гетероарильной, аралкильной и гетероаралкильной группы, предпочтительно водорода.

Description

Настоящее изобретение относится к способу получения конъюгатов действующего вещества и гидроксиалкилкрахмала и к конъюгатам действующего вещества и гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, где конъюгаты получают путем ковалентного связывания гидроксиалкилкрахмала и действующего вещества с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I)

или формулы (I') или формулы (I) где Κι, К₂, Кг', К₃, К₃' и К₄ независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, необязательно подходящим образом замещенной, линейной, циклической и/или разветвленной алкильной, арильной, гетероарильной, аралкильной и гетероаралкильной группы, предпочтительно водорода.

В УО 03/031581 А2 описан способ конъюгирования производного полимера с полипептидом, имеющим на Ν-конце цистеиновый или гистидиновый остаток, где указанный способ содержит получение полипептида, имеющего на Ν-конце цистеиновый или гистидиновый остаток, получение полимера, оканчивающегося тиоэфирной группой, полимера, включающего водорастворимый и непептидный каркас полимера, предпочтительно полиэтиленгликолевого полимера, и взаимодействие производного полимера и полипептида. В качестве полимеров используются поли(алкиленгликоль), сополимеры этиленгликоля и пропиленгликоля, поли(оксиэтилированный полиол), поли(олефиновый спирт), поли(винилпирролидон), поли(альфа-гидроксильная кислота), поли(виниловый спирт), полифосфазен, полиоксазолин, поли(№акрилоилморфолин), полиакрилат, полиакриламиды, полисахариды и сополимеры, тройные сополимеры и их смеси. Все подробно описанные полимеры являются полиэтиленгликолевыми полимерами.

Несмотря на прогресс способов связывания и использование монофункциональных РЕО-молекул, основной недостаток пегилированных лекарственных препаратов заключается в том, что путь метаболизма РЕО, как искусственного полимера, точно не известен.

Далее, из 1. Ат. Сйст. Зое., 1995, 117, 3893-3899 известен общий подход для образования пептидных дендримеров с оксимным, гидразоновым и тиазолидиновым звеньями. В указанном документе описаны в качестве строительных блоков незащищенные пептиды и селективное лигирование между альдегидом и слабым основанием.

В УО 99/07719 А1 раскрывают пролекарства и конъюгаты тиол- и селеонолсодержащих соединений и способы их использования. В числе некоторых других соединений описывают пролекарство, которое получают путем взаимодействия этилового эфира Ь-цистеина и моносахарида Ό-рибозы, указанное пролекарство содержит тиазолидиновое кольцо. В качестве общей формулы моносахарида раскрыт (СНОН)_ПСН₂ОН с п=1-5. Совместно с образованием тиазолидиновых колец раскрыты не только дисахариды, не говоря уже о высокомолекулярных полимерных соединениях, таких как крахмал, в частности гидроксиалкилкрахмале.

Поэтому целью настоящего изобретения является получение новых конъюгатов действующего вещества и полимера, образованных ковалентной связью, в которых в качестве полимера использовался бы не полиалкиленгликоль, конкретно не полиэтиленгликоль.

Соответственно, другой целью настоящего изобретения было создание способа получения этих конъюгатов.

Решением этого вопроса является способ получения конъюгата действующего вещества и гидро

- 1 013910 ксиалкилкрахмала, в котором действующее вещество и гидроксиалкилкрахмал ковалентно связывают с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I)

или формулы (I') или формулы (I)

где Κι, К₂, К₂', К₃, К₃' и Кц независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, необязательно подходящим образом замещенной, линейной, циклической и/или разветвленной алкильной, арильной, гетероарильной, аралкильной и гетероаралкильной группы, предпочтительно водорода, указанный способ включает:

(А) взаимодействие альдегидной группы, кетогруппы или полуацетальной группы гидроксиалкил крахмала или его производного, содержащего указанную альдегидную группу, кетогруппу или полуацетальную группу, с альфа-8Н-бета-аминогруппой

действующего вещества или его производного, содержащего указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, таким образом получая конъюгат указанного действующего вещества и указанного гидроксиалкилкрахмала, ковалентно связанных с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I); или с альфа-8Н-бета-аминогруппой

К₃ К,

Н8—--ΝΗΒ,

К₃' действующего вещества или его производного, содержащего указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, таким образом получая конъюгат указанного действующего вещества и указанного гидроксиалкилкрахмала, ковалентно связанных с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I'); или с альфа-8Н-бета-аминогруппой

Н8—- I......ΝΗ—в₃- Кф действующего вещества или его производного, содержащего указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, таким образом получая конъюгат указанного действующего вещества и указанного гидроксиалкилкрахмала, ковалентно связанных с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I''), где Κι, К₂, К₂', К₃, К₃' и К такие же, как определены выше; или (В) взаимодействие альдегидной группы, кетогруппы или полуацетальной группы действующего вещества или его производного, содержащего указанную альдегидную группу, кетогруппу или полуацетальную группу, с альфа-8Н-бета-аминогруппой

- 2 013910

К, Ъ

Н8--1—·ΝΗΚ.₁ производного гидроксиалкилкрахмала, содержащего указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, таким образом получая конъюгат указанного действующего вещества и указанного гидроксиалкилкрахмала, ковалентно связанных с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I); или с альфа-8Нбета-аминогруппой

Ид—Б--ΝΗΚ₁ ^Кз' производного гидроксиалкилкрахмала, содержащего указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, таким образом получая конъюгат указанного действующего вещества и указанного гидроксиалкилкрахмала, ковалентно связанных с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I'); или с альфа8Н-бета-аминогруппой *з Ъ

Н8—4--ь- ΝΗ—

Кз’ производного гидроксиалкилкрахмала, содержащего указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, таким образом получая конъюгат указанного действующего вещества и указанного гидроксиалкилкрахмала, ковалентно связанных с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I''), где Κι, К₂, К₂', К₃, Κ₃' и К₄ такие же, как определены выше.

Поэтому используемый в контексте настоящего изобретения термин альфа-8Н-бета-аминогруппа относится к этиленовой группе, в которой с одним атомом углерода связана необязательно защищенная 8Н-группа, а с соседним атомом углерода связана необязательно защищенная первичная или вторичная аминогруппа. Связями в вышерассмотренных формулах, у которых на одном из концов отсутствует остаток, являются такие связи, к которым присоединяются либо гидроксиалкилкрахмал, либо действующее вещество.

Используемый в контексте изобретения термин алкил предпочтительно относится к алкильной группе, имеющей от 1 до 20, более предпочтительно от 1 до 10, в частности от 1 до 4 атомов углерода, за исключением случаев, особо указанных в настоящем описании ниже.

Используемый в контексте изобретения термин арил предпочтительно относится к арильную группе, имеющей от 6 до 20, более предпочтительно от 6 до 14, в частности 6 атомов углерода, за исключением случаев, особо указанных в настоящем описании ниже.

Используемый в контексте изобретения термин гетероарил предпочтительно относится к гетероарильной группе, имеющей от 6 до 20, более предпочтительно от 6 до 14, в частности 6 атомов углерода, в которой по меньшей мере один, предпочтительно от 1 до 3, в частности 1 из атомов углерода замещается гетероатомом, таким как 8, N и/или О, за исключением случаев, особо указанных в настоящем описании ниже.

Используемый в контексте изобретения термин аралкил предпочтительно относится к арильной группе, связанной через алкильную группу с указанным соединением, за исключением случаев, особо указанных в настоящем описании ниже.

Используемый в контексте изобретения термин алкарил предпочтительно относится к алкильной группе, связанной через арильную группу с указанным соединением, за исключением случаев, особо указанных в настоящем описании ниже.

Используемый в контексте изобретения термин гетероаралкил предпочтительно относится к гетероарильной группе, связанной через арильную группу с указанным соединением, за исключением случаев, особо указанных в настоящем описании ниже.

Используемый в контексте изобретения термин необязательно подходящим образом замещенный предпочтительно означает, что существует от 1 до 10, более предпочтительно от 1 до 4, в частности 1 заместитель, за исключением случаев, особо указанных в настоящем описании ниже.

Используемый в контексте изобретения термин действующее вещество относится к веществу, которое может воздействовать на какое-либо физическое или биохимическое свойство биологического организма, включая, но ими не ограничиваясь, вирусы, бактерии, грибы, растения, животных и людей. В частности, используемый в контексте изобретения термин действующее вещество относится к веществу, предназначенному для диагностики, лечения, смягчения симптомов или профилактики заболевания у людей и животных или же для улучшения физического или психического здоровья людей или животных. Примерами действующих веществ являются, но ими не ограничиваются, пептиды, белки, ферменты, низкомолекулярные лекарственные препараты, красители, липиды, нуклеозиды, нуклеотиды, олигонуклеотиды, полинуклеотиды, нуклеиновые кислоты, клетки, вирусы, липосомы, микрочастицы и мицеллы.

- 3 013910

Примерами белков являются, но ими не ограничиваются, эритропоэтин (ЕРО), такой как рекомбинантный ЕРО человека (гйЕРО), колониестимулирующие факторы (С8Е), такие как С-С8Е, подобный рекомбинантному С-С8Е человека (ЛС-С8Е), альфа-интерферон (ΙΕΝ а1рПа), бета-интерферон (ΙΕΝ Ье1а) или гамма-интерферон (ΙΕΝ датта), такие как рекомбинантный ΙΕΝ а1рПа человека или ΙΕΝ Ье1а (ιΊιΙΡΝ а1рПа или ιΊιΙΡΝ Ьс1а). интерлейкины, например от ЕЪ-1 до Ш-18, такие как Ш-2 или Ш-3, подобные рекомбинантным Ш-2 или Ш-3 человека (гЫЬ-2 или гЫЬ-3), белки сыворотки, такие как факторы свертывания ΙΙ-ΧΙΙΙ, подобные фактору УШ, альфа 1-антитрипсин (А1АТ), активированный белок С (АРС), активаторы плазминогена, такие как тканеспецифический активатор плазминогена (!РА), такой как тканевый активатор плазминогена человека (ИТРЛ), АТ ΙΙΙ, такой как рекомбинантный АТ ΙΙΙ человека (гНЛТ ΙΙΙ), миоглобин, альбумин, такой как бычий сывороточный альбумин (В8А), факторы роста, такие как эпидермальный фактор роста (ЕСЕ), фактор роста тромбоцитов (ΡΌ6Ε), фактор роста фибробластов (ЕСЕ), мозговой фактор роста (ΒΌ6Ρ), фактор роста нервов (Ν6Ρ), фактор роста В-клеток (ВССЕ), мозговой нейротропный фактор роста (ΒΌΝΤ), цилиарный нейротропный фактор (СОТЕ), трансформирующие факторы роста, такие как ТСЕ альфа или ТСЕ бета, ВМР (костные морфогенные белки), гормоны роста, такие как гормон роста человека, факторы некроза опухолей, такие как ТЛЕ альфа или ΕΝΕ бета, соматостатин (пептид), соматотропин, соматомедины, гемоглобин, гормоны или их предшественники, такие как инсулин, гонадотропин, меланоцитстимулирующий гормон (альфа-М8Н), трипторелин, гормоны гипоталамуса, такие как антидиуретические гормоны (ЛЭН) и окситоцин, а также высвобождающие гормоны и ингибирующие высвобождение гормоны, паратиреоидный гормон, тиреоидные гормоны, такие как тироксин, тиротропин, тиролиберин, пролактин, кальцитонин, глюкагон, глюкагон-подобные пептиды (СЬР-1, СЬР-2 и т.д.), экзендины, такие как экзендин-4, лептин, вазопрессин, гастрин, секретин, интегрины, гликопротеиновые гормоны (например, ЬН, Е8Н и т.д.), меланозидстимулирующие гормоны, липопротеины и аполипопротеины, такие как апо-В, апо-Е, апо-Е_а, иммуноглобулины, такие как ^С, Ι§Ε, IдМ, Ι§Λ, ΙβΩ и их фрагменты, гирудин, ингибитор пути тканевого фактора, растительные белки, такие как лектин или ризин, пчелиный яд, змеиный яд, иммунотоксины, антиген Е, ингибитор альфапротеиназы, пыльцевой аллерген, меланин, олиголизиновые белки, КСЭ белки или при необходимости соответствующие рецепторы для каждого из этих белков; или функциональное производное или фрагмент любого из этих белков или рецепторов. В наиболее предпочтительном варианте осуществления действующим веществом является ЕРО, конкретно окисленный ЕРО, как описано ниже.

Примерами ферментов являются, но ими не ограничиваются, углевод-специфические ферменты, протеолитические ферменты, оксидазы, оксидоредуктазы, трансферразы, гидролазы, лиазы, изомеразы, киназы и лигазы. Специфическими не ограничивающими примерами являются аспарагиназа, аргиназа, аргининдезаминаза, аденозиндезаминаза, глютаминаза, глютаминаза-аспарагиназа, фенилаланин, триптофаназа, тирозиназа, супероксиддисмутаза (8ΟΌ), эндотоксиназа, каталаза, пероксидаза, калликреин, трипсин, химотрипсин, эластаза, термолизин, липаза, уриказа, аденозиндифосфатаза, фосфорилаза пуриновых нуклеозидов, оксидаза билирубина, оксидаза глюкозы, глюкодаза, оксидаза глюконата, галактозидаза, глюкоцереброзидаза, глюкуронидаза, гиалуронидаза, тканевый фактор, стрептокиназа, урокиназа, МАР-киназы, ДНКазы, РНКазы, лактоферрин и функциональные производные или их фрагменты.

По одному из вариантов настоящего изобретения действующим веществом является низкомолекулярное лекарство, пептид и/или белок.

В числе других особо упоминаются следующие белки: эритропоэтин (ЕРО), такой как рекомбинантный ЕРО человека (гйЕРО), колониестимулирующие факторы (С8Е), такие как С-С8Е, подобный рекомбинантному С-С8Е человека (ЛС-С8Е), альфа-интерферон (ШИ а1рПа), бета-интерферон (ШИ Ьс1а) или гамма-интерферон (ΙΡΝ датта), такие как рекомбинантный ΚΝ а1р11а человека или ΚΝ Ьс1а (гЫЕХ а1р11а или γΜΡΝ Ье!а), белки сыворотки, такие как факторы свертывания ΙΙ-ΧΙΙΙ, подобные фактору УП, фактору УШ или фактору ΙΧ, альфа 1-антитрипсин (А1АТ), активированный белок С (АРС), активаторы плазминогена, такие как тканеспецифический активатор плазминогена (!РА), такой как тканевый активатор плазминогена человека (ЬТРА), АТ ΙΙΙ, такой как рекомбинантный АТ ΙΙΙ человека (ЛАТ ΙΙΙ).

Примерами пептидов являются АСТН, адреномедуллин, амилоидный бета-протеин, ангиотензин Ι, ангиотензин ΙΙ, атриальный натрийуретический пептид (А№), фрагменты антител, брадикинин, мозговой натрийуретический пептид В-типа (ΒNΡ), кальцитонин, фактор высвобождения кортикотропина (СНЕ), эндорфины, эндотелины, энкефалины, гастрин, родственный гастрину пептид, желудочный ингибирующий полипептид (СГР), гастрин-высвобождающий пептид (СКР), глюкагон, глюкагон-подобные пептиды, фактор высвобождения гормона роста (СКЕ), фактор роста гепатоцитов, инсулины, гонадотропин-высвобождающий гормон (ЬН-КН, СпКН), нейрокинины, окситоцин, паратиреоидный гормон, соматостатин, вещество Р, тиреотропин-высвобождающий гормон (ТКН), вазоактивный интестинальный пептид (У1Р) и вазопрессин.

Действующее вещество предпочтительно выбирают из группы, состоящей из антибиотиков, антидепрессантов, противодиабетических, антидиуретических, антихолинэргических, противоаритмических, противорвотных, противокашлевых, противоэпилептических, антигистаминовых, противогрибковых, антисимпатотонических, антитромботических средств, андрогенов, антиандрогенов, эстрогенов, антиэстрогенов, противоостеопорозных, противоопухолевых средств, сосудорасширяющих, других антигипер

- 4 013910 тонических средств, жаропонижающих средств, болеутоляющих, противовоспалительных средств, βблокаторов, цитостатиков, иммуносупрессирующих средств и витаминов.

Некоторыми дополняющими, не ограничивающими примерами действующих веществ являются альбутерол, алендронат, амикацин, ампициллин, амоксициллин, амфотерицин В, атенолол, азатиоприн, цефаклор, цефадроксил, цефотаксим, цефтазидим, цефтриаксон, циластатин, циметидин, ципрофлоксацин, клонидин, колистин, козинтропин, циклосерин, даунорубицин, доксорубицин, десмопрессин, дигидроэрготамин, добутамин, допамин, эфедрин, эпинефрин, ε-аминокапроновая кислота, эргометрин, эсмолол, фамотидин, флекаинид, фолиевая кислота, флюцитозин, фуросемид, ганцикловир, гентамицин, глюкагон, гидразалин, имипенем, изопротеренол, кетамин, лиотиронин, ЬНКН, мерпатрицин, метараминол, метилдопа, метоклопрамид, метопролол, мексилетин, митомицин, неомицин, нетилмицин, нимодипин, нистатин, октреотид, окситоцин, памидронат, пентамидин, фентоламин, фенилэфрин, прокаинамид, прокаин, пропранолол, ритодрин, соталол, тейкопланин, тербуталин, тиамин, тилудронат, толазолин, триметоприм, трометамин, тилозин, ванкомицин, вазопрессин и винбластин.

По одному из вариантов в качестве действующего вещества также можно использовать рифамицин, тетрациклин, спектомицин, стрептомицин или эритромицин.

Примерами олигонуклеотида являются аптамеры, ДНК, РНК, ΡΝΑ или их производные.

В контексте настоящего изобретения термин гидроксиалкилкрахмал (НА8) относится к производному крахмала, которое имеет по меньшей мере одну замещенную гидроксиалкильную группу. Предпочтительный гидроксиалкилкрахмал по настоящему изобретению имеет структуру формулы (II)

где К', К'' и К' независимо являются водородом, линейной или разветвленной гидроксиалкильной группой или группой

-[ (СК^тОЫСК^Зо-ОН где К¹, К², К³ и К⁴ независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и алкильной группы, предпочтительно водорода и метильной группы, т имеет значения от 2 до 4, где остатки К¹ и К² могут быть одинаковыми или различаться в т группах СК¹К²;

η имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 4;

о имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 2 до 4, где в случае, если η=0, о не равняется 0, и где остатки К³ и К⁴ могут быть одинаковыми или различаться в о группах СК³К⁴;

где остаток НА8 вместе с концевым фрагментом глюкозы составляет молекулу НА8, т.е. формула (II) показывает молекулу НА8, концевой углеводный фрагмент которой представлен особо, остальная часть молекулы крахмала представляет собой НА8.

В формуле (II) восстанавливающий конец молекулы крахмала показан в не окисленной форме, а концевой сахаридный мономер НА8 представлен в полуацетальной форме, которая в зависимости, например, от растворителя может находиться в равновесии с альдегидной формой. Используемая в контексте настоящего изобретения аббревиатура НА8 относится к молекуле НА8 без концевого сахаридного мономера на восстанавливающем конце молекулы НА8.

Используемый в контексте изобретения термин гидроксиалкилкрахмал не ограничивается соединениями, в которых концевой углеводный фрагмент содержит гидроксиалкильные группы К', К'' и/или К''', как показано для краткости в формуле (II), но также относится к соединениям, в которых по меньшей мере одна гидроксиалкильная группа, представленная где угодно, либо в концевом углеводном фрагменте и/или в остальной части молекулы крахмала, НА8, заменяется гидроксиалкильной группой К', К или К'''.

