WO2002102361A1 - Remedes a des maladies provoquees par une mutation non-sens - Google Patents

Remedes a des maladies provoquees par une mutation non-sens Download PDF

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nonsense mutation
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Masayuki Arakawa
Ryouichi Matsuda
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Masayuki Arakawa
Ryouichi Matsuda
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for a disease caused by a nonsense mutation, and in particular, to an agent that induces the nonsense mutation to be read through.
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • mdx mice which are animal models of DMD, exist.
  • This mdx mouse has a nonsense mutation at nucleotide position 3,185 of the dystrophin gene (AA force et al., IAA), resulting in the formation of a stop codon at exon position 23 (Bulfiled, G. et al. , Siller, WG, Wight, PA., Moore, KJ (1989) X chromosome-1 inked muscular dystrophy (mdx) in t he mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1189-1192, Sicinski, P.
  • corticosteroids such as prednisone or deflazacotol and azathioprine
  • a drug that reduces the use of corticosteroids a drug that reduces the use of corticosteroids.
  • the use of corticosteroids has side effects, so the benefit of the drug is limited to short-term use (Granc helli, JA, Pollina,, Hudecki, MS, (2000) Pre-clinical screening of drugs using the drug).
  • Duchenne dyst rophy randomized, control led trial of prednisone (18 months) and azothioprine. Neurology 43, 520-527) 0 Therefore, identifying a clinically useful method of suppressing the immature stop mutation in the dystrophin gene is a significant task for a significant number of DMD patients. Will benefit you.
  • Genya mycin one of the aminoglycoside antibiotics, reduces translation fidelity and thus nonsense.
  • Administration of GM causes suppression of the stop codon during protein translation not only in eukaryotic cells but also in prokaryotic cells.
  • GM has already reported on humans related to cystic fibrosis, Hurler's disease and infant neuronal ceroid 1 ipof use inosis, also caused by nonsense mutations. It has also been used in clinical trials with patient cells.
  • GM has also been shown to restore dystrophin function in drug-treated mdx mice (Barton-Davis, ER, Cordiner, L., Shoturma, DI, Leiland, SE, Sweeney, H L. (1999) Aminoglycoside antib iotics restore dystrophin function to skeletal muscles of md x mice. J Clin Invest 104, 375-381). And GM treatment is currently in clinical trials for Duchenne and limb girdle muscular dystrophy.
  • GM like other aminoglycoside antibiotics, tends to cause many side effects, such as kidney damage and hearing impairment, and prolonged use of one drug may lead to the emergence of drug-resistant bacteria.
  • Disclosure of the invention
  • aminoglycoside antibiotics such as GM are currently potent drug candidates for the treatment of diseases caused by nonsense mutations, but differ from GM because of their severe side effects Drug candidates with other stop codon read-through activity are required.
  • Negamicin methylhydrazinoacetic acid linkage (5-hydroxy-lysine: NM)
  • NM methylhydrazinoacetic acid linkage
  • a first aspect is a composition for treating a disease caused by a nonsense mutation, which comprises a dipeptide antibiotic.
  • the dipeptide antibiotic in the first embodiment is a compound represented by the following formula (1) (molecular weight: 248) or an analog of the compound capable of promoting read-through of nonsense mutation.
  • the disease caused by the nonsense mutation is any one of muscular dystrophy, cystic fibrosis, Hala disease, and infant cellophage lipofuscinosis.
  • the composition for treating a disease caused by a nonsense mutation of the present invention includes diptide.
  • Dipeptide antibiotics do not have the serious side effects of conventional aminoglycoside antibiotics such as genyumycin, and can promote read-through of nonsense mutations. It can be used in combination with genomycin to treat non-sense-induced diseases.
  • negamycin analog a compound structurally similar to negamycin (hereinafter referred to as “negamycin analog”) can also be included.
  • negamycin analog means that the antibacterial activity is not limited, as long as it is structurally similar to negamycin and has an activity that can promote read-through of nonsense mutation, similarly to negamycin.
  • Negamycin can be obtained, for example, from the culture supernatant of actinomycetes strain M890-C2 and strain MF752-NF9 (Hamada, ⁇ ⁇ , Takeuchi, T., Kondo, S. 5 Ikeda, ⁇ ⁇ , Naganawa, H. , Maeda, K., Okami, Y., and Umezawa, H. (1970) A new antibiotic, negamyc in. J Antibiot Tokyo 23, 170-171).
  • the “disease caused by nonsense mutation” is not particularly limited as long as it is a disease caused by loss of gene function due to nonsense mutation.
  • cystic fibrosis CFTR
  • Thalassemia Beta-globin
  • gastric cancer APC
  • Hemophilia Factor !!, IX
  • lung cancer ovarian cancer
  • p53 Duchenne type (dystrophin) and limb girdle muscular dystrophy (a-sarcoglycan), obesity (insulin receptor), phenylketo (Phenylalanine hydroxylase) and others (Atkinson, J., and Martin, R.
  • the dosage form for administration to a patient is not particularly limited, and may be powders, granules, tablets, capsules, solutions, injections, and the like.
  • peptide antibiotics such as negamycin
  • pharmaceutically acceptable excipients such as negamycin
  • binders such as binders, disintegrants, lubricants
  • auxiliary agents such as flavoring agents, solubilizing agents, suspending agents, coating agents, etc. as appropriate be able to.
  • FIG. 1 is a photograph showing the presence / absence of dys-oral fin expression and the rate of muscle degeneration in mdx TA muscle with and without negamycin administration. Immunofluorescence and EBD staining were performed as described in Materials and Methods. Panels A, C, and E show the results of immunofluorescence staining using anti-dystrophin antibodies from B10 control mice, untreated mdx mice, and dragon-treated mdx mice, respectively. Panels B, D and F show the EBD staining patterns of B10 control mice, untreated mdx mice and NM treated mdx mice, respectively. The bar is 100 111.
  • Figure 2 is a graph showing the percentage of dystrophin expression (immunofluorescence-positive fibers) and degenerated muscle fibers (EBD dye-positive fibers) in TA muscle fibers of antibiotic-treated mice.
  • the black bar (shown as “dys” in the figure) indicates the percentage of dystrophin-positive fibers
  • the gray bar shown as “EB” in the figure) indicates the percentage of Evans blue-positive fibers .
  • "Keio” is Mdx mice (7 weeks old, each 6 animals) in PBS entitled 1.2 X 10- 5 mol / ks / day
  • GM is GM
  • Fig. 3 is a photograph showing the results of analysis of dystrophin expression using an im- munobing.
  • (1) shows dystrophies in B10 control mice (lanes A, B, C), control mdx mice (lanes!), E, F) and NM-administered mdx mice (lanes G, H, I). This shows the result of the sim-nove mouth.
  • (2) shows the results of dystrophin imunoblotting in hind limb muscles.
  • Lane A mdx mouse treated with bandits
  • B sample buffer
  • mdx treated with 'NM 100 times A
  • D control mdx mouse without NM
  • E B10 control mouse.
  • FIG. 4 is a photograph showing the results of dystrophin expression in cultured mdx skeletal muscle cells (mdx-sk).
  • C and D show the results of dystrophin expression in the cells shown in A and B, respectively.
  • A phase contrast micrograph of NM (negamicin 50 ⁇ g / m 1) -treated myotube
  • B phase-contrast micrograph of myotube not treated with NM
  • C NM (negamicin 50 ig / ml)
  • Dissected myotube D NM dystrophine staining of untreated myotubes.
  • the bar is 40 m.
  • FIG. 5 is a photograph showing the results of immunoprototyping of dystrophin (427 kDa) in cultured mdx skeletal muscle cells (mdx-sk).
