CN112138019A - 环糊精在制备治疗和/或预防多囊肾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了环糊精在制备治疗和/或预防多囊肾病药物中的应用，属于生物技术领域。本发明应用ADPKD模型证明，羟丙基‑β‑环糊精清除多囊肾囊肿组织细胞膜表面的小窝结构后，使小窝蛋白‑1(CAV1)表达降低，进而达到治疗和/或预防基因突变引起的常染色体显性多囊肾病的目的。

Description

环糊精在制备治疗和/或预防多囊肾病药物中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及环糊精在制备治疗和/或预防多囊肾病药物中的应用。

背景技术

多囊肾病最主要为常染色体显性多囊肾病，常染色体显性多囊肾病(ADPKD)是最常见的单基因遗传性肾脏病，主要由pkd1(约占78％)或pkd2(约占15％)基因突变引起，在全球发病率约1/2500～1/1000。ADPKD是一种系统性疾病，临床表现主要为肾脏囊肿不可控地增长最终引起肾脏功能的丧失导致终末期肾脏病，同时在肾外还表现为肝囊肿、胰腺囊肿、高血压及颅内血管瘤等。据统计，在常见的导致需肾脏替代治疗的肾脏疾病中，ADPKD排第4位。目前，对于ADPKD仍缺乏有效的治疗技术，已上市的托伐普坦主要针对的是肾脏的AVP受体靶点，但其引起多尿、脱水及价格昂贵等因素限制其使用。

胞膜窖(caveolae)，即小窝，是细胞膜表面存在的小囊泡是一类富含鞘磷脂和胆固醇的脂筏。小窝蛋白-1(CAV1)是小窝的一种主要组成蛋白，其分子质量为21～24kD，长178AA，编码基因定位于7q31.1，处于D7S522与D7S2460位点之间，其参与小窝的形成、介导膜泡运输、维持细胞胆固醇稳态。目前，对小窝蛋白-1的研究表明小窝蛋白-1与肿瘤发生、发展和转移有关，并且表明其与细胞的增殖、分子信号转导有关。

环糊精能有效地增加一些水溶性不良的药物在水中的溶解度和溶解速度，如前列腺素-CD包合物能增加主药的溶解度从而制成注射剂；还能提高药物(如肠康颗粒挥发油)的稳定性和生物利用度；减少药物(如穿心莲)的不良气味或苦味；降低药物(如双氯芬酸钠)的刺激和毒副作用；以及使药物(如盐酸小檗碱)缓释和改善剂型。目前并未发现环糊精在治疗多囊肾病方面的研究。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供环糊精在制备治疗和/或预防多囊肾病药物中的应用，所述环糊精包括羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)，该羟丙基-β-环糊精可显著抑制多囊肾组织细胞膜表面小窝蛋白-1的表达，达到治疗和/或预防基因突变引起的ADPKD的目的。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了环糊精在制备治疗和/或预防多囊肾病药物中的应用。

优选的，所述多囊肾病包括：常染色体显性遗传性多囊肾病、常染色体隐性遗传性多囊肾病。

本发明提供了环糊精在制备治疗和/或预防pkd1基因或pkd2基因引发的常染色体显性多囊肾病药物中的应用。

优选的，所述环糊精为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精或上述三种的衍生物。

本发明提供了一种治疗和/或预防多囊肾病的药物，含有有效剂量的环糊精及其药学上可接受的载体。

本发明提供了抑制组织细胞膜表面小窝蛋白-1表达的试剂在治疗和/或预防多囊肾病药物中的应用。

优选的，所述抑制组织细胞膜表面小窝蛋白-1表达的试剂包括：特异性干扰小窝蛋白-1表达的抑制剂、拮抗剂、阻断剂。

优选的，所述特异性干扰小窝蛋白-1表达的抑制剂包括：环糊精、与环糊精具有相似或相同活性功能的化合物。

本发明提供了一种治疗和/或预防多囊肾病的药物，含有有效剂量的抑制组织细胞膜表面小窝蛋白-1表达的试剂及其药学上可接受的载体。

优选的，所述有效剂量为0.4～10mg/g。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的环糊精在制备治疗和/或预防多囊肾病药物中的应用，所述环糊精包括羟丙基-β-环糊精，该羟丙基-β-环糊精可显著抑制多囊肾组织细胞膜表面小窝蛋白-1的表达，达到治疗和/或预防基因突变引起的ADPKD的目的。