Также возможен гидроксиалкилкрахмал, содержащий две или более различные гидроксиалкильные группы.

По меньшей мере одна гидроксиалкильная группа, содержащаяся в НА8, может содержать одну или несколько, в частности две или более гидроксильных группы. По предпочтительному варианту осуществления по меньшей мере одна гидроксиалкильная группа, содержащаяся в НА8, содержит одну гидроксильную группу.

Выражение гидроксиалкилкрахмал также включает производные, в которых алкильная группа является моно- или полизамещенной. В этом контексте предпочтительно, чтобы алкильная группа замещалась галогеном, в частности фтором, или арильной группой. Более того, гидроксильная группа гидроксиалкильной группы может быть превращена в сложный или простой эфир.

Более того, вместо алкильных также можно использовать линейные или разветвленные замещенные

- 5 013910 или незамещенные алкеновые группы.

Гидроксиалкилкрахмал является простым эфиром крахмала. В контексте настоящего изобретения помимо указанных производных простого эфира можно также использовать другие производные крахмала. Например, можно использовать производные, которые содержат эстерифицированные гидроксильные группы. Этими производными могут быть, например, производные незамещенных моно- или дикарбоновых кислот с 2-12 атомами углерода или их замещенные производные. В частности, можно использовать производные незамещенных монокарбоновых кислот с 2-6 атомами углерода, конкретно производные уксусной кислоты. В этом контексте предпочитаются ацетильный крахмал, бутирильный крахмал и пропионильный крахмал. Более того, предпочитаются производные незамещенных дикарбоновых кислот с 2-6 атомами углерода. В случае производных дикарбоновых кислот можно использовать то обстоятельство, что вторая карбоксильная группа дикарбоновой кислоты также эстерифицируется. Более того, в контексте настоящего изобретения также подходят производные моноалкильных эфиров дикарбоновых кислот. Для замещенных моно- или дикарбоновых кислот могут быть предпочтительными те же замещающие группы, что и упомянутые выше для замещенных алкильных остатков. Технологии эстерификации крахмала известны в данной области (см., например, К1етт Ό. с! а1., СотргсНспДус Сс11и1о5с СНстЩгу Уо1. 2, 1998, \У1и1су-УСН. ХУсшйспп. №\ν Уогк, с8рсс1а11у сНарЮг 4.4, ЕМспПсабоп о£ Сс11и1о8с (Ι8ΒΝ 3-527-29489-9)).

По предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения используется гидроксиалкилкрахмал вышеупомянутой формулы (ΙΙ). Другие структуры сахаридного кольца, содержащиеся в ΗΆδ, могут быть такими же или отличными от особо описанного сахаридного кольца с тем различием, что у них отсутствует восстанавливающий конец.

В отношении остатков В', В и В' формулы (II) не существует специфических ограничений. По предпочтительному варианту осуществления В', В'' и В''' независимо являются водородом или гидроксиалкильной группой, гидроксиаралкильной группой или гидроксиалкарильной группой, имеющей в соответствующем алкильном остатке от 2 до 10 атомов углерода. Предпочитаются водород и гидроксиалкильные группы, имеющие от 2 до 10 атомов углерода. Более предпочтительно, чтобы гидроксиалкильная группа имела от 2 до 6 атомов углерода, более предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода и еще более предпочтительно от 2 до 3 атомов углерода. В предпочтительном варианте осуществления гидроксиалкилкрахмал представляет собой гидроксиэтилкрахмал, в котором В', В'' и В''' независимо являются водородом или группой (СН₂СН₂О)_п-Н, в которой п имеет целочисленные значения, предпочтительно 0, 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Поэтому гидроксиалкилкрахмал предпочтительно содержит гидроксиэтилкрахмал, гидроксипропиловый крахмал и гидроксибутиловый крахмал, где особенно предпочитаются гидроксиэтилкрахмал и гидроксипропиловый крахмал, а наиболее предпочтителен гидроксиэтилкрахмал.

Алкильная, аралкильная и/или алкарильная группа может быть линейной или разветвленной и подходящим образом замещенной.

Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, описанному выше, в котором В', В'' и В''' независимо являются водородом или линейной или разветвленной гидроксиалкильной группой с 2-6 атомами углерода.

Таким образом, В', В'' и В''' предпочтительно могут представлять собой Н, гидроксигексил, гидроксипентил, гидроксибутил, гидроксипропил, такой как 2-гидроксипропил, 3-гидроксипропил, 2гидроксиизопропил, гидроксиэтил, такой как 2-гидроксиэтил, особенно предпочтительными являются водород и 2-гидроксиэтиловая группа.

Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, описанному выше, в котором В', В'' и В''' независимо являются водородом или 2-гидроксиэтиловой группой, особенно предпочтителен вариант осуществления, в котором по меньшей мере один остаток В', В'' и В''' является 2гидроксиэтилом.

Для всех вариантов осуществления настоящего изобретения наиболее предпочтительным является гидроксиэтилкрахмал (ΗΕ8). Поэтому настоящее изобретение относится к способу и конъюгату, описанному выше, в котором полимер является гидроксиэтилкрахмалом, а производное полимера является производным гидроксиэтилкрахмала.

Гидроксиэтилкрахмал (ΗΕ8) представляет собой производное природного амилопектина и в организме разлагается с помощью альфа-амилазы. ΗΕ8 является замещенным производным углеводного полимера амилопектина, который в кукурузном крахмале присутствует в концентрации до 95% по весу. ΗΕ8 имеет улучшенные биологические свойства и используется во врачебной практике в качестве кровезаменителя и при гемодилюции (Боттсгтсусг с! а1., 1987, Кгапкспйаикрйагта/ю, 8(8), 271-278; аиб \Ус1б1сг с! а1., 1991, Аг/пспп.-ЕогесНипд/Опщ Вс§., 41, 494-498).

Амилопектин состоит из фрагментов глюкозы, при этом в главной цепи имеются альфа-1,4гликозидные связи, а на участках разветвления находятся альфа-1,6-гликозидные связи. Физикохимические свойства этой молекулы определяются, главным образом, типом гликозидных связей. Благодаря разорванной альфа-1,4-гликозидной связи получаются спиральные структуры примерно с шестью мономерами глюкозы на виток. Физико-химические, а также биохимические свойства полимера можно

- 6 013910 модифицировать путем замещения. Гидроксиэтиловую группу можно ввести путем щелочного гидроксиэтилирования. В отношении гидроксиэтилирования, адаптировав условия проведения реакции, можно использовать различную реакционную способность соответствующей гидроксильной группы в незамещенном мономере глюкозы. Благодаря этому специалист может в ограниченном масштабе влиять на профиль замещения.

НЕ8 характеризуется, главным образом, распределением молекулярной массы и степенью замещения. Существует две возможности описания степени замещения.

1. Степень замещения можно описать в виде количества замещенных мономеров глюкозы по отношению ко всем фрагментам глюкозы.

2. Степень замещения можно описать в виде молярного замещения, в котором описывается количество гидроксиэтиловых групп на фрагмент глюкозы.

В контексте настоящего изобретения степень замещения, обозначаемая как Ό8, относится к молярному замещению, описанному выше (см. также статью Боттегшеуег с1 а1., 1987, 1<гапксп11аи5р11агта/1с. 8(8), 271-278, приводимую выше, в частности с. 273).

Растворы НЕ8 представлены в виде полидисперсных композиций, в которых каждая молекула отличается от другой по степени полимеризации, количеству и паттерну участков разветвления и профилю замещения. Поэтому НЕ8 является смесью соединений с различной молекулярной массой. Следовательно, конкретный раствор НЕ8 определяется средней молекулярной массой с помощью статистической обработки данных. В этом контексте М_п рассчитывают как среднее арифметическое, зависящее от числа молекул. Альтернативно, М„ (или М^), средняя молекулярная масса, представляет собой единицу измерения, которая зависит от массы НЕ8.

Предпочтительно, чтобы гидроксиалкилкрахмал, используемый по изобретению, имел среднюю молекулярную массу (среднюю массу) от 1 до 300 кДа. Гидроксиэтилкрахмал может необязательно показывать предпочтительное молярное замещение от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,1 до 2, более предпочтительно от 0,1 до 0,9 или от 0,4 до 2, предпочтительно от 0,4 до 1,3 и предпочтительное соотношение замещений в позициях С₂ и С₆ в интервале от 2 до 20 в отношении гидроксиэтиловых групп.

Используемый в контексте настоящего изобретения термин средняя молекулярная масса относится к массе, определенной по способу ЕАЕЕ8-(малоугловое лазерное светорассеяние)-СРС, описанному в статьях Зоттегтеуег е1 а1., 1987, Кгапкепйаи8рйагта71е, 8(8), 271-278; аиб ХУеШЛег е1 а1., 1991, Агхпепп.Еогасйипд/Огид Век., 41, 494-498. Для средних молекулярных масс 10 кДа и меньше необязательно выполняли калибровку со стандартом, который предварительно откалибровали с помощью ТАТЬБ-СРС.

По предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения средняя молекулярная масса используемого гидроксиэтилкрахмала составляет от 1 до 300 кДа, более предпочтительно от 2 до 200 кДа, более предпочтительно от 10 до 150 или от 4 до 130 кДа, более предпочтительно от 10 до 100 кДа.

Примером НЕ8, имеющим среднюю молекулярную массу примерно от 1 до 300 кДа, предпочтительно от 10 до 100 кДа, является НЕ8 с молярным замещением от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,4 до 1,3, например 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2 или 1,3, предпочтительно от 0,7 до 1,3, например 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2 или 1,3.

Примером НЕ8 со средней молекулярной массой примерно 130 кДа является Уо1иуеп®, производимый Ггекешик. Уо1иуеп® является искусственным коллоидом, применяемым, например, для замещения объема, что используется по показаниям для лечения и профилактики гиповолемии. Характеристиками Уо1иуеп® являются средняя молекулярная масса 130,000±20,000 Да, молярное замещение 0,4 и соотношение С₂:С₆ примерно 9:1.

Настоящее изобретение также относится к способу и к конъюгатам, описанным выше, в которых гидроксиалкилкрахмал представляет собой гидроксиэтилкрахмал, имеющий среднюю молекулярную массу от 10 до 150 кДа, предпочтительно от 10 до 100 кДа.

Предпочтительными диапазонами средней молекулярной массы являются, например, от 10 до 150, или от 10 до 130, или от 30 до 130, или от 50 до 130, или от 70 до 130, или от 100 до 130, или от 10 до 100, или от 4 до 100, или от 10 до 100, или от 12 до 100, или от 18 до 100, или от 50 до 100, или от 4 до 70, или от 10 до 70, или от 12 до 70, или от 18 до 70, или от 50 до 70, или от 4 до 50, или от 10 до 50, или от 12 до 50, или от 18 до 50, или от 4 до 18, или от 10 до 18, или от 12 до 18, или от 4 до 12, или от 10 до 12, или от 4 до 10 кДа.

По наиболее предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения средняя молекулярная масса используемого гидроксиэтилкрахмала находится в диапазоне от более чем 4 и до менее 150 кДа, например около 10, или в диапазоне от 9 до 10, или от 10 до 11, или от 9 до 11 кДа, или примерно 12 кДа, или в диапазоне от 11 до 12, или от 12 до 13, или от 11 до 13, или около 15 кДа, или в диапазоне от 14 до 15, или от 15 до 16, или около 18 кДа, или в диапазоне от 17 до 18, или от 18 до 19, или от 17 до 19, или около 50 кДа, или в диапазоне от 49 до 50, или от 50 до 51, или от 49 до 51, или около 56 кДа, или в диапазоне от 55 до 56 либо от 56 до 57 кДа.

По другому наиболее предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения сред

- 7 013910 няя молекулярная масса используемого гидроксиэтилкрахмала находится в диапазоне от более чем 60 и вплоть до 130 кДа, например около 70 кДа, или в диапазоне от 65 до 75 или около 80 кДа, или в диапазоне от 75 до 85 или около 90 кДа, или в диапазоне от 85 до 95 или около 100 кДа, или в диапазоне от 95 до 105 или около 110 кДа, или в диапазоне от 105 до 115 или около 120 кДа, или в диапазоне от 115 до 125 или около 130 кДа, или в диапазоне от 125 до 135 кДа.

В отношении верхней границы молярного замещения (Ό8) также возможны значения вплоть до 3,0, например 0,9; 1,0; 1,1; 1,2; 1,3; 1,4; 1,5; 1,6; 1,7; 1,8; 1,9 или 2,0, предпочтительны значения ниже 2,0, более предпочтительны значения менее 1,5, еще более предпочтительны значения менее 1,3, например 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,1; 1,2 или 1,3.

Поэтому предпочтительные диапазоны молярного замещения находятся в интервале от 0,1 до 2, или от 0,1 до 1,5, или от 0,1 до 1,3, или от 0,1 до 1,0, или от 0,1 до 0,9, или от 0,1 до 0,8. Более предпочтительные диапазоны молярного замещения находятся в интервале от 0,2 до 2, или от 0,2 до 1,5, или от 0,2 до 1,0, или от 0,2 до 0,9, или от 0,2 до 0,8. Еще более предпочтительные диапазоны молярного замещения находятся в интервале от 0,3 до 2, или от 0,3 до 1,5, или от 0,3 до 1,0, или от 0,3 до 0,9, или от 0,3 до 0,8. Даже более предпочтительные диапазоны молярного замещения находятся в интервале от 0,4 до 2, или от 0,4 до 1,5, или от 0,4 до 1,3, или от 0,4 до 1,0, или от 0,4 до 0,9, или от 0,4 до 0,8.

Что касается молярного замещения (Όδ), Ό8 предпочтительно имеет значение по меньшей мере 0,1, более предпочтительно по меньшей мере 0,2, более предпочтительно по меньшей мере 0,4 и более предпочтительно по меньшей мере 0,7. Предпочтительные диапазоны значений Ό8 находятся в интервале от 0,1 до 3, предпочтительно от 0,1 до 2, более предпочтительно от 0,1 до 1,3, более предпочтительно от 0,1 до 0,9, более предпочтительно от 0,1 до 0,8, более предпочтительно от 0,2 до 0,8, более предпочтительно от 0,3 до 0,8 и даже более предпочтительно от 0,4 до 0,8, еще более предпочтительно от 0,1 до 0,7, более предпочтительно от 0,2 до 0,7, более предпочтительно от 0,3 до 0,7 и более предпочтительно от 0,4 до 0,7. Особо предпочтительными значениями Ό8 являются, например, 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7; 0,8; 0,9; 1,0; 1,2 или 1,3 с более предпочтительными 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 или 0,8, даже более предпочтительными 0,3; 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 или 0,8, еще более предпочтительными 0,4; 0,5; 0,6; 0,7 или 0,8 и особенно предпочтительными, например, 0,4 или 0,5 и 0,7 или 0,8.

В контексте настоящего изобретения заданное значение молярного замещения, такое как 1,3, может быть точным значением или может пониматься как находящееся в диапазоне от 1,25 до 1,34, или точным значением может быть 1,0 или оно может пониматься как находящееся в диапазоне от 0,95 до 1,04, или точным значением может быть 0,9 или оно может пониматься как находящееся в диапазоне от 0,85 до 0,94, или точным значением может быть 0,8 или оно может пониматься как находящееся в диапазоне от 0,75 до 0,84. Поэтому, например, заданное значение 0,1 может быть точным значением 0,1 или может находиться в диапазоне от 0,05 до 0,14, заданное значение 0,4 может быть точным значением 0,4 или может находиться в диапазоне от 0,35 до 0,44 или заданное значение 0,7 может быть точным значением 0,7 или может находиться в диапазоне от 0,65 до 0,74.

Особенно предпочтительными сочетаниями молекулярной массы гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, и его молярного замещения Ό8 являются, например, 10 кДа и 0,4, или 10 кДа и 0,7, или 12 кДа и 0,4, или 12 кДа и 0,7, или 15 кДа и 0,4, или 15 кДа и 0,7, или 18 кДа и 0,4, или 18 кДа и 0,7, или 50 кДа и 0,4, или 50 кДа и 0,7, или 56 кДа и 0,4, или 56 кДа и 0,7, или 70 кДа и 0,4, или 70 кДа и 0,7, или 100 кДа и 0,4, или 100 кДа и 0,7, или 130 кДа и 0,4, или 130 кДа и 0,7.

Что касается соотношения С₂:С₆ замещения, указанное замещение является предпочтительным в диапазоне от 2 до 20, более предпочтительно в диапазоне от 2 до 15 и даже более предпочтительно в диапазоне от 3 до 12.

По дополнительному варианту осуществления настоящего изобретения также могут использоваться смеси гидроксиэтилкрахмалов, имеющие различные средние молекулярные массы и/или разное молярное замещение и/или разные соотношения С₂:С₆ замещения. Поэтому можно использовать смеси гидроксиэтилкрахмалов, имеющие различные средние молекулярные массы и разное молярное замещение и разные соотношения С₂:С₆ замещения, или имеющие различные средние молекулярные массы и разное молярное замещение и одинаковое или примерно одинаковое соотношение С₂: С₆ замещения, или имеющие различные средние молекулярные массы и одинаковое или примерно одинаковое молярное замещение и разные соотношения С2: С6 замещения, или имеющие одинаковую или примерно одинаковую среднюю молекулярную массу и разное молярное замещение и разные соотношения С2:С6 замещения, или имеющие различные средние молекулярные массы и одинаковое или примерно одинаковое молярное замещение и одинаковое или примерно одинаковое соотношение С2: С6 замещения, или имеющие одинаковые или примерно одинаковые средние молекулярные массы и разное молярное замещение и одинаковое или примерно одинаковое соотношение С2: С6 замещения, или имеющие одинаковую или примерно одинаковую среднюю молекулярную массу и одинаковое или примерно одинаковое молярное замещение и разные соотношения С₂:С₆ замещения, или имеющие примерно одинаковую среднюю молекулярную массу и примерно одинаковое молярное замещение и примерно одинаковое соотношение С₂:С₆ замещения.

В различных конъюгатах и/или различных способах по настоящему изобретению могут использо

- 8 013910 ваться разные гидроксиалкилкрахмалы, предпочтительно разные гидроксиэтилкрахмалы и/или различные смеси гидроксиалкилкрахмалов, предпочтительно различные смеси гидроксиэтилрахмалов.

В предпочтительном варианте осуществления гидроксиалкилкрахмал или его производное содержит от 1 до 100, предпочтительно от 1 до 15, в частности 1 альдегидную группу(ы), кетогруппу(ы) и/или полуацетальную группу(ы), или гидроксиалкилкрахмал или его производное содержит от 1 до 100, предпочтительно от 1 до 15, в частности 1 альфа-8Н-бета-аминогруппу(ы).

В другом предпочтительном варианте осуществления действующее вещество содержит от 1 до 15, предпочтительно от 1 до 8, в частности 1 альдегидную группу(ы), кетогруппу(ы) и/или полуацетальную группу(ы), или действующее вещество содержит от 1 до 15, предпочтительно от 1 до 8, в частности 1 альфа-8Н-бета-аминогруппу(ы).