  • a and B are immunotubes of myotubes treated with a marauder (100 jug / ml) for 7 days, C is an untreated mdx myotube, and D is an immunoblot of C2C12 myotube.
  • FIG. 6 is a graph showing changes in body weight of mdx mice upon administration of NM.
  • Ne Gamai Shin administration mdx mice (NM1: ⁇ ): negation 1.2X 10- 5 mol / kg dose, NM 10 ( ⁇ ): NM1.2 ⁇ 1 ( ⁇ 4 mol / kg dose, NM50 ( ⁇ ): NM6.0xl0 " 4 mol / kg administration, marauder 100 (X): NM1.2x10 mol / kg administration, control mdx mouse (solid line): NM non-administration.
  • FIG. 7 shows the results of the hearing measurement of the antibiotic-administered mice by the brainstem response.
  • A, B, and C are the results in mice without antibiotics, mice with NM, and mice with GM, respectively.
  • Flask culture C medium (2.0% glucose, 2.0% starch, 2.0% soybean E key scan, 0.5 dry yeast, 353 ⁇ 4 CaC0 35 0.0005% CuS0 4 - 5H 2 0 3 0.0005MnCl 2 - 4 H 2 0, 0.005% ZnS0 4 - 7H 2 0) 60ml has entered the 500ml flask, the Re fifty it its, inoculated with actinomycetes M890- C2 strain was carried out for 4 days with shaking culture (220 r pm) at 28 degrees. The culture was filtered through a pad light (4%), and the filtrate was collected.
  • the filtrate was passed through anion column chromatography (Diaion SA10A, 1.5 L, OH form) and eluted with a 0.2N HC1 solution to collect an antibacterial activity fraction against the K-12 strain (every 500 ml). Images, fraction numbers 12 to 16). This active fraction was neutralized with aqueous ammonia and concentrated under reduced pressure to 500 ml. Next, this concentrated solution was passed through a cation exchange resin (Amberlite CG50, 250 ml, NH 4 form), developed with 0.1% aqueous ammonia, and an antibacterial activity fraction against the K-12 strain was collected (every 18 g). Fractions, fraction numbers 31-70). This active fraction was freeze-dried to obtain 32.8 mg of a light brown powder.
  • anion column chromatography Diaion SA10A, 1.5 L, OH form
  • This powder was resuspended in a buffer solution, passed through a cation exchange resin (Amberlite CG50, 250 ml, NH 4 form) again, and developed with 0.1% aqueous ammonia in the same manner to obtain an antibacterial activity fraction against the K-12 strain. Collected (fraction every 200 g, fraction number 6). This active fraction was freeze-dried to obtain 13.8 mg of a white powder.
  • a cation exchange resin Amberlite CG50, 250 ml, NH 4 form
  • Jar culture Actinomycetes strain M890-C2 was inoculated into a culture jar containing 5 L of C medium, and shaking culture (300 rpm) was performed at 28 ° C., 5 L / min aeration for 5 days.
  • the culture solution was filtered with perlite (4%) in the same manner as after the above flask culture, and the filtrate was subjected to anion column chromatography (Diaion SA10A, 1.5 L, OH form) to collect the active fraction (500 ml). Fractionation, fraction number 9-12). This active fraction was neutralized with ammonia water and concentrated under reduced pressure to 500 ml.
  • This concentrate was applied to a cation exchange resin, washed with 1 L of distilled water, developed with 0.1% aqueous ammonia, and the active fraction was collected (2 Fractionation for each OOg, washing fraction and fraction number 1-2). The active fraction was freeze-dried to obtain 4.8 g of a brown powder. This powder was resuspended in a buffer, passed through a cation exchange resin (Amberlite CG50, 250 ml, NH 4 form), developed with 0.1% aqueous ammonia, and the active fraction was collected (every 200 g Fractionation, fraction numbers 15 to: 16). The active fraction was freeze-dried to obtain 27.7 mg of a brown powder. Antibacterial activity was also confirmed for fractions 6 to 9 during the second purification using a cation exchange resin.
  • a cation exchange resin Amberlite CG50, 250 ml, NH 4 form
  • mdx mouse was prepared as a dystrophin model mouse. NM was dissolved in PBS immediately before injection into mdx mice and filtered using Millipore to avoid degradation during storage in solution. Barton-Davis, E.R., Cordiner, L., Shoturma, D.I., Lei land, S.E., Sweeney, H.L. (1999) Aminoglycoside antibiotics restore dyst rophin function to skeletal muscles of mdx mice .
  • dystrophin was detected by immunofluorescence and Evanspl-monostaining. Immunofluorescent staining was performed by the following method using an antibody against the C-terminus of dystrophin. Animals were sacrificed by an excess of ether gas and the tibialis anterior (TA) muscle was removed for immunohistochemistry. Frozen in isopentane for study. After freezing, 7 m cross-section frozen sections were prepared. Frozen sections were pre-plated in a blocking solution for 15 minutes with a solution of 20% poma sera in PBS and then washed three times for 10 minutes with PBS. Next, the sections were incubated at room temperature with a primary antibody (Egret anti-distal fin polyclonal antibody, donated by Dr.
  • Evans blue staining was performed by intraperitoneal administration of Evans blue dye (EBD: 0.1% PBS solution of 2% EBD) to all animals 12 hours before sacrifice. Denatured muscle fibers with a permeable membrane are visualized by EBD staining (Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. (1995) Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mice by vital s taining with Evans Blue: Evidence of apoptosis in dystrophin -deficient muscle. J Biochem 118, 959-964).
  • EBD Evans blue dye
  • GM Arakawa, M., Nakayama, Y., Hara, T., Shiozuka, M.,
  • Negamycin can restore dystrophin in mdx s keletal muscle. Acta Myologica XX, 154-158) The percentage of dystrophine-positive TA muscle fibers was higher in mice treated with NM than in mice treated with NM (Fig. 2) ( Increased membrane permeability (EBD-positive). The results were lower in animals, and were lower in mice treated with GM than in mice treated with GM (Fig. 2).
  • the pellet was redissolved in 1 ml of a 1% digitonin solution (0.5 M NaCK, 0.5 M sucrose, 0.1 mM PMSF, 50 mM Tris-HCl, 1 U / ml aprotinin, pH 7.2).
  • a 1% digitonin solution 0.5 M NaCK, 0.5 M sucrose, 0.1 mM PMSF, 50 mM Tris-HCl, 1 U / ml aprotinin, pH 7.2.
  • the mixture was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes at 4 ° C. After centrifugation, wash the pellet three times with 0.2% NP-40 in PBS (500 5001), and add sodium dodecyl sulfate (SDS) sample buffer (62.5 DIM Tris-HCl, 2% SDS, 5 mM Boiled in EDTA, 5% 2-mercaptoethanol, 0.1 mM PMSF, 10% glycerol, pH 6.8) for 4 minutes. After boiling, the supernatant was collected and the protein concentration was determined by the microburette method.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the proteins were transferred from the gel to a nitrocellulose membrane (German Sciences) for immuno-mouthing.
  • a blocking solution 5% skim milk in 25 mM Tris-HCl [pH 7.4], 137 mM NaCK 2.68 mM KC1, [TBS], 0.05% tween 20: 5% skim milk TBST or PBST
  • a dystrophin-specific antibody anti-dystrophin monoclonal antibody DYS3, DYS2, 100-fold diluted [Novocastra, Newcastle, UK] was used.
