WO2002087559A1

WO2002087559A1 - Agent d'ouverture du canal potassique

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Publication number: WO2002087559A1
Application number: PCT/JP2002/004085
Authority: WO
Inventors: Yuji Imaizumi; Tomohiko Ohwada
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co., Ltd.
Priority date: 2001-04-25
Filing date: 2002-04-24
Publication date: 2002-11-07
Also published as: US20060235072A1; JPWO2002087559A1; EP1421936A1; CA2445330A1; KR20040015145A; AU2003255184A1; CN1522142A; US7385083B2; US7495127B2; JP3973561B2; EP1421936A4; US20040116482A1

Description

明細書カリウムチャネル開口薬技術分野

本発明は力リゥムチャネル開口薬に関するものである。

カルシウム依存性カリウムチャネル（「BKチャネル」と呼ぶ場合もある。）は細胞膜上に存在し、カリウムイオンを選択的に透過させる蛋白質である。このチヤネル蛋白質は細胞内に面したアミノ酸配列にカルシウム結合部位を有しており、カルシウムの結合によりチャネル活性が増大する性質を有している。すなわち、細胞内カルシウム濃度の上昇により、単位時間あたりに個々のカルシウム依存性カリウムチャネルの開口している確率（開口確率）が増大し、細胞膜のカリウム透過性の上昇をもたらす。 3種類のカルシゥム依存性カリウムチヤネルが知られているが、これらのうち大コンダク夕ンス ·カルシウム依存性カリウムチャネルは血管、膀胱、気管支、消化管など各種臓器の構成要素である平滑筋及び中枢- 末梢神経に存在するが、心筋には発現していない。

細胞膜電位はナトリウム、カリウム、塩素、カルシウムなどのイオンの細胞膜透過性のバランスで決定されるため、力リゥムチャネル開口率が選択的に上昇するとカリウム透過性が優位になり、細胞は過分極する。従ってカルシウム依存性カリウムチャネルの開口は、例えば平滑筋細胞を過分極させ、電位依存性カルシゥムチャネルの活性を低下させ、細胞外液からカルシウム流入を抑制する。その結果として、細胞内カルシウム濃度が減少し、平滑筋が弛緩する。従って、カルシゥム依存性カリウムチャネルの開口は、本態性高血圧症、緊張性膀胱、気道過敏症などの病態において定常的に収縮気味 (過緊張)の平滑筋組織を弛緩させる。また強い刺激が加わり、過剰活動（過興奮）によりカルシウム濃度が上昇している神経細胞に対しても過分極を介した興奮抑制作用を示す。逆に、 BKチャネル閉口作用を持つ化合物のマウス中枢神経への投与は痙攣をもたらす。このように、カルシウム依存性力リゥムチャネルを含む力リゥムチャネル活性変化による病態が近年明らかになつたため、カリウムチャネル作用薬による治療についての可能性は益々増大している。その中でも、カルシウム依存性カリウムチャネル開口薬は最も注目されつつあるものの 1つである（Shieh, C.C. , et al.， Pharmacol. Rev. , 52, pp.557-593, 2000)。

カルシウム依存性力リゥムチャネル活性化作用を持つ物質としては、天然物から単離された Maxikdiol (Singh, S.， et al. , J. Chem. Soc. Perkin. Trans. I, pp.3349-3352, 1994 )、 Dehydrosoyasaponin-I (McManus, O.B. , et al.₅ Biocchemistry, 32, pp.6128 -6133, 1993)、 L-735,334 (Lee, S.H. , et al. , J. Nat. Prod. , 58， pp.1822 -1828， 1995 )、合成化合物としてデンマークのニューロサ一チ社ゃ米国のブリストルマイャ一ズスクィブ社が開発している NS- 1619および関連化合物（Olesen, S.P. et al. , 欧州特許公開 0477819A2、 Olsen, S.P. et al. , Euro. J. Pharmacol. , 251, pp.53-59, 1994) などが知られている。

axikaioi しかしながら、 Dehydrosoyasaponin-Iと L- 735， 334は比較的分子量が高く、かつ作用様式に難点があり、 NS- 1619 関連化合物は活性が低く、作用が特異的でないという問題を有している。また、 Maxikdiolは優れた活性を有しているものの、天然物であり入手が極めて困難である。従って、 Maxikdiol と同等またはより高い BKチャネル開口活性を有し、作用の特異性の高い薬剤の開発が切望されている _c 発明の開示

本発明の課題は、カリウムチャネル開口薬、好ましくはカルシウム依存性力リゥムチャネル開口薬を提供することにある。より具体的には、 Maxikdiol と同等またはより高い BKチャネル開口活性を有し、かつその作用が特異的な力リゥムチャネル開口薬、好ましくはカルシウム'依存性力リゥムチャネル開口薬を提供することが本発明の課題である。本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意研究を行つた結果、 Pimaric acid及びその類縁ィ匕合物が極めて優れた力リゥムチャネル開口作用を有しており、しかもその作用が特異的であることを見出しした。本発明は上記の知見を基にして完成されたものである。