Гидроксиалкилкрахмал, предпочтительно гидроксиэтилкрахмал, содержащий по меньшей мере одну альдегидную группу, кетогруппу, полуацетальную группу или альфа-8Н-бета-аминогруппу, можно получить с помощью любого подходящего способа. В предпочтительном варианте осуществления производное гидроксиалкилкрахмала, содержащее указанную альдегидную группу, кетогруппу, полуацетальную группу или указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, получают с помощью способа, заключающегося во (а)(1) введении в гидроксиалкилкрахмал по меньшей мере одной альдегидной группы посредством реакции окисления с раскрытием кольца или (а)(2) взаимодействии гидроксиалкилкрахмала по меньшей мере с одним по меньшей мере бифункциональным компонентом, указанный компонент содержит две функциональные группы, Μι и О. одна функциональная группа Μι взаимодействует с гидроксиалкилкрахмалом и одна функциональная группа О является (ί) альдегидной группой, кетогруппой, полуацетальной группой или (ίί) функциональной группой, химически модифицируемой для получения альдегидной группы, кетогруппы, полуацетальной группы.

По (а)(1) предпочитается, чтобы, используя перйодат, гидроксиалкилкрахмал подвергли реакции окисления с раскрытием кольца для получения производного гидроксиалкилкрахмала, имеющего по меньшей мере одну альдегидную группу.

Реакцию окисления с раскрытием кольца по (а)(1) можно выполнить в водной среде. Реакцию окисления с раскрытием кольца выполняют при температуре от 0 до 37°С, предпочтительно от 0 до 5°С.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления (а)(2) функциональную группу Μι выбирают из группы, состоящей из карбоксильной группы, реакционноспособной карбоксильной группы, ангидрида карбоновой кислоты, галогенида карбоновой кислоты, изоцианата, изотиоцианата, хлорформиатов и эпоксидных групп, а функциональная группа О является альдегидной группой, кетогруппой, полуацетальной группой, альфа-8Н-бета-аминогруппой или функциональной группой, химически модифицируемой для получения альдегидной группы, кетогруппы, полуацетальной группы или альфа-8Нбета-аминогруппы.

По одному из вариантов осуществления настоящего изобретения способ по (а)(2) может заключаться в том, что гидроксиалкилкрахмал участвует в реакции посредством своего необязательно окисленного восстанавливающего конца по меньшей мере с одним бифункциональным компонентом, содержащим по меньшей мере две функциональные группы Μι и О.

Используемый в контексте настоящего изобретения термин, указывающий на то, что гидроксиалкилкрахмал, предпочтительно гидроксиэтилкрахмал, участвует в реакции посредством необязательно окисленного восстанавливающего конца, может относиться к процессу, по которому гидроксиалкилкрахмал взаимодействует преимущественно посредством своего необязательно окисленного восстанавливающего конца.

Термин преимущественно посредством своего необязательно окисленного восстанавливающего конца относится к процессу, по которому статистически более 50%, предпочтительно по меньшей мере 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90%, и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, например 95, 96, 97, 98 или 99% задействованных в данной реакции молекул гидроксиалкилкрахмала участвует в реакции посредством по меньшей мере одного необязательно окисленного восстанавливающего конца на молекулу гидроксиалкилкрахмала, где данная молекула гидроксиалкилкрахмала, которая участвует в реакции посредством по меньшей мере одного восстанавливающего конца, может участвовать в той же данной реакции посредством по меньшей мере одной дополнительной подходящей функциональной группы, которая содержится в указанной молекуле гидроксиалкилкрахмала и которая не является восстанавливающим концом. Если одна или несколько молекул гидроксиалкилкрахмала участвуют в реакции посредством по меньшей мере одной восстанавливающей и одновременно посредством по меньшей мере одной дополнительной подходящей функциональной группы, которая содержится в этой (этих) молекуле(ах) гидроксиалкилкрахмала и не является восстанавливающим концом, статистически предпочтительно более

- 9 013910

50%, предпочтительно как минимум 55%, более предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно по меньшей мере 65%, более предпочтительно по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, более предпочтительно по меньшей мере 80%, более предпочтительно по меньшей мере 85%, более предпочтительно по меньшей мере 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, например 95, 96, 97, 98 или 99% от всех реакционноспособных функциональных групп этих молекул гидроксиалкилкрахмала, то указанные функциональные группы, включая восстанавливающие концы, являются восстанавливающими группами.

Используемый в контексте настоящего изобретения, термин восстанавливающий конец относится к концевой альдегидной группе молекулы гидроксиалкилкрахмала, которая может присутствовать в виде альдегидной группы и/или в виде соответствующей полуацетальной форме. В случае, когда восстанавливающий конец является окисленным, альдегидная или полуацетальная группа существует в форме карбоксильной группы и/или соответствующего лактона.

Поэтому по одному из вариантов настоящего изобретения способ по (а)(2) может содержать окисление гидроксиалкилкрахмала на его восстанавливающем конце для получения гидроксиалкилкрахмала формулы (111а)

и/или формулы (ШЬ)

где К', К и К' определяют по формуле (II), и взаимодействие гидроксиалкилкрахмала, окисленного на своем восстанавливающем конце, по меньшей мере с одним подходящим соединением для получения альдегидного, кето, полуацетального или альфа-8Н-бета-амино-функционального гидроксиалкилкрахмала.

Окисление гидроксиалкилкрахмала, предпочтительно гидроксиэтилкрахмала, может быть выполнено любым способом или сочетанием способов, которые приводят к соединениям, имеющим вышеупомянутые структуры (Ша) и/или (ШЬ). Несмотря на то что окисление может быть выполнено любым подходящим способом или способами, приводящими к получению окисленного восстанавливающего конца гидроксиалкилкрахмала, предпочитается осуществлять его с использованием щелочного раствора йода, как описано, например, в ΌΕ 19628705 А1, соответствующее содержание которого (пример А, колонка 9, линии с 6 по 24) включено в настоящее описание в качестве ссылки.

В другом предпочтительном варианте осуществления полуацетальная группа гидроксиалкилкрахмала является полуацетальной группой восстанавливающего конца гидроксиалкилкрахмала в своей неокисленной форме.

По (а)(2) предпочитается, чтобы гидроксиалкилкрахмал, необязательно окисленный на своем восстанавливающем конце, взаимодействовал, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, содержащим функциональную группу М₁, которая взаимодействует с гидроксиалкильным крахмалом, предпочтительно на необязательно окисленном восстанавливающем конце, и функциональную группу О, которая является альдегидной группой, кетогруппой, полуацетальной группой или альфа-8Н-бетааминогруппой либо функциональной группой, которая может быть модифицирована для получения любой из этих групп.

В качестве функциональной группы М₁, по меньшей мере, бифункционального соединения, которая взаимодействует с гидроксиалкильным крахмалом, наиболее часто упоминается группа, имеющая структуру Κ*-ΝΗ-, где К* является водород или алкильный, циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или циклоалкиларильный остаток, где циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или циклоалкиларильный остаток может быть непосредственно связан с ΝΗ-группой или, по другому варианту осуществления, может быть связан с ΝΗ-группой с помощью кислородного мостика. Алкильный, циклоалкильный, арильный, аралкильный, арилциклоалкильный, алкарильный или циклоалкиларильный остатки могут быть подходящим образом замещенными. В качестве предпочтительных заместителей можно упомянуть галогены, такие как Е, С1 или Вг. Наиболее предпочтительными остатками К* являются водород, алкильная или алкоксильная группы и даже

- 10 013910 более предпочтительными являются водород и незамещенные алкильная и алкоксильная группы.

Среди алкильной или алкоксильной групп предпочитаются группы с 1, 2, 3, 4, 5 или 6 атомами С. Более предпочтительными являются метильная, этильная, пропильная, изопропильная, метоксильная, этоксильная, пропоксильная и изопропоксильная группы. Наиболее предпочитаются метильная, этильная, метоксильная, этоксильная, а особое предпочтение отдается метильной или метоксильной группам.

По другому варианту настоящего изобретения функциональная группа М₁ имеет структуру Κ*-ΝΗК**-, где К** предпочтительно содержит структурную единицу -ΝΗ- и/или структурную единицу -(С=О)-, где О - это О или 8 и/или структурная единица -8О₂-. Конкретными примерами функциональной группы К** являются

где если О присутствует дважды, то он независимо является О или 8.

Поэтому настоящее изобретение также относится к способу и конъюгату, указанным выше, в которых функциональную группу М₁ выбирают из группы, состоящей из

где О является О или 8 и, если присутствует дважды, то независимо является О или 8, а К' является метильной группой.

По особенно предпочтительному варианту осуществления настоящего изобретения функциональная группа М1 является аминогруппой -ΝΗ2.

Что касается случая, когда группа 0 является альдегидной группой, кетогруппой, полуацетальной группой или альфа-8Н-бета-аминогруппой или функциональной группой, химически модифицируемой для получения одной из этих групп, среди прочих указываются следующие функциональные группы:

С-С-двойные связи или С-С-тройные связи или ароматические С-С-связи;

тиогруппа или гидроксильная группа;

гидразид алкилсульфоновой кислоты, гидразид арилсульфоновой кислоты;

1.2- диолы;

1.2- амино-тиоспирты;

азиды;

1.2- аминоспирты;

аминогруппа -ΝΗ2 или производные аминогрупп, включающие структурную единицу -ΝΗ-, такие как аминоалкильные группы, аминоарильная группа, аминоаралкильные группы или алкариламиногруппы;

гидроксиламиногруппа -О-NΗ₂ или производные гидроксиламиногруппы, содержащие структурную единицу -О-ΝΗ-, такие как гидроксилалкиламиногруппы, гидроксилариламиногруппы, гидроксиларалкиламиногруппы или гидроксалалкариламиногруппы;

алкоксиаминогруппы, арилоксиаминогруппы, аралкилоксиаминогруппы или алкарилоксиаминогруппы, каждая из которых содержит структурную единицу -ΝΗ-Ο-;

остатки, имеющие карбонильную группу, -0-С(=О)-М, где О - это О или 8, а N является, например, -ОН или -8Η;

алкоксильной группой, арилоксильной группой, аралкилоксильной группой или алкарилоксильной группой;

алкилтиоловой группой, арилтиоловой группой, аралкилтиоловой группой или алкарилтиоловой группой;

алкилкарбонилоксильной группой, арилкарбонилоксильной группой, аралкилкарбонилоксильной группой, алкарилкарбонилоксильной группой;

активированными сложными эфирами, такими как эфиры гидроксиламинов, имеющие имидную структуру, такую как Ν-гидроксисукцинимид, или имеющие структурную единицу О-Ν, где N является частью гетероарильного соединения или с О=О и отсутствующим 0, такие как арилоксильные соедине

- 11 013910 ния с замещенным арильным остатком, таким как пентафторфенил, паранитрофенил или трихлорфенил, где О отсутствует или является ΝΗ или гетероатомом, таким как 3 или О;

-ΝΗ-ΝΗ₂ или -ΝΗ-ΝΗ-;

-ΝΟ₂;

нитрильной группой;

карбонильными группами, такими как альдегидная группа или кетогруппа;

карбоксильной группой;

-Л=С=О группой или -Л=С=3 группой;

винилгалогенидными группами, такими как винилйодидная или винилбромидная группа или трифлат;

-С С-Н;

-(С=NН₂С1)-Оалкил группы -(С=О)-СН₂-галоген, где галогеном является С1, Вг или I;

-СН=СН-3О2-;

дисульфидной группой, содержащей структуру -3-3-;

группой

о группой

В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению функциональная группа М₁ взаимодействует с ОН-группой на гидроксиалкилкрахмале (или с необязательно окисленным или неокисленным восстанавливающим концом гидроксиалкилкрахмала). В этом варианте осуществления функциональная группа М₁ предпочтительно является карбоксильной группой или реакционноспособной карбоксильной группой, а функциональная группа О является альдегидной группой, кетогруппой или полуацетальной группой, конкретно бифункциональное соединение, содержащее М₁ и О. выбирается из группы, состоящей из формилбензойной кислоты, пентафторфенильного эфира 4формилбензойной кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного эфира 4-формилбензойной кислоты, 4-(4формил-3,5-диметоксифенокси)масляной кислоты и ангидрида 4-формилбензойной кислоты или биосовместимого соединения, выбираемого из группы, состоящей из альфа-кетокарбоновых кислот, нейраминовых кислот или их производных и пиридоксальфосфата.

В отношении альфа-кетокарбоновых кислот предпочтительными являются такие альфакетокарбоновые кислоты, которые получены из аминокислот и которые в большинстве случаев также могут быть найдены в организме человека. Предпочтительные альфа-кетокарбоновые кислоты, полученные из аминокислот, выбирают из группы, состоящей из кетовалина, кетолейцина, кетоизолейцина и кетоаланина. В предпочтительном варианте осуществления этого изобретения карбоксильная группа альфа-кетокарбоновых кислот взаимодействует с ОН-группой на гидроксиалкилкрахмале (или с необязательно окисленным или неокисленным восстанавливающим концом гидроксиалкилкрахмала) или взаимодействует с группой О гидроксиалкилкрахмала, являющейся аминогруппой. Оставшаяся свободной кетогруппа альфа-кетокарбоновой кислоты затем может участвовать в реакции с образованием тиазолидина.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу по (а)(2)(1) или (а)(2)(п), в котором гидроксиалкилкрахмал взаимодействует с альфа-кетокарбоновой кислотой.

В отношении нейраминовой или сиаловой кислот или их производных предпочтительными являются их биосовместимые разновидности, в частности сахара, присутствующие в организме человека и являющиеся Ν- и/или О-ацетилированными. В предпочтительном варианте осуществления нейраминовые кислоты или сиаловые кислоты являются Ν-ацетилнейраминовыми кислотами. Благодаря пиранозной структуре эти соединения имеют требуемую упругость для выполнения спейсерной функции. С другой стороны, в эти соединения можно ввести альдегидную группу путем выборочного окисления. Сиаловые кислоты присутствуют в организме человека, например, в виде концевых моносахаридов в гликановых цепях гликозилированных белков.

В предпочтительном варианте осуществления сиаловая кислота может быть избирательно окислена до альдегидной группы.

В данной области известны способы избирательного окисления сиаловых кислот или нейраминовых кислот, например, из Ь.У. Задиек, В.Б. Клексо, У. УеИиег, СагЬойубга!е Кекеагсй, 83 (1980), 21-32 апб Т. Макиба, 3. 3ЫЬиуа, М. Ага1, 3. УокЫба, Т. Тотоха^а, А. Ойпо, М. Уатакййа, Т. Нопба, Вюогдатс & Мебюта1 Сйетлкйу Ьебегк, 13 (2003), 669-673.

- 12 013910

Предпочтительно, чтобы окисление сиаловой кислоты можно было выполнить до взаимодействия с гидроксиалкильным крахмалом.

Затем необязательно окисленная сиаловая кислота может взаимодействовать посредством своей карбоксильной группы с гидроксиалкилкрахмалом. В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению карбоксильная группа окисленной сиаловой кислоты взаимодействует с ОН-группой на гидроксиалкилкрахмале или с необязательно окисленным или неокисленным восстанавливающим концом гидроксиалкилкрахмала или взаимодействует с О группой гидроксиалкилкрахмала, являющейся аминогруппой. Оставшаяся карбонильная группа окисленной сиаловой кислоты затем может участвовать в реакции с образованием тиазолидина.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу по (а)(2)(1) или (а)(2)(п), в котором гидроксиалкилкрахмал взаимодействует с окисленной сиаловой кислотой.

Что касается пиридоксальфосфата (РуР), он представляет собой бифункциональное соединение с высокой биосовместимостью, также называемое витамином В6. РуР является коэнзимом, принимающим участие в реакциях переаминирования, декарбоксилирования, рацемизаций и в большом количестве модификаций боковых цепей аминокислот. Все ферменты, которым необходим РуР, действуют посредством образования основания Шиффа между аминокислотой и коэнзимом.

В предпочтительном варианте осуществления способа по настоящему изобретению фосфатная группа РуР либо взаимодействует с ОН-группой на гидроксиалкилкрахмале или с необязательно окисленным или неокисленным восстанавливающим концом гидроксиалкилкрахмала, образуя фосфатную группу, либо взаимодействует с О группой гидроксиалкилкрахмала, являющейся аминогруппой, образуя фосфорамид. Оставшаяся карбонильная группа РуР затем может участвовать в реакции с образованием тиазолидина.

В случае РуР, функциональную группу гидроксиалкилкрахмала предпочтительно встраивают в гидроксиалкилкрахмал, используя диаминовое соединение, описанное выше.

Соответственно, настоящее изобретение относится к способу по (а)(2)(1) или (а)(2)(п), в котором гидроксиалкилкрахмал взаимодействует с пиридоксальфосфатом.

В предпочтительном варианте осуществления в (а)(2)(1) функциональную группу М₁ выбирают из группы, состоящей из карбоксильной группы, реакционноспособной карбоксильной группы, ангидрида карбоновой кислоты, галогенида карбоновой кислоты, изоцианата, изотиоцианата, эфира хлороформной кислоты и эпоксидных групп, а функциональная группа О представляет собой альдегидную группу, кетогруппу или полуацетальную группу, где функциональная группа Μι взаимодействует с ОН-группой на гидроксиалкилкрахмале.

В предпочтительном варианте осуществления в (а)(2)(1) функциональную группу Μι выбирают из группы, состоящей из аминогруппы и альфа-8Н-бета-аминогруппы, а функциональная группа О представляет собой альфа-8Н-бета-аминогруппу, в частности, где функциональная группа М₁ взаимодействует с необязательно окисленным восстанавливающим концом гидроксиалкилкрахмала.

В предпочтительном варианте осуществления в (а)(2)(1) гидроксиалкилкрахмал, содержащий указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, получают способом, заключающимся во взаимодействии гидроксиалкилкрахмала на необязательно окисленном восстанавливающем конце с соединением, содержащим функциональную группу М₁ и функциональную группу О. являющуюся альфа-8Н-бета-аминогруппой, в частности где соединение, содержащее М₁ и альфа-8Н-бета-аминогруппу, представляет собой 1,3диамино-2-тиопропан или 2,3-диамино-1-тиопропан.

В предпочтительном варианте осуществления в (а)(2)(п), по меньшей мере, бифункциональное соединение содержит М₁, являющуюся карбоксильной группой или реакционноспособной карбоксильной группой, и О, являющуюся защищенной альфа-8Н-бета-аминогруппой, в частности, где, по меньшей мере, бифункциональное соединение выбирают из группы, состоящей из Ό-, Ь-РС|-Су5(РС₂)-ОН или из их рацемизированной смеси и их активного сложного эфира, где РС₁ может быть любой подходящей защитной группой для аминогруппы, предпочтительно выбираемой из группы, состоящей из третбутилоксикарбонила (Вос) или 9-флуоренилметоксикарбонила (Ртос), а РС₂ может быть любой подходящей защитной группой для тиоловой группы, предпочтительно выбираемой из группы, состоящей из тритила (Тг!), р-метокситритила (Мт!), 8-трет-бутилтио (8-!-Ви) и ацетамидометила (Аст).

По (а)(2)(н) функциональная группа О представляет собой группу, которую дополнительно модифицируют для получения альдегидной группы, кетогруппы, полуацетальной группы или альфа-8Н-бетааминогруппы. По этому варианту осуществления производное гидроксиалкилкрахмала, получаемое в реакции гидроксиалкилкрахмала, необязательно окисленного на своем восстанавливающем конце, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, взаимодействует с дополнительным, по меньшей мере, бифункциональным соединением, содержащим функциональную группу, которая взаимодействует с функциональной группой О производного гидроксиалкилкрахмала.