  • the cells were incubated for 1 hour at room temperature with Rofin polyclonal antibody (500-fold dilution). After three washes with 5% skim milk TBST or PBST for 10 minutes, the membrane was diluted 1000-fold or 3000-fold with 5% skim milk TBST with horseradish peroxidase-conjugated secondary antibody. Incubated. Then, the plate was washed three times with TBST or PBST for 30 minutes. The washed membrane is treated with an enzymatic chemiluminescence (ECL) kit (Amersham Armasia Biotech, Tokyo, Japan), and then exposed to X-ray film and Hyperfilm ECL (Amersham Armasia Biotech). By doing so, the electrophoresis pattern of dystrophin was visualized.
  • ECL enzymatic chemiluminescence
  • Example 3 Effect of NM on dystrophin recovery on immortalized cells (mdx-sk) derived from mdx skeletal muscle cells
  • mdx-sk an SV40T immortalized mdx satellite strain
  • the establishment of mdx-sk was performed by retrovirus vector containing the cDNA of temperature-sensitive simian virus 40 large T antigen in primary culture of mdx myoblasts collected from mdx mice (donated by Dr. Yunichi Drinkwa). This was done by introducing Retroviruses have been described previously (Morita, S., Kojima, T., Kitamura, II. (2000) PI at-E: an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy 7).
  • differentiation medium solution of 4.0xl (T 4 mol / kg) , after were differentiated for 7 days in antibiotic-free medium.
  • C2C12 cells were maintained in growth medium, 38 ° instead of differentiation medium (it was cultured in C 0 2 b Nkyubeta.
  • NM can restore dystrophin in the mdx-sk cells established as described above.
  • 50 ⁇ g / M of M was added to the differentiation medium of the 7-day-old myotube culture. ml and 100 g / ml were added and the culture was continued for a further 7 days. After culturing (in the presence of NM 50 g / ml), the presence or absence of dystrophin recovery was detected by immunofluorescence staining. The medium was removed from the mdx-sk cells and washed twice with PBS. The cells were fixed with 100% ethanol for 15 minutes, and then treated with 0.5% Triton-X100 in PBS for 10 minutes. Cells were washed three times for 10 minutes with PBS.
  • DNase 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride [PMSF], 1 / ml N-tosyl -L-phenylalanylchloromethylketone [TPCK] ⁇ 1 ⁇ -g / l N-tosyl-L-risk mouth Romethylketone [TLCK], 200 U / ml abrotinin, 5 mM ethylenediamine tetraacetic acid [EDTA]) Homogenized in 500 ⁇ 1.
  • PMSF phenylmethylsulfonylfluoride
  • TPCK N-tosyl -L-phenylalanylchloromethylketone
  • TLCK 1 ⁇ -g / l N-tosyl-L-risk mouth
  • EDTA 5 mM ethylenediamine tetraacetic acid
  • Protein A Sepharose ( ⁇ -4 ⁇ (301) (Sigma, Tokyo, Japan) was added, the mixture was incubated at room temperature for another 60 minutes, and the solution was centrifuged at 14,000 rpm for 5 minutes. The cells were washed three times with a 0.2% NP-40 / PBS solution (500 ⁇ l) and boiled in sodium dodecyl sulfate (SDS) buffer for 5 minutes.
  • aminoglycoside antibiotics such as GM are associated with severe side effects. Although these antibiotics are used routinely for the treatment of bacterial infections, they often cause nephrotoxicity and ototoxicity. We investigated weight changes and hearing in mice treated with drugs. The title toxicity was determined by measuring the activity.
  • mice receiving low doses of NM (1 and 10 times the minimum effective dose) continuously gained weight (NM1, NM in Fig. 6).
  • the composition of the present invention is used as a therapeutic agent for diseases caused by nonsense mutations such as muscular dystrophy, cystic fibrosis, and Hurler syndrome, in place of or in combination with genyumycin. , Can be used effectively.

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Description

明細 : ナンセンス変異に起因した疾患の治療薬 技術分野
