WO2002088366A1 - Enzyme de clivage du facteur de von willebrand (vwf) - Google Patents

Enzyme de clivage du facteur de von willebrand (vwf) Download PDF

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vwf
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leu
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Kenji Soejima
Noriko Mimura
Hiroaki Maeda
Chikateru Nozaki
Takayoshi Hamamoto
Tomohiro Nakagaki
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Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute
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Definitions

  • VWF Von Willebrand Factor
  • the present invention relates to a plasma protein in the field of ethical drugs. More specifically, it relates to a specific cleavage enzyme of von Willebrand Factor (hereinafter sometimes referred to as vWF) involved in blood coagulation.
  • vWF von Willebrand Factor
  • the vWF-cleaving enzyme provided by the present invention provides replacement therapy for a patient suffering from a deficiency or reduction of the enzyme such as thrombotic thrombocytopenic purpura (hereinafter sometimes referred to as TTP), etc. Possibilities are opened up. In addition, it is expected to be used as a novel antiplatelet thrombotic agent.
  • TTP thrombotic thrombocytopenic purpura
  • vWF is produced in vascular endothelial cells and bone marrow megakaryocytes, and has a multimeric structure (molecular weight 500-20, molecular weight: 500--20, with a single unit consisting of 2050 amino acid residues (monomer about 250 kDa) connected by S--S bonds. It is a hemostatic factor that exists with 000 kDa a).
  • the blood concentration is about 10 ⁇ g / m 1, and the higher the molecular weight, the higher the specific activity.
  • vWF has two major haemostatic factors: one is a carrier protein that binds to and stabilizes blood coagulation factor VIII, and the other is vascular endothelial cells on the injured vessel wall. It is a function of forming platelet thrombi by adhering and agglutinating platelets to the underlying tissue.
  • Thrombotic thrombocytopenic purpura is a disease that causes platelet thrombi in systemic arterioles and capillaries, and despite the advancement in medical technology today, the associated mortality rate in the disease was 1971- By 1991 it had increased about threefold.
  • TTP is thought to be caused by vascular endothelial cell damage and intravascular platelet aggregation, and immunohistochemistry shows that a large amount of vWF is present in the resulting platelet thrombus. WF is thought to play a major role in this.
  • VWF of TTP patients The structure of the chima is normal or has a high molecular weight, especially unusually unusually large vWF (unvually large vWF mul timer: UL vWFM) and high molecular weight vWF polymer (large vW multimer: L vWFM) ) Is thought to play a major role in promoting platelet aggregation and forming microthrombi under high shear stress.
  • vWF was known to undergo degradation at the position of 842Tyr_843Met under the action of vWF-cleaving protease under high shear stress in circulating blood of healthy subjects. Therefore, a scenario is drawn in which the enzyme activity in plasma decreases for some reason, platelet aggregation increases due to an increase in UL vWFM to LvWFM, and platelet thrombi are formed in blood vessels. I have.
  • Plasma exchange therapy has been used to treat patients with congenital deficiency of vWF-specific cleavage enzyme and patients with an antibody positive to the acquired enzyme, and purified products of the enzyme or pure products such as genetically modified products It is hoped that replacement therapy will be established. It has been reported that familial TTP patients are congenitally deficient in the vWF-specific cleavage enzyme, and that non-familial TTP are caused by the production of autoantibodies against the enzyme. Therefore, replacement therapy with this enzyme is desirable for patients with familial TTP (actually plasma is administered), and non-familial TTP requires removal of autoantibodies by plasma exchange and replacement of this enzyme. is there. Furthermore, the use of this enzyme is expected to be applied as a novel antiplatelet thrombotic drug.
  • vWF-cleaving enzymes are described by Furlan et al. (Blood, vol. 87, 4223—4234: 1996, Table 2000—508918), and Tsai et al. 87, 4235—4244: 1996), suggesting that it is a mammalian protease in plasma, that it was partially purified, and that its specific activity was 1,000- Although it was reported that the concentration was 10,000-fold, even under these conditions, there has been no progress in the characterization of the enzyme itself, such as the amino acid sequence of the protein, for about five years since then. No specific biochemical information has yet been obtained for this enzyme.
  • the present inventors have conducted intensive studies in order to achieve the isolation and identification of the vWF-cleaving enzyme, and as a result, succeeded in the purification and isolation of the desired vWF-cleaving enzyme, which has not been reported before.
  • the amino acid sequence of the mature protein and the gene encoding the amino acid sequence have been identified.
  • the vWF-cleaving enzyme of the present invention has the property of being able to cleave the 842Tyr-843Met bond of vWF.
  • the enzyme has a 105-160 kDa or 160-250 kDa value in SDS-PAGE under reducing or non-reducing conditions. It is shown to have a molecular weight and is composed of a polypeptide chain containing Leu-Leu-Val-Ala-Val as a partial sequence, and more preferably Ala-Ala-Gly-Gly-lie-Leu-His-Leu -Glu-Leu-Leu-Val-Ala-Val consists of a polypeptide chain containing the N-terminal amino acid partial sequence of the mature protein. And it is a new substance characterized by the following properties:
  • the enzyme of the present invention cleaves the 842Tyr-843Met peptide bond as a result of N-terminal sequence analysis of the cleavage fragment.
  • FI paste When FI paste is used as starting material, fractionation using gel filtration chromatography , Most of the activity is recovered at a molecular weight of 150 kDa to 300 kDa, but one example of the actually obtained active substance of the present invention is 150 to 16 O O by electrophoresis. Since it has a molecular weight of about kDa, it is a substance that may easily form a dimer or bind to other molecules, or a substance that may be easily degraded or have heterogeneity in glycosylation. You.
  • this enzyme derived from FI paste or cryoprecipitate which is derived from human plasma, exhibits a molecular size of about 105 kDa to 160 kDa, which is a molecular weight marker, in SDS-MGE. .
  • the amino acid sequence represented by the frame including the termination codon from the start codon of atg 445 to the tga of pos 476 and below is genetically modified based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 15.
  • the molecular size When expressed using a technique, although the molecular size differs slightly depending on the host, it generally indicates a molecular size of about 160 kDa to 25 OkDa, which is the molecular weight marker. This size is also found in the plasma of healthy humans and some TTP patients.
  • this enzyme may have the presence of an alternative splicing product (SEQ ID NOs: 16 to 21) observed during gene cloning, a difference in post-translational modification such as glycosylation, or degradation during the purification process. There are multiple species in human plasma that may be due to Furthermore, this enzyme can be recovered in an active state after non-reducing SDS-PAGE.
  • a nucleic acid sequence encoding the amino acid sequence of the present invention was identified with high reliability by a database search. Specifically, as a result of performing a database search on the genome using the program tblas tn, a chromosome clone (AL158826) presumed to encode the enzyme of the present invention was identified. Tag) A clone that is presumed to be a part of the target enzyme and a part of the polypeptide encoded by the genome based on comparison with the data base.
  • the enzyme protein was further prepared in large quantities, and the amino acid sequence of 29 amino acids from the ⁇ end was determined.
  • the amino acid sequence is shown in SEQ ID NO: 8. This result is almost identical to the sequence of SEQ ID NO: 3 or 7 estimated using bioinformatics, the only difference being that the amino acid at position 27 is the same as that of SEQ ID NO: 3 or 7. This is G1u, whereas Arg was found in this ⁇ -terminal sequence analysis. This was considered to be a gene polymorphism (polymorphism). Thus, it was confirmed that the present enzyme, as its mature form, was composed of a polypeptide chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 or 7 at the N-terminus.
  • the gene fragment encoding this enzyme was cloned by the following procedure. Based on the nucleic acid sequence in SEQ ID NO: 7, a sense primer (SEQ ID NO: 9) and an antisense primer (SEQ ID NO: 10) were prepared based on the nucleic acid sequence indicated by the underlined site in FIG. The amplified part of the gene was amplified. After the fragment was cloned, the nucleotide sequence was confirmed. Using the fragment as a probe, the expression site of the present enzyme gene was confirmed by Northern blot analysis. As a result, it was confirmed that this enzyme gene was characteristically expressed in the liver.
  • a human liver cDNA library was purchased, and the gene encoding this enzyme was identified using the RACE method (Rapid Amplification of cDNA Ends).
  • RACE Rapid Amplification of cDNA Ends.
  • an approximately 5 kilobase mRNA (cDNA) sequence up to the poly-A-added site shown in SEQ ID NO: 15 was identified.
  • this enzyme Based on the amino acid sequence deduced from this gene sequence, this enzyme has a prebub sequence and a ADAM (A Disintegrin And Metalloprotease) family, which has a disintegrin domain, a metaprotease domain, etc., especially TSP-1 (thrombospondin). Type-1) It was presumed to belong to one of the ADAM-TS families with domains.
  • ADAM Disintegrin And Metalloprotease
  • Type-1 thrombospondin
  • the isoforms shown in SEQ ID NOs: 16 to 21 were identified. Therefore, the requirement of the enzyme of the present invention is that the vWF is cleaved with 842Tyr-843Met, and is expressed as having an amino acid partial sequence of Leu-Leu-Vat Ala_Val.
  • the vWF-cleaving enzyme of the present invention can be prepared by the following method.
  • the feature of the method for measuring the activity of the enzyme in the present invention is that the presence or absence of the activity can be evaluated in a short time.
  • analysis was performed on the vWF cleavage pattern by Western blotting using an anti-vWF antibody. It takes time to transfer data. More specifically, an enzymatic reaction with the substrate vWF is performed for 24 hours, followed by 17 hours for electrophoresis, and 3 hours for transfer to the filter followed by a detection reaction using an anti-vWF antibody. It takes at least about 45 hours.
  • the activity measurement performed by the inventors of the present invention indicates that the enzymatic reaction with the substrate vWF is
  • the electrophoresis and detection can be completed in 6 hours and 2 hours in a total of 18 hours, and the time can be reduced by a little less than one third.
  • the time for the purification step can be reduced, and the inactivation of the activity of the present enzyme can be reduced. Therefore, the purification efficiency is higher than that of Furan et al., And as a result, the purification degree is improved.
  • the starting material was examined using the above-mentioned Atsushi system, and it was found that the present enzyme activity was more concentrated in the FI paste than cryoprecipitate reported by the conventional Furan et al. .
  • the activity measurement system is combined by applying a purification method combining gel filtration chromatography and ion exchange chromatography.
  • the FI paste is solubilized in a buffer and fractionated using gel filtration chromatography.
  • the activity of this enzyme is estimated at the molecular weight of 150 kDa to 300 kDa by estimating from the size marker of the gel filtration, and then the precipitate is concentrated with 33% saturated ammonium sulfate. This process was performed a total of three times, and the pooled active fraction from the third gel filtration was subjected to 4 ° C- ⁇ filtration in a buffer containing 50 mM MTris-HC1 pH 7.1 and 50 mM NaCl, followed by anion exchange chromatography. (DEAE) and elute stepwise with 0.25M NaCl.
  • a peptide or protein prepared based on the obtained sequence is used as an antigen, and a normal immunization method (Current Protocols in Molecular Biotechnology, Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et al. 1 or ANTIBODY ENGINEERING second edition Edited by Carl AK BOR EBAE CK) makes it possible to produce monoclonal and polyclonal antibodies and the like or to produce these human antibodies.
  • antibody production technology using phage display technology Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual Edited by Brian K.
  • these genes are incorporated into an appropriate expression vector by a conventional method (such as Molecular Cloning 2nd edit ion by J. Sambrook et al., Or CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY), and transformed into an appropriate host cell. It is possible to prepare a recombinant product of the enzyme.
  • the gene to be incorporated does not necessarily need to be a gene encoding the entire region of the protein, and may include the expression of a part of the protein as defined by the domain depending on the application.
  • polynucleotide of the present invention is introduced into host cells using known techniques of transduction, transfection, and transformation.
  • Polynucleotides can be introduced alone or with other polynucleotides.
  • Such other polynucleotides may be introduced independently, co-introduced, or introduced in conjunction with a polynucleotide of the invention.
  • a polynucleotide of the present invention can be encoded in a host cell with another polynucleotide, eg, in a mammalian cell, using standard techniques for co-transfection and selection. Transfection.
  • the polynucleotide will generally be stably integrated into the host cell genome.
  • the polynucleotide may be associated with a vector containing a selectable marker for growth in a host.
  • the vector construct is introduced into a host cell by the techniques described above.
  • a plasmid vector is introduced as a DNA precipitate, such as a calcium phosphate precipitate, or a complex with a charged lipid.
  • Elect mouth por- tion is also used to introduce a polynucleotide into a host.
  • the vector is a virus, it is packaged in vitro or introduced into a packaging cell, which introduces the packaged virus into the cell.
  • the vector is, for example, a plasmid vector, a single or double stranded phage vector, a single or double stranded RNA or a DNA viral vector.
  • Such vectors are introduced into cells as polynucleotides, preferably DNA, by techniques well known for the introduction of DNA and RNA into cells.
  • Vectors, in the case of phage and viral vectors are preferably introduced into cells as packaged or encapsulated viruses by techniques well known for infection and transduction.
  • the viral vector may be either replication competent or replication defective.
  • vectors that express the polynucleotides or polypeptides of the invention.
  • such vectors contain a cis-acting control region effective for expression in a host operably linked to the polynucleotide to be expressed.
  • Suitable trans-acting factors include the forces supplied by the host when introduced into host cells. It is either supplied by the supplementary vector or supplied by the vector itself.
  • the vector provides for specific expression.
  • specific expression may be inducible expression or only in certain types of cells, or may be inducible and cell-specific.
  • Particularly preferred among inducible vectors are vectors whose expression can be induced by environmental factors that are easy to manipulate, such as temperature and nutrient additives.
  • a variety of vectors suitable for this aspect of the invention including constructions and inducible expression vectors for use in prokaryotic and eukaryotic cells hosts, are well known and are routinely used by those skilled in the art.
  • the engineered host cells can be cultured in conventional nutrient media, which are modified to suit, inter alia, activation of the promoter overnight, selection of transformants, or gene amplification.
  • the temperature conventionally used for the host cell generally selected for expression
  • Culture conditions, such as pH, will be suitable for expressing the polypeptides of the invention, as will be apparent to those skilled in the art.
  • vectors can be used to express the polypeptides of the present invention.
  • Such vectors include those derived from chromosomes, episomes, and viruses, such as bacterial plasmids, bacteriophages, yeast episomes, yeast chromosome elements, baculovirus, simian virus 40 ("SV40").
  • SV40 simian virus 40
  • any vector suitable for the maintenance, propagation or expression of the polynucleotide can be used for expression in this regard.
  • Suitable DNA sequences are inserted into the vector by a variety of well-known conventional techniques.
  • the DNA sequence for expression is ligated to the expression vector by cleavage of the expression vector with the DNA sequence and one or more restriction endonucleases, and the restriction fragments are then combined using T4 DNA ligase.
  • T4 DNA ligase T4 DNA ligase.
  • Restrictions and ligation methods that can be used for this purpose are well known to those skilled in the art and are routine. Suitable methods for constructing expression vectors in this regard and using other techniques well known and routine to those of skill in the art are described in great detail by Sambrook et al., Supra.
  • the DNA sequence in the expression vector is operably linked to a suitable expression control sequence, including, for example, a promoter to direct mRNA transcription.
  • a promoter to direct mRNA transcription include the phage lambda PL promoter, E. coli lac, trp, trc and tac promoters, SV40 early and late promoters and retroviruses, to name just a few known promoters. Includes LTR promoter. Many promoters not described are suitable for use in this aspect of the invention, are known, and will be more readily employed as described by the discussion and examples herein.
  • the expression construct will include a transcription initiation or termination site, and The transcribed region contains a ribosome binding site for translation.
  • the coding portion of the mature transcript expressed by the construct contains the translation initiation AUG at the start and stop codons, located approximately at the ends of the polypeptide to be translated.
  • the construct contains regulatory regions that regulate and cause expression. Generally, in accordance with many commonly practiced methods, such regions will act by modulating the transcription of the reblesser-binding site and enhancers.
  • Vectors for propagation and expression include selection tools. Such markers are suitable for propagation or vectors are provided for this purpose; they contain specific markers.
  • the expression vector preferably contains one or more selectable marker genes to provide phenotypic characteristics for selection of transformed host cells. Preferred markers include dihydrofolate reductase or neomycin resistance for eukaryotic cell culture, or tetracycline or ampicillin resistance for E. coli and other bacterial cultures.
  • a vector containing a suitable DNA sequence as described herein, as well as a suitable promoter or regulatory sequence, is placed in a suitable host using a variety of well-known techniques suitable for expressing the desired polypeptide. Introduce.
  • Suitable hosts include bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces and Salmonella typhimurium cells; fungal cells such as yeast cells; insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells; CHO, COS and Bowes melanoma cells and the like, as well as adherent and planktonic animal cells and plant cells such as SP20.
  • bacterial cells such as Escherichia coli, Streptomyces and Salmonella typhimurium cells
  • fungal cells such as yeast cells
  • insect cells such as Drosophila S2 and Spodoptera Sf9 cells
  • CHO, COS and Bowes melanoma cells and the like as well as adherent and planktonic animal cells and plant cells such as SP20.
  • Hosts for the various expression constructs are well known and one of skill in the art can readily select a host for expressing a polypeptide according to this aspect of the present invention according to the present disclosure.
  • the invention also encompasses recombinant constructs, for example, expression constructs comprising one or more of the above sequences.
  • Constructs include a vector, such as a plasmid or viral vector, into which a sequence of the invention has been inserted. Insert arrays in forward or reverse order.
  • the construct further has regulatory sequences, including, for example, a promoter operably linked to the sequence.
  • a promoter operably linked to the sequence.
  • Preferred vectors for use in bacteria are pQE 70, pQE60, pQE-9 available from Qiagen; pBS vector, phage script vector, blue script vector available from Stratagene, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A Ptrc 99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 available from Pharmacia.
  • Preferred eukaryotic vectors are pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, available from Stratagene; pXTl and pSG; and ⁇ S VK3, pBPV, pMSG, pSVL available from Pliarmacia.
  • These vectors are commercially available and are merely exemplary of known vectors available to those of skill in the art for use in accordance with aspects of the present invention.
  • other plasmids or vectors suitable for introducing, maintaining, propagating or expressing a polynucleotide or polypeptide of the invention can also be used in a host in this aspect of the invention.
  • the promoter region may be a promoter region, such as a candidate promoter fragment; ie, a chlorane phenico-l-acetyltransferase (“CAT”) transcription unit downstream of the restriction site (s) for introducing the promoter-containing fragment.
  • the desired gene can be selected using a vector containing the missing reporter transcription unit.
  • introduction of a promoter-containing fragment into a vector at a restriction site upstream of the cat gene results in the production of CAT activity detectable by standard CAT assays.
  • Vectors suitable for this purpose are well known and readily available. Two such vectors are pKK232-8 and PCM7. Accordingly, the promoter for expression of the polynucleotide of the present invention includes not only a well-known and easily available promoter but also a promoter easily obtained by using the reporter gene by the above technique.
  • known bacterial promoters suitable for expressing polynucleotides and polypeptides according to the present invention include E. coli 1 ac I and 1 ac Z promoters, T3 and ⁇ 7 promoters, gpt promoter, lambda PR, PL Promoter And the trp and trc promoters.
  • known eukaryotic cell promoters suitable in this regard are the cytomegalovirus ("CMV") immediate-early promoter, the HSV thymidine kinase promoter, the early and late SV40 promoter, the retroviral LTR promoter, e.g. Includes the promoter of the Rous sarcoma virus (“RoSV”) and the promoter of the metallotionin such as the metamouth thionine-I promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • HSV thymidine kinase promoter the early and late SV40 promoter
  • retroviral LTR promoter e.
  • the present invention also relates to a host cell having the above construct.
  • the host cell can be a higher eukaryotic cell, such as a mammalian cell, or a lower eukaryotic cell, such as a yeast cell, or the host cell can be a prokaryotic cell, such as a bacterial cell.
