WO2002095408A1 - Procede de production d'un support sur lequel est immobilisee une substance physiologiquement active et procede de production dudit support, substance physiologiquement active immobilisee, procede d'analyse de constituants dans un echantillon et kit d'analyse de constituants dans un echantillon - Google Patents

Procede de production d'un support sur lequel est immobilisee une substance physiologiquement active et procede de production dudit support, substance physiologiquement active immobilisee, procede d'analyse de constituants dans un echantillon et kit d'analyse de constituants dans un echantillon Download PDF

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carrier
physiologically active
active substance
group
carbon
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PCT/JP2002/004661
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Michifumi Tanga
Hiroshi Okamura
Kenichi Takagi
Makoto Amano
Tatsuo Kurosawa
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Toyo Kohan Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a physiologically active substance-immobilized carrier, a method for producing the carrier, a physiologically active substance immobilized on a carrier, a method for analyzing a target component in a sample using the carrier, and a sample containing the carrier.
  • the present invention provides a kit for analyzing a target component therein.
  • the physiologically active substance refers to a substance that exerts an action specific to a living body, or a protein or peptide derived from a living body.
  • physiologically active substances such as enzymes and antibodies have high selectivity for specific substances, and are used to detect specific biological components with high accuracy by utilizing such properties.
  • an antibody that reacts with a target substance is immobilized on an appropriate solid phase (carrier), the sample is contacted, and the target substance is measured by reacting with a labeled antibody that specifically binds to the target substance, It is frequently used in immunoassays.
  • a physiologically active substance such as a protein or a carbohydrate on a carrier firmly and efficiently due to various surface charges of the protein or the carbohydrate.
  • IgE is used to generate IgE that specifically binds to the allergen that causes the allergy.
  • Test methods have been used, and a method has been implemented in which IgE in patient serum is reacted with an allergen and detected with a labeled anti-IgE antibody.
  • the enzyme is further reacted with an anti-human IgE antibody labeled with an enzyme.
  • a method for generating a human IgE antibody-IgE-enzyme-labeled anti-human IgE antibody complex and detecting the label in the complex Methodhods in enzymology Vol. 184 501-507, 1990; A method of binding to filter paper, reacting it with serum, and detecting with an anti-IgE antibody labeled with a firefly-derived luciferase (Japanese Unexamined Patent Publication No.
  • the present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and has a method of immobilizing a physiologically active substance at a high density and having a high immobilization efficiency, a method for producing the immobilized carrier, An object of the present invention is to provide a method for efficiently analyzing a target component in a sample using the immobilized carrier, and a kit for the analysis. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted studies to achieve the above object, and found that a carrier having a carbon or metal or metalloid carbon compound layer formed on the surface thereof as a carrier for immobilizing a physiologically active substance.
  • the functional group can be coordinated with high density, and the functional group of the physiologically active substance can be bonded to and fixed to this functional group, so that the immobilization efficiency is improved and
  • the present inventors have found that the use of an immobilized carrier makes it possible to efficiently analyze a target component in a sample.
  • the invention of claim 1 provides a bioactive substance-immobilized carrier comprising a carrier having a carbon or metal or metalloid carbon compound layer on which a bioactive substance is immobilized, formed on the carrier surface. Things.
  • the immobilization of the physiologically active substance on the surface of the carrier may be carried out by a known immobilization method, for example, a method of immobilizing by physically adsorbing or a method of immobilizing by chemical bonding.
  • the carbon or metal or metalloid carbon is preferably fixed via a functional group of the carbon compound layer, and in particular, as described in claim 3, the function of the physiologically active substance is It is preferable that the group is immobilized on the surface of the carrier by bonding between the group and carbon or a functional group of the metal or metalloid carbon compound layer.
  • the functional group of the physiologically active substance or Z and the functional group of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer are a hydroxyl group, a carboxyl group, a sulfate group, or a cyano group.
  • One or more selected from the group consisting of a nitro group, a nitro group, a thiol group, an amino group, an aminophenyl group and an epoxy group Preferably, there is.
  • the physiologically active substance is a substance or a protein or a peptide derived from a living body that exerts an action specific to a living body, as described in claim 5, and particularly, an antigen or a protein as described in claim 6. And antibodies are preferred.
  • the physiologically active substance is a tumor marker, a hormone, an environmental hormone, a microorganism or a protein or peptide or a sugar chain antigen, a receptor, a ligand, an allergen, an immunoglobulin, a lectin, a sugar chain, a lipid. And lipopolysaccharide and antibodies against these are particularly preferred.
  • the physiologically active substance is one or more selected from the group consisting of allergens, immunoglobulins, and antibodies thereto.
  • the carbon or metal or metalloid carbon compound is preferably composed of crystalline carbon and / or amorphous carbon, as described in claims 9 and 10.
  • the crystalline carbon is preferably diamond or diamond-like carbon
  • the amorphous carbon is preferably graphite or amorphous carbon.
  • crystalline carbon, particularly diamond is particularly preferred.
  • the invention according to claim 13 is characterized in that a carrier having a carbon or metal or metalloid carbon compound layer having a functional group formed on the surface thereof is brought into contact with a bioactive substance, wherein the bioactive substance is immobilized.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a dani carrier.
  • a functional group is introduced on the surface of the carrier on which the carbon or metal or metalloid carbon compound layer has been formed, and then this is brought into contact with a physiologically active substance.
  • a physiologically active substance Preferably.
  • the functional group to be introduced on the carrier surface is, as described in claim 15, a hydroxyl group, a carboxyl group, a sulfate group, a cyano group, a nitro group, and a thiol group. It is preferably one or more selected from the group consisting of a group, an amino group, an amino group and an epoxy group.
  • the invention according to claim 16 provides a bioactive substance immobilized on a carrier on which a carbon or metal or metalloid carbon compound layer is formed.
  • the invention according to claim 17 provides a method for analyzing a target component in a sample, characterized by using the carrier for immobilizing a physiologically active substance according to any one of claims 1 to 12.
  • the bioactive substance immobilized on the carrier formed by contacting the bioactive substance-immobilized carrier with the sample containing the target component and the sample This is to analyze the complex with the target component.
  • the bioactive substance immobilized on the carrier surface is either an antigen or an antibody as described in claim 19, and the target component is an antigen or an antibody against the bioactive substance.
  • the antigen or antibody is a tumor marker, a hormone, an environmental hormone, a microorganism-derived protein or peptide or a sugar chain antigen, a receptor, a ligand, an allergen, an immunoglobulin, as described in claim 20. It is one or more selected from the group consisting of lectins, sugar chains, lipids, lipopolysaccharides and antibodies thereto.
  • the antigen or antibody is particularly preferably one or more selected from the group consisting of allergens, immunoglobulins, lectins, and antibodies thereto, as described in claim 21. .
  • An invention according to claim 22 provides a kit for analyzing a target component, comprising the physiologically active substance-fixing carrier according to any one of claims 1 to 11.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the analysis of Ig E by the analysis method of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the analysis of IgE for a specific allergen by the analysis method of the present invention. is there.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of IgE analysis obtained in Example 1.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of allergen analysis when the negative serum obtained in Example 2 was used as a sample.
  • FIG. 5 is a diagram showing the results of allergen analysis using the cedar positive serum obtained in Example 2 as a specimen.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of allergen analysis when the mite positive serum obtained in Example 2 was used as a specimen.
  • the carrier for immobilizing a physiologically active substance of the present invention according to claim 1 is characterized in that the carrier comprises a carbon or metal or metalloid carbon compound layer on which a physiologically active substance is immobilized, which is formed on the surface of the carrier.
  • the physiologically active substance is, as described in claim 5, a substance that exerts an action specific to a living body or a protein or peptide derived from a living body.
  • an antigen or Z and an antibody are preferable because a biological component can be accurately analyzed by an antigen-antibody reaction as described later.
  • tumor markers for example, protein antigens such as AFP, PSA, CEA, PGI, PGII, sugar chain antigens such as CA19-9, PIV KA-II, CA 125, etc.
  • Hormones eg, ⁇ , T3, T4, TSH, insulin, C-peptide, LH, FSH, prolactin, etc.
  • environmental hormones eg, tributynoles, noyphenol, 4-octynolephenol, phthalanolate
  • Proteins or peptides derived from microorganisms or carbohydrate antigens eg, Mycobacterium tuberculosis, pneumococci, diphtheria, meningococci
  • carbohydrate antigens eg, Mycobacterium tuberculosis, pneumococci, diphtheria, meningococci
  • Viruses such as fungi such as Candida and T.
  • spirochetes such as Leptosvira and Treponema pallidum
  • proteins or peptides derived from microorganisms such as Chlamydia and Mycoplasma, or sugar chain antigens
  • receptors eg, receptors for estrogen, TSH, etc.
  • ligands for example, estrogens, TSH, etc., allergens (for example, bronchial asthma, allergic rhinitis, inhalable allergens which cause allergic diseases such as rheumatoid dermatitis, etc.)
  • food allergens Strike for example, Kona Hiyoda Mites such as Dermatophagoides pteronyssinus; mites such as Dermatophagoides pteronyssinus; pollen such as cedar, cypress, sparrow crab, ragweed, oooga-gaeri, harugaya, rye, etc., animals
  • Allergens derived from wood, drugs, chemicals, etc. immunoglobulins (eg, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, degradation products thereof, etc.), lectins (eg, concanavalin A, Lentil bean lectin, kidney bean lectin, dalla lectin, wheat germ lectin, etc., sugar chains (eg, ABO antigen), lipids (eg, lipids such as cholesterol monophosphate, phospholipids such as cardiolipin, phosphatidylcholine, and sphingomyelin) Sphingophospholipid, lipoprotein), lipopolysaccharide (eg, endotoxin) and anti- It is particularly preferable that the one or more selected group consisting of.
  • immunoglobulins eg, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, degradation products thereof, etc.
  • lectins eg, concanavalin A,
  • the target component can be analyzed by a protein peptide-protein reaction or the like.
  • a physiologically active substance that specifically binds to a component to be analyzed may be appropriately selected.
  • the target component in the sample is an antigen
  • an antibody against the antigen is selected as the physiologically active substance to be immobilized on the carrier
  • the target component is an antibody
  • the antigen or the antibody against the antibody is selected. What is necessary is just to select the antibody with respect to the said antibody.
  • a single operation can simultaneously analyze two or more different target components present in a sample or analyze unknown target components, that is, detect or identify ⁇ It becomes possible to identify.
  • the target component is a receptor, a ligand, a lectin, a tumor marker (sugar chain), a protein or a peptide, a ligand for the receptor, a receptor for the ligand, a sugar chain for the lectin, a lectin for the tumor marker (sugar chain).
  • a peptide chain for a protein or a protein for a peptide may be selected as a physiologically active substance.
  • bioactive substance-immobilized carrier having immobilized thereon enables analysis of allergies, which is one of the preferred specific embodiments of the present invention.
  • allergen analysis analysis of the presence or absence of allergen in a sample and the amount of allergen, etc.
  • specific analysis of allergens that cause allergic reactions can be performed.
  • an anti-IgE antibody is selected as a physiologically active substance, it is possible to analyze the total amount of IgE present in the sample (e.g., whether or not it is allergic and its degree).
  • an appropriate display for example, assigning a number, etc.
  • the amount of the physiologically active substance immobilized on the carrier on which the carbon or metal or metalloid carbon compound layer is formed varies depending on the surface area of the carrier used, the nature and type of the physiologically active substance, etc., and cannot be determined unconditionally.
  • the immobilization amount per unit area (cm 2 ) of the portion where the physiologically active substance is immobilized is usually 0.1 to 1 mg, preferably 1 to 100 mg / l;
  • the carrier having a carbon or metal or metalloid metal compound layer formed thereon means that the carrier is carbon or metal. Alternatively, the surface is coated with a metalloid metal compound.
  • carbon or metal or metalloid metal compound as described in claims 9 and 10, carbon such as crystalline carbon and amorphous carbon, metal carbon compound, metalloid carbon compound And the like.
  • the crystalline carbon is preferably diamond, diamond-like carbon, or the like, as described in claim 11, and the amorphous carbon is graphite, as described in claim 12. And amorphous carbon are preferred.
  • the metal carbon compound tungsten carbide, titanium carbide and the like are preferable, and as the metalloid metal compound, silicon carbide and the like are preferable.
  • the diamond includes carbonized synthetic diamond, high pressure forming diamond, natural diamond and the like.
  • the crystalline carbon compound may have a single-crystal structure or a polycrystalline structure. These carbon or metal or metalloid carbon compounds may be used alone or in combination of two or more.
  • Crystalline carbon such as diamond and diamond-like carbon
  • Amorphous carbon such as silicon, graphite, and amorphous carbon, and particularly crystalline carbon such as diamond and diamond-like carbon, are particularly preferable because a large amount of a physiologically active substance can be bonded thereon. .
  • the carrier coated with the carbon or metal or metalloid carbon compound in the carbon or metal or metalloid carbon compound layer-forming carrier may be made of various ceramics such as glass, silica gel, silicon, and the like, and may be made of fluoride, iron, nickel or the like.
  • Organic carriers such as inorganic carriers such as alloys containing aluminum, cobalt, etc., and organic synthetic polymers such as cellulose, dextran, polyacrylamide, polystyrene derivatives, maleic anhydride polymers, nylon, and polyatalonitrile.
  • the shape of the carrier is not particularly limited, such as a particle shape, a plate shape, a rod shape, a film shape, a disk shape, and a disk shape. Of these, glass is preferred because it is inexpensive and readily available.
  • the size of the carrier varies depending on the purpose of use and is not particularly limited, but is 100 cm 2 or less, preferably 50 cm 2 or less, more preferably 25 cm 2 or less.
  • the thickness of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer-forming carrier is preferably 1 nm or more. Preferably it is 1.5 nm to 100 nm. If it is less than 1 nm, the effect of the coating cannot be obtained substantially. On the other hand, if the thickness exceeds 100 nm, only the very surface of the substantial coating layer is used, which is wasteful in terms of labor and cost.
  • the carbon or metal or metalloid carbon compound layer can be produced by coating a carrier with a carbon or metal or metalloid metal compound by a known method.
  • Known methods include microwave plasma CVD, ECRCVD, IPC, DC sputtering, ECR sputtering, ion plating, arc ion plating, EB evaporation, resistance heating evaporation, and slurry. Coating methods and the like (JP-A-10-95569, JP-A-8-296044, JP-A-8-165576, JP-A-8-74056, etc.).
  • the surface of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer-forming carrier may be smooth or intentionally roughened. Roughening increases the surface area of the carrier, which is convenient for immobilizing large amounts of bioactive substances.
  • the immobilization of the physiologically active substance on the surface of the carrier may be performed by a known immobilization method, for example, a method of immobilization by physically adsorbing or a method of immobilization by chemical bonding. It is preferable that the bioactive substance is immobilized through a functional group of a carbon or metal or metalloid carbon compound layer, as described in claim 3. It is preferable that the functional group is fixed by bonding between the functional group and the functional group of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer.
  • the functional group of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer may be any as long as it can directly or indirectly bind to a physiologically active substance through a spacer or the like. As described in, one or more selected from the group consisting of a hydroxyl group, a propyloxyl group, a sulfate group, a cyano group, a nitro group, a thiol group, an amino group, an aminophenyl group and an epoxy group Can be
  • the functional group of the physiologically active substance may be any as long as it can directly or indirectly bind to the functional group of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer through a spacer or the like. Examples thereof include those similar to the functional groups of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer.
  • Introduction of a functional group onto the surface of the carbon- or metal- or semi-metallic carbon compound layer-forming carrier can be carried out by activating the carrier surface by chemical modification.
  • Chemical modification of the surface of the carbon- or metal- or semi-metallic carbon compound layer-forming carrier may be performed by adding a hydroxyl group, a carboxyl group, a sulfate group, a cyano group, a nitro group, a thiol group, an amino group, an aminophenyl group or an epoxy group to the surface of the carrier.
  • the functional group may be directly bonded, but may also be bonded via a spacer such as a hydrocarbon group having 1 or more carbon atoms, preferably 1 to 12 and more preferably 1 to 6 carbon atoms.
  • the functional group is carboxy
  • monocarboxylic acids such as formic acid, acetic acid, and propionic acid
  • dicarboxylic acids such as oxalic acid, malonic acid, succinic acid, maleic acid, and fumaric acid
  • polycarboxylic acids such as trimellitic acid
  • the carrier surface is exposed to oxygen plasma. Oxidation, followed by steam treatment; Hydrogenation of the carrier surface, followed by irradiating the carrier surface with ultraviolet rays in chlorine gas to chlorinate the carrier surface, followed by hydrolysis in an alkaline solution for hydroxylation; Carrier A method in which the surface is oxidized with oxygen plasma and then chlorinated and then hydrolyzed in an alkaline solution to cause hydroxylation; the carrier surface is hydrogenated, and then the carrier surface is chlorinated by irradiation with ultraviolet light in chlorine gas.