В предпочтительном случае (а)(2)(н) как М₁, так и О представляют собой аминогруппу -ΝΉ₂, М₁ и О можно разделить с помощью любого подходящего спейсера. Среди прочих, спейсер может быть необязательно замещенным, линейным, разветвленным и/или циклическим углеводным остатком. Как правило, углеводный остаток имеет от 1 до 40, предпочтительно от 1 до 20, более предпочтительно от 2 до

- 13 013910

10, более предпочтительно от 2 до 6 и наиболее предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода. Если присутствуют гетероатомы, разделяющая группа обычно содержит от 1 до 20, предпочтительно от 1 до 8 и наиболее предпочтительно от 1 до 4 гетероатомов. Углеводный остаток может содержать алкильную цепь, при желании разветвленную, или арильную группу или циклоалкильную группу, имеющую, например, от 5 до 7 атомов углерода, или быть аралкильной группой, алкарильной группой, где алкильная часть может быть линейной и/или циклической алкильной группой. Согласно даже более предпочтительному варианту осуществления углеводный остаток является алкильной цепью, состоящей из от 1 до 20, предпочтительно от 2 до 10, более предпочтительно от 2 до 6 и наиболее предпочтительно от 2 до 4 атомов углерода.

В одном из вариантов осуществления способа по изобретению по (а)(2)(п) предпочитают, чтобы, по меньшей мере, бифункциональное соединение, содержащее М₁ и О, представляло собой необязательно замещенный диаминоалкан, имеющий от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно соединение, выбранное из группы, состоящей из 1,2-диаминоэтана, 1,3-диаминопропана и 1,4-диаминобутана, 1,5диаминопентана, 1,6-диаминогексана, 1,7-диаминогептана, 1,8-диаминооктана, 1,9-диаминононана, 1,10диаминодекана, 1,11-диаминоундекана, 1,12-диаминододекана, 1,13-диаминотридекана, 1,14диаминотетрадекана, 1,15-диаминопентадекана, 1,16-диаминогексадекана, 1,17-диаминогептадекана,

1,18-диаминооктадекана, 1,19-диаминононадекана и 1,20-диаминоэйкозана, или соединение, имеющее формулу

где К¹', К²', К³' и К⁴' независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и алкильной группы, предпочтительно водорода и метильной группы, р имеет значения от 2 до 4, где остатки К¹' и К²' могут быть одинаковыми или различными в р группах СК¹'К²', ц имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 10; г имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 2 до 4, где в случае, если ц=0, то г не равняется 0, и где остатки К³' и К⁴' могут быть одинаковыми или различаться в г группах с К³'К⁴'.

Предпочтительный вариант осуществления по настоящему изобретению также относится к способу, описанному ранее, в котором для получения амино-функционального производного гидроксиалкилкрахмала гидроксиалкилкрахмал взаимодействует с бифункциональным соединением, которое можно выбрать из группы, состоящей из 1,2-диаминоэтана, 1,3-диаминопропана и 1,4-диаминобутана, 1,5диаминопентана, 1,6-диаминогексана, 1,7-диаминогептана, 1,8-диаминооктана, 1,9-диаминононана, 1,10диаминодекана, 1,11-диаминоундекана, 1,12-диаминододекана, 1,13-диаминотридекана, 1,14диаминотетрадекана, 1,15-диаминопентадекана, 1,16-диаминогексадекана, 1,17-диаминогептадекана,

1,18-диаминооктадекана, 1,19-диаминононадекана и 1,20-диаминоэйкозана, или с соединением, имеющим формулу

где К¹', К²', К³' и К⁴' независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и алкильной группы, предпочтительно, водорода и метильной группы, р имеет значения от 2 до 4, где остатки К¹' и К²' могут быть одинаковыми или различными в р группах СК¹'К²', ц имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 4, а г имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 2 до 4, где в случае, если ц=0, то г не равняется 0, и где остатки К³' и К⁴' могут быть одинаковыми или различаться в г группах СК³'К⁴', в частности, с 1,4диаминобутаном, и это амино-функциональное производное гидроксиалкилкрахмала в дальнейшем взаимодействует, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, содержащим одну функциональную группу, взаимодействующую с аминогруппой амино-функционального гидроксиалкилкрахмала, и одну функциональную группу, представляющую собой по меньшей мере одну альдегидную группу, кетогруппу, полуацетальную группу или альфа-8Н-бета-аминогруппу. Это необязательное бифункциональное соединение выбирают предпочтительно из группы, состоящей из формилбензойной кислоты, пентафторфенильного эфира 4-формилбензойной кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного эфира 4формилбензойной кислоты, 4-(4-формил-3,5-диметоксифенокси)масляной кислоты и ангидрида 4формилбензойной кислоты или биосовместимого соединения, выбираемого из группы, состоящей из альфа-кето-карбоновых кислот, нейраминовых кислот или их производных и пиридоксальфосфата.

В другом варианте осуществления способа в (а)(2)(п) гидроксиалкилкрахмал, содержащий указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, получают способом, заключающимся в том, что для получения первого производного гидроксиалкилкрахмала гидроксиалкилкрахмал, необязательно окисляемый на своем восстанавливающем конце, взаимодействует окисленным или неокисленным восстанавливающим концом с функциональной группой Μι соединения, содержащего помимо Μι дополнительную функциональную группу С), и для получения функционального производного гидроксиалкилкрахмала, имеющего необязательно защищенную альфа-8Н-бета-аминогруппу, функциональная группа О первого производного гидроксиалкилкрахмала взаимодействует с функциональной группой V соединения, содержащего помимо V необязательно защищенную альфа-8Н-бета-аминогруппу.

Предпочитают функциональные группы Μι и С), описанные выше.

В предпочтительном варианте осуществления соединением, содержащим V и необязательно защищенную альфа-8Н-бета-аминогруппу, является цистеин или его производное, V представляет собой кар

- 14 013910 боксильную группу или реакционноспособную карбоксильную группу, предпочтительно реакционноспособный сложный эфир или ангидрид карбоновой кислоты.

Предпочтительно, чтобы в (а)(2)(п) гидроксиалкилкрахмал в своей неокисленной форме взаимодействовал с бифункциональным соединением, имеющим аминогруппу Μι и аминогруппу С), путем восстановительного аминирования. Конкретно, бифункциональное соединение можно выбрать из группы, состоящей из первичных аминов, аммония, 1,2-диаминоэтана, 1,3-диаминопропана и 1,4-диаминобутана, 1,5-диаминопентана, 1,6-диаминогексана, 1,7-диаминогептана, 1,8-диаминооктана, 1,9-диаминононана, 1,10-диаминодекана, 1,11 - диаминоундекана, 1,12-диаминододекана, 1,13 - диаминотридекана, 1,14диаминотетрадекана, 1,15-диаминопентадекана, 1,16-диаминогексадекана, 1,17-диаминогептадекана,

1,18-диаминооктадекана, 1,19-диаминононадекана и 1,20-диаминоэйкозана, или соединения, имеющего формулу

где К¹', К²', К³' и К⁴' независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и алкильной группы, предпочтительно водорода и метильной группы, р имеет значения от 2 до 4, где остатки К¹' и К²' могут быть одинаковыми или различными в р группах СК¹'К²', ς имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 4, и г имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 2 до 4, где в случае, если ц=0, то г не равняется 0, и где остатки К³' и К⁴' могут быть одинаковыми или различаться в г группах СК³'К⁴', в частности 1,4диаминобутана.

Предпочтительно, чтобы в (а)(2)(н) гидроксиалкилкрахмал, окисленный на своем восстанавливающем конце, взаимодействовал с бифункциональным соединением, имеющим аминогруппу Μ1 и аминогруппу С), путем реакции с раскрытием лактонного кольца. В частности, бифункциональное соединение можно выбрать из группы, состоящей из 1,2-диаминоэтана, 1,3-диаминопропана и 1,4-диаминобутана, 1,5-диаминопентана, 1,6-диаминогексана, 1,7-диаминогептана, 1,8-диаминооктана, 1,9-диаминононана, 1,10-диаминодекана, 1,11 - диаминоундекана, 1,12-диаминододекана, 1,13 - диаминотридекана, 1,14диаминотетрадекана, 1,15-диаминопентадекана, 1,16-диаминогексадекана, 1,17-диаминогептадекана,

Предпочтительно, чтобы в (а)(2)(п) гидроксиалкилкрахмал сначала взаимодействовал с бифункциональным соединением, имеющим аминогруппу С), предпочтительно полученную, как описано выше, а полученный амино-функциональный гидроксиалкилкрахмал далее взаимодействовал с бифункциональным соединением, имеющим активированную карбоксильную группу и альдегидную группу, кетогруппу или полуацетальную группу.

В наиболее предпочтительном варианте осуществления способ по изобретению в (а)(2)(п) включает взаимодействие предпочтительно окисленного гидроксиалкилкрахмала с соединением, имеющим аминогруппу Μ₁ и аминогруппу С), в частности, с диаминоалкильным соединением, конкретно 1,4диаминобутаном, и затем во взаимодействии амино-функционального гидроксиалкилкрахмала с соединением, выбранным из группы, состоящей из необязательно защищенного цистеина и 4формилбензойной кислоты.

Действующее вещество, содержащее по меньшей мере одну альдегидную группу, кетогруппу, полуацетальную группу или альфа-8Н-бета-аминогруппу, можно получить любым подходящим способом.

В предпочтительном варианте осуществления действующее вещество, предпочтительно дополнительно модифицированный белок, пептид, синтетический пептид или олигонуклеотид, содержащие указанную альдегидную группу, кетогруппу, полуацетальную группу или альфа-8Н-бета-аминогруппу, получают способом, заключающимся во:

(Ъ)(1) встраивании по меньшей мере одной альдегидной группы, кетогруппы, полуацетальной группы или по меньшей мере одной альфа-8Н-бета-аминогруппы в действующее вещество во время его получения или путем химической модификации, или (Ъ)(2) взаимодействии действующего вещества, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, указанное соединение содержит две функциональные группы М₂ и С), одну функциональную группу М₂, взаимодействующую с действующим веществом, и одну функциональную группу С), являющуюся:

(1) альдегидной группой, кетогруппой, полуацетальной группой или (ΐΐ) функциональной группой, химически модифицируемой для получения альдегидной группы, кетогруппы, полуацетальной группы.

Предпочтительно, чтобы в (Ъ)(1) действующее вещество представляло собой белок или пептид, ко

- 15 013910 торый получили путем органического синтеза, предпочтительно с использованием синтетической смолы, с учетом того, что белок или пептид должен содержать функциональную альдегидную группу, функциональную кетогруппу, функциональную полуацетальную группу, или чтобы в (Ь)(1) действующее вещество представляло собой белок или пептид, который получили с использованием экспрессирующего вектора, в результате получая белок или пептид, содержащий функциональную альдегидную группу, функциональную кетогруппу, функциональную полуацетальную группу или функциональную альфа-8Н-бета аминогруппу, или чтобы в (Ь)(1) действующее вещество представляло собой белок или пептид, а остов белка или пептида замещался альдегидной группой, кетогруппой, полуацетальной группой или альфа8Н-бета аминогруппой, или чтобы в (Ь)(1) действующее вещество представляло собой белок или пептид, где указанная альдегидная группа, кетогруппа, полуацетальная группа или указанная альфа-8Н-бетааминогруппа связывалась непосредственно с остовом белка или пептида или являлась частью боковой цепи остова.

В предпочтительном варианте осуществления (Ь)(1) для введения альдегидной группы действующее вещество получают модификацией действующего вещества, в частности белка или пептида, путем окисления.

В предпочтительном варианте осуществления действующее вещество представляет собой белок или пептид, а альдегидная группа, кетогруппа или полуацетальная группа содержится в углеводном фрагменте полипептида, в частности, где углеводный фрагмент выбирают из группы, состоящей из гидроксиальдегидов, гидроксикетонов и их химических модификаций. Углеводный фрагмент может быть производным природного углеводного фрагмента и выбирается из группы, состоящей из глюкозы, галактозы, маннозы и сиаловой кислоты, которые являются необязательно химически или ферментативно окисленными, предпочтительно остатком окисленной галактозы или окисленной сиаловой кислоты углеводной боковой цепи, более предпочтительно концевым остатком галактозы или сиаловой кислоты углеводной боковой цепи, окисление концевого углеводного фрагмента предпочтительно выполняется либо ферментативно либо химически, химическое окисление предпочтительно выполняют, используя перйодат.

В предпочтительном варианте осуществления углеводный фрагмент является производным природного углеводного фрагмента и представляет собой концевую галактозу, ферментативно или химически окисленную, когда концевой остаток галактозы дополнительно получают после расщепления концевой сиаловой кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления альфа-8Н-бета-аминогруппа содержится в цистеиновом остатке действующего вещества, предпочтительно белка или пептида, цистеиновый остаток предпочтительно является Ν-концевым цистеиновым остатком действующего вещества.

В предпочтительном варианте осуществления действующее вещество является модифицированным белком или пептидом с Ν-концевым цистеиновым остатком, который не является частью дисульфидного мостика, в частности, где модифицированный белок или пептид, обладающий Ν-концевым цистеиновым остатком, является мутантом природного белка или пептида, полученным путем (1) добавления цистеинового остатка к Ν-концевой аминокислоте, (2) замещения Ν-концевой аминокислоты цистеином или путем (3) удаления Ν-концевой аминокислоты(т) до тех пор, пока не получится концевой цистеин.

Указанный цистеин можно встроить в пептиды во время синтеза. Пептидный синтез известен в данной области (^. Сйапд, Ρ.Ό. ^ййе; Етос койб рйаке рерйбе куп1йещк, а ргасйса1 арргоасй; ОхГогб Ишуегкйу Ргекк, Οχίοτά, 2000, Ι8ΒΝ 0199637245).

Рекомбинантные полипептиды получают стандартными молекулярно-биологическими технологиями, как, например, описанными в Мо1еси1аг С1ошпд: А ЬаЬога1огу Мапиа1, 3^Γά ебйюп, Εάκ. 8атЬгоок е! а1., С8НЬ Ргекк 2001. Кратко, полипептиды можно экспрессировать из рекомбинантных экспрессирующих векторов, содержащих нуклеиновую кислоту, кодирующую желаемый полипептид, где нуклеиновая кислота функционально связана по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью, позволяющей экспрессировать желаемый полипептид. Например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую желаемый полипептид, можно выделить и клонировать в экспрессирующем векторе, а вектор затем может быть трансформирован в подходящую клетку-хозяина для экспрессии желаемого полипептида. Такой вектор может быть плазмидой, фагмидой или космидой. Например, молекула нуклеиновой кислоты может быть клонирована в подходящей форме в прокариотические или эукариотические экспрессирующие векторы (Мо1еси1аг С1ошпд, см. выше). Такие экспрессирующие векторы содержат по меньшей мере один промотор, а также могут содержать сигнал начала трансляции и - в случае прокариотических экспрессирующих векторов - сигнал терминации трансляции, тогда как в случае эукариотических экспрессирующих векторов предпочтительно содержат сигналы терминации транскрипции и полиаденилирования. Примерами прокариотических экспрессирующих векторов для экспрессии в ЕксйепсЫа сой являются, например, экспрессирующие векторы, основанные на промоторах, распознаваемых Т7 РНК-полимеразой, как описано в патенте США 4952496, примерами эукариотических экспрессирующих векторов для экспрессии в 8ассйаготусек сегегыае являются, например, векторы С426/Ме125 или Р526/Са11 (МитЬегд е! а1., (1994) №с1. Ααάκ Век., 22, 5767-5768), для экспрессии в клетках насекомых, например, бакуловирусные векторы, как, например, описанные в ЕР-В1-0127839 или ЕР-В1-0549721 или Сюсагопе е! а1. (Сепегайоп оГ гесотЬшап! Васи1оуник ΌΝΑ ш Е.сой икшд Ьаси1оуник кйий1е уес!ог

- 16 013910 (1997) Уо1ите 13, и. Ве1ксй!, ей. (ΤοΙο\ν;·ι. N1: Нитапа Ргекк 1пс.)) и для экспрессии в клетках млекопитающих, например, векторы Яс/СМ\У. Вс/А8\У и 8^40-векторы, которые являются хорошо известными и коммерчески доступными, или ΕΒΝΑ-система, описанная в примере 4, рСу!Т8 на основе репликона Синдбис (Воогкта е! а1. (2002) Вю!есйпо1. Вюепд. 79(6): 602-609), экспрессирующая вирус Синдбис система (8сй1екшдег (1993) Тгепйк Вю!есйпо1. 11(1):18-22) или аденовирусная экспрессирующая система (Не е! а1. (1998) Ргос. №11. Асай. 8сг ϋδΑ 95:2509-2514). Специалистам хорошо известны молекулярнобиологические способы получения этих экспрессирующих векторов, а также способы трансфекции клеток-хозяев и культивирования таких трансфицированных клеток-хозяев, а также условия выработки и получения полипептидов по изобретению из указанных трансфицированных клеток-хозяев.

Полипептиды с желаемым Ν-концевым цистеиновым остатком можно получить из полипептидов, экспрессированных и очищенных, как описано выше, путем клонирования интересуемого полипептида, следующего за Ν-концевой лидерной последовательностью, которую удаляют для получения полипептидов с желаемым Ν-концевым цистеиновым остатком.

Этого можно достичь, например, протеолитическим расщеплением полипептида, экспрессированного и очищенного, как описано ранее. В таком случае клонировали, экспрессировали и очищали слитый полипептид, в котором цистеиновый остаток следует непосредственно за высоко избирательным сайтом расщепления протеазой, например, Сук остаток, непосредственно следующий за участком расщепления фактором Ха: 11е (61ц/Акр) 61у Агд | (Сук/Шк), или Н1к или Сук остаток, непосредственно следующий за участком расщепления энтерокиназой: Акр Акр Акр Акр Ьук | (Сук/Ηίκ), где | обозначает сайт расщепления протеазой.

Кроме того, этого можно достичь, например, расщеплением полипептида во время экспрессии, например, расщеплением на этапе ЕВ транслокации с помощью сигнальной пептидазы. В таком случае клонировали и экспрессировали слитый полипептид, в котором Сук остаток следует непосредственно за сигнальным пептидом, направляя рекомбинантный полипептид на секреторный путь (более подробно см. Варорой е! а1., Аппи Веу Вюсйет. 1996; 65:271-303).

Молекулярно-биологические способы вмешательства в кодирующую последовательность рекомбинантного полипептида хорошо известны в данной области, при этом создают кодирующую последовательность для полипептида с желаемым Сук остатком в желаемом положении (8атЬгоок, выше).

Предпочтительными вариантами осуществления (Ь)(2) являются такие же, как описанные выше для (а)(2), в частности функциональные группы М₂ и О предпочтительно такие же, как описанные выше функциональные группы Μι и О, при условии, что действующее вещество содержит функциональную группу, которая взаимодействует с группой Μι, как описано выше.

В особенно предпочтительном варианте осуществления действующее вещество выбирают из белка и пептида и получают по (Ь)(1) предпочтительно, как описано выше.

В особенно предпочтительном варианте осуществления по (А) гидроксиалкилкрахмал, содержащий альдегидную группу, получают по (а)(2)(п), предпочтительно взаимодействием предпочтительно окисленного гидроксиалкилкрахмала с соединением, имеющим аминогруппу Μ₁ и аминогруппу О, в частности с диаминоалкильным соединением, конкретно 1,4-диаминобутаном, и затем взаимодействием аминофункционального гидроксиалкилкрахмала с бифункциональным соединением, содержащим альдегидную группу, в частности 4-формилбензойную кислоту, а затем взаимодействием альдегидной группы гидроксиалкилкрахмала с необязательно защищенной альфа-8Н-бета-аминогруппой действующего вещества, полученного путем (Ь)(2)(1), предпочтительно встраиванием в действующее вещество, в частности белок или пептид, необязательно защищенного цистеина.