  • Introduction of the construct into the host cell can be by calcium phosphate transfection, DAE-dextran mediated transfection, cationic lipid-mediated transfection, electoral poration, transduction, infection or other methods. Such methods are described in many standard laboratory manuals, for example, in the book by Sambrook et al.
  • the construct in the host cell can be used in a conventional manner, resulting in the gene product encoded by the recombinant sequence.
  • the partial polypeptides of the present invention can be synthesized on a conventional peptide synthesizer.
  • Mature proteins can be expressed in mammalian cells, yeast, bacteria, or other cells under the control of appropriate promoters. Such a protein can also be produced using a translation system that does not contain cells and using an RNA derived from the DNA construct of the present invention.
  • Suitable cloning and expression vectors to use for prokaryotic and eukaryotic hosts are described in Sambrook et al., Supra.
  • recombinant expression vectors include an origin of replication, a promoter from a highly expressed gene to direct transcription of downstream structural sequences, and isolation of cells containing the vector after contact with the vector. Includes selection markers to make. Among them, suitable promoters are 3-phosphodalyserate kinase (“PGK”), ⁇ -factor It can be derived from genes encoding glycolytic enzymes such as protein, acid phosphatase, and heat shock proteins. Selectable markers include the E. coli ampicillin resistance gene and the S. cerepiche trp1 gene.
  • PGK 3-phosphodalyserate kinase
  • ⁇ -factor can be derived from genes encoding glycolytic enzymes such as protein, acid phosphatase, and heat shock proteins.
  • Selectable markers include the E. coli ampicillin resistance gene and the S. cerepiche trp1 gene.
  • Enhancers are usually cis-acting elements of DNA, which act to increase the transcriptional activity of a promoter in a given host cell type. Examples of enhancers include the SV40 enhancer, the cytomegalovirus early promoter enhancer, the polio enhancer behind the origin of replication,] 8 actinenhancer and adenovirus enhancer. I do.
  • the polynucleotide of the invention encoding the heterologous structural sequence of the polypeptide of the invention is generally inserted into the vector using standard techniques so that it is operably linked to the promoter for expression. .
  • the polypeptide is positioned such that the transcription initiation site is appropriately located 5 'of the liposome binding site.
  • the ribosome binding site is 5 'to the AUG that initiates translation of the expressed polypeptide. Generally, it begins with the start codon, usually AUG, and there are no other open reading frames between the ribosome binding site and the start AUG.
  • there will be a translation stop codon at the end of the polypeptide and there will be an adenylated sydanal and a transcription termination signal appropriately located at the 3 'end of the transcribed region.
  • an appropriate secretion signal is incorporated into the expressed polypeptide.
  • the signal may be endogenous to the polypeptide or a heterologous signal.
  • prosequence following the signal sequence may be endogenous, or other heterologous ones (eg, pre / pro sequences of other meta-oral proteases) may be used.
  • Polypeptides are expressed in a modified form, such as a fusion protein, and include not only secreted sidanal but also additional heterologous functional regions. Therefore, for example If, for example, additional amino acids, particularly regions of charged amino acids, are added to the polypeptide during purification or during subsequent manipulation and storage to improve stability and storage in host cells. Also, a region may be added to the polypeptide to facilitate purification. Such regions may be removed prior to final preparation of the polypeptide. Adding a peptide moiety to a polypeptide to induce secretion or excretion, or to increase stability or to facilitate purification, is a conventional technique well known in the art.
  • Prokaryotic hosts suitable for growing, maintaining or expressing polynucleotides and polypeptides according to the present invention include E. coli, Bacillus subtilis and Salmonella typhimurium. Various Pseudomonas, Streptomyces and Staphylococcus are suitable hosts in this regard. Furthermore, a number of other hosts known to those skilled in the art in this regard may also be used.
  • expression vectors useful for bacterial applications include selectable markers and the genetic elements of the well-known cloning vector pBR322 (ATCC37017). Includes bacterial origin of replication from commercially available plasmids.
  • Such commercially available vectors include, for example, PKK2 23-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden) and GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wisconsin, USA).
  • the motor is triggered by appropriate means (eg, a temperature shift or a chemical trigger) and the cells are cultured for an additional period.
  • the cells are typically harvested by centrifugation, disrupted by physical or chemical means, and the resulting crude extract is further purified.
  • Microbial cells used for protein expression can be disrupted by any convenient method, including freeze-thaw cycles, sonication, mechanical disruption, or cell lysing agents. It is well known to traders.
  • mammalian cell culture systems can also be used for expression.
  • mammalian expression systems include the COS-6 line of monkey kidney fibroblasts described in Gluzman et al., Cell 23: 175 (1981).
  • Other cells capable of expressing the compatible vector Lines include, for example, C127, 3T3, CHO, HeLa, human kidney 293 and BHK cell lines.
  • myeloma such as SP2 / 0, which is a suspension cell line, can also be used.
  • Mammalian expression vectors contain an origin of replication, an appropriate promoter and enhancer, as well as necessary ribosome binding sites, polyadenylation sites, spliced donor and exceptor sites, transcription termination sequences, and 5 'flanking sequences required for expression. Includes transcribed sequences.
  • DNA sequences derived from the SV40 splice site and the SV40 polyadenyl site are used for these types of desired non-transformed transcriptional genetic elements.
  • a CAG-based expression vector H. Niwa et al., Gene, 108, 193-199, (1991)
  • a probe, primer or antisense is used to control gene expression by antisense DNA or RNA or by formation of a triple helix by a usual method.
  • Antisense technology is described, for example, in Okano, J., Neurochem., 56: 560 (1991); OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTI SENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, BocaRaton, FL (1988).
  • Triple helix formation is discussed, for example, in Lee et al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 21: 456 (1988); and Dervan et al., Science 251: 1360 (1991).
  • the method is based on the binding of the polynucleotide to the complementary DNA or RNA.)), which allows for genetic diagnosis or gene therapy.
  • cells from a patient are engineered ex Vivo with a polynucleotide such as DNA or RNA encoding a polypeptide, and the engineered cells are then provided to a patient to be treated with the polypeptide.
  • a polynucleotide such as DNA or RNA encoding a polypeptide
  • cells can be genetically engineered ex vivo using a retroviral plasmid vector containing RNA encoding the polypeptide of the present invention.
  • retroviral plasmid vector containing RNA encoding the polypeptide of the present invention Such methods are well known in the art, and their use in the present invention will be apparent from the description herein.
  • cells are engineered in vitro by procedures known in the art for expression of the polypeptide in vivo.
  • the poly of the present invention The nucleotides are engineered for expression in a replication defective retroviral vector as described above.
  • the retroviral expression construct is then isolated, introduced into a packaging cell, and the RN encoding the polypeptide of the present invention so that the packaging cell produces an infectious viral particle containing the control gene.
  • Transduction is carried out with a retrovirus plasmid vector containing A.
  • producer cells are administered to a patient to manipulate the cells in vitro and express the polypeptide in vivo.
  • Retroviruses derived from the aforementioned retroviral plasmid vectors include, for example, Moroni murine leukemia virus, spleen necrosis virus, Rous sarcoma virus, Habey's sarcoma virus, chicken leukemia virus, gibbon ape leukemia virus, and human immunodeficiency. Virus, myeloproliferative sarcoma virus, and breast tumor virus.
  • Such vectors contain one or more promoters for expression of the polypeptide. Suitable promoters to be used include the retrovirus LTR; the SV40 promoter; and the CMV promoter described in Miller et al., Biotecimidues 7: 980-990 (1989), or other CMV promoters.
  • Promoters e.g., cell promoters, including but not limited to histones, RNA polymerase III and / 3-actin promoters
  • eukaryotic cell promoters include but not limited to this.
  • Other viral promoters used include, but are not limited to, the adenovirus promoter, the thymidine kinase (TK) promoter, and the B19 parvovirus promoter. The selection of an appropriate promoter will be apparent to one of skill in the art from the teachings contained herein.
  • the nucleic acid sequence encoding the polypeptide of the present invention is under the control of a suitable promoter.
  • suitable promoters that can be used include adenovirus promoters such as the adenovirus major promoter; or heterologous promoters such as the CMV promoter; respiratory syncytial virus ("RSV") promoters; Induced promoters such as MMT promoter, methylthionein promoter, etc .; heat shock promoter; albumin promoter; At) o AI promoter; A human globin promoter; a viral thymidine kinase promoter, such as a simple hereditary kinase promoter; a retrovirus LTR (including the modified retrovirus LTR); a 3-actin promoter; and a human growth hormone. Promoters, but are not limited thereto.
  • the promoter may also be a native promoter that controls the gene encoding the polypeptide.
  • the retrovirus plasmid vector is used to transduce a
  • packaging cells to be transfected include PE501, PA317, Y-2, Y-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, YCRE, YCR IP, GP + E-86, GP + en vAml 2, and ILL, including but not limited to the DAN cell line described in Human Gene Therapy 1: 5-14 (1990).
  • the vector is transduced into the packaging cells by means known in the art. Such means elect Pollet over Chillon, use of ribosomes, and CaP_ ⁇ 4 including sedimentation, but is not limited thereto.
  • the retroviral plasmid vector is encapsulated in ribosomes or conjugated to lipids and administered to the host.
  • the producer cell line produces infectious retrovirus vector particles that contain the nucleic acid sequence (s) encoding the polypeptide. Eukaryotic cells are transduced either in vitro or in vivo using such retroviral vector particles.
  • the transduced eukaryotic cells will express the nucleic acid sequence encoding the polypeptide.
  • Eukaryotic cells that may be transduced include embryonic stem cells, embryonal carcinoma cells, and hematopoietic stem cells, liver cells, fibroblasts, myoblasts, keratinocytes, endothelial cells, and bronchial epithelial cells. It is not limited to.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is prepared by diluting the protease of the present invention, an antibody against the protease, an agonist, an inhibitor, an agonist, and an activity regulator of the protease with a physiological saline solution, a buffer solution, or the like.
  • the pH of the preparation is preferably weakly acidic to neutral pH close to the pH of body fluid, the lower limit is preferably 5.0 to 6.4, and the upper limit is pH 6.4 to 7.4.
  • the preparation of the present invention may contain pharmacologically acceptable additives (for example, carriers, excipients, diluents, etc.), stabilizers or pharmaceutically necessary components usually used for pharmaceuticals.
  • stabilizer include monosaccharides such as glucose, disaccharides such as saccharose and maltose, and mannii! , Sugar alcohols such as sorbitol, neutral salts such as sodium chloride, amino acids such as glycine, polyethylene glycol, polyoxyethylene-polyoxypropylene copolymer (pull nick), polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester
  • Non-ionic surfactants such as (Tween), human albumin, etc .;
  • about 10 w / V% is added.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered in an effective amount by intravenous injection, intramuscular injection, subcutaneous injection, etc., and is administered once or in divided doses.
  • the dosage varies depending on symptoms, age, weight, etc., but is preferably 0.001 mg to 100 ing per dose.
  • composition can be obtained by formulating sense DNA or antisense DNA of DNA encoding the protease of the present invention in the same manner.
  • the present invention provides a method for administering the peptide, protein, or DNA of the present invention to inhibit platelet thrombus in myocardial infarction or cerebral infarction, inhibit arteriosclerosis, prevent restenosis or re-embolization in PTCA, and prevent infarction in PTCR. Includes measures to prevent reemboli and prevent platelet thrombi caused by HUS and 0-157.
  • the present invention relates to the prevention of platelet thrombus in myocardial infarction and cerebral infarction, the suppression of arteriosclerosis, the prevention of restenosis and reembolation in PTCA, the prevention of infarction, the prevention of reembolation in PTCR, the HUS 7 also includes the use of the peptide, protein, or MA of the present invention in the manufacture of a medicament for the prevention of platelet thrombus caused by 7.
  • an amino acid using the peptide or protein of the present invention as a reed substance it is possible to prepare a molecule having altered activity of the enzyme of the present invention.
  • Angonist obtained by producing an inactivated mutant such as by substituting an amino acid residue near the active center in the meta-oral protease domain with another amino acid
  • an antagonist agonist can be produced.
  • an effective antagonist is one that binds to the polypeptide of the present invention with a small organic molecule, peptide, polypeptide or the like, thereby suppressing or eliminating the activity thereof, and includes an antibody.
  • a compound capable of cleaving vWF can be screened by using the evaluation system for vWF cleavage activity.
  • the cleavage activity of the test compound may be evaluated using the above-described evaluation system.
  • Fig. 1 is a diagram showing the multimeric structure of vWF and the cleavage points by the vWF-cleaving enzyme.
  • Fig. 2 is a photograph showing the result of multimer analysis of vWF (agarose electrophoresis).
  • FIG. 4 presents photographs showing the results of confirming vWF cleavage activity by SDS-PAGE (5% gel) under reducing conditions.
  • Figure 4 is a photograph of SDS-PAGE (5% gel) electrophoresis of a sample solubilized with Fraction 1 (F1) under non-reducing conditions.
  • Figure 5 shows the results of analysis of the vWF-cleaved enzyme fraction after passing through three gel filtration chromatographies using the F 1 paste solubilized sample as a starting material (a diagram showing a gel filtration mouth chromatographic chart, and FIG. 5A is a photograph showing SDS-PAGE under non-reducing conditions and SDS-PAGE of vWF cleavage activity under reducing conditions.
  • FIG. 5A is a chart of gel filtration chromatography
  • FIG. 5B is a fraction under non-reducing conditions.
  • FIG. 5C shows the results of SDS-PAGE of VWF cleavage activity under reducing conditions.
  • FIG. 6 shows the results of analysis of the VWF-cleaved enzyme fraction obtained by purifying the fraction collected by gel filtration chromatography using DEAE anion exchange chromatography (a diagram showing a chart of the gel filtration gel, FIG. 6A is a photograph showing SDS-PAGE under reducing conditions and SDS-PAGE of vWF cleavage activity under reducing conditions.
  • Fig. 6B shows the results of SDS-PAGE (8% gel) of the eluted fraction under non-reducing conditions
  • Fig. 6C shows the results of SDS-PAGE of vWF cleavage activity under reducing conditions. Show.
  • the three bands in FIG. 6C show intact vWF molecules (scissors), vWF-cleaved fragments, and vWF-cleaved fragments as in FIG. 5C.
  • Fig. 7 is a photograph showing the electrophoretic fraction when the vWF-cleaving enzyme fraction purified and concentrated by DEAE anion exchange chromatography was further purified by SDS-PAGE (under non-reducing) based on biophoresis. It is.
  • FIG. 8 shows the results of confirming the activity of the vWF-cleaving enzyme in the fraction obtained by further purifying the vWF-cleaving enzyme fraction by SDS-PAGE based on biophoresis, and the electrophoresis photograph of SDS-PAGE under reduction of the active fraction.
  • FIG. 8A shows the results of SDS-PAGE under non-reducing vWF cleavage enzyme activity
  • FIG. 8B shows the results of SDS-PAGE under reducing active fractions.
  • FIG. 9 is a diagram showing a primer used for amplifying a gene fragment for Northern plotting for identification of a vWF-cleaving enzyme gene.
  • FIG. 10 is a photograph showing autoradiography of a Northern plot for identification of a vWF-cleaving enzyme gene.
  • Fig. 1 OA shows the results when the gene encoding the protease was used as a probe
  • Fig. 10B shows the results when the 3 actin probe (RNA control) was used.
  • FIG. 11 is a diagram showing the position and sequence of one primer used in the RACE reaction for identification of the vWF cleavage enzyme gene.
  • FIG. 12 is a diagram showing the positions of primers designed for full-length cDNA cloning.
  • FIG. 13 is a diagram showing the procedure for constructing a vector containing full-length cDNA.
  • Fig. 14 is a photograph showing the expression in various cell lines (Western blot under anti-FLAG antibody under reducing conditions; Mock inserted the gene into the expression vector in the reverse direction)
  • each lane shows the results using the following samples.
  • Lane 1 Mock (host: 293 cells)
  • Lane 2 vWF cleaving enzyme cDNA + FLAG host: 293 cells
  • Lane 3 Mock Host: HepG2 cells
  • Lane 4 vWF cleaving enzyme cDNA + FLAG host: HepG2 cells
  • Lane 6 vWF cleavage enzyme cDNA + FLAG host: Hela cells
  • FIG. 15 is a photograph showing the measurement of the activity of the recombinant expressed enzyme (confirmation of vW cleavage by SDS-PAGE under non-reducing conditions; Mock inserted the gene into an expression vector in the reverse direction).
  • each lane shows the results using the following samples.
  • Lane 2 vWF cleaving enzyme expression supernatant (Host: HeLa cells)
  • Lane 4 vWF cleaving enzyme expression supernatant (host: HepG2 cells)
  • Lane 6 vWF-cleaving enzyme expression supernatant (host: 293 cells)
  • Lane 7 Mock (host: BHK cells)
  • Lane 8 vWF cleaving enzyme expression supernatant (host: BHK cells)
  • Lane 9 Mock (host: COS cell)
  • Lane 10 vWF cleavage enzyme expression supernatant (host: COS cells)
  • Lane 1 1 Mock (host: CH0 cells)
  • Lane 1 Supernatant expressing vWF-cleaving enzyme (host: CH0 cells)
  • Fig. 16 is a photograph showing a Western plot with an antibody established against this enzyme, and a photograph showing a Western blot with various antisera using recombinant vWF-cleaving enzyme using 293 cells as a host. .
  • each lane shows the results using the following samples.
  • Lane 1 mouse antiserum (prepared by administration of purified protein)
  • Lane 2 Egret antiserum (prepared by subcutaneously administering expression vector to Egret)
  • Lane 4 ⁇ egret antiserum (prepared by administering a partially synthesized peptide to KLH conjugation)
  • Fig. 17 is a photograph showing a Western plot using an antibody established against this enzyme.
  • Various samples derived from human plasma and recombinant expression products were obtained using the rabbit antiserum obtained by administration of full-length cDNA of vWF-cleaving enzyme. 4 is a photograph showing the detection of.
  • each lane shows the results using the following samples.
  • Lane 4 Recombinant vWF cleaving enzyme (host: 293 cells)
  • Lane 5 Recombinant vW cleavage enzyme (host: Hela cells)
  • Fig. 18 is a photograph showing a Western plot with an antibody established against this enzyme.
  • the plasma from a healthy individual and a TTP patient using a rabbit herb antiserum obtained by immunizing a partially synthesized peptide of the vWF-cleaving enzyme were used.
  • 4 is a photograph showing confirmation of vW cleavage enzyme and recombinant vWF cleavage enzyme in plasma.
  • each lane shows the results using the following samples.
  • Lane 7 Recombinant vWF cleaving enzyme (host: 293 cells)
  • Lane 8 Recombinant vWF cleaving enzyme (host: Hela cells)
  • FIG. 19 is a diagram showing an ELISA using an antibody prepared against the vWF-cleaving enzyme.
  • FIG. 20 is a photograph showing SDS-PAGE (silver staining) of affinity-purified vW cleavage enzyme fractions using an antibody under reduction.
  • each lane shows the results using the following samples.
  • FIG. 21 is a photograph showing evaluation of neutralizing activity using an antibody (SDS-PAGE of vW cleavage activity under non-reducing conditions).
  • each lane shows the results using the following samples.
  • Lane 8 vWF digestion enzyme buffer only 1: 1
  • FIG. 22 is a diagram showing the construction of an expression vector for a C-terminal domain deleted molecular species.
  • vWF was prepared by using a 2.6 ⁇ 90 cm column of Cefacryl S-500HR (Amersham Pharmacia) to transfer 2 g of the plasma cryo fraction to 20 mL of buffer (0.01% Tween-80 / 50 ni Tris-HCl ⁇ NaCl H 7.4). The solution was prepared by gel filtration. The flow rate was 2 mL / min., And fractions were collected in 6 mL steps.
  • vWF was confirmed by Western blotting using a peroxidase-labeled ⁇ heron anti-human vWF antibody (manufactured by DAK0), and the high molecular weight VWF fractions were pooled.
  • vWF monomer molecules are polymerized at the N-terminus and C-terminus as shown in Fig. 1 and have a multimeric structure, and are restricted by vWF-specific cleavage enzymes as shown in the figure. It is known to undergo decomposition.