本发明通过羟丙基-β-环糊精缓解小鼠pkd1基因敲除引起的多囊肾表型的研究结果表明，羟丙基-β-环糊精组的早期诱导模型和晚期诱导模型的多囊肾小鼠肾脏大小较对照组明显减小，肾脏/体重比、囊肿指数、肾功能均有明显改善。

本发明通过免疫组化和Western blot的方法分析小窝蛋白-1(CAV1)在人癌旁肾组织、人多囊肾组织中的表达，结果表明CAV1在人多囊肾组织中显著增加，可知CAV1的表达与多囊肾病有一定的关系。

本发明通过免疫组化、免疫荧光、电镜方法分析早期诱导pkd1条件敲除小鼠的肾组织CAV1的表达，结果表明予以羟丙基-β-环糊精处理的早期诱导敲除pkd1小鼠肾组织中CAV1表达显著降低。

附图说明

图1羟丙基-β-环糊精对早期诱导敲除pkd1小鼠大体肾脏和肾组织切片全面扫描结果。

图2羟丙基-β-环糊精对晚期诱导敲除pkd1小鼠大体肾脏结果。

图3免疫组化分析人癌旁肾组织和人多囊肾组织中CAV1表达情况。

图4Western blot分析人癌旁肾组织和人多囊肾组织中CAV1表达情况。

图5免疫组化和免疫荧光分析敲除pkd1小鼠模型中CAV1的表达情况。

图6电镜观察早期诱导敲除pkd1小鼠上皮细胞内小窝结构情况。

图7免疫荧光分析羟丙基-β-环糊精对早期诱导敲除pkd1小鼠肾组织CAV1表达情况。

具体实施方式

本发明提供了环糊精在制备治疗和/或预防多囊肾病药物中的应用。

在本发明中，所述环糊精包括α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精或上述三种的衍生物；所述环糊精的衍生物还包括葡萄糖-β-环糊精、甲基-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、磺基烷基醚β-环糊精、羟丙基-α-环糊精等。所述环糊精优选为羟丙基-β-环糊精。本发明对所述环糊精的来源没有特殊限定，可以通过从自然界生物体中分离、化学合成，也可通过市售获得的。

在本发明中，所述多囊肾病优选为常染色体显性遗传性多囊肾病、常染色体隐性遗传性多囊肾病，更优选为常染色体显性遗传性多囊肾病。

本发明提供了环糊精在制备治疗和/或预防pkd1基因或pkd2基因引发的常染色体显性多囊肾病药物中的应用。

在本发明中，所述的环糊精与上述应用中环糊精完全一致，在此不做赘述。所述pkd1基因位于人类第16染色体短臂1区3带(16p13)编码序列有12912bp，含46个外显子，蛋白质产物是由4302个氨基酸残基构成的糖蛋白，称为多囊蛋白1。所述pkd1基因表达的多囊蛋白1在ADPKD的发生发展中起着重要的作用，主要表现为：突变的多囊蛋白1参与多条信号转导途径异常，扰乱调节增生/凋亡的信号，使囊肿上皮细胞不断增生；突变的多囊蛋白1在细胞表面缺失，细胞间黏附断裂，导致肾小管极性改变；突变的多囊蛋白1促进肾脏组织内炎症通路异常激活，导致肾脏发生炎症性纤维化等。所述pkd2是一个单拷贝基因，基因定位于4号染色体(4q21-23)，有15个外显子，其编码蛋白产物为968个氨基酸的多囊蛋白2(PC2)，属于钙离子通道的组成亚单位，约15％的ADPKD患者由于pkd2基因突变致病。