本発明は、 ナンセンス変異により生じる疾患の治療薬、 特にナンセンス 変異を読み過ごしを誘導する薬剤に関する。 背景技術 '
多く の遺伝疾患は、 翻訳の未成熟な停止を誘導して、 切断型の不 活性かつ不安定な産物（Atkinson, J., and Martin, R. ( 1994) Mut ations to nonsense codons in human genetic disease : implicat ions for gene thrapy by nonsense suppressor tRNAs . Nucleic A cid Res 22, 1327-1334)を生じるヒ ト遺伝子の未成熟な終止変異（s top mutation) が原因である。 その一例と してデュシェンヌ型筋ジ ス ト ロフィー （ DMD) があるが、 この疾患は筋繊維鞘におけるジス ト ロフ ィ ン蛋白質の欠如を特徴とする男性 3500人に 1人が罹患する X 連鎖劣性障害である。
こう した終止変異が起因する疾患の解明および治療方法の開発等 のため、 DMDの動物モデルである mdxマウスが存在する。 この mdxマウ スは、 ジス ト ロフィ ン遺伝子のヌク レオチ ド 3,185位にナンセンス変 異 （ AA力 ら IAA) を有し、 その結果、 ェキソン 23位に終止コ ドンが 形成される （Bulfiled， G. , Siller, W.G. , Wight, PA. , Moore, K. J. ( 1989 ) X chromosome- 1 inked muscular dystrophy (mdx) in t he mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1189- 1192、 Sicinski, P., Geng, Y.， Ryder-Cook, A.S., Barnard, E.A. Darlison, M. G. : Barnard, P.J. (1989) The molecular basis of muscular dystro phy in the mdx mouse. Science 244, 1578-1582) 。 ここで形成さ れた終止コ ドンは蛋白質を未成熟な状態で終止させ、 これによつて ジス ト ロ フィ ンおよびジス ト ロフィ ン関連糖蛋白質複合体の発現が 阻害され、 筋細胞膜でのこれらタンパク質等の欠乏がもたらされる。 DMDの少年の 65%では、 遺伝子は明らかな転位（主に欠失または重複） を含むが、 残りの 35 %はナンセンス変異または転写スプライ シング 部位に影響を及ぼす他の点突然変異を有するジス ト ロフ ィ ン遺伝子 を有する。 現在、 DMD患者および mdxマウスの薬理学的治療は、 プレ ドニゾンまたはデフラザコ一卜のようなコルチコステロイ ドおよび コルチコステロイ ドの使用を軽減する薬剤であるァザチォプリ ンを 用いて主に行われる。 しかし、 コルチコステロイ ドの使用は副作用 を伴うため、 その薬剤による利益は短期間の使用に限られる （Granc helli, J. A., Pollina, ， Hudecki, M.S. , (2000) Pre- clinical screening of drugs using the mdx mouse . Neuromuscular Disord ers. 10, 235-239 Griggs3 R.C., Moxley, R.T 3rd. , Mendell J.R. ;
Fenichel, G.M. , Brooke, Ml, Pestr.onk, A. , Miller, J. P., C wik, V. A. , Pandya, S.， and Robinson, J. (1993) Duchenne dyst rophy： randomized, control led trial of prednisone( 18 months ) and azothioprine. Neurology 43, 520-527) 0 そのため、 ジス 卜 ロフィ ン遺伝子内で未成熟な終止変異を抑制する臨床的に有用な方 法を同定するこ とは、 有意な数の DMD患者に対して利益をもたらすで あろう。
最近、 ナンセンス変異を夕一ゲティ ングした化学療法の可能性が 現れつつある。 アミ ノ グリ コシ ド系抗生物質の一つであるゲン夕マ イ シン （GM) は、 翻訳の忠実度を低下させ、 このよう にナンセンス 変異によって引き起こされた疾患に対して利用しやすい治療を提供 する。 GMの投与によって、 真核細胞のみならず原核細胞においても 蛋白質の翻訳の際に終止コ ドンの抑制が起こる。 GMは既に、 同様に ナンセンス変異が原因で起こる嚢胞性繊維症 （cystic fibrosis) 、 ハーラー疾患（Hurler' s disease)および乳児神経セロイ ド リポフス チン沈着症 ( infant neuronal ceroid 1 ipof use inosis )に関するヒ ト患者細胞,による臨床試験においても用いられている。 また、 GMが 薬剤処置 mdxマウスにおいてジス ト ロ フ ィ ン機能を回復する こ とが 幸 告されている （Barton— Davis， E.R.， Cordiner, L. , Shoturma, D. I., Leiland, S.E.， Sweeney, H. L . (1999) Aminoglycoside antib iotics restore dystrophin function to skeletal muscles of md x mice. J Clin Invest 104, 375-381) 。 そして GM治療は、 デュシ ェンヌ型および肢帯筋ジス ト ロフィ ーに関して現在臨床試験中であ る。
しかしながら、 GMは、 他のアミ ノ グリ コシ ド系抗生物質と同様に、 腎障害および聴力障害のような多く の副作用を引き起こす傾向があ り、 また一剤の長期使用は薬剤耐性細菌の出現を促進する。 発明の開示
上述の通り、 GMのようなアミノグリコシド系抗生物質は現在のところナ ンセンス変異が起因する疾患の治療剤として有力な候補薬剤であるが、 そ の副作用が重篤であるために、 GMとは異なる他の終止コ ドン読み過ごし活 性を有する薬剤候補物質が要求されている。文献において、 1970年に日本 で発見されたジぺプチド系抗生物質であるネガマイシン （メチルヒ ドラジ ノ酢酸結合 (5-ヒ ドロキシ- リジン ： NM) も同様に、 原核細胞翻訳系に おいて終止コ ドンの読み過ごしを誘発することが報告されている （Hamada, M. , Takeuchi , T. , Kondo, S . , Ikeda, Y. , Naganawa, H. , Maeda, K. , Okami , Y. , and Umeza^a, H. ( 1970 ) A nei antibiotic , negamycin . J Antibiot Tokyo 23, 170-171、 Uehara, Υ · , Hori , M.， Umezawa, H. ( 1974) Negamycin inhibits termination of protein synthesis directed by phage f2 RNA in vitro . Biochim Biophys Acta 374, 82-95)。 そこで、 本願発明者らは、 この NM によりナンセンス変異が起因する疾患の治療薬として使用し得る かを mdxマウスを用いて解析し、 NMは in vivoおよび in vitroにおいて 骨格筋にジス トロフィンを回復させることを見出した。 また、 この NM は GM と同等あるいはそれ以上に読み過ごし誘導活性が高く有効である上に GMに比べ毒性が極めて低いことを見出した。 すなわち、 本願発明は、 これ ら本願発明者らの知見に基づく ものであり、 具体的には次の通りである。 第一の態様はジぺプチド系抗生物質を含む、 ナンセンス変異に起因した 疾患の治療用組成物である。
第二の態様は、 上記第一の態様におけるジペプチド系抗生物質が、 下記 式 （ 1 ) で表された化合物 （分子量 248) またはナンセンス変異の読み過 ごしを促進し得る該化合物の類似物である組成物。 式 （ 1 )
H
Figure imgf000006_0001
第三の態様は、 上記第一または第二の態様において、 ナンセンス変異に 起因した疾患が、 筋ジス トロフィー、 嚢胞性繊維症、 ハーラ一疾患および 乳児神経セロイ ドリポフスチン沈着症のいずれかである、 組成物である。 本発明のナンセンス変異に起因した疾患の治療用組成物には、 ジぺプチ ド系構成物質が含まれる。 ジぺプチド系抗生物質は従来のゲン夕マイシン などのアミノグリコシ ド系抗生物質のような重篤な副作用がなく、 また、 ナンセンス変異の読み過ごしを促進し得るため、 ゲン夕マイシンなどに代 えて或いはゲン夕マイシンなどとの併用としてナンセンス変異に起因し た疾患の治療に用いることができる。