  • the purified VWF showed a multimer pattern on agarose gel electrophoresis comparable to that in healthy human plasma (the ladder in the figure shows vWF migration with a multimer structure). In the pattern, the higher rank indicates that the polymerization is more advanced vWF).
  • vWF essentially free of vWF-degrading contaminants can be prepared, and this fraction was used as a substrate for measuring the vWF cleavage activity described below.
  • protease was activated by preincubating a sample containing barium chloride at a final concentration of 10 at 37 ° C for 5 minutes. Buffer (15-20 mL of 1.5 M Urea I 5 mM Tris-HCl pH 8.0) was placed in a 50 mL Falcon tube. Next, a membrane filter (0.025 ⁇ ffl) manufactured by Millipore was suspended, and an activated sample mixed with 50 L of a vWF substrate solution was added thereto at 100 / x L. Incubation at 37 ° C In the evening, the mixture was allowed to stand still and collected from the filter the next day. The collected sample was evaluated according to the cleavage pattern of vWF shown in the section of SDS-PAGE below.
  • SDS-5% polyacrylamide gel was self-prepared and used.
  • An electrophoresis sample was prepared by adding 2 L of SDS electrophoresis buffer (in the presence or absence of a reducing agent 2-mercaptoethanol) to 10 L of the sample described in the section of Atsushi on vWF cleavage activity and boiling for 3 minutes. After electrophoresis at 30 mA for 1 hour, the gel was stained with Gel Code Blue Stain Reagent (PI ERCE) using CBB staining. Interpretation of the presence or absence of the activity is evaluated by the appearance of cut fragments under reducing and non-reducing conditions and the presence of remaining fragments that remain unremoved, as shown in FIG. More specifically, refer to the section of “Example 3” and FIG. 3 described later.
  • the gel was immersed in a transfer buffer (0.005% SDS, 50 mM phosphate buffer, pH 7.4) for 10 minutes, and transferred to a ⁇ -nitrocellulose membrane at 4 ° C and 0.5 A using a transfer device. Transcribed. After blocking with a plotting solution (5% skim milk, PBS) for 30 minutes, a reaction was performed for 6 hours or more with a peroxidase-labeled ⁇ heron anti-human vWF antibody (manufactured by MK0) diluted 1000-fold with the plotting solution.
  • a transfer buffer 0.005% SDS, 50 mM phosphate buffer, pH 7.4
  • Plasma is subjected to ethanol fractionation of corn, and the four fractions, starting plasma, cryoprecipitate, fraction I (FI) supernatant and paste, which have high vWF cleavage activity when the protein amount is equal ( High specific activity). As shown in Fig. 3, this enzyme activity was highest in FI paste. Analysis of the N-terminal sequence of this cleaved fragment revealed that the active substance derived from the Clio and FI pastes cleaved the peptide bond of 842Tyr-843Met. Therefore, the FI paste was used as the main starting material for the refining.
  • the FI paste was divided into 12 g portions and stored frozen. Thaw out at 4 ° C the day before use The next day, 120 mL of a solubilization buffer (0.05% azide, 50 EM Tris-HCI pH 7.4, ⁇ NaCl) was added at 10 mg / mL, and the mixture was stirred at 37 ° C for 2 hours. After centrifugation at lOOOOrpm for 10 minutes, the supernatant was collected and filtered in the order of prefilter, 5. 5.filter-1 and filter to obtain a solubilized sample.
  • Figure 4 shows the SDS-PAGE of the solubilized sample.
  • solubilized F1 paste was applied to a 5 ⁇ 90 cm column of Sephacryl S-300HR (Amersham Pharmacia), and the first gel filtration was performed. Same as solubilization buffer 0.05% Az aid, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 100 mM NaCl (hereinafter elution buffer), flow rate 5 mL / min. , Fractions were collected in 10 mL portions. After the vWF cleavage reaction, the activity of the fraction was confirmed by SDS-PAGE. The fractions having the enzymatic activity were pooled, and a small amount of saturated ammonium sulfate was added dropwise thereto to a final concentration of 33%. This was left still at 4 ° C overnight.
  • the elution position was determined from the elution experiment for a high molecular weight gel filtration marker (Amersham Pharmacia), which was performed separately. It was suggested that this corresponds to an estimated 150 kDa to 300 M) a. At this stage, it was clear that considerable contaminants were still present in large quantities.
  • the pool fraction obtained by performing the gel filtration three times was dialyzed overnight against 50 mM Tris-HCl, 50 mM NaC1 pH 7.1 buffer. After dialysis, anion-exchange chromatography was performed using 5 mL of High Trap DEAE Fast Flow Sepharose column (Pharmacia) to further purify and concentrate. Equilibration and washing buffer was performed with 50 inM Tris-HCl H7.1, and elution was performed with 0.25 M NaCl. The flow rate was 5 mL / mm, and five fractions were collected in 5 mL portions and pooled.
  • Figure 6 shows the SDS-PAGE of the eluted fraction and the SDS-PAGE of the VWF cleavage activity. From the SDS-PAGE of the activity measurement, it was revealed that the present enzyme having the activity of cleaving vWF was concentrated in the eluted fractions with high efficiency.
  • the step of the present invention is a separation method having a high resolution.
  • Figure 8 shows the confirmation of the activity of the fraction further purified by electrophoresis and SDS-PAGE of the active fraction. This enzyme can be recovered as an active molecule even after SDS-PAGE. At this stage, if the activity of this enzyme in plasma is defined as 1 as the specific activity, the average protein content of plasma ( (60 mg / ml), it was estimated that the purification degree reached 30,000 to 100,000 times.
  • vWF-cleaving enzyme of the present invention isolated under the above conditions comprises a polypeptide chain having a molecular weight in the range of 105 to 160 kDa under reduction in SDS-PAGE.
  • a partial sequence of Leu-Leu-Val-Ala_Val preferably Ala-Ala-Gly-Gly-lie-Leu-His-
  • a genomic database search identified a chromosomal clone (AL158826) presumed to encode this enzyme, and as an EST (Expressed Sequence Tag), a part of the target enzyme and the above-mentioned genome.
  • Clones (AI 346761 and AJ011374) presumed to be part of the encoded polypeptide were identified. Based on this, the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 or 7 was estimated as an active site as a vWF cleavage enzyme.
  • a sense primer (SEQ ID NO: 9) and an antisense primer (SEQ ID NO: 10) were prepared, and Universal QUICK-Clone TM cDNA (a mixture of normal human tissue-derived cDNA) (CLONTECH) was rusted.
  • Universal QUICK-Clone TM cDNA a mixture of normal human tissue-derived cDNA
  • CLONTECH Universal QUICK-Clone TM cDNA
  • As a template perform a PCR reaction with TAKAM LA Tag with GC rich buffer, amplify the gene between the primers, and fragment the fragment from Invitrogen T Cloning was performed with the 0P0 TA cloning TM kit.
  • a clone having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 6 was isolated from several clones.
  • a portion of the vector was removed from the cloned DNA by EcoRI digestion, separated and purified by agarose gel electrophoresis, and used as a type II for Northern blot probe preparation.
  • the gene was prepared by a conventional method from emerged colonies (Molecular Cloning 2 nd edition p 1.25-1.28 ), an automatic DNA Shikuensa one was decryption of nucleic acid sequences.
  • the primer used for sequencing was the same as the primer used for PCR or a primer internal thereto. Furthermore, it was set based on the sequence after sequential decoding.
  • 3 'RACE was prepared from 3'-Full RACE Core Set (TA After performing a reverse transcription reaction with the attached oligo dT primer based on the attached manual using KARA Corporation), the sense primer (SEQ ID NO: 14) at the position of primer 2 in Fig. 11 and the attached
  • the band amplified by PCR with the oligo dT primer was separated by agarose gel electrophoresis, and TA cloning was performed after extraction. Genes were prepared from the colonies that appeared, and the nucleic acid sequence was decoded using an automatic DNA sequencer. Primers used for sequencing were set based on the sequence after sequential decoding.
  • a cDNA encoding the protein is added with Xhol as a restriction enzyme site, and a sense primer 1 (SEQ ID NO: 22) containing an initiation codon and an antisense primer 2 containing a termination codon added with a Sail site (SEQ ID NO: 2) 3) (see Figure 12), using the above-mentioned normal human liver-derived Marathon-Ready ni cDNA as type II, one-step PCR with TAKARA LA Ta with GC rich buffer, and then TA cloning as described above. And the total length was automatically determined.]) Confirmed at M Sequencer.
  • the DNA obtained in Example 6 or 7 was digested with ⁇ / Sal I by restriction enzyme.
  • the Sail site in pCAG vector Niwa, ⁇ ⁇ , et al. Gene vol. 108, 193-199 Ligation was performed, and the orientation and full-length sequence were confirmed using an automatic DNA sequencer.
  • the expression vector for animal cells prepared in Example 8 was transfected using 293 cells (human embryonic kidney cell line), HeLa cells and HepG2 cells according to the following procedure. First, 24 to 4 hours before transfection, the cells are wound with 1 to 3 x 10 5 Z35 yeast dishes, and the next day, the above expression vector is transfected with 21 polyamine transfection reagents, TransIT ( TAKARA Co., Ltd.), add it to serum-free medium 100 such as Opti_MEM, and prepare a complex with DNA according to the instructions attached to the reagent. After incubation for an hour, the medium was changed, and three days later, the medium was changed to a G418-added selective medium. From now on, the medium was changed every three days to produce a stable expression strain.
  • 21 polyamine transfection reagents TAKARA Co., Ltd.
  • serum-free medium 100 such as Opti_MEM
  • FIG. 14 shows the transient expression of a fragment containing a FLAG epitope tag at the C-terminus. Detection was performed by Western blotting using an anti-FLAG-M2 antibody (manufactured by Kodak) by staining with an anti-mouse Ig-alkaline phosphatase enzyme-labeled antibody system.
  • the recombinant expression product using the cDNA shown in this example had a molecular size of about 250 kDa under reduction. This molecular size was also found to be present in the plasma of healthy human subjects (FIG. 18 in Example 14, which will be described later).
  • Example 2 the WF cleavage activity of the recombinant was confirmed by the method described in Example 2 (FIG. 15). As a result, it was confirmed that the human plasma-derived enzyme and the recombinant product of the present invention show the same vWF cleavage activity.
  • a cDNA encoding the meta-oral protease domain region of the protein is terminated, for example, by adding Ncol as a restriction enzyme site, adding a sense primer (SEQ ID NO: 30) containing an initiation codon and a Hindlll site.
  • a codon-containing antisense primer SEQ ID NO: 31
  • TAKAR A LA Ta with GC rich buffer digestion with Ncol / Hindlll, E. coli expression vector such as UTl (Soejima et al., J. Biochem.
  • the host Escherichia coli transfected with the expression vector constructed in Example 10 was pre-cultured in 200 ffll of LB medium containing 50 g / ml of ampicillin at 30 ° C- ⁇ , and it was fermented in 8 liters of LB medium containing LB medium. And cultured at 30 ° C. until the turbidity at 600 nm became 0.2 to 0.5. Thereafter, isopropyl-1-thio-jS-D-galactopyranoside was added to a final concentration of lmM, and the mixture was further cultured overnight to induce the expression of the meta-oral protease domain region of the protein. Then, the cultured E. coli was collected by a centrifuge (30 minutes, 4 ° C).
  • the harvested E. coli pellet was resuspended in distilled water to give a final concentration of 0.6 nig / inl lysate.
  • the team was added, the mixture was stirred at room temperature for 30 minutes, and left still at 4 ° C overnight to disrupt the cells. Then, after further sonication, the mixture was centrifuged with a centrifuge (20 minutes, 4 ° C), and the pellet was recovered. This was resuspended in 50 DIM Tris lOfflM EDTA 1 Triton X-100 pH 8.0.
  • the pellet After repeating the centrifugation, sonication, and resuspension operations several times, the pellet is resuspended in distilled water, and the centrifugation, sonication, and resuspension operations are repeated several times in the same manner. Was recovered. This inclusion body was used as an antigen in producing antibodies.
  • RNA and Marathoii-Ready TM cDNA manufactured by CL0NTECH
  • the gene of this enzyme was isolated and identified by the RACE method as in humans.
  • the gene sequence of the mouse homologue of this enzyme shown in SEQ ID NOs: 35 and 36 was determined.
  • the Exon / Int nm structure of the 5 'side of mouse chromosome 10 was determined, and based on this, a conventional method (Gene Targeting: A Practial A pproac According to Fis t E d ion ion Edited by A ⁇ Joyner, Teratocarcinoma and embryonic stem cell cel la practical approach, etc., it becomes possible to create a evening-targeting vector for knockout (knock-in) mouse production. Work is now possible. Further, the present protein can be expressed recombinantly by a conventional method.
  • an antigen protein partially purified from human plasma or a synthetic peptide having a partial amino acid sequence (for example, a peptide sequence of one C-terminal region of the isoform of the enzyme (SEQ ID NO: 37) )
  • P e-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser) Therefore, those that are bound to an optimal carrier substance (such as KLH) (Cys is added to the N-terminus or C-terminus to facilitate the addition of KLH), the above-mentioned recombinant protein, or Injection of the expression vector into which the gene encoding The generation of antibody expression High Priestess dormer establishment and polyclonal antibodies (antisera) was performed.
  • a peptide sequence of one C-terminal region of the isoform of this enzyme (SEQ ID NO: 37) Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro -Gln-Glu-Asn-Ser-Vat Gin-Ser-SeR bound to KLH, using a peptide antibody obtained as an immunogen.
  • this enzyme was detected from recombinant culture supernatant, it was not clear in some TTP patient plasmas, but was approximately 250 M) A band that was assumed to be a signal derived from the enzyme of about a was confirmed (Fig. 18).
  • an enzyme-linked immunosorbent assay constructed by combining the obtained antibodies produced a concentration-dependent calibration curve at the level of the culture supernatant of recombinant protein (Fig. 19). ).
  • ELISA can be exemplified by the following description.
  • the obtained mouse anti-vWF-cleaving enzyme antibody was immobilized on a Maxisorp plate manufactured by Nunc, and the culture supernatant of 293 cells, which temporarily expressed the vWF-cleaving enzyme, was diluted 1/1, 1/2, and 1/4 (referred to as 0). Mock supernatant) and react with 100 ⁇ 1 Noel. For example, after 1 hour at 37 ° C, wash the plate with 0.05% Tween20 / TBS.
  • the resulting antibody was bound to an appropriate immobilization carrier to prepare an affinity ram, which was used for purification of the enzyme.
  • the antibody was immobilized using NHS-activated cell mouth fine manufactured by Chisso Corporation according to the package insert. Using about 1 ml of the swelling carrier prepared in this way, the expression culture supernatant of the recombinant obtained using the 293 cells of the enzyme shown in Example 9 as a host was applied, and then 50 mM Tris-HCl 0. After washing the column with 1M NaCI pH7.5 (TBS), the column was eluted with 0.1M glycine PH3 buffer containing urea.
  • the eluted fraction was neutralized with 1 M Tris-HCl pH 8.5 and dialyzed against TBS.
  • the SDS-PAGE of the purified enzyme obtained is shown in FIG. It was also confirmed that the purified fraction obtained had the activity of cleaving vWF. Then, the cleavage point of vWF fragmented by this recombinase was confirmed to be the position of 842Tyr-843Met by N-terminal amino acid sequence analysis of the fragment.
  • a clone (Clone No. C) which can be similarly used for purification using a monoclonal antibody prepared by the method described in Example 13 is also used. PHSWH-7.2 and 10) have been established.
  • the partial amino acid sequence of the purified enzyme was determined. After SDS-PAGE, transfer to PVDF membrane and air-drying were performed by a conventional method. After that, analysis was performed using an auto-protein sequencer-492 of PE Applied Biosystems. As a result, it was clarified that the partial N-terminal sequence had Al a-Ala-Gly-Gly_Ile-. This sequence corresponded to the N-terminal sequence of the mature form of the enzyme deduced from the gene structure.
  • Amino acid sequence Asp Tyr Lys Asp Asp Shows the site to which Asp Lys (SEQ ID NO: 48)) was added.
  • the primers used at this time are as follows, S indicates a sense primer, and AS indicates an antisense primer.
  • the findings provided by the present invention open up the possibility of replacement therapy for patients suffering from deficiency of the enzyme such as thrombotic thrombocytopenic purpura. This enables the cloning of genes and the establishment of an efficient purification method from serum and plasma. In particular, this information makes it possible to perform genetic recombination on the basis of the obtained nucleotide sequence, and to stably produce and supply the enzyme of the present invention, which was difficult in the past, and to provide TTP to patients with TTP.
  • Enzyme replacement therapy or a novel antiplatelet drug: Myocardial infarction, suppression of thrombotic thrombosis in cerebral infarction, suppression of arteriosclerosis, prevention of restenosis, reembolation, infarction in PTCA, prevention of reemboli in PTCR, HUS Thrombosis caused by or O—15 7 Can be applied to prevention.
  • diagnosis and treatment using a gene encoding the enzyme or an antibody against the enzyme can be performed.