本发明提供了一种治疗和/或预防多囊肾病的药物，含有有效剂量的环糊精及其药学上可接受的载体。

在本发明中，所述的环糊精与上述应用中环糊精完全一致，在此不做赘述。

在本发明中，所述药物优选为环糊精或其药学上可接受的载体。本发明对环糊精药学上可接受的载体没有特殊限定，选择可使环糊精发挥活性作用的辅料即可。

本发明提供了抑制组织细胞膜表面小窝蛋白-1表达的试剂在治疗和/或预防多囊肾病药物中的应用。

在本发明中，所述小窝蛋白-1(CAV1)是分子质量为21～24kD的胞膜窖标志蛋白质，主要存在于细胞质膜表面，参与胞膜窖的形成、介导膜泡运输、维持细胞胆固醇稳态；还通过其脚手架结构域(caveolin scaffoldingdomain，CSD)与多种信号分子相互作用，调控细胞的信号转导，影响细胞的增殖、凋亡、转化和癌变等过程。

在本发明中，所述抑制组织细胞膜表面小窝蛋白-1表达的试剂优选为特异性干扰小窝蛋白-1表达的抑制剂、拮抗剂、阻断剂；所述特异性干扰小窝蛋白-1表达的抑制剂优选为环糊精、与环糊精具有相似或相同活性功能的化合物。

本发明提供一种治疗和/或预防多囊肾病的药物，含有有效剂量的抑制组织细胞膜表面小窝蛋白-1表达的试剂及其药学上可接受的载体。

在本发明中，所述药物优选为抑制组织细胞膜表面小窝蛋白-1表达的试剂及其药学上可接受的载体。更优选为环糊精及其药学上可接受的载体。本发明对环糊精药学上可接受的载体没有特殊限定，选择可使环糊精发挥活性作用的辅料即可。

在本发明中，所述有效剂量优选为0.4～10mg/g，更优选为0.4mg/g。

在本发明中，所称的“药物”是指可以用于预防或治疗某种疾病的单一化合物、多种化合物形成的组合物、中药材及其提取物，或指以单一化合物为主要活性成分的组合物或制剂，还指由多种化合物为活性成分的组合物或制剂。“药物”应理解为不仅指根据一国之法律规定，通过其设立的行政机构审批并准予生产的产品，还指在为了获得通过审批和准予生产的过程中，所形成的含单一化合物为活性成分的各类物质形态。“形成”应理解为通过化学合成、生物转化或购买等途径获得。

所述药物包括各种与所含化合物相适应的药物辅料，以制成有利于给药的剂型，如：但不仅限于水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂等。这些药用辅料既可以是各种制剂中常规使用的，如：但不仅限于等渗剂、缓冲液、矫味剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等；也可以是为了与所述物质相适应而选择使用的，如：乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等，这类辅料能有效提高组合物所含化合物的稳定性和溶解性或改变化合物的释放速率和吸收速率等，从而改善各种化合物在生物体内的代谢，进而增强组合物的给药效果。此外，还可以为实现特定的给药目的或方式，如：缓释给药、控释给药和脉冲给药等，而使用的辅料，如：但不仅限于明胶、白蛋白、壳聚糖、聚醚和聚酯类高分子材料，如：但不仅限于聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等。所称的“有利于给药”的主要表现有：但不仅限于提高治疗效果、提高生物利用度、降低毒副作用和提高患者顺应性等。

在水溶液注射剂中，辅料一般包括等渗剂和缓冲液，以及必要的乳化剂(如：Tweeen-80、Pluronic和Poloxamer等)、增溶剂和抑菌剂等。此外，还包括含有药学上可接受的其它药用辅料，如：抗氧剂、pH调节剂和止痛剂等。用于制取口服液体制剂的辅料一般包括溶剂，以及必要的矫味剂、抑菌剂、乳化剂和着色剂等。用于制取片剂的辅料一般包括填充剂(如：淀粉、糖粉、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙和甘露醇等)、粘合剂(如：乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶溶液、蔗糖溶液和聚乙烯吡咯烷酮的水溶液或醇溶液等)、崩解剂(如：干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠)和润滑剂(如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇4,000、聚乙二醇6,000和月桂醇硫酸镁等)等。用于制取乳剂的辅料一般为水、油(如：脂肪酸)、乳化剂，以及必要的防腐剂和矫味剂等。用于制取颗粒剂的辅料与片剂类似，但造粒过程不同。根据需要，将制得的颗粒剂与助流剂混合后装入胶囊即得胶囊剂。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1羟丙基-β-环糊精对敲除pkd1小鼠多囊肾表型的研究