В особенно предпочтительном варианте осуществления по (В) действующее вещество, содержащее альдегидную группу, получают путем (Ь)(1), в частности введением альдегидной группы путем химической модификации, предпочтительно с помощью окисления белка или пептида, и затем взаимодействием альдегидной группы действующего вещества с гидроксиалкилкрахмалом, содержащим альфа-8Н-бетааминогруппу, полученным путем (а)(2)(п), предпочтительно взаимодействием предпочтительно окисленного гидроксиалкилкрахмала с соединением, имеющим аминогруппу Μ₁ и аминогруппу О, в частности с диаминоалкильным соединением, конкретно 1,4-диаминобутаном, а затем взаимодействием аминофункционального гидроксиалкилкрахмала с бифункциональным соединением, содержащим альфа-8Нбета-аминогруппу, в частности цистеин.

Реакцию по изобретению по (А) и (В) действующего вещества с гидроксиалкилкрахмалом можно выполнить в любом подходящем растворителе или смеси по меньшей мере двух растворителей, при подходящем значении рН и при подходящей температуре реакции.

В предпочтительном варианте осуществления реакцию (А) или (В) выполняют при температуре от 0 до 40°С, предпочтительно от 0 до 25°С, в частности от 20 до 25°С, в присутствии растворителя и при значении рН от 3,5 до 10, предпочтительно от 4 до 8, в частности от 4,8 до 8,0, с временем проведения реакции предпочтительно от 0,1 до 24 ч, в частности около 21 ч.

Растворитель предпочтительно выбирают из группы, состоящей из воды, водного буфера, ΌΜΡ (диметилформамида), ΌΜ8Θ (диметилсульфоксида), ^ΜΑ (диметилацетамида) и их смеси.

Молекулярное соотношение гидроксиалкилкрахмала к действующему веществу составляет при

- 17 013910 мерно от 1:1 до 2 00:1, предпочтительно от 10:1 до 100:1, в частности от 40:1 до 70:1.

Более того, изобретение относится к конъюгату действующего вещества и гидроксиалкилкрахмала, получаемому способом, описанным выше.

В другом варианте осуществления изобретение относится к конъюгату действующего вещества и гидроксиалкилкрахмала, в котором действующее вещество и гидроксиалкилкрахмал являются ковалентно связанными посредством химического остатка, имеющего структуру формулы (I)

или формулы (I') или формулы (I)

где К1, К2, К2', К3, К3' и К4 независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, необязательно подходящим образом замещенной, линейной, циклической и/или разветвленной алкильной, арильной, гетероарильной, аралкильной и гетероаралкильной группы, предпочтительно водорода, указанный конъюгат имеет структуру формулы (IV), (IV') или (IV)

или где ΗΑ8' является остатком гидроксиалкилкрахмала или его производного, связанным с альдегидной группой, кетогруппой или полуацетальной группой, и где Α8' является остатком действующего вещества или его производного, связанным с альфа-8Η-бета-аминогруппой, или структуру формулы (V), (V') или (V'')

- 18 013910 или

где НА8' является остатком гидроксиалкилкрахмала или его производного, связанным с альфа-8Н-бетааминогруппой, и где А8' является остатком действующего вещества или его производного, связанным с альдегидной группой, кетогруппой или полуацетальной группой.

В предпочтительном варианте осуществления конъюгат выбирают из группы, состоящей из

где К₅ определяют так же, как для К₁-К₄, рассмотренных выше,

- 19 013910

где в формуле (1У'а), (1У'Ь), (У'Ь) или (У'с) η является целым числом, предпочтительно η имеет значения от 0 до 20, и где в формуле (Уа), (УЬ), (У'Ь) или (У'е) η является целым числом, предпочтительно η имеет значения от 1 до 20. В предпочтительном варианте осуществления формулы (1У'Ь) и (У'с) η имеет значения от 2 до 4, в частности 2.

В предпочтительном варианте осуществления конъюгат является

- 20 013910

где К', К и/или К' определяются по формуле (II) и где по меньшей мере в одном глюкозном мономере ΗΕδ по меньшей мере один из К', К'' и/или К''' независимо выбирается из группы, состоящей из

и где η является целым числом, предпочтительно от 1 до 20 и/или где по меньшей мере один из К', К'' и/или К''' представляет собой -(СН₂СН₂О)_т-К#, где т принимает целочисленные значения, предпочтительно от 1 до 3, а К# выбирается из группы, состоящей из формулы (У1а), (У1Ь), (У1с) и (У1б).

В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к альфа-3Н-бета-аминофункциональному производному гидроксиалкилкрахмала, выбираемому из группы, состоящей из

где К₅ определяют так же, как для Кх-Кц, рассмотренных выше, и

где η принимает целочисленные значения, предпочтительно от 0 до 20, или из группы, состоящей из

где К', К'' и/или К''' определяются по формуле (II) и где по меньшей мере в одном глюкозном мономере ΗΕδ по меньшей мере один из К', К'' и/или К''' независимо выбирают из группы, состоящей из

- 21 013910

и где η принимает целочисленные значения, предпочтительно от 1 до 20 и/или где по меньшей мере один из К', К'' и/или К''' представляет собой -(СН₂СН₂О)_т-К^#, где т принимает целочисленные значения, предпочтительно от 1 до 3, а К# выбирается из группы, состоящей из формулы (СТа), АТЬ) и (СТс).

Аббревиатуры НЕ8'' и НЕ8', специфически использованные в контексте формул (VI) и (VI'), относятся к остаткам молекулы НЕ8, которые совместно с углеводным фрагментом, связывающим НЕ8'' и НЕ8', как показано в (VI) и (VI'), составляют молекулу НЕ8, которая в свою очередь является частью конъюгатов, как определено в (VI) и (VI').

В дополнительном варианте осуществления изобретение относится к описанному выше конъюгату, используемому в способе лечения человека или животного или в качестве лекарственного средства.

Конъюгаты по изобретению могут быть очищенными по меньшей мере на 50%, даже более предпочтительно по меньшей мере на 70%, еще более предпочтительно по меньшей мере на 90%, в частности по меньшей мере на 95% или по меньшей мере на 99%. В наиболее предпочтительном варианте осуществления конъюгаты могут быть очищены на 100%, т.е. они не содержат других побочных продуктов.

Поэтому по другому аспекту настоящее изобретение также относится к композиции, которая может содержать конъюгат(ы) по изобретению, в которой количество конъюгата(ов) может составлять по меньшей мере 50% по массе, даже более предпочтительно по меньшей мере 70% по массе, еще более предпочтительно по меньшей мере 90% по массе, в частности по меньшей мере 95% по массе или по меньшей мере 99% по массе. В наиболее предпочтительном варианте осуществления композиция может состоять из конъюгата(ов), т.е. количество конъюгата(ов) составляет 100% по массе.

Соответственно, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей описанный выше конъюгат или конъюгат, получаемый описанным выше способом.

Более того, настоящее изобретение также относится к фармацевтической композиции, содержащей описанный выше конъюгат или конъюгат, получаемый описанным выше способом, указанная фармацевтическая композиция необязательно содержит по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, адьювант или носитель.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 показан анализ 8Э8-гель-электрофорезом неочищенных конъюгатов белок-НЕ8, полученных путем образования тиазолидина из Н-Суз(Н)-НЕ810/0,4 и окисленного ЕРО.

Линия X: маркер молекулярной массы Кой®-Магк 8ΤΑN^ΑК^ (Саг1 Ко1й ОтЬН + Со. КО, КаЛзгийе, Ό) сверху вниз: 200, 119, 66, 43, 29, 20, 14,3 кДа.

Линия А: конъюгирование Н-Суз(Н)-НЕ810/0,4 с окисленным ЕРО.

На фиг. 2 показан анализ 8Э8-гель-электрофорезом неочищенных конъюгатов белок-НЕ8, полученных образованием тиазолидина из Н-Су8-пептид-NН₂ и альдегидо-НЕ8.

Линия X: маркер молекулярной массы Кой®-Магк 8ΤΑN^ΑК^ (Саг1 Ко1й ОтЬН + Со. КО, КагЕгиЬе, Ό) сверху вниз: 200, 119, 66, 43, 29, 20, 14,3 кДа.

Линия А: конъюгирование альдегидо-НЕ810/0,7 при рН 4,6.

Линия В: конъюгирование альдегидо-НЕ850/0,7 при рН 4,6.

Линия С: контроль реакции: пептид при рН 4,6.

Линия Э: конъюгирование альдегидо-НЕ810/0,7 при рН 8,0.

Линия Е: конъюгирование альдегидо-НЕ850/0,7 при рН 8,0.

Линия Е: контроль реакции: пептид при рН 8,0.

На фиг. 3 показан электрофорез в агарозном геле неочищенных конъюгатов ДНК-НЕ8, полученных образованием тиазолидина из Н-Суз(Н)-НЕ850/0,7 и альдегид-модифицированной ДНК, как описано в экспериментальных разделах 8.4-8.5 настоящего документа.

Линия X: маркер риС19/Мзр I (Саг1 Ко1й ОтЬН + Со. КО, Кайзгийе, Ό) маркер молекулярной массы сверху вниз: 501/489, 404, 331, 242, 190, 147, 111/110, 67 нп.

Линия А, верхний ряд: конъюгирование Н-Суз(Н)-НЕ850/0,7 с ЕВА-модифицированной ДНК при

- 22 013910 рН 4,6, как описано в экспериментальном разделе 8.5.

Линия В, верхний ряд: контроль реакции; конъюгирование Охо-ИЕ850/0,7 с ΕΒΑмодифицированной ДНК при рН 4,6, как описано в экспериментальном разделе 8.5.

Линия. С, верхний ряд: конъюгирование Η-ί.’ν5(Η)-ΗΕ850/0.7 с ΕΒΑ-модифицированной ДНК при рН 8,0, как описано в экспериментальном разделе 8.5.

Линия Ό, верхний ряд: контроль реакции; конъюгирование Охо-ИЕ850/0,7 с ΕΒΑмодифицированной ДНК при рН 8,0, как описано в экспериментальном разделе 8.5.

Линия Е, верхний ряд: контроль реакции; ΕΒΑ-модифицированная ДНК в воде без ΗΕ8производного.

Линия А, нижний ряд: конъюгирование Η^γδ(Η)-ΗΕ850/0,7 с формилиндол-модифицированной ДНК при рН 4,6, как описано в экспериментальном разделе 8.5.

Линия В, нижний ряд: контроль реакции; конъюгирование Охо-ИЕ850/0,7 с формилиндолмодифицированной ДНК при рН 4,6, как описано в экспериментальном разделе 8.5.

Линия С, нижний ряд: конъюгирование Η^γδ(Η)-ΗΕ850/0,7 с формилиндол-модифицированной ДНК при рН 8,0, как описано в экспериментальном разделе 8.5.

Линия Ό, нижний ряд: контроль реакции; конъюгирование Охо-ИЕ850/0,7 с формилиндолмодифицированной ДНК при рН 8,0, как описано в экспериментальном разделе 8.5.

Линия Е, нижний ряд: контроль реакции; формилиндол-модифицированная ДНК в воде без ΗΕ8производного.

На фиг. 4-6 показан анализ неочищенного конъюгата даунорубицин-ΗΕ8, полученного образованием тиазолидина из Н-Су8(Η)-ΗΕ850/0,7 и даунорубицина, посредством ΗΡΕ-С обратнофазовой хроматографии, иХ-детекция при 290 нм, как описано в экспериментальном разделе 9 настоящего документа.

Фиг. 4: №ЬС анализ неочищенного конъюгата.

Фиг. 5: №ЬС анализ даунорубицина.

Фиг. 6: 11Р1.С анализ Η-Су8(Η)-ΗΕ850/0,7.

На фиг. 7-9 показан анализ неочищенного конъюгата тилозин-ΗΕ8, полученного образованием тиазолидина из Η-Су8(Η)-ΗΕ850/0,7 и тилозина, посредством ΗΡΡ-С обратнофазовой хроматографии, ЦУдетекция при 220 нм, как описано в экспериментальном разделе 9 настоящего документа.

Фиг. 7: №ЬС анализ неочищенного конъюгата.

Фиг. 8: №ЬС анализ тилозина.

Фиг. 9: 11Р1.С анализ Η-Су8(Η)-ΗΕ850/0,7.

На фиг. 10 показан анализ 8О8-гель-электрофорезом неочищенных конъюгатов пептид-ИЕЗ, как описано в экспериментальном разделе 10 настоящего документа.

Линия X: маркер молекулярной массы КоИ®-Магк 8ΤΑΝΏΑΚΌ (Саг1 Ко111 СтЫ + Со. КО, Кагкгийе, Ό) сверху вниз: 200, 119, 66, 43, 29, 20, 14,3 кДа.

Линия А: конъюгирование №810/0,7 с пептидом при 21°С в ΌΜΤ.

Линия В: конъюгирование №810/0,7 с пептидом при 37°С в ΌΜΕ.

Линия С: контроль реакции: пептид при 50°С в ΌΜΕ.

Линия Ό: конъюгирование №810/0,7 с пептидом при 50°С, рН 4,6.

Линия Е: конъюгирование №810/0,7 с пептидом при 50°С в ΌΜΕ.

Линия Е: конъюгирование №810/0,7 с пептидом при 50°С, рН 4,6, 1% Тритон.

Линия О: конъюгирование №810/0,7 с пептидом при 50°С в ΌΜΤ, 1% Тритон.

Более подробное объяснение изобретения будет дано с помощью следующих примеров.

Примеры

1. Синтез Η-Су8(8ίΒи)-ΗΕ810/0,4.

1.1. Синтез амино-№810/0,4 из окисленного №8.

Охо-№810/0,4 (4 г, Μ^=10,9 кДа, Ό8=0,4, 8иргато1 Рагеи1ега1 СоНоШь ОтЫ, Ко8Ьас1-Кобйе1т, Ό) нагревали в течение ночи при 80°С в вакууме, растворяли в атмосфере аргона в безводном диметилсульфоксиде (25 мл, Е1ика, 8щта-Л1бпс11 С1ет1е ОтЬИ ТаиШгсйеп, Ό) и добавляли 1,4-диаминобутан (4,0 мл, Е1ика, 8ί^α-Α1άΓκ1 С1ет1е ОтЬИ ТаиШгсйеп, Ό). После перемешивания при 45°С в течение 24 ч реакционную смесь добавляли к 2-пропанолу (125 мл Саг1 Ко!1 ОтЬΗ + Со. КО, Кагкгийе, Ό) и инкубировали в течение 1 ч при -20°С. Преципитировавший продукт собирали центрифугированием при 4°С, отмывали 2-пропанолом (100 мл) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в воде (20 мл, ΜίΡί-Ο), диализовали против воды Μί11ί-0 в течение 43 ч (змеевидная диализная трубка, 3,5 кДа Μ^ΤΌ, РегЬю 8с1епсе§ ОеиксШапб ОтЬИ Βоηη, Ό) и лиофилизировали. Выход выделенного продукта составил 65%.

1.2. Синтез Етос-Су8(8ίΒи)-№810/0,4 из амино-№:8.

Етос-СуБ^БЩ-ОН (150 мг, Е1ика, 8^дта-Α1ά^^сй СТеппе ОтЬИ ТаиШгсйеп, Ό) и 1-гидрокси-1Нбензотриазол (61,4 мг, Л1ά^^с11. 8^дта-Α1ά^^сй С1ет1е ОтЬИ ТаиШгсйеп, Ό) растворяли в Ν,Νдиметилформамиде (3,5 мл Рерббе зупИекк дгабе, Бю^оке, Vа1кеп5\νаа^ά. ΝΣ) и добавляли Ν,Ν'диизопропилкарбодиимид (54,3 мкл, Е1ика, 8^дта-Α1ά^^сй С1ет1е ОтЬИ ТаиШгсйеп, Ό). После инкубации при 21°С в течение 30 мин добавляли амино-№810/0.4 (0,35 г), полученный в 1.1. После перемеши

- 23 013910 вания при комнатной температуре в течение ночи реакционную смесь добавляли к охлажденной на льду смеси 1:1 (35 мл, об./об.) ацетона (Саг1 Ко1й СтЪН + Со. КС, КаНкгиИе, Ό) и этанола (ΌΛΒ. ЗоииеиЬегд, Вгаииксйтее1д, Ό) и инкубировали в течение 1 ч при -20°С. Преципитировавший продукт собирали центрифугированием при 4°С, растворяли в воде (20 мл, Μί11ί-Ο) и добавляли дихлорметан (Саг1 Ко(И СтЬН + Со. КС, КабкгиИе, Ό) (20 мл). Смесь тщательно перемешивали и центрифугировали. Водный верхний слой диализовали против воды МПН-Ц в течение 41 ч (змеевидная диализная трубка, 3,5 кДа МХУ СО, РегЬю Заепсек Веи1ксИ1апб СтЬН, Вопи, Ό) и лиофилизировали. Выход выделенного продукта составил 78%.

1.3. Синтез Н-Сук(З1Ви)-НЕЗ10/0,4 из Етос-Сук(З1Ви)-НЕЗ10/0,4.

Етос-Сук(З1Ви)-НЕЗ10/0,4 (0,35 г), полученный в 1.2, растворяли в растворе пиперидина (4 мл, 20% в ΌΜΕ, об./об., Е1ика, Зщта-А1бпсИ СИепие СтЬН, ТаиПбгсИеп, Ό). После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 мин реакционную смесь добавляли к охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (35 мл, об./об.) и инкубировали в течение 1 ч при -20°С. Преципитировавший продукт собирали центрифугированием при 4°С и отмывали трет-бутилметиловым эфиром (25 мл, Асгок Огдашск, Сее1, В) и инкубировали в течение 1 ч при -20°С. Преципитировавший продукт собирали центрифугированием при 4°С и высушивали в потоке азота. Выход выделенного продукта составил 68%.

2. Синтез альдегидо-НЕ810/0,7.

2.1. Синтез амино-НЕ810/0,7 из окисленного НЕ8.

Охо-НЕЗ 10/0,7 (6,02 г, МХУ=14,7 кДа, Ό8=0,76, 8иргато1 Рагеи1ега1 Со11о1бк СтЬН, КокЬасИКобйе1т, Ό) нагревали в течение 16,5 ч при 80°С в вакууме, растворяли в атмосфере аргона в безводном диметилсульфоксиде (25 мл, Е1ика, Зщта-А1бпсИ СИепие СтЬН, ТаиШгсйеи, Ό) и добавляли 1,4диаминобутан (5,1 мл, Е1ика, Зщта-А1бпсИ Сйет1е СтЬН, ТаиПбгсИеп, Ό). После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (150 мл, об./об.). Преципитировавший продукт собирали центрифугированием при 4°С, отмывали охлажденной на льду смесью 1:1 ацетона и этанола (40 мл, об./об.) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в воде (80 мл), диализовали против воды Μί11ί-0 в течение 42 ч (змеевидная диализная трубка, 3,5 кДа МУСО, РегЬю Заепсек Веи1ксИ1апб СтЬН, Вопи, Б) и лиофилизировали. Выход выделенного продукта составил 67%.

2.2. Синтез альдегидо-НЕЗ10/0,7 из амино-НЕЗ.