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Description

フォンビルブラント因子（ V WF )切断酵素 技術分野
本願発明は、 医療用医薬品の分野に係る血漿蛋白質に関する。 詳細には、 血液凝 固に関与するフォンビルブラント因子 (von Willebrand Factor：以下、 vWFと称 することがある）の特異的切断酵素に関する。 本願発明で提供される vWF切断酵素 により血检性血小板減少性紫斑病（thrombotic thrombocytopenic purpura ： 以下、 TTPと称することがある）等の当該酵素の欠損または低下に起因する疾病患者への 補充療法の可能性が拓かれる。 加えて、 新規な抗血小板血栓薬としての利用も見込 まれる。 背景技術
vWFは、 血管内皮細胞や骨髄巨核球で産生され、 2050ァミノ酸残基（モノマー 約 250 kD a )からなる単一サブュニットが S— S結合にて結ばれたマルチマー構 造 (分子量 500〜 20，000 kD a)を持って存在している止血因子である。 血中 濃度は約 10 μ g/m 1で、 一般に高分子量のものほど比活性が高い。
vWFには 2つの大きな止血因子としての機能があり、 1つは血液凝固第 VIII因 子と結合し、 これを安定ィヒさせるキャリアー蛋白質としての働き、 もう 1つは傷害 血管壁の血管内皮細胞下組織に血小板を粘着 ·凝集させ、 血小板血栓を形成する機 能である。
血栓性血小板減少性紫斑病は、 全身の体組織細動脈と毛細血管に血小板血栓を生 じる疾患であり、 今日の医療技術の進歩にもかかわらず、 当該疾患での関連死亡率 は 1971〜 1991年にかけて約 3倍に増加している。 病理学的に、 TTPは血 管内皮細胞障害や血管内血小板凝集によって惹き起こされると考えられており、 免 疫組織学的には生じた血小板血栓中に多量の vWFの存在が認められ、 V WFがこ の成因に大きな役割を果たしていると考えられている。 TT P患者の V WFのマル チマ一構造は正常もしくは高分子量が優位となっており、 特に通常では見られない 超高分子量の vWF (unusually large vWF mul timer： UL vWFM)や高分子量 v WF重合体 （large vW multimer : L vWFM)が、 高ずり応力下での血小板凝集の 促進と微小血栓形成に大きな役割を果たしていることが推察される。 一方で、 vW Fは健常人の循環血液中で高ずり応力下、 vWF切断酵素（vWF- cleaving protea se)の作用により 842Tyr_843Me tの位置で分解を受けることが知られて いた。 したがって、 TTPは血漿中の当該酵素活性が何らかの原因で低下して、 U L vWFM〜L vWFMが増加して血小板凝集が亢進し、 血管内に血小板血栓が形 成されるためというシナリオが描かれている。
最近、 Fur l anら（B l ood, vo l. 87, 4223-4234 : 199 6、 特表 2000— 508,918)、 Ts a iら（B 1 o o d, vo l. 87, 42 35-4244： 1996)により vWF特異的切断酵素の測定法が考案され、 TT Pでは、 事実この酵素活性が低下していることが報告された。 そして前記報告の著 者等は当該酵素が血漿中のメタ口プロテア一ゼであることを示し、 部分精製したこ とを報告したが、 当該酵素を特定化するようなアミノ酸配列の決定等には至らずそ れ以来進展がない。 発明の開示
vWF特異的切断酵素の先天的欠損患者および後天性の当該酵素に対する抗体陽 性患者の治療法として、 現在まで血漿交換療法が施されており、 当該酵素の精製品 または遺伝子組換え体等純品による補充療法の確立が望まれる。 家族性 TT P患者 は、 先天的に vWF特異的切断酵素が欠損しており、 非家族性では後天的に当該酵 素に対する自己抗体の産生が原因と報告されている。 したがって、 家族性 TTP患 者には、 本酵素の補充療法が望ましく（現実には血漿投与が行われている）、 非家族 性では、 血漿交換による自己抗体の除去と本酵素の補充が必要である。 さらに、 本 酵素の利用は新規な抗血小板血栓薬としての応用も見込まれる。
しかし、 vWF切断酵素は、 前述のごとく Fu r l anら（B l ood, vo l. 87, 4223— 4234 : 1996、 特表 2000— 508918)、 Ts a iら (B l ood, vo l. 87, 4235— 4244 : 1996 )により、 血漿中のメ 夕口プロテアーゼであることが示唆され、 部分精製したこと、 そしてその比活性に おいて血漿から 1, 000〜10, 000倍濃縮されたと報告されているが、 この条 件下でもなお、 これ以来現在までおよそ 5年間に渡って、 その蛋白質のアミノ酸配 列など本酵素本体の性状解析には進展が無く、 未だ本酵素に関しての具体的、 生化 学的情報は一切得られていない。 これは、 Fu r 1 anらの報告にもあるように、 目的蛋白質が巨大であることが示唆されており、 これに伴う、 様々な問題点が考え られる。 例えば、 様々な相互作用分子ゃコファクターの存在など、 本酵素の存在様 式の多様性が想定され、 精製法の複雑化、 さらには、 精製ステップでの非特異的な 相互作用による分離能の低下などから、 Fur l anらの血漿画分からの精製法で は本酵素の単離同定に至るには大きな困難性が立ちふさがつていたことが推察され た。
上述の状況の下、 本願発明者等は vWF切断酵素の単離同定を達成するべく、 鋭 意研究を重ねた結果、 従来報告のなかった所望の vWF切断酵素の精製単離に成功 し、 その成熟型蛋白質のアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードする遺伝子を 同定するに至った。
本願発明の vWF切断酵素は、 vWFの 842Ty r- 843Me tの結合を切断し 得る性状を有し、 一態様として還元あるいは非還元条件下の SDS— PAGEにお いて 105〜160kDaまたは 160〜250kDaの分子量を有することが例 示され、 部分配列として Leu-Leu - Val-Ala-Valを含有するポリぺプチド鎖よりなり、 より好適には Ala- Ala- Gly- Gly- lie- Leu- His- Leu-Glu- Leu- Leu- Val- Ala- Valの成熟型 蛋白質の N末端側アミノ酸部分配列を含有するポリぺプチド鎖よりなる。 そして、 下記の性状によって特徴付けられる新規な物質である。
1) vWF切断活性
本願発明酵素は、 切断断片の N末端配列解析の結果、 842Tyr— 843Me tのペプチド結合を切断する。
2)ゲル濾過による分画 '
F Iペーストを出発材料とした場合、 ゲル濾過クロマトグラフィーを用いて分画 を行なうと、 分子量が 1 5 0 kDa〜 3 0 0 kDaのサイズにほとんどの活性が回収され るが、 実際に得られる本発明中の活性物質の一例では電気泳動で 1 0 5〜1 6 O kDa 程度の分子量を示すことから、 二量体等の形成あるいは他の分子と結合しやすい可 能性のある物質、 または易分解性、 あるいは糖鎖付加の不均一性を有しうる物質で める。
3)硫安沈澱
例えば、 F Iペーストを出発原料とした場合、 粗精製画分中で 3 3 %飽和硫安で 本酵素の大部分は沈殿画分として回収される。
4) S D S - P A G E
例えば、 ヒ卜プール血漿を原料とした F Iペーストあるいはクリオプレシピテー 卜由来の本酵素は、 SDS-MGEにおいて、 主に、 分子量マーカーの 1 0 5 kDa〜l 6 0 kDa程度の分子サイズを示す。 そして、 配列番号 1 5の核酸配列を基に、 4 4 5番目 以降 atgの開始コドンから 4 7 2 6番目以下の tgaまでの終結コドンを含んだフレー ムで表されるアミノ酸配列を遺伝子組換え技術を用いて発現させた場合、 宿主によ り多少の分子サイズは異なるものの、 概ね、 分子量マーカ一の 1 6 0 kDa〜2 5 O kD a程度の分子サイズを示す。 そして、 このサイズのものは、 ヒト健常者及び一部の T T P患者の血漿中にも認められる。 また、 この酵素は、 遺伝子のクローニングの際 に認められた al ternat ive spl icing産物 （配列番号 16〜21) などの存在、 糖鎖付加 などの翻訳後修飾の違い、 あるいは精製工程中での分解に起因すると思われる複数 の分子種がヒト血漿中では存在する。 さらに、 本酵素は、 非還元下の SDS-PAGE後、 活性を有する状態で回収可能である。
5)アミノ酸配列分析
単離されたポリぺプチド断片のアミノ酸配列の解析の結果、 部分ァミノ酸配列と して Leu_Leu_Va卜 Ala- Valの配列を有し、 成熟型蛋白質の N末端側アミノ酸配列とし て、 Ala- Ala- Gly- Gly- I le_Leu- His- Leu- Glu_Leu- Leu- Va卜 Ala- Valの配列を有するポ リペプチド鎖より例示されることが明らかとなった。 そしてさらには、 現在のバイ ォインフォ一マテイクスの方法 （BIOINFOMATICS : A Pract ical Guide to the Anal ys is of Genes and Proteins edi ted by Andreas D. Baxevanis and B. F. Francis Oue l let te) により、 前記部分配列を基に、 データベースサーチにより、 信頼性高 く、 本アミノ酸配列をコードする核酸配列の同定を行うに至った。 具体的には、 プ ログラム tblas tnによりゲノムでのデータベースサーチを行った結果、 本願発明の酵 素をコードしていると推察される染色体クローン （AL158826) が同定され、 さらに 、 E S T (Expressed Se uence Tag) デ一夕ベースとの照合により、 目的酵素の一 部分及び上記ゲノムによりコードされるポリペプチドの一部と推察されるクローン
(AI346761及び AJ011374) を同定した。 これを基に vWF切断酵素としての活性部 位として配列番号 3または 7に示すアミノ酸配列を同定した。
配列としてゲノムから想定される GCT GCA GGC GGC ATC CTA CAC CTG GAG
CTG CTG GTG GCC GTG、 より好適には E S Tによりそのトランスクリプトーム が確認されている部分としての CTG CTG GTG GCC GTGが得られた。 そして、 得ら れた塩基の配列解析、 アミノ酸への推定からモチーフ解析を行い、 本願発明の酵素 の一つの候補として、 メタ口プロテアーゼドメインを有していることが推察できた 。 上記知見により、 さらにより具体的な当該酵素の一つとしてのポリペプチド鎖の 配列を開示できるに至った。 また、 酵素は一般的にそのアミノ酸配列の一部の置換 あるい欠失、 挿入、 点変異の導入等でその活性が変化することが知られている（血夜 凝固第 VI I因子の改変体；副島ら特開 2 0 0 1— 6 1 4 7 9 )。 それで、 本願発明の 酵素においてもこれらと同様に 1または数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加さ れるなどの改変操作で、 より最適化された酵素の作製が可能である。
さらなる本酵素蛋白質の大量調製を行い、 Ν末端から 2 9個のアミノ酸配列を決 定した。 そのアミノ酸配列を配列番号 8に示す。 この結果は、 バイオインフォ一マ テイクスを用いて推定された配列番号 3または 7記載の配列とほぼ一致しており、 唯一異なったのは 2 7位のアミノ酸が、 配列番号 3または 7記載のものが G 1 uで あるのに対して、 今回の Ν末端配列解析では A r gであった点であるが、 これは遺 伝子多型 （ポリモルフィズム） と考えられた。 これにより、 本酵素はその成熟体と して N末端に配列番号 3または 7記載のアミノ酸配列を有するポリぺプチド鎖から なることが確認された。 そこで、 本酵素をコードする遺伝子断片を以下の手順でク ローニングした。 配列番号 7中の核酸配列に依拠し、 図 9中の下線部位で示される核酸配列を基に 、 センスプライマ一 （配列番号 9) 及びアンチセンスプライマー （配列番号 10) を作製し、 プライマーで挟まれた部分の遺伝子を増幅した。 その断片をクロ一ニン グ後、 塩基配列を確認した。 当該断片をプローブとし、 ノーザンプロット解析によ り、 本酵素遺伝子の発現部位を確認した。 その結果、 本酵素遺伝子は肝臓で特徴的 に発現していることが確認された。 これにより、 ヒト肝臓 cDNAライブラリ一を 購入し、 RACE法 （Rapid Amplification of cDNA Ends) を用いて、 本酵素をコ ードする遺伝子を同定した。 これらの結果、 配列番号 15に示されるポリ A付加サ イトまでのおよそ 5キロべ一スの mRNA (cDNA) の配列を同定した。
この遺伝子配列から推定されたアミノ酸配列により、 本酵素はプレブ口配列を有 し、 ディスインテグリンドメイン、 メタ口プロテアーゼドメイン等を有する ADA M (A Disintegrin And Metalloprotease) ファミリ一、 特に TSP- 1 (トロンポ スポンジン Type-1) ドメインを有する ADAM- TSファミリ一に属するものであ ると推察された。 最終的に、 一部の核酸配列に挿入，欠失を生じたものを含めて、 成熟体であるプレブ口配列が切断された以降の N末端にそれぞれ配列番号 3および 7に示される配列を有する配列番号 16から 21に示されるァイソフォームが同定 された。 したがって、 本願発明の酵素の要件としては、 vWFを 842Tyr- 843Met で切断し、 かつアミノ酸の部分配列として Leu- Leu- Va卜 Ala_Valの配列を有するもの として表されるものである。
本願発明の vWF切断酵素は大略以下の方法によって調製され得る。
本願発明における当該酵素の活性測定法の特徴は、 短時間に活性の有無の評価が 可能な点にある。 Fur l anら （Blood, vol. 87, 4223-4234： 1996 特表 20 00-508918) の報告では、 抗 vWF抗体を用いたウエスタンブロット法に よる vWF切断パターンの解析で行われるため、 フィルターへのトランスファーな ど時間を要する。 より具体的には、 基質である vWFとの酵素反応に 24時間、 さ らにその電気泳動に 17時間、 フィルタ一へのトランスファーに 3時間その後の抗 vWF抗体を用いた検出反応が続くもので少なくとも計 45時間程度を要する。 こ れに比し、 本願発明者等の行った活性測定は、 基質である vWFとの酵素反応に 1 6時間、 さらにその電気泳動および検出に 2時間の計 1 8時間で完了し、 3分の 1 弱の時間短縮が可能である。 これに伴い、 精製工程の時間短縮が可能となり、 本酵 素の活性失活を低減できる。 したがって、 精製効率が F u r 1 a nらの方法より向 上しており、 その結果、 精製度の向上につながつている。
さらに、 上述のアツセィ系を用いて、 出発材料の検討を行って、 従来 F u r 1 a nらが報告したクリオプレシピテートよりも F Iペースト中に本酵素活性が濃縮さ れていることを見出した。 これを出発材料とし、 前述の迅速な活性測定系を組み合 わせることにより、 本酵素の単離同定が可能となった。 具体的な態様として、 ゲル 濾過クロマトグラフィ一およびイオン交換クロマトグラフィーを組み合わせる精製 法を適用し前記活性測定系を組み合わせる。
より具体的には、 F Iペーストをバッファ一にて可溶化し、 これをゲル濾過クロ マトグラフィ一を用いて分画する。 本酵素活性はゲル濾過のサイズマーカーから推 定して分子量 1 5 0 kDa〜3 0 0 kDaの溶出位置に分画され、 この後、 3 3 %飽和硫 安にて沈殿濃縮せしめる。 この行程を計 3回行い、 3回目のゲル濾過の活性画分を プールしたものを 50mMTris- HC1 pH7. 1に NaCl 50mM添加したバッファーで 4°Cー晚透 析した後、 陰イオン交換クロマトグラフィー （DEAE) にかけ、 0. 25Mの NaClにてス テツプワイズに溶出する。 本願発明の酵素を単離同定するための方法として、 鋭意 研究した結果、 驚くべきことに、 非還元下の SDS- PAGE後、 活性を有するバンドとし て回収可能であることを見いだした。 これをもとにさらに大量調製するために、 精 製 ·濃縮された画分を SDS-PAGEの原理を利用したバイオフォレーシスに供した。 こ れにより、 泳動分離された画分で vWF切断活性を有する画分を分取した。 この段 階までの比活性を概算するとおよそ 3 0， 0 0 0〜1 0 0 , 0 0 0倍近い精製度を達 成したことになる。 さらに、 これを効率よく複数回に渡り迅速に行うことにより、 現在のアミノ酸配列分析の限界である 0. 5ピコモル程度のサンプルが取得できた。 これにより、 アミノ酸配列分析が可能になった。 つまりは、 最終工程として SDS - PAG Eの原理に基づいた分離精製 （バイオフォレーシス） が重要なステップであり、 それ は本願発明に至るまでの鋭意研究の結果得られた知見に基づくものである。
F u r 1 a nらの報告では、 1 0 , 0 0 0倍近い比活性の向上を達成したにも拘わ らず、 本酵素の本質的な単離同定に至らなかったのは、 精製中の失活等あるいは、 各種液体クロマトグラフィーに属する分離方法では、 本酵素のように巨大蛋白質で 様々な他の蛋白質との相互作用が可能と考えられる分子では、 単離同定まで達する のが困難であったためであろうと考えられる。 さらに、 本酵素の血漿中での含量が 微量であることが想定され、 本願発明の手法が確立されるのを待たねばならなかつ たのである。 さらに、 この方法を用いることにより、 遺伝子組み換え体も精製可能 である。
本願発明により得られた知見に基づき、 得られた配列を基に調製されるペプチド もしくは蛋白質を抗原に、 通常の免疫方法 （Current Protocols in Molecular Biol ogy、 Ant ibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edited by J. McCAFFERTY et a 1.あるいは ANTIBODY ENGINEERING second edi t ion Edi ted by Carl A. K. BOR EBAE CK ) によってモノクローナルおよびポリクローナル抗体等の作製あるいはこれらの ヒト型抗体の作製が可能となる。 あるいは、 ファージディスプレイ技術を利用した 抗体作製技術 (Phage Display of Pept ides and Proteins : A Laboratory Manual E dited by Brian K. Kay et al.、 Antibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Ed ited by J. McCAFFERTY et al.あるいは ANTIBODY ENGINEERING second edi t ion edi t ed by Carl A. K. BOR EBAECK) により当該蛋白質と結合する抗体の作出が可能であ る。 あるいは、 これらの技術に基づき、 本酵素に対する自己抗体陽性である T T P 患者検体からの本酵素活性の中和抗体もしくは単なる結合抗体の単離も可能である 。 そして、 これらの抗体を用いることで、 例えば T T Pなどの疾患の診断及び治療 への応用が可能となる。
さらには、 得られたゲノムあるいは E S Tの配列を基に通常の方法 （Molecular C loning 2nd edition) により、 本願発明の酵素をコードする c DNAやゲノム遺伝 子をクローニングすることが可能である。 さらに、 バイオインフォ一マティックな 解析 (BIOINFORMATICS: A Pract ical Guide to the Analys is of Genes and Protei ns edited by Andreas D. B axe van is and B. F. Francis Ouellette) により、 これ と相同な他動物種の当該蛋白質のクローニングも可能となり、 その遺伝子を通常の 方法 (Gene Target ing: A Practial Approach First Edit ion Edited by A. L. Joyn er、 Teratocarcinomas and embryonic stem cel l a pract ical approachなど) に よって遺伝子破壊することにより、 T T P様モデル動物の作出が可能となる。 とり わけマウス由来の本蛋白質をコードする遺伝子配列を同定することにより、 この遺 伝子のノックアウトマウスの作出が可能となる。 これにより、 先天的 T T Pなどの 疾患モデルマゥスが作製できる。
さらには、 通常の方法 （J. Sambrook et al.著 Molecular Cloning 2nd edit ion 、 または CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGYなど） により、 これらの遺伝子 を適当な発現ベクターに組み込み、 適当な宿主細胞に形質転換し、 当該酵素の遺伝 子組み換え産物を調製することが可能である。 この時、 組み込む遺伝子は、 必ずし も当該蛋白質の全域をコードした遺伝子である必要はなく、 用途に応じてドメイン で定義されるような当該蛋白質の一部分の発現も含まれる。