1、对早期诱导小鼠模型的研究

取刚出生的小鼠15只，随机分三组，每组5只，分为正常组、羟丙基-β-环糊精组和对照组。对羟丙基-β-环糊精组和对照组小鼠出生后第10天腹腔注射他莫西芬10mg/kg敲除pkd1，在出生后第13天开始每两天一次腹腔注射羟丙基-β-环糊精溶液(HP-beta-CD/HP-β-CD)(4mg/g)，对照组于同一时间腹腔注射等剂量生理盐水(Saline)，正常组不进行pkd1敲除。待小鼠出生后第30天处死，取其血液进行肾组织切片HE染色和肾功能检测、并对肾脏大体观察。结果见图1和表1。

表1羟丙基-β-环糊精对早期诱导敲除pkd1小鼠肾脏/体重比、血清肌酸酐和尿素氮结果

由图1和表1结果表明，羟丙基-β-环糊精组的早期诱导小鼠模型的多囊肾脏大小相对于对照组明显减小，肾脏/体重比、囊肿指数、肾功能均有明显改善。

2、对晚期诱导小鼠模型的研究

取刚出生的小鼠9只，随机分三组，每组3只，分为正常组、羟丙基-β-环糊精组和对照组。对羟丙基-β-环糊精组和对照组小鼠出生后第27、28天连续腹腔注射他莫西芬,总剂量为250mg/kg敲除pkd1，在出生后第60天开始每两天一次腹腔注射羟丙基-β-环糊精溶液(4mg/g，浓度为400mg/ml)，对照组于同一时间腹腔注射等剂量生理盐水，正常组不进行pkd1敲除。待小鼠出生后第120天处死，进行肾脏大体观察和肾组织切片HE染色。结果见图2和表2。

表2羟丙基-β-环糊精对晚期诱导敲除pkd1小鼠肾脏/体重比结果

由图2和表1结果表明，羟丙基-β-环糊精组的晚期诱导小鼠模型的多囊肾脏大小较对照组明显减小，肾脏/体重比均有明显改善。

实施例2羟丙基-β-环糊精对多囊肾组织中CAV1的抑制作用研究

1、人癌旁肾组织与人多囊肾组织中CAV1的对比研究

取人癌旁肾组织、人多囊肾组织(来源分别为因肾癌切除肾脏患者的肾癌旁组织和多囊肾切除术患者的肾组织，组织获取得到长征医院伦理委员会批准，遵循伦理规范)，通过免疫组化和Western blot的方法分析CAV1的表达情况，结果见图3和图4。

免疫组化实验步骤如下：将人癌旁肾组织、人多囊肾组织经组织固定液固定后予以石蜡包埋，然后制成2μm的切片。55℃烤片过夜，二甲苯和乙醇脱蜡。使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，封闭液封闭和过氧化氢处理后一抗过夜。第二天二抗室温孵育半小时，PBS洗3次后予以辣根过氧化物酶处理，PBS洗3次后进行DAB染色，然后用苏木素染细胞核，10％盐酸酒精分化后流水返兰，石蜡封片后置于显微镜下观察。

Western blot实验步骤如下：将人癌旁肾组织、人多囊肾组织使用INVENT总蛋白提取试剂盒提取总蛋白后，经BCA法测定蛋白浓度，用水和5×loading buffer均一化，95℃加热15min。使用SDS-PAGE胶进行电泳，然后使用20％甲醇电转液电转到PVDF膜上，3％BSA封闭0.5h后一抗过夜。第二天一抗予以TBST洗3次后，加入二抗室温孵育1h，TBST洗3次后，予以BCL液显影。