すなわち、本発明は、下記の一般式（I )：

(式中、、 R²、 R³、 R\ \ R⁶、及び R⁷はそれそれ独立にアルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシ基、ァリール基、ァシル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシルサム酸基（-C(0)N¾0H)、スルホン酸基 (- S0₃H)、力ルバモイル基 (- C0NH₂)、スルホン酸アミド基 ( -S0₂N¾)、アルデヒド基、又は二トリル基を示し、 R⁴及び R⁵は互いに結合して環を形成してもよく、 R⁶ 及び R⁷は互いに結合して環を形成してもよく、 zzzzで表される 3つの結合はいずれも単結合であるか、又は 3つの結合のうちの 1つの結合が二重結合であり、他の結合は単結合である）で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含むカリウムチャネル開口薬を提供するものである。

この発明の好ましい態様によれば、 II¹、 \ R\ 及び R⁵がアルキル基又はアルケニル基であり、 R⁶及び R⁷が水素原子であり、がカルボキシル基である化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む上記の力リゥムチャネル開口薬が提供される。より好ましい態様として、下記の化合物：（l)R¹がアルキル基であり、 R²がカルボキシル基であり、 R³がアルキル基であり、 R⁴がアルケニル基であり、 R⁵がアルキル基であり、 R⁶及び R⁷が水素原子である化合物、（Z)R¹がアルキル基であり、 R²がカルボキシル基であり、 R³がアルキル基であり、 R⁴がァルキル基であり、 R⁵がアルケニル基であり、 R⁶及びが水素原子である化合物、及び (3) R¹がアルキル基であり、 R²がカルボキシル基であり、 R³がアルキル基であり、 R⁴がアルキル基であり、 R⁵がアルキル基であり、 R⁶及びが水素原子である化合物、並びに生理学的に許容されるそれらの塩からなる群から選ばれる物質を有効成分として含む上記の力リウムチャネル開口薬が提供され、さらに好ましい態様として、ピマル酸、ジヒドロピマル酸、サンダラコピマル酸、イソピマル酸、及びジヒドロイソピマル酸、並びに生理学的に許容されるそれらの塩からなる群から選ばれる物質を有効成分として含む上記の力リゥムチャネル開口薬が提供される。

また、本発明により、下記の一般式（II)：

(式中、 R^u、 R¹², R¹³、 R¹⁴、 R¹⁵、 R¹⁶、 R¹⁷、 R¹⁸、 R¹⁹、 R²⁰ヽ及び R²¹はそれそれ独立にアルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシ基、ァリール基、ァシル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシルサム酸基、スルホン酸基、力ルバモイル基、スルホン酸アミド基、アルデヒド基、又は二トリル基を示し、 R 及び R²¹は互いに結合してォキソ基を形成してもよい）で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む力リゥムチヤネル開口薬が提供される。

この発明の好ましい態様によれば、 R^u、 R¹³, 及び R¹⁸がアルキル基であり、 R¹² がカルボキシル基であり、 R¹⁴、 R¹⁵、及び R¹⁶が水素原子である化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む上記のカリウムチャネル開口薬が提供され、さらに好ましい態様によれば、 R^u、 R¹³、及びがアルキル基であり、 R¹²がカルボキシル基であり、 R¹⁴、 R¹⁵、 R¹⁶、 R²⁰、及び R²¹が水素原子であり、 R¹⁷ 及び R¹⁹がハロゲン原子である化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む上記力リゥムチャネル開口薬が提供される。

本発明により提供される上記のカリウムチャネル開口薬は好ましくはカルシゥム依存性力リゥムチャネル開口薬であり、例えば、本態性高血圧症、緊張性膀胱、気道過敏症、又は虚血性中枢神経障害の予防及び/又は治療に用いることができる。

別の観点からは、本発明により、上記のカリウムチャネル開口薬の製造のための上記一般式（I )又は一般式 (Π )で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩の使用；本態性高血圧症、緊張性膀胱、気道過敏症、又は虚血性中枢神経障害の予防及び Z又は治療方法であって、上記一般式（ I )又は一般式（ II )でされる化合物又は生理学的に許容されるその塩の予防及び Z又は治療有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；及びヒトを含む哺乳類動物において力リゥムチャネル、好ましくはカルシウム依存性カリウムチャネルを開口させる方法であって、上記一般式（ I )又は一般式（ 11 )で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法が提供される o