  • a method of reacting with sodium sulfonate in a non-aqueous solvent may, for example, be mentioned. More specifically, for example, when it is desired to chemically modify the surface of the carbon- or metal- or semi-metallic carbon compound layer-forming carrier with a carboxyl group, hydrogenation treatment of the surface of the carbon- or metal- or semi-metallic carbon compound layer-forming carrier is desired. It is desirable to perform chlorination treatment, amination treatment and carboxylation treatment.
  • the surface of the carrier is hydrogenated, and the surface of the carbon material or the like is chlorinated by irradiating ultraviolet rays in a chlorine gas in the next step, and then is aminated by irradiating it with an ultraviolet ray in an ammonia gas.
  • a method of performing a condensation reaction with a dicarboxylic acid is preferred.
  • the immobilization of the physiologically active substance on the carbon or metal or metalloid carbon compound layer-forming carrier can be performed as follows based on the type of the functional group on the carrier surface (for example, Methodsin Enzymology Vol. 44, p. 11-148, (1976) etc.).
  • the functional group of the carbon or metal or metalloid metal compound layer-forming carrier has an amino group, and the surface of the carbon or metal or metalloid metal compound layer-forming carrier is chemically modified with an amino group.
  • the bioactive substance can be immobilized by binding the carboxyl group of the bioactive substance to the amino group on the surface of the carrier using a condensing reagent such as N-hydroxysuccinimide or carboxydiimide. .
  • immobilization can be performed by binding amino acid derived from a physiologically active substance after isocyanate by applying phosgene to an amino group on the surface of the carrier. Further, immobilization can also be carried out by bonding thiophosphogen to an amino group on the surface of the carrier and isolating the amino group derived from a physiologically active substance after the thiothiogenation.
  • immobilization can be achieved by reacting dartaldehyde with an amino group on the surface of the carrier and reacting it with an amino group or phenol group derived from a physiologically active substance.
  • the physiologically active substance is a sugar or a sugar derivative such as a glycoprotein, it is reacted with periodate in advance, then reacted with an amino group on the surface of the carrier, and further reduced with sodium borohydride or the like. , Can be fixed.
  • the amino group on the surface of the carrier may be replaced with a bifunctional spacer having a maleimide group such as m-maleimide benzoyl N-hydroxysuccinimide ester or a 4-functional succinimidyloxycarbol- ⁇ - ( 2-Pyridyldithio)
  • a bifunctional spacer having a pyridyldithiosulfide group such as toluene, etc.
  • maleidation or pyridyldithiosulfide It can be immobilized by reacting an immobilized carrier with a thiol group of a physiologically active substance.
  • a condensing reagent such as ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ -hydroxysuccinimide and carbodiimide is used to convert the carboxyl group on the carrier surface to the amino group of a physiologically active substance. Act on By reacting, it can be fixed. In addition, the carboxyl group on the surface of the carrier is acted on by the action of thionyl chloride to form a carboxyl sulfide. Immobilization can also be performed by reacting the formed carboxychloride with an amino group derived from a physiologically active substance.
  • hydrochloric acid and methanol are added to the lipoxyl group on the surface of the carrier and reacted, and then hydrazine is added and reacted to form hydrazide.
  • hydrazine is added and reacted to form hydrazide.
  • fluthermore, sodium nitrite and hydrochloric acid are added to hydrazide to form acylazid.
  • the surface of the carrier is activated, it can be immobilized by reacting it with an amino, thiol or hydroxyl group derived from a physiologically active substance.
  • anhydride from a carboxyl group on the surface of the carrier and reacting it with an amino group derived from a physiologically active substance (dehydration condensation), it can be immobilized.
  • the surface of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer-forming carrier is chemically modified with a hydroxyl group if the surface is chemically modified.
  • the surface of the carrier is chemically modified with hydroxyl groups
  • the surface of the carrier is activated by acetylating the hydroxyl groups on the surface of the carrier and then brominating them, and replacing the bromine and iodine with NaI to activate the surface of the carrier.
  • Immobilization can also be performed by reacting with an amino group, thiol group or hydroxyl group of the active substance.
  • cyanogen bromide can be acted on a hydroxyl group on the surface of a carrier to activate the same, and this can be immobilized by covalently bonding to an amino group derived from a physiologically active substance.
  • the surface of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer forming carrier is chemically modified with epoxy groups.
  • it can be immobilized by reacting it with a hydroxyl group derived from a physiologically active substance (derived from tyrosine, serine, etc.), an amino group or a thiol group.
  • the surface of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer-forming carrier is chemically modified with a sulfo / pho group
  • the sulfo group on the surface of the carrier is reacted with salt sulfonic acid to form sulfonyl chloride. It can be immobilized by reacting with an amino group, imidazole group, thiol group, phenol group or the like derived from an active substance.
  • the aminofuryl group on the surface of the carrier is activated with sodium nitrite and hydrochloric acid.
  • Immobilization can also be achieved by using a diazonium coupling method in which a reaction with an amino group, a thiol group, a phenol group, an imidazole group, or a guanidino group derived from a physiologically active substance is performed.
  • the carbon or metal or metalloid metal compound layer-forming carrier has a functional group of a cyano group and the surface of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer-forming carrier is chemically modified with a cyano group, the cyano group is used. Is hydrolyzed in the presence of an acid catalyst, and this is converted into a hydroxyl group, which can be immobilized in the same manner as in (2) above.
  • Lithium aluminum hydride when the surface of the carbon- or metal- or semi-metallic carbon compound layer-forming carrier has been modified with a nitro-functional carbon- or metal- or semi-metallic carbon compound layer-forming surface. After reducing with a reducing agent such as this and converting it to an amino group, immobilization can be carried out in the same manner as in the above (1).
  • the functional group of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer forming carrier is a thiol group
  • the amino group of the physiologically active substance is added to, for example, m-maleimibenzyl N-hydroxysuccinimide ester.
  • Bifunctional spacer having a maleimide group such as, for example, 4-succinimidyloxycarboxy-2- (2-pyridyldithio) bifunctional having a pyridyldithiosulfide group such as toluene
  • Maleimide or pyridyldithiosulfide can be immobilized by reacting the maleimide or pyridyldithiosulfide bioactive substance with a thiol group on the surface of the carrier.
  • bifunctional spacer such as bismaleimide hexane or 1,4-zy (3,1,2,1-pyridyldithio (propionamide)) butane is used.
  • the immobilization can be carried out by reacting the thiol group on the surface of the carrier with the thiol group of the physiologically active substance using the above.
  • the physiologically active substance-immobilized carrier comprising the carrier on which the carbon or metal or metalloid carbon compound layer on which the physiologically active substance according to the present invention is immobilized is formed can be analyzed by non-specific adsorption.
  • blocking more specifically, for example, albumin, globulin, casein, polyvinyl alcohol, surfactants, silane coupling agents, titanium coupling agents, aluminum coupling agents, etc. It is desirable to perform a blocking treatment with a blocking agent.
  • the carrier according to the present invention may be in a variety of forms, for example, in a state of being subjected to a drying treatment, a freezing treatment, a freeze-drying treatment or the like, or a state of being immersed in an appropriate buffer. Can be stored in a state.
  • the buffer examples include a tris buffer, a phosphate buffer, a veronal buffer, a borate buffer, a good buffer and the like which are usually used in this field. May contain, for example, stabilizers such as albumin, globulin, water-soluble gelatin, and polyethylene glycol, surfactants, and saccharides.
  • a physiologically active substance-immobilized carrier is prepared.
  • the method may be performed in accordance with the above-described method, except that two or more different types are appropriately used.
  • a bioactive substance is immobilized on the surface of the carrier by using a known immobilization method, for example, a method of physically adsorbing and immobilizing (physical binding method), etc.
  • a bioactive substance-immobilized carrier comprising a carrier having a carbon or metal or metalloid carbon compound layer on which biomaterial is immobilized formed on the surface can be produced.
  • the carrier and the physiologically active substance can be more firmly bonded to each other, so that the carrier having a carbon or metal or metalloid carbon compound layer having a functional group on its surface is brought into contact with the physiologically active substance. It is preferable to immobilize the physiologically active substance on the surface of the carrier via a functional group of the carbon or metal or metalloid carbon compound layer by a chemical bond (a method of bonding). Group and carbon or metal or semi It is preferable that the physiologically active substance is immobilized on the surface of the carrier by chemically bonding the functional group of the metal carbon compound layer to the functional group.
  • a hydroxyl group examples thereof include one or more selected from the group consisting of a carboxyl group, a sulfate group, a cyano group, a nitro group, a thiol group, an amino group, an aminophenyl group and an epoxy group.
  • the production method of the present invention may be specifically carried out, for example, as follows. That is, when a physical bonding method is used, for example, a solution containing a physiologically active substance is applied, for example, by coating, dripping, or spraying on a carbon or metal or metalloid metal compound layer-forming carrier, or The carrier is immersed in the solution, or a method using a commercially available stamping device (for example, a method using a stamping device sold by Japan Laser Electronics Co., Ltd. or the like) is used to form the carrier and the carrier.
  • a physical bonding method for example, a solution containing a physiologically active substance is applied, for example, by coating, dripping, or spraying on a carbon or metal or metalloid metal compound layer-forming carrier, or The carrier is immersed in the solution, or a method using a commercially available stamping device (for example, a method using a stamping device sold by Japan Laser Electronics Co., Ltd. or the like) is used to form the carrier and the carrier.
  • a physiologically active substance-fixed carrier comprising a carrier having a layer formed on the surface can be obtained.
  • a solution containing a physiologically active substance is applied to a carbon- or metal- or metalloid-carbon compound layer-forming carrier having a functional group on its surface, for example, by coating. , Dripping or spraying, or the carrier in the solution
  • the carrier and the physiologically active substance are immersed in the carrier or a method using a commercially available stamping device (for example, a method using a stamping device sold by Nippon Laser Ichi Electronics Co., Ltd.).
  • the functional group of the carrier and the physiologically active substance specifically, the functional group of the physiologically active substance are reacted and chemically bonded to each other according to a known chemical bonding method.
  • the bioactive substance-immobilized carrier comprising a carrier having a carbon or metal or metalloid carbon compound layer on the surface of which the target bioactive substance is immobilized can be obtained. it can.
  • the carbon or metal or metalloid carbon compound layer-forming carrier does not have an appropriate functional group for binding a physiologically active substance, for example, the carbon
  • the carrier may be brought into contact with the physiologically active substance as described above.
  • the method for introducing a functional group onto the surface of the support on which the carbon or metal or metalloid carbon compound layer is formed is as described above.
  • the solution containing a physiologically active substance may be any of those usually used in this field, for example, Tris buffer, phosphate buffer, Benetal buffer, borate buffer, good buffer. And the like.
  • the amount of the physiologically active substance in the solution at the time of immobilization cannot be specified unconditionally depending on the nature and type of the physiologically active substance to be used, but it is usually from IngZml to; I000mg / ml, preferably 1 / gZml. ⁇ : 10 mg / ml, more preferably 10 zg / ml to 2 mgZml.
  • the physiologically active substance is immobilized on the surface of the carrier so as to be in the concentration range described above.
  • the invention according to claim 16 relates to a physiologically active substance which is solidified on a carrier on which a carbon or metal or metalloid carbon compound layer is formed.
  • a physiologically active substance has not been known so far, and thus, for example, a target component having a property of binding to the physiologically active substance in a sample can be measured with high sensitivity and high accuracy. Become like
  • physiologically active substance the carbon or metal or metalloid carbon compound, the carrier, etc.
  • method of forming the carbon or metal or metalloid carbon compound layer the method of immobilization, etc. are as described above. .
  • the carrier is used as a solution containing a blocking agent such as albumin, pulp, casein, polyvinyl alcohol / leanorecol, a surfactant, a silane coupling agent, a titanium coupling agent, and an aluminum coupling agent. It is desirable to perform a treatment of immersion in the film.
  • a blocking agent such as albumin, pulp, casein, polyvinyl alcohol / leanorecol, a surfactant, a silane coupling agent, a titanium coupling agent, and an aluminum coupling agent. It is desirable to perform a treatment of immersion in the film.
  • the method of the present invention according to claim 17 uses the carrier for immobilizing a physiologically active substance according to any one of claims 1 to 12.
  • the target component in the sample can be efficiently analyzed with high sensitivity and high accuracy. More specifically, as described in claim 18, first, the physiologically active substance-immobilized carrier according to any one of claims 1 to 12 is brought into contact with a sample containing the target component, A complex is formed between the physiologically active substance immobilized on the carrier and the target component in the sample. Subsequently, the target component in the sample may be analyzed by analyzing the complex.
  • a physiologically active substance-immobilized carrier comprising a carrier having a carbon or metal or metalloid carbon compound layer formed on the surface to which two or more different physiologically active substances are immobilized.
  • various target components contained in a sample are contacted substantially simultaneously with all of two or more different physiologically active substances immobilized on a physiologically active substance-immobilized carrier.
  • the various target components in the sample are supplied. The analysis may be performed.
  • target component means a substance capable of specifically binding to a physiologically active substance by, for example, an antigen-antibody reaction, a receptor-ligand reaction, a lectin-sugar chain reaction, or a protein peptide chain reaction. It is. More specifically, the same as the above-mentioned physiologically active substance can be mentioned, and the combination of the physiologically active substance and the target component is also as described above.
  • samples include body fluids such as serum, plasma, cerebrospinal fluid, synovial fluid, and lymph, excretions such as urine and feces, and biological samples such as sputum, pus, and skin-derived materials such as foods, beverages, Environmental samples such as tap water, seawater, lake water, river water, factory effluent, cleaning water for semiconductors, cleaning liquids after cleaning medical instruments, etc., and water or the tris buffer used in this field, such as Tris buffer Solution, a phosphate buffer, a veronal buffer, a borate buffer, a buffer such as a good buffer, and the like.
  • Tris buffer Solution such as Tris buffer Solution, a phosphate buffer, a veronal buffer, a borate buffer, a buffer such as a good buffer, and the like.
  • a physiologically active substance-fixed carrier comprising a carrier having a surface formed with a carbon or metal or metalloid carbon compound layer on which a physiologically active substance is immobilized;
  • Method of contacting with a sample containing, or contacting various target components contained in the sample with all of two or more different biologically active substances immobilized on a physiologically active substance-immobilized carrier substantially simultaneously As a method, the sample is placed on the carrier. Or a method of dipping or coating the carrier in the sample.
  • the complex in order to analyze the complex between the physiologically active substance immobilized on the physiologically active substance-immobilized carrier and the target component in the sample, the complex is usually used, and the target is further analyzed.
  • a labeled binding substance having a property of specifically binding to the component or the complex is brought into contact with the biologically active substance immobilized on the biologically active substance-immobilized carrier, and the target component and the labeled binding substance in the sample are combined with the biologically active substance.
  • a complex (labeled complex) is generated, a labeling substance in the labeled complex is measured, and the measurement is performed based on the result.
  • the target component is a substance that can be detected by any method such as an enzyme, a dye, a fluorescent substance, a luminescent substance, or a substance that absorbs in the ultraviolet
  • the label-binding substance described above must be used. You don't have to.
  • a complex of the physiologically active substance immobilized on the physiologically active substance-immobilized carrier and the target component in the sample, and a labeled binding substance having a property of specifically binding to the target component or the complex are included.
  • a physiologically active substance-immobilized carrier comprising a carrier on which a carbon or metal or metalloid carbon compound layer is formed, the physiologically active substance as described above being immobilized on the surface thereof; It can be performed in the same manner as in the method of contacting the sample containing the component.
  • a labeled binding substance having a property of specifically binding to the target component or the complex is a substance having a property of binding specifically to the target component or the complex and detectable by any method. Which is usually labeled with a labeling substance and has the ability to specifically bind to the target component or the complex.
  • the substance having the ability to specifically bind to the target component or the complex is the same as the above-mentioned physiologically active substance.
  • an antibody or antigen against the target component or the complex is generally used. It is a target.
  • Labeling substances used in the present invention include enzyme immunoassay (EIA), Any method usually used in this field, such as immunoimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay (FIA), and hybridization, may be used.
  • EIA enzyme immunoassay
  • Any method usually used in this field such as immunoimmunoassay (RIA), fluorescent immunoassay (FIA), and hybridization
  • ALP alkaline phosphatase
  • POD peroxidase
  • G6PDH gnorecosoxidase
  • G6PDH glucose-6-phosphate dehydrogenase
  • malate dehydrogenase luciferase enzymes
  • Kumashiburi Lian preparative Blue R250 dyes such as methyl orange, for example, 99 m T c, 131 I, 125 I, 14 C, 3 H, 32 P, 35 S, radioactive same position elements etc.
  • a spin labeling agent represented by compounds having an oxyl group such as to
  • a usual method used in this field for example, a known EIA, RIA, FIA, or hybridization method is used.
