JP3713032B2

JP3713032B2 - 低アレルゲンスギ選抜に関する簡便なＣｒｙｊ１免疫測定法

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Publication number: JP3713032B2
Application number: JP2003306429A
Authority: JP
Inventors: 揚佐々木
Original assignee: Akita Prefecture
Current assignee: Akita Prefecture
Priority date: 2003-08-29
Filing date: 2003-08-29
Publication date: 2005-11-02
Anticipated expiration: 2023-08-29
Also published as: JP2005077191A

Description

本発明は、アレルゲンの少ないスギの選抜に有用な新たなスギ花粉アレルゲンのイムノアッセイ法に関する。

スギ花粉症は、スギ花粉を原因とするアレルギーで、近年、患者数の増加とともに大きな社会問題になっている。この花粉症患者が増加した理由には、車社会の発達によって増加したディーゼル排出粒子にアジュバント作用があることや、都市化に伴って生活環境が衛生になったため、人間の免疫防御システムが変化し、アレルギーになりやすくなったなどが考えられている。

また、直接的な原因としてスギ飛散花粉の増加が考えられる。国内では、１９５０年代から７０年代にかけて、木材生産を向上させるためにスギの造林が急増した。現在、これらのスギが開花樹齢に達してスギの飛散花粉が増加し始めている。

林業サイドからのスギ花粉症対策として、花粉の少ないスギの選抜に関する研究が始まっっている。秋田県を含む東北地方では１３系統が選抜され、中でも、生長、病虫害抵抗性などを考慮して多数の候補木から選抜した精英樹から生産される種子が広く植林に供給されている。

これまでは、スギ種子生産の採種園には種子生産性と遺伝的多様性を高めるために花粉生産性が高い系統を積極的に用いてきた。しかし、スギ花粉症との関係で花粉量とアレルゲン量を総合して考えれば、花粉が多くてもアレルゲンが少ない、あるいは花粉が少なくかつアレルゲンが少ない精英樹が選抜されれば、花粉症対策として有効と考えられる。

スギ花粉症の原因物質であるアレルゲンは、花粉の表面と内部に存在する２種類のタンパク質Ｃｒｙｊ１（非特許文献１）とＣｒｙｊ２（非特許文献２）である。このスギ花粉症アレルゲンに関する研究により、Ｃｒｙｊ１含量とＣｒｙｊ２含量には１％水準で有意な相関が認められることが報告されている（非特許文献３）。このことは、Ｃｒｙｊ１あるいはＣｒｙｊ２のいずれか一方を測定対象とすることによって、低アレルゲンスギの選抜が可能となることを示している。

スギ花粉アレルゲンの定量は、免疫測定法の一種であるサンドイッチＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）によって行われることが一般的である。しかしながら、これまでの方法では、スギ花粉アレルゲンを特異的に認識することのできる２種類の異なる抗体の準備が必要であった。

これに対して、本発明者らは、ただ一種類の抗スギ花粉アレルゲン抗体を用いてスギ花粉アレルゲンであるＣｒｙｊ１を検出することのできる方法を開発した（非特許文献４）。この方法（以下、これを簡便法と称する）では、抗スギ花粉アレルゲン抗体ではなく検出目的であるスギ花粉アレルゲン自体を直接マイクロプレートなどの固相に吸着させ、ここに該アレルゲンを特異的に認識する抗体を添加して反応させて、固相に吸着したスギ花粉アレルゲンを検出、定量する方法である。

Ｙａｓｕｅｄａ，Ｈ．，Ｙｕｉ，Ｙ．，Ｓｃｈｉｍｉｚｕ，Ｔ．ａｎｄＳｈｉｄａ，Ｔ．Ｊ．ＡｌｌｅｒｇｙＣｌｉ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７１：７７−８６（１９８３）Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｓ．，Ｔａｎｉａｉ．Ｍ．，Ａｎｄｏ．Ｓ．，Ｕｓｕｉ．Ｍ．ａｎｄＭａｔｓｕｈａｓｉ，Ｔ．、Ａｌｌｅｒｇｙ４５：３０９−３１２（１９９０）佐々木義則，谷口美文，正山征洋、大分県研究時報２２：８〜１２（１９９６）佐々木揚，堀田康雄、２００２年林学会講演要旨集、第３２９頁、２００２年４月