また、ヒトを含む哺乳類動物における平滑筋を弛緩する方法であって、上記一般式（I)又は一般式（Π)で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；ヒトを含む哺乳類動物において中枢神経を保護する方法であって、上記一般式（I )又は一般式（Π)で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；ヒトを含む哺乳類動物における平滑筋を過分極する方法であって、上記一般式 ( I )又は一般式（II )で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法；並びにヒトを含む哺乳類動物における中枢神経細胞を過分極する方法であって、上記一般式（I)又は一般式（II )で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩の有効量をヒトを含む哺乳類動物に投与する工程を含む方法提供される。図面の簡単な説明

第 1図は、ピマル酸を投与したときのチャネル活性ィ匕の結果を示す。上段及び下段はそれぞれ時間経過の早いトレース及び時間経過の遅いトレースを示す。第 2図は、ピマル酸の投与前、投与後、 10//M投与後、及び洗浄後の単一 BKチャネル電流値（横軸）と単位時間あたりの出現頻度（横軸）のヒストグラムを示す。図中、 CONTROLは対照、 1〃Mは 1 μΆ投与後、 10 Μは 10 ζΜ投与後、 WASH OUTは洗浄後の結果を示す。

第 3図は、ピマル酸の濃度と BKチャネル活性化作用の関係を示す。横軸は開口確率（NPo)、横軸はピマル酸の濃度を示す。

第 4図は、一般式（II )で表される化合物の代表的化合物としてジクロロデヒドロアビエチン酸を投与したときのチャネル活性化の結果を示す（Whole-cell電流記録)。図中、 Aは薬物投与にともなう経時変化を示し、 Bは図 Aに示した各点での電流の原トレースを示し、 Cは 3種の被検薬物について B K ( α + ?1)電流増強作用についての用量-作用関係を示した図である。図 C中、〇はジクロロデヒドロアビエチン酸（2Cl 'DhA)、口はアビェチン酸 (AbA)、 ▲はピマル酸 (PiA)の結果を示す。

第 5図は、一般式（II )で表される化合物の代表的化合物としてジクロロデヒドロアビエチン酸を投与したときのチャネル活性化の結果を示す（single -channel 電流記録)。図中、 Aは保持電位を +40 mV にしチャネルの開口確率の変化を観察した結果を示し、 Bは原トレースから作成した開閉口現象のヒストグラムを示し、 Cは濃度作用関係を示す。発明を実施するための最良の形態

本明細書において用いられる用語の意味は以下のとおりである。

「アルキル基」と言う場合には、直鎖状、分岐鎖状、環状、又はそれらの組み合わせのいずれでもよく、例えば炭素数 1から 12個、好ましくは炭素数 1から 8 個、より好ましくは炭素数 1から 6個、特に好ましくは炭素数 1から 4個程度のアルキル基を用いることができる。本明細書において言及するアルキル部分を有する置換基（例えばアルケニル基、ハロゲン化アルキル基、アルコキシ基、ヒドロキシアルキル基など）のアルキル部分についても同様である。

アルケニル基に含まれる二重結合の位置及び個数は特に限定されないが、二重結合の数は 1から 3個であることが好ましく、より好ましくは 1又は 2個であり、特に好ましくは 1個である。アルケニル基としては、ァリル基又はビニル基が好ましく、特に好ましいのはビニル基である。二重結合について幾何異性が生じる場合には二重結合の配置は Z又は Eのいずれでもよい。

「ハロゲン原子」（又は「ハロゲン」）と言う場合には、フヅ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよい。「ハロゲン化アルキル基」上に存在するハロゲン原子の種類、個数、及び置換位置は特に限定されず、ハロゲン原子としてはフッ素原子、塩素原子、臭素原子、又はヨウ素原子のいずれでもよいが、フッ素原子又は塩素原子が好ましい。ハロゲン化アルキル基としては、例えばトリハロゲン化メチル基が好ましく、特に好ましいのはトリフルォロメチル基又はトリクロロメチル基である。

「ヒドロキシアルキル基」上に存在するヒドロキシ基の個数及び置換位置は特に限定されないが、好ましくは 1から 4個程度であり、より好ましくは 1又は 2 個、特に好ましくは 1個である。ヒドロキシアルキル基としては、例えばヒドロキシメチル基が好ましい。「ァミノアルキル基」に存在するァミノ基の個数及び置換位置は特に限定されないが、好ましくは 1から 4個程度であり、より好ましくは 1または 2個、特に好ましくは 1個である。アミノアルキル基としてはァミノメチル基が好ましい。

「ァリ一ル基」としては、単環性又は縮合環性のァリ一ル基の、ずれでもよく、例えば、フエニル基又はナフチル基などを用いることができる。ァリール基は 1 個又は 2個以上のへテロ原子を璟構成原子として含んでいてもよい。こような例としてピリジル基、フリル基、チェニル基、又はピロリル基などを挙げることができる。「ァシル基」はベンゾィル基などのァリールカルボニル基、又はァセチル基などのアルカノィル基のいずれでもよい。