ここで 「ジぺプチド系抗生物質」 の好適な例として、 ゲン夕マイシンよ りも読み過ごし促進活性が高い上記式 （ 1 ) で表されたネガマイシン （メ チルヒ ドラジノ酢酸結合 5 -ヒ ドロキシ リジン ： NM) を挙げることが できる。 また、 上記 「ジぺプチド系抗生物質」 として、 ネガマイシンと構 造的に類似している化合物 （以下 「ネガマイシン類似物」 と称する） をも 含めることができる。 ここでネガマイシン類似物とは、 ネガマイシンと構 造的に類似し、 ネガマイシンと同様にナンセンス変異の読み過ごしを促進 し得る活性を持っていれば、 抗菌活性の大小は問わない。
ネガマイシンは、 例えば、 放線菌 M890— C2株、 MF752- NF9株の培養上清 から得ることができる （Hamada， Μ·， Takeuchi , T.， Kondo, S. 5 Ikeda, Υ· , Naganawa, H . , Maeda, K . , Okami , Y.， and Umezawa, H. ( 1970 )A new antibiotic , negamyc in . J Antibiot Tokyo 23， 170 - 171 )。 ネガマイ シン類似物については、 上記放線菌株あるいは他の放線菌の培養上清から ナンセンス変異の読み過ごしを促進し得る活性を指標に得ることも、 また、 天然から調製する以外に上記ネガマイシンを人工的に修飾して調製して もよい。 人工的な修飾は、 ナンセンス変異の読み飛ばし促進活性を調節す る目的、 製剤化や標的細胞へ薬剤を輸送する ドラッグデリバリーなどの目 的で加えられたものであってもよい。
また、 「ナンセンス変異に起因した疾患」 とは、 ナンセンス変異が原因 して遺伝子の機能が欠失することよりに生じた疾患であれば特に限定は なく、例えば、嚢胞性線維症（CFTR)、サラセミァ（Beta- globin)、胃癌（APC )、 血友病（Factor!!, IX)、肺癌、卵巣癌等（p53)、デュシェンヌ型（dystrophin) および肢帯筋ジス ト ロ フ ィ ー（ ァ - sarcoglycan)等、 肥満（insulin receptor)、フェニルケ卜ン尿征 (Phenylalanine hydroxylase)等 (Atkinson, J. , and Martin, R. (1994) Mutations to nonsense codons in human genetic disease: implications for gene therapy by nonsense suppressor tRNAs. Nucleic Acid Res 22 ： 1327-34) を含めることができる。 このうち、 嚢 胞性線維症 (Howard et al. Biochem Soc Trans, 21: 846-851 ( 1996)、 Wilschanski et al. Am J Respir Crit Care Med 161: 860-865 (2000)、 Clancy JP. et al. Am J Respir Crit Care Med, 163:1683 (2001))、 筋 ジス トロフィ一（Barton- Davis et al. J Clin Invest, 104: 375-381(1999)、 Wagner KR et al , Ann Neurol 49:706-711 (2001))、ハーラー症候群 (Hurler Syndrome) (KimM. Keeling, et al. Human Mol. Gene. 10: 291-299 (2001))、 乳児神経セロイ ド リポフスチン沈着症 （Late Infanitiile Neural Ceroid lipofucinosis (2001 lysosomal tripeptidyl - peptidase 1： SI eat DE et al Europ J Paediatr Neurol 5 Suppl A :57-62(2001)) は、 ゲン夕マイ シンの読み過ごし活性を用いて治療研究がされていることから、 このゲン 夕マイシンに代えてネガマイシンによりこれら疾患を治療してもよい。 上記ネガマイシンを用いてナンセンス変異の読み過ごしを誘導するた めには、ネガマイシンを一日体重（kg)当たり lxlO-7mol/kg〜lxl(T½ol/kg、 好ましくは 1x10— 6mol/kg〜lxl0—¾ol/kgを効果が生じる適切な期間、 投 与することにより実施することができる。 また、 患者へ投与するための剤 型は特に限定はなく、 散剤、 顆粒剤、 錠剤、 カプセル剤、 水剤、 注射剤な どとすることができる。 したがって、 製剤化に当たっては、 治療用組成物 には、 主成分である上記ネガマイシンなどのジぺプチド系抗生物質以外に、 必要に応じて薬学的に許容され得る賦形剤、 結合剤、 崩壊剤、 滑沢剤、 矯 味矯臭剤、 溶解補助剤、 懸濁剤、 コーティ ング剤等の補助剤を適宜含める ことができる。 図面の簡単な説明
図 1 はネガマイ シン投与および無投与 mdx TA筋におけるジス ト 口 フ ィ ンの発現の有無と筋変性の割合を示す写真である。 免疫蛍光と E BD染色は材料と方法に記載した通り に実施した。 パネル A、 Cおよび E はそれそれ、 B10対照マウス、 非投与 mdxマウス、 および龍投与 mdxマ ウスの抗ジス ト ロ フィ ン抗体を用いて免疫蛍光染色の結果を示す。 パネル B、 Dおよび Fはそれぞれ、 B10対照マウス、 非投与 mdxマウス、 および NM投与 mdxマウスの EBD染色パターンを示す。 バーは 100 111。
図 2 は抗生物質投与マウスの TA筋繊維におけるジス トロフィ ン発 現 （免疫蛍光陽性繊維） および変性筋繊維 （EBD色素陽性繊維） の割 合を示すグラフである。 黒色バー （図中 「dys」 と して示す） はジス ト ロ フ ィ ン陽性繊維の割合を示し、 灰色バー （図中 「EB」 と して示 す） はエバンスブルー陽性繊維の割合を示す。 「應」は Mdxマウス （ 7 週齢、 各 6匹） に題 1.2 X 10—5 mol/ks/日の PBS溶液を、 「GM」 は GM
1.2 X 10"5 mol/kg/日の PBS溶液を、 2週間皮下注射した。 対照 「md x」 マウス （n= 6 ) および C57BL/10 ( 「M0」 ） （n= 6 ) マウスに は PBS (0.1 ml) のみを注射した。 各マウスについて筋繊維約 350〜5 50個を計数した （n= 6 ) 。 バーは平均値士標準偏差を示す。
図 3はジス ト ロ フィ ン発現をィ ムノ ブ口ティ ングによ り解析した 結果を示す写真である。 （ 1 ) は、 B 10対照マウス （レーン A、 B、 C)、 対照 mdxマウス （レーン！)、 E、 F) 、 NM投与 mdxマウス （レーン G、 H、 I) におけるジス ト ロ フ ィ ンのィ ムノ ブ口 ヅ トの結果を示す。 各マウ ス、 左のレーンから後肢筋 （A、 D、 および G) 、 横隔膜 （B、 E、 およ び H) 、 心筋 （ C、 F、 および I ) におけるジス ト ロフ ィ ン発現を示す。 ( 2 ) は後肢筋におけるジス ト ロフ ィ ンのィ ムノ ブロ ヅ トの結果を 示す。 レーン A: 匪投与 mdxマウス、 B: 試料緩衝液、 ' NM投与 mdx (A の 100倍） 、 D: NM非投与対照 mdxマウス、 E: B10対照マウス。
図 4は培養 mdx骨格筋細胞 （mdx-sk) におけるジス トロフ ィ ン発現 の結果を示す写真である。 Cおよび Dはそれそれ、 Aおよび Bに示す細 胞のジス ト ロフ ィ ン発現結果を示す。 A、 NM (ネガマイシン 50 〃g/m 1) 処理筋管の位相差顕微鏡写真 ； B、 NM非処理筋管の位相差顕微鏡 写真 ； C、 NM (ネガマイ シン 50 ig/ml) 処理筋管のジス ト ロフ ィ ン 染色； D、 NM非処理筋管のジス ト ロフ ィ ン染色。バーは 40 mである。
図 5は培養 mdx骨格筋細胞 （mdx- sk) におけるジス トロフ ィ ン （42 7 kDa) のィムノプロ ヅ トの結果を示す写真である。 Aおよび Bは匪 (1 00 jug/ml) を 7 日間処理した筋管のィ ムノ プロ ヅ トであ り、 Cは無 処理 mdx筋管、 Dは C2C12筋管のィムノ ブロ ッ トである。