上記の簡便法によるスギ花粉アレルゲンの定量は、２種類以上の抗スギ花粉アレルゲン抗体の調製を不要とする点などにおいて従来のサンドイッチイムノアッセイに比べて有利な方法ではあるが、所要時間は通常のサンドイッチイムノアッセイと殆ど変わらず、低アレルゲンスギの選抜作業にあってはいまだ迅速性に改善の余地を有している。

本発明は、既に報告した簡便法をさらに改良して、より短時間で正確なスギ花粉アレルゲンの定量を可能にする方法に関する。

すなわち本発明は、スギ花粉抽出液を添加した固相を加熱処理することを特徴とする、スギ花粉アレルゲンを特異的抗体で検出するイムノアッセイに関する。

簡便法は、一般的なサンドイッチイムノアッセイと同様に、スギ花粉からの抽出液あるいはその希釈液を加熱処理してから、スギ花粉アレルゲンをマイクロプレート等の固相に吸着させる方法である。この方法では、スギ花粉アレルゲンの固相への吸着に要するインキュベーション時間は最低でも一夜（１２時間）。すなわち、１夜未満のインキュベーション時間では、特異抗体を用いたイムノアッセイによるスギ花粉アレルゲンの検出感度は実質上０に近く、スギ花粉アレルゲンの定量を行うことは出来なかった。その結果、スギ花粉からの抽出液の調製に始まり、スギ花粉アレルゲンを定量するまでに２日もの時間が必要であった。

本発明では、スギ花粉からの抽出液あるいはその希釈液をそのままマイクロプレートなどの固相に加えた後に、固相ごとスギ花粉アレルゲンの加熱処理を行うものである（以下、本発明の方法をダイレクト法と称する）。驚くべきことに、この改良によってスギ花粉アレルゲンの固相への吸着時間は著しく改善される。実際には、スギ花粉アレルゲンの固相への吸着に要する時間はわずか数分で測定可能となる。

特に予想外なことには、固相の加熱処理時間とＣｒｙｊ１の検出感度について特徴的な関係が認められた。具体的には、処理温度８０℃の場合、２〜４分間の間にスギ花粉アレルゲンの検出感度にピークが存在していた。このことは、加熱処理自体も極めて短時間で済むことを意味し、Ｃｒｙｊ１を高感度かつ迅速に測定するという目的において、より好適な特徴の一つである。

（発明の効果）
本発明の方法により、スギ花粉アレルゲンの測定に要する抗スギ花粉アレルゲン抗体は１種類のみで足りることに加え、スギ花粉アレルゲンの固相への吸着が３分間と短時間であるなど、極めて簡便かつ短時間に測定を行うことができる。また、後に示す試験例から明らかなように、様々な共雑物を含有するスギ花粉抽出液を用いても、該抽出液中のスギ花粉アレルゲンの量を正確に定量することができ、アレルゲンの少ないスギを的確かつ簡便に選別することができる。

（発明の実施の形態）
スギ花粉からのアレルゲンの抽出は、例えば後藤ら（後藤陽子、近藤禎二、井手武、山本恵三、稲岡心、安枝浩、２００２年林学会講演要旨集、第３３０頁）の方法に基き、あるいはその他当業者に公知の方法によって抽出すればよく、本発明を実施するに当たり格別の操作は要しない。

また、本発明に言う固相は、蛋白質、特にスギ花粉アレルゲンを吸着し得る容器、プレート、粒子等を意味するが、典型的にはイムノアッセイを一度に大量に行うために汎用されるマイクロプレートである。

本発明で使用される抗体の種類には特別の制限はなく、スギ花粉アレルゲン、例えばＣｒｙｊ１あるいはＣｒｙｊ２をそれぞれ特異的に認識することのできる抗体であれば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆａｂ等のフラグメントなど何れも使用することができる。特に、Ｃｒｙｊ１において複数のサブタイプ（表１）の存在が報告されていることから、Ｃｒｙｊ１を対象としてスギ花粉アレルゲンを確実に測定することを考慮すれば、Ｃｒｙｊ１サブタイプ間で保存されているアミノ酸配列部分を認識することのできる抗体の利用が好ましい。

具体的には、Ｃｒｙｊ１サブタイプ間で保存されているアミノ酸配列からなるペプチドあるいはかかるペプチドと他の蛋白質との結合体を抗原として動物に投与し、通常の操作によって該抗原に特異的な抗体を調製すればよい。