例えば、 本願発明のポリヌクレオチドを形質導入、 トランスフエクシヨン、 およ びトランスフォーメ一ションの公知の技術を用いて宿主細胞中に導入する。 ポリヌ クレオチドは単独または他のポリヌクレオチドと共に導入される。 このような他の ポリヌクレオチドは、 独立して導入されるか、 同時導入されるか、 または本発明の ポリヌクレオチドと合わせて導入される。
このように、 例えば本発明のポリヌクレオチドを宿主細胞中に選択マーカーをコ ードする他の別のポリヌクレオチドで、 例えば哺乳動物細胞中、 同時トランスフエ クションおよび選択についての標準的技術を用いてトランスフエクシヨンする。 こ' の場合、 ポリヌクレオチドは一般的に宿主細胞ゲノム中に安定に組み込まれるであ ろう。
別法として、 ポリヌクレオチドを宿主中の増殖用選択マーカーを含有するべクタ 一と結合させてもよい。 ベクター構築物は前記技術により宿主細胞中に導入される 。 一般に、 プラスミドベクターは、 沈殿物、 例えばリン酸カルシウム沈殿物、 また は荷電脂質との複合体などの D NAとして導入される。 エレクト口ポレーシヨンも ポリヌクレオチドを宿主中に導入するために用いられる。 ベクターがウィルスの場 合、 これは in vitroでパッケージされるか、 またはパッケージング細胞中に導入さ れ、 パッケージされたウィルスを細胞中に導入する。 本発明のこの態様にしたがって、 ポリヌクレオチドを産生し、 ポリヌクレオチド を細胞中に導入するのに適した広範囲に及ぶ技術は当業界で周知であり慣例的であ る。 このような技術は、 S ambrookら （前掲） に記載され、 これはこれらの技術を詳 述した多くの標準的実験マニュアルを説明するものである。 本発明のこの態様に関 して、 ベクタ一は、 例えばプラスミドベクター、 一本または二本鎖ファ一ジベクタ ―、 一本または二本鎖 RNAまたは D NAウィルスベクターである。 このようなべ クタ一は、 ポリヌクレオチド、 好ましくは D NAとして、 DNAおよび R NAの細 胞中への導入について周知の技術により細胞中に導入される。 ベクターは、 ファー ジおよびウィルスベクターの場合、 好ましくは、 感染および形質導入について周知 の技術によりパッケ一ジされたまたは封入されたウイルスとして細胞中に導入され る。 ウィルスベクタ一は複製受容または複製欠陥のいずれであってもよい。
ベクターのうち好ましいものは、 ある点において、 本発明のポリヌクレオチドま たはポリペプチドを発現するベクターである。 一般に、 このようなベクタ一は、 発 現されるポリヌクレオチドと操作可能に結合した宿主中の発現に有効なシス一作用 制御領域を含む。 適当なトランス一作用ファクタ一は （例えば、 シグナルべプチダ ーゼあるいはフ一リンなどの翻訳後のプロセッシングに関与する酵素群など） 、 宿 主細胞中に導入される際、 宿主により供給される力 補足べクタ一により供給され るかまたはベクターそれ自身により供給されるかのいずれかである。
この点に関して好ましい一態様において、 ベクタ一は特異的発現を提供する。 こ のような特異的発現は、 誘発性発現またはある型の細胞でのみ発現するか、 または 誘発性かつ細胞特異性なものである。 誘発性ベクターの中で特に好ましいのは、 操 作が簡単な環境因子、 例えば温度および栄養添加物により発現を誘発できるベクタ —である。 原核および真核細胞宿主における使用についての構成および誘発可能な 発現ベクターを含む本発明のこの態様に適した種々のべクタ一は、 周知であり、 当 業者により慣例的に用いられるものである。
遺伝子操作した宿主細胞は、 通常の栄養培地中で培養でき、 これは、 特にプロモ 一夕一の活性化、 形質転換体の選択または遺伝子の増幅に適するように修飾される 。 一般に発現のために選択された宿主細胞について今までに用いられている温度、 p Hなどの培養条件は、 当業者に明らかなように、 本発明のポリペプチドの発現に 適しているであろう。
非常に多種の発現べクタ一を本発明のポリペプチドの発現に用いることができる 。 このようなベクターは、 染色体、 ェピソ一ムおよびウィルス由来のベクター、 例 えばバクテリアプラスミド、 バクテリオファージ、 酵母ェピソ一ム、 酵母染色体ェ レメン卜、 バクロウィルス、 シミアンウィルス 4 0 ( 「S V 4 0」 ) などのパポバ ウィルス、 ワクチニァウィルス、 アデノウイルス、 鶏痘ウィルス、 偽狂犬病ウィル 来のベクタ一、 例えばプラスミドおよびパクテリオファージ遺伝子エレメント由来 のもの、 例えばコスミツドおよびファージミツドを包含し、 これらはすべて本発明 のこの態様にしたがって発現に用いられる。 一般に、 宿主においてポリペプチドを 発現するため、 ポリヌクレオチドの維持、 増殖または発現に適したいかなるベクタ 一もこの点に関して発現に用いることができる。 適当な D NA配列は種々の周知の 慣例技術よりベクター中に挿入される。 一般に、 発現用 D NA配列は、 D NA配列 および 1またはそれ以上の制限エンドヌクレアーゼを有する発現ベクターの開裂に より発現べクタ一に結合させ、 次に制限フラグメントを T 4 D N Aリガーゼを用い て一緒に結合させる。 この目的に用いることができる制限およびライゲーション法 は当業者には周知であり、 慣例的である。 この点に関して、 また当業者に周知であ り慣例的である別の技術を用いた発現ベクターの構築に適当な方法は、 Sambrookら (前掲） に非常に詳しく説明されている。
発現ベクター中の D N A配列を、 例えば、 プロモーターを含む適当な発現調整配 列に操作可能に結合させ、 mR NA転写を方向付ける。 このようなプロモーターの 代表例は、 ごく僅かの周知のプロモータ一を列挙すると、 ファージラムダ P Lプロ モーター、 大腸菌 l a c、 t r p、 t r cおよび t a cプロモ一夕一、 S V 4 0初 期および後期プロモーターおよびレトロウイルス L T Rのプロモーターを包含する 。 記載していない多くのプロモーターが本発明のこの態様における使用に適し、 周 知であり、 本明細書の考察および実施例により説明されたようにしてより容易に用 いられると考えられる。 一般に、 発現構築物は、 転写開始または終止部位、 および 転写された領域に、 翻訳のためのリボソーム結合部位を含有する。 構築物により発 現された成熟転写物のコ一ディング部分は翻訳されるポリぺプチドのほぼ末端に位 置する開始および終止コドンに翻訳開始 AU Gを含む。 加えて、 構築物は、 発現を 調節し、 引き起こす調節領域を含む。 一般に、 多くの通常実施されている方法にし たがって、 このような領域は、 レブレッサ一結合部位およびェンハンサーなどの転 写を調節することにより作用する。
増殖および発現用ベクターは、 選択マ一力一を含む。 このようなマ一カーは増殖 に適しているか、 またはべクタ一はこの目的のために付; ¾的なマーカ一を含有する 。 この点に関して、 発現べクタ一は、 形質転換された宿主細胞の選択のための表現 型特質を提供するために好ましくは 1またはそれ以上の選択マーカー遺伝子を含む 。 好ましいマーカ一は、 真核細胞培養について、 ジヒドロ葉酸還元酵素またはネオ マイシン耐性、 あるいは大腸菌および他のバクテリアの培養に関して、 テトラサイ クリンまたはアンピシリン耐性を含む。 本明細書に記載するような適当な D NA配 列を含むベクター、 ならびに適当なプロモーターまたは調節配列を、 所望のポリべ プチドの発現に適した種々の周知の技術を用いて適当な宿主中に導入する。
適当な宿主の代表例は、 大腸菌、 ストレブ卜マイセスおよびサルモネラ ·チフィ ムリゥム細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞； ドロソフイラ S 2および スポドプテラ S f 9細胞などの昆虫細胞； C HO、 C O Sおよび B owes黒色腫細胞 など、 さらには S P 2ノ0など接着性、 浮遊性いずれの動物細胞および植物細胞を 包含する。 種々の発現構築物に対する宿主は周知であり、 当業者は本発明の開示に より本発明のこの態様にしたがってポリペプチドを発現するための宿主を容易に選 択できる。
より詳細には、 本発明は組換え構築物、 例えば 1またはそれ以上の前記配列を含 む発現構築物も包含する。 構築物は、 ベクタ一、 例えばプラスミドまたはウィルス ベクターであって、 その中に本発明の配列が挿入されているものを含む。 配列を正 または逆の順序に挿入する。 この点に関して好ましい具体例において、 構築物はさ らに、 例えば配列に操作可能に結合したプロモータ一などを含む調節配列を有する 。 多数の適当なベクターおよびプロモータ一が当業者に公知であり、 本発明におけ る使用に適した多くの商業上入手可能なベクタ一がある。
以下の商業的に入手可能なベクターを例示のために記載する。 細菌においての使 用に好ましいベクターは Qiagenから入手可能な pQE 70、 pQE60、 pQE- 9 ； Stratageneから入手可能な pBSベクター、 ファージスクリプトベクター、 ブ ルースクリプトベクタ一、 pNH8A、 pNH16 a、 pNH18A、 pNH46 A ; Pharmaciaから入手可能な p t r c 99 a、 pKK223— 3、 pKK233 — 3、 pDR 540、 pR I T 5である。 好ましい真核細胞ベクターは、 Stratagen eから入手可能な pWLNEO、 pSV2CAT、 pOG44, ； pXTlおよび pS G；および Pliarmaciaから入手可能な ρ S VK3、 pBPV、 pMSG、 pSVLで ある。 これらのベクターは、 本発明の態様にしたがって用いるために、 当業者に利 用可能な商業上入手可能であり、 かつ周知のベクターを単に例示として列挙したも のである。 例えば本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの導入、 維持、 増 殖または発現に適した他のプラスミドまたはベクターも本発明のこの態様において 宿主にて用いることができる。
プロモー夕一領域は、 例えば候補プロモーターフラグメント；すなわちプロモー ターを含有するフラグメントを導入するための制限部位 （複数） の下流のクロラン フエニコ一ルァセチルトランスフェラーゼ （ 「CAT」 ） 転写単位などのプロモー ター領域を欠くリポーター転写単位を含有するべクタ一を用いて所望の遺伝子から 選択できる。 周知のように、 c a t遺伝子の上流の制限部位でプロモータ一含有フ ラグメン卜のベクター中に導入すると、 標準 CATアツセィにより検出可能な CA T活性の産生を引き起こす。 この目的に適したベクターは周知で容易に入手可能で ある。 2つのこのようなベクターは pKK232— 8および PCM7である。 した ifiつて、 本発明のポリヌクレオチドの発現用プロモーターは、 周知で容易に入手可 能なプロモーターだけでなく、 前記技術により、 リポーター遺伝子を用いて容易に 得られるプロモーターも包含する。
そのうち、 本発明にしたがつてポリヌクレオチドおよびポリぺプチドの発現に適 した公知の細菌プロモーターは、 大腸菌 1 a c Iおよび 1 a c Zプロモーター、 T 3および Τ 7プロモータ一、 gp tプロモーター、 ラムダ PR、 PLプロモ一ター および t r p、 t r cプロモーターである。 そのうち、 この点に関して適当な公知 の真核細胞プロモータ一は、 サイトメガロウィルス （ 「CMV」 ） 即時型プロモー ター、 H S Vチミジンキナーゼプロモーター、 初期および後期 S V 4 0プロモータ 一、 レトロウイルス L T Rのプロモーター、 例えばラウス肉腫ウィルス （ 「R o S V」 ） のプロモータ一、 およびメタ口チォネイン一 Iプロモーターなどのメタロチ ォネィンプロモータ一を包含する。
宿主細胞における発現についての適当なべクターおよびプロモータ一の選択は、 公知方法であり、 発現べクタ一構築、 ベクターの宿主細胞中への導入および宿主に おける発現に必要な技術は当業界で慣例の技術である。 本発明はまた前記構築物を 有する宿主細胞に関する。 宿主細胞は、 哺乳動物細胞などのより高等な真核細胞、 または酵母細胞などのより低級な真核細胞、 あるいは宿主細胞は細菌細胞などの原 核細胞とすることができる。
構築物の宿主細胞中への導入はリン酸カルシウムトランスフエクシヨン、 D E A E—デキストラン媒介トランスフエクシヨン、 カチオン性脂質—媒介トランスフエ クシヨン、 エレクト口ポレーシヨン、 形質導入、 感染または他の方法により行うこ とができる。 このような方法は、 多くの標準実験室マニュアル、 例えば、 Sambrook らの本に記載されている。
宿主細胞中の構築物は常法で用いることができ、 組換え体配列によりコードされ る遺伝子産物を生じる。 別法として、 本発明中の部分ポリペプチドは通常のぺプチ ド合成機により合成できる。 成熟蛋白質は、 哺乳動物細胞、 酵母、 細菌、 または他 の細胞において適当なプロモーターの調節下で発現できる。 また、 細胞を含まない 翻訳系を用い、 本発明の D NA構築物由来の R NAを用いてこのような蛋白質を産 生することもできる。 原核および真核宿主について用いる適当なクローニングおよ び発現ベクターは、 Sambrookら （前掲） に記載されている。
一般に、 組換え発現ベクターは、 複製起点、 下流構造配列の転写を方向付けるた めに高度に発現された遺伝子由来のプロモータ一、 およびベクターに接触させた後 ベクタ一を含有する細胞の単離を行うための選択マ一カーを含む。 そのうち、 適当 なプロモーターは、 3—ホスホダリセレートキナ一ゼ （ 「P GK」 ） 、 α—ファク ター、 酸ホスファターゼ、 および熱ショック蛋白質などの糖分解酵素をコードする 遺伝子から誘導できるものである。 選択マーカーは大腸菌のアンピシリン耐性遺伝 子およびエス ·セレピシェの t r p 1遺伝子を包含する。
高等な真核細胞による本発明のポリペプチドをコードする D N Aの転写はェンハ ンサー配列をべクタ一中に揷入することにより増加させてもよい。 ェンハンサ一は 、 所定の宿主細胞型においてプロモーターの転写活性を増加させるように作用する 、 通常、 D NAのシス一作用エレメントである。 ェンハンサ一の例は、 S V 4 0ェ ンハンサ一、 サイトメガロウィルス初期プロモーターェンハンサー、 複製起点の後 側のポリオ一マエンハンサー、 ]8ァクチンェンハンサーおよびアデノウイルスェン ハンサ一などを包含する。
本発明のポリペプチドのヘテロ口一ガスな構造配列をコードする本発明のポリヌ クレオチドは一般に標準的技術を用いて、 これが発現用プロモーターに操作可能に 結合するようにべクタ一中に挿入される。 ポリぺプチドは転写開始部位が適当にリ ポソ一ム結合部位の 5 ' に位置するように配置される。 リボソーム結合部位は発現 されるポリペプチドの翻訳を開始する AU Gに対して 5 ' である。 一般に、 開始コ ドン、 通常は AU Gで始まり、 リボソーム結合部位と開始 AU Gの間にある他のォ ープンリーディングフレームは存在しない。 また、 一般に、 ポリペプチドの末端に 翻訳終止コドンがあり、 転写領域の 3 ' 末端に適切に配置されたアデ二ル化シダナ ルおよび転写終止シグナルが存在する。
翻訳された蛋白質の小胞体のル一メン中、 細胞質隙中または細胞外環境への分泌 については、 適当な分泌シグナルが発現されたポリべプチド中に組み込まれている 。 シグナルはポリべプチドに対して内因性であるかまたはへテロローガスなシグナ ルであってもよい。
さらには、 シグナル配列に続くプロ配列に関しても内因性のものであっても良い し、 その他のヘテロローガスなもの （例えば他のメタ口プロテア一ゼのプレ /プロ 配列など） を用いても良い。
ポリべプチドは例えば融合蛋白質などの修飾された形態で発現され、 分泌シダナ ルだけでなく、 付加的なヘテロローガスな機能領域も包含する。 したがって、 例え ば付加的アミノ酸、 特に荷電アミノ酸の領域は、 精製中またはそれに続く操作およ び保存中、 宿主細胞における安定性および保存性を向上させるためにポリペプチド に添加される。 また、 ある領域をポリペプチドに付加して精製を促進してもよい。 このような領域は、 ポリペプチドの最終調製の前に除去してもよい。 ペプチド部を ポリペプチドに付加し、 分泌または排出を誘起するか、 または安定性を向上させる かまたは精製を容易にすることは、 当業界で周知の慣例的技術である。
本発明によるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの増殖、 維持または発現に適 当な原核宿主は、 大腸菌、 バチルス ·サチリスおよびサルモネラ ·チフィムリウム を包含する。 種々のシユードモナス、 ストレプトマイセスおよびスタフイロコッカ スがこの点で適当な宿主である。 さらにまた、 この点に関して当業者に公知の多数 の他の宿主も用いうる。 代表的であるが制限的でない例として、 細菌の用途に有用 な発現べクタ一は、 選択可能なマーカーおよび周知のクローニングベクター p B R 3 2 2 (AT C C 3 7 0 1 7 ) の遺伝子エレメントを含む市販のプラスミド由来の 細菌の複製起源を含みうる。 このような市販のベクターは、 例えば P KK 2 2 3— 3 (Pharmacia Fine Chemicals, ウプサラ、 スウェーデン） および G EM 1 (Prome ga Biotec, マディソン、 ウィスコンシン州、 米国） を包含する。 これらの p B R 3 2 2 「主鎖」 セクションを、 適当なプロモーターおよび発現させる構造配列と合す 適当な宿主株の形質転換および宿主株の至適細胞濃度への増殖後、 選択されたプ 口モーターを適当な手段 （例えば、 温度シフトまたは化学誘発因子） により誘発さ せ、 細胞をさらなる期間培養する。 細胞を典型的には遠心分離により収穫し、 物理 的または化学的手段により破碎し、 得られた粗抽出物をさらに精製する。 蛋白質の 発現に用いた微生物細胞は、 凍結一解凍サイクル、 超音波処理、 機械的破碎、 また は細胞溶解剤を含むいずれか都合のよい方法で破砕することができ、 このような方 法は当業者には周知である。
種々の哺乳動物細胞培養系はまた、 発現にも用いることができる。 哺乳動物発現 系の例は、 Gluzmanら、 Cel l 23： 1 7 5 ( 1 9 8 1 ) に記載されているサル腎臓線 維芽細胞の C O S— 6系統を包含する。 適合性ベクターの発現能を有する他の細胞 系は、 例えば、 C 127、 3T3、 CHO、 HeL a、 ヒト腎臓 293および BH K細胞系を包含する。 さらには、 浮遊系の細胞株である SP2/0等のミエローマも用い ることが出来る。
哺乳動物発現ベクターは、 複製起点、 適当なプロモータ一およびェンハンサー、 ならびに必要なリボソーム結合部位、 ポリアデニル化部位、 スプライスドナ一およ ぴァクセプター部位、 転写終止配列、 および発現に必要な 5' フランキング非転写 配列を含む。 あるいは SV40スプライス部位、 および SV40ポリアデニル部位由来の DNA 配列は、 これらのタイプの所望の非形質転換転写遺伝子エレメントについて用いら れる。 この点に関して、 例えば、 CAG系の発現ベクター （H. Niwa et al. , Gene, 10 8, 193-199, (1991)) 等が挙げられる。
また、 当該酵素の遺伝子配列を基に通常の方法により、 プローブやプライマーあ るいはアンチセンス (アンチセンス技術は、 アンチセンス DNAまたは RNAにより 、 あるいは三重らせんの形成により、 遺伝子発現を制御するのに用いることができ る。 アンチセンス技術は、 例えば、 Okano, J.、 Neurochem.、 56 : 560 (19 91) ； OLIGODEOXYNUCLEOTIDES AS ANTI SENSE INHIBITORS OF GENE EXPRESSION, CRC Press, BocaRaton, FL (1988) に記載されている。 三重らせんの形成 は、 例えば、 Leeら、 Nucleic Acids Research 6 : 3073 (1979) ； Cooney ら、 Science 2 1 : 456 (1988) ；および Dervanら、 Science 251 : 1 360 (1991) において考察されている。 方法はポリヌクレオチドの相補 DN Aまたは RNAに対する結合に基づく。 ）をデザインすることによって、 遺伝子診断 あるいは遺伝子治療が可能となる。