  • Labeling methods known per se in general eg, Medical Chemistry Laboratory, Vol. 8, supervised by Yuichi Yamamura, 1st edition, Nakayama Shoten, 1971; Illustrated fluorescent antibody, Akira Kawao, 1st edition, Soft Science Co., Ltd., 1983; Enzyme immunoassay, Eiji Ishikawa, Tadashi Kawai, Kiyoshi Miyai, 3rd edition, Yakuhin Shoin, 1987, Molecular Claw Young Laboratory Laboratory, Second Edition, T. Sampunorek , EF Free C., T. Maniate, Cold Spring Harbor Laboratory Press, etc.], or a conventional method utilizing the reaction of avidin (or streptavidin) with biotin.
  • a carbon or metal or metalloid carbon compound layer on which one or different two or more physiologically active substances are immobilized is formed on the surface of the carrier.
  • a carbon or metal or semi-metallic carbon compound layer on which the target component in a complex of the physiologically active substance-immobilized carrier and the target component in the sample, or one or two or more different physiologically active substances is immobilized Complex of a physiologically active substance-immobilized carrier consisting of a carrier having a surface formed on the surface and a target component in a sample and a label binding substance having a property of specifically binding to the target component or the complex (label complex)
  • the detection of the presence of the target component in the sample can be performed by detecting based on the properties of the labeling substance in the sample.
  • the amount of the target component in the complex or the amount of the labeling substance in the labeled complex is determined by a measuring method according to these properties, and the amount of the sample is determined based on these amounts.
  • the amount of the target component therein can be determined quantitatively or semi-quantitatively.
  • a sample standard product
  • concentration of the target component is measured by the same method, and Calculate the amount of the target component in the sample using a calibration curve that shows the relationship between the concentration of the target component and the obtained measurement value (the measured amount of the target component in the complex or the amount of the labeled substance in the labeled complex).
  • a physiologically active substance-immobilized carrier comprising a carrier having a carbon or metal or metalloid carbon compound layer formed on the surface on which one or two or more different physiologically active substances are immobilized;
  • the sample containing is contacted with each other by the method described above to form a complex of the physiologically active substance and the target component.
  • the carrier is used in the fields of hybridization, immunization, and the like, for example, in Tris buffer, phosphate buffer, Vero " ⁇ " buffer, borate buffer, Good buffer, sSC buffer, etc. Wash with a buffer solution to remove components in the sample that did not participate in the formation of the complex.
  • the resulting complex was brought into contact with the target component or a labeled binding substance having a property of specifically binding to the complex, and the complex was immobilized on a physiologically active substance-immobilized carrier.
  • the carrier is washed with a buffer solution or the like as described above, and the carrier that has not been involved in the generation of the labeled complex is released.
  • the labeled binding substance is removed.
  • the target component in the complex or the labeling substance in the labeled complex is measured by a predetermined method according to these properties, and the target component in the sample can be analyzed based on the result.
  • a so-called competitive method in which a target component labeled with a labeling substance is used and a competitive reaction between the target component and the target component in the sample is used, so that the target molecule in the sample is Can be analyzed.
  • a physiologically active substance-immobilized carrier comprising a carrier having a carbon or metal or metalloid carbon compound layer formed on the surface on which one or two or more different physiologically active substances are immobilized; And a target component labeled with a labeling substance, and a labeled complex of the physiologically active substance and the labeled target component, and a complex of the physiologically active substance and the target component Is generated. Thereafter, the carrier is washed with a buffer solution or the like as described above to remove components in the sample that did not participate in the complex formation and free labeled target components.
  • the labeling substance in the labeling complex or the labeling substance bound to the removed free labeled target component is measured by a predetermined method according to these properties, and based on the results, the amount of the labeling substance in the sample is determined.
  • the target component can be analyzed.
  • a method for labeling a target component with a labeling substance and a carrier for immobilizing a physiologically active substance includes the method of labeling a substance capable of specifically binding to the target component or complex with the labeling substance described above, and the method of immobilizing a bioactive substance.
  • the method is the same as that for bringing the carrier into contact with the sample containing the target component, and the rest is as described above.
  • a predetermined measuring method may be used for each of these types.
  • the property is enzyme activity
  • standard methods such as EIA and hybridization are used.
  • EIA enzyme-linked immunosorbent assay, Protein Nucleic Acid Enzyme Supplement No.31, Kitakawa Tsunehiro, Minamihara Toshio, Tsuji Akio, Eiji Ishikawa Editing , Pages 51-63, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., published on September 10, 1987 ”, etc., and when the detected substance is a radioactive substance, RIA or hybridization is used.
  • the measurement may be performed by a conventional method using a measuring instrument such as a spectrophotometer.
  • the measurement may be performed by a conventional method using a measuring instrument.
  • a conventional method using an electron spin resonance apparatus for example, “Enzyme-linked immunosorbent assay, Protein Nucleic Acid Enzyme Supplement No. 31, Tsunehiro Kitagawa, Toshio Minamihara, Akio Tsuji, Stone
  • the measurement may be performed according to the method described in Eiji Kawai, pp. 264-271, Kyoritsu Shuppan Co., Ltd., published on September 10, 1987.
  • the amount of the labeled binding substance having the property of specifically binding to the target component or the complex cannot be generally determined because it varies depending on the type of the labeled binding substance to be used.
  • the concentration is equal to or higher than the concentration capable of binding to all of the physiologically active substances immobilized on the physiologically active substance-fixed carrier, and the amount of the target component labeled with the labeling substance is also the type of the target component used.
  • the concentration is usually higher than the concentration capable of binding to all the physiologically active substances immobilized on the physiologically active substance-immobilized carrier.
  • the pH and temperature during the reaction cannot be determined unconditionally because they differ depending on the type of the physiologically active substance and the target component, etc., but the complex of the physiologically active substance and the target component,
  • the pH may be within a range that does not prevent the formation of a labeled complex of the substance, the target component, and the labeling substance or a complex of the physiologically active substance and the labeling target component, and the pH is usually 2 to 10; It is preferably 5 to 9, and the temperature is usually 0 to 90 ° C, preferably 20 to 80 ° C.
  • the reaction time depends on the properties of the components forming the complex and the like, and the reaction time is usually several seconds to several hours. I just need to.
  • the biological activity immobilized on the surface of the carrier according to the present invention If an antigen or an antibody is selected as the substance as described in claim 19, an antigen or an antibody against the physiologically active substance present in the sample can be simply and accurately analyzed as a target component. Further, as described in claim 20, tumor markers, hormones, environmental hormones, microbial proteins or peptides or bran chain antigens, receptors, ligands, allergens, immunoglobulins (particularly IgE), lectins, It is useful to select one or two or more selected from the group consisting of sugar chains and antibodies against these, because these can be easily analyzed in the sample or antibodies against these physiologically active substances.
  • a receptor When a receptor, ligand, lectin, tumor marker (sugar chain), protein or peptide, etc. is selected as a physiologically active substance, not only antigen-antibody reaction but also receptor-ligand reaction, lectin-sugar chain It can also be analyzed by a reaction or a protein-peptide chain reaction.
  • allergen as a physiologically active substance, immunoglobulin (especially I g E), or 1 selected from the group consisting of antibodies against ⁇ pico these fixed I those more It is particularly useful if the analysis method of the present invention is carried out using a carrier for immobilizing a physiologically active substance, which enables simple and highly accurate analysis of perilla.
  • an antibody against an allergen is used as a bioactive substance, it is useful for analysis of allergen (analysis of the presence or absence of allergen in a sample and the amount of allergen). It is useful for the specific analysis of allergens that cause allergies (analysis of the allergic response to allergens and the degree of allergic reactions).
  • allergens that cause allergies analysis of the allergic response to allergens and the degree of allergic reactions.
  • active substance When used as an active substance, it is useful for analysis of the total amount of IgE present in a sample (analysis of whether or not it is an allergic substance and its degree).
  • the force of dropping or applying a sample containing the target component (allergen) onto a bioactive substance-immobilized carrier on which an antibody against an allergen is immobilized as a bioactive substance, or the carrier is placed in the sample. It is immersed or the like and brought into contact with each other to form a complex between the antibody against the allergen on the bioactive substance-immobilized carrier and the allergen. Thereafter, the carrier is washed with an appropriate buffer or the like to remove components (free allergens and the like) in the sample that did not participate in the formation of the complex.
  • the produced complex is brought into contact with an antibody against the allergen labeled with a labeling substance (the target binding component or a labeled binding substance having a property of specifically binding to the complex) in the same manner as described above, A labeled complex of the antibody against the allergen immobilized on the active substance-immobilized carrier, the allergen, and the antibody against the labeled allergen is generated. Thereafter, the antibody is washed with an appropriate buffer or the like to remove antibodies against free labeled allergen which did not participate in the formation of the labeled complex. Next, if the labeling substance in the labeling complex is measured by the method described above, it can be analyzed whether or not the allergen is present in the sample.
  • a labeling substance the target binding component or a labeled binding substance having a property of specifically binding to the complex
  • the amount of the labeling substance in the labeling complex is determined by the above-described method, and the amount of the labeling substance obtained is determined in the same manner using a sample (standard product) having a known allergen concentration.
  • the allergen present in the sample can be determined.
  • the amount can be determined quantitatively or semi-quantitatively.
  • a bioactive substance-immobilized carrier consisting of a carrier having a carbon or metal or metalloid carbon compound layer formed on the surface to which antibodies against two or more different allergens are immobilized is used. Is performed in a single operation. This is advantageous because it can identify, identify, and quantify multiple existing allergens.
  • the target component (the allergen) is placed on a bioactive substance-immobilized carrier composed of a carbon or metal or metalloid carbon compound layer on the surface of which an allergen (antigen) is immobilized as a bioactive substance.
  • the carrier containing allergen on the carrier and IgE with respect to the allergen is formed by dropping or applying a sample containing (IgE) to the carrier, or by immersing the carrier into the sample and bringing them into contact with each other. Let it. Thereafter, the carrier is washed with an appropriate buffer or the like to remove components (such as free non-targeted IgE) in the sample that did not participate in the complex formation.
  • the complex thus produced is brought into contact with the anti-IgE antibody labeled with a labeling substance (the labeling substance having the property of specifically binding to the target component or the complex) in the same manner as described above.
  • a labeling substance the labeling substance having the property of specifically binding to the target component or the complex
  • a labeled complex of the allergen immobilized on the carrier, IgE against the allergen and a labeled anti-IgE antibody is generated. Thereafter, this is washed with an appropriate buffer or the like to remove free labeled anti-IgE antibody that has not been involved in the formation of the labeled complex.
  • the labeling substance in the labeling complex is measured by the method described above, it is determined whether or not IgE for the specific allergen used as the physiologically active substance is present in the sample, that is, the sample is derived. Whether or not the living body causes an allergic reaction to a specific allergen, or in other words, the allergen that causes allergy can be identified.
  • the amount of the labeling substance in the labeling complex is determined by the method described above, and the amount of the labeling substance obtained is determined using a sample (standard) with a known IgE concentration.
  • the sample for allergens used as bioactive substances
  • the amount of the antibody (IgE) can be determined quantitatively or semi-quantitatively, whereby the degree of the sensitivity of the living body from which the sample is derived to a specific allergen, that is, the biological Can be analyzed to determine the degree to which it causes an allergic reaction.
  • a bioactive substance-immobilized carrier consisting of a carrier having a carbon or metal or metalloid carbon compound layer formed on the surface to which two or more different allergens are immobilized is used.
  • the type of allergen to which various IgE present in the sample reacts that is, to what kind of allergen the living body of the sample causes an allergic reaction
  • the degree of susceptibility to identification and specific / identified allergens can be analyzed.
  • the target component (I) is placed on a bioactive substance-immobilized carrier comprising a carbon or metal or metalloid carbon compound layer on the surface of which an anti-IgE antibody is immobilized as a bioactive substance.
  • g E) is dropped or applied, or the carriers are immersed in the sample and brought into contact with each other to form a complex of anti-IgE antibody and IgE on the carrier.
  • the carrier is washed with an appropriate buffer or the like to remove components in the sample that did not participate in the formation of the complex.
  • the produced complex is brought into contact with an anti-IgE antibody labeled with a labeling substance (a labeled binding substance having a property of specifically binding to the target component or the complex) in the same manner as described above. Then, a labeled complex of the anti-IgE antibody immobilized on the carrier, the IgE, and the labeled anti-IgE antibody is generated. Thereafter, this is washed with an appropriate buffer or the like to remove free labeled anti-IgE antibody which has not been involved in the production of the labeled complex. Next, the amount of the labeling substance in the labeling complex is determined by the method described above, and the amount of the obtained labeling substance is calculated as follows.
  • a labeling substance a labeled binding substance having a property of specifically binding to the target component or the complex
  • the anti-IgE antibody and two or more allergens different from each other are each immobilized on the same surface, and each comprises a carrier having a carbon or metal or metalloid carbon compound layer formed on the surface.
  • the type of allergen to IgE present in the sample ie, the sample Identify and / or identify the allergen to which allergens cause allergic reactions
  • Analyze the degree of sensitivity to the identified allergens This is advantageous because it can analyze the degree of susceptibility to general allergens (whether or not the organism is monoallergic).
  • Force of dropping or coating a sample containing the target component (IgE) on a physiologically active substance-immobilized carrier consisting of A complex of various allergens with IgE and a complex of anti-IgE antibody on the carrier and IgE are respectively formed.
  • the carrier is washed with a suitable buffer or the like to remove components in the sample that did not participate in the formation of the complex.
  • the produced various complexes are brought into contact with an anti-IgE antibody labeled with a labeling substance in the same manner as described above, and the allergen immobilized on the carrier and the IgE are labeled.
  • a labeled complex with the anti-IgE antibody and a labeled complex of the anti-IgE antibody immobilized on the carrier and the IgE and the labeled anti-IgE antibody are generated, respectively. After which it is removed by dividing the appropriate free labeled anti-I g E antibodies not involved washed and the generation of the labeled complex with a buffer solution or the like.
  • the two substances used as the physiologically active substances were determined. Whether an antibody (IgE) against any of the above allergens is present in the sample, that is, identification / identification of the type of allergen against IgE present in the sample, in other words, It is possible to analyze whether or not the living body of the sample causes an allergic reaction to any allergen. Based on the amount of the labeling substance measured by the method as described above, the method as described above is used.
  • the identification and identification of the living body of the sample can be performed.
  • the degree of intensity of the sensitivity to Arerugen was, that is, to analyze the degree of strength with which the living body causes ⁇ Les Energy response against specific. Identified allergen.
  • the biological activity of the sample can be determined. It is possible to analyze the degree of the susceptibility to allergens in general, that is, whether or not the living body is allergic. Subsequently, a kit for analyzing a target component in a sample according to the present invention described in claim 22 will be described.
  • a kit according to the present invention according to claim 22 includes the physiologically active substance-immobilized carrier according to any one of claims 1 to 12. 'One or two or more physiologically active substances capable of binding specifically to one or more target components to be analyzed are fixed to these physiologically active substance-immobilized carriers.
  • preferred embodiments and specific examples of the physiologically active substance-immobilized carrier are as described above.
  • the kit of the present invention may contain, in addition to the carrier, a labeling substance having the property of specifically binding to the target component or the complex relating to the target component as described above. it can.
  • the kit of the present invention comprises, as described above, reagents usually used in this field as described above, except that the kit comprises the physiologically active substance-immobilized carrier according to any one of claims 1 to 12.
  • a solution such as a buffer solution (washing solution)
  • a color-forming agent such as an acidifying color reagent or a coupling agent
  • a labeling substance is an enzyme
  • a substrate for measuring the enzyme and an enzyme reaction are used.
  • It may contain reagents such as a reaction terminator for terminating the reaction, and standard products comprising the target component.
  • concentration of each component contained in such reagents and standard products may be appropriately selected from the concentration range usually used in this field.
  • IgE was analyzed using a diamond-coated carrier to which an anti-IgE antibody was bound.
  • the diamond-coated carrier covered with carboxylic acid group was treated with 20 mM N-hydroxysucc inimide and 0.1 M l- (3- (dimethylamino) ropyl) 3-ethylcarbodimideSr'a ii 0.1 M phosphate buffer ( It was immersed in pH 6) for 30 minutes. After completion of the immersion, the carrier was washed twice with sterile distilled water, and the diamond-coated carrier was centrifuged to completely remove moisture.
  • the anti-human IgE antibody was adjusted to a predetermined concentration with 50 mM MOPS buffer pH 7.5, and spotted on the activated diamond-coated carrier prepared above using a GT-MA SS stamping machine manufactured by Nippon Laser Electronics.
  • the IgE antibody-enhanced diamond-coated carrier obtained in the above 2 was covered with 50 mM MOPS buffer (pH 7.5) containing 2% bovine serum albumin for 24 hours at room temperature. After the blocking treatment, centrifugation was performed at 1000 rpm for 1 minute.