R¹, R²、 R³、 \ 及び R⁷、並びに R^u、 R¹²、 R¹³、 R¹⁴、 R¹⁵、 R¹⁶, R¹⁷、 R¹⁸、 R¹⁹、 ² 及び R²¹が示すアルキル基、アルケニル基、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アルコキシ基、ァリール基、ァシル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシルサム酸基、力ルバモイル基、又はスルホン酸アミド基は、さらに 1個又は 2個以上の置換基を有していてもよい。置換基の種類、置換位置、及び個数は特に限定されず、 2個以上の置換基を有する場合には、それらは同一でも異なっていてもよい。例えば、ァリール基が置換基を有する場合としてフルオロフェニル基、ヒドロキシフヱニル基などを挙げることができ、ァシル基が置換基を有する場合として、例えばクロ口ベンゾィル基、トリフロロァセチル基などを挙げることができるが、置換基の例はこれらに限定されることはない。

本明細書において示される上記一般式（I )又は一般式（Π )で表される化合物において、特に立体化学を表示していない場合には、任意の立体異性体であることを意味しており、純粋な形態の任意の立体異性体のほか、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体、ジァステレォ異性体の混合物などが本発明の範囲に包含される。一般式 ( I)で表される化合物の好ましい例として、以下の化合物群 A 1から A 4を挙げることができる。下記 A 1から A 4までの式中の立体配置は絶対配置を示す。

A1 A2 A3 A4

R¹. R³、 R⁴、及び R⁵はそれぞれ独立にアルキル基又はアルケニル基であることが好ましい。 β¹がアルキル基であり、 R³がアルキル基であり、 R⁴がアルケニル基であり、かつ R⁵がアルキル基であるか、 R¹がアルキル基であり、 R³がアルキル基であり、がアルキル基であり、かつ R⁵がアルケニル基であることがより好ましく、 R¹がメチル基であり、 R³がメチル基であり、 R⁴がビニル基又はェチル基であり、かつ R⁵がメチル基であるか、 R¹がメチル基であり、 R³がメチル基であり、 Β⁴がメチル基であり、 Ε⁵がビニル基又はェチル基であることがさらに好ましい。

Β²はカルボキシル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシルサム酸基、スルホン酸基、力ルバモイル基、スルホン酸アミド基、アルデヒド基、又は二トリル基であることが好ましく、カルボキシル基又はアルコキシカルボニル基であることがより好ましい。 R⁶及び R⁷はともに水素原子であることが好ましい。特に好まし、化合物は下記のィ匕合物である。

Pimaric acid Dihydropimaric acid

Sandaracopimaric Isopimaric acid Dihydroisopimaric

acid acid 上記に示した特に好ましい化合物のうち、ピマル酸 (Pimaric acid)は樹脂酸性成分として公知の化合物である。また、サンダラコピマル酸（Sandaracopimaric acid)、イソピマル酸（ Isopimaric acid)、及びジヒドロイソピマル酸 (dihydroisopimaric acid)も市販品を入手することができる。上記一般式（I )で表される化合物は、例えば上記のピマル酸、ジヒドロピマル酸、サンダラコピマル酸、イソピマル酸、又はジヒドロイソピマル酸を出発原料として、当業者に周知の官能基変換を行うことにより製造することができる。例えば、ピマル酸において R⁴として存在するビニル基を通常の手段により還元することにより、 R⁴がェチル基のジヒドロピマル酸を製造す ¾ことができ、として存在するカルボキシル基をエステル化することにより、 R²がアルコキシカルボニル基である化合物を製造することができる。

また、一般式 ( II)で表される化合物において、好ましい立体化学は下記に示すとおりであり（式中の立体は絶対配置を示す)、 R^u、 H¹³、及び R¹⁸がアルキル基であり、 R¹²がカルボキシル基であり、 R¹⁴、 R¹⁵、及び R¹⁶が水素原子であることが好ましく、より好ましくは、 R^u、 R¹³、及び R¹⁸がアルキル基であり、 R¹²がカルポキシル基であり、 R^M、 R¹⁵、 R^2fl、及び R²¹が水素原子であり、 R¹⁷及び R¹⁹がハロゲン原子である。 ¹及び H¹³が示すアルキル基としてはメチル基が好ましく、 R¹⁸ が示すアルキル基としては、ェチル基、 n—プロピル基、イソプロピル基、 n—ブチル基、 sec—ブチル基、 tert—ブチル基などが好ましい。 R¹⁸が示すアルキル基として特に好ましいのはイソプロピル基である。 R¹⁷及び R¹⁹が示すハロゲン原子としては塩素原子が好ましい。