例えば患者からの細胞を ex V i voでポリペプチドをコードする D N Aまたは R N A などのポリヌクレオチドで遺伝子操作し、 その遺伝子操作をした細胞を次にポリべ プチドで処置すべき患者に提供する。 例えば、 細胞を本発明のポリペプチドをコー ドする RNAを含有するレトロウイルスプラスミドベクターを用いて ex vivoで遺伝 子操作できる。 このような方法は当業界で周知であり、 本発明におけるその使用は 本明細書の記載から明らかである。 同様に、 in vivoでのポリペプチドの発現に関し て、 当業界で公知の手順により細胞を in vitroで操作する。 例えば、 本発明のポリ ヌクレオチドを前記のように複製欠陥レトロウイルスベクタ一における発現用に操 作する。 ついで、 レトロウイルス発現構築物を単離し、 パッケージング細胞中に導 入し、 そのパッケージング細胞が対照となる遺伝子を含有する感染性ウイルス粒子 を産生するように、 本発明のポリペプチドをコードする RN Aを含有するレトロゥ ィルスプラスミドベクターで形質導入する。 これらのプロデューサー細胞を、 in vi troにて細胞を操作し、 in vivoにてポリペプチドを発現させるために患者に投与す る。 このような方法によるこれらおよび他の本発明のポリぺプチドの投与法は本発 明の教示により当業者には明らかである。
前記したレトロウイルスプラスミドベクタ一が由来するレトロウイルスは、 例え ば、 モロニ一ネズミ白血病ウィルス、 脾臓壊死ウィルス、 ラウス肉腫ウィルス、 ハ 一べィ肉腫ウィルス、 ニヮトリ白血症ウィルス、 テナガザル白血病ウィルス、 ヒト 免疫不全ウィルス、 骨髄増殖性肉腫ウィルス、 および乳房腫瘍ウィルスを包含する が、 これに限定されない。 このようなベクタ一はポリペプチドの発現に関して 1ま たはそれ以上のプロモーターを含む。 用いられる適当なプロモーターは、 レトロゥ ィルス L T R ; S V 4 0プロモーター；および Mi l lerら、 Biotecimidues 7 : 9 8 0— 9 9 0 ( 1 9 8 9 ) に記載されている CMVプロモータ一、 または他のプロモ 一ター (例えば、 ヒス卜ン、 R NAポリメラ一ゼI I Iおよび /3—ァクチンプロモ 一夕一を包含するがこれに限定されない真核細胞プロモータ一などの細胞プロモ一 夕一） を包含するが、 これに限定されない。 用いられる他のウィルスプロモーター は、 アデノウイルスプロモー夕一、 チミジンキナーゼ （TK) プロモーター、 およ び B 1 9パルボウイルスプロモータ一を包含するが、 これに限定されない。 適当な プロモーターの選択は、 本明細書に含まれる教示から当業者には自明である。
本発明のポリペプチドをコードする核酸配列は、 適当なプロモーターの制御下に ある。 用いることのできる適当なプロモ一夕一は、 アデノウイルスメジャーレイト プロモーターなどのアデノウイルスプロモータ一；または C MVプロモーターなど のへテロローガスプロモーター；呼吸器合胞体ウィルス （ 「R S V」 ） プロモ一夕 一； MMTプロモーター、 メチタルチオネインプロモ一ターなどの誘導プロモ一夕 一；熱ショックプロモ一タ；アルブミンプロモータ一； A t) o A Iプロモータ一； ヒトグロビンプロモータ一；単純へルぺスチミジンキナーゼプロモータ一などのゥ ィルスチミジンキナーゼプロモーター；レトロ ウィルス LTR (前記修飾レトロ ウィルス L TRを包含する） ； /3—ァクチンプロモー夕一；およびヒト成長ホルモ ンプロモーターを包含するが、 これに限定されない。 プロモーターはまたポリぺプ チドをコードする遺伝子を制御するネィティブプロモータ一であってもよい。 レト ロウィルスプラスミドベクタ一をパッケージング細胞系の形質導入に用いて、 プロ デュ一サー細胞系を形成する。
トランスフエクシヨンされるパッケージング細胞の例は、 PE501、 PA31 7、 Y- 2、 Y- AM、 PA12、 T19- 14X、 VT- 19- 17- H2、 YCRE 、 YCR I P、 GP+E— 86、 GP + e n vAml 2、 および iller、 Human Gene Therapy 1 : 5— 14頁 （ 1990 ) に記載されている DAN細胞系を包含するが 、 これに限定されない。
ベクターはパッケージング細胞中に当業界で公知の手段により形質導入される。 このような手段は、 エレクトポレーシヨン、 リボソームの使用、 および CaP〇4沈降 を包含するが、 これに限定されない。 別法として、 レトロウイルスプラスミドべク ターをリボソーム中に封入するか、 または脂質と結合させ、 宿主に投与する。 プロ デューサー細胞系は、 ポリペプチドをコードする核酸配列 （複数） を含む感染性レ トロウィルスベクター粒子を生成する。 このようなレトロウイルスベクタ一粒子を 用いて、 真核細胞を in vitroまたは in vivoのいずれかで形質導入する。
形質導入された真核細胞はポリペプチドをコードする核酸配列を発現する。 形質 導入されてもよい真核細胞は胚幹細胞、 胎生期癌細胞、 ならびに造血幹細胞、 肝細 胞、 線維芽細胞、 筋芽細胞、 ケラチノサイ卜、 内皮細胞、 および気管支上皮細胞を 包含するが、 これに限定されない。
本発明の蛋白質分解酵素、 該蛋白質分解酵素に対する抗体、 該分解酵素 のアン夕ゴニスト、 阻害剤、 ァゴニスト、 活性調節剤等を生理食塩水、 緩 衝液等で希釈して製剤化し、 医薬組成物を得ることができる。 製剤の； pH は体液の p Hに近い弱酸性〜中性域の p Hが望ましく、 その下限は 5.0〜 6. 4が望ましく、 その上限は pH6.4〜7.4が望ましい。 また、 凍結乾燥形態等 の長期間保存可能な形態で提供することもでき、 この場合使用時に水、 生 理食塩水、 緩衝液等で所望の濃度になるように溶解して使用することがで ぎる。
本発明の製剤は、 通常医薬品に用いられる薬理的に許容される添加剤 （例えば担 体、 賦形剤、 希釈剤等） 、 安定化剤または製薬上必要な成分を含有していてもよい 。 安定化剤としては、 グルコース等の単糖類、 サッカロ一ス、 マルト一ス等の二糖 類、 マンニ！ ^一ル、 ソルビトール等の糖アルコール、 塩化ナトリウム等の中性塩、 グリシン等のアミノ酸、 ポリエチレングリコール、 ポリオキシエチレン一ポリオキ シプロピレン共重合体 （プル口ニック） 、 ポリオキシエチレンソルピタン脂肪酸ェ ステル （トウィーン） 等の非イオン系界面活性剤、 ヒトアルブミン等が例示され、 ；！〜 1 0 w/ V %程度が添加されていることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、 静脈内注射、 筋肉内注射、 皮下注射等により有効量で投 与することができ、 1回または数回に分けて投与される。 その投与量は、 症状、 年 齢、 体重などによって異なるが、 1回あたり、 0. 001mg〜100ingが好ましい。
また、 本発明の蛋白質分解酵素をコードする DNAのセンス DNAまたはアンチセンス D NAも同様にして製剤化し、 医薬組成物を得ることができる。
さらに、 本発明は、 本願発明のペプチド、 蛋白質、 DNAを投与して、 心筋梗塞、 脳 梗塞における血小板血栓抑制、 動脈硬化症の抑制、 P T C Aにおける再狭窄や再塞 栓'梗塞の防止、 P T C Rにおける再塞栓の防止、 HU Sや 0— 1 5 7が原因とな る血小板血栓の予防の方法をも含む。 さらに、 本発明は、 心筋梗塞、 脳梗塞におけ る血小板血栓抑制、 動脈硬化症の抑制、 P T C Aにおける再狭窄や再塞栓，梗塞の 防止、 P T C Rにおける再塞栓の防止、 HU Sや O— 1 5 7が原因となる血小板血 栓の予防のための医薬の製造における本願発明のペプチド、 蛋白質、 MAの使用をも 含む。
さらに、 本願発明のぺプチドまたは蛋白質をリ一ド物質としてアミノ酸を改変す ることにより、 本願発明酵素の活性を変化させた分子を調製することが可能である 。 メタ口プロテア一ゼドメイン内の活性中心近傍のアミノ酸残基を他のアミノ酸に 置換する等して不活性化された変異体の作製などによって得られるアン夕ゴニスト の作製、 または分子認識部位と触媒部位を分離もしくはその一部もしくは両方を変 化させることにより得られる変異体分子などが例示される。
また、 本願発明中に述べられている vWF切断活性の評価系を利用することによ りアンタゴニスト ·ァゴニストの作出が可能である。 例えば、 有効なアン夕ゴニス 卜とは、 小さな有機分子、 ペプチド、 ポリペプチド等で本発明のポリペプチドと結 合し、 これによりその活性を抑制または消失させるもので抗体を包含する。
また、 同様に前記 vWF切断活性の評価系を利用することにより、 vWFを切断 し得る化合物をスクリーニングすることも可能である。 この際、 被験化合物の切断 活性を前記評価系を用いて評価すればよい。
図面の簡単な説明
図 1は、 vWFのマルチマー構造と vWF切断酵素による切断点を示す図である 図 2は、 vWFのマルチマ一解析の結果（ァガロース電気泳動）を示す写真である 図 3は、 血漿各画分の vWF切断活性を還元条件下の SDS— PAGE (5%ゲ ル） で確認した結果を示す写真である。
図 4は、 フラクション 1 (F 1)ペースト可溶化サンプルの非還元下の SDS— P AGE (5%ゲル） の泳動写真である。
図 5は、 F 1ペース卜可溶化サンプルを出発原料として 3回のゲル濾過クロマト グラフィ一に通液後の vWF切断酵素画分の解析結果（ゲル濾過ク口マトグラフィー のチャートを示す図、 ならびに非還元下での SDS— PAGE及び還元条件下での vWF切断活性の SDS— PAGE)を示す写真であり、 図 5 Aはゲル濾過クロマト グラフィ一のチャート、 図 5 Bは非還元下でのフラクションの SDS— PAGEの 結果、 図 5 Cは還元条件下での V W F切断活性の SDS— PAGEの結果を示す。 図 6は、 ゲル濾過クロマトグラフィー回収画分を DEAE陰イオン交換クロマト グラフィ一によつて精製した V W F切断酵素画分の解析結果 (ゲル濾過ク口マトダラ フィ一のチヤ一トを示す図、 ならびに非還元下での SDS— PAGE及び還元条件 下での vWF切断活性の SD S— PAGE)を示す写真であり、 図 6 Aはゲル濾過ク 口マトグラフィ一のチヤ一ト、 図 6 Bは非還元下での溶出フラクションの SDS— PAGE (8%ゲル） の結果、 図 6 Cは還元条件下での vWF切断活性の SDS— PAGEの結果を示す。 図 6 C中の 3本のバンドは、 図 5 Cと同様にインタクトな vWF分子 （切れのこり） 、 vWF切断断片、 vWF切断断片を示す。
図 7は、 DEAE陰イオン交換クロマトグラフィーによって精製 ·濃縮した vW F切断酵素画分をバイオフォレーシスに基づく SDS— PAGE (非還元下） によ つてさらに精製した時の泳動画分を示す写真である。
図 8は、 vWF切断酵素画分をバイオフォレーシスに基づく SDS— PAGE によってさらに精製した画分の vWF切断酵素活性の確認及び活性画分の還元下で の SDS— PAGEの泳動写真であり、 図 8 Aは v WF切断酵素活性の非還元下で の SDS— PAGEの結果、 図 8 Bは活性画分の還元下での SDS—PAGEの結 果を示す。
図 9は、 vWF切断酵素遺伝子の同定に関し、 ノザンプロットプロ一プ用遺伝子 断片の増幅に用いたプライマ一を示す図である。
図 10は、 vWF切断酵素遺伝子の同定に関し、 ノザンプロットのオートラジオ グラフィーを示す写真である。 図 1 OAは当該蛋白質分解酵素コード遺伝子をプロ ーブとして用いた場合の結果、 図 10 Bは 3ァクチンプローブ （RNAコント口一ル） を用いた場合の結果を示す。
図 1 1は、 vWF切断酵素遺伝子の同定に関し、 RACE反応に用いたプライマ 一の位置と配列を示す図である。
図 12は、 全長 cDNAクローニング用に設計したプライマーの位置を示す図である 図 13は、 全長 cDNAを含むベクターの構築手順を示す図である。
図 14は、 各種細胞株での発現を示す写真である （抗 FLAG抗体を用いた還元条件 下のウェスタンブロット； Mockは遺伝子を発現ベクターへ逆向きに挿入したもの）
。 図 14中、 各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。
レーン 1 Mock (宿主： 293細胞）
レーン 2 vWF切断酵素 cDNA+FLAG (宿主： 293細胞） レーン 3 Mock (宿主： HepG2細胞）
レーン 4 vWF切断酵素 cDNA+FLAG (宿主： HepG2細胞）
レーン 5 Mock (宿主： He la細胞）
レーン 6 vWF切断酵素 cDNA+FLAG (宿主： Hela細胞）
図 1 5は、 組換え発現酵素の活性測定を示す写真である（非還元下の SDS- PAGEによ る vW切断の確認； Mockは遺伝子を発現ベクターへ逆向きに挿入したもの）。
図 1 5中、 各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。
レーン 1 Mock (宿主： He la細胞）
レーン 2 vWF切断酵素発現上清 （宿主： He la細胞）
レーン 3 Mock (宿主： HepG2細胞）
レーン 4 vWF切断酵素発現上清 （宿主： HepG2細胞）
レーン 5 Mock (宿主： 293細胞）
レーン 6 vWF切断酵素発現上清 （宿主： 293細胞）
レーン 7 Mock (宿主： BHK細胞）
レーン 8 vWF切断酵素発現上清 （宿主： BHK細胞）
レーン 9 Mock (宿主： COS細胞）
レーン 1 0 vWF切断酵素発現上清 （宿主： COS細胞）
レーン 1 1 Mock (宿主： CH0細胞）
レーン 1 2 vWF切断酵素発現上清 （宿主： CH0細胞）
図 1 6は、 本酵素に対して確立された抗体によるウエスタンプロットを示す写真 であり、 293細胞を宿主とした組換え vWF切断酵素を用いた各種抗血清でのウェス夕 ンブロットを示す写真である。
図 1 6中、 各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。
レーン 1 マウス抗血清 （精製タンパク質を投与して調製）
レーン 2 ゥサギ抗血清 （発現ベクターをゥサギ皮下に投与して調製）
レーン 3 未処理ゥサギ抗血清
レーン 4 ゥサギ抗血清 （部分合成ペプチドを KLHコンジユゲー卜したものを投与し て調製） 図 1 7は、 本酵素に対して確立された抗体によるウエスタンプロットを示す写真 であり、 vWF切断酵素全長の cDNA投与により得られたゥサギ抗血清を用いてヒト血漿 由来各種サンプルと組換え発現体の検出を示す写真である。
図 1 7中、 各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。
レ一ン 1 ヒト血漿クリォ由来部分精製サンプル
レーン 2 ヒト血漿由来精製 切断酵素 ' レーン 3 ヒトプール血漿の FIペーストのゲルろ過サンプル
レーン 4 組換え vWF切断酵素 （宿主： 293細胞）
レーン 5 組換え vW切断酵素 （宿主： Hela細胞）
図 1 8は、 本酵素に対して確立された抗体によるウエスタンプロットを示す写真 であり、 vWF切断酵素の部分合成べプチドを免疫して得られたゥサギ抗血清を用いた 健常人血漿及び TTP患者血漿中の vW切断酵素並びに遺伝子組換え vWF切断酵素の確認 を示す写真である。
図 1 8中、 各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。
レーン 1 ヒトプール血漿の FIペーストのゲルろ過サンプル
レーン' 2 健常人血漿 1
レーン 3 健常人血漿 2
レーン 4 健常人血漿 3
レーン 5 TTP患者血漿 1
レーン 6 TTP患者血漿 2
レーン 7 組換え vWF切断酵素 （宿主： 293細胞）
レーン 8 組換え vWF切断酵素 （宿主： Hela細胞）
図 1 9は、 vWF切断酵素に対して調製された抗体を用いた ELISAを示す図である。 図 2 0は、 抗体を用いたァフィ二ティー精製 vW切断酵素各画分の還元下での SDS- PAGE (銀染色） を示す写真である。
図 2 0中、 各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を示す。
レーン 1 アプライ培養上清 （10倍希釈）
レーン 2 素通り画分 レーン 3 洗浄画分
レーン 4 溶出画分
図 21は、 抗体を用いた中和活性能の評価 （非還元下の vW切断活性の SDS- PAGE) を示す写真である。 図 21中、 各レーンはそれぞれ以下のサンプルを用いた結果を 示す。
レーン 1 vWF切断酵素液 正常家兎血清 =1 ： 1
レーン 2 vWF切断酵素液 正常家兎血清 （5倍希釈） =1 : 1
レーン 3 vWF切断酵素液 ペプチド免疫家兎血清 =1 ： 1
レーン 4 切断酵素液 ペプチド免疫家兎血清 （5倍希釈） =1 : 1
レーン 5 vW切断酵素液 組換え蛋白免疫家鬼血清 = 1 ： 1
レーン 6 vWF切断酵素液 組換え蛋白免疫家兎血清 （5倍希釈） =1 : 1 レーン 7 WF切断酵素液 10mM EDTA= 1 ： 1
レーン 8 vWF切断酵素液 バッファーのみ =1 ： 1
レ一ン 9 バッファ一 （vW切断酵素なし） ：バッファー =1 ： 1
図 22は、 C末端ドメイン欠失分子種の発現ベクター構築図である。 発明を実施するための最良の形態
以下に、 実施例に従って本願発明を詳説するが、 本願発明はこれら実施例に何等 限定されるものではない。
実施例 1
(vWFの調製）
vWFは、 セフアクリル S- 500HR (アマシャムフアルマシア）の 2.6X90 cmカラムに より、 血漿クリオ画分 2gを 20 mLのバッファー（0.01% Tween-80 / 50 ni Tris-HCl ι ΙΟΟπιΜ NaCl H 7.4)に溶解したものをゲル濾過することにより調製した。 流速は 2 mL / min.でフラクションは 6 mLづっ回収した。 vWFは、 ペルォキシダ一ゼ標識 ゥサギ抗ヒト vWF抗体 (DAK0社製）を用いたウェスタンプロット法により確認し、 高分子量 V W F画分をプールした。 これを後述するァガロース電気泳動法を利用し たマルチマー解析に供した。 本来、 vWFは図 1に示されるように vWFモノマー分子が、 N末端、 C末端同 士で重合し、 マルチマ一構造をとつており、 vWF特異的切断酵素により図中に示 されるような限定分解を受けることが知られている。 解析の結果、 図 2に示される ように、 精製した V W Fは健常人血漿中のそれと同等程度のァガロース電気泳動上 でのマルチマーパターンを示した （図中のラダ一がマルチマー構造を有する vWF の泳動パターンで、 上位の方がより重合が進んだ vWFであることを示す） 。 これ により、 本質的に vWFを分解する夾雑物を含まない vWFを調製することができ 、 この画分は後述する vWF切断活性を測定する際の基質として使用した。
実施例 2
(v WF切断反応）
v WF切断活性のアツセィは、 終濃度 10 の塩化バリゥムを加えたサンプルを 37 °Cで 5分間プレインキュベー卜し、 プロテアーゼの活性化を行った。 50mLのフアル コンチューブにバッファー（15〜20mLの 1. 5M Urea I 5mM Tri s-HCl pH8. 0)を入れた 。 次にミリポア社製のメンプレンフィルター（0. 025〃ffl)を浮遊させ、 50 Lの vWF 基質溶液を加えて混合した活性化サンプルを 100 /x L添加した。 37°Cのィンキュベー 夕一にー晚静置して翌日フィルターから回収した。 回収したサンプルを、 以下の SD S- PAGEの項に示す vWFの切断パターンにより評価した。
SDS-PAGE
SDS-5%ポリアクリルアミドゲルを自家調製し使用した。 vWF切断活性のアツセ ィ項で述べたサンプル 10 Lに、 SDS泳動バッファー (還元剤 2 -メルカプトエタノ一ル 存在下または不在下) 2 Lを加え 3分間煮沸したものを泳動サンプルとした。 30mAで 1 時間電気泳動したのち、 ゲルは CBB染色を利用した Gel Code Blue Stain Reagent (PI ERCE社）にて染色した。 活性の有無の解釈は図 1に示されるように還元下、 非還元下 での切断断片の出現及び切れ残る残存断片の有無で評価される。 より具体的には、 後述する 「実施例 3」 の項、 図 3を参照されたい。
ァガロース電気泳動法を利用したマルチマー解析
ゲリレの作製、 電気泳動
375 niM Tr is-HCl (pH6. 8)に Low Ge l l ing Temperature (シグマ TypeVII)を 1. 4%にな るように加え電子レンジで加熱し完全に溶解した後、 0. 1% SDSを加え、 一旦 56°Cに なるように保った。 ゲル型に流し 4°Cで一晩冷やし固めた (Ruiming gel)。 翌日、 375 mM Tris-HCl (pH6. 8)に High Gel l ing Temperature (SeaKem)を 0. 8 になるように混じ 、 電子レンジで煮沸溶解した後、 一旦 56°Cに保った（Stacking gel)。 前日に調製し たゲルは端から 1 0 c mを残し切り取った。 切り取ったところに上述のゲルを流し 込み、 4°Cで 3時間以上流し固めた。 vWF切断活性のアツセィ項で述べたサンプル に、 パイ口ニン Yを加え、 非還元、 煮沸をせずに調製後、 SDS- PAGEバッファーを用い て 10mA、 24時間以上泳動した。
ウェスタンプロット