  • Human IgE to be measured is adjusted to a predetermined concentration with 50 mM MOPS buffer (pH 7.5) containing 2% bovine serum albumin to prepare a sample, and each sample is supplied to a 10 ⁇ L chip. Then, after covering with a cover glass to prevent air bubbles from entering, the cells were placed in a hybridization container and reacted at room temperature for 1 hour. After the reaction was completed, the force glass was removed, washed three times with SSC (0.15 ⁇ NaC 1 -0.015M trisodium citrate solution), and centrifuged at 1000 rpm for 1 minute.
  • MOPS buffer pH 7.5
  • bovine serum albumin bovine serum albumin
  • the degree of the antigen-antibody reaction was measured using a confocal laser scanner manufactured by GSI Lumonicus to measure the amount of the Cy 3 label anti-human IgE antibody.
  • the measurement results are shown in Table 1 and FIG. Measurement results of anti-human IgE antibody levels
  • allergen analysis was performed using a diamond-coated carrier to which an anti-IgE antibody was bound.
  • a diamond-coated substrate covered with a carboxyl group was treated with 0.1 M phosphate buffer containing 20 mM N-hydroxysuccinimide and 0.1 M 1- (3-dimethylamino) propyl 3-ethylcarpoimide. H 6) for 30 minutes. Thereafter, this was washed twice with sterile distilled water, and centrifuged to completely evaporate water.
  • Allergens were adjusted to a concentration of 0.5 mgZml each with 50 mM MOPS buffer (pH 7.5), and the activated diamond-coated substrate prepared above was applied to Nippon Laser Electronics Co., Ltd. GT— Spotted using a MAS S stamping machine. After spotting, incubate for 1 hour in a humidified chamber containing 50% formamide. Was.
  • Serum from a human that shows an allergic reaction to cedar or tick (cedar-positive serum or mite-positive serum) and human serum that does not show an allergic reaction to both (negative serum) were used as samples.
  • Serum 10 was applied to each of the microarrays, covered with a cover glass to prevent air bubbles, and reacted at 4 ° C for 24 hours. After the reaction, the cover glass was removed, washed three times with 1 ⁇ SSC, and excess water was removed by centrifugation.
  • the degree of antigen-antibody reaction was measured using a confocal laser scanner manufactured by GSI Lumonicus to measure the fluorescence derived from the Cy 3 label anti-human IgE antibody.
  • Fig. 4 shows the results when negative serum was used as the sample
  • Fig. 5 shows the results when cedar positive serum was used as the sample
  • Fig. 6 shows the results when mite positive serum was used as the sample. Shown respectively.
  • FIG. 6 weak fluorescence derived from the Cy 3 label anti-human IgE antibody was also observed from the cedar antigen-immobilized site on the microarray. As a result of a detailed examination of, it shows that it shows a slight allergic reaction not only to mites but also to cedar. That is, the mite-positive serum was a serum that showed an allergic reaction to ticks and cedar. It is. From these results, it is understood that the method of the present invention enables the identification of an allergen causing allergy. In addition, it can be seen that the degree of sensitivity to the specified allergen can be analyzed. Industrial applicability
  • the physiologically active substance-immobilized carrier of the present invention can immobilize a physiologically active substance at a high density, a high immobilization efficiency can be realized without consuming a large amount of the physiologically active substance. Even with a bioactive substance having various surface charges, high immobilization efficiency can be maintained.
  • the carrier can be produced efficiently. it can.
  • the method of the present invention for analyzing a target component in a sample uses the carrier, so that various target components can be accurately analyzed.
  • the analysis of the target component in the sample can be performed more easily.
  • a carrier on which an anti-IgE antibody is immobilized can accurately analyze IgE, which reacts with allergens and is deeply involved in allergy, and is useful for various immunodiagnoses such as the cause of allergies. .
  • the present invention is useful in various fields such as disease diagnosis in the medical field, biochemistry, and research in the field of molecular biology.

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Description

明 細 書 生理活性物質固定化担体及びその製造方法、 固定化生理活性物質、 試料中の対象 成分分析方法、 並びに試料中の対象成分分析用キット 技術分野
本発明は、 生理活性物質固定化担体、 前記担体の製造方法、 担体上に固定化さ れた生理活性物質、 前記担体を用いて試料中の対象成分を分析する方法、 並びに 前記担体を含む試料中の対象成分分析用キットを提供するものである。
なお、 本発明において生理活性物質とは、 生体に特有の作用を及ぼす物質又は 生体由来タンパク若しくはペプチド等をいう。 背景技術
酵素、 抗体等の生理活性物質は、 特定の物質に対し高い選択性を有しているも のが多く、 このような性質を利用して特定の生体成分等を高精度に検出するため に利用されている。 特に、 目的物質と反応する抗体を適当な固相 （担体） に固定 した後検体を接触させ、 さらに目的物質と特異的に結合する標識抗体と反応させ て目的物質の測定を行うィムノアツセィ法は、免疫検查において多用されている。 しかしながら、 タンパク質や糖質等の生理活性物質を、 担体へ強固で効率よく 固定化することは、 タンパク質や糖質等の表面電荷が様々であること等に起因し て非常に困難であった。
従来より、 タンパク質等の生理活性物質をスライドガラスやポリアクリルアミ ドゲル等の担体の上に固定ィヒする方法、 並びに当該固定ィヒ担体を用いて試料中の 抗原を当該担体状の抗体と結合させ高効率 （High - throughput) で検出する方法に ついて、 BioTechniques 27, 778—788 (1999)、 Biosensors & Bioelectronics Vol. 13， No. 3-4, pp. 407-415, 1998、 Clin. Chem. 44： 9, 2036-2043 (1998)、 Clin. Chem. Acta (1990) 194 (1)、 Anal. Chem. 1999, 71, 3845-3852、 J. Immunol. M ethods, 136 (1991) , 239-246、 Anal. Biochem. 278, 123-131 (2000)、 J. Immun ol. Methods. 99 (1987) 107-112、 Anal. Biochem. 250, 203-211 (1997)、 Scien ce Vol. 289, 1760-1763) 等の報告がある。
し力 し、 これらの報告の方法では、 担体に抗体を高密度に固定ィヒすることがで きず、 大量の抗体を必要とする割には固定ィ匕の効率が低いという問題があった。 また、 アレルギーの原因 （アレルゲン） を同定するため、 アレルギーの発現に よって、 当該アレルギーの原因であるアレルゲンと特異的に結合する I g Eが産 生されることを利用して、 I g Eを検査する方法が行われており、 患者の血清中 の I g Eをアレルゲンと反応させて、 標識した抗 I g E抗体で検出する方法が実 用化されている。
具体的には、 試料中の I g Eと、 スライドグラス上に固定化された抗ヒト I g E抗体とを反応させた後、 更に酵素標識した抗ヒト I g E抗体を反応させて、 抗 ヒト I g E抗体一 I g E—酵素標識抗ヒト I g E抗体複合体を生成させ、 当該複 合体中の標識を検出する方法（Methods in enzymology Vol. 184 501-507， 1990)、 アレルゲンをろ紙に結合して、 これに血清を反応させ、 ゥミホタル由来のルシフ ヱラーゼでラベルした抗 I g E抗体で検出する方法 （特開平 5—1 1 3 4 4 3号 公報）、 ァフィ二ティーカラムを使用する方法 （特表平 5— 5 0 8 2 2 0号公報）、 抗 I g E抗体を 2官能性の試薬によりポリスチレンプレートゃガラス繊維フィル ターなどの固相支持体に固定する方法 （特表平 8— 5 0 9 0 6 4号公報） などが ある。
し力 し、 これらの報告の方法でも、 担体に各種アレルゲンゃ抗 I g E抗体を高 密度に固定化することができず、 大量の抗体を必要とする割には固定化の効率が 低いという問題があった。 本発明は、 上記した如き状況に鑑みなされたもので、 生理活性物質を高密度に 固定化することができ、 固定化効率が高い生理活性物質固定化担体、 該固定化担 体の製造方法、該固定化担体を用いて効率良く試料中の対象成分を分析する方法、 及び前記分析のためのキットを提供することを目的とする。 発明の開示
本発明者らは上記目的を達成すベく検討を行った結果、 生理活性物質を固定ィ匕 するための担体として炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が表面に形成さ れている担体を採用すると高密度に官能基を配位することが可能となり、 この官 能基に生理活性物質の官能基を結合させて固定することができるので、 固定化の 効率が向上し、 該生理活性物質固定化担体を用レ、た試料中の対象成分の分析の効 率^が可能となることを見出して本発明に至った。
すなわち、 請求項 1記載の発明は、 生理活性物質が固定化された炭素乃至は金 属又は半金属炭素化合物層が担体表面に形成されている担体からなる生理活性物 質固定化担体を提供するものである。
生理活性物質の担体表面への固定化は、 自体公知の固定化方法、 例えば物理的 に吸着させて固定化する方法或いは化学的結合により固定化する方法等を利用す ればよいが、 請求項 2に記載するように、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合 物層の官能基を介して固定されていることが好ましく、 特に、 請求項 3に記載す るように、 生理活性物質が有する官能基と炭素乃至は金属又は半金属炭素化合 物層の官能基との結合により、 担体表面に固定化されていることが好ましい。 この場合において、 請求項 4に記載されているように、 生理活性物質が有 する官能基又は Z及び炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層の官能基が、 水酸基、 カルボキシル基、 硫酸基、 シァノ基、 ニトロ基、 チオール基、 アミノ基、 アミノフヱニル基及びエポキシ基からなる群から選ばれた 1又は 2以上のもので あることが好ましい。
また、 生理活性物質は、 請求項 5に記載するように、 生体に特有の作用を及 ぼす物質又は生体由来タンパク或いはペプチドであり、 特に、 請求項 6に記 載するように、 抗原又はノ及び抗体が好ましい。 中でも、 生理活性物質が、 請求 項 7に記載するように、 腫瘍マーカー、 ホルモン、 環境ホルモン、 微生物由来タ ンパク又はペプチド或いは糖鎖抗原、 レセプター、 リガンド、 アレルゲン、 免疫 グロブリン、 レクチン、 糖鎖、 脂質、 リポ多糖及びこれらに対する抗体からなる 群から選ばれた 1又は 2以上のものであることが特に好ましい。
具体的には、 請求項 8に記載するように、 生理活性物質が、 アレルゲン、 免疫 グロプリン、 及ぴこれらに対する抗体からなる群から選ばれた 1又は 2以上のも のであることが好ましい。
更に、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物は、 請求項 9及び 1 0に記載す るように、 結晶性炭素又は/及ぴ非晶性炭素からなるものが好ましく、 より具体 的には、 請求項 1 1に記载するように、 結晶性炭素はダイャモンド又はダイャモ ンドライクカーボンが、 また、 請求項 1 2に記載するように、 非晶性炭素はグラ ファイト又は非晶性カーボンが好ましい。 これらの中でも、 結晶性炭素、 特に、 ダイヤモンドが特に好ましい。
請求項 1 3に記載の発明は、 官能基を有する炭素乃至は金属又は半金属炭素 化合物層が表面に形成された担体と、 生理活性物質とを接触させることを特徴と する、 生理活性物質固定ィ匕担体の製造方法を提供するものである。
より具体的には、 請求項 1 4に記载するように、 炭素乃至は金属又は半金属 炭素化合物層が形成された担体表面に官能基を導入し、 次いでこれと生理活性物 質とを接触させることが好ましい。
この場合において、 当該担体表面に導入する官能基は、 請求項 1 5に記載 するように、 水酸基、 カルボキシル基、 硫酸基、 シァノ基、 ニトロ基、 チオール 基、 アミノ基、 ァミノフエエル基及ぴエポキシ基からなる群から選ばれた 1又は 2以上のものであることが好ましい。
請求項 1 6記載の発明は、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が形成さ れている担体上に固定化されてなる生理活性物質を提供するものである。
請求項 1 7記載の発明は、 請求項 1〜1 2の何れかに記載の生理活性物質固定 化担体を用いることを特徴とする、 試料中の対象成分の分析方法を提供するもの である。
より具体的には、 請求項 1 7に記載するように、 生理活性物質固定化担体と対 象成分を含有する試料とを接触させて生成した担体に固定ィヒされた生理活性物質 と試料中の対象成分との複合体を分析するものである。