由图3和图4结果表明，CAV1在人多囊肾组织相较于人癌旁肾组织有所增加，可知CAV1的表达与多囊肾病有一定的关系。

2、羟丙基-β-环糊精对早期诱导敲除pkd1小鼠肾组织中CAV1的表达情况研究

取刚出生的小鼠10只，随机分两组，每组5只，分为敲除pkd1组、对照组。在小鼠出生后第10天对敲除pkd1组腹腔注射他莫西芬10mg/kg敲除pkd1，对照组未进行pkd1敲除，在第30天处死各组小鼠，取其组织进行免疫组化(免疫组化实验步骤同上)、免疫荧光、电镜观察。结果见图5和图6。

免疫荧光实验步骤如下：取上述肾组织经组织固定液固定后予以石蜡包埋，然后制成2μm的切片。55℃烤片过夜，二甲苯和乙醇脱蜡。使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，封闭液封闭和过氧化氢处理后一抗过夜。第二天二抗室温孵育半小时，PBS洗3次后DAPI染细胞核，使用荧光封片剂封片后置于显微镜下观察。

电镜观察实验步骤如下：取上述肾组织经2.5％戊二醛固定，然后经乙醇和丙酮脱水，再进行包埋、固化，使用超薄切片机切片50～60nm，然后用3％醋酸铀-枸橼酸铅双染色，置于透射电镜下观察。

由图5和图6结果表明，敲除pkd1小鼠模型中CAV1的表达明显高于对照组，且早期诱导敲除pkd1小鼠上皮细胞内小窝结构增多，进一步表明敲除正常小鼠pkd1制备的模型与ADPKD表型一致。

取刚出生的小鼠10只，随机分两组，每组5只，分为羟丙基-β-环糊精组和对照组。在小鼠出生后第10天腹腔注射他莫西芬10mg/kg敲除pkd1，在出生后第13天开始每两天一次腹腔注射羟丙基-β-环糊精溶液(4mg/g)，对照组于同一时间腹腔注射等剂量生理盐水。待小鼠出生后第30天处死，取其组织进行免疫荧光检测(免疫荧光实验步骤同上)，观察羟丙基-β-环糊精组和对照组中CAV1表达情况。结果见图7。

由图7结果表明，给予羟丙基-β-环糊精溶液处理的早期诱导pkd1敲除小鼠肾组织中CAV1表达显著降低。

综上研究可知，羟丙基-β-环糊精显著降低了由小鼠pkd1基因缺失引起的肾囊肿体积增大及肾功能减退。使用该药物治疗过程中，无论是早期诱导还是晚期诱导给药方案均未见明显不良反应，小鼠耐受性良好。与生理盐水处理的对照组相比，羟丙基-β-环糊精处理的小鼠肾组织CAV1表达显著降低，进而表明羟丙基-β-环糊精可作为CAV1的抑制剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.环糊精在制备治疗和/或预防多囊肾病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，所述多囊肾病包括：常染色体显性遗传性多囊肾病、常染色体隐性遗传性多囊肾病。

3.环糊精在制备治疗和/或预防pkd1基因或pkd2基因引发的常染色体显性多囊肾病药物中的应用。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的应用，其特征在于，所述环糊精为α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精或上述三种的衍生物。

5.一种治疗和/或预防多囊肾病的药物，其特征在于，含有有效剂量的环糊精及其药学上可接受的载体。

6.抑制组织细胞膜表面小窝蛋白-1表达的试剂在治疗和/或预防多囊肾病药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制组织细胞膜表面小窝蛋白-1表达的试剂包括：特异性干扰小窝蛋白-1表达的抑制剂、拮抗剂、阻断剂。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述特异性干扰小窝蛋白-1表达的抑制剂包括：环糊精、与环糊精具有相似或相同活性功能的化合物。

9.一种治疗和/或预防多囊肾病的药物，其特征在于，含有有效剂量的抑制组织细胞膜表面小窝蛋白-1表达的试剂及其药学上可接受的载体。

10.根据权利要求5或9所述的药物，其特征在于，所述有效剂量为0.4～10mg/g。

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