また、一般式（II )で表される化合物において、 R^2flがヒドロキシ基であり、かつ R²¹が水素原子である化合物、及び I 及び R²¹がー緖になってォキソ基を形成した化合物も好ましい。例えば、 R"、 R¹³、及び R¹⁸がアルキル基であり、 R¹²がカルボキシル基であり、 R¹⁴、 R¹⁵、及び R¹⁶が水素原子であり、 R¹⁷及び R¹⁹がハロゲン原子又は水素原子であり、 R^2flがヒドロキシ基であり、 R²¹が水素原子である化合物、及び R^u、 R¹³、及ぴ R¹⁸がアルキル基であり、 R¹²がカルボキシル基であり、 R¹⁴、 R¹⁵、及び R¹⁶が水素原子であり、 R¹⁷及び R¹⁹がハロゲン原子又は水素原子であり、 R^2fl 及び R²¹がー緖になってォキソ基を形成した化合物が好ましい。より具体的には、好ましい一般式（II )の化合物として下記の化合物を例示することができ、これらのうち（1 )で表される化合物が特に好ましい。下記の（1)から（3)の化合物はいずれも市販されている。

(1) (2) (3) 本発明のカリウムチャネル開口薬の有効成分としては、上記一般式 ( I )又は一般式（I I )で表される化合物のほか、置換基の種類に応じて生理学的に許容されるその塩を用いることができる。塩の種類は生理学的に許容されるものであれば特に限定されず、酸付加塩、塩基付加塩のいずれであってもよい。酸付加塩としては、例えば、塩酸塩、硫酸塩、硝酸塩などの鉱酸塩、 p—トルエンスルホン酸塩、メ夕ンスルホン酸塩、シユウ酸塩、マレイン酸塩、酒石酸塩などの有機酸塩を挙げることができ、塩基付加塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩などの金属塩、アンモニゥム塩、トリェチルァミン塩、ェチルァミン塩などの有機ァミン塩を挙げることができる。ダリシンなどのアミノ酸との塩を用いてもよい。

本発明の力リゥムチャネル開口薬の有効成分としては、遊離形態の化合物又は生理学的に許容されるその塩のほか、それらの任意の水和物又は溶媒和物を用いてもよい。溶媒和物を形成する溶媒の種類は特に限定されないが、例えば、ァセトン、エタノール、テトラヒドロフランなどを挙げることができる。また、上記一般式（I )又は一般式（I I )で表される化合物は、上記式中に含まれる不斉炭素のほか、置換基の種類に応じてさらに 1個以上の不斉炭素を有する場合がある。従つて、このような不斉炭素の存在に基づいて光学活性体又はジァステレオ異性体などの立体異性体が存在する場合があるが、純粋な形態の立体異性体、立体異性体の任意の混合物、ラセミ体などを本発明の力リゥムチャネル開口薬の有効成分として用いてもよい。

いかなる特定の理論に拘泥するわけではないが、本発明の力リゥムチャネル開口薬は血管、膀胱、気管支、消化管など各種臓器の構成要素である平滑筋及び中枢 ·末梢神経に存在するカルシゥム依存性カリウムチャネル蛋白質に作用し、単位時間あたりに個々のカルシウム依存性力リゥムチャネルの開口している確率

(開口確率）を増大させ、細胞膜のカリウム透過性の上昇をもたらす。この結果として、平滑筋細胞を過分極させ、電位依存性カルシウムチャネルの活性を低下させる。そして、細胞外液からカルシウム流入を抑制することにより平滑筋を弛緩させ、神経細胞をカルシウム過負荷による障害から保護する。

従って、本発明の力リゥムチャネル開口薬は、本態性高血圧症を含む高血圧症、緊張性膀胱、末梢循環障害、気道過敏症、知覚神経過敏症、中枢性痙攣などの疾患において定常的に収縮気味（過緊張）の平滑筋組織を弛緩させることができ、これらの疾患の予防及び/又は治療のための医薬として有用である。また、中枢及び末梢神経細胞、特に中枢神経細胞を保護するための医薬としても有用である。もっとも、本発明のカリウムチャネル開口薬の適用対象は、上記の特定の疾患に限定されることはなく、平滑筋を弛緩させることによって予防及び z又は治療が可能な各種の疾患や神経細胞を保護することによつて予防及び/又は治療が可能な各種の疾患に対して適用可能である。

本発明の力リゥムチャネル開口薬は、上記の式（I )又は一般式（II)で表される化合物及び生理学的に許容されるその塩、並びにそれらの水和物及び溶媒和物からなる群から選ばれる物質の 1種又は 2種以上を有効成分として含んでてもよい。本発明の医薬としては上記物質それ自体を投与してもよいが、好ましくは、当業者に周知の方法によって製造可能な経口用あるいは非経口用の医薬組成物として投与することができる。経口投与に適する医薬用組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、液剤、及びシロップ剤等を挙げることができ、非経口投与に適する医薬組成物としては、例えば、注射剤、点滴剤、坐剤、吸入剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、軟膏剤、クリーム剤、経皮吸収剤、経粘膜吸収剤、及び貼付剤等を挙げることができる。