また、本発明で使用する抗体としては、スギ花粉タンパク質Ｃｒｙｊ１のアミノ酸配列ＦＴＧＨＤＤＡＹＳＤＤＫＳＭＫＶＴで表される抗原決定基を認識し結合する抗体として株式会社エル・エス・エルから市販されている抗スギ花粉タンパク質Ｃｒｙｊ１モノクローナル抗体である「Ａｎｔｉ（ＭＡＰ）Ｃｒｙｊ１」が好適である。

また、本発明で使用する抗体には、適当なプローブ分子、例えばストレプトアビジンなどの低分子化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ホースラディッシュパーオキシダーゼなどの様な酵素を標識として結合させることが出来、そのような標識抗体は当業者に周知の方法により調製することができる。この標識化抗スギ花粉アレルゲン抗体の使用は、本発明における方法の実施を容易にするものとして好ましい態様である。

以下、非限定的な実施例を示して、本発明をさらに詳述する。

（実施例）
スギ精英樹より採取し４℃で冷蔵保存したスギ花粉２０ｍｇに、１ｍＬの０．１２５ＭＮａＨＣＯ_３を加えて４℃で１時間インキュベートし、１５，０００ｒｐｍ、１０分の遠心分離を行った。得られた花粉抽出液９μＬと脱気した０．１２５ＭＮａＨＣＯ_３９１μＬを９６穴マイクロプレートのウェルに分注し、ウォーターバスを用いて８０℃で３分間の加熱処理を行った。

加熱処理後のウェルに２００μＬの５％ＢＳＡ（アルブミンフリー）／ＴＢＳを加えて、３７℃１時間あるいは一昼夜ブロッキング処理を行い、さらにＴＢＳで３回洗浄した。抗体としては、０．２％ＢＳＡを含むＴＢＳで５００倍に希釈したウサギモノスペシフィックポリクローナル抗体Ａｎｔｉ（ＭＡＰ）Ｃｒｙｊ１（ＬＳＬ）１００μＬを、３７℃で１時間反応させた。その後、ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で３回、さらにＴＢＳで３回洗浄後、０．２％ＢＳＡを含むＴＢＳで１，０００倍希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ウサギヤギＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ）を、３７℃で１時間反応させた。
その後、ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で３回、ＴＢＳで３回洗浄後、ＢｌｕｅＰｈｏｓキット（ＫＰＬ）で発色および発色反応を停止させたのち、６５５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ５５０，Ｂｉｏｒａｄ）で測定した。

花粉抽出液を添加したマイクロプレートを加熱処理しない場合にはＣｒｙｊ１は殆ど測定されないが、上記の加熱処理によりＣｒｙｊ１が測定可能となり、また加熱時間により検出感度が変化し、２〜４分の加熱処理時間に検出感度のピークが存在し、６分でほぼ定常状態となった（図１）。

＜試験例１＞
１）ダイレクト法と簡便法との比較
スギ精英樹８個体から、実施例１の方法に従ってＣｒｙｊ１を測定した。一方、ダイレクト法と比較するため、従来の簡便法によって同じスギ精英樹８個体を用いて、Ｃｒｙｊ１を以下のように測定した。

花粉抽出液９μＬと０．１２５ＭＮａＨＣＯ_３９１μＬを９６穴マイクロプレートのウェルに分注し、１晩マイクロプレートを４℃でインキュベートした。その後、ウェルに２００μＬの５％ＢＳＡ（アルブミンフリー）／ＴＢＳを加えて、３７℃１時間ブロッキング処理を行い、さらにＴＢＳで３回洗浄した。

抗体としては、０．２％ＢＳＡを含むＴＢＳで５００倍に希釈したウサギモノスペシフィックポリクローナル抗体Ａｎｔｉ（ＭＡＰ）Ｃｒｙｊ１（ＬＳＬ）１００μＬを、３７℃で１時間反応させた。その後、ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で３回、さらにＴＢＳで３回洗浄後、０．２％ＢＳＡを含むＴＢＳで１，０００倍に希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ウサギヤギＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ）を、３７℃で１時間反応させた。ＴＴＢＳで３回、さらにＴＢＳで３回洗浄後、ＢｌｕｅＰｈｏｓキット（ＫＰＬ）で発色および発色反応を停止し、６５５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（Ｍｏｄｅｌ５５０，Ｂｉｏｒａｄ）で測定した。