• ここで担体表面に固定化された生理活性物質は、請求項 1 9に記載するように、 抗原又は抗体の何れかであり、 対象成分が当該生理活性物質に対する抗原又は抗 体であることが好ましく、 より好ましくは、 当該抗原又は抗体は、 請求項 2 0に 記載するように、 腫瘍マーカー、 ホルモン、 環境ホルモン、 微生物由来タンパク 又はペプチド或いは糖鎖抗原、 レセプター、 リガンド、 アレルゲン、 免疫グロプ リン、 レクチン、 糖鎖、 脂質、 リポ多糖及びこれらに対する抗体からなる群から 選ばれた 1又は 2以上のものである。 中でも、 抗原又は抗体は、 請求項 2 1に記 載するように、 アレルゲン、 免疫グロブリン、 レクチン、 及ぴこれらに対する抗 体からなる群から選ばれた 1又は 2以上のものであることが特に好ましい。
請求項 2 2記載の発明は、 請求項 1〜1 1の何れかに記載の生理活性物質固定 ィ匕担体を含んでなる対象成分分析用キットを提供するものである。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の分析方法による I g Eの分析を示す模式図である。 図 2は、 本発明の分析方法による特定のアレルゲンに対する I g Eの分析を示す模式図で ある。 図 3は、 実施例. 1で得られた I g E分析の結果を示す図である。 図 4は、 実施例. 2で得られた陰性血清を検体として用いた場合のアレルゲン分析の結 果を示す図である。 図 5は、 実施例. 2で得られたスギ陽性血清を検体として 用いた場合のアレルゲン分析の結果を示す図である。 図 6は、 実施例. 2で得 られたダニ陽性血清を検体として用いた場合のアレルゲン分析の結果を示す図 である。 発明を実施するための最良の形態
まず、 請求項 1記載の発明の生理活性物質固定ィ匕担体について説明する。
請求項 1記載の本発明の生理活性物質固定化担体は、 生理活性物質が固定化さ れた炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が担体表面に形成されている担体 力 らなることを特徴とする。
生理活性物質とは、 請求項 5に記載するように、 生体に特有の作用を及ぼす 物質若しくは生体由来タンパク或いはペプチドであり、 具体的には、 例えば タンパク、 タンパク誘導体、 ペプチド、 ペプチド誘導体、 糖、 糖誘導体、 脂質、 脂質誘導体等である。 より具体的には、 請求項 6に記載するように、 抗原又は Z 及び抗体が、 後述するように抗原抗体反応により生体成分を正確に分析できるの で、 好ましい。 中でも、 請求項 7に記載するように、 腫瘍マーカー （例えば AF P, P S A, CEA, PG I , PGII等のタンパク抗原、 CA19— 9， P I V KA- I I， CA 125等の糖鎖抗原等）、 ホルモン （例えば ΡΤΗ, T 3, T4, TSH, インシュリン， Cペプチド， LH, FSH， プロラクチン等）、 環境ホル モン （例えばトリブチノレスズ， ノユルフェノール, 4ーォクチノレフエノール， フ タノレ酸ジ一n—プチル, フタル酸ジシク口へキシル, ベンゾフエノン， オタタク ロロスチレン， フタル酸ジ一 2—ェチルへキシル等） 微生物由来タンパク又はべ プチド或いは糖鎖抗原 （例えば結核菌， 肺炎球菌， ジフテリア菌， 髄膜炎菌， 淋 菌， ブドウ球菌， レンサ球菌， 腸内細菌， 大腸菌， へリコパクター 'ピロリ等の 細菌、 ィンフルェンザウィルス， アデノウイルス，炎テロウィルス， ポリオウィル ス， E Bウィルス， HAV， H B V, H C V, H I V, H T L V等のウィルス、 例えばカンジダ， タリプトコッカス等の真菌、 レプトスビラ， 梅毒トレポネーマ 等のスピロヘータ、 クラミジァ、 マイコプラズマ等の微生物由来のタンパク又は ペプチド或いは糖鎖抗原）、 レセプター （例えばエストロゲン， T S H等に対する レセプター)、 リガンド (例えばエスト口ゲン， T S H等)、 ァレルゲン （例えば 気管支喘息， ァレルギ一性鼻炎， 了トピー性皮膚炎等のァレルギ一の原因となる 吸入性アレルゲン、 例えば食物アレルゲン等。 より具体的には、 例えばハウスダ スト， 例えばコナヒヨウダニ， ャケヒヨウダニ等のダニ類、 例えばスギ、 ヒノキ、 スズメノヒェ， ブタクサ， ォオアヮガエリ， ハルガヤ， ライムギ等の花粉、 例え ばネコ， ィヌ， 力二等の動物、 例えば米， 卵白等の食物、 真菌、 昆虫、 木材、 薬 剤、化学物質等に由来するアレルゲン）、免疫グロブリン （例えば I g G， I g M, I g A, I g E , I g D， これらの分解産物等）、 レクチン （例えばコンカナバリ ン A， レンズマメレクチン, インゲンマメレクチン， ダッラレクチン, 小麦胚芽 レクチン等）、 糖鎖 （例えば A B O抗原等）、 脂質 （例えばコレステロ一ノレ等の脂 質、 カルジォリピン、 ホスファチジルコリン等のリン脂質、 スフインゴミエリン 等のスフインゴリン脂質、 リポタンパク質）、 リポ多糖（例えばエンドトキシン等） 及ぴこれらに対する抗体からなる群から選ばれた 1又は 2以上のものであること が特に好ましい。
尚、 生理活性物質としてレセプター、 リガンド、 レクチン、 腫瘍マーカー (糖鎖）、 タンパク又はペプチド等を用いた場合には、 抗原抗体反応に限らず、 レセプタ^ 一ァクセプター間反応、 レクチン一糖鎖間反応或いはタンパクー ぺプチド鎮間反応等によっても対象成分を分析し得る。
本発明の生理活性物質固定ィ匕担体を試料中の対象成分の分析に用いる場合には、 分析対象となる成分と特異的に結合する生理活性物質を適宜選択すればよい。 例 えば、 試料中の対象成分が抗原である場合には、 担体上に固定化させる生理活性 物質として当該抗原に対する抗体を選択し、 対象成分が抗体である場合には、 当 該抗体に対する抗原或いは当該抗体に対する抗体を選択すればよい。
また、 異なる 2種以上の生理活性物質を選択すれば、 一回の操作で、 試料 中に存在する 2種以上の異なる対象成分を同時に分析することや未知の対象 成分を分析、 即ち検出乃至特定 ·同定することが可能となる。
尚、 対象成分がレセプター、 リガンド、 レクチン、 腫瘍マーカー （糖鎖）、 タンパク又はペプチド等である場合には、 レセプターに対するリガンド、 リ ガンドに対するレセプター、 レクチンに対する糖鎖、 腫瘍マーカー （糖鎖） に対するレクチン、 タンパクに対するペプチド鎖、 ペプチドに対するタンパ クを夫々生理活性物質として選択してもよい。
本発明には、 例えば、 請求項 8に記载するように、 生理活性物質としてアレル ゲン、 免疫グロプリン （特に I g E)、 及びこれらに対する抗体からなる群から選 ばれた 1又は 2以上のものを固定ィ匕した生理活性物質固定化担体を用いることに より、 ァレルギ一関連の分析を行うことができ、 本発明の好ましい具体的な実施 態様のひとつである。
即ち、 例えばアレルゲンに対する抗体を生理活性物質として選択すれば、 ァレ ルゲンの分析 （試料中のァレルゲンの存在の有無及びァレルゲンの量の分析等） を行うことができ、 例えばァレルゲンを生理活性物質として選択すれば、 ァレル ギ一の原因となるアレルゲンの特定分析 (どのようなアレルゲンに対してアレル ギー反応を示すのか否か及びァレルギ一反応の程度の分析等） を行うことができ る。 また、 例えば抗 I g E抗体を生理活性物質として選択すれば、 試料中に存在 する総 I g E量の分析 （アレルギー体質であるか否か及びその程度の分析等） を 行うことができる。 尚、 上記したように、 異なる 2種以上の生理活性物質を、 炭素乃至は金属 又は半金属炭素化合物層が表面に形成されてなる担体上に固定化する場合に は、 これらの生理活性物質が固定化されている位置が夫々明らかになるよう に、 表面に適当な表示 （例えば番号等を付す等） 等をしておくことが好まし い。
炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が形成されてなる担体に生理活性 物質を固定化する量としては、 使用する担体の表面積や生理活性物質の性質 や種類等によって異なるため一概には言えないが、 例えば生理活性物質が固 定化される部分の単位面積（cm2) 当たりの固定化量として、通常 0. lng〜l mg、 好ましくは l ng〜； lOO /z gである。
本発明で用いられる炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が形成されてな る担体（以下、炭素乃至は.金属又は半金属炭素化合物層形成担体という。） とは、 担体が炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物で表面が被覆されたものである。 具体的には、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物としては、 請求項 9及び 1 0に記載するように、 結晶性炭素、 非晶性炭素等の炭素、 金属炭素化合物、 半金 属炭素化合物等が挙げられる。
より具体的には、 結晶性炭素は、請求項 1 1に記載するように、 ダイヤモンド， ダイヤモンドライクカーボン等が好ましく、 また、 非晶性炭素は、 請求項 1 2に 記載するように、 グラフアイト， 非晶性カーボン等が好ましい。 また、 金属炭素 化合物としては炭化タングステン, 炭化チタユウム等が、 半金属炭素化合物とし ては炭化珪素等が好ましい。 尚、 ダイヤモンドとしては、 炭化合成ダイヤモンド、 高圧形成ダイヤモンド、 或いは天然のダイヤモンド等が挙げられる。 また、 結晶 性炭素化合物は、 その構造が単結晶体或いは多結晶体のいずれでも差し支えない。 これら炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物は、 1種でも、 また 2種類以上 組み合わせてもよい。 ダイャモンド， ダイャモンドライクカーボン等の結晶性炭 素、 グラフアイト， 非晶性カーボン等の非晶性炭素、 なかでもダイヤモンド、 ダ ィャモンドライクカーボン等の結晶性炭素は、 その上に生理活性物質を多く結合 させることができるので、 特に好ましい。
炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体に於ける炭素乃至は金属又 は半金属炭素化合物で被覆される担体は、 ガラス、 シリカゲル、 シリコンなど各 種セラミックスや、 フ ライ卜、 鉄、 ニッケル、 コバルト等を主成分とした合金 といった無機系の担体や、 セルロース、 デキストラン、 ポリアクリルアミド、 ポ リスチレン系誘導体、 無水マレイン酸系重合体、 ナイロン、 ポリアタリロニトリ ルなどの有機合成ポリマーなど有機系の担体が挙げられる。担体の形状は粒子状、 板状、 棒状、 膜状、 ディスク状、 円盤状など特に限定されない。 これらのうち、 安価で入手しやすい点からガラスが好ましい。
また、 担体の大きさは、 使用目的により異なり、 特に限定されないが、 1 0 0 c m2以下、 好ましくは 5 0 c m2以下、 より好ましくは 2 5 c m2以下である。 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体の炭素乃至は金属又は半金 属炭素化合物層の厚さは、 一般に 1 n m以上とすることが望ましい。 好ましくは 1 . 5 n m〜 1 0 0 0 n mである。 1 n m未満だと被覆の効果が実質上得られな い。 一方で、 1 0 0 0 n mを超えると、 実質コーティング層の極表面のみを利用 することになるため、 労力及ぴ費用の点で無駄となる。
炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層は、 公知の方法で炭素乃至は金属又 は半金属炭素化合物を担体に被覆させることにより製造することができる。 公知 の方法としては、 マイクロ波プラズマ C V D法、 E C R C V D法、 I P C法、 直 流スパッタリング法、 E C Rスパッタリング法、 イオンプレーティング法、 ァー クイオンプレーティング法、 E B蒸着法、 抵抗加熱蒸着法、 スラリーコーティン グ法などが挙げられる (特開平 10-95695号公報、 特開平 8-296044号公報、 特開平 8 - 165576号公報、 特開平 8- 74056号公報等）。 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体の表面は、 平滑であっても、 意図的に粗面化されていてもよい。 粗面化すると、 担体の表面積が増え、 多量の 生理活性物質を固定させるのに好都合である。
生理活性物質の担体表面への固定化は、 自体公知の固定化方法、 例えば物理 的に吸着させて固定化する方法或いは化学的結合により固定化する方法等を利用 すればよいが、 請求項 2に記载するように、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化 合物層の官能基を介して固定化されていることが好ましく、 特に、 請求項 3に記 載するように、 生理活性物質が有する官能基と炭素乃至は金属又は半金属炭素 化合物層の官能基との結合により固定化されていることが好ましい。
炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層の官能基としては、 生理活性物質 と直接或いはスぺーサ一等を介して間接的に結合し得るものであればよく、 具体的には、 請求項 4に記載するように、 水酸基、 力ルポキシル基、 硫酸基、 シァノ基、 ニトロ基、 チオール基、 アミノ基、 ァミノフエ二ル基及ぴエポキシ基 からなる群から選ばれた 1又は 2以上のものが挙げられる。
また、 生理活性物質が有する官能基も同様に、 炭素乃至は金属又は半金属 炭素化合物層の官能基と直接又はスぺーサ一等を介して間接的に結合し得る ものであればよく、 具体例も、 上記炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層 が有する官能基と同様のものが挙げられる。
炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面への官能基の導入は、 担体表面を化学修飾して活性化させることにより行うことができる。
炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面の化学修飾は、 該担体 表面に水酸基、 カルボキシル基、 硫酸基、 シァノ基、 ニトロ基、 チオール基、 ァ ミノ基、 ァミノフエニル基、 エポキシ基などの官能基を直接結合させてもよいが、 例えば炭素数 1以上、 好ましくは 1〜 1 2、 より好ましくは 1〜 6の炭化水素基 等のスぺーサーを介して結合させることもできる。 例えば、 官能基がカルボキシ ル基の場合には、 蟻酸、 酢酸、 プロピオン酸などのモノカルボン酸；シユウ酸、 マロン酸、 コハク酸、 マレイン酸、 フマル酸などのジカルボン酸； トリメリット 酸等の多価カルボン酸等、 好ましくはシユウ酸、 コハク酸を炭素乃至は金属又は 半金属炭素化合物層の表面に結合させればよレ、。
炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体の表面を、 化学修飾してそ の表面に官能基を直接或いはスぺーサ一等を介して導入する方法としては例えば、 担体表面を酸素プラズマで酸化し、 次いで水蒸気処理する方法；担体表面を水素 化処理し、 次いで塩素ガス中で紫外線照射して担体表面を塩素化した後、 アル力 リ溶液中で加水分解してヒドロキシル化する方法；担体表面を酸素プラズマで酸 化し、 次いで塩素化した後アルカリ溶液中で加水分解してヒドロキシルイヒする方 法；担体表面を水素化処理し、 次いで塩素ガス中で紫外線照射して担体表面を塩 素化した後、 非水溶媒中で力ルポン酸ソーダと反応させる方法等が挙げられる。 より具体的には、 例えば、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体 の表面をカルボキシル基で化学修飾したい場合は、 炭素乃至は金属又は半金属炭 素化合物層形成担体表面の水素化処理、 塩素化処理、 アミノ化処理及ぴカルボキ シル化処理を行うことが望ましい。 詳しくは、 担体表面を水素化処理し、 次!/、で 塩素ガス中で紫外線照射して炭素材料等の表面を塩素化し、 次いでァンモ -ァガ ス中で紫外線照射してァミノ化した後、 ジカルボン酸と縮合反応させる方法が望 ましい。
生理活性物質の炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体への固定ィ匕 は、 担体表面の官能基の種類に基づき、 以下のように行うことができる （例えば M ethodsin Enzymology Vol. 44, p. 11-148, (1976)等）。
( 1 ) 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体の官能基がァミノ基の 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面がァミノ基で化学修飾 されている場合には、生理活性物質のカルボキシル基と担体表面のァミノ基とを、 N—ヒドロキシスクシンイミド、 カルボキシジイミド等の縮合試薬を用いて結合 させることにより生理活性物質の固定化が可能である。
また、 担体表面のァミノ基にフォスゲンを作用させてイソシァネート化してお いた後、 生理活性物質由来のアミノ基を結合させることにより、 固定化できる。 さらに、 担体表面のァミノ基にチォフォスゲンを作用させてィソチオシァネート ィ匕しておいた後、 生理活性物質由来のアミノ基を結合させることによつても、 固 定化できる。
更にまた、 担体表面のァミノ基にダルタルアルデヒドを反応させ、 これを生理 活性物質由来のアミノ基、 フエノール基と反応させることにより、 固定化できる。 そして、 生理活性物質が糖、 糖タンパク等の糖誘導体の場合は、 予め過ヨウ素 酸と反応させた後、 担体表面のァミノ基と反応させ、 さらに水素化ホウ素ナトリ ゥム等で還元することにより、 固定化できる。
また、 担体表面のアミノ基を、 例えば m—マレイミ ドベンゾィル N—ヒ ド ロキシサクシンイミ ド エステル等のマレイミ ド基を有する 2官能性スぺーサ 一、 4ーサクシンイミジルォキシカルボ-ルー α一 ( 2—ピリジルジチォ) トルエン等のピリジルジチォスルフィ ド基を有する 2官能性スぺーサ一等で マレイミ ド化或いはピリジルジチォスルフィ ド化した後、 当該マレイミ ド化 又はピリジルジチォスルフィ ド化担体と生理活性物質のチオール基とを反応 させることにより固定化できる。
( 2 ) 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体の官能基がカルボキシ ル基の場合
炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面がカルボキシル基で化 学修飾されている場合は、 担体表面のカルボキシル基と生理活性物質のアミノ基 とを Ν—ヒドロキシスクシンイミドとカルポジイミド等の縮合試薬を作用させて 反応させることにより、 固定ィ匕できる。 また、 担体表面のカルボキシル基に塩ィ匕 チォニルを作用させカルボキシク口リ ドを形成させる。 形成されたカルボキシク ロリ ドと生理活性物質由来のアミノ基を反応させることによつても固定ィ匕できる。 さらに、 担体表面の力ルポキシル基に塩酸とメタノールを加え反応させ、 次い で、 ヒドラジンを加え反応させ、 ヒドラジドを形成させ、 さらに、 ヒドラジドに 亜硝酸ナトリウムと塩酸を加えァシルァジド化することによつて担体表面を活性 化させた後、 これを生理活性物質由来のァミノ、 チオール、 水酸基と反応させる ことにより、 固定ィ匕できる。
また、 担体表面のカルボキシル基から無水物を形成させ、 これを生理活性物質 由来のァミノ基と反応 （脱水縮合） させることにより、 固定ィ匕できる。
( 3 ) 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体の官能基が水酸基の場 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面が水酸基で化学修飾さ れている場合には、 担体覆表面の水酸基に塩化シァヌルを作用させてトリアジ- ル誘導体を形成させ、 生理活性物質由来のアミノ基を結合させることにより、 固 定ィ匕できる。
また、 担体表面が水酸基で化学修飾されてなる場合には、 担体表面の水酸基を ァセチル化した後臭素化し、 N a Iで臭素と沃素を置換することによって担体表 面を活性化し、 これに生理活性物質のアミノ基、 チオール基又は水酸基と反応さ せることによつても、 固定^:できる。
さらにまた、 担体表面の水酸基に臭化シアンを作用させ活性ィヒし、 これを生理 活性物質由来のァミノ基と共有結合させることによつても、 固定化できる。
( 4 ) 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体の官能基がエポキシ基 の場合
炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面がエポキシ基で化学修 飾されている場合は、 これを生理活性物質由来の水酸基 （チロシン， セリン等に 由来するもの），アミノ基又はチオール基と反応させることにより、固定ィ匕できる。
( 5 ) 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体の官能基が硫酸基 （ス ルホ基） の場合
炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面がス^ /ホ基で化学修飾 されている場合には、 担体表面のスルホ基に塩ィヒスルホン酸を反応させてスルホ ンクロライドを形成させ、 生理活性物質由来のアミノ基、 イミダゾール基、 チォ ール基、 フヱノール基等.と反応させることにより、 固定化することができる。
( 6 ) 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体の官能基がアミノフ ニル基の場合
炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面がァミノフ 二ル基で 化学修飾されている場合には、 担体表面のァミノフヱ二ル基を亜硝酸ナトリウム と塩酸で活性化しておいて、 これを生理活性物質由来のアミノ基、 チオール基、 フエノール基、 イミダゾール基、 グァニジノ基と反応させるといったジァゾニゥ ムカツプリング法を利用しても固定ィ匕できる。
( 7 ) 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体の官能基がシァノ基の 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面がシァノ基で化学修飾 されている場合は、 当該シァノ基を酸触媒の存在下で加水分解し、 これを力 ルポキシル基に変換した後、 上記 （2 ) と同様にすれば固定化できる。
( 8 ) 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体の官能基がニトロ基の 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面が二トロ基で修飾され ている場合は、 リチウムアルミニウムハイドライド等の還元剤で還元し、 こ れをァミノ基に変換した後、 上記 （1 ) と同様にすれば固定化できる。 ( 9 ) 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体の官能基がチオール基 の場合
炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面がチオール基で化学修 飾されている場合は、 生理活性物質のアミノ基を、 例えば m—マレイミ ドべ ンゾィル N—ヒ ドロキシサクシンイミ ド エステル等のマレイミ ド基を有す る 2官能性スぺ一サー、 4ーサクシンィミジルォキシカルボ二ルーひ一 （2 一ピリジルジチォ) トルエン等のピリジルジチォスルフィ ド基を有する 2官 能性スぺーサ一等でマレイミド化或いはピリジルジチォスルフィド化した後、 当該マレイミ ド化又はピリジルジチォスルフィ ド化生理活性物質と担体表面 のチオール基とを反応させることにより固定化できる。
また、 上記した如き 2官能性スぺーサ一の代わりに、 ビス マレイミ ドへキ サン、 1 , 4ージー 〔3， 一 2， 一ピリジルジチォ (プロピオンァミ ド）〕 ブ タン等の 2官能性スぺーサーを用いて、 担体表面のチオール基と生理活性物 質のチオール基とを反応させることにより、 固定化できる。
尚、 上記方法は、 互いに結合させる官能基の組み合わせが同じであれば、 担体表面の官能基と生理活性物質由来の官能基が逆であつても、 場合によつ ては適用可能である。
本発明に係る生理活性物質がその表面に固定化されている炭素乃至は金属又は 半金属炭素化合物層が形成されている担体からなる生理活性物質固定化担体は、 非特異的な吸着による分析への影響を防止するために、 いわゆるプロッキング処 理、 より具体的には、 例えばアルブミン， グロブリン， カゼイン， ポリビニルァ ルコール， 界面活性剤， シランカップリング剤， チタンカップリング剤， アルミ 力ップリング剤等のプロッキング剤によるプロッキング処理を施しておくことが 望ましい。 また、 本発明に係る当該担体は、 例えば乾燥処理、 凍結処理、 凍結乾 燥処理等を施した状態、 或いは適当な緩衝液に浸漬させた状態等、 多種多様の状 態で保存し得る。
当該緩衝液としては、 通常この分野で用いられている例えばトリス緩衝液、 リン酸緩衝液、 ベロナール緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 グッド緩衝液等が挙げら れ、 また、 このような緩衝液中には、 例えばアルブミン、 グロブリン、 水溶 性ゼラチン、 ポリエチレングリコール等の安定化剤、 界面活性剤、 糖類等を 含有させておいてもよい。
尚、 異なる 2種以上の生理活性物質が固定化された炭素乃至は金属又は半 金属炭素化合物層が表面に形成されている担体からなる生理活性物質固定化担体 を製造するには、 生理活性物質として異なる 2種以上のものを適宜使用する以外 は、 上記した方法に準じて行えばよい。
次に、 本発明の表面に生理活性物質が固定化された炭素乃至は金属又は半金 属炭素化合物層が形成された生理活性物質固定化担体の製造方法について説明す る。
即ち、 請求項 1 3に記載するように、 その表面に官能基を有する炭素乃至は金 属又は半金属炭素化合物層が形成された担体と、生理活性物質とを接触させた後、 前述したように自体公知の固定化方法、 例えば物理的に吸着させて固定化する方 法 （物理的結合方法） 等を利用して当該担体表面に生理活性物質を固定ィヒし、 目 的の生理活十生物質が固定化された炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が表 ' 面に形成されている担体からなる生理活性物質固定化担体を製造することができ る。
なかでも、 当該担体と生理活性物質とをより強固に結合し得るので、 その表面 に官能基を有する炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が形成された担体と、 生理活性物質とを接触させ、 化学的結合により炭素乃至は金属又は半金属炭素 化合物層の官能基を介して生理活性物質を担体表面に固定することが好ましく（ィ匕 学的結合方法)、 特に、 生理活性物質が有する官能基と炭素乃至は金属又は半 金属炭素化合物層の官能基とを化学的結合により結合させて生理活性物質を 担体表面に固定することが好ましい。
尚、 本発明の製造方法に於いて、 生理活性物質、 炭素乃至は金属又は半金属炭 素化合物並びに担体等の具体例及び好ましい態様、 炭素乃至は金属又は半金属 炭素化合物層形成方法等は先に述べた通りである。
また、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層に導入される官能基、 並びに 結合させる生理活性物質中の官能基の種類や組み合わせも前述の通りであり、 生 理活性物質又は炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層の官能基と直接或い はスぺーサ一等を介して間接的に結合し得るものであればよく、 具体的には、 請求項 1 5に記載するように、 水酸基、 カルボキシル基、 硫酸基、 シァノ基、 二 トロ基、 チオール基、 アミノ基、 ァミノフエニル基及ぴエポキシ基からなる群か ら選ばれた 1又は 2以上のものが挙げられる。
上記本発明の製造方法は、 具体的には例えば以下の如くして実施すればよい。 即ち、 物理的結合方法を利用する場合には、 例えば、 炭素乃至は金属又は半金 属炭素化合物層形成担体に、 生理活性物質を含有する溶液を、 例えば塗布、 滴下 又は噴霧等するか、 若しくは当該溶液中に当該担体を浸漬する力、 或いは市販の スタンビング装置を用いる方法 （例えば、 日本レーザー電子 （株） 等から販売さ れているスタンビング装置を用いる方法等） 等により、 当該担体と生理活性物質 とを接触させた後、 これを乾燥して物理的吸着により担体表面に生理活性物質を 固定ィヒし、 目的の生理活性物質が固定化された炭素乃至は金属又は半金属炭素 化合物層が表面に形成されている担体からなる生理活性物質固定ィヒ担体を得るこ とができる。
また、 化学的結合方法を利用する場合には、 例えば、 その表面に官能基を有す る炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体に、 生理活性物質を含有す る溶液を、 例えば塗布、 滴下又は噴霧等するか、 若しくは当該溶液中に当該担体 を浸漬する力 或いは市販のスタンビング装置を用いる方法 （例えば、 日本レー ザ一電子 （株） 等から販売されているスタンビング装置を用いる方法等） 等によ り、 当該担体と生理活性物質とを接触させた後、 自体公知の化学的結合方法に従 つて当該担体の官能基と生理活性物質、 具体的には生理活性物質の官能基とを反 応させて化学的に結合させ、 担体表面に生理活性物質を固定化し、 目的の生理活 性物質が固定化された炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が表面に形成さ れている担体からなる生理活性物質固定化担体を得ることができる。
尚、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体が生理活性物質を結合 させるための適当な官能基を有さない場合等に於いては、 請求項 1 4に記載する ように、 予め炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面に適当な官 能基を導入した後、 上記したように当該担体と、 生理活性物質とを接触させれば よい。
上記方法に於いて、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成担体表面へ の官能基の導入方法は、 先に述べた通りである。
また、 上記方法に於いて、 生理活性物質を含有させる溶液としては、 通常 この分野で用いられている例えばトリス緩衝液、 リン酸緩衝液、 ベ口ナール 緩衝液、 ホウ酸緩衝液、 グッド緩衝液等が挙げられる。 また、 固定化する際 の溶液中の生理活性物質量としては、 使用する生理活性物質の性質や種類等 により一概には言えないが、 通常 I ngZml〜； I000mg/ml、 好ましくは 1 / gZ ml〜： 10mg/ml、 より好ましくは 10 z g/ml〜 2 mgZmlである。 このような生理 活性物質含有溶液を用いて先に述べた濃度範囲となるように担体表面に生理 活性物質が固定化される。
また、 請求項 1 6記載の発明は、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層 が形成されている担体上に固 化されてなることを特徴とする生理活性物質 に関するものである。 このような生理活性物質は従来知られておらず、 このようにすることによ り、 例えば試料中の当該生理活性物質と結合する性質を有する対象成分を高 感度に且つ高精度に測定し得るようになる。
尚、 生理活性物質、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物並びに担体等の 具体例及び好ましい態様、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層形成方法、 固定化方法等は先に述べた通りである。
上記方法により生理活性物質がその表面に固定化されている、 炭素乃至は金属 又は半金属炭素化合物層が形成されている担体を得た後、 これを通常この分野で 行われているブロッキング処理、 即ち、 当該担体を、 更に例えばアルブミン， グ 口プリン， カゼイン， ポリビ-/レアノレコール， 界面活个生剤， シランカップリング 剤， チタンカツプリング剤， アルミカツプリング剤等のブロッキング剤を含有す る溶液中に浸漬する処理を行うことが望ましい。
次に、 請求項 1 7記載の本発明の試料中の対象成分の分析方法について説明す る。
請求項 1 7記載の本発明の方法は、 請求項 1〜 1 2の何れかに記載の生理活性 物質固定化担体を用いるものである。 該生理活性物質固定化担体を用いることに より、 試料中の対象成分を効率よく高感度且つ高精度に分析することができる。 より具体的には、 請求項 1 8に記載するように、 先ず、 請求項 1〜1 2の何 れかに記載の生理活性物質固定化担体と、対象成分を含有する試料とを接触させ、 当該担体に固定化された生理活性物質と試料中の当該対象成分との複合体を生成 させる。 次いで当該複合体を分析することにより試料中の対象成分の分析を行え ばよい。
また、 本発明の分析方法に於いて、 異なる 2種以上の生理活性物質が固定 化された炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が表面に形成されている担体 からなる生理活性物質固定化担体を用いることにより、 試料中の対象成分を効率 よく高感度且つ高精度に分析し得るだけでなく、 一回の操作で、 試料中に存在 する 2種以上の異なる対象成分を同時に分析することや未知の対象成分を分 析 （特定 ·同定） することも可能となる。
より具体的には、 先ず、 試料中に含有される各種対象成分を、 生理活性物質固 定化担体上に固定化された異なる 2種以上の生理活性物質全てと実質上同時に接 触することになるように、 当該担体表面に供給し、 生成される当該担体に固定ィ匕 された各種生理活性物質と試料中の当該各種対象成分との複合体を分析すること により、 試料中の各種対象成分の分析を行えばよい。
ここでいう対象成分とは、 例えば抗原抗体反応、 レセプタ一一リガンド間反 応、 レクチン一糖鎖間反応、 タンパクーペプチド鎖間反応等によって生理活 性物質と特異的に結合する能力を有するものである。 より具体的には、 前述 した如き生理活性物質と同様のものが挙げられ、 また、 生理活性物質と対象 成分の組み合わせも先に述べた通りである。
また、 試料としては、 例えば血清， 血漿， 髄液， 滑液， リンパ液等の体液、 尿， 糞便のような排泄物、 喀たん， 膿， 皮膚由来物等の生体由来試料、 例えば食品， 飲料， 水道水， 海水， 湖沼水， 河川水， 工場廃液， 半導体用洗浄水， 医療器具等 を洗浄した後の洗浄液等の環境試料及ぴこれらを水や通常この分野で用いられて いる例えぱトリス緩衝液、 リン酸緩衝液、 ベロナ一ル緩衝液、 ホゥ酸緩衝液、 グッド緩衝液等の緩衝液等に適宜溶解させて再構成して得られた処理物等が 挙げられる。
本発明の分析方法に於いて、 生理活性物質が固定ィヒされた炭素乃至は金属又 は半金属炭素化合物層が表面に形成されている担体からなる生理活性物質固定ィ匕 担体と、 対象成分を含有する試料とを接触させる方法、 又は試料中に含有される 各種対象成分を、 生理活性物質固定化担体上に固定化された異なる 2種以上の生 理活性物質全てと実質上同時に接触させる方法としては、 当該試料を当該担体上 に滴下又は塗布等する方法、 若しくは当該試料中に当該担体を浸漬する方法等が 挙げられる。
上記方法に於いて、 生理活性物質固定化担体に固定化された生理活性物質と試 料中の当該対象成分との複合体を分析するには、 通常、 当該複合体に、 更に、 当 該対象成分或いは当該複合体に特異的に結合する性質を有する標識結合物質を接 触させ、 生理活性物質固定化担体に固定化された生理活性物質と試料中の当該対 象成分と当該標識結合物質との複合体 （標識複合体） を生成させ、 当該標識複合 体中の標識物質を測定し、 その結果に基づいて行うのが一般的である。
尚、 対象成分が、 例えば酵素、 色素、 蛍光物質、 発光物質、 紫外部に吸収 を有する物質等何らかの方法により検出可能なものである場合等には、 必ず しも上記した如き標識結合物質を用いなくても良い。 また、 生理活性物質固定 化担体に固定化された生理活性物質と試料中の当該対象成分との複合体と、 当該 対象成分或いは当該複合体に特異的に結合する性質を有する標識結合物質とを接 触させるには、 上記した如き生理活性物質がその表面に固定化されている、 炭素 乃至は金属又は半金属炭素化合物層が形成されている担体からなる生理活性物 質固定化担体と、 対象成分を含有する試科とを接触させる方法と同様に行えばよ レ、。
ここで、 対象成分或いは当該複合体に特異的に結合する性質を有する標識結合 物質は、 対象成分或いは当該複合体に特異的に結合する性質を有し、 且つ何らか の方法により検出可能なものであり、 通常は標識物質によって標識された、 対象 成分或いは当該複合体に特異的に結合する能力を有する物質である。 尚、 対象成 分或いは当該複合体に特異的に結合する能力を有する物質は、 先に述べた生理活 性物質と同様のものであり、 通常、 対象成分或いは当該複合体に対する抗体又は 抗原が一般的である。