4-Формилбензойную кислоту (75 мг, Ьаисак1ег Зуи1йек1к, ЕгаикГий/Маш, Б) и 1-гидрокси-1Нбензотриазол (115 мг, А1бпсИ, Зщта-А1бпсИ СИепие СтЬН, ТаиПбгсИеп, Б) растворяли в Ν,Νдиметилформамиде (БМЕ, 5 мл, Рерббе куи1йек1к дгабе, ВюкоКе, Уа1кеиктеаагб, ΝΣ) и добавляли Ν,Ν'диизопропилкарбодиимид (102 мкл, Е1ика, Зщта-А1бпсИ СИепие СтЬН, ТаиШгсйеи, Б). После инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин добавляли амино-НЕЗ 10/0,7 (0,5 г, МУ=14,7 кДа, БЗ=0,76). После перемешивания при комнатной температуре в течение ночи реакционную смесь добавляли к 2-пропанолу (30 мл, Саг1 Ко(И СтЬН + Со. КС, Каг1кгийе, Б) и инкубировали в течение 1 ч при -20°С. Преципитировавший продукт собирали центрифугированием при 4°С, отмывали 2-пропанолом (30 мл) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в воде (10 мл, МПН-С), диализовали против воды МПй-О в течение 44 ч (змеевидная диализная трубка, 3,5 кДа МХУСО, РегЬю Зс1еисек Веи1ксИ1апб СтЬН, Вопи, Б) и лиофилизировали. Выход выделенного продукта составил 86%.

3. Синтез альдегидо-НЕЗ50/0,7.

3.1. Синтез амино-НЕЗ50/0,7 из окисленного НЕЗ.

Охо-НЕЗ50/0,7 (6,09 г, МХУ=56,7 кДа, БЗ=0,76, Зиргато1 Рагеи1ега1 Со11о1бк СтЬН, КокЬасИКобйе1т, Б) нагревали в течение 16,5 ч при 80°С в вакууме, растворяли в атмосфере аргона в безводном диметилсульфоксиде (32 мл, Е1ика, Зщта-А1бпсИ СИепие СтЬН, ТаиШгсйеи, Б) и добавляли 1,4диаминобутан (1,2 мл, Е1ика, Зщта-А1бпсИ СИепие СтЬН, ТаиПбгсИеп, Б). После перемешивания при 40°С в течение 17 ч реакционную смесь добавляли к охлажденной на льду смеси 1:1 ацетона и этанола (150 мл, об./об.). Преципитировавший продукт собирали центрифугированием при 4°С, отмывали охлажденной на льду смесью 1:1 ацетона и этанола (40 мл, об./об.) и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в воде (80 мл), диализовали против воды МПН-Ц в течение 42 ч (змеевидная диализная трубка, 3,5 кДа МХУСО, РегЬю Зыеисек Веи1ксИ1аиб СтЬН, Вопи, Б) и лиофилизировали. Выход выделенного продукта составил 82%.

3.2. Синтез альдегидо-НЕЗ50/0,7 из амино-НЕЗ.

4-Формилбензойную кислоту (124 мг, Ьаисак1ег Зуп(Иек1к, ЕгапИий/Маш, Б) и 1-гидрокси-1Нбензотриазол (174 мг, А1бг1сИ, Зщта-А1бпсИ СИепие СтЬН, ТаиПбгсИеп, Б) растворяли в Ν,Νдиметилформамиде (БМЕ, 38 мл, Рерббе куп!Иек1к дгабе, ВюкоКе, Уа1кеиктеаагб, ΝΣ) и добавляли Ν,Ν'диизопропилкарбодиимид (155 мкл, Е1ика, Зщта-А1бпсИ СИепие СтЬН, ТаиШгсйеи, Б). После инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин добавляли амино-НЕЗ50/0,7 (3,80 г, МУ=56,7 кДа, БЗ=0,76). После перемешивания при комнатной температуре в течение ночи реакционную смесь добавляли к 2-пропанолу (160 мл, Саг1 Ко1й СтЬН + Со. КС, Каг1кгийе, Б) и инкубировали в течение 1 ч при -20°С. Преципитировавший продукт собирали центрифугированием при 4°С, растворяли в БМЕ (20 мл), преципитировали 2-пропанолом, как описано ранее, и собирали центрифугированием. Неочищенный

- 24 013910 продукт растворяли в воде, диализовали против воды Μίίίί^ в течение 24 ч (змеевидная диализная трубка, 3,5 кДа МАСО, РсгЫо 8с1спсс8 ВсиЕсЫапб ОтШ, Вопп, Ό) и лиофилизировали. Продукт растворяли в воде (20 мл), преципитировали охлажденной на льду смесью 1:1 ацетона и этанола (150 мл, об./об.), инкубировали в течение 1 ч при -20°С и собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в воде (29 мл), диализовали против воды М1Ш^ в течение 24 ч (змеевидная диализная трубка, 10 кДа МАСО, РсгЫо ЗЫспссз ВсиЕсЫапб ОтЬН, Вопп, Ό) и лиофилизировали. Выход выделенного продукта составил 77%.

4. Образование тиазолидина из Η-Су8(Η)-ΗΕ810/0,4 и окисленного ЕРО.

4.1. Снятие защитной группы с Η-Су8(8ΐΒи)-ΗΕ810/0,4.

Η-Су8(8ΐΒи)-ΗΕ810/0,4 (10 мг), полученный в примере 1, растворяли в натрий-ацетатном буфере (1 мл, 0,1 М, рН 4,6, 10 мМ ЭДТА) и добавляли трис-(2-карбоксиэтил)фосфингидрохлорид (2,8 мг, ТСЕР, Асгоз Огдашсз, Осс1, В). Реакционную смесь инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре и удаляли избыток ТСЕР диафильтрацией.

Реакционную смесь разбавляли буфером (натрий-фосфатным буфером, 0,1 М, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА) до 0,5 мл и центрифугировали при 20°С в течение 10 мин при 13000хд в концентраторе УЫазрт 500 (У1уа 8с1спсс, 5 кДа МАСО, 11аппотсг, Осгтапу). Процедуру отмывки повторяли три раза разбавлением остаточного раствора буфером до 0,5 мл и центрифугированием в течение 35 мин, как описано. Растворы Η-Су8(Η)-ΗΕ810/0,4 разбавляли тем же реакционным буфером до 150 мкл, получая конечную рассчитанную концентрацию 66,6 мкг/мл.

4.2. Конъюгирование с окисленным ЕРО.

Для получения окисленного ЕРО к 20 мл 2,0 мг/мл раствора ЕРО (полученный по рекомбинантным технологиям ЕРО, имеющий аминокислотную последовательность ЕРО человека и похожие или по существу аналогичные коммерчески доступному эритропоэтину альфа характеристики: Ргуро, ОВТЕО ΒΙΟΤΕΟΗ, Дапзсп-СПад или эритропоэтину бета: №оВссогтоп, ВосПс; с£. ЕР 0148605, ЕР 0205564, ЕР 0411678), хранящегося при 0°С, добавляли 2,2 мл охлажденного на льду 10 мМ раствора натрия метаперйодата до конечной концентрации 1 мМ натрия метаперйодата. Смесь инкубировали при 0°С в течение 1 ч в ледяной бане в темноте, останавливали реакцию добавлением 40 мкл глицерина и инкубировали в течение дополнительных 5 мин. Заменяли буфер смеси на натрий-ацетатный буфер, рН 5,5.

К полученному окисленному ЕРО (14,9 мкл, 1,34 мг/мл, натрий-ацетатный буфер, рН 5,5) добавляли раствор Η-Су8(Η)-ΗΕ810/0,4 (5 мкл), полученный в 4.1. После инкубации в течение 21 ч при комнатной температуре анализировали реакционную смесь с помощью 8Ό8 гель-электрофореза. Для проведения 8Ό8 гель-электрофореза использовали камеру ХСсП 8игс Ьоск МЫ СсП (1пу11годсп ОтШ, КагЕгиПс, Ό) и источник питания СопзоП Ε143 (ОО^ОВТпу, ТигпПои!, В). Согласно инструкции производителя использовали 10% бис/трис гель с буфером для проведения электрофореза МОР8 в восстанавливающих условиях (оба произведены 1пу11годсп ОтШ, КагЕгиПс, Ό).

5. Образование тиазолидина из Η-Су8(Η)-пептид-NΗ₂ и альдегидо-ΗΕ8.

Раствор пептида, имеющего на своем Ν-конце свободный остаток цистеина (2 мкл, 15 мкг, 3147 г/моль, 7,5 мг/мл в ОМЕ, Η-С^Р8^ΕОNΜ^^Р8ΕЕΗСΜΜNА88ΗIААС-NΗ2, полученный стандартным твердофазным синтезом Етос и очищенный с помощью 11РРС) добавляли к 20 мкл раствора альдегидо-ΗΕ8 (см. табл. 1) в реакционном буфере (см. табл. 1, дегазированном в течение 15 мин в ультразвуковой бане), и инкубировали смесь в течение ночи при комнатной температуре. Для анализа посредством 8Ό8 гель-электрофореза использовали камеру ХСсП 8игс Ьоск М1ш СсП (ЫуИгодсп ОтШ, КагЕгиПс, Ό) и источник питания СопзоП Ε143 (СО^ОВТпу, ТигпПои!, В). Согласно инструкции производителя использовали 12% бис/трис гель с буфером для проведения электрофореза ΜΕ8 в восстанавливающих условиях (оба произведены ЫуИгодсп ОтШ, КагЕгиПс, Ό).

Таблица 1

Условия проведения , реакции

АльдегидоНЕЗ	Концентрация альдегидоНЕЗ	Реакционный буфер
АльдегидоНЕ310/0,7, полученный в 2.	119 мг/мл	Натрий-ацетатный, 0,1 М, рН 4,6, 10 мМ ЭДТА
АльдегидоНЕ850/0,7, полученный в 3.	595 мг/мл	Натрий-ацетатный, 0,1 М, рН 4,6, 10 мМ ЭДТА
АльдегидоНЕ810/0,7, полученный в 2.	119 мг/мл	Натрий-ацетатный, 0,1 М, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА
АльдегидоНЕ350/0,7, полученный в 3. 1::.	595 мг/мл	Натрий-ацетатный, 0,1 М, рН 8,0, 1мМ ЭДТА

6. Результаты.

Результаты экспериментов можно увидеть на фигурах.

- 25 013910

Как можно увидеть из вышеприведенных примеров, были осуществлены две различных стратегии. В одном случае (см. 4) карбонильную группу вводили в гликан ЕРО путем перйодатного окисления и конъюгировали с альфа^Н-бета аминогруппой, содержащей ΗΕδ. Это ΗΕδ10/0,4 производное синтезировали в два этапа из ΗΕδ, окисленного на восстанавливающем конце. Окисленный ΗΕδ с помощью известной процедуры превращали в амино-ΗΕδ (см. 1.1) с последующим ацилированием защищенным цистеином (Етос-Сук^1Ви)-ОН) (см. 1.2) и снятием защитной группы (см. 1.3). По другому пути (см. 5) использовали альдегидо-ИЕШ0/0,7, альдегидо-ИЕ^50/0,7 (см. 2.2 и 3.2), синтезированные ацилированием известного амино-ΗΕδ (см. 2.1 и 3.1) формилбензойной кислотой, и пептид, содержащий незащищенный цистеин на своем Ν-конце. Фактически полное превращение получено обеими стратегиями (см. фиг. 1 и 2). Конъюгирование альдегидо-ΗΕδ с Сук-пептидом одинаково хорошо проходило при значениях рН 4,6 и 8,0 (см. фиг. 2, линию А и Ό или линию В и Е). В этих условиях проведения реакции пептид с ΗΕδ10/0,7 или ΗΕδ50/0,7 не взаимодействовал. При изменении условий проведения реакции можно было бы ожидать успеха.

Способ по этому изобретению имеет преимущество для белков, измененные Ν-концевыми цистеиновыми остатками варианты которых получают путем экспрессии, тогда как другие модификации белков, которые также должны были бы давать возможность хемоселективного конъюгирования, не возможны по этому пути. К тому же предполагается, что допускается избирательное взаимодействие с гидроксиалкильным крахмалом, в частности с гидроксиэтилкрахмалом, через Ν-концевой остаток белка.

Дополнительным преимуществом способа по изобретению является хемоселективность взаимодействия альдегидной, кето или полуацетальной группы с альфа-δΗ-бета-аминогруппой. Поэтому не должно быть взаимодействия с функциональными группами боковых цепей, например, белка или пептида.

7. Синтез Η^κ(Η)-ΗΕδ50/0,7.

7.1. Синтез амино-ΗΕδ50/0,7 из окисленного ΗΕδ.

Οχο-ΗΕδ50/0,7 (10,1 г, Μ\ν=44.2 кДа, Όδ=0,7, Ьо1 502, δиρ^ато1 РагсШсга1 Со11о1бк СтЬИ. КокЬасЬКобйспп. Ό) нагревали в течение 72 ч при 80°С в вакууме, растворяли в атмосфере аргона в безводном диметилсульфоксиде (52 мл, Е1ика, δί^ΐΓΐη-А10г1с11 СИенне СтЬИ ТаиГкпсЬеп, Ό) и добавляли 1,4диаминобутан (2,3 мл, Е1ика, δί^α-Ά1άΓκΗ СИенне СтЬЩ ТаиГкггсЬеп, Ό). После перемешивания при 45°С в течение 19,5 ч реакционную смесь по каплям добавляли к смеси 1:1 (400 мл, об./об.) ацетона (Саг1 Ко1Ь СтЬΗ + Со. КС, Каг1кгиЬе, Ό) и этанола (ЭАВ, δοηηеηЬе^д, ВгаипксЬете1д, Ό). Преципитировавший продукт собирали центрифугированием. Неочищенный продукт растворяли в воде (100 мл, МзШЮ), диализовали в течение 24 ч против 20 мМ уксусной кислоты и в течение 3,5 ч против воды (змеевидная диализная трубка, 10 кДа М\\^;С'О, РегЬю δс^еηсек ЭеШксЫапб СтЬИ Вопп, Ό). Выход выделенного продукта после лиофилизации составил 84%.

7.2. Синтез Εтοс-Сук(δΐВи)-ΗΕδ50/0,7 из амино-ΗΕδ50/0,7.

Етос-Сук^®и)-ОН (293,1 мг, Е1ика, δί£ΐτιη-Α1άΓ^1ι СИенне СтЬИ ТаиГкисЬеп, Ό) и 1-гидрокси-1Нбензотриазол (155,9 мг, [γικ Вю1есЬ СтЬИ Магк1гебтеЙ2, Ό) растворяли в Ν,Ν-диметилформамиде (30 мл Рерйбе куп1йек15 дгабе, Вюкоке, Уа1кепотаагб, ΝΣ) и добавляли Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимид (138 мкл, Е1ика, δ^дта-Α1ά^^сЬ СЬет1е СтЬИ ТаиГкпсЬеп, Ό). После инкубации при 21°С в течение 30 мин добавляли амино-ВВ^50/0,7 (3,00 г), полученный как описано в 7.1. После перемешивания при комнатной температуре в течение ночи реакционную смесь добавляли к смеси 1:1 (230 мл, об./об.) ацетона (Саг1 Ко111 СтЬЧ + Со. КС, Каг1кгиЬе, Ό) и этанола (ЭАВ, δοηηеηЬе^д, ВгаипксЬете1д, Ό). Преципитировавший продукт собирали центрифугированием, растворяли в ΌΜΕ (30 мл) и снова преципитировали, как описано выше. После центрифугирования неочищенный продукт растворяли в воде (30 мл, МИй-О), диализовали против воды Μί11ί-0 в течение 28 ч (змеевидная диализная трубка, 10 кДа М\\^;СО, РегЬю δс^еηсек ЭеШксЫапб СтЬИ Вопп, Ό) и лиофилизировали. Выход выделенного продукта составил 98%.

7.3. Синтез Η-Сук(δΐВи)-ΗΕδ50/0,7 из Εтοс-Сук(δΐВи)-ΗΕδ50/0,7.

Εтοс-Сук(δΐВи)-ΗΕδ50/0,7 (2,62 г), полученный как описано в 7.2, растворяли в ΌΜΕ (20 мл) и добавляли пиперидин (5 мл, Е1ика, δ^дта-Α1ά^^сЬ СИенне СтЬИ ТаиГкпсЬеп, Ό). После перемешивания при комнатной температуре в течение 15 мин реакционную смесь добавляли к смеси 1:1 ацетона и этанола (190 мл, об./об.). Преципитировавший продукт собирали центрифугированием, растворяли в ΌΜΕ (25 мл) и снова преципитировали, как описано выше. После центрифугирования неочищенный продукт растворяли в воде (25 мл, МПН-О), диализовали против воды М1111-0 в течение 45 ч (змеевидная диализная трубка, 10 кДа М\\^;С'О, РегЬю δс^еηсек ЭеШксЫапб СтЬЩ Вопп, Ό) и лиофилизировали. Выход выделенного продукта составил 83%.

7.4. Синтез Η^κ(Η)-ΗΕδ50/0,7 из Η-Сук(δΐВи)-ΗΕδ50/0,7.

Η-Сук(δΐВи)-ΗΕδ50/0,7 (0,50 г), полученный как описано в 7.3, растворяли в 50 мМ растворе трис(2-карбоксиэтил)фосфингидрохлорида (5 мл, ТСЕР, Асгок Огдашск, Сее1, В в 0,1 М натрий-ацетатном буфере рН 5,0). После перемешивания при комнатной температуре в течение 1 ч реакционную смесь диализовали (змеевидная диализная трубка, 10 кДа М\\^;С'О, РегЬю δс^еηсек ЭеШксЫапб СтЬИ Вопп, Ό) в течение 22 ч против 5 мМ водного ЭДТА (Ийка, δ^дта-Α1ά^^сЬ СЬет1е СтЬИ ТаиГкпсЬеп, Ό в воде Μί11ί-Ο) и 1 ч против воды (Μί11ί-Ο) и лиофилизировали. Выход выделенного продукта составил 97%.

8. Конъюгирование с ДНК.

- 26 013910

8.1. Гибридизация формилиндол-модифицированной ДНК.

5'-Формилиндол-модифицированную ДНК (формилиндоловую модификацию, т.е. 3-формилиндолмодификацию ввели согласно А. ОкатоФ е! а1., Те1гайебгоп Ьей. 2002, 43, 4581-4583; 200 мкл, а1бЫо, 8оиШатрФп, ик, 1о1 А0795, Μ=9361 г/моль, с=37,8 мкМ в воде, последовательность:

ХТАСТСАСССТОСОААТТСААСТОСТОССТС) и немодифицированную комплементарную цепь (199 мкл, а!бЫо, 8оиФатрФп, ик, 1о1 А0794, Μ=9376 г/моль, с=38,2 мкМ в воде, последовательность: ОАООСАОСАТТОААТТСОСАОООТОАОТА) гибридизовали в молярном соотношении 1:1, основываясь на концентрациях, данных производителем. Растворы смешивали и инкубировали при 95°С в течение 5 мин, получая конечную концентрацию двойной цепи ДНК 0,356 мг/мл. 157 мкл (55,9 мкг) лиофилизировали в течение ночи и растворяли в воде (27,9, ΜΪ11Ϊ-Ρ), получая рассчитанную конечную концентрацию 2 мг/мл. Концентрации являются рассчитанными и экспериментально не проверялись.

8.2. Гибридизация 5'-амино-С6-модифицированной ДНК.

5'-Амино-С6-модифицированную ДНК (59,1 нмоль, Ыотегз.пе! ОтЬН, И1т, Ώ, 1о1 00033426_1 ДНК, М = 9218 г/моль, 59,1 нмоль, последовательность: ТАСТСАСССТОСОААТТСААСТОСТОССТС) растворяли в воде (100 мкл; ΜΪ11Ϊ-Ρ). Гибридизовали ее (38,78 мкл, 595 мкМ) с немодифицированной комплементарной цепью (600 мкл, а1бЫо, 8оиШатрФп, ик, 1о1 А0794, М=9376 г/моль, с=38,2 мкМ в воде, последовательность: ОАООСАОСАТТОААТТСОСАОООТОАОТА) в молярном соотношении 1:1 на основании данных производителем концентраций. Растворы смешивали и инкубировали при 95°С в течение 5 мин, получая конечную рассчитанную концентрацию двойной цепи ДНК 0,667 мг/мл. Концентрации рассчитывались и экспериментально не проверялись.