上記の医薬組成物は 1種又は 2種以上の製剤用添加物を加えて製造することができる。製剤用添加物としては、例えば、賦形剤、崩壊剤ないし崩壊補助剤、結合剤、滑沢剤、コ一ティング剤、色素、希釈剤、基剤、溶解剤ないし溶解補助剤、等張化剤、 pH調節剤、安定化剤、噴射剤、及び粘着剤等を挙げることができるが、これらは医薬用組成物の形態に応じて当業者が適宜選択可能である。

本発明の力リゥムチャネル開口薬の投与量は特に限定されず、その作用の種類や作用の強弱などに応じて適宜選択することができ、さらに患者の体重や年齢、疾患の種類や症状、投与経路など通常考慮すべき種々の要因に応じて、適宜増減することができる。一般的には、経口投与の場合には成人一日あたり 0.01 〜 1,000 mg程度の範囲で用いることができる。実施例

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されることはない。実施例に用いたピマル酸は米国 ICN社より購入した。例 1

(A)実験系

カルシウム依存性カリウムチャネル（以下、実施例において「M チャネル」と略す）は 2種の蛋白質 α (ΒΚα )及び 5 (BK^ )サブュニヅトが各 4つずつ会合して機能する。 BK はチャネル本体を形成し、 BK ?は活性調節因子である。 BKチヤネル開口作用を選択的に検出するために、本来的にそれを持たない培養細胞（ヒト胎児腎臓由来培養細胞 HEK293細胞）に BKチャネルを遺伝子導入により人為的に発現させ、探索実験系を構築した。 Ahringらの方法（Ahring P.K. , et al.， FEBS Lett. , 415, pp.67-70, 1997) に準じて、ラヅト子宮平滑筋由来 BK と遺伝子 cMA (GenBank accession numbers; U55995 および AF020712 ) を HEK293細胞へリン酸カルシゥム沈殿法により導入し、 BKひあるいは BKひ^を定常的に高発現させた。

(B)測定法と結果

(a) Inside-out patch clamp法による単一チャネル電流記録

Inside-out patch clam 法により、チャネルを含む細胞膜の断片を単離して細胞膜内側の環境を人為的に調節しながら、単一チャネルの開閉を直接観察することができる。チャネル機能解析法としてだけでなく、チャネル作用薬の定量的な効力検定を行うためにも、充分に確立された方法である（Hamil, O .P. , et al.， Pfl gers Archiv. , 391, pp.85 -100, 1981)。本測定で用いられた HEK293細胞に発現した BKひ及び ΒΚ α ^は、パヅチ膜内外の溶液が 140mM Kを含む場合に、単一チヤネルコンダクタンスがどちらも 230-240 p Sを示し、これまでの文献に良く適合する性質を有することを確認した。

この条件下でピマル酸の BKひに対する作用と効力を測定した。図 1の上段はパヅチ膜電位を細胞内面が外面に対して +40 mVの状態で、細胞内面の Ca濃度が 0.1 μ の場合の ΒΚ α単一チャネル記録を示す (上段;下向き矩形がチャネル開口による電流を示す)。ピマル酸を細胞内面側の溶液に以下の濃度で加えると、チャネル活性が著しく上昇し（中段)、ピマル酸の除去によりその作用は消失した。図 2には、このような電流記録を 30秒間連続して行った結果をヒストグラムとして示した。 Current Amplitude の 0 pAは閉口を意味する。ピマル酸を 1 /M又は 10 Mの濃度で加えることにより、開口した状態の時間が増加し、特に 10 z Mでは 2つのチャネルが同時に開口する場合があることが示された。図 3にこの条件下でのピマル酸の濃度と BKチャネル活性化作用の関係を示す。ピマル酸 3 M以上の濃度で顕著な開口確率上昇が認められた。また、細胞内面側 Ca濃度が 0.3 μΆ, パッチ膜電位 +40 mVの場合には、 1 /Mで開口確率が 3倍となった。

(b)Whole cell voltage- clamp法による膜電流記録

BKひチャネルの開口による細胞全体の膜電流を Whole eel 1 voltage -clamp法により記録した。この方法は細胞膜上に多数発現したイオンチヤネルが総和としてどのような機能を示すかを検討するために頻用され、やはり充分に確立された方法である（Hajnill, O.P.上掲書）。 BKひチャネルを発現させた単一 HEK293細胞にこの方法を適用したところ、細胞外液に加えた 1 の化合物 IVは +60 mVにおける BKひ電流を約 50%増大させ、顕著な開口作用を示した。ピマル酸の作用は BKチャネル抑制薬の 1 mM tetraethylajnmoniumにより完全に抑制されたことからも BKチヤネル開口作用であることが確認された。