本発明に於いて用いられる標識物質としては、 酵素免疫測定法 （EIA)、 放 射免疫測定法 （RIA)、蛍光免疫測定法（FIA)、ハイプリダイゼーシヨン法等、 通常この分野で用いられるものであればよく、 例えばアル力リホスファタ一 ゼ （ALP), ]3-ガラク トシダーゼ （ -G al), パーォキシダーゼ （POD), マイク口パーォキシダーゼ, グノレコースォキシダーゼ (GOD), グルコース -6-リン酸脱水素酵素 （G 6 PDH), リンゴ酸脱水素酵素， ルシフェラーゼ等 の酵素類、 例えばクーマシーブリ リアントブルー R250, メチルオレンジ等の 色素、 例えば99 mT c， 131 I , 125 I , 14C, 3H， 32P, 35 S, 等の放射性同 位元素、 例えば C y 3， フルォレセィン, ローダミン， ダンシル， フルォレ スカミン， クマリン， ナフチルァミン或はこれらの誘導体， ユウ口ピウム （E u) 等の蛍光性物質、 例えばルシフェリ ン， ィソルミノール， ノレミノ一ノレ， ビ- ス（2,4,6-トリフロロフエニル) ォキザレート等の発光性物質、 例えばフエノ ール， ナフトール， アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有 する物質、 例えば 4-ァミノ- 2，2,6，6-テトラメチルピペリジン- 1-ォキシル， 3-T ミノ -2,2,5,5-テトラメチルピロリジン- 1-ォキシル, 2,6-ジ -t-ブチル -α-(3，5-ジ -t-プチノレ- 4-ォキソ -2， 5-シク口へキサジェン -1-ィリデン) -p.トリルォキシル等 のォキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を 有する物質等が挙げられる。
標識物質により、 対象成分或いは当該複合体に特異的に結合する能力を有する 物質を標識するには、 通常この分野で用いられる常法、 例えば自体公知の E I A、 R I A、 F I A或いはハイプリダイゼーシヨン法等に於いて一般的に 行われている自体公知の標識方法 [例えば、 医化学実験講座、 第 8卷、 山村 雄一監修、第 1版、 中山書店、 1971；図説 蛍光抗体、川生明著、第 1版、 （株） ソフトサイエンス社、 1983；酵素免疫測定法、 石川栄治、 河合忠、 宮井潔編、 第 3版、 医学書院、 1987、 モレキュラー クローユング ァ ラボラトリー マ二ユアノレ セカンド エディション、 T . サムプノレック， E. F. フリ ッシュ， T . マニアテイス、 コールド スプリング ハーバー ラボラトリ 一 プレス等] や、 アビジン （又はストレプトアビジン） とピオチンの反応 を利用した常法等何れの方法により行ってもよい。
本発明の分析方法に於いては、 生成した、 1又は異なる 2種以上の生理活性 物質が固定化された炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が表面に形成され て!/、る担体からなる生理活性物質固定化担体と、 試料中の対象成分との複合体中 の当該対象成分、 又は 1又は異なる 2種以上の生理活性物質が固定化された炭素 乃至は金属又は半金属炭素化合物層が表面に形成されている担体からなる生理 活性物質固定化担体と試料中の対象成分と当該対象成分或いは当該複合体に特異 的に結合する性質を有する標識結合物質との複合体 （標識複合体） 中の標識物質 の性質に基づいて検出することにより、 試料中の対象成分の存在の有無を分析す ることができる。
更に、 本発明の分析方法によれば、 当該複合体中の対象成分又は当該標識複合 体中の標識物質の量を、 これらの性質に応じた測定方法により求め、 これらの量 に基づいて、試料中の対象成分の量を定暈的又は半定量的に求めることができる。 尚、 得られた対象成分又は標識物質の量に基づいて、 試料中の対象成分の 量を求めるには、 例えば対象成分濃度既知の試料 （標準品） を用いて同様の 方法により測定を行い、 対象成分濃度と得られた測定値 （測定された複合体 中の対象成分量又は標識複合体中の標識物質量） との関係を示す検量線を用 いて試料中の対象成分の量を算出すればよい。
本発明の分析方法をより具体的に述べれば以下の通りである。
即ち、 先ず、 1又は異なる 2種以上の生理活性物質が固定化された炭素乃至 は金属又は半金属炭素化合物層が表面に形成されている担体からなる生理活性物 質固定化担体と、 対象成分を含有する試料とを上記した如き方法により互いに接 触させ、 当該生理活性物質と当該対象成分との複合体を生成させる。 その後、 当 該担体を、 例えばトリス緩衝液， リン酸緩衝液， ベロ"^ "一ル緩衝液， ホウ酸緩 衝液， グッド緩衝液， s S C緩衝液等のハイプリダイゼーション法， 免疫法 等の分野で用いられる緩衝液等で洗浄し、 複合体の生成に関与しなかった試 料中の成分を除去する。 次いで、 要すれば、 生成した当該複合体と、 当該対象成 分或いは当該複合体に特異的に結合する性質を有する標識結合物質とを接触させ、 生理活性物質固定化担体に固定ィ匕された生理活性物質と試料中の対象成分と当該 標識結合物質との標識複合体を生成させた後、 当該担体を、 上記した如き緩衝液 等で洗浄して標識複合体の生成に関与しなかった遊離の標識結合物質を除去する。 次いで、 当該複合体中の対象成分又は当該標識複合体中の標識物質を、 これらの 性質に応じた所定の方法により測定し、 その結果に基づいて試料中の対象成分を 分析することができる。
また、 上記した如き方法の他に、 例えば標識物質によって標識された対象 成分を用いて、 これと試料中の対象成分との競合反応を利用する、 いわゆる 競合法によっても、 試料中の対象分子を分析することができる。
即ち、 先ず、 1又は異なる 2種以上の生理活性物質が固定化された炭素乃至 は金属又は半金属炭素化合物層が表面に形成されている担体からなる生理活性物 質固定化担体と、 対象成分を含有する試料と、 標識物質により標識された対象成 分とを接触させ、 当該生理活性物質と当該標識された対象成分との標識複合体と、 当該生理活性物質と当該対象成分との複合体を生成させる。 その後、 当該担体を、 上記した如き緩衝液等で洗浄し、 複合体の生成に関与しなかった試料中の成 分及び遊離の標識された対象成分を除去する。 次いで、 当該標識複合体中の標 識物質又は除去された遊離の標識された対象成分に結合した標識物質を、 これら の性質に応じた所定の方法により測定し、 その結果に基づいて試料中の対象成分 を分析することができる。
ここで、 標識物質による対象成分の標識方法及び生理活性物質固定化担体 と試料と標識された対象成分との接触方法は、 夫々先に述べた標識物質によ り対象成分或いは複合体に特異的に結合する能力を有する物質を標識する方 法及び生理活性物質固定化担体と対象成分を含有する試料とを接触させる方 法と同様であり、 それ以外については前述した通りである。
上記方法に於いて、 複合体中の対象成分又は標識複合体中の標識物質を測定 するには、 これらの種類に応じて夫々所定の測定方法に従って行えばよい。 例えば、 その性質が酵素活性の場合には E I Aやハイプリダイゼーション法 等の常法、 例えば 「酵素免疫測定法、 蛋白質 核酸酵素 別冊 No.31、 北川常 廣， 南原利夫 ·辻章夫 ·石川榮治編集、 51〜63頁、 共立出版 （株）、 1987年 9月 10日発行」 等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、 検出物質が 放射性物質の場合には R I Aやハイブリダィゼーシヨン法等の常法に従い、 該放射性物質の出す放射線の種類及び強さに応じて液浸型 GMカウンター， 液体シンチレーションカウンター， 井戸型シンチレーションカウンタ一等の 測定機器を適宜選択して使用し、 測定を行えばよい （例えば医化学実験講座、 第 8卷、 山村雄一監修、 第 1版、 中山書店、 1971， 生化学実験講座 2 トレ ーサ一実験法下、 竹村彰祐， 本庶佑、 501〜525頁、 （株） 東京化学同人、 197 7年 2月 25日発行等参照。）。 また、 その性質が蛍光性の場合には蛍光光度計や 共焦点レーザー顕微鏡等の測定機器を用いる F I Aやハイブリダイゼーショ ン法等の常法、 例えば 「図説 蛍光抗体、 川生明著、 第 1版、 （株)ソフトサ ィエンス社、 1983」、 「生化学実験講座 2
核酸の化学 III、 実吉峯郎、 299〜318頁、 （株） 東京化学同人、 1977年 12月 15日発行」 等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、 その性質が発光 性の場合にはフオ トンカウンタ一等の測定機器を用いる常法、 例えば 「酵素 免疫測定法、 蛋白質核酸 酵素 別冊 No.31、 北川常廣 ·南原利夫 ·辻章夫 · 石川榮治編集、 252〜263頁、 共立出版 （株）、 1987年 9月 10日発行」 等に記 載された方法に準じて測定を行えばよい。 更に、 その性質が紫外部に吸収を 有する性質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を 行えばよく、 その性質が発色性の場合には分光光度計や顕微鏡等の測定機器 を用いる常法によって測定を行えばよい。 また、 検出物質がスピンの性質を 有する物質の場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、 例えば 「酵素免疫 測定法、 蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、 北川 常廣 ·南原利夫 ·辻章夫 ·石 川榮治編集、 264〜271頁、 共立出版 （株）、 1987年 9月 10日発行」 等に記載 された方法に準じて夫々測定を行えばよい。
上記の方法に於いて、 対象成分或いは複合体に特異的に結合する性質を有する 標識結合物質の量は、 用いられる当該標識結合物質の種類等により異なるため一 概には言えないが、 通常は生理活性物質固定ィヒ担体に固定ィヒされた生理活性物質 の全てと結合し得る濃度以上であり、 また、 標識物質により標識された対象成 分の量も同様に、 用いられる対象成分の種類等により異なるため一概には言 えないが、 通常は生理活性物質固定化担体に固定化された生理活性物質の全てと 結合し得る濃度以上である。
また、 上記方法に於いて、 反応時の p Hや温度は、 生理活性物質と対象成 分の種類等により異なるため一概には言えないが、 生理活性物質と対象成分 との複合体、 生理活性物質と対象成分と標識物質との標識複合体又は生理活 性物質と標識対象成分との複合体が形成されるのを妨げない範囲であれば良 く、 p Hは、 通常 2〜1 0、 好ましくは 5〜 9であり、 温度は、 通常 0〜9 0 °C, 好ましくは 2 0〜8 0 °Cである。 また、 反応時間は、 上記した如き複 合体が形成されるのに要する時間が、 当該複合体を形成する成分の性質等に より異なるので、 夫々の性質に応じ、 通常数秒乃至数時間適宜反応させれば よい。
本発明の分析方法に於いては、 本発明に係る担体表面に固定ィヒさせる生理活性 物質として、 請求項 1 9に記載するように、 抗原又は抗体を選択すれば、 試料中 に存在する、 当該生理活性物質に対する抗原又は抗体を対象成分として簡便且つ 高精度に分析し得る。 また、 請求項 2 0に記载するように、 腫瘍マーカー、 ホル モン、 環境ホルモン、 微生物由来タンパク又はペプチド或いは糠鎖抗原、 レセプ ター、 リガンド、 アレルゲン、 免疫グロブリン （特に I g E)、 レクチン、 糖鎖、 及びこれらに対する抗体からなる群から選ばれた 1又は 2以上のものを選択すれ ば、 試料中に存在するこれら自体或いはこれら生理活性物質に対する抗体を簡便 に分析し得るので有用である。
尚、 生理活性物質としてレセプター、 リガンド、 レクチン、 腫瘍マーカー （糖 鎖)、 タンパク又はペプチド等を選択した場合には、 抗原抗体反応に限らず、 レセ プタ一一リガンド間反応、 レクチン一糖鎖間反応或いはタンパク一^ ^プチド鎖間 反応等によっても分析し得る。
更には、 請求項 2 1に記載するように、 生理活性物質としてアレルゲン、 免疫 グロブリン （特に I g E)、 及ぴこれらに対する抗体からなる群から選ばれた 1又 は 2以上のものを固定ィ匕した生理活性物質固定ィ匕担体を用いて本発明の分析方法 を実施すれば、 了レルギ一関連の分析を簡便且つ高精度に行うことができるので 特に有用である。
即ち、 例えばアレルゲンに対する抗体を生理活性物質として用いれば、 アレル ゲンの分析 （試料中のアレルゲンの存在の有無及ぴアレルゲンの量の分析） に有 用であり、 例えばアレルゲンを生理活性物質として用いれば、 アレルギーの原因 となるアレルゲンの特定分析 (どのようなアレルゲンに対してアレルギー反応を 示すの力否か及ぴアレルギー反応の程度の分析） に有用であり、 また、 例えば抗 I g E抗体を生理活性物質として用いれば、 試料中に存在する総 I g E量の分析 (ァレルギ一体質であるか否か及ぴその程度の分析） に有用である。
本発明の分析方法を、 ァレルギ一関連の分析を例にとり、 以下により具体的に 説明する。
( 1 ) アレルゲンの分析
先ず、 生理活性物質としてアレルゲンに対する抗体が固定化された生理活性物 質固定化担体上に、 対象成分 （アレルゲン） を含有する試料を滴下又は塗布等す る力、 或いは当該試料中に当該担体を浸漬等して互いに接触させ、 生理活性物質 固定化担体上のァレルゲンに対する抗体とァレルゲンとの複合体を生成させる。 その後、 当該担体を適当な緩衝液等で洗浄し、 複合体の生成に関与しなかった 試料中の成分 （遊離のアレルゲン等） を除去する。 次いで、 生成した当該複合 体と、 標識物質により標識されたアレルゲンに対する抗体 （当該対象成分或いは 当該複合体に特異的に結合する性質を有する標識結合物質） とを上記と同様にし て接触させ、 生理活性物質固定化担体に固定化されたァレルゲンに対する抗体と ァレルゲンと標識されたァレルゲンに対する抗体との標識複合体を生成させる。 その後、 これを、 適当な緩衝液等で洗浄して標識複合体の生成に関与しなかった 遊離の標識されたアレルゲンに対する抗体を除去する。 次いで、 当該標識複合体 中の標識物質を、 前述した如き方法により測定すれば、 試料中にアレルゲンが存 在するのか否かを分析することができる。
更に、 上記方法に於いて当該標識複合体中の標識物質の量を、 前述した如き方 法により求め、得られた標識物質の量を、 アレルゲン濃度既知の試料（標準品） を用いて同様の方法により測定を行って得られた、 アレルゲン濃度と得られ た測定値 （測定された標識複合体中の標識物質量） との関係を示す検量線に 当てはめれば、 試料中に存在するアレルゲンの量を定量又は半定量的に求め ることができる。
上記方法に於いて、 異なる 2種以上のアレルゲンに対する抗体が固定化さ れた炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が表面に形成されている担体から なる生理活性物質固定化担体を用いてこれを行えば、 一回の操作で、 試料中に存 在する複数種のアレルゲンを特定 ·同定 ·定量等を行うことができるので有 利である。
( 2 ) アレルギーの原因となるアレルゲンの特定分析
先ず、 生理活性物質としてアレルゲン （抗原） が固定ィヒされた炭素乃至は金属 又は半金属炭素化合物層が表面に形成されている担体からなる生理活性物質固定 化担体上に、 対象成分 （当該アレルゲンに対する I g E ) を含有する試料を滴下 又は塗布等するか、 或いは当該試料中に当該担体を浸漬等して互いに接触させ、 担体上のァレルゲンと当該ァレルゲンに対する I g Eとの複合体を生成させる。 その後、 当該担体を適当な緩衝液等で洗浄し、 複合体の生成に関与しなかった 試料中の成分 （遊離の対象外の I g E等） を除去する。 次いで、 生成した当該 複合体と、 標識物質により標識された抗 I g E抗体 （当該対象成分或いは当該複 合体に特異的に結合する性質を有する標識結合物質） とを上記と同様にして接触 させ、 担体に固定化されたァレルゲンと当該ァレルゲンに対する I g Eと標識抗 I g E抗体との標識複合体を生成させる。 その後、 これを、 適当な緩衝液等で洗 浄して標識複合体の生成に関与しなかった遊離の標識抗 I g E抗体を除去する。 次いで、 当該標識複合体中の標識物質を、 前述した如き方法により測定すれば、 試料中に生理活性物質として用いた特定のアレルゲンに対する I g Eが存在する のか否か、 即ち、 試料が由来する生体が特定のアレルゲンに対してアレルギー反 応を引き起こすのか否か、 更に換言すれば、 アレルギーの原因となるアレルゲン を特定することができる。
更に、 上記方法に於いて当該標識複合体中の標識物質の量を、 前述した如き方 法により求め、 得られた標識物質の量を、 I g E濃度既知の試料 （標準品） を 用いて同様の方法により測定を行って得られた、 I g E濃度と得られた測定 値 （測定された標識複合体中の標識物質量） との関係を示す検量線に当ては めれば、 試料中に存在する、 生理活性物質として用いたアレルゲンに対する 抗体 （I g E ) の量を定量又は半定量的に求めることができ、 これにより、 試料が由来する生体の特定のアレルゲンに対する感受性の強さの程度、 即ち、 当該生体が特定のアレルゲンに対してアレルギー反応を引き起こす強さの程 度をも分析することができる。
尚、 上記方法の概略を図 1に示す。
上記方法に於いて、 異なる 2種以上のアレルゲンが固定化された炭素乃至 は金属又は半金属炭素化合物層が表面に形成されている担体からなる生理活性物 質固定ィヒ担体を用いてこれを行えば、 一回の操作で、 試料中に存在する各種 I g Eが反応するアレルゲンの種類 （即ち、 当該試料に係る生体がどのような アレルゲンに対してアレルギー反応を引き起こすのか否か） を特定 .同定す ることや特定 ·同定されたアレルゲンに対する感受性の強さの程度を分析す ることができるので有利である。
( 3 ) 試料中に存在する総 I g E量の分析
先ず、 生理活性物質として抗 I g E抗体が固定ィヒされた炭素乃至は金属又は半 金属炭素化合物層が表面に形成されている担体からなる生理活性物質固定化担体 上に、 対象成分 （I g E) を含有する試料を滴下又は塗布等する力、 或いは当該 試料中に当該担体を浸漬等して互いに接触させ、 担体上の抗 I g E抗体と I g E との複合体を生成させる。 その後、 当該担体を適当な緩衝液等で洗浄し、 複合 体の生成に関与しなかった試料中の成分を除去する。 次いで、 生成した当該複 合体と、 標識物質により標識された抗 I g E抗体 （当該対象成分或いは当該複合 体に特異的に結合する性質を有する標識結合物質） とを上記と同様にして接触さ せ、 担体に固定化された抗 I g E抗体と I g Eと標識抗 I g E抗体との標識複合 体を生成させる。 その後、 これを、 適当な緩衝液等で洗浄して標識複合体の生成 に関与しなかった遊離の標識抗 I g E抗体を除去する。 次いで、 当該標識複合体 中の標識物質の量を、 前述した如き方法により求め、 得られた標識物質の量を、 I g E濃度既知の試料 （標準品） を用いて同様の方法により測定を行って得 られた、 I g E濃度と得られた測定値 （測定された標識複合体中の標識物質 量） との関係を示す検量線に当てはめれば、 試料中に存在する総 I g E量を 定量又は半定量的に求めることができる。 これにより、 当該試料に係る生体 のアレルゲン全般に対する感受性の強さの程度、 即ち、 当該生体がアレルギ 一体質であるのか否か （その程度） を分析することができる。