8.3. Образование ЕВА-модифицированной ДНК из 5'-амино-С6-модифицированной ДНК.

К двухцепочечной 5'-амино-С6-модифицированной ДНК (500 мкл, 0,667 мг/мл в воде), полученной как описано в 8.2, добавляли сукцинимидил-4-формилбензоат (50 мкл, 4 мг/мл в ΏΜΕ, КоуаЫосйет, Иегск КОаА, ОагпШаФ, Ώ) и инкубировали прозрачный раствор в течение 5 ч при 21°С. Реакционную смесь центрифугировали при 21°С в течение 15 мин при 13000хд в концентраторе У1уазрт 500 (У ϊνη 8с1епсе, 5 кДа ИШСО, Наппоуег, Оегтапу). Повторяли процедуру отмывки три раза путем разведения остаточного раствора водой (ΜΪ11Ϊ-Ρ) до 0,5 мл и центрифугирования в течение 12 мин, как описано. Раствор ДНК разбавляли водой до 167 мкл, получая конечную рассчитанную концентрацию 2 мг/мл. Концентрации рассчитывались и экспериментально не проверялись.

8.4. Образование тиазолидина из Н-Суз(Н)-НЕ850/0,7 и формилиндол-модифицированной ДНК.

К водному раствору формилиндол-модифицированной ДНК (1,4 мкл, 2 мг/мл), полученной как описано в 8.1, добавляли раствор производного НЕ850/0,7 (4 мкл, 147,5 мг/мл, см. табл. 1) в реакционном буфере (см. табл. 2 далее в настоящем документе). После инкубирования в течение 14 ч при 21°С реакционную смесь анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Были использованы Ададе1 81апбагб зуз!ет и источник питания Μΐπϊθ(311 Ромег Раск Р20 (оба произведены Вюте1га ОтЬН, ОоШпдеп, Ώ). Для проведения электрофореза использовали 2% агарозу ΝΕΕΟ ИНга-РиаШа! (Саг1 КоФ ОтЬН + Со. КО, КагЕгийе, Ώ) и буфер 0,5хТВЕ. Для регистрации результатов использовали систему гельдокументации Ое1 Оос 2000 вместе с программным обеспечением Риа1йу Опе У4.0.3 (ΒΙΟ-ΚΛΏ йаЬогаФпез, Μ^^φ Ώ). Результаты экспериментов можно увидеть на фиг. 2.

Таблица 2

Условия проведения реакции

НЕ350/0,7-производное	Реакционный буфер
Н-Суз(Η)-НЕ350/0,7, полученный в 7.4.	Натрий-ацетатный, 0,1 М, рН 4,6, 10 мМ ЭДТА
Охо-НЕ550/0,7 (Зиргато1 Рагепбега1 СоИоШз СтЬН, КозЬасН-КосЗЬетт, Ц)	Натрий-ацетатный, 0,1 М, рН 4,6, 10 мМ ЭДТА
Н-Суз(Η)-НЕ350/0,7, полученный в 7.4.	Натрий-фосфатный, 0,1 М, рН 8,0, 5 мМ ЭДТА
Охо-НЕ350/0, 7 (Зиргато1 Рагепбега1 СоИоШз ОтЬН, КозЬасИ-ВосДтетт, Ц) \|	Натрий-фосфатный, 0,1 М, рН 8,0, 5 мМ ЭДТА

8.5. Образование тиазолидина из Н-Суз(Н)-НЕ850/0,7 и ЕВА-модифицированной ДНК.

К водному раствору ЕВА-модифицированной ДНК (1,5 мкл, 2 мг/мл), полученной, как описано в

8.3, добавляли раствор производного НЕ850/0,7 (4 мкл, 147,5 мг/мл, см. табл. 3 в настоящем документе ниже) в реакционном буфере (см. табл. 3 в настоящем документе ниже). После инкубирования в течение 144 при 21 °С реакционную смесь анализировали электрофорезом в агарозном геле, как описано в 8.4. Результаты экспериментов можно увидеть на фиг. 3.

- 27 013910

Таблица 3

Условия проведения реакции

НЕ350/0,7-производное	Реакционный	буфер
Н-Суз(Η)-НЕ350/0, 7,		Натрий-ацетатный,	0,1	м,	рН
полученный в 7.4.		4,6, 10 мМ ЭДТА
ОХО-НЕ350/0,7	(Зиргато!	Натрий-ацетатный,	0,1	м,	рН
Рагепбега! СоИогбз СтЬН,	4,6,10 мМ ЭДТА
КозЬасЬ-КоЬЬегт, Э)
Н-Суз(Η)-НЕ350/0, 7,		Натрий-фосфатный,	0,1	м,	рН
полученный в 7.4.		8,0, 5 мМ ЭДТА
ОХО-НЕ350/0,7	(Зиргато!	Натрий-фосфатный,	0,1	м,	рН
Рагепбега! СоИоШз СтЬН,	8,0, 5 мМ ЭДТА
КозЬасЬ-КоЬЬетт, ϋ)

9. Конъюгирование с небольшими органическими молекулами (в настоящем документе подразумеваются антибиотики (даунорубицин) и цитостатики (тилозин)).

Конъюгирование с небольшими органическими молекулами посредством образования тиазолидина.

Н-Суз(Н)-НЕ850/0,7 (11,0 мг), полученный как описано в 7.4, растворяли в растворе небольших органических молекул (44 мкл, имеющем концентрацию [А] мг/мл, 13,4 экв., см. табл. 4 в настоящем документе ниже) в ЭМТ (см. табл. 4 ниже), инкубировали при 21°С в течение ночи и анализировали 40 мкл реакционной смеси посредством НРЬС. Результаты экспериментов можно увидеть на фиг. 4-9.

В качестве небольших органических молекул использовали даунорубицин (Т1ика, 81§та-А1бпсН, Таи1к1гсНеп, Ώ) и тартрат тилозина (оба препарата производства ВюСНет1ка дгабе, Т1ика, 81§та-А1бпсН, ТаиПлгсКеп, ϋ).

Для НРЬС анализа использовали колонку Верго8б-РиВ Ваз1с С18 150x4,6 мм ΐ.ά. (Огбег # В15.В9. 81546, 1)г. Ма1зсб ОтЬН, АттегЬисб, Ώ) и систему для хроматографии Ак1а Ваз1с (насос Р900 Серия # 01118816, υν-детектор ИУ900 Серия # 01120613, определитель рН/электропроводности рН/С900 Серия # 01120665, коллектор фракций Ггас900 Серия # 01120011 и программное обеспечение ишсогп 5.0 Серия # 01119821, все Атегзбат Вюзс1епсез, ГгеАигд, Ώ).

Для всех анализов применялся следующий способ.

Буфер А: вода с 0,1 ТТА (Вобзок 6С-М8 Оагбе, Саг1 Во1б ОтЬН + Со. КО, Каг1згибе, Ώ).

Буфер В: смесь 15% воды с 0,1 ТТА и 85% ацетонитрила с 0,1% ТТА (оба Вобзок 6С-М8 дгабе, Саг1 Во1б ОтЬН + Со. КО, Каг1згибе, Ώ).

Градиент: 0% буфер В в 2 объемах колонки (СТ); линейный градиент 0-50% буфер В в 15 СТ, линейный градиент 50-100% буфер В в 7 СТ, 100% буфер В для 7 СТ, 0% буфер В для 5 СТ.

υν-детекция при 220 и 290 нм.

Скорость тока: 2 мл/мин.

Таблица 4 ______Условия проведения реакции__________________

Небольшая органическая Концентрация [А] / (мг/мл) молекула

Даунорубицин 43,0

Тилозин 80,7

10. Образование тиазолидина из Н-Суз-пептида и нашивного НЕ8.

Раствор пептида, имеющий на своем Ν-конце свободный цистеиновый остаток (1 мкл, 20 мкг, 2528 г/моль, 20 мг/мл в ОМГ, последовательность Н-Суз-Азп-Тбг-Аг§-Еуз-Аг§-11е-Аг§-11е-О1п-Аг§-О1уРго-О1у-Аг§-А1а-Рбе^а1-Тбг-11е-О1у-буз-ОН, 8С623, №оМР8 8.А., 81газЬоиг§, Т), добавляли к 9 мкл раствора НЕ810/0,7 (408 мг/мл в [Реакционном буфере] (см. табл. 5 ниже), МШ 9,2 кДа, ϋ8=0,7, Ьо1 437, 8иргато1 Рагеп1ега1 Со11о1бз ОтЬН, ВозЬасб-Воббе1т, Ώ), к избранным реакциям (см. табл. 5 ниже) добавляли раствор тритона-Х100 (1 мкл, 10% в воде) и инкубировали смеси в течение ночи при [В]°С (см. табл. 5 ниже). Для анализа путем 8Ώ8 гель-электрофореза использовали камеру ХСе11 8иге Ьоск МЫ Се11 (1пу11го§еп ОтЬН, Каг1згибе, Ώ) и источник питания Сопзог! Е143 (СОЖ8ОВТпу, Тигпбои!, В). Согласно инструкции производителя использовали 12% бис/трис-гель с буфером для проведения электрофореза МОР8 в восстанавливающих условиях (оба произведены 1пуйго§еп ОтЬН, Каг1згибе, Ώ). Результаты эксперимента можно увидеть на фиг. 10.

- 28 013910

Таблица 5

Условия проведения реакции

11. Результаты экспериментов по вышерассмотренным пп.8-10.

11.1. Конъюгирование с ДНК путем образования тиазолидина (вышерассмотренный п.8).

Конъюгирование с ДНК путем образования тиазолидина получали с двумя различными альдегидмодифицированными ДНК (см. п.8 в настоящем документе выше). Необходимые ДНК-альдегиды были либо коммерчески доступными в случае формилиндол-модифицированной ДНК (см. п.8.1 выше), либо их получали из коммерчески доступных 5'-амино-ДНК и сукцинимидил-4-формилбензоата (см. п.8.3 выше). Альфа-3Н-бета-аминогруппу, содержащую НЕ3 (Н-Суз(Н)-НЕ350/0,7), получали из Н-Суз(31Ви)НЕ350/0,7 путем восстановления ТСЕР и очищали преципитацией и диализом (см. п.7.4 выше). НСуз(31Ви)-НЕ350/0,7 получали по аналогии с Н-Суз(31Ви)-НЕ310/0,4 (см. п.4.1 в настоящем документе выше). Результаты конъюгирования с обеими альдегид-модифицированными ДНК показаны на фиг. 3. О том, что конъюгирование произошло, говорило появление новой полосы с большей молекулярной массой. Увеличенная ширина полосы была обусловлена распределением молекулярной массы НЕ3-части конъюгата. Конъюгирование было получено при значениях рН 4,6 (линия А) или 8,0 (линия С). Отсутствие конъюгирования было обнаружено с ОхоНЕ350/0,7, исходным материалом для получения Н-Сук(Н)НЕ350/0,7 (Линия В и Ώ).

11.2. Конъюгирование с небольшими органическими молекулами (рассмотренный выше п.9).

Конъюгирование с небольшими органическими соединениями путем образования тиазолидина было получено для цитостатического лекарственного препарата даунорубицин (см. фиг. 4 в настоящем документе ниже) и для антибиотика (тилозин, см. фиг. 7 ниже). Альфа-3Н-бета-аминогруппа, содержащая НЕ3 исходный материал (в той же концентрации, что и в реакции конъюгации) появлялась в виде широкой полосы примерно через 10 мин (см. фиг. 6, 9 ниже). Увеличенная ширина пика была обусловлена распределением молекулярной массы НЕ3. На фиг. 5 и 8 показаны НРЬС анализы небольших органических соединений (в той же концентрации, что и в реакции конъюгации). О том, что конъюгирование произошло, говорит появление нового широкого пика через интервал времени между появлением НЕ3 исходного материала и небольшого органического соединения (фиг. 4 и 7). С другой стороны, образование широкого пика отображало распределение молекулярной массы НЕ3-части конъюгата.

11.3. Конъюгирование с использованием нативного НЕ3 (вышерассмотренный п.10).

Конъюгирование с нативным НЕ3 путем образования тиазолидина было получено для пептида, имеющего на своем Ν-конце свободный цистеиновый остаток (см. п.10 в настоящем документе выше), в ЭМЕ в качестве растворителя в температурном диапазоне между 21 и 50°С (фиг. 10 линии А, В и Е) или в водном буфере при значении рН 4,6 при 50°С (фиг. 10 линия Ώ). Конъюгирование также было обнаружено в присутствии детергента тритона Х-100 при 50°С (фиг. 10, линии Е и О). О том, что конъюгирование произошло, говорило появление новой полосы с большей молекулярной массой. Увеличенная ширина полосы была обусловлена распределением молекулярной массы НЕ3-части конъюгата.

Таким образом, надо было показать, что конъюгирование нативного НЕ3 с Сук-пептидом обычно происходит даже в различных других условиях, что отмечено в вышерассмотренном п.6 настоящего документа.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ получения конъюгата действующего вещества и гидроксиалкилкрахмала, в котором действующее вещество и гидроксиалкилкрахмал ковалентно связаны с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (Ι) или формулы (Ι') или формулы (Ι) где К1, К
2, К2', К3, К3' и К4 независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, необязательно подходящим образом замещенной, линейной, циклической и/или разветвленной алкильной, арильной, гетероарильной, аралкильной и гетероаралкильной группы, предпочтительно водорода, указанный способ включает:

(А) взаимодействие альдегидной группы, кетогруппы или полуацетальной группы производного гидроксиалкилкрахмала, содержащего указанную альдегидную группу, кетогруппу или полуацетальную группу, с альфа-8Н-бета-аминогруппой действующего вещества или его производного, содержащего указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, таким образом получая конъюгат указанного действующего вещества и указанного гидроксиалкилкрахмала, ковалентно связанных с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (Ι), или с альфа-8Н-бета-аминогруппой действующего вещества или его производного, содержащего указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, таким образом получая конъюгат указанного активного вещества и указанного гидроксиалкилкрахмала, ковалентно связанных с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (Ι'), или с альфа8Н-бета-аминогруппой действующего вещества или его производного, содержащего указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, таким образом получая конъюгат указанного активного вещества и указанного гидроксиалкилкрахмала, ковалентно связанных с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (Г), где Κι, К₂, К₂', К₃, К₃' и К₄ такие же, как определенные выше,

- 30 013910 причем производное гидроксиалкилкрахмала, содержащее указанную альдегидную группу, кетогруппу или полуацетальную группу, получают способом, включающим взаимодействие гидроксиалкилкрахмала по меньшей мере с одним, по меньшей мере, бифункциональным соединением, указанное соединение содержит две функциональные группы Μι и С), одна функциональная группа Μι взаимодействует с гидроксиалкилкрахмалом и одна функциональная группа О является:

(1) альдегидной группой, кетогруппой, полуацетальной группой или (ΐΐ) функциональной группой, химически модифицируемой для получения альдегидной группы, кетогруппы или полуацетальной группы; или (В) взаимодействие альдегидной группы, кетогруппы или полуацетальной группы действующего вещества или его производного, содержащего указанную альдегидную группу, кетогруппу или полуацетатную группу, с альфа-8Н-бета-аминогруппой производного гидроксиалкилкрахмала, содержащего указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, таким образом получая конъюгат указанного действующего вещества и указанного гидроксиалкилкрахмала, ковалентно связанных с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I), или с альфа-8Нбета-аминогруппой

К₃ Кз Н5—4---ΝΗΚ, *з’ производного гидроксиалкилкрахмала, содержащего указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, таким об разом получая конъюгат указанного активного вещества и указанного гидроксиалкилкрахмала, ковалентно связанных с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I'), или с альфа-8Нбета-аминогруппой к; к;

производного гидроксиалкилкрахмала, содержащего указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, таким об разом получая конъюгат указанного активного вещества и указанного гидроксиалкилкрахмала, ковалентно связанных с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I''), где К₁, К₂, К₂', К₃, где К', К'' и К''' независимо являются водородом, линейной или разветвленной гидроксиалкильной группой или группой

- [ (ск^ьоШсьААо-он где К¹, К², К³ и К⁴ независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и алкильной группы, предпочтительно водорода и метильной группы, т имеет значения от 2 до 4, где остатки К¹ и К² могут быть одинаковыми или различаться в т группах СК¹К²;

η имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 4;

о имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 2 до 4, где в случае, если η=0, о не равняется 0, и где остатки К³ и К⁴ могут быть одинаковыми или различаться в о группах СК³К⁴;

К', К'' и К''' предпочтительно независимо являются водородом или 2-гидроксиэтильной группой.
3. Способ по п.1 или 2, в котором гидроксиалкилкрахмал является гидроксиэтилкрахмалом, указанный гидроксиэтилкрахмал предпочтительно имеет молекулярную массу от 1 до 300, более предпочтительно от 2 до 200, более предпочтительно от 10 до 150 или от 4 до 130, более предпочтительно от 10 до 100 кДа, указанный гидроксиэтилкрахмал далее предпочтительно имеет молярное замещение от 0,1 до 3, более предпочтительно от 0,1 до 2, еще более предпочтительно от 0,1 до 0,9 или от 0,4 до 2, предпочтительно от 0,4 до 1,3, и указанный гидроксиэтилкрахмал далее предпочтительно имеет предпочтительное соотношение между С2: С6 замещением в диапазоне от 2 до 20 по отношению к гидроксиэтильным груп пам.