図 6は NM投与の際の mdxマウスの体重変化を表すグラフである。 ネ ガマイ シン投与 mdxマウス （NM1 ： ♦) ：匪 1.2X 10— 5 mol/kg投与、 NM 10 (■) ： NM1.2χ1(Γ4 mol/kg投与、 NM50 (▲) ： NM6.0xl0"4 mol/k g投与、 匪 100 ( X ) ： NM1.2x10 mol/kg投与、 対照 mdxマウス （実線 園） ： NM非投与。
図 7は抗生物質投与マウスの聰性脳幹反応による聴力測定結果を 示す。 A、 B、 Cはそれそれ抗生物質未投与マウス、 NM投与マウス、 G M投与マウスにおける結果である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例によ り さ ら に詳細に説明するが、 本発明は 実施例に制限されるものではない。 [実施例 1 ] ネガマイ シンの調製
フラスコ培養 ： C培地 （2.0%グルコース、 2.0%澱粉、 2.0%大豆ェキ ス、 0.5 乾燥酵母、 35¾ CaC035 0.0005% CuS04 - 5H2030.0005MnCl2 - 4 H20， 0.005% ZnS04 - 7H20) 60mlが入った 500mlフラスコ、 50本それそ れに、 放線菌 M890- C2株を植菌し、 28度にて 4 日間振とう培養 （220r pm) を行った。 培養液をパ一ライ ト （ 4 %) でろ過し、 ろ液を回収 した。 ろ液を陰イオンカラムクロマ トグラフィー （Diaion SA10A、 1. 5L、 OH form) に通し、 0.2N HC1溶液で溶出して、 K- 12株に対する抗 菌活性画分を回収した （ 500ml毎に分画、 フラクショ ン番号 1 2〜 1 6 ) 。 この活性画分をアンモニア水で中和し、 500mlまで減圧濃縮し た。次に、 この濃縮液を陽イオン交換樹脂（Amberlite CG50、 250ml、 NH4 form) に通し、 0,1%アンモニア水で展開し、 K- 12株に対する抗 菌活性画分を回収した （18g毎の分画、 フラクショ ン番号 31〜70) 。 この活性画分を凍結乾燥し、 淡褐色粉末 32.8mgを得た。 この粉末を 緩衝液に再懸濁し、 再度、 陽イオン交換樹脂 （Amberlite CG50、 250 ml、 NH4 form) に通し、 同様に 0.1 %アンモニア水で展開して K- 12株 に対する抗菌活性画分を回収した （ 200g毎の分画、 フラクショ ン番 号 6 ) 。 この活性画分を凍結乾燥し白色粉末 13.8mgを得た。
ジャー培養 ： C培地 5Lが入った培養用ジャーに放線菌 M890- C2株を 植菌し、 28度、 5L/分通気にて、 5日間振とう培養 （ 300rpm) を行つ た。 培養液を上記フラスコ培養後と同様にパーライ ト （ 4 %) でろ 過し、 ろ液を陰イオンカラムクロマ ト グラフィ一 （Diaion SA10A、 1. 5L、 OH form) にかけ活性画分を回収した （ 500ml毎に分画、 フラク ショ ン番号 9〜 1 2 ) 。 この活性画分をァンモニァ水で中和、 500ml に減圧濃縮した。 この濃縮液を陽イオン交換樹脂にかけ、 蒸留水 1 L で洗浄した後、 0.1%アンモニア水で展開し、 活性画分を回収した （2 OOg毎に分画、 水洗画分とフラクショ ン番号 1〜 2 ) 。 活性画分を凍 結乾燥し、 褐色粉末 4.8gを得た。 この粉末を緩衝液に再懸濁し、 再 度、 陽イオン交換樹脂 （Amberlite CG50、 250ml、 NH4 form) に通し、 0 · 1 %アンモニア水で展開して活性画分を回収した （ 200g毎の分画、 フラクショ ン番号 15〜： 16) 。 この活性画分を凍結乾燥し褐色粉末 27. 7mgを得た。 なお、 二度目の陽イオン交換樹脂による精製の際、 フラ クシヨ ン番 6〜 9 にも抗菌活性が確認された。
[実施例 2 ] 筋ジス ト ロフィーモデルマウスへのネガマイ シン投与 によるジス ト ロフィ ン発現の回復
ジス トロフィ ンのモデルマウスと して mdxマウスを用意した。 NMは、 溶液での保存中の分解を避けるために、 mdxマウスへの注射直前に PB Sに溶解しミ リポアを用いて濾過した。 バー ト ン-デービスら （Barto n - Davis, E . R. , Cordiner , L. , Shoturma, D . I . , Lei land, S . E . , Sweeney, H. L . (1999) Aminoglycoside antibiotics restore dyst rophin function to skeletal muscles of mdx mice. J Clin Inve st 104, 375- 381) による GM実験と半分の濃度（1.2xl0—5niol/kg)を P BSに溶解した NM溶液 （137mM NaCl、 2.68mM KC1、 8.10mM Na2HS04、 1. 47mM KH2P04) を mdxマウス （雄性 7週齢、 各用量 6匹） に 2週間毎日 皮下注射した。 コン ト ロールの] ndxマウス （n= 6 ) および C57BL/10 (B10、 n= 6 ) には PBSのみ （0.1 ml) を同様に 2週間毎日皮下注射 した。
注射後、 免疫蛍光およびエバンスプル一染色によってジス ト ロフ イ ンの検出を行った。 免疫蛍光染色は、 ジス ト ロフィ ンの C末端に対 する抗体を用いて、 次の方法によ り実施した。 動物をエーテルガス の過剰量によって屠殺し、 前脛骨 （TA) 筋を摘出して、 免疫組織化 学のために融解イ ソペンタン中で凍結した。 凍結後、 7 mの横断面 凍結切片を調製した。 凍結切片をプロ ッキング溶液中で 20%ゥマ血 清の PBS溶液と共に 15分間プレイ ンキュペー ト した後、 PBSによって 1 0分間、 3回洗浄した。 次に切片を室温で一次抗体 （ゥサギ抗ジス ト 口フィ ンポリ ク ロ一ナル抗体、 東京大学ノ ノ ムラ博士の寄贈、 2 % ゥシ血清アルブミ ン [BSA]を含む PBS溶液によつて 200倍希釈） と共に 1時間イ ンキュベー ト した。 一次抗体と反応させた切片を PBSによつ て 3回 10分間洗浄した後、 100倍希釈したフルォレセィ ン標識抗ゥサ ギ IgG (アマシャムフアルマシアバイオテック、 東京、 日本） によつ て切片を室温で 1時間標識した。 二次抗体での標識後、 蛍光顕微鏡 にて蛍光発光に基づきジス ト ロフィ ンの検出を行った。
エバンスブルー染色は、動物全てにエバンスブルー色素（EBD： 2 % EBDの PBS溶液、 0.1 ml) を屠殺の 12時間前に腹腔内投与するこ とに よ り実施した。 EBD染色によ り透過性の膜を有する変性筋繊維が可視 化される (Matsuda, R.， Nishikawa, A., Tanaka, H. ( 1995 ) Visu al ization of dystrophic muscle fibers in mdx mice by vital s taining with Evans Blue ： Evidence of apoptosis in dystrophin -deficient muscle. J Biochem 118, 959-964) 。
免疫蛍光染色の結果、 匪処置 mdxマウス （図 1 E) では、 ジス ト ロ フィ ン陽性コ ン ト ロールの B10マウス （図 1 A) のよう にジス ト ロ フ イ ン陽性繊維が検出された。 一方、 NM非投与 mdxマウス （図 1 C) で は、 筋繊維は全てジス ト ロ フ ィ ン陰性であった （図 1 C) 。 また EBD 陽性繊維 （図 1 B、 D、 F) は、 対応する免疫蛍光染色では全てジス ト ロフィ ン陰性であつた。
薬物投与マウスにおけるジス ト ロ フ ィ ン陽性 TA筋繊維の割合は、 非投与 mdxマウスよ り も高く、 薬物投与マウスとの間では既に報告さ れている GM ( Arakawa, M. , Nakayama, Y.， Hara, T. , Shiozuka, M. ,
Takeda, S . , Kaga, K.， Kondo, S . , Morita, S . , Kitamura, T. , Matsuda, R. (2001 ) Negamycin can restore dystrophin in mdx s keletal muscle. Acta Myologica XX , 154-158) に比べ NM投与マ ウスのほうがジス ト ロフィ ン陽性 TA筋繊維の割合は高かった （図 2 ) ( 膜透過性の増加を示した （EBD陽性） 繊維の割合は、 非投与動物よ り 薬物投与動物において低く、 薬物投与マウス間で比較する と GM投与 マウスに比べ題処理マウスがよ り低いことが示された （図 2 ) 。