以上の結果から、ピマル酸が BK に作用し BKチャネル開口作用を示すこと、細胞外液に投与することにより作用が発現し、洗浄により速やかに作用が消失することが示され、その作用は Maxikdiolの文献上の効力と比較して少なくとも 3 倍以上であった。 BKチャネル開口作用の知られている公知化合物である NS-1619 と比較すると 10倍以上の効力を持つと考えられる。これらの結果から、ピマル酸が BKチャネル開口薬として極めて有用であると結論できた。例 2

一般式 ( II)で表される化合物として上記に示した化合物 (1) (ジクロロデヒドロァビエチン酸： dichrolodehydroabietic acid) を用いて BKチャネル開口作用を検討した。

(1)材料と方法

(a) hole cell電流記録

whole-cell patch clamp法によりラヅト由来 BK + ^1サブュニヅトを定常的に発現させた HEK293細胞全体の電流を記録した。実験は全て 22-24°Cで行った。溶液：

ピぺヅト内液（mM) 140 KC1, 4 MgCl ₂₅ 5 ATP, 10 HEPES, 5 E6TA (pCa を固定するために CaCl₂を適量加え、 pCa6.5に調整）。 pHは K0Hにより 7.2に調整した。細胞外液 (mM) 137 NaCl₃ 5.9 KC1, 2.2 CaCl, 1.2 MgCl ₂, 14 Glucose, 10 HEPES pHは NaOHにより 7.4に調整した。

(b) Single-channel電流記録

inside-out patch clamp法によりラット BKひ + ? 1サブュニットを定常的に発現させた HEK293細胞で単一チャネル電流を記録した。実験は全て 22-24°Cで行つ o

溶液：

細胞内液 (mM) 140 KC1, 1.2 MgCl ₂₃ 14 Glucose, 5 EGTA ( Ca を固定するために CaCl₂を適量加え、 pCa7に調整）。 pHは NaOHにより 7.2に調整した。

細胞外液 (mM) 140 KC1, MgCl₂, 5 ATP, 10 HEPES, 0.05 EGTA pH は K0H により 7.2に調整した。被検薬物は脂溶性が高く、水に難解であるので DMS0で溶解して 30 mMのストヅクソリューションとして保存した。投与に際し、 DMS0の溶液中の最終濃度は最高でも 0.03%とした。なお、 DMS0は 0.3%以下では BK電流になんら影響を及ぼさないことを確認している。

(2)結果

BK (ひ + ^ 1 )チャネルを定常的に発現させた細胞に対し、 Whole- cell patch clamp 法により細胞全体の電流を記録した。このとき細胞内液の Ca²⁺濃度は Ca²⁺-EGTA緩衝液により pCa6.5 に固定している。保持電位- 60 mVから +10 mVへ脱分極パルスを 150ミリ秒加えて、惹起される電流を観察した。脱分極刺激により、 ΒΚ( α + /51)チャネル特有の緩徐に活性化される外向き電流が観察された

(図 4Β) の control)。 Whole- cell確立後、約 20分後安定した電流測定が得られたところで記録を開始した。 100 nMの被検薬物を投与したところ電流はやがて増強され、さらに薬物濃度を上げていくとそれに応じて電流が大きくなつていくのが観察された。その後、洗浄により電流はほぼ投与前のレベルにまで戻った（図 4A) o この活性化作用は 4例の記録をもとに統計解析したところ 100 nMで電流を 1.90±0.21倍に、 300 nMで 2.54±0.14倍に、そして 1 Μで 6.37±0.91倍に活性化させた。これは pimaric acidが 1〃Mで電流を 1.92±0.24倍活性化させるのに比べて明らかに効力が強いことを示している（図 4C )。

BKチャネルは細胞内の Ca²⁺濃度上昇により活性化する。そのため、被検薬物に細胞内 Ca²⁺を上昇させる作用があれば、それによつてもチャネルの活性化が起こることになる。そこで、 whole-cellの記録に際して、ピぺヅト内液に 5 mM EGTA と CaCl₂を加えることによって細胞内 Ca²⁺濃度を pCa6.5付近に緩衝させて、影響をほとんど排除させている。