その結果、ダイレクト法と簡便法には有意な相関が認められ、ダイレクト法によってもＣｒｙｊ１の定量が可能であることが明らかになった。なお、ダイレクト法と簡便法の変動係数（ＣＶ）は、１３．７％ＢＳと９．７％ＢＳであり、実用上において大きな差はなかった。

＜試験例２＞
スギ花粉抽出液にはＣｒｙｊ１以外のタンパク質や多糖類も含まれる。したがって、これらＣｒｙｊ１以外の物質が多ければ、定量精度に影響を与える可能性によって、実際に検出されていても正確に定量されていない可能性も十分考えられる。そこで、簡便法ＥＬＩＳＡがＣｒｙｊ１の定量に有効かどうか、サンドイッチＥＬＩＳＡとの相関を調べた。

１）簡便法
スギ精英樹１４個体から上述の＜試験例１＞に従ってＣｒｙｊ１を測定した。

２）サンドイッチイムノアッセイ
ＴＢＳ（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５００ｍＭＮａＣｌ）で１００倍に希釈した第一の抗体としての一次抗体（マウスモノクローナル抗体ａｎｔｉ−Ｃｒｙｊ１ｍＡｂ０２６、Ｈａｙａｓｈｉｂａｒａ製）１００μＬを、４℃で１晩マイクロプレートに吸着させた。ブロッキングは５％ＢＳＡ（アルブミンフリー，Ｓｉｇｍａ製）を含む２００μＬのＴＢＳで一昼夜行った。

ＴＢＳで３回洗浄後、０．１２５ＭＮａＨＣＯ_３で希釈した試料１００μＬをマイクロプレートに分注し、４℃で１晩おいた。ＴＢＳで３回洗浄後、第二の抗体としての二次抗体（ウサギモノスペフィックポリクローナル抗体Ａｎｔｉ（ＭＡＰ）Ｃｒｙｊ１、ＬＳＬ）を、ＴＢＳで５００倍希釈した１００μＬを３７℃で１時間、反応させた。

ＴＴＢＳ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ）で３回、さらにＴＢＳで３回洗浄後、０．２％ＢＳＡを含むＴＢＳで１，０００倍希釈したアルカリホスファターゼ標識抗ウサギヤギＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ）を、３７℃で１時間反応させた。ＴＴＢＳで３回、さらにＴＢＳで３回洗浄後、ＢｌｕｅＰｈｏｓキット（ＫＰＬ）で発色および発色反応を停止し、６５５ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダーで（Ｍｏｄｅｌ５５０，Ｂｉｏｒａｄ）で測定した。

その結果、サンドイッチイムノアッセイと簡便法には有意な相関が認められ、簡便法によって定量が正確であることが明らかになった。重要なこととして、Ｃｒｙｊ１の含有量が低いスギの系統の場合、Ｃｒｙｊ１が多い系統と比較して実測値とサンドイッチイムノアッセイ−簡便法の回帰直線から推定される予測値との差が小さいことがわかった。したがって、簡便法によるＣｒｙｊ１の定量法は、抽出液中のＣｒｙｊ１以外のタンパク質や多糖類による測定精度への影響は少ないことが確認された。この結果は、簡便法と明確な相関を有するダイレクト法にもそのまま反映される。

以上のことから、ダイレクト法は従来の簡便法よりもさらに迅速にＣｒｙｊ１を測定でき、低アレルゲンスギ選抜に関して極めて有効な手法であることが確認された。

図１は、スギ花粉抽出の加熱処理の処理温度と本発明の方法における検出感度との関係を示す。図２は、雄勝１４号、北秋田１号、平鹿２号からの花粉抽出液を用いた場合の本発明による測定結果を示す。図３は、スギ精英樹８個体からの花粉抽出液を用いた場合の本発明による測定結果と簡便法による測定結果を示す。図４は、スギ精英樹１４個体からの花粉抽出液を用いた場合の本発明による測定結果と簡便法による測定結果を示す。

Claims

ＮａＨＣＯ_３水溶液を用いてＣｒｊ１を含み得るスギ花粉から調製したスギ花粉抽出液を添加した固相を８０℃で２〜４分間処理することを特徴とする、スギ花粉アレルゲンＣｒｙｊ１を特異的抗体で検出するイムノアッセイ方法。
前記特異的抗体が、Ａｎｔｉ（ＭＡＰ）Ｃｒｙｊ１である請求項１に記載の方法。