これら結果よ り、 NM投与によ り ジス ト ロフィ ンの発現を回復し得 る こ とが示される と ともに、 NMによ り膜透過性を有する変性筋繊維 の形成をよ り効果的に抑制し得るこ とが示された。
上記免疫蛍光染色等によって、 NMがジス ト ロフィ ンの発現を回復 させ得るこ とが示されたこ とから、 さ らに詳細に、 免疫沈降および ィ ムノブロ ッティ ングによ り ジス ト ロフィ ンの発現を確認した。
上記題投与または NM非投与 mdxマウスおよび B10マウスの左後肢筋 ( 600 mg) 、 横隔膜 （100 mg) および心筋 （100 mg) をそれそれ、 1 0%蔗糖および 0.5 mM EDTAを含む pH 7.2のホモジナイズ溶液 （ピ口 ホスフェー ト混合液、 20 mM Na4P207 20 mM NaH2P04、 および 1 mM Mg Cl2、 pH 7.1) 15 ml中、 テフロンホモジナイザーを用い、 最高速で 1 分間ホモジナイズした （Mitchell, R.D. , Palade, P. , and Fleiche r, S. ( 1983 ) Purification of morphological ly intact triad st ructures from skeletal muscle. J Cell Biol 96， 1008 - 1016、 Y oshida, M,， Suzuki, A., Shimizu, T.， and Ozawa, E. (1992) Pr oteinase -sensitive sites on isolated rabbit dystrophin. J. B iochem 112， 433-439) 。 ホモジネー トを RAロータ一 （KUB0TA) にお いて 9, 000 rpmで 15分間遠心した。 上清を回収し、 さらに RAロー夕一 において 14,000 rpmで 30分間遠心して、 ミ クロソーム分画を作製し た。 ペレ ッ トを 1 %ジギ トニン溶液 （0.5 M NaCK 0.5 M蔗糖、 0.1 mM PMSF、 50 mMト リス塩酸、 1 U/mlァプロチニン、 pH7.2) 1 mlに再 溶解させた。
上記の通り調製された mdxマウスおよび B10マウスの筋蛋白質消化 試料を用い、アベら（Abe, M.， Saitoh, 0. , Nakata, H. , Yoda, A. , and Matsuda, R. (1996) Expression of neurofilament proteins in proliferating C2C12 mouse skeletal muscle cells. Exp Cel 1 Res 229, 48-59) に記載された方法に従って免疫沈降を実施した, 上記蛋白質消化試料をそれそれ抗ジス ト ロ フィ ンモノ クローナル抗 体 D S2 ( 10 ju l) [ノボカス ト ラ、 ニューカ ヅスル、 イギリス ]と共 に 4 °Cで一晚イ ンキュベー ト した。 その後、 さ らに小麦ァグルチニ ンセファロ一ス 6B (30 j l) (シグマ社、 東京、 日本） を加え、 溶液を 4 °Cで 60分間イ ンキュベー ト した。 イ ンキュベー ト後、 4 °C にて 14,000rpm、 5分間遠心した。 遠心後、 ペレッ トを 0.2 % NP-40の PBS溶液 （ 500 〃 1) によって 3 回洗浄し、 ドデシル硫酸ナ ト リ ウム (SDS) 試料緩衝液 （62.5 DIMト リス塩酸、 2 %SDS、 5 mM EDTA、 5 % 2-メルカプトエタノール、 0.1 mM PMSF、 10%グリセロール、 pH 6.8) 中で 4分間沸騰させた。 沸騰後、 上清を回収して、 蛋白質濃度をマ イ クロビュレ ツ ト法によって決定した。
免疫沈降後の総蛋白質 25 zgに相当する試料を、 4〜 8 %句配ゲ ルを用いた SDS-ポリ アク リルアミ ドゲル電気泳動（PAGE) に供した。
SDS- PAGE後、 ィ ムノ ブ口ティ ングを行うために、 蛋白質をゲルか らニ ト ロセルロースメ ンブレン （ゲルマンサイェンシズ） に転写し た。 メ ンプレ ンをブロ ッキング溶液 （ 5 %スキムミルクの 25 mMト リ ス塩酸 [pH 7.4]、 137 mM NaCK 2.68 mM KC1、 [TBS]、 0.05%tween 20 : 5 %スキム ミルク TB STまたは PBST) に浸し、 4 °Cでー晚処理し た。 ブロ ッキング後、 ブロ ッキング溶液を用いて希釈したジス ト ロ フィ ン特異的抗体 （抗ジス トロフィ ンモノクローナル抗体 DYS3、 DYS 2、 100倍希釈 [ノボカス ト ラ、 ニューカ ッスル、 イギリス ]、 ゥサギ 抗ジス ト ロフ ィ ンポリ クロ一ナル抗体、 500倍希釈） と共に室温で 1 時間ィ ンキュぺ一 卜 した。 5 %スキムミルク TB STまたは PB STによつ て 10分間、 3回洗浄を行った後、 メ ンブレンを 5 %スキムミルク TBST によつて 1000倍または 3000倍希釈したホースラディ ッシュペルォキ シダ一ゼ結合二次抗体と共にイ ンキュベー ト した。 その後、 TB STま たは PBSTによって 30分間、 3回洗浄した。 洗浄後のメ ンプレンを酵素 化学発光 （ ECL ) キッ ト （アマシャムフ アルマシアバイオテ ック社、 東京、 日本） によって処理した後、 X線フィルム、 ハイパーフィルム ECL (アマシャムフアルマシアバイオテック社） に露出することによ つてジス トロフ ィ ンの泳動パターンを可視化した。
ィ ムノ プロティ ングの結果、 ジス ト ロ フィ ンのバン ドは陽性コン ト ロール B10マウスの後肢筋 （図 3 ( 1 ) A、 B、 C ) において予想通 り検出された。 また、 これら陽性コ ン ト ロールに比してバン ド強度 は低いが、 NM投与] ndx マウスの後肢筋においてもジス ト ロフ ィ ンの バン ドが検出された （図 3 ( 1 ) G、 H、 I ) 。 また、 後肢筋における ジス ト ロフ ィ ン発現結果による と、 NM投与によるジス ト ロ フ ィ ン発 現の回復 （図 3 ( 2 ) A) は、 正常な M 0 後肢筋におけるジス ト ロフ イ ン発現 （図 3 ( 2 ) E) の約 10 %である と推定された。
[実施例 3 ] mdx骨格筋細胞由来の不死化細胞 （mdx-sk) に対する NM のジス トロフィ ン回復効果
培養 mdx骨格筋細胞におけるジス ト ロ フ ィ ンの回復を調べるため に、 まず、 SV40T不死化 mdxサテライ ト株である mdx-skを mdxマウスか ら確立した。 mdx - skの確立は、 mdxマウスから採取した mdx筋芽細胞 の初代培養に温度感受性型シ ミ アンウィルス 40ラージ T抗原の cDNA を有するレ トロウィルスベクタ一 （ ド リ ンクウォー夕一博士の寄贈） を導入する こ とによって行った。 レ ト ロウイルスは、 既に記述され ているよう に （Morita, S. , Kojima, T. , Kitamura, Τ. (2000) PI at-E： an efficient and stable system for transient packaging of retroviruses. Gene Therapy 7, 1063-1066) 、 A、リケージ、ノ グ細胞株 Plat- Eを用いるこ とによって作製した。 細胞株を 20%仔ゥ シ胎児血清を添加したダルべッコ改変ィーグル最小基本培地 （DMEM) 高グルコース型 （4， 500 mgハ） 中、 32.5°C、 C02イ ンキュベータにて 培養、 維持した。 筋の分化を誘導するために、 培地を分化培地 （10% ゥマ血清を含むイーグル MEM) に交換し、 温度を 39.5°Cにシフ トさせ た。 分化誘導後、 細胞を増殖させて、 NM (50〃g/ml， 2.0x10— 4mol/k g または 100〃g/ml, 4.0xl(T4mol/kgの分化培地溶液） を加えた後、 抗生物質不含培地中で 7 日間分化させた。 C2C12細胞は生育培地で維 持した後、分化培地に替えて 38 ° ( 、 C 02 イ ンキュベータにて培養した。