さらにこの点を確認するために単一チャネルでの電流測定を行った。 ΒΚ( α + β 1)チャネルを定常的に発現させた細胞に対し、 inside-out patch clamp法により単一チャネルの電流を記録した。このとき細胞内液（細胞膜の内側に接する液）は pCa7.0に固定した。保持電位を +40 mVにしチャネルの閧ロ確率の変化を観察した。被検薬物を細胞内膜側に投与すると 100 nM以上でチャネルの活性化が見られ、洗浄により作用は消失した（図 5A)。原トレースから開閉口現象のヒストグラムを作成した。薬物投与に伴ってチャネル開口を示す 10 pA付近のピークが大きくなり、洗浄により作用は消失した（図 5B)。このヒストグラムをもとにチヤネル開口確率を算出して濃度作用関係を図 5 C を得た。この結果から、被検薬物の作用が濃度依存的であることが分かる。産業上の利用可能性

本発明の医薬は極めて優れたカリウムチャネル開口作用を有しており、しかもその作用が特異的であることから、本態性高血圧症、緊張性膀胱、気道過敏症、又は虚血性中枢神経障害の予防及び/又は治療に有用である。

Claims

請求の範囲

1 .下記の一般式 ( I )：

(式中、 II¹、 R²、 R³、 R⁴、 R⁵、 R⁶、及び R⁷はそれぞれ独立にアルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシ基、ァリール基、ァシル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシルサム酸基、スルホン酸基、カルバモィル基、スルホン酸アミド基、アルデヒド基、又は二トリル基を示し、 R⁴及び R⁵ は互いに結合して環を形成してもよく、 R⁶及び R⁷は互いに結合して環を形成してもよく、 ZZZZで表される 3つの結合はいずれも単結合であるか、又は 3つの結合のうちの 1つの結合が二重結合であり、他の結合は単結合である）で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含むカリウムチャネル開口薬。

2 . R¹, R³、 R⁴、及ぴ R⁵がアルキル基又はアルケニル基であり、 R⁶及びが水素原子であり、 R²がカルボキシル基である化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む請求の範囲第 1項に記載の力リウムチャネル開口薬。

3 .下記の化合物：（l)R¹がアルキル基であり、 R²がカルボキシル基であり、 R³がアルキル基であり、 E⁴がアルケニル基であり、 R⁵がアルキル基であり、 R⁶及び R⁷ が水素原子である化合物、 ¹がアルキル基であり、 R²がカルボキシル基であり、 R³がアルキル基であり、がアルキル基であり、 R⁵がアルケニル基であり、 R⁶及び R⁷が水素原子である化合物、及び (3) R¹がアルキル基であり、 R²がカルボキシル基であり、 R³がアルキル基であり、 R⁴がアルキル基であり、 E⁵がアルキル基であり、 R⁶及び E⁷が水素原子である化合物、並びに生理学的に許容されるそれらの塩からなる群から選ばれる物質を有効成分として含む請求の範囲第 1項に記載のカリウムチャネル開口薬。

4 .ピマル酸、ジヒドロピマル酸、サンダラコピマル酸、ィソピマル酸、及びジヒドロイソピマル酸、並びに生理学的に許容されるそれらの塩からなる群から選ばれる物質を有効成分として含む請求の範囲第 1項に記載の力リゥムチャネル開口

5 .下記の一般式（Π)

(式中、 R^u、 R¹²、 R¹³、 R¹⁴、 R¹⁵、 R¹⁶、 R¹⁷、 R¹⁸、 R¹⁹ヽ R²⁰、及び R²¹はそれそれ独立にアルキル基、アルケニル基、ハロゲン原子、ヒドロキシ基、ハロゲン化アルキル基、ヒドロキシアルキル基、アミノアルキル基、アルコキシ基、ァリール基、ァシル基、カルボキシル基、アルコキシカルボニル基、ヒドロキシルサム酸基、スルホン酸基、力ルバモイル基、スルホン酸アミド基、アルデヒド基、又は二トリル基を示し、 R^2fl及び β²¹は互いに結合してォキソ基を形成してもよい）で表される化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含むカリウムチヤネル開口薬。

6 . R^U、 R¹³、及び R¹⁸がアルキル基であり、 R¹²がカルボキシル基であり、 R¹⁴、 R¹⁵、及び R¹⁶が水素原子である化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む請求の範囲第 5項に記載の力リゥムチャネル開口薬。

7 . R¹¹, I 、及び R¹⁸がアルキル基であり、 R¹²がカルボキシル基であり、 R¹⁴、 R¹⁵, R¹⁶、 R^2Q、及び R²¹が水素原子であり、 R¹⁷及び R¹⁹がハロゲン原子である化合物又は生理学的に許容されるその塩を有効成分として含む請求の範囲第 5項に記載の力リウムチャネル開口薬。

8 .カルシウム依存性力リゥムチャネル開口薬である請求の範囲第 1項ないし第 7項のいずれか 1項に記載の力リゥムチャネル開口薬。

9 .本態性高血圧症、緊張性膀胱、気道過敏症、又は虚血性中枢神経障害の予防及び Z又は治療に用いる請求の範囲第 1項から第 8項のいずれか 1項に記載の力リゥムチャネル開口薬。