- 31 013910
4. Способ по любому из пп.1-3, в котором действующее вещество выбирают из группы, состоящей из белков, пептидов, низкомолекулярных лекарственных средств, действующих средств, гликопротеинов и олигонуклеотидов, таких как ДНК, РНК, ΡΝΑ или их производных, действующее вещество предпочтительно выбирают из группы, состоящей из белков, пептидов и ΡΝΑ, содержащих альфа-8Н-бетааминогруппу, предпочтительно содержащих цистеиновую группу, в частности Ν-концевой цистеин, указанный белок предпочтительно выбирают из группы, состоящей из ЕРО, С-С8Р, ΖΕΝ альфа, ΣΕΝ бета, АТ III, П.-2, !Е-3, миоглобина, 8ΘΌ, В8А, гЕЕРО, гЬО-С8Р, γΜΕΝ альфа, γΜΕΝ бета, гРАТ III, г11П.-2, гЫЕ-3, А1АТ, фактора VII, фактора VIII, фактора IX, !РА и АРС.
5. Способ по п.4, в котором действующее вещество выбирают из группы, состоящей из белков, гликопротеинов или пептидов, содержащих альдегидную, кетогруппу или полуацетальную группу, предпочтительно гликопротеинов, содержащих альдегид в гликановой боковой цепи, или синтетических пептидов.
6. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором производное гидроксиалкилкрахмала содержит от 1 до 100, предпочтительно от 1 до 15, в частности 1 альдегидную группу(ы), кетогруппу(ы) и/или полуацетальную группу(ы) или в котором гидроксиалкилкрахмал или его производное содержит от 1 до 100, предпочтительно от 1 до 15, в частности 1 альфа-8Н-бета-аминогруппу(ы).
7. Способ по любому из предыдущих пунктов, в котором действующее вещество содержит от 1 до 15, предпочтительно от 1 до 8, в частности 1 альдегидную группу(ы), кетогруппу(ы) и/или полуацетальную группу(ы) или в котором действующее вещество содержит от 1 до 15, предпочтительно от 1 до 8, в частности 1 альфа-8Н-бета-аминогруппу(ы).
8. Способ по любому из пп.1-7, в котором производное гидроксиалкилкрахмала, содержащее указанную альфа-8Н-бета-аминогруппу, получают способом, включающим взаимодействие гидроксиалкилкрахмала по меньшей мере с одним, по меньшей мере, бифункциональным соединением, указанное соединение содержит две функциональные группы, М₁ и 0, одна функциональная группа М₁ взаимодействует с гидроксиалкилкрахмалом и одна функциональная группа О является:

(ί) альфа-8Н-бета-аминогруппой; или (ίί) функциональной группой, химически модифицируемой для получения альфа-8Н-бетааминогруппы.
9. Способ по п.1 или 8, в котором функциональная группа М₁ взаимодействует с ОН-группой на гидроксиалкилкрахмале или с окисленным или неокисленным восстанавливающим концом гидроксиалкилкрахмала.
10. Способ по п.1, в котором функциональная группа М1 является карбоксильной группой или реакционноспособной карбоксильной группой, а функциональная группа О является альдегидной группой, кетогруппой или полуацетальной группой, причем указанное бифункциональное соединение, содержащее М₁ и 0, предпочтительно выбирают из группы, состоящей из формилбензойной кислоты, пентафторфенилового эфира 4-формилбензойной кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного эфира 4формилбензойной кислоты и 4-(4-формил-3,5-диметоксифенокси)масляной кислоты или биосовместимого соединения, выбранного из группы, состоящей из альфа-кето-карбоновых кислот, нейраминовых кислот или их производных и пиридоксальфосфата.
11. Способ по п.1 или 8, в котором (ίί), по меньшей мере, бифункциональное соединение содержит аминогруппу М₁ и аминогруппу 0, по меньшей мере, бифункциональное соединение предпочтительно представляет собой необязательно замещенный диаминоалкан, имеющий от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно соединение, выбранное из группы, состоящей из 1,2-диаминоэтана, 1,3диаминопропана и 1,4-диаминобутана, 1,5-диаминопентана, 1,6-диаминогексана, 1,7-диаминогептана, 1,8-диаминооктана, 1,9-диаминононана, 1,10-диаминодекана, 1,11-диаминоундекана, 1,12диаминододекана, 1,13-диаминотридекана, 1,14-диаминотетрадекана, 1,15-диаминопентадекана, 1,16диаминогексадекана, 1,17-диаминогептадекана, 1,18-диаминооктадекана, 1,19-диаминононадекана и 1,20-диаминоэйкозана, или соединение, имеющее формулу

Η₂Ν- [ (СК¹'К²' ) рО] Ч[СК³'К⁴' ] γ-νη₂где К¹', К²', К³ ' и К ' независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и алкильной группы, предпочтительно водорода и метильной группы;

р имеет значения от 2 до 4, где остатки К¹' и К²' могут быть одинаковыми или различными в р группах СВ?'К²';

ς имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 10;

г имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 2 до 4, где в случае, если ς=0, то г не равняется 0, и где остатки К³' и К⁴' могут быть одинаковыми или различаться в г группах СК³'К⁴';

и где гидроксиалкилкрахмал предпочтительно взаимодействует по своему необязательно окисленному восстанавливающему концу с функциональной группой М₁, в котором статистически более 50, предпочтительно по меньшей мере 55, более предпочтительно по меньшей мере 60, более предпочтительно по меньшей мере 65, более предпочтительно по меньшей мере 70, более предпочтительно по меньшей мере 75, более предпочтительно по меньшей мере 80, более предпочтительно по меньшей мере

- 32 013910

85, более предпочтительно по меньшей мере 90 и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, например 95, 96, 97, 98 или 99% молекул гидроксиалкилкрахмала, участвовавших в данной реакции, взаимодействуют по меньшей мере одним необязательно окисленным восстанавливающим концом на молекулу гидроксиалкилкрахмала.
12. Способ по п.11, дополнительно включающий взаимодействие производного гидроксиалкил- крахмала, полученного по реакции гидроксиалкилкрахмала, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, содержащим две аминогруппы Μι и О. по аминогруппе О с дополнительным бифункциональным соединением, содержащим альдегидную группу, кетогруппу или полуацетальную группу, для получения производного гидроксиалкилкрахмала, имеющего альдегидную группу, кетогруппу или полуацетальную группу, причем дополнительное бифункциональное соединение предпочтительно выбирают из группы, состоящей из формилбензойной кислоты, пентафторфенилового эфира 4-формилбензойной кислоты, Ν-гидроксисукцинимидного эфира 4-формилбензойной кислоты, 4-(4-формил-3,5диметоксифенокси)масляной кислоты и ангидрида 4-формилбензойной кислоты.
13. Способ по п.1, в котором в (1) функциональную группу Μ! выбирают из группы, состоящей из карбоксильной группы, реакционноспособной карбоксильной группы, ангидрида карбоновой кислоты, галогенида карбоновой кислоты, изоцианата, изотиоцианата, эфира хлороформной кислоты и эпоксидных групп, а функциональная группа О представляет собой альдегидную группу, кетогруппу или полуацетальную группу, в котором функциональная группа Μι предпочтительно взаимодействует с ОНгруппами на гидроксиалкилкрахмале.
14. Способ по п.1, в котором в (1) функциональную группу Μι выбирают из группы, состоящей из аминогруппы и альфа-8Н-бета-аминогруппы, и функциональная группа О представляет собой альфа-8Нбета-аминогруппу, в котором функциональная группа Μι предпочтительно взаимодействует с необязательно окисленным восстанавливающим концом гидроксиалкилкрахмала, в котором статистически предпочтительно более 50, более предпочтительно по меньшей мере 55, более предпочтительно по меньшей мере 60, более предпочтительно по меньшей мере 65, более предпочтительно по меньшей мере 70, более предпочтительно по меньшей мере 75, более предпочтительно по меньшей мере 80, более предпочтительно по меньшей мере 85, более предпочтительно по меньшей мере 90 и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, например 95, 96, 97, 98 или 99% молекул гидроксиалкилкрахмала, участвовавших в данной реакции, взаимодействуют по меньшей мере одним необязательно окисленным восстанавливающим концом на молекулу гидроксиалкилкрахмала.
15. Способ по п.8, в котором в (1) гидроксиалкилкрахмал, содержащий указанную альфа-8Н-бетааминогруппу, получают способом, заключающимся во взаимодействии гидроксиалкилкрахмала на необязательно окисленном восстанавливающем конце с соединением, содержащим функциональную группу Μι и функциональную группу О, представляющую собой альфа-8Н-бета-аминогруппу, в котором соединением, содержащим функциональную группу Μι и альфа-8Н-бета-аминогруппу, является 1,3диамино-2-тиопропан или 2,3-диамино-1-тиопропан.
16. Способ по п.8, в котором в (ίί), по меньшей мере, бифункциональное соединение содержит Μ_μявляющуюся карбоксильной группой или реакционноспособной карбоксильной группой, и О, являющуюся защищенной альфа-8Н-бета-аминогруппой.
17. Способ по п.8, в котором в (ίί), по меньшей мере, бифункциональное соединение выбирают из группы, состоящей из Ό-, Ь-РС1-Су8(РС₂)-ОН или их рацемизированной смеси и их активного эфира, где РС1 может быть любой подходящей защитной группой для аминогруппы, предпочтительно выбираемой из группы, состоящей из трет-бутилоксикарбонила (Вос) или 9-флуоренилметоксикарбонила (Ртос), а РС₂ может быть любой подходящей защитной группой для тиоловой группы, предпочтительно выбираемой из группы, состоящей из тритила (Ττί), р-метокситритила (Μтΐ), 8-трет-бутилтио (δ-ΐ-Ви) и ацетамидометила (Аст).
18. Способ по п.8, в котором в (ίί) гидроксиалкилкрахмал, содержащий указанную альфа-8Н-бета- аминогруппу, получают способом, заключающимся в том, что гидроксиалкилкрахмал, необязательно окисляемый на своем восстанавливающем конце, взаимодействует окисленным или неокисленным восстанавливающим концом с функциональной группой Μ₁ соединения, содержащего помимо Μ₁ дополнительную функциональную группу О, для получения первого производного гидроксиалкилкрахмала, а функциональная группа О первого производного гидроксиалкилкрахмала взаимодействует с функциональной группой V соединения, содержащего помимо V необязательно защищенную альфа-8Н-бетааминогруппу, для получения функционального производного гидроксиалкилкрахмала с необязательно защищенной альфа-8Н-бета-аминогруппой, в котором соединение, содержащее Μι и О, представляет собой предпочтительно диаминосоединение или карбодиимидазол или Ν,Ν'-дисукцинимидилкарбонат, и в котором, по меньшей мере, бифункциональное соединение представляет собой предпочтительно необязательно замещенный диаминоалкан, имеющий от 1 до 20 атомов углерода, предпочтительно соединение, выбранное из группы, состоящей из 1,2-диаминоэтана, 1,3-диаминопропана и 1,4-диаминобутана, 1,5-диаминопентана, 1,6-диаминогексана, 1,7-диаминогептана, 1,8-диаминооктана, 1,9-диаминононана, 1,10-диаминодекана, 1,11-диаминоундекана, 1,12-диаминододекана, 1,13-диаминотридекана, 1,14диаминотетрадекана, 1,15-диаминопентадекана, 1,16-диаминогексадекана, 1,17-диаминогептадекана,

- 33 013910

1,18-диаминооктадекана, 1,19-диаминононадекана и 1,20-диаминоэйкозана, или соединение, имеющее формулу где К¹', К²', К³' и К⁴' независимо выбирают из группы, состоящей из водорода и алкильной группы, предпочтительно водорода и метильной группы;

р имеет значения от 2 до 4, где остатки К¹' и К²' могут быть одинаковыми или различными в р группах СК¹'К²';

ς имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 0 до 10;

г имеет значения от 0 до 20, предпочтительно от 2 до 4, где в случае, если ς=0, то г не равняется 0, и где остатки К³' и К⁴' могут быть одинаковыми или различаться в г группах СК³'К⁴';

в котором предпочтительно соединением, содержащим У и необязательно защищенную альфа-8Нбета-аминогруппу, является цистеин или его производное, У является карбоксильной группой или реакционноспособной карбоксильной группой, предпочтительно реакционноспособным эфиром или ангидридом карбоновой кислоты, или соединение, содержащее У, является 1,3-диамино-2-тиопропаном или 2,3-диамино-1-тиопропаном.
19. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором действующее вещество, предпочтительно необязательно модифицированный белок, пептид, синтетический пептид или олигонуклеотид, содержащие указанную альдегидную группу, кетогруппу, полуацетальную группу или указанную альфа8Н-бета-аминогруппу, получают способом, включающим:

(Ь)(1) введение по меньшей мере одной альдегидной группы, кетогруппы, полуацетальной группы или по меньшей мере одной альфа-8Н-бета-аминогруппы в действующее вещество во время его получения или путем химической модификации или (Ь)(2) взаимодействие действующего вещества, по меньшей мере, с бифункциональным соединением, указанное соединение содержит две функциональные группы М₂ и Р, одну функциональную группу М₂, взаимоидействующую с действующим веществом, и одну функциональную группу Р, представляющую собой:

(1) альдегидную группу, кетогруппу, полуацетальную группу или альфа-8Н-бета-аминогруппу или (и) функциональную группу, химически модифицируемую для получения альдегидной группы, кетогруппы, полуацетальной группы или альфа-8Н-бета-аминогруппы.
20. Способ по п.19, в котором в (Ь)(1) действующее вещество является белком или пептидом, которое получили органическим синтезом, предпочтительно используя синтетическую смолу, с учетом того, что белок или пептид должен содержать функциональную альдегидную группу, функциональную кетогруппу, функциональную полуацетальную группу или функциональную альфа-8Н-бета-аминогруппу, или в котором в (Ь)(1) действующее вещество представляет собой белок или пептид, который получили, используя экспрессирующий вектор, в результате получая белок или пептид, содержащий функциональную альдегидную группу, функциональную кетогруппу, функциональную полуацетальную группу или функциональную альфа-8Н-бета-аминогруппу, или в котором в (Ь)(1) действующее вещество представляет собой белок или пептид, а остов белка или пептида замещают альдегидной группой, кетогруппой, полуацетальной группой или альфа-8Н-бета-аминогруппой, или в котором в (Ь)(1) действующее вещество представляет собой белок или пептид, в котором указанная альдегидная группа, кетогруппа, полуацетальная группа или указанная альфа-8Н-бета-аминогруппа связывается непосредственно с остовом белка или пептида или является частью боковой цепи остова, или в котором действующее вещество представляет собой белок или пептид, а альдегидная группа, кетогруппа или полуацетальная группа содержится в углеводном фрагменте полипептида, в котором предпочтительно указанный углеводный фрагмент выбирают из группы, состоящей из гидроксиальдегидов, гидроксикетонов и их химических модификаций, или является производным природного углеводного фрагмента и выбирается из группы, состоящей из глюкозы, галактозы, маннозы и сиаловой кислоты, которые являются необязательно химически или ферментативно окисленными, предпочтительно остатка окисленной галактозы или окисленной сиаловой кислоты углеводной боковой цепи, более предпочтительно концевого остатка галактозы или сиаловой кислоты углеводной боковой цепи, окисление концевого углеводного фрагмента предпочтительно выполняется либо ферментативно, либо химически, химическое окисление предпочтительно выполняется с использованием перйодата, или является производным природного углеводного фрагмента и является концевой галактозой, химически или ферментативно окисленной, где остаток концевой галактозы необязательно получают после расщепления концевой сиаловой кислоты.
21. Способ по п.19, в котором в (Ь)(2)(1) альфа-8Н-бета-аминогруппа содержится в цистеиновом остатке действующего вещества, предпочтительно белка или пептида, цистеиновый остаток предпочтительно является Ν-концевым цистеиновым остатком действующего вещества.
22. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором действующее вещество представляет собой модифицированный белок или пептид с Ν-концевым цистеиновым остатком, не являющимся

- 34 013910 частью дисульфидного мостика, в котором модифицированный белок или пептид, обладающий Νконцевым цистеиновым остатком, является мутантом природного белка или пептида, полученным путем (1) добавления цистеинового остатка к Ν-концевой аминокислоте, (2) замещения Ν-концевой аминокислоты цистеином или (3) удаления Ν-концевой аминокислоты(т) до тех пор, пока не получится концевой цистеин.
23. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором реакцию (А) или (В) выполняют при температуре от 0 до 40°С, предпочтительно от 0 до 25°С, в частности от 20 до 25°С, в присутствии растворителя и при значениях рН от 3,5 до 10, предпочтительно от 4 до 8, в частности от 4,8 до 8,0, с временем проведения реакции предпочтительно от 0,1 до 24 ч, в частности около 21 ч, растворитель выбирают из группы, состоящей из воды, водного буфера, ЭМЕ, ЭМ3О, ОМА и их смесей, где молекулярное соотношение гидроксиалкилкрахмала к действующему веществу составляет примерно от 1:1 до 200:1, предпочтительно от 10:1 до 100:1, в частности от 40:1 до 70:1.
24. Конъюгат действующего вещества и гидроксиалкилкрахмала, полученный способом по любому из пп.1-23.
25. Конъюгат действующего вещества и гидроксиалкилкрахмала, в котором действующее вещество и гидроксиалкилкрахмал ковалентно связаны с помощью химического остатка, имеющего структуру формулы (I) или формулы (I') или формулы (I) где Κι, К₂, К₂', К₃, К₃' и К4 независимо выбирают из группы, состоящей из водорода, необязательно подходящим образом замещенной, линейной, циклической и/или разветвленной алкильной, арильной, гетероарильной, аралкильной и гетероаралкильной группы, предпочтительно водорода, указанный конъюгат имеет структуру формулы (IV), (IV') или (IV)

- 35 013910 где НА8' представляет собой остаток производного гидроксиалкилкрахмала, который связан с альдегидной группой, кетогруппой или полуацетальной группой, посредством взаимодействия гидроксиалкилкрахмала по меньшей мере с одним, по меньшей мере, бифункциональным соединением, указанное соединение содержит две функциональные группы М₁ и 0, одна функциональная группа М₁ взаимодействует с гидроксиалкилкрахмалом и одна функциональная группа О является:

(1) альдегидной группой, кетогруппой или полуацетальной группой или (ц) функциональной группой, химически модифицируемой для получения альдегидной группы, кетогруппы или полуацетальной группы, и где А8' представляет собой остаток действующего вещества или его производного, который связан с альфа-8Н-бета-аминогруппой, или структуру формулы (V), (V') или (V'') где НА8' является остатком гидроксиалкилкрахмала или его производного, связанным с альфа-8Н-бетааминогруппой, и где А8' является остатком действующего вещества или его производного, связанным с альдегидной группой, кетогруппой или полуацетальной группой.
26. Конъюгат по п.25, в котором конъюгат выбирают из группы, состоящей из

- 36 013910 где Κ₅ определяют как для Κ1-Κ4, рассмотренных выше, где К₅ определяют, как для Κ1-Κ4, рассмотренных выше,

- 37 013910 где в формуле (1У'а), (IУ'Ь), (УЬ) или (Ус) п принимает целочисленные значения, предпочтительно п имеет значения от 0 до 20, и где в формуле (Уа), (Уй), (Уй) или (Уе) п принимает целочисленные значения, предпочтительно п имеет значения от 1 до 20.
27. Конъюгат по п.25, в котором конъюгат представляет собой где В', В'' и/или В''' определяют по формуле (II) и где по меньшей мере в одном мономере глюкозы НЕ8 по меньшей мере один из В', В'' и/или В''' независимо выбирают из группы, состоящей из

- 38 013910 и где п принимает целочисленные значения, предпочтительно от 1 до 20 и/или где по меньшей мере один из Κ', Κ'' и/или Κ''' представляет собой -(СН₂СН₂О)_т-К#, где т является целым числом, предпочтительно от 1 до 3, а Κ# выбирают из группы, состоящей из формулы (У1а), (У1Ь), (У1с) и (νΐά).
28. Альфа-8Н-бета-аминофункциональное производное гидроксиалкилкрахмала, выбранное из группы, состоящей из где К₅ определяют, как для Κχ-Κ₄, рассмотренных выше, и где п является целым числом, предпочтительно от 0 до 20, или из группы, состоящей из где Κ', Κ'' и/или Κ''' определяются по формуле (II) и где по меньшей мере в одном мономере глюкозы НЕ8 по меньшей мере один из Κ', Κ'' и/или Κ''' независимо выбирают из группы, состоящей из

- 39 013910 и где п принимает целочисленные значения, предпочтительно от 1 до 20 и/или где по меньшей мере один из К', К'' и/или К''' представляет собой -(СН₂СН₂О)_т-К# #, где т является целым числом, предпочтительно от 1 до 3, а К# # выбирают из группы, состоящей из формулы (УРа), (УРЬ) и (УРс).
29. Применение конъюгата по любому из пп.24-27 в способе лечения организма человека или животного.
30. Терапевтическое средство, включающее конъюгат по любому из пп.24-27.
31. Фармацевтическая композиция, содержащая конъюгат по любому из пп.24-27, предпочтительно дополнительно содержащая по меньшей мере один фармацевтически приемлемый разбавитель, наполнитель или носитель.
32. Композиция, содержащая конъюгат действующего бому из пп.24-27.

вещества и гидроксиалкилкрахмала по лю-