尚、 上記方法の概略を図 2に示す。
上記方法に於いて、 抗 I g E抗体と異なる 2種以上のアレルゲンとが夫々 同一面上に固定化された炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が表面に形成 されている担体からなる生理活性物質固定ィ匕担体を用いて、 上記方法 （2 ) と方 法 （3 ) とを同時に行えば、 一回の操作で、 試料中に存在する I g Eに対する アレルゲンの種類 （即ち、 当該試料に係る生体がどのようなアレルゲンに対 してアレルギー反応を引き起こすのか否か) の特定 ·同定又は/及ぴ特定 · 同定されたアレルゲンに対する感受性の強さの程度の分析と同時に当該試料 に係る生体のァレルゲン全般に対する感受性の強さの程度 （当該生体がァレ ルギ一体質であるのか否か） の分析を行うことができるので有利である。 即ち、 先ず、 生理活性物質として抗 I g E抗体と異なる 2種以上のアレルゲ ンとが夫々同一面上に固定化された炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が 表面に形成されている担体からなる生理活性物質固定化担体上に、 対象成分 （I g E) を含有する試料を滴下又は塗布等する力、、 或いは当該試料中に当該担体を 浸漬等して互いに接触させ、 担体上の各種アレルゲンと I g Eとの複合体及び担 体上の抗 I g E抗体と I g Eとの複合体を夫々生成させる。 その後、 当該担体を 適当な緩衝液等で洗浄し、 複合体の生成に関与しなかった試料中の成分を除 去する。 次いで、 生成した各種複合体と、 標識物質により標識された抗 I g E抗 体とを上記と同様にして接触させ、 担体に固定化されたアレルゲンと I g Eと標 識抗 I g E抗体との標識複合体と担体に固定化された抗 I g E抗体と I g Eと標 識抗 I g E抗体との標識複合体を夫々生成させる。 その後、 これを、 適当な緩衝 液等で洗浄して標識複合体の生成に関与しなかった遊離の標識抗 I g E抗体を除 去する。 その後、 生成した該標識複合体のうち、 担体に固定化された各種アレル ゲンに係る標識複合体中の夫々の標識物質を、 前述した如き方法により測定すれ ば、 生理活性物質として用いた 2種以上のァレルゲンのうちの何れのァレルゲン に対する抗体 （I g E) が試料中に存在するのか否か、 即ち、 試料中に存在する I g Eに対するアレルゲンの種類の特定 ·同定、 換言すれば、 当該試料に係 る生体がどのようなアレルゲンに対してアレルギー反応を引き起こすのか否 かの分析を行うことができ、 また、 前述した如き方法により測定された標識 物質の量に基づいて、 前述した如き方法により試料中に存在する特定 ·同定 されたアレルゲンに対する抗体 ( I g E ) の量を定量又は半定量的に求めれ ば、 当該試料に係る生体の当該特定 ·同定されたァレルゲンに対する感受性 の強さの程度、 即ち、 当該生体が特定 .同定されたアレルゲンに対してァレ ルギー反応を引き起こす強さの程度を分析することができる。 更に、 前述し た如き方法により測定された標識物質の量に基づいて、 前述した如き方法に より試料中に存在する総 I g E量を定量又は半定量的に求めれば、 当該試料 に係る生体のアレルゲン全般に対する感受性の強さの程度、 即ち、 当該生体 がアレルギー体質である.のか否か （その程度） を分析することができる。 続いて請求項 2 2記載の本発明の試料中の対象成分分析用キットについて説明 する。
請求項 2 2記載の本発明のキットは、 請求項 1〜1 2の何れかに記載の生理活 性物質固定化担体を含んでなるものである。 'これらの生理活性物質固定化担体に は、 分析対象となる 1又は 2以上の対象成分に対応し、 それぞれに特異的に結合 しうる 1又は 2以上の生理活性物質が固定化されている。 本発明のキットに於いて、 当該生理活性物質固定化担体の好ましい態様及び具 体例等は、 先に述べた通りである。 また、 本発明のキットには、 当該担体の他に、 上記した如きの対象成分或レ、は当該対象成分に係る複合体に特異的に結合する性 質を有する標識結合物質を含ませることができる。
尚、 本発明のキットは、 上記した如き請求項 1〜1 2の何れかに記載の生理活 性物質固定化担体を含んでなる以外は、 上記した如き通常この分野で用いられる 試薬類、 例えば緩衝液 （洗浄液） 等の溶液、 例えば被酸ィヒ性呈色試薬やカツプリ ング剤等の発色剤、 例えば標識物質が酵素である場合は、 その酵素を測定するた めの基質、 酵素反応を停止するための反応停止剤等の試薬類、 対象成分からなる 標準品等を含んでいてもよい。 尚、 このような試薬類や標準品に含まれる各 種成分の使用濃度は、 この分野で通常使用される濃度範囲から適宜選択すれ ばよい。 実施例
以下、 実施例により本発明を説明する。
(実施例 1 )
図 1のプロセスに従い、 抗 I g E抗体を結合したダイヤモンド被覆担体を用い て I g Eの分析を行った。
1 . 官能基の活性ィ匕
力ルボキシル基で覆われたダイャモンド被覆担体を、 2 0 mM N-hydroxysucc inimide及ぴ 0 . 1 M l- (3- (dimethylamino) ropyl) 3-ethylcarbodimideSr'a ii 0 . 1 M リン酸緩衝液 （ p H 6 ) に 3 0分間浸漬した。 浸漬終了後、 滅菌蒸留 水で 2回洗浄し、 完全に水分が飛ぶように、 ダイャモンド被覆担体を遠心分離し た。
2 . 抗ヒト I g E抗体の固定ィ匕 抗ヒト I g E抗体を 50 mM MOPS緩衝液 pH7. 5で所定濃度に調整し、 上記で作成した活性化ダイャモンド被覆担体に、 日本レーザー電子製 G T -MA S Sスタンビングマシーンを用いてスポッティングした。
スポッティング終了後、 あらかじめ、 65°Cにした 50% ホルムアミドを含 む加湿チヤンバー内で 1時間ィンキュベーションを行った。
3. ブロッキング処理
上記 2で得た I g E抗体囪定化ダイャモンド被覆担体に、 2 % 牛血清アルブ ミンを含む 50 mM MOPS緩衝液 (pH7. 5) で一昼夜室温でプロッキン グを行った。 プロッキング処理後、 1000 r p mで 1分間遠心分離を行った。
4. 検体との反応
測定対象であるヒ ト I g Eを、 2 % 牛血清アルプミンを含む 50 mM MO P S緩衝液 (pH7. 5) で所定濃度に調製して検体とし、 各検体を 10 μ Lチ ップに供与し、 気泡が入らないようにカバーグラスをかぶせた後、 ハイプリダイ ゼーション容器に入れ室温で 1時間反応させた。 反応終了後、 力パーグラスを除 去し、 SSC (0. 15Μ Na C 1 -0. 01 5M クェン酸三ナトリウム溶 液） で 3回洗浄し、 1000 r pm 1分間遠心分離を行った。
5. 担体に結合したヒト I gEの検出
Cy 3 label 抗ヒト I g E抗体 0.86μ g/mlを 10 Lチップに供与し、 気 泡が入らないように力パーグラスをかぶせた後、 ハイブリダィゼーション溶液に 入れ、室温で 1時間反応させた。反応終了後、カバーグラスを除去し、 S SC (0. 15M Na C 1 -0. 015M クェン酸三ナトリウム溶液） で 5回洗浄し、 1000 r pmで 1分間遠心分離を行った。
抗原抗体反応の度合いを GSI Lumonicus社製の共焦点レーザースキャナ一で C y 3 label 抗ヒト I g E抗体の量を測定した。 測定結果を表 1及び図 3に示す。 抗ヒ ト IgE抗体量の測定結果
Figure imgf000038_0001
表 1及ぴ図 3の結果から、 本発明の方法によりヒト I gEの検出及び定量が可 能となることが判る。
(実施例 2 )
図 2のプロセスに従い、 抗 I gE抗体を結合したダイヤモンド被覆担体を用い てァレルゲンの分析を行った。
1. ダイヤモンド被覆基体の活性化
カルボキシル基で覆われたダイヤモンド被覆基体を 20 mM N—ヒ ドロ キシサクシンイミ ド及び 0. 1M 1― (3—ジメチルアミノ） プロピル 3 一ェチルカルポジイミ ドを含む 0. 1M リン酸緩衝液 （p H 6) に 30分 間浸漬した。 その後、 これを、 滅菌蒸留水で 2回洗浄し、 完全に水分が蒸発 するように、 遠心分離処理を行った。
2. アレルゲンの固定化
アレルゲン （ダニ抗原又はスギ抗原） を、 50mM MOP S緩衝液 (p H7. 5) で夫々 0. 5mgZmlの濃度となるように調整し、 上記作製した活 性化ダイヤモンド被覆基体に、 日本レーザー電子製 GT— MAS Sスタンピ ングマシーンを用いてスポッティングした。 スポッティング終了後、 50% ホルムアミ ドを含む加湿チャンバ一内で、 1時間インキュベーションを行つ た。
3. ブロッキング処理
2 %牛血清アルブミンを含む 50 mM MOP S緩衝液 （ p H 7. 5) 1 Ο / lを、 ダイヤモンド被覆基体にアプライし、 力パーガラスを気泡が入らな いようにかぶせ、 2時間プロッキングを行った。
カバーガラスを取り除き、 1 X S S Cで 3回洗浄を行った後、 遠心分離処 理により、 余分な水分を除去した。
4. 検体のアプライ
スギ又はダニに対してアレルギー反応を示すヒ トの血清 （スギ陽性血清又 はダニ陽性血清）、及ぴ両者に対してアレルギー反応を示さないヒ トの血清（陰 性血清） を検体とし、 これら血清 1 0 を夫々マイクロアレイ上にアプライ し、 カバーガラスを気泡が入らないようにかぶせ、 4 °Cで 1昼夜反応させた。 反応後、 カバーガラスを除去し、 1 X S S Cで 3回洗浄を行い、 遠心分離処 理により余分な水分を除去した。
5. 標識抗体との反応
4. 3 μ g/ral C y 3 label 抗 I g E抗体、 及ぴ 2% 牛血清アルブ ミンを含む、 50mM MOP S緩衝液 （pH 7. 5) Ι Ο μΙを、 マイクロ アレイ上にアプライし、 カバーガラスを気泡が入らないようにかぶせ、 3時 間反応を行った。 反応後、 力パーガラスを除去し、 1 X S S Cで 3回洗浄後、 遠心分離処理により余分な水分を除去した。
6. 結果
抗原抗体反応の度合いを、 GSI Lumonicus社製の共焦点レーザースキャナー で Cy 3 label 抗ヒ ト I g E抗体由来の蛍光を測定した。 陰性血清を検体 として用いた場合の結果を図 4に、 スギ陽性血清を検体として用いた場合の 結果を図 5に、 また、 ダニ陽性血清を検体として用いた場合の結果を図 6に 夫々示す。
図 4の結果から、 陰性血清を用いた場合は、 マイクロアレイ上のスギ抗原 及ぴダニ抗原固定化部位からは、 C y 3 label 抗ヒ ト I g E抗体由来の蛍 光が殆ど認められないことが、 図 5の結果から、 スギ陽性血清を用いた場合 は、 マイクロアレイ上のスギ抗原固定化部位からは C y 3 label 抗ヒ ト I g E抗体由来の蛍光が認められるのに対して、 ダニ抗原固定化部位からは C y 3 label 抗ヒ ト I g E抗体由来の蛍光が殆ど認められないことが、また、 図 6の結果から、 ダニ陽性血清を用いた場合は、 ダニ抗原固定化部位から C y 3 label 抗ヒ ト I g E抗体由来の強い蛍光が認められることが、 夫々判 る。
尚、 図 6に於いて、 マイクロアレイ上のスギ抗原固定化部位からも C y 3 label 抗ヒ ト I g E抗体由来の弱い蛍光が若干認められているが、 これは、 当該ダニ陽性血清提供者に関して詳細な検査を行った結果、 ダニのみでなく、 スギに対しても若干の弱いアレルギー反応を示すこと、 即ち、 当該ダニ陽性 血清は、 ダニとスギに対してアレルギー反応を示す血清であったためである。 これらの結果から、 本発明の方法によりアレルギーの原因となるアレルゲンの 特定が可能となることが判る。 また、 特定されたアレルゲンに対する感受性の 強さの程度を分析することが可能となることが判る。 産業上に利用可能性
本発明の生理活性物質固定化担体は、 生理活性物質を高密度に固定化すること ができるので、 生理活十生物質を大量に消費することなく高い固定化効率を実現す ることができる。 し力も、 種々の表面電荷を示す生理活性物質であっても、 高い 固定化効率を保つことができる。
また、 本発明の担体の製造方法によれば、 前記担体を効率よく製造することが できる。
さらに、 本発明の試料中の対象成分を分析する方法は、前記担体を用いるので、 各種対象成分を正確に分析することが可能である。
さらに、 本発明のキットを用いることにより、 試料中の対象成分の分析をより 簡便に行うことができる。
特に、 抗 I g E抗体を固定化した担体は、 アレルゲンと反応しアレルギーに深 く関与する I g Eを正確に分析することができるので、 ァレルギ一の原因など各 種免疫診断に有用である。
したがって、 本発明は、 医療分野での疾病診断、 生化学、 分子生物学分野での 研究等の各分野で有用である。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 生理活性物質が固定ィヒされた炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が 担体表面に形成されている担体からなる生理活性物質固定化担体。
2 . 生理活性物質が、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層の官能基を介 してその表面に固定ィヒされている請求項 1に記載の生理活性物質固定ィ匕担体。
3 . 生理活性物質が、 該物質が有する官能基と炭素乃至は金属又は半金属 炭素化合物層の官能基との結合により、 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合 物層の表面に固定化されている請求項 1に記載の生理活性物質固定化担体。
4 . 生理活性物質が有する官能基又はノ及び炭素乃至は金属又は半金属炭 素化合物層の官能基が、水酸基、 カルボキシル基、硫酸基、 シァノ基、 ニトロ基、 チオール基、 アミノ基、 ァミノフエ-ル基及びエポキシ基からなる群から選ばれ た 1又は 2以上のものである請求項 3に記載の生理活性物質固定ィヒ担体。
5 . 生理活性物質が、 生体に特有の作用を及ぼす物質又は生体由来タンパ ク若しくはぺプチドである請求項 1〜4の何れかに記載の生理活性物質固定 化担体。
6 . 生理活性物質が、 抗原又は Z及び抗体である請求項 1〜 5の何れかに記載 の生理活性物質固定化担体。
7 . 抗原又は/及び抗体が、 腫瘍マーカー、 ホルモン、 環境ホルモン、 微生物 由来タンパク又はペプチド或いは糖鎖抗原、 レセプター、 リガンド、 アレルゲン、 免疫グロプリン、 レクチン、 糖鎖、 脂質、 リポ多糖及びこれらに対する抗体から なる群から選ばれた 1又は 2以上のものである請求項 6に記載の生理活性物質固 定化担体。
8 . 抗原又は/及び抗体が、 アレルゲン、 免疫グロプリン、 及ぴこれらに対す る抗体からなる群から選ばれた 1又は 2以上のものである請求項 7に記載の生理 活性物質固定化担体。
9 . 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が、 結晶性炭素からなる層であ る、 請求項 1〜 8の何れかに記載の生理活性物質固定ィ匕担体。
1 0 . 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が、 非晶性炭素からなる層で ある、 請求項 1〜 8の何れかに記載の生理活性物質固定化担体。
1 1 . 結晶性炭素が、 ダイヤモンド又はダイヤモンドライクカーボンである請 求項 9に記載の生理活性物質固定化担体。
1 2 . 非晶性炭素が、 グラフアイト又は非晶性カーボンである請求項 1 0に記 載の生理活性物質固定化担体。
1 3 . 官能基を有する炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が表面に形成 された担体と、 生理活性物質とを接触させることを特徴とする生理活性物質固定 化担体の製造方法。
1 4 . 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が形成された担体表面に官能 基を導入し、 次いでこれと生理活性物質とを接触させることを特徴とする生理活 性物質固定化担体の製造方法。
1 5 . 官能基が、 水酸基、 カルボキシル基、 硫酸基、 シァノ基、 ニトロ基、 チ オール基、 アミノ基、 ァミノフエ二ル基及ぴエポキシ基からなる群から選ばれた 1又は 2以上のものである請求項 1 3又は 1 4に記載の生理活性物質固定ィ匕担体 の製造方法。
1 6 . 炭素乃至は金属又は半金属炭素化合物層が形成されている担体表面に 固定化されてなる生理活性物質。
1 7 . 請求項 1〜 1 2の何れかに記載の生理活性物質固定化担体を用いること を特徴とする、 試料中の対象成分の分析方法。
1 8 . 請求項：！〜 1 2の何れかに記載の生理活性物質固定化担体と対象成分を 含有する試料とを接触させ、 当該担体表面に固定化された生理活性物質と試料中 の対象成分とから生成した複合体を分析することを特徴とする、 請求項 1 7に記 載の試料中の対象成分の分析方法。
1 9 . 担体表面に固定化された生理活性物質が、 抗原又は抗体の何れかであり、 試料中の対象成分が、 当該生理活性物質に対する抗原又は抗体である請求項 1 7 又は 1 8に記載の試料中の対象成分の分析方法。
2 0 . 抗原又は抗体が、 腫瘍マーカー、 ホルモン、 環境ホルモン、 微生物由来 タンパク又はペプチド或いは糖鎖抗原、 レセプター、 リガンド、 アレルゲン、 免 疫グロブリン、 レクチン、 糖鎖、 脂質、 リポ多糖及ぴこれらに対する抗体からな る群から選ばれた 1又は 2以上のものである請求項 1 9に記載の試料中の対象成 分の分析方法。
2 1 . 抗原又は抗体が、 アレルゲン、 免疫グロブリン、 及びこれらに対する抗 体からなる群から選ばれた 1又は 2以上のものである請求項 2 0に記載の試料中 の対象成分の分析方法。
2 2 . 請求項 1〜 1 2の何れかに記載の生理活性物質固定ィ匕担体を含んでなる 試料中の対象成分分析用キット。
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