電気泳動後、 ゲルを転写緩衝液 (0. 005%SDS、 50mMリン酸緩衝液 PH7. 4)に 10分間浸 し、 転写装置を用いて 4°C、 0. 5Aでー晚ニトロセルロース膜に転写した。 プロット液 (5%スキムミルク、 PBS)でブロッキングを 30分した後、 プロット液で 1000倍希釈した ペルォキシダーゼ標識ゥサギ抗ヒト vWF抗体 (MK0社製）と 6時間以上反応させた。 この後ブロット液にて 3回、 PBSにて 1回洗浄してペルォキシダ一ゼの基質反応液であ るコニカイムノスティン HRP- 1000 (コ二力社製）で発色を行つた。 本アツセィを用い て確認された精製 vWFは、 分解を受けたものではなく十分、 本願発明中で利用さ れた基質として用いるに値することが確認された （図 2 ) 。
実施例 3
(vWF切断酵素の調製）
血漿をコーンのエタノール分画に供し、 出発血漿、 クリオプレシピテート、 フラ クシヨン I (F I )上清及びペーストの 4つの画分について、 タンパク量を等しくし た場合の vWF切断活性の高いもの（比活性の高いもの）を選定した。 図 3に示すご とく本酵素活性は FIペース卜で最も活性が高かった。 この切断断片の N末端配列解 析を行ったところ、 クリオ、 FIペースト由来の活性本体は 842Tyr- 843Metのペプチド 結合を切断することが判った。 そこで、 これ以降 FIペーストを主な精製の出発原料 とした。
FIペーストの可溶化
FIペーストは 12gずつに小分けし凍結保存した。 使用する前日に 4 °Cに出して融解 させ、 翌日、 可溶化バッファ一（0. 05% ァザィド、 50 EM Tris-HCI pH7. 4、 ίΟΟ πιΜ N aCl)を 10 mg/mLになるよう、 120mL加え 37°Cで 2時間攪拌した。 lOOOOrpmで 10分間遠 心した後、 上清を回収し、 プレフィルター、 5. Ο ΙΠフィルタ一、 フィルター の順でろ過したものを可溶化サンプルとした。 図 4に可溶化サンプルの SDS- PAGEを 示す。
vWF切断酵素のゲルろ過クロマ卜グラフィ一
可溶化した F 1ペーストを、 セファクリル S-300HR (アマシャムフアルマシア) の 5 X 90cmカラムにかけ、 1回目のゲルろ過を行った。 可溶化バッファーと同じ 0. 05% Az aid、 50 mM Tri s-HCl pH7. 4、 100 mM NaCl (以後溶出バッファー）を用い、 流速は 5 m L/min.、 分取はサンプルアプライ後 600mL目から、 フラクションは 10 mLづっ回収し た。 フラクションは vWF切断反応後、 SDS— PAGEで活性を確認した。 酵素活性のあつ たフラクションをプールし、 これに、 終濃度 33 %飽和となるよう飽和硫安を少量ず つ滴下した。 これをさらに一晩 4°Cに静置した。 翌日 10000rpm、 10分遠心し、 目的の 活性画分を沈殿として回収した。 以上の可溶化 ·ゲルろ過 ·硫安沈澱の操作を 5バ ツチ行い、 — 20°Cで凍結保存した。
1回目のゲルろ過によって得られた硫安沈殿物 2〜3バ チ分を、 溶出バッファー 5 OniLに溶解し 1回目と同様セファクリル S- 300HR力ラム（5 X 90cm)に通液し、 2回目の ゲルろ過を行った。 溶出バッファー、 条件、 操作等については 1回目と同様である 。 フラクションは vWF切断反応後、 SDS— PAGEで活性を確認した。 活性のあったフ ラクシヨンをプールし、 硫安沈澱を同様に行った。 この操作を 2回実施した。
2回目のゲルろ過によって得られた硫安沈殿物 2回分を、 溶出バッファー 50mLに 溶解し、 1、 2回目と同様、 セフアクリル S- 300HRカラム（5 X 90cm)にかけ、 3回目 のゲルろ過を実施した。 溶出バッファ一、 条件、 操作等については 1、 2回目と同 様である。 得られたフラクションは、 vWF切断反応後、 SDS— PAGEで活性を確認し たのちプールした。 図 5にフラクションの SDS- PAGE及び vWF切断活性の SDS-PAGE を示す。 ゲル濾過のパターンと活性のデ一夕よりフラクション 3 7番から 4 7番に 渡って本酵素が溶出されてきていることが確認できた。 この溶出位置は、 別途行つ た高分子量ゲル濾過マーカー （アマシャムフアルマシア） の溶出実験から、 分子量 として推定 1 5 0 kDa〜3 0 0 M)aに相当することが示唆された。 この段階では、 ま だかなりの夾雑物が大量に存在していることが明らかとなった。
D E A E陰イオン交換クロマトグラフィー
ゲルろ過を 3回かけて得られたプールフラクションを、 50mM Tris- HC1、 50mM NaC 1 pH7. 1バッファーで一晩透析した。 透析後、 ハイトラップ DEAEファストフローセフ ァロースカラム (フアルマシア） 5mLを用い、 陰イオン交換クロマトグラフィーを行い 、 さらなる精製及び濃縮を行った。 平衡化及び洗浄バッファ一は 50inM Tris- HC1 H7 . 1にて行い、 溶出は 0. 25Mの NaCl で溶出させた。 流速は 5 mL/mm、 フラクションは 5 mLずつ 5本回収しプールした。 図 6に溶出フラクションの SDS- PAGE及び V WF切断 活性の SDS-PAGEを示す。 活性の測定の SDS- PAGEから、 かなり効率よく溶出画分に v WFを切断する活性を有する本酵素が濃縮されていることが明らかとなった。
SDS-PAGEを利用した分画
DEAE陰イオン交換クロマトグラフィーにより精製 ·濃縮されたサンプル 5 mlをさ らに、 分子量カット 1 0 , 0 0 O Daのセントリコン （アミコン社製） にて 0 . 5 mL まで濃縮し、 SDS- PAGEを利用したアト一社製バイオ ·フォレーシス I I Iにより、 本酵 素の単離を行った。 Laeiml i法 (Nature, vol. 227, 680-685 ： 1970)に従い、 泳動槽 用緩衝液を調製し、 ポリアクリルアミド 8%ゲルにて展開し、 泳動画分を回収した。 ' 図 7に回収画分の SDS-PAGEを示す。 回収バッファ一は 50 Tris-HCl、 10%グリセ ロール pH 8. 8を用いた。 図 7からも理解されるように、 本願発明の当該工程は高分 離能を有する分離法であることが判る。 図 8に電気泳動によってさらに精製した画 分の活性の確認及び活性画分の SDS-PAGEを示す。 本酵素は SDS-PAGE後も活性を有す る分子として回収することができ、 この段階で、 比活性として血漿中での本酵素活 性を 1とした場合、 血漿の平均的なタンパク含量 （60mg/ml) から推定して、 3 0， 0 0 0〜 1 0 0， 0 0 0倍の精製度に達したことが推定された。
実施例 4
(部分アミノ酸配列の決定）
単離した本酵素の部分アミノ酸配列を決定した。 バイオフォレシスにて単離され た本酵素を常法により、 SDS-PAGE後、 PVDF膜へトランスファ一し、 風乾したのち、 P Eアプライドバイオシステムズ社のオートプロテインシークェンサ一 492にて、 解析 を行った。 その結果、 上記条件で単離した本願発明の vWF切断酵素の一態様は、 分子量が SDS- PAGEにおいて還元下 105〜160kDaの範囲にあるポリぺプチド鎖よりなり
、 部分配列として Leu- Leu- Val- Ala_Valを、 好適には Ala- Ala- Gly- Gly- lie- Leu- His-
Leu_Glu - Leu- Leu- Va卜 Ala - Valを有することが明らかとなった。
バイオインフォ一マテイクスを利用した単離酵素の推定
現在は、 バイオインフォ一マテイクスの技法を用いることで、 今まで蓄積された データベースとの照合により、 実質的な遺伝子のクロ一エングなしに当該ポリぺプ チドをコードする全塩基配列の推定が可能となっている （BIOINFORMATICS: A Pract ical Guide to the Analysis of Genes and Proteins edi ted by Andreas D. Baxev anis and B. F. Francis Ouel lette) 。 上述した手法により決定されたアミノ酸部 分配列 （Ala- Ala_Gly-Gly_I le- Leu-His- Leu- Glu- Leu- Leu- Val-Ala-Val) を基に、 プ ログラム tblastnによりデータベースサーチを行った結果、 ゲノムでのデータべ一ス サーチにより、 本酵素をコードしていると推察される染色体クローン （AL158826) が同定され、 さらに、 EST (Expressed Se uence Tag) として目的酵素の一部分及び 上記ゲノムによりコードされるポリペプチドの一部と推察されるクローン （AI 34676 1及び AJ011374) を同定した。 これをもとに vWF切断酵素としての活性部位として 配列番号 3もしくは 7に示すァミノ酸配列を推定した。
実施例 5
(遺伝子の同定）
以下、 全ての合成プライマーはグライナ一ジャパン (株) に依頼した。 さらに、 遺伝子組換えに関する試薬類は、 特に断りのない限り、 TAKARA、 TOYOBOおよび New E ngland Biolabs社製を用いた。
ノザンブロットプローブ用遺伝子断片の調製
センスプライマー （配列番号 9 ) 及びアンチセンスプライマ一 （配列番号 1 0 ) を作製し、 正常ヒト組織由来 c D NAの混合物である Universal QUI CK-C lone™ c丽 A (CLONTECH社製） を銹型として、 TAKAM LA Tag wi th GC rich bufferにて P C R 反応し、 プライマーで挟まれた部分の遺伝子を増幅し、 その断片を Invitrogen社製 T 0P0 TA cloningTMキットにてクロ一ニングした。 数個のクロ一ンから配列番号 6記 載の塩基配列を有するものを単離した。
このクローン化 DNAから EcoRI消化によりべクタ一部分を取り除き、 ァガロース電 気泳動により分離 ·精製し、 ノザンブロッ卜のプローブ調製用の鐯型とした。
ノザンプロッ卜
上述により調製された遺伝子断片を铸型として、 [ - 32P]dCTP (Amershani pliarm acia社製） および BcaBESTTMラベリングキット （TAKARA社製） により、 放射性プロ ーブを調製した。 そして、 Human 12 - lane Mutiple Tissue Northern Blots™ (CLON TECH社製) フィルターを用いて、 Molecular Cloning 2nd edition P 9.52-9· 55記 載の方法により、 ハイブリダィズし、 オートラジオグラフィ一により検出した。 図 1 0に示されるように、 本酵素をコードする mRNAの発現部位は、 主に肝臓であ ることが確認された。 そして、 その mRNAのサイズは、 4.4キロベース以上に及 ぶことが明らかとなった。
本酵素コード遺伝子の単離 ·同定
ノザンブロットの結果、 mRNAの主要発現部位は肝臓であることが確認された ため、 正常ヒト肝臓由来の Poly A+ RNA¾r/Maratlion-Ready™ cDNA (CL0NTECH社製 ) を用いて、 RACE法により本酵素遺伝子の単離 ·同定を行った。
より具体的には、 5' RACEとして正常ヒト肝臓由来 Marathon- ReadyTM cDNA を用い て、 製品マニュアルに基づき、 添付の AP- 1プライマーと図 1 1に示す Gene Specific Primer (GSP)プライマ一群から最上流のプライマー 1位のものを除き、 アンチセン スプライマーを任意に選択し （配列番号 11〜13) 、 1st PCRを行い、 さらにそ の内側の AP- 2と図 11中の 1s t PCRで用いたプライマ一より内側の位置のアンチセ ンスプライマーにて nested PCR (2nd PCR) を行ったのち、 TA cloningを実施した。 出現したコロニーから常法により遺伝子を調製し （Molecular Cloning 2nd edition p 1.25-1.28) 、 自動 DNAシークェンサ一にて核酸配列の解読を行った。 シー クェンシングに用いたプライマーは、 PCRに用いたプライマーあるいはそれより 内部のプライマーを用いて行った。 さらには、 逐次解読後の配列を基に設定した。
3 ' RACEは、 正常ヒト肝臓由来の Poly A+ RNAから、 3'- Full RACE Core Set (TA KARA社製） を用いて、 添付マニュアルに基づき、 添付のオリゴ dTプライマーにて逆 転写反応を行った後、 図 1 1中のプライマー 2の位置のセンスプライマー （配列番 号 1 4 ) と添付のオリゴ dTプライマ一での P C Rで増幅したバンドをァガロース電 気泳動により分離、 そして抽出後 TA cloningを行った。 出現したコロニーから遺伝 子を調製し、 自動 D N Aシークェンサ一にて核酸配列の解読を行った。 シークェン シングに用いたプライマーは、 逐次解読後の配列を基に設定した。
実施例 6
(全長 cDNAを含むベクターの調製 1 )
当該蛋白質をコードしている cDNAを例えば制限酵素サイトとして Xholを付加し、 開始コドンを含むセンスプライマー 1 (配列番号 2 2 ) 及び Sailサイトを付加した 終結コドンを含むアンチセンスプライマー 2 (配列番号 2 3 ) を用いて （図 1 2参 照） 、 前出の正常ヒト肝臓由来 Marathon- Readyni cDNAを铸型として、 TAKARA LA Ta with GC rich bufferにて一段階 PCRの後、 前出の TA cloningを行い、 その全長を 自動]) Mシークェンサ一にて確認した。
実施例 7
(全長 cDNAを含むベクターの調製 2 )
当該蛋白質をコードしている cDNA (配列番号 1 5 ) の内部配列中で 1点のみで切 断する制限酵素サイト Accl及び Avrllを見い出した。 これを利用して、 図 1 2に示す ように、 全長 cDNAを 3つのフラグメントに分割し、 それぞれにセンスプライマ一 1 (配列番号 2 2 ) 及びアンチセンスプライマ一 3 (配列番号 2 4 ) で挟まれたフラ グメント （フラグメント 1 ) 、 センスプライマ一 4 (配列番号 2 5 ) 及びアンチセ ンスプライマー 5 (配列番号 2 6 ) で挟まれたフラグメント （フラグメント 2 ) そ して、 センスプライマー 6 (配列番号 2 7 ) 及びアンチセンスプライマー 2 (配列 番号 2 3 ) で挟まれたフラグメント （フラグメント 3 ) を設定し、 前出の正常ヒト 肝臓由来 Maratl丽- ReadyT M cDNAを銬型として、 TAKAM LA Ta wi th GC rich buff erにてそれぞれ PCRの後、 前出の TA cloningを行い、 その全長を自動 DNAシ一クェン サ一にて確認した。 さらに、 前出の TAクローニングキットに含まれる pCR2. 1ベクタ 一をセルフライゲーシヨンしたものを、 Xliol/ ndlllで切断後、 Xhol/Accl/Avrll/H indlllを含むリンカ一 （配列番号 2 8及び 2 9に示す合成 DNAをァニールさせたもの ) をライゲ一シヨンし、 上述の 3つのフラグメントを逐次、 常法によりライゲーシ ヨンしてこれらのフラグメントを結合して全域を含む cDNAを調製した （図 1 3参照 実施例 8
(全長 cDNAを含む発現ベクターの調製：動物細胞宿主系）
実施例 6または 7で得られた DNAを ΏιοΙ/Sal Iにて制限酵素消化し、 例えば pCAGベ クタ一 （Niwa, Η·， et al. Gene vol. 108, 193-199) 中の Sai lサイトにライゲーシ ヨンし、 その揷入向きと全長配列を自動 DNAシークェンサ一にて確認した。
実施例 9
(全長 cDNAを含む発現ベクターの動物細胞への形質転換）
実施例 8で調製した動物細胞用発現ベクターを 293細胞 （ヒト胎児腎細胞株） 、 He la細胞及び HepG2細胞を用いて、 以下の手順でトランスフエクトした。 まず初めにト ランスフエクシヨンの 2 4時間前に 1〜3 X 105個 Z35讓 dishで細胞を捲き、 その翌 日に上記発現ベクターを 1 当たり 2 1の Polyamine Transfect ion Reagentである TransIT (TAKARA社製） をとり、 Opt i_MEM等の無血清培地 100 に添加して、 試薬添 付文書に従い、 DNAとのコンプレックスを調製後、 準備しておいた前記各種細胞へ滴 下し、 2 ~ 8時間インキュベーションし、 その後、 培地交換し、 さらにその 3日後 G 418添加選択培地に交換した。 これからさらに 3日毎に培地交換を行い、 安定発現株 を作出した。 一例として、 C末端に FLAGェピトープタグを含むものの一時発現を図 14 に示す。 検出は抗 FLAG-M2抗体 （コダック社製） を用いたウェスタンプロット法によ り、 抗マウス Ig -アルカリフォスファターゼ酵素標識抗体系で染色して行った。 この 実施例に示す cDNAを用いた組換え発現体は、 還元下 250kDa程度の分子サイズを示し た。 そして、 この分子サイズは、 ヒト健常人血漿中にも存在することが認められた (後述する実施例 14項の図 18) 。 また、 この酵素は、 遺伝子のクローニングの際に 認められた al ternat ive spl icing産物 （配列番号 6〜21) などの存在、 糖鎖付加など の翻訳後修飾の違い、 あるいは精製工程中での分解に起因すると思われる複数の分 子種がヒト血漿中では存在することが確認されている （後述する実施例 14項の図 17 及び Gerri tsenら、 Blood vol. 98， 4-mi (2001) 記載） 。
次に、 組み換え体の WF切断活性を実施例 2に示した方法で確認した (図 15) 。 こ れらの結果、 本願発明のヒト血漿由来酵素及び遺伝子組換え産物は、 同じ vWFの切断 活性を示すことが確認された。
実施例 1 0
(部分 cDNAを含む発現ベクターの調製：大腸菌宿主系）
一例として当該蛋白質のメタ口プロテアーゼドメイン領域をコードしている部分 c DNAを、 例えば制限酵素サイトとして Ncolを付加し、 開始コドンを含むセンスプライ マー （配列番号 3 0 ) 及び Hindlllサイトを付加した終結コドンを含むアンチセンス プライマー （配列番号 3 1 ) を用いて、 前出の正常ヒト肝臓由来 Marathon-Ready1 M cDNAを铸型として、 もしくは実施例 6または 7で得られた cDNAを鍀型として、 TAKAR A LA Ta with GC rich bufferにて PCRの後、 Ncol/Hindlllにて消化、 大腸菌発現 用ベクターである例えば、 UTl (Soej ima et al.， J. Biochem. (Tokyo) vol. 130, 269-277 (2001) ) の Ncol/Hindlll消化物とライゲーシヨンし、，常法により、 大腸菌 コンビテントセル JM109にトランスフォーメーションした。 形成したコロニー群から 数クロ一ンをとり、 それらから遺伝子を調製したのち、 そのプラスミドベクタ一の インサート部位の核酸配列が配列番号 3 2と同等あるいは本質的に配列番号 3 3で 表されるポリペプチドをコードしている遺伝子であることを自動 DNAシークェンサ一 に一し確 δ忍した。
実施例 1 1
(部分 cDNAを含む発現ベクターの大腸菌菌体内発現）
実施例 1 0により構築した発現ベクターを導入した宿主大腸菌を 50 g/mlのアン ピシリンを含む LB培地 200ffll中に 30°C—晚前培養し、 それを 8リットルの LB培地を含 むフアーメンターに播種し、 600nmの濁度が 0. 2〜0. 5になるまで 30°Cにて培養した。 その後、 終濃度 lmMとなるようにィソプロピル - 1 -チォ - jS - D-ガラクトピラノシドを 添加して、 さらに一晩培養し、 当該蛋白質のメタ口プロテアーゼドメイン領域の発 現を誘導した。 そして、 培養した大腸菌を遠心機にて （30分 4°C) 集菌した。
続いて、 集菌した大腸菌ペレットを蒸留水にて再懸濁し、 終濃度 0. 6nig/inlのリゾ チームを添加して、 室温 30分撹拌後、 一晩 4°Cに静置し、 菌体を破砕した。 そして、 さらに超音波処理後、 遠心機にて （20分 4°C) 遠心分離し、 ペレットを回収し、 これ を 50DIMトリス lOfflM EDTA 1 トライトン X- 100 pH8. 0にて再懸濁した。 この遠心分離 、 超音波処理、 再懸濁操作を数回繰り返したのち、 ペレットを蒸留水に再懸濁し、 同様に遠心分離、 超音波処理、 再懸濁操作を数回繰り返し、 インクルージョンポデ ィーを回収した。 このインクルージョンボディは、 抗体作製の際の抗原として用い られた。
実施例 1 2
(他動物種ホモ口グ遺伝子の単離）
配列番号 1 5記載の核酸配列をプローブとして、 GenomeNet WWW server (ht tp ://w ww. genome, ad. j /)においてプログラム BLASTNにより、 ホモロジ一サ一チを行った結 果、 マウス染色体 1 0番にマップされる染色体クローン AC091762及び AC090008が得 られた。 この配列を基に、 配列番号 3 4に示す本酵素のマウスホモログを推定した 。 この配列から新たにプライマ一を設計し、 前述したヒト v WF切断酵素コード遺 伝子の単離同定で行った手法により、 ノザンプロット解析を行い、 ヒトと同様、 肝 臓で特異的に発現していることを確認した。 さらに、 正常マウス肝臓由来の Poly A+