上記の通り確立された mdx- sk 細胞において、 NMによ り ジス ト ロフ イ ンを回復させ得るかを調べるために、 上記 7 日齢筋管培養物の分 化培地に Mの 50 〃g/mlおよび 100 g/mlを加え、 培養をさ らに 7 日 間継続した。 培養 （NM50 g/ml存在下） 後、 免疫蛍光染色によ り ジ ス ト ロフィ ン回復の有無を検出した。 mdx- sk細胞から培地を除去し て、 PBSによって 2回洗浄した。 細胞を 100%エタノールによって 15 分間固定した後、 0.5% トライ ト ン- X100の PBS溶液によって 10分間処 理した。 細胞を PBSによって 10分間、 3回洗浄した。 ブロ ッキング溶 液中で 20%ゥマ血清の PBS溶液と共に 15分間プレイ ンキュペー ト し た後、 細胞を PBSによって 10分間、 3回洗浄した。 細胞を室温で一次 抗体 （ゥサギ抗ジス ト ロフイ ンポリ ク口一ナル抗体、 東京大学ノ ノ ムラ博士の寄贈、 2 %ゥシ血清アルブミ ン [BSA]を含む PBS溶液によ つて 200倍希釈） と共に 1時間イ ンキュベー ト した。 PBSによって 10 分間、 3回洗浄した後、 100倍希釈したフルォレセイ ン標識抗ゥサギ IgG (アマシャムフアルマシアバイオテック、 東京、 日本） によって 細胞を室温で 1時間標識した後、 蛍光顕微鏡を用いて調べた。
免疫蛍光染色の結果、 NM非処理筋管では蛍光発光がほとんど観察 されずジス ト ロフィ ンの発現は見られないが （図 4B，D) 、 一方、 NM 処理筋管では強い蛍光発光が観察され、 ジス ト ロフ ィ ンの発現が確 認された （図 4A,C)
また、 上記培養細胞 （（題 (100 /g/ml3 4.0xl0—4mol/kg)条件下） を用いたィ ムノ プロ ッ トによ り ジス ト ロフ ィ ンの検出も行った。 ま ず、 蛋白質を消化するために、 Mdx-sk筋管 （各 10 cmゼラチンコ一テ イ ング皿） および C2C12筋管を氷中にプールして、 ホモジナイゼ一シ ョ ン溶液 （HS : 20 mMト リス塩酸 [pH 7.6]. 150 mM NaCl、 1 %ノニ デッ ト P-40[NP- 40]、 100 US/ ! DNァーゼ、 l mMフエ二ルメチルス ルホニルフルオラィ ド [PMSF]、 1 /ml N-トシル -L-フエ二ルァラ ニルク ロ ロメチルケ ト ン [TPCK]ヽ 1 μ-g/ l N-トシル- L-リ シルク 口 ロメチルケ ト ン [TLCK]、 200 U/mlアブロチニン、 5 mMェチレンジァ ミ ン四酢酸 [EDTA]) 500 〃1中でホモジナイズした。
上記 mdx- sk筋管蛋白質消化物を用い、 実施例 2 と同様にアベら （前 掲） に記載された方法に従って免疫沈降を実施した。 mdx- skおよび C 2C12筋管蛋白質消化物をそれそれ 9, 000 rpmで遠心後、 上清を回収し た。 上清を抗ジス ト ロフィ ンモノ クローナル抗体 DYS2 ( 3 ul) また は抗ジス ト ロフィ ンモノ ク口一ナル抗体 MANDRA1 ( 3 i l) (シグマ 社、 東京、 日本） と共に室温 （RT ) で 60分間イ ンキュベー ト した。 プロテイ ン Aセファロ一ス（^-4Β ( 30 1 ) (シグマ社、 東京、 日本） を加えて、 室温でさらに 60分間イ ンキュベー ト して、 溶液を 14 , 000 rpmで 5分間遠心した。 ペレッ トを 0. 2 % NP- 40/PBS溶液 （ 500 μ \ ) によって 3回洗浄し、 ドデシル硫酸ナ ト リ ゥム （SDS) 緩衝液中で 5 分間沸騰させた。
各 10 cm皿あた りの免疫沈降後の総蛋白質に相当する試料を、 4〜 8 %勾配ゲルにて SDS-ポリ アク リルアミ ドゲル電気泳動 （PAGE ) を 行った。 PAGE後は、 実施例 2 と同様の方法で、 ニ ト ロセルロースメ ンブレン （ゲルマンサイェンシズ） への転写した後、 特異的抗体 （抗 ジス ト ロフ ィ ンモノ ク口一ナル抗体 DYS3、 DYS2、 100倍希釈 [ノボカ ス トラ、 ニューカ ッスル、 イギリス ]、 ゥサギ抗ジス ト ロフ ィ ンポリ クローナル抗体、 500倍希釈） を用いてィムノブロ ッテイ ングを行つ た。 最終的にメ ンブレ ンを X線フ ィ ルムへの露光等を行う こ とによ り . ジス トロフィ ンの泳動パターンを可視化した。
ィ ムノ ブロ ッティ ングによ り ジス ト ロフ ィ ンの発現を可視化した 結果、 NM非処理の] ndx- sk筋管サンプルでは 427kDaの位置にバン ドが 全く検出されないが、龍処理した mdx- sk筋管サンプルでは（図 5 Α, Β ) . ジス ト ロフ ィ ン陽性 C2C 12筋管サンプル （図 5 D ) と同様に 427kDaの 位置にジス ト ロフィ ン発現によるバン ドが明確に検出された。
[実施例 4 ] NMの毒性試験
一般的に GMのようなアミ ノ グリ コシ ド系抗生物質は、 重度の副作 用に関連している。 これらの抗生物質は、 細菌感染症の治療のため に日常的に用いられているが、 それらはしばしば腎毒性と耳毒性を 引き起こす。 われわれは、 薬物投与マウスにおける体重変化と聴力 活性とを測定することによって題の毒性を調べた。
薬物投与による体重変化の測定は、 雄性 mdxマウス （ 7週齢、 各用 量についてマウス 4匹） に匪 1.2X 10-5 mol/kg (有効量の 1倍） 、 1. 2xl0"4 mol/kg (10倍量） 、 6.0 x 10— 4mol/kg (50倍量） 、 または 1,2 X 10— 3 mol/kg (100倍量） を 14日間毎日注射し、 各マウスの体重を毎 日測定することによ り実施した。 対照試験と して、 同様に mdxマゥス
( 7週齢、 各用量マウス 2 匹） に GM (1.2 X 10—3 mol/kg[100倍量]) を注射し、 各マウスの体重を毎日測定した。
耳毒性の測定は、 Mdxマウスに NMまたは GMの 1.2 X 10—4 mol/kgを 7 日間毎日注射し、 最後の注射の 1 日後にシャピロ ら （Shapiro, S.M.,
Moller, A. R. , Shiu, G. K. Brain-stem auditory evoked potent i als in rats with high-dose pentbarbital . (1984) Electroencep halogr Clin Neurophysiol 58， 266-276) に従って聴性脳幹反応に よ り聴力閾値を測定するこ とによ り実施した。
まず、 聴性脳幹反応の評価による と、 80 dN以下の聴力の喪失は GM 投与マウスに限って認められたが、 NM投与マウスでは認められなか つたこ とが示された （図 7 ) 。 また、 体重変化の測定では、 コン ト ロールのマウスと同様に NMの低用量 （最小有効量の 1倍および 10倍） を投与したマウスの体重は連続的に増加した （図 6 における NM1、 NM 10) 。 しかし、 題の高用量 （50倍および 100倍） を投与したマウスで は体重は減少した （図 6 における NM50、 NM100) 。 但し、 NMの最高用 量が致死的でなかったこ とは注目すべき点である。 この結果とは対 照的に、 従来の GMの高用量 （1.2 X 10—3 mol/kg/日 [100倍]) では、 投 与したマウス全てが 4時間以内に死亡した （図示せず） 。 このこ と は、 謂は に比して毒性が極めて低いことを示している。 産業上の利用の可能性
上述の通り、 本発明によればナンセンス変異によるジス トロフィン発現 欠損を in vitroおよび in vivoで回復させ得ることを明らかにした。 そ して、 この発現回復の効果は従来のゲン夕マイシンに比べ高く、 かつ、 ゲ ン夕マイシンのような重篤な副作用をもたらさないことをも示した。従つ て、 本発明の組成物は、 筋ジス トロフィー、 嚢胞性繊維症、 ハーラー症候 群などのナンセンス変異が起因する疾患の治療薬として、 ゲン夕マイシン に代えてあるいはゲン夕マイシンとの併用として、 有効に利用し得る。

Claims

請求の範囲
1 . ジペプチド系抗生物質を含む、 ナンセンス変異に起因した疾患の治療 用組成物。
2 . ジペプチド系抗生物質が、 下記式 （ 1 ) で表された化合物またはナン センス変異の読み過ごしを促進し得る該化合物の類似物である、 請求の範 囲 1記載の組成物。 式 （ 1 )
Figure imgf000022_0001
3 .ナンセンス変異に起因した疾患が、筋ジス トロフィー、嚢胞性繊維症、 ハーラ一疾患および乳児神経セロイ ドリポフ 'スチン沈着症のいずれかで ある、 請求の範囲 1又は 2記載の組成物。
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