RNA及び Marathoii-ReadyT M cDNA (CL0NTECH社製） を用いて、 ヒト同様、 R A C E 法により本酵素遺伝子の単離 ·同定を行った。 その結果、 配列番号 3 5、 3 6に示 す本酵素のマウスホモ口グの遺伝子配列が決定された。
決定されたこのマウスホモログ部分配列を基に、 前出のマウス染色体 1 0番の 5 ' 側の Exon/Int nm構造を決定し、 これを基に常法 (Gene Target ing: A Pract ial A pproac Firs t Edi t ion Edi ted by A丄 Joyner、 Teratocarc inomas and embryonic s tem cel l a pract ical approachなど） に従い、 ノックアウト （ノックイン） マ ウス作出用の夕ーゲッティングベクター作製が可能となり， 遺伝子変異マウスの作 製が可能となった。 また、 さらには、 本蛋白質を常法により組換え発現させること も可能である。
実施例 1 3
(抗体の作製及びその抗体を用いた本酵素の検出系の構築） マウス ·ゥサギに常法により （Current Protocols in Molecular Biology： Cha ter 11 i腿翻 logy、 Ant ibody Engineering: A PRACTICAL APPROACH Edi ted by J. McCAFFERTY et al.あるいは ANTIBODY ENGINEERING second edi t ion Edi ted by Carl A. K. BORREBAECKなど） 、 ヒト血漿より部分精製した抗原タンパク、 あるいはその 一部のアミノ酸配列を有する合成ペプチド （一つの例として、 本酵素のアイソフォ ームの一つの C末端領域のペプチド配列 （配列番号 3 7 ) P e-Ser-Pro-Ala-Pro-Gl n-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-Ser-Val-Gln-Ser-Ser) を場合に よっては至適なキャリアー物質 （KLH等） に結合させたもの （KLHを付加しやすくす るために Cysを N末端あるいは C末端などに付加したもの） 、 上述の遺伝子組換えタン パク質またはそれをコードする遺伝子を導入した発現ベクターを投与し、 モノクロ ーナル抗体発現ハイプリドーマの確立及びポリクローナル抗体 （抗血清） の作出を 行った。
続いて、 上記種々の方法により調製された抗体を用いて、 常法により （Current P rotocols in Molecular Biology： Cha ter 10 analys is of proteins、 Chapter 1 1 i腿 unologyなど） 、 本酵素のウエスタンプロット法による検出を行った。 具体的 には、 遺伝子組み換え体の発現の確認として、 実施例 9に示す手順で得られた組み 換え体発現 293細胞の培養上清の非還元状態での SDS- PAGEを行つた後、 PVDF膜への転 写後、 マウス、 ゥサギ等の抗血清により確認した （図 16) 。 その結果、 分子サイズ として 1 6 0〜2 5 O kDaの範囲に本酵素由来と想定されるバンドが検出された。 そ して、 次に、 原料血漿等と組換え体での本酵素の検出を非還元下で行ったところ、 1 0 5〜1 6 O kDaあるいは 1 6 0〜2 5 0 kDaにパンドが確認された （図 17) 。 ま た、 組換え蛋白質を免疫して確立したモノクローナル抗体 （Clone No. CPHSWH-10) においても同様な組換え体由来のバンドが検出できた。
さらに、 本酵素のアイソフオームの一つの C末端領域のペプチド配列 （配列番号， 3 7 ) Phe-Ser-Pro-Ala-Pro-Gln-Pro-Arg-Arg-Leu-Leu-Pro-Gly-Pro-Gln-Glu-Asn-S e r - Va卜 Gin- Se r- Se rを KLHに結合したものを免疫原として得られたぺプチド抗体によ り、 還元条件下、 健常人血漿、 TTP患者血漿あるいは、 組み換え体培養上清中から本 酵素の検出を行ったところ、 一部の TTP患者血漿では明瞭ではないが、 概ね 2 5 0 M) a程度の本酵素由来のシグナルと想定されるバンドが確認された （図 18) 。
またさらには、 得られた抗体を組み合わせることで構築される酵素免疫測定法 (EL ISA)により、 組換え夕ンパク質の培養上清レベルでの濃度依存的な検量線が作製で きた （図 19) 。 E L I S Aとしては以下の記述により例示されることができる。 得 られたマウス抗 vWF切断酵素抗体を Nunc社製 Maxisorpプレートに固相化し、 vWF切断 酵素一時発現 293細胞の培養上清を 1/1、 1/2、 1/4希釈したもの （0として、 Mock上 清） を 100 ^ 1ノゥエルで反応させ、 例えば 37°C 1時間後、 0. 05 %Tween20/TBSでプ レートを洗浄後、 ゥサギ抗 切断酵素抗体を例えば 100倍希釈濃度で 100 μ 1 Zゥ工 ルで反応させ、 例えば 37°C 1時間後、 0. 05 %Tween20/TBSでプレートを洗浄後、 さら にパ一ォキシダーゼ標識抗ゥサギ Ig抗体 （BioRad社製） を例えば 1000倍希釈濃度で 1 00 x 1 Zゥエルで反応させ、 例えば 37°C 1時間後、 0. 05 %Tween20/TBSでプレートを 洗浄後、 発色基質 TMBZを用いて一定時間の発色反応後、 停止液として 1 M硫酸にて反 応を停止させて、 450raiの吸光度を測定する。 これを応用することで、 様々な検体で の本酵素の定量が可能となった。
実施例 1 4
(抗体を用いた本酵素の精製）
得られた抗体を適当な固定化担体に結合させることでァフィ二ティ一力ラムを作 製し、 当該酵素の精製に供した。 ァフィ二ティーカラムの調製には、 チッソ社製 NHS 活性化セル口ファインを用いて、 添付文書に従い抗体を固定化した。 これにより調 製した約 l m lの膨潤担体を用いて、 実施例 9に示す当該酵素の 2 9 3細胞を宿主 とした遺伝子組換え体の発現培養上清をアプライしたのち、 50mM Tris-HCl 0. 1M Na CI pH7. 5 (以下 TBS) でカラムを洗浄後、 尿素を含んだ 0. 1Mグリシン PH3バッファー で溶出した。 溶出された画分を 1M Tris-HCl pH8. 5にて中和し、 TBSに対して透析し た。 得られた精製酵素の SDS-PAGEを図 2 0に示す。 また、 得られた精製画分に vWFを 切断する活性が存在することも確認された。 そして、 この組換え酵素により断片化 された vWFの切断点は、 その断片の N末端アミノ酸配列解析から 842Tyr- 843Metの位置 であることが確認された。 また、 実施例 1 3に示される方法により作製されたモノ クローナル抗体を用いても同様に精製に供することが可能なクローン （Clone No. C PHSWH- 7. 2および 10など） が確立された。
続いて精製された本酵素の部分アミノ酸配列を決定した。 常法により、 SDS-PAGE 後、 PVDF膜へトランスファーし、 風乾したのち、 PEアプライドバイオシステムズ社 のオートプロテインシークェンサ一 492にて解析を行った。 その結果、 部分 N末端配 列として Al a- Ala- Gly- Gly_I le-を有することが明らかとなった。 この配列は、 遺伝 子構造から推定された当該酵素の成熟体の N末端配列に一致した。
実施例 1 5
(抗体による本酵素活性の中和） . 前述の家兎ポリクローナル抗体による vWF切断酵素の中和活性を評価した。 遺伝子 組換ぇ ?切断酵素1〜10 8 /111 1 (ブラッドフォード法にて概算） に対して、 正 常家兎血清、 C末端領域のペプチド配列 （配列番号 3 7 ) Phe-Ser-Pro-Al a-Pro-Gl n - Pro_Arg- Arg- Leu- Leu- Pro- Gly_Pro- Gin- Glu- Asn- Ser_Va卜 Gin- Ser- Serを KLHに結 合したものを免疫原として得られた家兎抗血清、 および実施例 7、 8に示す発現べ クタ一により発現された蛋白質により免疫誘導された抗血清のそれぞれを体積比 ォ 1あるいは 5倍希釈した抗血清を 1対 1で予め 3 7 °Cで 1時間反応させた後、 前述した 方法で vWFの切断活性を評価したところ、 図 2 1に示すごとく蛋白質により免疫誘導 された抗血清で本酵素の阻害活性 (アン夕ゴニス卜活性) を有するものが調製され た （メタ口プロテアーゼのインヒビターである EDTAをコントロールとした。 ） 。 こ のことは、 単に中和抗体の作製が可能であるという知見のみならず、 vWF切断酵素に 対する自己抗体陽性の後天的 ΠΡ患者様のモデルを構築できる可能性も示唆している 実施例 1 6
(C末端削除改変体の構築）
図 2 2に示すストラテジーにより、 実施例 6， または 7により得られた全長の vWF 切断酵素遺伝子クロ一ニングベクター （pCR2. lvWFCP) を利用して、 C末端より逐次 ドメインを欠失させた変異体 （T1135s top、 W1016s top, W897s top、 T581s top、 Q449s top：それぞれの数字は開始コドン ATGのコードする Metから終結コドンまでのァミノ 酸の残基数を示し、 FLAGェピトープ （DNA配列： gactacaaggacgatgacgataagtga (配列 番号 4 7 ) 、 アミノ酸配列： Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys (配列番号 4 8 ) ) を付加した部位を示す。 この際に用いたプライマーは以下の通りであり、 Sはセンス プライマーを ASはアンチセンスプライマ一を示す。 Stu I-S (配列番号 3 8 ) 、 Acc I - S (配列番号 3 9 ) 、 Avr II-S (配列番号 4 0 ) 、 Q449stop-AS (配列番号 4 1 ) 、 T581stop-AS (配列番号 4 2 ) 、 W897stop-AS (配列番号 4 3 ) 、 W1016s top-AS ( 配列番号 4 4 ) 、 T1135stop-AS (配列番号 4 5 ) 、 Ful l length - AS (配列番号 4 6 ) ) 遺伝子を調製し、 実施例 8、 9同様の方法により、 pCAG発現ベクターに組み込 み、 Hela細胞にその発現ベクターを遺伝子導入した。 図 2 2上部の制限酵素地図下 に示すプライマー対を用いて PCRフラグメント（ から（F)を得て、 各 PCRフラグメン トを PCR2. lvWFCPにライゲ一シヨンした。 さらに、 Stu I/Sal I消化し、 フラグメン ト（A)および (B)を Stu I/Sal I消化してライゲーシヨンした。 また、 Acc I消化し、 フラグメント （C) を Acc I消化してライゲーシヨンした。 さらに、 Avr II/Sal I消 化し、 フラグメント )、 （E)および (F)を Avr II/Sal I消化してライゲーシヨンした 。 その結果、 C末端から^ 97位まで欠失した変異体においても、 定性的ではあるが 活性を有することが明らかになった。 こういったアプローチにより、 様々な機能ド メインの同定が可能になり、 当該ドメインを含む酵素活性を有しない分子のデザィ ンを行うことでアン夕ゴニストの設計あるいはその逆にァゴニス卜の設計が可能に なると考えられる。 産業上の利用可能性
本願発明によりもたらされた知見により、 血栓性血小板減少性紫斑病等の当該酵 素の欠損に起因する疾病患者への補充療法の可能性が拓かれる。 遺伝子のクローニ ング及び、 血清、 血漿からの効率的な精製法の確立が可能となる。 とりわけ今回の 情報により、 得られた塩基配列をもとに、 遺伝子組み換え化が可能となり、 従来困 難であった本願発明の酵素の安定的な生産、 供給が可能となり、 T T Pの患者への 当該酵素の補充療法、 あるいは新規な抗血小板薬として心筋梗塞、 脳梗塞における 血小板血栓抑制、 動脈硬化症の抑制、 P T C Aにおける再狭窄や再塞栓 ·梗塞の防 止、 P T C Rにおける再塞栓の防止、 HU Sや O— 1 5 7が原因となる血小板血栓 の予防への応用が可能となる。 また、 本酵素をコードする遺伝子あるいは当該酵素 に対する抗体を用いた診断及び治療が可能となる。 本明細書に引用されたすベての刊行物は、 その内容の全体を本明細書に取り込む ものとする。 また、 添付の請求の範囲に記載される技術思想および発明の範囲を逸 脱しない範囲内で本発明の種々の変形および変更が可能であることは当業者には容 易に理解されるであろう。 本発明はこのような変形および変更をも包含することを 意図している。

Claims

： 求の範囲
1. フォンビルブラント因子 (von Willebrand Factor：以下、 vWFと称するこ とがある）の 842 Ty r -843Me tの結合を切断し得る性状を有し、 部分配列 として Leu- Leu - Va卜 Ala- Valのアミノ酸配列または当該アミノ酸配列のうち 1もしく は数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたアミノ酸配列を含有するポリべ プチド鎖よりなる蛋白質分解酵素。
2. 成熟型蛋白質の N末端側部分配列として Ala- Ala- Gly_Gly- lie- Leu- His-Leu-G lu- Leu- Leu - Val- Ala - Valのアミノ酸配列または当該アミノ酸配列のうち 1もしくは 数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたァミノ酸配列を含有するポリぺプ チド鎖よりなる、 請求項 1に記載の蛋白質分解酵素。
3. 成熟型蛋白質の N末端側部分配列として、 配列番号 3もしくは 7で表される アミノ酸配列のうち 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたァ ミノ酸配列または前記のいずれかのアミノ酸配列の部分配列もしくは前記アミノ酸 配列を含有するポリペプチド鎖よりなる、 請求項 1または請求項 2のいずれかに記 載の蛋白質分解酵素。
4. 配列番号 16カ ら配列番号 21のいずれかに記載のァミノ酸配列のうち 1ま たは数個のアミノ酸が欠失、 置換または付加されたァミノ酸配列を含有するポリべ プチド鎖よりなる、 請求項 1から請求項 3のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素
5. 還元あるいは非還元条件下の SDS— PAGEにおいて 105〜： L 60kD aあるいは 160〜250 k D aの分子量を有する請求項 1から請求項 4のいずれ か 1項に記載の蛋白質分解酵素。
6. vWの 842Ty r— 843Me tの結合を切断する能力を有し、 部分配列と して Leu- Leu- Va卜 Ala-Valのアミノ酸配列または当該アミノ酸配列のうち 1もしくは 数個のアミノ酸が欠失、 置換もしくは付加されたァミノ酸配列を含有するポリぺプ チド鎖よりなる蛋白質分解酵素をコードする遺伝子断片。
7. 請求項 2から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素をコードする 遺伝子断片。
8. vWFの 842Ty r— 843Me tを切断し得る活性を有するポリペプチドを コードする塩基配列であって、 CTG CTG GTG GCC GTGからなる塩基 配列または当該配列のうち 1もしくは数個の塩基が欠失、 置換もしくは付加された 塩基配列を含有する、 前記請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分 解酵素をコードする DNA。
9. GCT GCA GGC GGC ATC CTA CAC CTG GAG CTG CTG GTG GCC GTGからなる塩基配列または当該配列のうち 1もしくは 数個の塩基が欠失、 置換もしくは付加された塩基配列を含有する、 請求項 8記載の 蛋白質分解酵素をコードする DNA。
10. 配列番号 6で表される塩基配列のうち 1もしくは数個の塩基が欠失、 置換 もしくは付加された塩基配列または前記のいずれかの塩基配列の部分配列または前 記塩基配列を含有する請求項 8または請求項 9記載の蛋白質分解酵素をコードする DNA。
11. 配列番号 15で表される塩基配列のうち 1もしくは数個の塩基が欠失、 置 換もしくは付加された塩基配列または前記のいずれかの塩基配列の部分配列または 前記塩基配列を含有する請求項 8から請求項 10のいずれか 1項に記載の蛋白質分 解酵素をコードする DNA。
12. 配列番号 6もしくは 15で表される塩基配列のうち 1もしくは数個の塩基 が欠失、 置換もしくは付加された塩基配列または前記のいずれかの塩基配列の部分 配列または前記塩基配列を含有する請求項 8または請求項 9記載の蛋白質分解酵素 をコードする DNAを含むことを特徴とするベクタ一。
13. ポリペプチドコード領域を含み、 当該ポリペプチドの発現に特化されるこ とを特徴とする請求項 12記載のベクター。
14. 請求項 12記載のベクターで形質転換またはトランスフエクトされた細胞
15. 請求項 13記載の発現べクタ一で形質転換またはトランスフエクトされた 宿主細胞。
1 6 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素を含有して 成る医薬品組成物。
1 7 . 遺伝子異常もしくは肝臓の疾病に伴う請求項 1から請求項 5のいずれか 1 項に記載の蛋白質分解酵素の活性低下による疾病の改善に適用される、 請求項 1 6 記載の医薬品組成物。
1 8 . 過剰量の vWF高分子マルチマーの生成に起因する血小板凝集の抑制に適 用される、 請求項 1 6または請求項 1 7に記載の医薬品組成物。
1 9 . 疾病が血栓性血小板減少性紫斑病である請求項 1 8記載の医薬品組成物。
2 0 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素に対する抗 体。
2 1 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素に対する抗 体であって、 当該酵素の活性を阻害もしくは中和し得る請求項 2 0記載の抗体。
2 2 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素に対する抗 体であって、 当該酵素のァフィ二ティー精製に用いられ得る請求項 2 0記載の抗体
2 3 . 請求項 2 2記載の抗体を使用してなる請求項 1から請求項 5のいずれか 1 項に記載の蛋白質分解酵素の精製方法。
2 4. 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素に対する抗 体を含有してなる医薬品組成物または診断薬。
2 5 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素のアン夕ゴ 二ストもしくは阻害剤あるいはァゴニストもしくは活性調節剤。
2 6 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素のアン夕ゴ ニス卜もしくは阻害剤あるいはァゴニストもしくは活性調節剤を含有してなる医薬 品組成物または診断薬。
2 7 . 請求項 8から請求項 1 1のいずれか 1項に記載の D NAまたは当該 D NA のアンチセンス D NAを含有して成る医薬品組成物または診断薬。
2 8 . 遺伝子異常もしくは肝臓の疾病に伴う、 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素の活性低下による疾病の改善を目的とする遺伝子治療 に用いられる、 請求項 2 7記載の医薬品組成物。
2 9 . メンブレンフィルタ一上での vWF及び vW切断酵素による酵素 ·基質反応の 後、 当該フィルタ一より基質サンプルを回収し、 ウェスタンブロッテイングに供す ることなく、 S D S— P A G Eに供し解析することを特徴とする vW切断活性の測定 方法。
3 0 . 請求項 2 9記載の方法により被験化合物の v 切断活性を測定することを含 む、 vWFを切断し得る化合物をスクリーニングする方法。
3 1 . ヒト血漿フラクション Iペーストを出発材料とする、 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素の調製方法。
3 2 . 請求項 1から請求項 5のいずれか 1項に記載の蛋白質分解酵素の他動物種 ホモログまたは相同な蛋白質。
3 3 . 請求項 3 2記載の当該蛋白質の他動物種ホモログまたは相同な蛋白質をコ 一ドする遺伝子。
3 4 . 請求項 3 2記載の当該蛋白質の他動物種ホモログまたは相同な蛋白質をコ 一ドする遺伝子を改変された動物。
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